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TITRE
Variants de HPIV-2, et leurs applications médicales
DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION
La présente demande est relative à des virus parainfluenza humains de type 2
(HPIV-2) variants, et à leurs applications médicales, plus particulièrement à
leurs
applications diagnostiques.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
Au sein de la famille des Paramyxoviridae, les virus parainfluenza humains
(HPIV)
sont des virus à ARN compris dans deux genres de la sous-famille des
Paramyxovirinae :
- les Respirovirus pour les virus parainfluenza de type 1 et 3 (HPIV-1, -3)
- les Rubulavirus pour les virus parainfluenza de type 2 et 4 (HPIV-2, -4).
Les HPIV sont des virus enveloppés. Leur génome est d'une taille d'environ 15
kilobases, constitué d'ARN simple brin de polarité négative. Le génome code
six
protéines principales.
Les gènes NP, P et L codent respectivement la nucléoprotéine, la
phosphoprotéine
et la polymérase (L pour large polymerase complex). Ces trois protéines
forment
avec l'ARN viral la nucléocapside (ou holonucléocapside). La nucléoprotéine
forme
avec l'ARN un support pour la phosphoprotéine et la polymérase, permettant la
transcrition et éventuellement la réplication du génome.
Les gènes F et HN codent respectivement la protéine de fusion F et
l'hémagglutinine-neuraminidase HN, qui sont les deux protéines d'enveloppe du
virus et qui participent au mécanisme d'entrée du virus dans la cellule hôte.
La protéine HN est responsable de l'attachement du virus à la cellule, en se
liant
aux acides sialiques cellulaires. Une fois le virus attaché, la protéine de
fusion F
est activée, insère un de ces domaines dans la membrane cellulaire et
s'ensuivent
des mécanismes rapprochant les deux membranes et les fusionnant.
Parmi les HPIV, différents virus HPIV2 ont été décrits dans l'art antérieur.
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L'isolat HPIV2 de référence est l'isolat Greer, qui a été isolé en 1955 à
partir d'un
patient.
Les moyens de diagnostic qui comprennent la détection de HPIV-2 sont tous
actuellement construits à partir de la structure de cet isolat de référence.
Par exemple, la détection de HPIV-2 dans le cadre hospitalier se fait
actuellement
par isolement en culture cellulaire (sur système sensible LLCMK2), ou par
immunofluorescence et immuno-capture ELISA. Les anticorps mis en oeuvre dans
ces techniques ont été obtenus à partir de la souche HPIV-2 Greer.
Or, les inventeurs montrent qu'il existe en fait toute une famille de virus
HPIV2 qui
sont suffisamment différents de I'isolat Greer, et plus particulièrement des
isolats
Greer, Toshiba et V98, pour ne pas être reconnus par les anticorps anti-
protéine
d'enveloppe qui, dans l'art antérieur, sont habituellement utilisés pour la
détection
de HPIV2.
De même, l'art antérieur propose quelques techniques de détection de HPIV-2
par
PCR, mais les amorces sont conçues par référence à la séquence de l'isolat
Greer, sans tenir compte du fait que, comme le démontrent les présents
inventeurs, il existe en fait toute une famille de virus HPIV-2 qui sont
différents de
l'isolat Greer, et plus particulièrement des isolats Greer, Toshiba et V98.
RESUME DE L'INVENTION
Les inventeurs ont identifié un nouveau groupe phylogénique variant de HPIV2,
et
un nouveau sous-groupe phylogénique variant de HPIV2.
La demande est relative à des virus HPIV2 qui font partie de ce nouveau groupe
phylogénique variant, et à des virus HPIV2 qui font partie de ce nouveau sous-
groupe phylogénique variant de HPIV2.
Le groupe phylogénique variant de l'invention est un groupe de virus HPIV2 qui
ne
comprend notamment pas les isolats Greer, Toshiba et V98.
Le sous-groupe phylogénique variant de l'invention est un groupe de virus
HPIV2
qui ne comprend notamment pas le's isolats Greer, Toshiba et V98, et qui ne
comprend en outre pas l'isolat V94.
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Cinq isolats faisant partie de ce groupe et également de ce sous-groupe ont
été
déposés auprès de la C.N.C.M. aux fins du Traité de Budapest.
La demande est relative aux protéines, plus particulièrement aux protéines
d'enveloppe des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique variant de
l'invention, notamment aux protéines F et HN de ces virus, ainsi qu'aux
fragments
de ces protéines.
La demande est également relative aux acides nucléiques codant ces protéines
ou
fragments de protéine.
La demande est également relative à des moyens pour la détection, plus
particulièrement le diagnostic de HPIV2.
La demande est relative à des régions nucléotidiques particulières des virus
du
groupe ou sous-groupe HPIV2 de l'invention, qui leur sont suffisamment
spécifiques pour permettre leur détection, de préférence leur détection
spécifique,
par rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats
Greer et
V98.
La demande est ainsi relative à des régions nucléotidiques qui ont été
spécifiquement sélectionnées pour la construction et la production de systèmes
de
type PCR temps réel, comprenant au moins une paire d'amorces et une sonde,
ainsi qu'à des régions nucléotidiques qui ont été spécifiquement sélectionnées
pour la construction et la production de sondes spécialement adaptées à une
mise
en ceuvre sur puce.
La demande est également relative à ces amorces, ces sondes et à des puces
comprenant au moins une sonde de l'invention.
La demande est en outre relative à des kits et compositions comprenant au
moins
une région spécifique et/ou au moins une amorce et/ou au moins une sonde de
l'invention.
La demande est également relative à des anticorps dirigés contre une protéine
d'enveloppe d'au moins l'un des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique
variant de l'invention, et à des hybridomes produisant de tels anticorps.
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BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La demande fait référence aux figures suivantes : -
Figure 1: modèle tridimensionnel des ectodomaines de la protéine HN de
l'isolat
prototype HPIV-2 Greer de l'art antérieur (modèle de gauche), et d'un isolat
de
l'invention -par exemple, isolat HPIV-2 18620 (modèle de droite).
Cette figure illustre le fait que des isolats de l'invention présentent une
protéine HN
différente de celle de l'isolat HPIV-2 Greer, notamment en ce qui concerne les
sites de glycosylation. Comme illustré sur la figure, des isolats de
l'invention
comprennent notamment une mutation S316N, qui crée un site de glycosylation
que ne présente pas la protéine HN de l'isolat HPIV-2 Greer.
Figure 2: alignement des séquences aminoacides du peptide de fusion (FP;
fragment 107-126 de la protéine de fusion F) de :
- cinq isolats HPIV-2 de l'invention (virus parainfluenza humains de type 2;
isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632), sur celles de
- l'isolat HPIV-2 Greer de l'art antérieur (virus parainfluenza humain de type
2) et du virus SV5 (virus simien parainfluenza simien de type 5).
Figure 3: Analyse phylogénétique des protéines F (arbre du haut) et HN (arbre
du
bas) des isolats suivants :
- cinq isolats HPIV-2 de l'invention (isolat HPIV-2 Lyon/20283/2001 = isolat
20283 ; isolat HPIV-2 Lyon/20435/2001 = isolat 20435 ; isolat HPIV-2
Lyon/18620/2001 = isolat 18620 ; isolat HPIV-2 Lyon/26632/1997 = isolat
26632 ; isolat HPIV-2 Lyon/26056/1997 = isolat 26056),
- isolat HPIV-2 Vanderbilt/1994 (= isolat HPIV-2 V94),
- isolat HPIV-2 Vanderbilt/1 998 (= isolat HPIV-2 V98),
- isolat HPIV-2 Greer/1955 (= isolat HIPV-2 Greer),
- virus SV5 (virus parainfluenza simien de type 5),
- HPIV-4A,
- HPIV-4B,
- HPIV-3, et
- HPIV-1.
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Les séquences déterminées par les inventeurs sont signalées par une flèche
(isolats 20283, 20435, 18620, 26632, 26056).
Les autres séquences ont été obtenues à partir de la base de données Genbank
(http///www.ncbi.nim.nih.gov).
5 Les arbres phylogénétiques ont été construits par la méthode du voisin le
plus
proche ( neighbour-joining ). L'échelle indique le nombre de substitutions
d'acides aminés par site, et la longueur des branches horizontales est
proportionnelle à l'échelle indiquée. La fiabilité des embranchements a été
évaluée
par la méthode des "bootstraps" (1000 réplications) et les pourcentages
résultant
de cette procédure sont indiqués.
Figure 4: présentation schématique des domaines structurels de la protéine F
de
HPIV-2, et présentation de l'alignement des séquences aminoacides de la
protéine
F pour cinq isolats HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056,
26632), pour l'isolat HPIV-2 Greer, et pour les isolats HPIV-2 V94 et V98
(Vanderbilt/1 994 et Vanderbilt/1998, respectivement).
Cette figure illustre le fait que certains acides aminés de la protéine F des
isolats
de l'invention sont différents de ceux observés dans les autres isolats HPIV-2
(isolats Greer, V94 et V98). Par exemple, on voit que :
- la protéine F d'isolats de l'invention diffère de celle de l'isolat Greer
notamment du fait des éléments de séquence suivants :
o la séquence du site de clivage (CS), qui est KPRRER (SEQ ID NO:
14), au lieu de la séquence KTRQER (SEQ ID NO : 13) observée
chez l'isolat Greer tel que séquencé par les inventeurs (mutations
T102P et Q104R), et au lieu de la séquence KTRQRK (SEQ ID NO :
118) telle que cela apparaît dans la séquence Greer disponible sur la
base de données NCBI (NLM, National Library of Medicine) sous le
numéro d'accession NC_003443 (mêmes mutations T102P et
Q104R),
o la séquence du peptide de fusion (FP) qui présente l'acide aminé I en
position 112, au lieu de l'acide aminé V (mutation V1121),
o la séquence du domaine HR1 du polypeptide F1, qui présente l'acide
aminé T en position 160, au lieu de l'acide aminé D (mutation
D160T);
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- la protéine F des isolats de l'invention diffère de celle de l'isolat V98
notamment du fait des mêmes éléments de séquence que ceux observés
par rapport à l'isolat Greer (mutations T102P, Q104R au niveau du CS ;
mutation V1121 au niveau de FP ; mutation D160T au niveau de HR1), ainsi
que par le fait qu'au niveau de la séquence du domaine HR1 du polypeptide
F1, les isolats de l'invention présentent :
o l'acide aminé R en position 163, au lieu de l'acide aminé K (mutation
K163R), et
o l'acide aminé R en position 175, au lieu de l'acide aminé H (mutation
H175R) ;
- la protéine F d'isolats de l'invention diffère de celle de l'isolat V94
notamment du fait de la séquence du domaine HR1 du polypeptide F1, qui,
dans des isolats de l'invention, présente l'acide aminé R en position 175 au
lieu de l'acide aminé H (mutation H175R).
On voit également que certains isolats de l'invention présentent d'autres
mutations,
notamment dans le domaine transmembranaire (TM) de la protéine F. Par
exemple, les isolats 20283 et 20435 de l'invention diffèrent des isolats
18620,
26056 et 26632 de l'invention, mais aussi des isolats Greer, V94 et V98, par
le fait
que leur domaine transmembranaire présente l'acide aminé I en position 516 au
lieu de l'acide aminé V (mutation V5161).
Les positions des acides aminés sont ici calculées par rapport à la séquence
de la
protéine F.
La figure 4 décrit plus particulièrement les séquences des sites de clivage
(CS),
des peptides de fusion (FP) des domaines HR1, HR2 et TM de chacun des cinq
isolats HPIV2 de l'invention (séquences 101-106, 107-126, 133-177, 451-484 et
487-518, respectivement), alignées sur les séquences respectives des isolats
Greer, V94 et V98.
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Les séquences codantes correspondantes peuvent être déduites par la personne
du métier, en suivant le code génétique universel, et en tenant compte de la
dégénérescence de ce code.
TM = partie transmembranaire
On peut observer que, par rapport aux isolats Greer, V98 et V94, les cinq
isolats
particuliers de l'invention se distinguent par le fait qu'ils présentent à la
fois :
- un acide aminé autre que D en position 160 (région HR1), préférablement
l'acide
aminé T en position 160 (mutation D160T par rapport aux isolats Greer et V98),
et
- un acide aminé autre que H en position 175 (région HR1), préférablement
l'acide
aminé R en position 175 (mutation H175R par rapport aux isolats V98 et V94).
Figure 5: alignement des séquences nucléotidiques codant F (1656 nucléotides)
de la souche HPIV-2 Greer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620,
20283, 20435, 26056 et 26632) ; de haut en bas :
- séquence codant F de l'isolat Greer NC_003443 (SEQ ID NO : 48),
- séquence codant F de l'isolat 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 23),
- séquence codant F de l'isolat 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 28),
- séquence codant F de l'isolat 20435 de l'invention (SEQ ID NO: 33),
- séquence codant F de l'isolat 26056 de l'invention (SEQ ID NO : 38),
- séquence codant F de l'isolat 26632 de l'invention (SEQ ID NO : 43).
Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position
où au
moins l'une des souches présentées en alignement contient un nucléotide
différent
des autres à cette position.
On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que
présente chacun des isolats particuliers de l'invention, par rapport à l'une
ou
plusieurs des autres souches présentées en alignement, et plus
particulièrement
par rapport à la souche Greer.
Figure 6: alignement des séquences nucléotidiques codant HN (1716 nucléotides)
de la souche HPIV-2 Greer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620,
20283, 20435, 26056) ; de,haut en bas :
- séquence codant HN de l'isolat Greer NC_003443 (SEQ ID NO : 50),
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- séquence codant HN de l'isolat 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 25),
- séquence codant HN de l'isolat 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 30),
- séquence codant HN de l'isolat 20435 de l'invention (SEQ ID NO : 35),
- séquence codant HN de I'isolat 26056 de l'invention (SEQ ID NO : 40).
Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position
où au
moins l'une des souches présentées en alignement contient un nucléotide
différent
à cette position.
On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que
présente chacun des isolats par rapport à l'une ou plusieurs des autres
souches
présentées en alignement, et plus particulièrement par rapport à la souche
Greer.
Figure 7: alignement des séquences aminoacides de F (551 aa) de la souche
HPIV-2 Greer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435,
26056 et 26632) ; de haut en bas :
- séquence F de l'isolat 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 24),
- séquence F de I'isolat 26632 de l'invention (SEQ ID NO : 44).
- séquence F de l'isolat 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 29),
- séquence F de l'isolat 20435 de l'invention (SEQ ID NO : 34),
- séquence F de l'isolat 26056 de l'invention (SEQ ID NO : 39),
- séquence F de I'isolat Greer NC_003443 (SEQ ID NO : 49).
Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position
où au
moins l'une des souches présentées en alignement contient un acide aminé
différent des autres à cette position.
On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que
présente chacun des isolats par rapport à l'une ou plusieurs des autres
souches
présentées en alignement, et plus particulièrement par rapport à la souche
Greer.
On peut ainsi remarquer que, par rapport à la souche Greer, les isolats de
l'invention présentent des changements qui leur sont communs au niveau de la
séquence de F, notamment au niveau des positions d'acide aminé suivantes :
- position 32 (acide aminé I pour la souche Greer, acide aminé V pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution 132V),
- position 96 (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T96A),
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- position 102 (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé P pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T102P),
- position 104 (acide aminé Q pour la souche Greer, acide aminé P pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q104P),
- position 112 (acide aminé V pour la souche Greer, acide aminé I pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution V1121),
- position 160 (acide aminé D pour la souche Greer, acide aminé T pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution D160T),
- position 247 (acide aminé N pour la souche Greer, acide aminé K pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution N247K),
- position 248 (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé L pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution F248L),
- position 390 (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé K pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution R390K),
- position 524 (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé A pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution S524A),
- position 538 (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé V pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution F538V).
Parmi ces changements communs par rapport à l'isolat Greer, on peut notamment
remarquer les substitutions T102P et Q104R que les isolats de l'invention
présentent au niveau du site de clivage (CS en Figure 4), la substitution
V1121 que
les isolats de l'invention présentent au niveau du peptide de fusion (FP en
Figure
4), la substitution D160T que les isolats de l'invention présentent au niveau
du
domaine HR1.
CDS = séquence nucléotidique codante.
Figure 8: alignement des séquences aminoacides de HN (571 aa) de la souche
HPIV-2 Greer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435,
26056) ; de haut en bas :
- séquence HN de l'isolat 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 26),
- séquence HN de l'isolat 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 31),
- séquence HN de l'isolat 20435 de l'invention (SEQ ID NO : 36),
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- séquence HN de l'isolat 26056 de l'invention (SEQ ID NO: 41).
- séquence HN de I'isolat Greer NC_003443 (SEQ ID NO : 51).
Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position
où au
moins l'une des souches présentées en alignement contient un acide aminé
5 différent des autres à cette position.
On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que
présente chacun des isolats par rapport à l'une ou plusieurs des autres
souches
présentées en alignement, et plus particulièrement par rapport à la souche
Greer.
On peut ainsi remarquer que, par rapport à la souche Greer, les isolats de
10 l'invention présentent des changements qui leur sont communs au niveau de
la
séquence de HN, notamment au niveau des positions d'acide aminé suivantes :
- position 57 (acide aminé D pour la souche Greer, acide aminé E pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution D57E),
- position 100 (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé L pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution F100L),
- position 114 (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T114A),
- position 139 (acide aminé K pour la souche Greer, acide aminé E pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution K139E),
- position 186 (acide aminé M pour la souche Greer, acide aminé I pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution M1861),
- position 195 (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T195A),
- position 201 (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé S pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A201 S),
- position 316 (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé N pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution S316N),
- position 319 (acide aminé P pour la souche Greer, acide aminé T pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution P319T),
- position 323 (acide aminé K pour la souche Greer, acide aminé E pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution K323E),
- position 344 (acide aminé E pour la souche Greer, acide aminé K pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution E344K),
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- position 348 (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé I pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A3481),
- position 378 (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé E pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A378E),
- position 379 (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé E pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution R379E),
- position 479 (acide aminé P pour la souche Greer, acide aminé L pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution P479L),
- position 480 (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé M pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T480M),
- position 482 (acide aminé Q pour la souche Greer, acide aminé R pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q482R),
- position 497 (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé K pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution R497K),
- position 513 (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé N pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution S513N),
- position 514 (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé S pour les
isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A514S).
CDS = séquence nucléotidique codante.
Parmi ces changements communs par rapport à l'isolat Greer, on peut notamment
remarquer la substitution N316S qui introduit un nouveau site de glycosylation
dans les isolats de l'invention par rapport à la souche Greer.
On peut également remarquer les acides aminés en positions 512, 513, 514 et
515
de la protéine HN, et plus particulièrement les acides aminés en position 513
et
514.
DESCRIPTION DETAILLEE
La présente demande est relative à un nouveau groupe et à un nouveau sous-
groupe phylogéniques de virus HPIV2, et aux applications médicales qui peuvent
être faites à partir de l'enseignement qui est présentement apporté par les
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inventeurs, à savoir l'existence de ce nouveau groupe et sous-groupe
phylogéniques.
La présente demande est plus particulièrement relative à des moyens pour la
détection, et plus particulièrement le diagnostic, de virus HPIV2 faisant
partie de ce
groupe et/ou de ce sous-groupe.
Les inventeurs ont isolé plusieurs souches de HPIV2, qui sont des souches
variantes par rapport à l'isolat HPIV2 Greer, et plus particulièrement par
rapport
aux isolats Greer, Toshiba et V98.
Dans l'art antérieur, l'isolat Greer est l'isolat de référence pour la mise au
point des
outils de détection, et plus particulièrement de diagnostic, de HPIV2.
Or, les inventeurs montrent qu'il existe toute une famille de virus HPIV2 qui
sont
suffisamment différents de l'isolat Greer, et plus particulièrement des
isolats Greer,
Toshiba et V98, pour ne pas être reconnus par les anticorps anti-protéine
d'enveloppe qui, dans l'art antérieur, sont habituellement utilisés pour la
détection
de HPIV2.
Plus particulièrement, les isolats HPIV2 faisant partie du nouveau groupe ou
sous-
groupe phylogénique de l'invention ne sont pas reconnus par l'anticorps anti-
HN
commercialisé par ARGENE S.A. (Parc Technologique Delta Sud
09120 Varilhes ; France) sous la référence 12E12G9.
Or, ces isolats variants de l'invention ont récemment été observés chez
plusieurs
patients atteints d'affections respiratoires.
Par contre, la souche HPIV2 qui sert de référence dans l'art antérieur pour la
mise
au point de moyen de diagnostic HPIV2 est une souche qui date de 1955 (souche
Greer).
Les inventeurs mettent donc en évidence le fait qu'il existe une inadéquation
entre
les moyens actuellement utilisés pour le diagnostic de HPIV2, et la nature des
souches HPIV2 actuellement observées chez des patients. Au fil de l'évolution
des
souches, il est hautement probable que cette inadéquation va aller en
s'accentuant.
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Le nouveau groupe phylogénique d'isolats HPIV2 de l'invention est caractérisé
par
le fait qu'il ne comprend pas les isolats Greer, Toshiba et V98.
La figure 3 donne une représentation du groupe phylogénique de l'invention,
qui
est basée sur les protéines d'enveioppe F et HN (arbre du haut : protéine F;
arbre
du bas : protéine HN).
Le nouveau groupe phylogénique de l'invention comprend notamment les isolats
qui, en figure 3, sont désignés par HPIV-2 Lyon/20283/2001, HPIV-2
Lyon/20435/2001 HPIV-2 Lyon/18620/2001 HPIV-2 Lyon/26632/1997 HPIV-2
Lyon/26056/1997, c'est-à-dire cinq nouveaux isolats qui ont été isolés par les
inventeurs et qui ont été déposés auprès de la C.N.C.M., aux fins du Traité de
Budapest. Ce nouveau groupe phylogénique comprend également l'isolat HPIV-2
Vanderbilt/1994 (=isolat V94).
Le nouveau sous-groupe de l'invention comprend notamment les isolats HPIV-2
Lyon/20283/2001, HPIV-2 Lyon/20435/2001 HPIV-2 Lyon/18620/2001 HPIV-2
Lyon/26632/1997 HPIV-2 Lyon/26056/1997, mais ne comprend pas l'isolat HPIV-2
Vanderbilt/1994 (=isolat V94). Des analyses de séquences F et HN permettent en
effet de distinguer quelques différences entre l'isolat V94 et le sous-groupe
dont
font partie les cinq isolats particuliers de l'invention.
Comme la représentation phylogénique de la Figure 3 le fait apparaître à la
personne du métier, les isolats HPIV2 qui sont les plus proches du nouveau
groupe et du nouveau sous-groupe phylogénique d'isolats HPIV2 de l'invention,
mais sans en faire partie, sont les isolats Greer, Toshiba et V98.
Ceci implique également que le nouveau groupe phylogénique et le nouveau sous-
groupe phylogénique de l'invention ne comprennent pas de microorganismes qui
ne seraient pas des virus Rubulavirus, et plus particulièrement qu'ils ne
comprennent pas de microorganismes qui ne seraient pas des virus HPIV2.
L'isolat qui, dans l'art antérieur, est décrit sous le nom d'isolat Toshiba,
est
identique à 99,8% à l'isolat Greer au niveau nucléotidique. La séquence de
l'isolat
Toshiba a été rapportée dans les bases de données, notamment sous les numéros
Genbank X57559, NC003443. On tiendra compte du fait que l'art antérieur
démontre que les différences que la séquence de l'isolat Toshiba semble
présenter
par rapport à la séquence de l'isolat Greer sont en fait plutôt dues à des
erreurs de
clonage d'ADNc, de synthèse et/ou d'analyse de séquences, qu'à la situation
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réelle naturelle de l'isolat en question (cf. Skiadopoulos et al. 2003,
Journal of
Virology, 77(1) : 270-279).
Dans la présente demande, l'isolat Toshiba est donc en fait considéré comme
étant identique à l'isolat Greer.
En tout état de cause, une différence par rapport à l'isolat Greer suffit à
constituer
une différence par rapport à l'isolat Toshiba.
Les séquences des isolats Greer, Toshiba et V98 sont disponibles sur Genbank
sous les numéros d'accession NC_003443 (isolat Greer), X57559 (isolat
Toshiba),
(isolat V98).
Dans la présente demande, le nouveau groupe phylogénique de l'invention
pourra,
par simplification, être désigné par groupe phylogénique de variants HPIV2, ou
groupe phylogénique variant, ou groupe de l'invention.
De même, le nouveau sous-groupe phylogénique de l'invention pourra être
désigné par sous-groupe phylogénique de variants HPIV2, sous-groupe
phylogénique variant, ou sous-groupe de l'invention.
Le nouveau groupe de l'invention est défini par le fait que les virus de ce
groupe
comprennent :
- une protéine F différente de celle de l'isolat, Greer et/ou
- une protéine HN différente de celle de l'isolat Greer.
De préférence, les virus du groupe de l'invention comprennent une protéine F
et
une protéine HN différentes des protéines F et HN, respectivement, de l'isolat
Greer.
Plus particulièrement, les virus du groupe de l'invention peuvent comprendre :
- une protéine F différente des protéines F des isolats Greer et V98, et/ou
- une protéine HN différente des protéines HN des isolats Greer et V98.
De préférence, les virus du groupe de l'invention présentent une protéine F
différente des protéines F des isolats Greer et V98, et une protéine HN
différente
des protéines HN des isolats Greer et V98.
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Cette ou ces différences protéiques peuvent notamment être une ou des
différences de séquences aminacides.
Un virus du groupe de l'invention a donc :
5 - une protéine F qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celle
de
l'isolat Greer, comprend au moins un acide aminé différent de celui présenté
par la séquence de la protéine F de l'isolat Greer à la même position, et/ou
(de préférence, et)
- une protéine HN qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celle
10 de l'isolat Greer, comprend au moins un acide aminé différent de celui
présenté par la séquence de la protéine HN de l'isolat Greer à la même
position.
Plus particulièrement, un virus du groupe de l'invention peut donc avoir :
15 - une protéine F qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celles
des isolats Greer et V98, comprend au moins un acide aminé différent de
celui présenté par la séquence de la protéine F de l'isolat Greer à la même
position et au moins un acide aminé différent de celui présenté par la
séquence de la protéine F de l'isolat V98 à la même position, et/ou (de
préférence, et)
- une protéine HN qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celle
des isolats Greer et V98, comprend au moins un acide aminé différent de
celui présenté par la séquence de la protéine HN de l'isolat Greer à la
même position et au moins un acide aminé différent de celui présenté par la
séquence de la protéine HN de l'isolat V98 à la même position.
Ledit au moins un acide aminé différent par rapport à I'isolat Greer et ledit
au
moins un acide aminé différent par rapport à l'isolat V98 peuvent se trouver à
des
positions différentes. Dans ce cas, le virus du groupe de l'invention présente
au
moins deux types de différences (sur sa protéine F et/ou sa protéine HN), à
savoir
au moins une différence à une position donnée par rapport à l'isolat Greer, et
au
moins une différence à une autre position par rapport à l'isolat V98.
Alternativement, ledit au moins un acide aminé différent par rapport à
l'isolat Greer
peut se trouver à la même position que ledit au moins un acide aminé différent
par
rapport à l'isolat V98. Dans ce cas, la protéine F du virus du groupe de
l'invention
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comprend, dans sa séquence aminoacide, au moins une position où l'acide aminé
qu'elle y présente est différent de celui présenté à la même position dans la
séquence des isolats Greer et V98, et/ou (de préférence, et), la protéine HN
du
virus du groupe de l'invention comprend, dans sa séquence aminoacide, au moins
une position où l'acide aminé qu'elle y présente est différent de celui
présenté à la
même position dans la séquence des isolats Greer et V98.
Dans la présente demande, l'expression au moins un(e) comprend dans sa
signification toutes les valeurs supérieures de nombre entier, jusqu'à la
valeur
maximale possible dans l'ensemble considéré. Par exemple, l'expression au
moins un acide aminé comprend dans sa signification au moins deux acides
aminés , au moins trois acides aminés , etc., jusqu'au nombre maximal de
changements d'acides aminés contenus dans l'ensemble considéré. De même,
l'expression en au moins une position comprend dans sa signification en
au
moins deux positions , en au moins trois positions , etc., jusqu'au nombre
maximal de positions contenues dans l'ensemble considéré.
Par rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats
Greer,
Toshiba et V98, les virus du groupe phylogénique variant de l'invention
peuvent
être définis par le fait qu'ils présentent une protéine F et/ou une protéine
HN
(protéines d'enveloppe) de séquence(s) particulière(s). Plus particulièrement
:
- la séquence aminoacide de leur protéine F présente une identité de plus de
99,3%, de préférence d'au moins 99,4%, plus préférentiellement d'au moins
99,5%
avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats
particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de
SEQ
ID NO : 24; 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056,
26632, respectivement), et/ou par le fait que
- la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus de
98,6%, de préférence d'au moins 98,7%, plus préférentiellement d'au moins
98,8%
avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats
particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de
SEQ
ID NO : 26, 31, 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056, respectivement).
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Les pourcentages d'identité indiqués ci-dessus, tout comme, sauf indication
contraire, dans le reste de la demande, sont des valeurs d'identité globale,
c'est-à-
dire une identité calculée sur toute la longueur de la séquence.
De préférence, les virus du groupe phylogénique variant de l'invention
présentent
les % indiqués ci-dessus avec chacune des SEQ ID indiquées.
Un moyen alternatif ou complémentaire pour définir les différences que les
virus du
groupe phylogénique variant de l'invention présentent par rapport à l'isolat
Greer,
et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, est le
fait
que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent présenter
au
moins un changement au niveau de la séquence aminoacide de la protéine F par
rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats
Greer,
Toshiba et V98.
Un virus du groupe de l'invention peut présenter une protéine F dont la
séquence
aminoacide diffère de celle de l'isolat Greer en au moins une des positions
suivantes (positions des acides aminés dans la séquence de la protéine F) :
positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538, 96, 248, 390, 524.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine F de l'isolat Greer, un virus
du
groupe de l'invention peut présenter au moins l'une des différences suivantes
:
a) en position 32, un acide aminé autre que I, préférentiellement l'acide
aminé
C (acide aminé I pour la souche Greer, acide aminé V pour les cinq isolats
particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution 132V), et/ou
b) en position 102, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide
aminé P (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé P pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T102P),
et/ou
c) en position 104, un acide aminé autre que Q, préférentiellement l'acide
aminé P (acide aminé Q pour la souche Greer, acide aminé P pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q104P),
et/ou
d) en position 112, un acide aminé autre que V, préférentiellement l'acide
aminé I(acide aminé V pour la souche Greer, acide aminé I pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution V1121),
et/ou
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e) en position 160, un acide aminé autre que D, préférentiellement l'acide
aminé T (acide aminé D pour la souche Greer, acide aminé T pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution D160T),
etlou
f) en position 247, un acide aminé autre que N, préférentiellement l'acide
aminé K (acide aminé N pour la souche Greer, acide aminé K pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution N247K),
et/ou
g) en position 538, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide
aminé V (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé V pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution F538V),
et/ou
h) en position 96, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide
aminé A (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T96A),
et/ou
i) en position 248, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide
aminé L (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé L pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution F248L),
et/ou
j) en position 390, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide
aminé K (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé K pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution R390K),
et/ou
k) en position 524, un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide
aminé A (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé A pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution S524A).
Parmi les positions de différences par rapport à la protéine F de l'isolat
Greer, ci-
dessus mentionnées, certaines peuvent également être des positions de
différence(s) par rapport à l'isolat V98. C'est notamment le cas des positions
32,
102, 104, 112, 160, 247, 538.
La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F
comprend un acide aminé différent de celui présenté par la protéine F de
l'isolat
Greer et de celui présenté par la protéine F de l'isolat V98 en au moins une
des
positions aminoacides 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538, de préférence en au
moins deux de ces positions, préférablement en au moins trois de ces
positions,
plus préférablement en au moins quatre de ces positions, encore plus
préférablement en au moins cinq de ces positions, très préférablement en au
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moins six de ces positions, et plus particulièrement en l'ensemble de ces sept
positions.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine F de l'isolat Greer et par
rapport à
la protéine F de l'isolat V98, un virus du groupe de l'invention peut
présenter au
moins l'une des différences de séquence aminoacide F a) à g) ci-dessus
mentionnées. La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont
la
protéine F présente au moins l'une des sept différences de séquence a) à g) ci-
dessus mentionnées, de préférence au moins deux de ces différences,
préférablement au moins trois de ces différences, plus préférablement au moins
quatre de ces différences, encore plus préférablement au moins cinq de ces
différences, très préférablement au moins six de ces différences, et plus
particulièrement l'ensemble de ces sept différences.
Parmi ces différences communément présentées par rapport à l'isolat Greer et à
l'isolat V98, les positions 102, 104, 112 et 160 de la séquence de protéine F
sont
particulièrement notables, et plus particulièrement les différences de
séquence
aminoacide F b), c), d) et e) ci-dessus mentionnées.
En effet, ces positions particulières se trouvent situées à des sites
caractéristiques
des HPIV2 :
- les positions 102 et/ou 104 se situent au niveau du site de clivage de la
protéine F (CS en Figure 4),
- la position 112 se situe au niveau du peptide de fusion (FP en Figure 4),
- la position 160 se situe au niveau du domaine HR1 de la protéine F.
Avantageusement, la présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2,
dont
la protéine F comprend un acide aminé différent de celui présenté par la
protéine F
de l'isolat Greer et de celui présenté par la protéine F de l'isolat V98 en au
moins
une des positions aminoacides 102, 104, 112, 160, de préférence en au moins
deux de ces positions, préférablement en au moins trois de ces positions, plus
préférablement en l'ensemble de ces quatre positions.
Un tel virus peut en outre présenter une protéine F:
- dont la séquence aminoacide comprend un acide aminé différent de celui
présenté par la protéine F de l'isolat Greer et de celui présenté par la
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protéine F de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides 32,
247, 538, et/ou
dont la séquence aminoacide comprend un acide aminé différent de celui
présenté par la protéine F de l'isolat Greer en au moins une des positions
5 aminoacides 32, 96, 247, 248, 390, 524, 538.
Plus particulièrement, la présente demande est relative à tout virus HPIV2,
dont la
protéine F présente au moins l'une des quatre différences particulières de
protéine
F ci-dessus mentionnées (différences de séquence de protéine F b), c), d),
e)), de
10 préférence au moins deux de ces différences, préférablement au moins trois
de
ces différences, plus préférablement l'ensemble de ces quatre différences.
Un tel virus HPIV2 peut bien sûr en outre présenter :
- par rapport aux isolats Greer et V98, au moins une des trois autres
différences de séquence de protéine F a) f) g) mentionnées ci-avant, de
15 préférence au moins deux de ces différénces a), f), g), préférentiellement
l'ensemble de ces trois différences a), f), g) ; et/ou
- par rapport à l'isolat Greer, au moins une des différences de séquence de
protéine F a), f) à k) mentionnées ci-avant, de préférence au moins deux de
ces différences a), f) à k), préférentiellement l'ensemble de ces sept
20 différences a), f) à k).
Un moyen alternatif ou complémentaire pour définir les différences que les
virus du
groupe phylogénique variant de l'invention présentent par rapport à l'isolat
Greer,
et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, est le
fait
que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent présenter
des
changements au niveau de la séquence aminoacide de la protéine HN.
Un virus du groupe de l'invention peut comprendre une protéine HN dont la
séquence aminoacide diffère de celle de l'isolat Greer en au moins une des
positions suivantes (positions des acides aminés dans la séquence de la
protéine
HN) : positions 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482,
100,
186, 316, 323, 479, 497, 513, 514.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine Hn de l'isolat Greer, un
virus du
groupe de l'invention peut présenter au moins l'une des différences suivantes
:
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a) en position 57, un acide aminé autre que D, préférentiellement l'acide
aminé
E (acide aminé D pour la souche Greer, acide aminé E pour les cinq isolats
particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution D57E), et/ou
b) en position 114, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide
aminé A (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T114A),
et/ou
c) en position 139, un acide aminé autre que K, préférentiellement l'acide
aminé E (acide aminé K pour la souche Greer, acide aminé E pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution K139E),
et/ou
d) en position 195, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide
aminé A (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T195A),
e) en position 201, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide
aminé S (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé S pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A201S),
et/ou
f) en position 319, un acide aminé autre que P, préférentiellement l'acide
aminé T (acide aminé P pour la souche Greer, acide aminé T pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution P319T),
et/ou
g) en position 344, un acide aminé autre que E, préférentiellement l'acide
aminé K (acide aminé E pour la souche Greer, acide aminé K pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution E344K),
et/ou
h) en position 348, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide
aminé I(acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé I pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A3481),
et/ou
i) en position 378, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide
aminé E (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé E pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A378E),
et/ou
j) en position 379, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide
aminé E (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé E pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution R379E),
et/ou
k) en position 480, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide
aminé M (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé M pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T480M),
et/ou
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1) en position 482, un acide aminé autre que Q, préférentiellement l'acide
aminé R (acide aminé Q pour la souche Greer, acide aminé R pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q482R),
et/ou
m) en position 100, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide
aminé L (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé L pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution F100L),
et/ou
n) en position 186, un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide
aminé I(acide aminé M pour la souche Greer, acide aminé isoleucine pour
les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution
M1861), et/ou
o) en position 316, un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide
aminé N (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé N pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution S316N),
et/ou
p) en position 323, un acide aminé autre que K, préférentiellement l'acide
aminé E (acide aminé K pour la souche Greer, acide aminé E pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution K323E),
et/ou
q) en position 479, un acide aminé autre que P, préférentiellement l'acide
aminé L (acide aminé P pour la souche Greer, acide aminé L pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution P479L),
et/ou
r) en position 497, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide
aminé K (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé K pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution R497K),
et/ou
s) en position 513, un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide
aminé N (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé N pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution S513N),
et/ou
t) en position 514, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide
aminé S (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé S pour les cinq
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A514S).
Parmi les positions de différence par rapport à la protéine HN de l'isolat
Greer, ci-
dessus mentionnées, certaines peuvent également être des positions de
différence(s) par rapport à l'isolat V98. C'est notamment le cas des positions
: 57,
114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
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La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine HN
comprend un acide aminé qui est différent de celui présenté par la protéine HN
de
l'isolat Greer, et qui est également différent de celui présenté par la
protéine HN de
l'isolat V98, en au moins-une des positions aminoacides 57, 114, 139, 195,
201,
319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, de préférence en au moins deux de ces
positions, préférablement en au moins trois de ces positions, plus
préférablement
en au moins quatre de ces positions, encore plus préférablement en au moins
cinq
de ces positions, très préférablement en au moins six de ces positions, et
plus
particulièrement en l'ensemble de ces douze positions. En sus de cette au
moins
une différence, la protéine HN dudit virus peut en outre comprendre un acide
aminé différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolat Greer en au
moins
une des positions aminocides 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513, 514.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine HN de l'isolat Greer et par
rapport à
la protéine HN de l'isolat V98, un virus du groupe de l'invention peut
présenter au
moins l'une des différences de séquence aminoacide HN a) à I) ci-dessus
mentionnées. La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont
la
protéine F présente au moins l'une des douze différences de séquence a) à I)
ci-
dessus mentionnées, de préférence au moins deux de ces différences,
préférablement au moins trois de ces différences, plus préférablement au moins
quatre de ces différences, encore plus préférablement au moins cinq de ces
différences, très préférablement au moins six de ces différences, et plus
particulièrement l'ensemble de ces douze différences.
En sus de cette au moins une différence, la protéine HN dudit virus peut en
outre
présenter au moins une des différences m) à t) ci-dessus mentionnées.
Parmi les différences présentées par rapport à l'isolat Greer, les positions
316, 513
et 514 de la séquence de la protéine HN sont particulièrement notables, et
plus
particulièrement les différences de séquence aminoacide HN o) s) et t) ci-
dessus
mentionnées.
L'isolat Greer présente l'acide aminé S en position 316 de leur protéine HN.
L'isolat Greer ne présente pas de site de glycosylation à cette position.
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A cette position, les virus du groupe phylogénique variant de l'invention
peuvent
présenter un acide aminé autre que S, et plus particulièrement un acide aminé
autre que S qui crée un site de glycosylation, préférentiellement l'acide
aminé N
(asparagine). Les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent
donc présenter un nouveau site de glycosylation, par rapport à l'isolat Greer.
Par rapport à l'isolat Greer, les virus du groupe phylogénique de l'invention
peuvent, alternativement ou complémentairement, se distinguer par le fait que
les
virus du groupe phylogénique variant de l'invention présentent en positions
512-
515 de la protéine HN une structure tertiaire différente de celle observée
chez le
virus HPIV2 Greer.
Cette différence structurale est notamment illustrée par la Figure 1, qui
présente la
structure tertiaire prédite de la protéine HN de virus du groupe phylogénique
variant de l'invention. En Figure 1, la flèche A signale une boucle qui, chez
la
souche Greer (modèle de gauche), est orientée vers l'intérieur de la protéine
HN,
alors que chez les isolats du groupe phylogénique variant de l'invention
(modèle
de droite) cette boucle, signalée par une flèche A' n'est pas orientée vers
l'intérieur
de la protéine, mais est orientée vers l'extérieur de la protéine HN.
Cette bouche correspond aux positions 512-515 de la protéine HN, et plus
particulièrement aux positions 513-514 de la protéine HN des isolats de
l'invention.
En terme de séquence aminoacide, les acides aminés qui sont en positions 513
et
514 de la séquence de la protéine HN sont, pour l'isolat Greer, S et A,
respectivement, alors qu'ils sont N et S, respectivement, pour - les cinq
isolats
particuliers de l'invention.
La présence d'un acide aminé autre que S, préférentiellement de l'acide aminé
N,
en position 513 de la protéine HN, et d'un acide aminé autre que A,
préférentiellement de l'acide aminé S, en position 514 de la protéine HN est
un
moyen de définir les virus faisant partie du groupe phylogénique de variants
de
l'invention.
Avantageusement, la présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2,
dont
la protéine HN comprend :
- un acide aminé différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolat
Greer et qui est aussi différent de celui présenté par la protéine HN de
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l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides 57, 114, 139, 195,
201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, et
- un acide aminé différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolat
Greer en au moins une des positions aminoacides 316, 513, 514, de
5 préférence en position 316 ou en positions 513 et 514, préférentiellement en
positions 36, 513 et 514.
Plus particulièrement, la présente demande est relative à tout virus HPIV2,
dont la
protéine HN présente :
10 - au moins l'une des différences de séquence de protéine HN a) à I) ci-
dessus mentionnées (différences communément présentées par rapport à
l'isolat Greer et à l'isolat V98), de préférence au moins deux de ces
différences, préférentiellement au moins trois de ces différences, plus
préférentiellement au moins quatre de ces différences, encore plus
15 préférentiellement au moins cinq de ces différences, très
préférentiellement
l'ensemble de ces douze différences, et
- au moins l'une des différences de séquence de protéine HN o) s) t) ci-
dessus mentionnées, de préférence la différence o) et/ou les différences s)
et t), préférentiellement au moins deux de ces différences, plus
20 préférentiellement au moins les différences s) et t), encore plus
préférentiellement les différences o) s) et t).
En résumé, un virus HPIV2 faisant partie du groupe phylogénique variant de
l'invention peut être défini par le fait que :
25 i. la séquence aminoacide de sa protéine F présente une identité de plus de
99,3%, de préférence d'au moins 99,4%, plus préférentiellement d'au moins
99,5% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des
cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des
séquences de SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620,
20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec
chacune de ces SEQ ID NO :, et/ou par le fait que
M. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente une identité de plus de
98,6%, de préférence d'au moins 98,7%, plus préférentiellement d'au moins
98,8% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN
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des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des
séquences de SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435,
26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces SEQ ID
NO :, et/ou par le fait que
iii. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolat
Greer en
au moins une des positions aminoacides suivantes : 32, 102, 104, 112, 160,
247, 538, 96, 248, 390, 524 (positions des acides aminés au sien de la
séquence de la protéine F) ; et/ou par le fait que
iv. la séquence aminoacide de sa protéine F présente au moins l'une des onze
différences de séquence F a) à k), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le
fait que
v. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolat Greer
et
de celle de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides
suivantes : 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538 (positions des acides aminés
au sien de la séquence de la protéine F) ; et/ou par le fait que
vi. la séquence aminoacide de sa protéine F présente au moins l'une des sept
différences de séquence F a) à g), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le
fait que
vii. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolat
Greer et
de celle de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides
suivantes : 102, 104, 112, 160 (positions des acides aminés au sien de la
séquence de la protéine F), tel que ci-dessus mentionné ; et/ou par le fait
que
viii. la séquence aminoacide de leur protéine F présente au moins l'une des
quatre différences de séquence F b) à e), tel que ci-dessus mentionné,
et/ou par le fait que
ix. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolat Greer
et
de celle de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides
suivantes : 102, 104, 112, 160 (positions des acides aminés au sein de la
séquence de la protéine F), et diffère en outre :
o de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins une
des positions aminoacides 32, 247, 538, et/ou
o de celle de l'isolat Greer en au moins une des positions aminoacides
32, 96, 247, 248, 390, 524, 538 ; et/ou par le fait que
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X. la séquence aminoacide de leur protéine F présente au moins l'une des
quatre différences de séquence F b) à e), tel que ci-dessus mentionné, et
présente en outre :
o au moins l'une des trois différences de séquence F a), f) g), tel que
ci-dessus mentionné, et/ou
o au moins l'une des différences de séquence F a), f) à k) ci-dessus
mentionnées ; et/ou par le fait que
xi. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolat
Greer
en au moins l'une des positions aminaocides suivantes : 57, 114, 139, 195,
201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513,
514 (positions des acides aminés au sein de la protéine HN) ; et/ou par le
fait que
xii. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des
vingt différences de séquence HN a) à t), tel que ci-dessus mentionné, et/ou
par le fait que
xiii. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolat
Greer
et de celle de l'isolat V98 en au moins l'une des positions aminoacides
suivantes : 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482 ; et/ou
par le fait que
xiv. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des
douze différences de séquence HN a) à I), tel que ci-dessus mentionné,
et/ou par le fait que
xv. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolat
Greer
et de celle de l'isolat V98 en au moins l'une des positions aminoacides
suivantes : 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, et
diffère en outre de celle de l'isolat Greer en au moins l'une des positions
aminoacides 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513, 514; et/ou par le fait que
xvi. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des
douze différences de séquence HN a) à i), tel que ci-dessus mentionné, et
présente en outre au moins l'une des différences de séquence HN m) à t),
tel que ci-dessus mentionné ; et/ou par le fait que
xvii. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolat
Greer
et de celle de l'isolat V98 en au moins l'une des positions aminaocides
suivantes : 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, et
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diffère en outre de celle de l'isolat Greer en au moins l'une des positions
aminoacides 316, 513, 514; et/ou par le fait que
xviii. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des
douze différences de séquence HN a) à I), tel que ci-dessus mentionné, et
présente en outre au moins l'une des différences de séquence HN o) s) t),
tel que ci-dessus mentionné.
De préférence, un virus du groupe de l'invention est défini par au moins l'un
des
caractéristiques listées ci-dessus sous i., ii., v. à x., xiii. à xviii,
préférentiellement
par au moins l'une des caractéristiques listées ci-dessus sous i., ii., vii.,
xiii.
De préférence, un virus du groupe de l'invention est défini par :
- au moins l'une des caractéristiques listées ci-dessus sous i., vii., et/ou
par
- au moins l'une des caractéristiques listées ci-dessus sous ii., xiii.,
par exemple par au moins les caractéristiques i. et ii., et/ou i. et xiii.,
et/ou vii. et ii.,
et/ou vii. et xiii.
Cinq isolats qui font partie du groupe phylogénique variant de l'invention, et
qui ont
été identifiés par les inventeurs, ont été déposés auprès de la C.N.C.M. aux
fins du
Traité de Budapest (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ;
C.N.C.M. ; Institut Pasteur ; 25, rue du Docteur Roux ; F-75724 PARIS Cedex 15
;
France).
Leurs numéros de dépôt sont : 1-3761 (isolat 26056), 1-3762 (isolat 26632), I-
3763
(isolat 18620), I-3764 (isolat 20283), 1-3765 (isolat 20435).
IIs ont été déposés auprès de la C.N.C.M. le : 10 mai 2007.
Ces isolats ont été isolés à partir d'aspirats nasaux ou de lavages
bronchoalvéolaires de patients souffrant d'infections respiratoires.
Le groupe phylogénique variant de l'invention comprend également I'isolat V94.
L'enseignement de l'art antérieur relatif à V94 incitait clairement la
personne du
métier à considérer que l'isolat V94 était un isolat très proche de l'isolat
Greer, et
qu'il ne comportait pas de différence technique significative par rapport à
l'isolat
G.reer, à tout le moins aucune.Oifférence technique significative pour la
détection,
et plus particulièrement le diagnostic de HPIV2.
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Par exemple, l'article Skiadopoulos et al. 2003 (Journal of Virology, vol. 77,
No. 1,
pp. 270-279) fait état du séquençage complet de l'isolat V94, et rapporte des
analyses comparatives de sa séquence avec celles des isolats Greer et V98.
Chacune des informations rapportées dans cet article présente l'isolat V94
comme
un isolat qui est très proche de l'isolat Greer.
A la connaissance des inventeurs, aucun art antérieur ne divulgue que l'isolat
V94
présenterait des différences structurales par rapport à l'isolat Greer, qui
seraient
suffisamment significatives pour considérer qu'un moyen qui permet de détecter
l'isolat Greer ne permet pas nécessairement de détecter l'isolat V94.
A la connaissance des inventeurs, aucun art antérieur ne divulgue que l'isolat
V94
présenterait des protéines d'enveloppe, et plus particulièrement des protéines
F
et/ou HN, suffisamment différentes de celles de l'isolat Greer, pour
considérer
qu'un moyen qui permet de détecter l'isolat Greer via la détection de ses
protéines
d'enveloppe ne permet pas nécessairement de détecter l'isolat V94.
En outre, à la connaissance des inventeurs, aucun art antérieur ne fait état
du fait
que, ou n'incite la personne du métier à considérer que, l'isolat V94 n'est
pas un
cas isolé appartenant au passé (l'isolat V94 a été isolé en 1994), mais qu'il
fait en
fait partie d'un groupe phylogénique particulier, qui est distinct du groupe
de HPIV2
dont fait partie l'isolat Greer, et dont des membres peuvent être actuellement
isolés
sur des patients.
A la connaissance des inventeurs, l'art antérieur ne suggère pas que l'isolat
V94,
qui a été isolé en 1994, était susceptible d'être phylogénétiquement lié à
d'autres
virus HPIV2 susceptibles d'être isolés postérieurement, notamment dans les
années 2000, à partir de patients souffrant d'infections respiratoires.
Le concept général de l'existence d'un groupe phylogénique variant de HPIV2,
qui
comprend plusieurs virus qui ont en commun de présenter une variation au
niveau
de l'enveloppe telle qu'ils pourraient ne pas être détectés par les moyens
traditionnels de diagnostic de HPIV2, n'a donc, à la connaissance des
inventeurs,
été ni divulgué ni suggéré dans l'art antérieur.
Le fait que les isolats faisant partie de ce groupe phylogénique variant sont
trouvés
sur des patients actuels, alors que la souche Greer de référence a été isolée
en
1955, souligne encore l'intérêt de la présente invention.
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Au sein du groupe phy(ogénique variant de l'invention, un sous-groupe
phylogénique peut être distingué. Ce sous-groupe comprend l'ensemble des cinq
isolats particuliers de l'invention, et ne comprend pas l'isolat V94. Ce sous-
groupe
phylogénique de l'invention comprend des virus HPIV2, qui sont extrèmement
5 proches les uns des autres.
Par rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats
Greer,
Toshiba et V98, les virus du sous-groupe phylogénique variant de l'invention
peuvent être définis par le fait qu'ils ne sont pas reconnus par certains
anticorps
10 anti-HPIV2 de l'art antérieur, et plus particulièrement par des anticorps
de l'art
antérieur qui sont dirigés contre la protéine d'enveloppe HN de virus HPIV2.
Ces
anticorps anti-HN de l'art antérieur ont en effet été produits ou construits à
partir
d'épitope(s) de la protéine HN de la souche HPIV2 qui servait de référence
dans
l'art antérieur, à savoir la souche HPIV2 Greer. Or, les inventeurs montrent
que la
15 protéine HN des virus du sous-groupe phylogénique variant de l'invention ne
comprend pas les mêmes épitopes que la protéine HN de I'isolat Greer. Plus
particulièrement, certains épitopes qui sont présents dans la protéine HN de
l'isolat
Greer ne sont pas présents dans la protéine HN des virus du groupe
phylogénique
variant de l'invention. De ce fait, les virus du groupe phylogénique variant
de
20 l'invention ne sont pas reconnus par certains anticorps anti-HN de l'art
antérieur.
Un exemple de tels anticorps anti-HN de l'art antérieur est l'anticorps
commercialisé par ARGENE S.A. (Parc Technologique Delta Sud 09120 Varilhes ;
France) sous la référence 12E12G9. Cet anticorps de l'art antérieur reconnaît
un
épitope sur la protéine HN de I'isolat Greer, qui n'est pas présent dans les
virus du
25 sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Alternativement, ou en complément, les virus du sous-groupe phylogénique
variant
de l'invention peuvent être définis comme ayant en commun de présenter une
substitution de l'acide aminé qui est en position 175 au sein de la séquence
de la
30 protéine F, et/ou une substitution de l'acide aminé qui est position 186 de
la
séquence de la protéine HN.
La position 175 de la protéine F se situe dans le domaine HR1 du polypeptide
Ft:-
En position 175, l'isolat V94 présente l'acide aminé H(histidine).
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La position 186 de la protéine HN est très proche du site catalytique de la
protéine,
et la nature de l'acide aminé présent à cette position est donc susceptible
d'avoir
une influence sur l'activité de la protéine.
En position 186 de la protéine HN, l'isolat V94 présente l'acide aminé M (et
!'on
peut incidemment noter que l'isolat Greer présente également l'acide aminé M
en
position 186).
Un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de variants de l'invention
peut
donc être défini par le fait que :
- il fait partie du groupe phylogénique de l'invention tel que ci-dessus
défini,
par exemple à l'aide d'une ou plusieurs des caractéristiques de groupe ci-
dessus mentionnées (telles que pourcentage d'identité de la protéine F et/ou
HN, différence(s) de séquence(s) F et/ou HN, structure tertiaire de HN
différente),
et en outre par le fait que:
- il n'est pas reconnu par des anticorps monoclonaux anti-HN de l'art
antérieur
qui, tel l'anticorps commercialisé par Argene sous la référence 12E12G9, ont
été construits et/ou obtenus à partir de la protéine Hn de l'isolat Greer,
et/ou
- il présente un acide aminé autre que H en position 175 de la protéine F
et/ou
(de préférence, et) un acide aminé autre que M en position 186 de la protéine
HN.
De préférence, l'acide aminé en position 175 de la séquence de la protéine F
d'un
virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de variants de l'invention
est
l'acide aminé R (asparagine).
De préférence, l'acide aminé en position 186 de la séquence de la protéine HN
d'un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de variants de
l'invention est
l'acidé aminé ! (isoleucine).
Toutes les combinaisons de caractéristique(s) de groupe et de
caractéristique(s)
de sous-groupe sont explicitement incluses dans la présente demande.
Par 'exemple, un virus HPIV2 qui fait partie du sous-groupe phylogénique de
variants HPIV2 de l'invention peut être défini :
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- par le fait qu'il présente au moins l'une des caractéristiques de groupe i.,
ii.,
v. à x., xiii. à xviii. ci-dessus listées, et
- par le fait qu'il présente en outre au moins l'une des caractéristiques de
sous-groupe suivantes :
- en position 186 de la séquence de la protéine HN, il présente un
acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I
(isoleucine), et/ou
- en position 175 de la séquence de sa protéine F, il présente un acide
aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R.
Pour définir les virus du sous-groupe phylogénique de l'invention, une ou
plusieurs
dix-huit caractéristiques i. à xviii. peuvent être utilisées, comme indiqué ci-
dessus
au chapitre de la définition du groupe phylogénique variant de l'invention.
Toutes les combinaisons de caractéristiques sont explicitement visées par la
présente demande.
Par exemple, un virus HPIV2 qui fait partie du sous-groupe phylogénique de
variants HPIV2 de l'invention peut être défini :
- par le fait qu'il présente au moins l'une des caractéristiques de groupe i.
à
xviii. ci-dessus listées, et
- par le fait qu'il présente en outre au moins l'une des caractéristiques de
sous-groupe suivantes :
- en position 186 de la séquence de la protéine HN, il présente un
acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I
(isoleucine), et/ou
- en position 175 de la séquence de sa protéine F, il présente un acide
aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R, et/ou
- il n'est pas reconnu par des anticorps monoclonaux anti-HN de l'art
antérieur qui, tel l'anticorps commercialisé par Argene sous la
référence 12E12G9, ont été construits et/ou obtenus à partir de la
protéine HN de l'isolat Greer.
La présente demande est plus particulièrement relative à des virus HPIV2 qui
font
partie d'un sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 qui ne comprend pas les
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isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98 et V94, et qui peuvent être définis par le
fait
que :
- la séquence aminoacide de leur protéine F présente une identité de plus de
99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au
moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un
des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des
séquences de SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620,
20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec
chacune de ces séquences, et/ou
- la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus
de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au
moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des
protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au
moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31, 36, 41 (isolats 18620,
20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de
ces séquences,
et en outre par le fait que :
- en position 186 de la séquence de la protéine HN, ils présentent un acide
aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé 1(isoleucine).
La présente demande est plus particulièrement relative à des virus HPIV2 qui
font
partie d'un sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 qui ne comprend pas les
isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98 et V94, et qui peuvent être définis par le
fait
que:
- la séquence aminoacide de leur protéine F présente une identité de plus de
99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au
moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un
des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des
séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620,
20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec
chacune de ces séquences, et/ou
- la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus
de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au
moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des
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protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au
moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31, 36, 41 (isolats 18620,
20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de
ces séquences, -
et en outre par le fait que :
- en position 175 de la séquence de sa protéine F, ils présentent un acide
aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R.
A titre récapitulatif ou illustratif, le tableau suivant peut être présenté :
Tableau 13:
Nature de Position Acide aminé Acide Acide Acide aminé
différences au sein présent chez aminé aminé préférentiellement
communes de la l'isolat présent présent présent chez des
aux isolats protéine Greer/Toshiba chez chez isolats du groupe
du groupe l'isolat l'isolat ou sous-groupe
ou sous- V98 V94 phylogénique de
groupe de l'invention
l'invention
32 I I V V
96 T A A A
102 T T P P
104 Q Q R R
Protéine F 112 V V I 1
160 D D T T
175 R R H R
247 N N K K
248 F L L L
390 R K K K
524 S A A A
538 F F V V
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Tableau 13 (suite et fin) :
Nature de Position Acide aminé Acide Acide Acide aminé
différences au sein présent chez aminé aminé préférentiellement
communes de la l'isolat présent présent présent chez des
aux isolats protéine GreerlToshiba chez chez isolats du groupe
du groupe l'isolat l'isolat ou sous-groupe
ou sous- V98 V94 phylogénique de
groupe de l'invention
l'invention
57 D D E E
100 F L L L
114 T T A A
139 K K E E
186 M I M I
195 T T A A
Protéine 201 A A S S
HN 319 s p T T
323 P E E E
344 K E K K
348 E A I I
378 A A E E
379 A R E E
479 R L L L
480 P T M M
482 Q Q R R
497 R K K K
513 s N N N
514 A S S S
5 Un moyen alternatif ou complémentaire pour définir les virus du sous-groupe
phylogénique de l'invention, sans faire nécessairement appel à au moins une
des
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caractéristiques de groupe ci-dessus mentionnées, est le % d'identité que
présente
la séquence aminoacide de leurs protéines F et/ou HN.
En effet, les virus du sous-groupe phylogénique de l'invention peuvent être
définis
par le fait que : -
- la séquence aminoacide de leur protéine F présente préférentiellement une
identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus
préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la
protéine
F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au
moins
une des séquences de SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats
18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec
chacune de ces séquences, et/ou
- la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus de
99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins
99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des
isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des
séquences de
SEQ ID NO : 26, 31, 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056,
respectivement),
et de préférence avec chacune de ces séquences.
Les virus HPIV2 qui répondent à ces critères d'identité font partie du sous-
groupe
phylogénique de l'invention, sans qu'il y ait nécessairement à faire appel à
une des
caractéristiques de groupe i. à xviii. ci-dessus mentionnées.
La présente demande est donc relative à tout virus HPIV2 :
i. qui répond à au moins des caractéristiques de groupe i. à xviii., tel que
ci-
dessus mentionné, et à au moins une des caractéristiques de sous-groupe,
tel que ci-dessus mentionné (acide aminé autre que H en position 175 de sa
protéine F, préférentiellement, l'acide aminé R ; acide aminé autre que M en
position 186 de sa protéine HN, préférentiellement, l'acide aminé I; virus
non reconnu des anticorps monoclonaux anti-HN de l'art antérieur),
et/ou
ii. dont la séquence aminoacide de sa protéine F présente une identité de
plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement
d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au
moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins
une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des
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isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de
préférence avec chacune de ces séquences,
et/ou
iii. dont la séquence âminoacide de sa protéine HN présente une identité de
plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement
d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des
protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au
moins une des séquences de SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (isolats
18620,20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec
chacune de ces séquences.
Un virus HPIV2 faisant partie du sous-groupe phylogénique de l'invention
présente
au moins l'une des ces caractéristiques i. à iii. ci-dessus, par exemple une,
deux,
ou l'ensemble de ces caractériques.
La demande vise plus particulièrement cinq virus particuliers. Ces cinq virus
particuliers sont ceux qui ont été déposés auprès de la C.N.C.M. le 10 mai
2007,
sous les numéros de dépôt 1-3761 (isolat 26056), 1-3762 (isolat 26632), 1-3763
(isolat 18620), 1-3764 (isolat 20283), 1-3765 (isolat 20435). Ils font partie
du groupe
phylogénique de l'invention, et également du sous-groupe phylogénique de
l'invention.
Les paramètres physico-chimiques des protéines F et HN de ces virus
particuliers
sont prtésentés en tableaux 14 et 15 ci-dessous (paramètres calculés à l'aide
du
logiciel CLC Free WorkBench version 3.2).
La présente demande est relative à tout virus HPIV-2 dont la protéine F
présente
une valeur de masse moléculaire et/ou de point isoélectrique et/ou d'index
aliphatique identique à celle(s) de la protéine F d'au moins l'un des virus
particuliers de l'invention, et/ou dont la protéine HN présente une valeur de
masse
moléculaire et/ou de point isoélectrique et/ou d'index aliphatique identique à
celle(s) de la protéine HN d'au moins l'un des virus particuliers de
l'invention.
La présente demande est plus particulièrement relative à tout virus HPIV-2
dont la
protéine F présente une valeur de point isoélectrique identique à celle de la
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protéine F d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention, et/ou dont
la
protéine HN présente une valeur de point isoélectrique identique à celle de la
protéine HN d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention.
De préférence, un virus HPIV-2 de l'invention a une protéine F qui présente au
moins deux paramètres parmi les paramètres de masse moléculaire et/ou de point
isoélectrique et/ou d'index aliphatique, dont les valeurs sont identiques
respectivement à celles des paramètres d'au moins l'un des virus particuliers
de
l'invention, et/ou dont une protéine HN qui présente au moins deux paramètres
parmi les paramètres de masse moléculaire et/ou de point isoélectrique et/ou
d'index aliphatique, dont les valeurs sont identiques respectivement à celles
des
paramètres d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention.
De préférence, lesdits au moins deux paramètres comprennent le paramètre de
point isoélectrique.
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La demande est également relative aux acides nucléiques, dont la séquence
séquence comprend, ou est constituée de (la séquence d'un acide nucléique d'un
virus HPIV2 de l'invention; et plus particulièrement) :
5 a) la séquence de l'ARN génomique d'un virus HPIV2 du groupe ou sous-
groupe de l'invention, ou
b) la séquence d'un ADNc (simple-brin ou double-brin) susceptible d'être
obtenu par transcription inverse (ou transcription inverse et polymérase)
d'un tel ARN génomique, ou
10 c) la séquence qui est la complémentaire d'une des séquences visées sous a)
et b) ci-dessus, sur toute la longueur de cette séquence a) ou b).
Protéines :
15 La présente demande est relative à toute protéine qui est celle d'un virus
qui fait
partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique variant de
l'invention.
Dans la présente demande, le terme protéine comprend dans sa portée les
protéines non glycosylées, tout comme les glycoprotéines.
Les virus qui font partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe,
phylogénique variant de l'invention présente une enveloppe virale différente
de
celle habituellement observée dans l'art antérieur, plus particulièrement
différente
de celle de l'isolat Greer, préférentiellement différente de celles des
isolats Greer,
Toshiba et V98.
L'enveloppe des virus qui font partie du sous-groupe phylogénique de
l'invention
est en outre différente de celle de l'isolat V94.
La présente demande est donc relative à tout protéine d'enveloppe d'un virus
qui
fait partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique variant
de
l'invention.
Cette protéine d'enveloppe peut être, ou comprendre, la protéine F d'un tel
virus
et/ou la protéine HN d'un tel virus.
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La présente demande est plus particulièrement relative aux protéines
d'enveloppe
qui sont spécifiques des virus du sous-groupe de l'invention,
préférentiellement
des cinq isolats particuliers de l'invention qui ont été déposés auprès de la
CNCM
sous les numéros 1-3761 à 1-3765.
Ladite protéine F présente un certain nombre de différence(s) par rapport à
une
protéine F de l'isolat Greer, plus particulièrement par rapport aux protéines
F des
isolats Greer, Toshiba et V98, préférentiellement par rapport aux protéines F
des
isolats Greer, Toshiba, V98 et V94.
Par exemple, la séquence de cette protéine F peut présenter un certain nombre
de
substitution(s) d'acide(s) aminé(s), par rapport à la séquence de la protéine
F de
l'isolat Greer, plus particulièrement par rapport aux protéines F des isolats
Greer,
Toshiba et V98, préférentiellement par rapport aux protéines F des isolats
Greer,
Toshiba, V98 et V94.
Chacune des définitions des protéines F et HN ci-dessus présentées au chapitre
de la définition des virus selon l'invention s'appliquent naturellement aux
protéines
F et HN en tant que telles.
Ainsi, comme indiqué ci-dessus au chapitre des virus, les protéines F et HN
peuvent être définies par une combinaison d'au moins une caractéristique de
groupe (au moins une différence par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98)
et
au moins une caractéristique de sous-groupe (au moins une différence par
rapport
à l'isolat V94).
Par exemple, parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la
protéine F
d'un isolat de l'invention, par rapport à l'isolat Greer, plus
particulièrement par
rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, peuvent notamment être citées les
différences suivantes, qui sont relatives au site de clivage de la protéine
F (positions 102 à 106 de la séquence complète de la protéine F; cf. CS en
Figure
4):
- en position 102, un acide aminé autre que T (thréonine), préférentiellement
l'acide aminé P (proline), et/ou
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- en position 104, un acide aminé autre que Q (glutamine), préférentiellement
l'acide aminé R (arginine).
De préférence, ladite protéine F comprend à la fois l'acide aminé P en
position 102
et l'acide aminé R en position 104.
En position 102, les isolats Greer, Toshiba et V98 présentent l'acide aminé T
(thréonine), et non l'acide aminé P.
En position 104, les isolats Greer, Toshiba et V98 présentent l'acide aminé Q
(glutamine), et non l'acide aminé R.
De préférence, ladite protéine F présente l'acide aminé E en position 105.
Avantageusement, la séquence de ce site de clivage est KPRRER (SEQ ID NO:
14).
Parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la protéine F d'un
isolat de
l'invention, par rapport à l'isolat Greer, plus particulièrement par rapport
aux isolats
Greer, Toshiba et V98, peuvent être alternativement ou complémentairement
citées les différences suivantes :
- en position 112, un acide aminé autre que V (valine), préférentiellement
l'acide
aminé I (isoleucine), et/ou
- en position 160, un acide aminé autre que D (acide aspartique),
préférentiellement l'acide aminé T (théonine).
La position 112 se situe dans le peptide de fusion (FP) ; la position 160 se
situe
dans le domaine HR1 du polypeptide F1.
En position 112, les isolats Greer et V98 présentent l'acide aminé V (valine).
En position 160, les isolats Greer et V98 présentent l'acide aminé D (acide
aspartique).
Parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la protéine F d'un
isolat de
l'invention, par rapport à l'isolat Greer, plus particulièrement par rapport
aux isolats
Greer, Toshiba et V98, peuvent être alternativement ou complémentairement
citées les différences suivantes :
- en position 32, un acide aminé autre que I(isoleucine), préférentiellement
l'acide
aminé V,
- en position 247, un acide aminé aùire que N, préférentiellement l'acide
aminé K,
- en position 538, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide
aminé V,
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La dite protéine F de virus faisant partie du groupe phylogénique variant de
l'invention peut présenter une, deux, trois, ou plus, voire l'ensemble des
différences ci-dessus mentionnées. Toute combinaison de ces différences est
explicitement visée par la demande.
La protéine F de virus faisant partie du sous-groupe phylogénique variant de
l'invention peut, en sus de la ou des différence(s) ci-dessus mentionnée(s),
présenter une ou des différence(s) par rapport à la protéine F de l'isolat
V94.
Avantageusement, la protéine F d'un virus faisant partie du sous-groupe
phylogénique de l'invention présente un acide aminé autre que H en position
175,
préférentiellement l'acide aminé R (mutation H175R).
Parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la protéine F par
rapport à
l'isolat V94, peuvent notamment être citées les différences particulières
suivantes :
- en position 4, un acide aminé autre que L, préférentiellement l'acide aminé
P,
et/ou
- en position 403, un acide aminé autre que N, préférentiellement l'acide
aminé T,
et/ou
- en position 516, un acide aminé autre que V, préférentiellement l'acide
aminé I
(isoleucine).
Par exemple :
- l'isolat 20283 de l'invention présente la substitution L4P et la
substitution V5161,
par rapport à l'isolat V94, et également par rapport à l'isolat Greer,
- l'isolat 26056 de l'invention présente la substitution N403T, par rapport à
l'isolat
V94,
- l'isolat 20435 présente la substitution V5161 par rapport à l'isolat V94, et
également par rapport à l'isolat Greer.
La dite protéine F de virus faisant partie du sous-groupe phylogénique variant
de
l'invention peut présenter une, deux, trois, des différences ci-dessus
mentionnées,
en sus d'au moins une différence de séquence F par rapport aux isolats Greer,
Toshiba et V98. Toute combinaison de ces différences est explicitement visée
par
la demande.
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Des virus HPIV2 faisant partie du groupe ou, le cas échéant, du sous-groupe
phylogénique variant de l'invention peuvent donc être des variants qui
présentent
la(Ies) mutation(s) V1121 et/ou D160T au sein de la protéine F par rapport aux
isolats Greer, Toshiba et V98 et la mutation H175R au sein de la protéine F
par
rapport à l'isolat V94.
Comme indiqué ci-dessus au chapitre des virus, des différences au niveau des
protéines F permettent de distinguer une protéine F d'un virus du sous-groupe
de
l'invention, sans avoir nécessairement à combiner cette différence avec une
différence de groupe. Il s'agit donc de différences spécifiques particulières,
qui
distinguent les protéines F des virus du sous-groupe de l'invention, tels que
les
cinq isolats particuliers déposés auprès de la CNCM sous les numéros 1-3761 à
I-
3765, des isolats Greer, Toshiba, V98 et V94.
La présente demande est plus particulièrement relative à toute protéine F,
dont la
séquence aminoacide présente une identité de plus de 99,85%, de préférence
d'au
moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence
aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de
l'invention,
c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44
(protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et
de
préférence avec chacune de ces séquences.
La présente demande et plus particulièrement relative aux protéines, et plus
particulièrement aux protéines d'enveloppe, qui comprennnent au moins une
protéine dont la séquence est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 24,
29,
34, 39, 44 (cf tableau 5).
Une protéine d'enveloppe de l'invention peut être, ou comprendre, la protéine
HN
d'un virus faisant partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe,
plylogénique variant de l'invention.
Cette protéine HN peut présenter au moins l'un des éléments suivants, de
préférence au moins deux de ces éléments, plus préférentiellement l'ensemble
des
éléments suivants (éléments de différence par rapport aux protéines HN des
isolats Greer, Toshiba et V98) :
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- en position 57, un acide aminé autre que D, préférentiellement l'acide aminé
E,
- en position 114, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide
aminé A,
- en position 139, un acide aminé autre que K, préférentiellement l'acide
aminé E,
- en position 195, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide
aminé A,
5 - en position 201, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide
aminé S,
- en position 319, un acide aminé autre que P, préférentiellement l'acide
aminé T,
- en position 344, un acide aminé autre que E, préférentiellement l'acide
aminé K,
- en position 348, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide
aminé I
(isoleucine),
10 - en position 378, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide
aminé E,
- en position 379, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide
aminé E,
- en position 480, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide
aminé M,
- en position 482, un acide aminé autre que Q, préférentiellement l'acide
aminé R.
15 Une protéine HN d'un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de
l'invention présente en outre au moins une différence par rapport à la
protéine HN
de l'isolat V94.
Préférentiellement, cette protéine HN présente un acide aminé autre que M,
préférentiellement l'acide aminé I(isoleucine) en position 186.
20 L'isolat V94 présente l'acide aminé M en position 186. L'isolat Greer
présente
également l'acide aminé M en position 186.
Les cinq isolats particuliers de l'invention, qui ont été déposés auprès de la
C.N.C.M., présentent quant à eux l'acide aminé I(isoleucine) en position 186.
La présente demande est donc relative à toute protéine HN qui présente au
moins
25 l'un des éléments de différences listés ci-dessus, par rapport aux isolats
Greer,
Toshiba et V98, et qui présente un acide aminé autre que M en position 186.
La présente demande est plus particulièrement relative à toute protéine HN,
dont
la séquence aminoacide présente une identité de plus de 99,15%, de préférence
30 d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec la
séquence
aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de
l'invention,
c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41
(protéine HN des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement),
et
de préférence avec chacune de ces séquences.
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La présente demande et plus particulièrement relative aux protéines, et plus
particulièrement aux protéines d'enveloppe, qui comprennnent au moins une
protéine dont la séquence est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 26,
31,
36, 41 (cf. tableau 5).
Fraaments de protéines :
La présente demande est également relative aux fragments des protéines
d'enveloppe des virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe
phylogénique variant de l'invention, et plus particulièrement aux fragments
des
protéines F et HN des virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe
phylogénique variant de l'invention.
Sont plus particulièrement visés ceux des fragments de protéine, qui sont
spécifiques des virus du sous-groupe phylogénique de l'invention, et plus
particulièrement des cinq isolats particuliers de l'invention, qui ont été
déposés
auprès de la CNCM sous les nuémros 1-3761 à 1-3765.
Parmi les fragments de protéines F de virus du groupe phylogénique variant, ou
du
sous-groupe phylogénique variant de l'invention, la présente demande est plus
particulièrement relative à ceux des fragments qui comprennent, ou sont
constitués
d'au moins un fragment choisi parmi :
- le fragment partie extracellulaire,
- le fragment polypeptide F2,
- le fragment site de clivage (CS),
- le fragment peptide de fusion (FP),
- le fragment domaine HR1,
- le fragment domaine HR2,
- le fragment polypeptide F1,
- le fragment partie transmembranaire,
- le fragment partie intracytoplasmique
de ces protéines F.
La Figure 4 donne une présentation schématique de tels fragments.
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Ces fragments s'étendent des positions suivantes, calculées à partir de la
séquence des protéines F complètes :
Tableau 12 : position des-fragments dans la séauence complète de la protéine F
Fragments de ces 1 er acide Dernier
protéines F aminé acide
aminé
Partie extracellulaire 1 486
Polypeptide F2 1 100
Site de clivage (CS) 101 106
Peptide de fusion (FP) 107 126
Domaine HR1 133 177
Domaine HR2 451 484
Polypeptide F1 101 486
Partie 487 518
transmembranaire
Partie 519 551
intracytoplasmique
Les séquences des protéines F complètes des cinq isolats particuliers de
l'invention sont les séquences de SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (isolats
18620,
20283, 20435, 26056, 26632, respectivement).
La présente demande est relative à toute protéine, polypeptide, peptide
(glycosylé
ou non), qui comprend au moins (ou qui est constitutée de) la séquence du site
de
clivage des protéines F des virus de l'invention, c'est-à-dire la séquence
KPRRER
(SEQ ID NO : 14).
Une telle protéine, ou le cas échéant un tel polypeptide ou peptide peut être
d'origine virale, plus particulièrement issu de l'enveloppe d'un virus, de
préférence
d'un virus HPIV-2.
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La présente demande vise notamment toute protéine F, de préférence toute
protéine F de HPIV2, qui comprend la séquence du site de clivage de SEQ ID NO
:
14.
Parmi les fragments de protéines F de virus du groupe phylogénique variant, ou
du
sous-groupe phylogénique variant de l'invention, la présente demande est par
ailleurs plus particulièrement relative à ceux des fragments dont la séquence
de ce
fragment comprend au moins 10 acides aminés, et a conservé au moins un acide
aminé (de préférence au moins deux acides aminés) qui, dans la protéine F dont
le
fragment dérive, était (étaient) à l'une des positions suivantes : positions
32, 102,
104, 112, 160, 247, 538.
La taille dudit fragment est d'au moins 10 acides aminés. Préférentiellement,
cette
taille est d'au moins un nombre entier choisi entre 11 et 550. Plus
préférentiellement, cette taille est d'au moins 14, encore plus
préférentiellement
d'au moins 19.
Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à être reconnu par
un
anticorps qui se lie spécifiquement aux virus du groupe phylogénique variant
de
l'invention, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à induire la
production
d'anticorps, lorsqu'il est injecté à un mammifère, de préférence un mammifère
non-
humain, de préférence en présence d'alun.
Avantageusement, un fragment d'au moins 10 acides aminés de protéine F de
l'invention a en outre conservé l'acide aminé qui, dans la protéine F dont le
fragment dérive, était à la position 175 (acide aminé autre que H).
Avantageusement, un fragment d'au moins 10 acides aminés de protéine F de
l'invention a conservé l'acide aminé qui, dans la protéine F dont le fragment
dérive,
était à la position 160 (acide aminé autre que D, tel que T), et a en outre
conservé
l'acide aminé qui, dans la protéine F dont le fragment dérive, était à la
position 175
(acide aminé autre que H, tel que R).
Parmi les fragments de protéines HN de virus du groupe phylogénique variant,
ou
du sous-groupe phylogénique variant de l'invention, la présente demande est
plus
particulièrement relative à ceux des fragments qui comprennent, ou sont
constitués
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d'au moins un fragment choisi parmi les fragments d'au moins 10 acides aminés,
et a conservé au moins un acide aminé (de préférence au moins deux acides
aminés) qui, dans la protéine HN dont le fragment dérive, était (étaient) à
l'une des
positions suivantes : -
57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
De tels fragments peuvent avoir en outre conservé au moins un, de préférence
au
moins deux, plus préférentiellement les trois, acide(s) aminé(s) parmi ceux
qui,
dans la séquence complète de la protéine HN dont le fragment dérive, étaient :
- à la position 316 (acide aminé autre que S),
- à la position 513 (acide aminé autre que S),
- à la position 514 (acide aminé autre que A).
De préférence, un tel fragment a conservé au moins l'acide aminé qui était à
la
position 316.
De préférence, un tel fragment a conservé au moins l'acide aminé qui était à
la
position 513, et au moins l'acide aminé qui était à la position 514.
De préférence, un tel fragment a conservé au moins l'acide aminé qui était à
la
position 316, au moins l'acide aminé qui était à la position 513, et au moins
l'acide
aminé qui était à la position 514.
Les fragments de protéine de l'invention sont notamment des candidats
d'intérêt
pour la production d'anticorps spécifiques des virus du groupe ou sous-groupe
phylogénique de l'invention, et/ou pour l'identification des épitopes de tels
anticorps.
La taille dudit fragment de protéine HN est d'au moins 10 acides aminés.
Préférentiellement, cette taille est d'au moins un nombre entier choisi entre
11 et
570. Plus préférentiellement, cette taille est d'au moins 14, encore plus
préférentiellement d'au moins 19.
Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à être reconnu par
un
anticorps qui se lie spécifiquement aux virus du groupe phylogénique variant
de
l'invention, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à induire la
production
d'anticorps, lorsqu'il est injecté à un mammifère, de préférence un mammifère
non-
humain, de préférence en présence d'alun.
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Avantageusement, un fragment d'au moins 10 acides aminés de protéine HN de
l'invention a en outre conservé l'acide aminé qui, dans la protéine HN dont le
fragment dérive, était à la position 186 (acide aminé autre que M).
Acides nucléiques codant protéines et petits fragments =
La présente demande est également relative aux acides nucléiques, dont la
séquence code au moins une protéine d'enveloppe selon l'invention, ou au moins
un fragment de protéine d'enveloppe selon l'invention, en tenant compte de la
dégénérescence du code génétique universel.
Ces acides nucléiques peuvent être de l'ADN ou de l'ARN.
Ladite protéine d'enveloppe peut être une protéine F et/ou HN de l'invention.
Ces acides nucléiques codent une protéine d'enveloppe, ou un fragment de
protéine d'enveloppe, d'au moins l'un des virus du group ou du sous-groupe
phylogénique variant de l'invention.
Les acides nucléiques de l'invention qui sont ceux de virus faisant partie du
groupe
phylogénique variant de l'invention présentent une ou des différences par
rapport
aux isolats Greer, toshiba et V98, et plus particulièrement par rapport à
l'isolat
Greer.
Par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, les acides nucléiques de
l'invention
qui codent une protéine F et/ou une protéine HN peuvent présenter la(les)
différence(s) nucléotidique(s), qui correspondent à la (aux) différence(s)
aminoacide(s) identifiées ci-dessus pour les protéines et fragment de protéine
de
l'invention, en suivant le code génétique universel, et en tenant compte de la
dégénérescence de ce code.
Par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, les acides nucléiques de
l'invention
qui codent une protéine F présentent au moins une, de préférence aù moins
deux,
plus préférentiellement l'ensemble des différences suivantes :
- en positions 94-96, un codon codant un acide aminé autre que I;
préférentiellement un codon codant l'acide, aminé V,
- en positions 304-306, un codon codant un acide aminé autre que T,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé P,
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- en positions 310-312, un codon codant un acide aminé autre que Q,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé R,
- en positions 334-336, un codon codant un acide aminé autre que V,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé I,
- en positions 478-480, un codon codant un acide aminé autre que D,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé T,
- en positions 739-741, un codon codant un acide aminé autre que N,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé K,
- en positions 1612-1614, un codon codant un acide aminé autre que F,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé V.
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la
protéine
F.
Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partie du
groupe phylogénique variant de l'invention.
Par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, les acides nucléiques de
l'invention
qui codent une protéine HN présentent au moins une, de préférence au moins
deux, plus préférentiellement l'ensemble des différences suivantes :
- en positions 169-171, un codon codant un acide aminé autre que D,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé E,
- en positions 340-342, un codon codant un acide aminé autre que T,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé A,
- en positions 415-417, un codon codant un acide aminé autre que K,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé E,
- en positions 583-585, un codon codant un acide aminé autre que T,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé A,
- en positions 601-603, un codon codant un acide aminé autre que A,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé S,
- en positions 955-957, un codon codant un acide aminé autre que P,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé T,
- en positions 1030-1032, un codon codant un acide aminé autre que E,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé K,
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- en positions 1042-1044, un codon codant un acide aminé autre que A,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé I,
- en positions 1132-1134, un codon codant un acide aminé autre que A,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé E,
- en positions 1135-1137, un codon codant un acide aminé autre que R,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé E,
- en positions 1438-1440, un codon codant un acide aminé autre que T,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé M,
- en positions 1444-1446, un codon codant un acide aminé autre que Q,
préférentiellement un codon codant l'acide aminé R.
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la
protéine
HN.
Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partir du
groupe
phylogénique variant de l'invention.
Les acides nucléiques de l'invention qui sont ceux de virus faisant partie du
sous-
groupe phylogénique variant de l'invention présentent au moins une des
différences ci-dessus par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, et plus
particulièrement par rapport à l'isolat Greer, et en outre au moins une
différence
par rapport à l'isolat V94.
Par rapport à l'isolat V94, les acides nucléiques de l'invention qui codent
une
protéine F de virus du sous-groupe phylogénique de l'invention présentent au
moins une, de préférence au moins deux, plus préférentiellement l'ensemble des
différences suivantes :
- en position 33, un nucléotide autre que T, préférentiellement le nucléotide
C (par
exemple, le codon 31-33 de l'isolat V94 est ATT, alors que dans les cinq
isolats
particuliers de l'invention, ce codon est ATC),
- en position 525, un nucléotide autre que A, préférentiellement le nucléotide
G
(par exemple, le codon 524-526 de l'isolat V94 est CAC, codant l'acide aminé H
en
position 175 de la protéine, alors que, dans les cinq isolats particuliers de
l'invention, ce codon est CGC, codant l'acide aminé R en position 175),
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- en position 1479, un nucléotide autre que C, préférentiellement le
nucléotide A
(par exemple, le codon 1479-1481 de l'isolat V94 est ATC, alors que, dans les
cinq
isolats particuliers de l'invention, ce codon est ATA).
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la
protéine
F.
De préférence, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine F
présentent au moins la différence ci-dessus mentionnée pour la position 525.
Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partir du
sous-
groupe phylogénique variant de l'invention.
Par rapport à l'isolat V94, les acides nucléiques de l'invention qui codent
une
protéine HN de virus du sous-groupe phylogénique de l'invention présentent au
moins la différence suivante :
- en position 558, un nucléotide autre que G, préférentiellement A (par
exemple, le
codon 556-558 est ATG dans l'isolat V94, codant pour l'acide aminé M en
position
186 de la protéine, alors que, dans les cinq isolats particuliers de
l'invention, ce
codon est ATA, codant l'acide aminé I-isoleucine- en position 186).
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la
protéine
HN.
Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partir du
sous-
groupe phylogénique variant de l'invention.
Toutes les combinaisons de différences nucléotidiques sont explicitement
visées
par la présente demande.
A titre récapitulatif et illustratif, le tableau suivant peut être présenté :
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Tableau 16:
Positions Par rapport à-l'isolat Par rapport aux Par rapport à
de Greer/Toshiba isolats I'isolat V94
différences Greer/Toshiba et
communes V98
aux isolats Acide Codon du Acide Codon du Acide Codon
du groupe aminé CDS aminé CDS aminé du CDS
ou sous-
groupe de
l'invention
32 94-96 32 94-96 -
96 286-288 - -
102 304-306 102 304-306 -
104 310-312 104 310-312 -
Protéine F 112 334-336 112 334-336 -
160 478-480 160 478-480 -
- - - 175 523-525
247 739-741 247 739-741 -
248 742-744 - -
390 1168-1170 - - -
524 1570-1572 - - -
538 1612-1614 538 1612-1614 -
57 169-171 57 169-171 -
100 288-300 - -
114 340-342 114 340-342 -
139 415-417 139 415-417 -
186 556-558 - 186 556-558
195 583-585 195 583-585 -
Protéine 201 601-603 201 601-603 -
HN 319 955-957 319 955-957 -
323 957-969 - -
344 1030-1032 344 1030-1032 -
348 1042-1044 348 1042-1044 -
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378 1132-1134 378 1132-1134 -
379 1135-1137 379 1135-1137 -
479 1435-1437 - -
480 1438-1440 480 1438-1440 - -
482 1444-1446 482 1444-1446 -
497 1489-1491 - - -
513 1537-1539 - - -
514 1540-1542 - - -
La présente demande vise plus particulièrement les acides nucléiques qui
codent
les protéines F et/ou HN des cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-
dire les
5 acides nucléiques dont la séquence comprend, ou est constituée, d'une
séquence
parmi les séquences de SEQ ID NO : 22, 27, 32, 37, 42, 23, 28, 33, 38, 43, 25,
30,
35, 40 (cf. tableau 5).
Applications pour la détection de HPIV2, et plus particulièrement pour son
10 diagnostic (moyens immunologigues ou moléculaires) :
Partant de l'identification, de la description et de la caractérisation du
groupe
phylogénique variant et du sous-groupe phylogénique variant, les inventeurs
proposent de nouveaux moyens de détection de HPIV2, et plus particulièrement
de
15 nouveaux moyens pour le diagnostic de HPIV2.
Les nouveaux moyens de détection, et plus particulièrement de diagnostic, de
HPIV2 de l'invention permettent de détecter l'ensemble des virus du groupe
phylogénique variant de l'invention.
20 L'invention propose notamment des moyens qui permettent leur détection
et/ou
leur diagnostic de manière spécifique, c'est-à-dire sans détection des isolats
HPIV2 Greer, Toshiba et V98.
L'invention propose en outre des moyens qui permettent la détection et/ou le
diagnostic des virus qui font partie du sous-groupe phylogénique de
l'invention de
25 manière spécifique, c'èst-à-dire sans détection des isolats HPIV2 Greer,
Toshiba
et V98, et sans détection de l'isolat V94.
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Moyens immunolopigues :
La présente demande est également relative à des anticorps, qui se lient à
l'enveloppe de virus HPIV2.
La présente demande est également relative à des fragments de tels anticorps
qui
ont conservé la capacité de se lier une protéine d'enveloppe de HPIV2.
Le terme fragment d'anticorps comprend notamment les fragment Fab,
F(ab)'2,
Fv, les CDR1, CDR2, CDR3, ainsi que les constructions dérivant de tels
fragments
tels que des scFv ou des anticorps humanisés.
L'expression se lier est ici utilisée dans son sens habituel dans le
contexte des
liaisons anticorps-antigène.
La présente demande est plus particulièrement relative à de tels anticorps ou
fragments d'anticorps, qui se lient à l'enveloppe d'au moins un virus du
groupe
phylogénique variant de l'invention, de préférence d'au moins l'un des cinq
virus
particuliers déposés par les inventeurs auprès de la C.N.C.M., de préférence
d'au
moins deux, trois ou quatre, plus préférentiellement de ces cinq virus.
La présente demande est plus particulièrement relative à de tels anticorps ou
fragments d'anticorps qui ne se lient pas à l'enveloppe de l'isolat HPIV2
Greer (la
séquence de l'isolat Greer est disponible auprès de Genbank sous le numéro
d'accès NC_003443, et est reproduite dans la présente demande, après la partie
exemples , point B.2.), et plus particulièrement sans se lier à une protéine
d'enveloppe des isolats HPIV2 Greer, Toshiba et V98.
De préférence, cet anticorps ne se lie à aucun microorganisme qui ne serait
pas un
virus HPIV2.
De préférence, un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention est un
anticorps
spécifique des virus faisant partie du groupe phylogénique variant de
l'invention.
De préférence, ladite protéine d'enveloppe d'au moins un virus HPIV2 de
l'invention comprend, ou est constituée d'une protéine F.
Un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention peut se lier à une
protéine-F de
l'invention et/ou à un fragment de protéine F de l'invention. Les
caractéristiques ci-
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dessus décrites pour définir les protéines F et les fragments de protéines F
de
l'invention s'appliquent naturellement à la définition des protéines F et des
fragments de protéines F qui sont les cibles épitopiques des anticorps et
fragment
d'anticorps de l'invention.-
Avantageusement, ledit anticorps ou fragment d'anticorps se lie à ladite
protéine F
en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les
acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine F, se situe en
positions 32,
96, 102, 104, 112, 160, 247, 248, 390, 524, 538, plus particulièrement en
positions
32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
De préférence, ladite protéine d'enveloppe d'au moins un virus HPIV2 de
l'invention comprend, ou est constituée, d'une protéine HN.
Un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention peut se lier à une
protéine HN
de l'invention et/ou à un fragment de protéine HN de l'invention. Les
caractéristiques ci-dessus décrites pour définir les protéines HN de
l'invention
s'appliquent naturellement à la définition des protéines HN et des fragments
de
protéines HN de l'invention qui sont les cibles épitopiques des anticorps et
fragment d'anticorps de l'invention.
Avantageusement, ledit anticorps ou fragment d'anticorps se lie à ladite
protéine
HN en au moins un épitope qui comprend :
- au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence
de ladite protéine HN, se situent en positions 316, 513, 514 (par exemple, un
épitope de protéine HN comprend les acides aminés qui, dans la séquence de la
protéine HN, qui se situe en positions 513-514, ou 512-515), et/ou
- au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence
de ladite protéine HN, se situe en positions 57, 100, 114, 139, 186, 195, 201,
319,
323, 344, 348, 378, 379, 479, 480, 482, 497, plus particulièrement en
positions 57,
114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
Plus particulièrement encore, la demande est relative à des anticorps ou
fragments
d'anticorps, qui sont spécifiques des virus faisant partie du sous-groupe
phylogénique variant de l'invention. De tels anticorps ne se lient donc pas à
l'isolat
HPIV2 V94.
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Un tel anticorps ou fragment d'anticorps peut notamment se lier à une protéine
F
d'au moins l'un des virus du sous-groupe phylogénique variant en au moins un
épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés
qui,
dans la séquence de ladite protéine F, se situe en position 175.
Un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention peut naturellement porter
un
marquage pour faciliter sa détection, tel qu'un marquage fluorsecent ou
enzymatique.
La présence demande est également relative à des hybridomes produisant de tels
anticorps ou fragments d'anticorps.
La présente demande est également relative à des cellules transfectées,
infestées
ou transformées, qui produisent de tels anticorps ou fragments d'anticorps.
La présente demande est également relative à toute composition qui comprend au
moins un anticorps, fragment d'anticorps, hybridome, cellule transfectée,
infectée
ou transformée de l'invention, avec éventuellement au moins un véhicule
pharmaceutique acceptable.
La présente demande est également relative à tout kit, plus particulier tout
kit de
diagnostic, qui comprend au moins un anticorps, fragment d'anticorps,
hybridome,
cellule transfectée, infectée ou transformée de l'invention.
Un tel kit de diagnostic peut en outre comprend des moyens pour la détection
d'autres microorganismes, et notamment :
- des moyens pour la détection des HPIV2 qui ne font pas partie du groupe, ou
le
cas échéant sous-groupe, phylogénique variant de l'invention, tels que les
HPIV2
Greer, Toshiba, V98, et/ou
- des moyens pour la détection de HPIV autres que HPIV2, tels que HPIV1,
HPIV3,
HPIV4, et/ou
- des moyens pour la détection de microorganismes qui ne sont pas de HPIV,
tels
que des microorganismes, et plus particulièrement, des virus impliqués dans
des
affections ou infections respiratoires (systèmes respiratoires inférieurs
et/ou
supérieurs), telles que la pneumonie, la bronchiolite, la grippe.
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La présente demande est également relative à une méthode pour produire un
anticorps capable de se lier à au moins un virus du groupe, ou le cas échéant,
du
sous-groupe, phylogénique variant de l'invention, et plus particulièrement à
au
moins l'un des cinq isolats particuliers déposés par les inventeurs auprès de
la
C.N.C.M., et de préférence à ces cinq isolats particuliers. De préférence, les
anticorps ainsi produits sont des anticorps spécifiques de ces virus.
Cette méthode peut comprendre l'administration à un mammifère (de préférence,
un mammifère non-humain) d'au moins un des cinq isolats particuliers de
l'invention, de préférence les cinq isolats particuliers de l'invention, et
éventuellement également l'isolat V94, et/ou d'au moins une protéine
d'enveloppe
ou d'au moins un fragment de protéine d'enveloppe de l'invention, tel que par
exemple un fragment de protéine HN qui a conservé l'acide aminé qui, dans la
séquence de la protéine HN, était en position 316 et/ou les deux acides aminés
qui, dans la séquence de la protéine HN, était en positions 513 et 514.
L'administration est réalisée de telle sorte que le(s) virus, protéine(s),
fragment(s)
de protéine(s) administré(s) induisent la production d'anticorps par le
mammifère
qui le(s) reçoit.
Cette administration peut être faite avec un adjuvant susceptible d'augmenter
l'immunogénicité tel qu'un alun.
Les anticorps produits sont alors recollectés, et de préférence isolés.
Des anticorps monoclonaux peuvent être produits selon les techniques connues
de
la personne du métier.
Moyens moléculaires :
Acides nucléiques de référence (grands fragments d'acides nucléiques) :
Les inventeurs ont sélectionné des acides nucléiques qui sont spécialement
adaptés à la détection spécifique d'au moins l'un des isolats de l'invention,
de
préférence de l'ensemble des isolats de l'invention.
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Les acides nucléiques qui sont spécialement adaptés à la détection spécifique
de
l'ensemble des isolats de l'invention permettent de détecter l'ensemble des
isolats
susceptibles de faire partie du groupe phylogénique variant.
5 La présente demande est relative à des acides nucléiques qui sont
spécifiques
d'un ou plusieurs virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention,
dont
ne font pas partie les isolats HPIV2 Greer, Toshiba et V98, et qui sont
spécialement adaptés à la détection spécifique d'un ou plusieurs virus de ce
groupe ou sous-groupe phylogénique et/ou à la construction et à la production
de
10 sondes et/ou d'amorces permettant une telle détection spécifique.
Ces acides nucléiques sont des fragments d'au moins un virus du groupe, ou le
cas échéant du sous-groupe, phylogénique de l'invention, dont font partie les
cinq
isolats particuliers qui ont été déposés par les inventeurs.
15 Ces acides nucléiques s'hybrident avec un ou plusieurs des virus du groupe,
ou
sous-groupe, phylogénique de l'invention dans des conditions de forte
stringence.
Des conditions de forte de stringence sont des conditiosn connues de la
personne
du métier, par exemple des conditions d'hybridations sur ADN lié à un flitre
dans
SSC 5X, dodecyl sulfate de sodium (SDS) 2%, 100 microgrammes/mL d'ADN
20 simple-brin, à 55-65 C pendant 8 heures, et lavage dans SSC 02X et SDS 0,2%
à
60-65 C pendant 30 minutes.
De préférence, de tels acides nucléiques ne s'hybrident à àucun microorganisme
autre que HPIV2 dans des conditions de forte stringence.
De préférence, dans des conditions de forte stringence, de tels acides
nucléiques
25 ne s'hybrident pas à des isolats HPIV2 qui ne font pas partie du groupe, ou
le cas
échéant du sous-groupe phylogénique de l'invention, tels que les isolats
Greer,
Toshiba et V98.
De tels acides nucléiques sont alors des acides nucléiques qui s'hybrident
spécificiquement à un, de préférence à plusieurs, plus préférentiellement à
30 l'ensemble, des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention.
Un tel acide nucléique peut être caractérisés par le fait que la séquence de
cet
acide nucléique comprend, ou est constituée de :
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- un fragment d'au moins 132 nucléotides d'une séquence codant la protéine F
et/ou la protéine HN d'au moins l'un des virus HPIV2 selon la revendication 1,
ou
- la séquence complémentaire d'un tel fragment sur toute la longueur de ce
fragment. -
De préférence, ledit fragment est un fragment d'au moins 133, 134, 135, 136,
137
nucléotides (par exemple des fragments de 137, 180, 208, 210 nucléotides, ou
des
fragments de 137, 208, 210 nucléotides, ou des fragments de 180 nucléotides).
Plus préférentiellement, ledit fragment est un fragment d'au moins 170, 175,
180
nucléotides (par exemple, 180, 208, 210 ou 180, ou 208, 210 nucléotides).
Par exemple, ledit fragment est un fragment d'au moins 240 nucléotides.
Avantageusement, notamment pour la construction et la production d'amorces et
sone(s) adaptées à une mise en ceuvre en amplification temps réel, ledit
fragment
est un fragment d'au plus 400 nucléotides.
De préférence, ladite séquence codant la protéine F est choisie parmi les
séquences de SEQ ID NO : 23, 28, 33, 38, 43, et/ou en ce que ladite séquence
codant HN est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 25, 30, 35, 40, et/ou
ladite séquence codant les protéines F et HN est choisie parmi les séquences
de
SEQ ID NO : 22, 27, 32, 37, 42.
De préférence, la séquence d'un tel acide nucléique comprend, ou est
constituée
d'au moins l'une des séquences SEQ ID NO : 57 à 86.
La demande est notamment relative à un acide nucléique, qui est spécialement
adapté à la construction et à la production de sondes ou d'amorces spécifiques
du
groupe ou sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 de l'invention, qui ne
comprend pas les isolats HPIV2 Greer, Toshiba et V98, caractérisé en ce que
cet
acide nucléique comprend, ou est constituée de:
a) au moins une séquence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO: 57 à 86,
ou
b) un fragment conservateur d'au moins l'une des séquences visées sous a),
ledit
fragment conservateur comprenant, ou étant constitué d'au moins une séquence
choisie parmi :
- les séquences qui s'étendent des positions 241 à 420 des séquences codant F
des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention,
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- les séquences qui s'étendent des positions 259 à 395 des séquences codant F
des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention,
- les séquences qui s'étendent des positions 234 à 443 des séquences codant HN
des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention,
- les séquences qui s'étendent des positions 241 à 420 des séquences codant HN
des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention,
- les séquences qui s'étendent des positions 961 à 1140 des séquences codant
HN des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention,
- les séquences qui s'étendent des positions 1381 à 1560 des séquences codant
HN des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention,
- les séquences qui s'étendent des positions 1466 à 1673 des séquences codant
HN des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, ou
c) la séquence complémentaire de l'une des séquences visées sous a) et b), sur
toute la longueur de cette séquence a) ou b).
La présente demande est plus particulièrement relative à un acide nucléique,
qui
est spécialement adapté à la construction et à la production d'au moins une
paire
d'amorces et d'au moins une sonde qui sont spécialement adaptées à une mise en
oruvre en amplification temps réel pour la détection spécifique d'un ou
plusieurs
virus dudit groupe ou sous-groupe phylogénique de variants HPIV2.
De tels acides nucléiques pourront, dans la présente demande, être désignés
par
l'expression acides nucléiques temps réel , par souçi de simplification.
Un tel acide nucléique peut être défini par le fait que sa séquence comprend,
ou
est constituée de :
- un fragment de la séquence codant F ou de la séquence codant HN d'un
virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, ou
- la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de
ce fragment,
et en ce que ledit fragment s'étend :
- des positions 259 à 395 de la séquence codant F dudit virus, ou
- des positions 234 à 443 de la séquence codant HN dudit virus, ou
- des positions 1466 à 1673 de la séquence codant HN dudit virus.
De préférence, ledit fragment s'étendant des positions 259 à 395 de la
séquence
codant F est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO :62 à 66, et/ou
ledit
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fragment s'étendant des positions 234 à 443 de la séquence codant HN est
constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO :67 à 70, et/ou ledit fragment
s'étendant des positions 1466 à 1673 de la séquence codant HN est constitué de
l'une des séquences de SEQ ID NO :83 à 86.
La séquence dudit acide nucléique séquence peut alors comprendre, ou être
constituée d'une des séquences suivantes :
les séquences de SEQ ID NO: 62 à 66, 67 à 70, 83 à 86, et les séquences qui
sont complémentaires à ces séquences de numéro SEQ ID déterminé sur toute la
longueur de ces séquences de numéro SEQ ID déterminé.
La présente demande est également relative à des acides nucléiques, qui sont
spécialement adaptés à la construction et à la production de sondes qui sont
spécialement adaptées à une mise en oeuvre sur puce, pour la détection
spécifique d'un ou plusieurs virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de
l'invention.
De tels acides nucléiques pourront, dans la présente demande, être désignés
par
l'expression acides nucléiques puces , par souçi de simplification.
La séquence d'un tel acide nucléique avantageusement comprend, ou est
constituée de :
- un fragment de la séquence codant F et/ou de la séquence codant HN d'un
virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, ou
- la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de
ce fragment,
et en ce que ledit fragment s'étend :
- des positions 241 à 420 de la séquence codant F dudit virus, ou
- des positions 241 à 420 de la séquence codant HN dudit virus, ou
- des positions 961 à 1140 de la séquence codant HN dudit virus, ou
- des positions 1381 à 1560 de la séquence codant HN dudit virus.
La présente demande est donc relative à des acides nucléiques, qui sont
spécialement adaptés à la construction et à la production d'au moins une sonde
qui est capable de s'hybrider à un acide nucléique d'un ou plusieurs virus
dudit
groupe ou sous-groupe phylogénique variant, sans s'hybrider à un acide
nucléique
des isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98.
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Avantageusement, la séquence d'un tel acide nucléique comprend, ou est
constituée d'une des séquences suivantes :
les séquences de SEQ ID NO: 57 à 61, 71 à 74, 75 à 78, 79 à 82, et les
séquences qui sont complémentaires à ces séquences de numéro SEQ ID
déterminé sur toute la longueur de ces séquences de numéro SEQ ID déterminé.
De préférence, la séquence d'un tel acide nucléique est constituée d'une des
séquences SEQ ID NO : 57 à 61, 71 à 74, 75 à 78, 79 à 82.
Amorces et sondes, spécialement dapatées à une amplification en temps réel :
La présente demande est également relatives à des paires d'amorces et des
sondes qui peuvent leur être associées pour une en oauvre en amplification
temps
réel, de préférence en PCR temps réel.
La présente demande est relative à une paire d'amorces qui est capable
d'amplifier un acide nucléique d'au moins un virus du groupe ou sous-groupe
phylogénique variant de l'invention, sans amplifier un acide nucléique des
isolats
HPIV Greer, Toshiba, et V98.
Une paire d'amorces de l'invention peut notamment être définie par le fait que
les
séquences de chacune des amorces de cette paire sont telles qu'elles
permettent
l'amplification d'un acide nucléique d'au moins un virus du groupe ou sous-
groupe
phylogénique de l'invention, sans amplifier un acide nucléique des virus HPIV2
Greer, Toshiba et V98,
lorsque cette paire d'amorces est placée en contact avec le matériel ARN dudit
au
moins un des cinq virus de la revendication 1, et d'autre part avec le
matériel ARN
de chacun desdits virus Greer, Toshiba et V98, par exemple dans quatre tubes
distincts, en présence des réactifs de RT-PCR appropriés, tels que par exemple
:
- tampon TaqMan EZ 5X (250 mM bicine -N,N-bis(2-hydroxyéthyle glycine); 575
mM acétate de potassium ; 0,05 mM EDTA ; 40% glycérol; pH 8,2) : pour une
concentration finale de 1 X,
- acétate de manganèse (25 mM) : pour une concentration finale de 2 à 5 mM,
par
exemple une concentration finale de 3 mM,
- dATP, dCTP, dGTP : pour une concentration finale de 300 pM chacun,
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- dUTP : pour une concentration finale de 600 pM,
- AmpErase UNG : pour une concentration finale de 0,01 U/pL,
- 500 nM de chaque amorce de la paire testée,
- 10 pg à 100 ng de l'ARN viral,
5 - polymérase thermostable, présentant une activité transcriptase inverse et
une
activité de ADN polymérase, telle que la rTth polymérase (disponible par
exemple
auprès de Applied Biosystems sous la référence produit N808-0192) : pour une
concentration finale de 0,1 U/pL,
- H20 déminéralisée et sans ARN,
10 et sous des conditions de RT-PCR appropriées, telles que par exemple les
conditions expérimentales suivantes :
- activité de l'AmpErase UNG (enzyme uracyl N-glycosy(ase ; CE 3.2.2) : 50 C
pendant 2 min,
- réverse transcription (rTth polymérase) à 60 C pendant 30 min,
15 - désactivation de l'AmpErase UNG : 95 C pendant 10 min,
- PCR : 25 à 40 cycles de
- dénaturation à une température de 95 C à 97 C pendant 15 secondes,
- annelage et extension à une température qui, de préférence, est de 15 C à
5 C inférieure à la valeur réelle de la température de fusion (Tm) de la paire
20 d'amorces testée et qui est, de préférence, supérieure à 55 C, par exemple
à une
température de 55 C à 70 C, par exemple 60 C, pendant 1 min.
Le mélange réactionnel commercialisé par Applied Biosystems sous la
désignation
Taqman EZ RT-PCR kit est une exemple de kit fournissant un milieu
25 réactionnel approprié.
II convient alors de déterminer si la paire d'amorces testée amplifie bien au
moins
un des cinq virus de l'invention, sans amplifier les isolats Greer, Toshiba et
V98,
c'est-à-dire si la paire d'amorces testée a conduit à la production d'un
amplicon à
30 partir du matériel ARN d'au moins un des cinq virus de l'invention, et n'a
pas
conduit à la production d'un amplicon à partir du matériel ARN de chacun des
isolats Greer, Toshiba et V98.
. Tout moyen que la personne du métier trouvera adapté à la détection de la
présence ou de l'absence d'un amplicon peut être mis en ceuvre.
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Un moyen simple, qui ne nécessite pas la production d'une sonde de détection,
peut comprendre l'électrophorèse des acides nucléiques (par exemple, sur gel
d'agarose à 1%) en présence de bromure d'éthidium et l'analyse visuelle ou
densitométrique des bandes résultantes après irradiation aux ultra-violets.
Les paires d'amorces appropriées sont celles :
- dont chacune des deux amorces parvient à s'hybrider à une cible sur le
matériel nucléotidique d'au moins l'un des cinq virus de l'invention, de
préférence de chacun des cinq virus de l'invention, de telle sorte à
permettre l'amplification de la région bornée par chacune de ces deux
amorces, et
- dont au moins une des deux amorces ne trouve pas de cible sur le matériel
nucléotidique de chacun des isolats Greer, Toshiba et V98, qui permettrait
l'amplification d'une région du matériel nucléotidique de chacun des isolats
Greer, Toshiba et V98.
Des paires d'amorces candidates peuvent donc être choisies parmi celles dont
au
moins une des deux amorces présente une cible sur le matériel nucléotidique
d'au
moins un des cinq virus de l'invention, et de préférence sur chacun des cinq
virus
de l'invention, qui ne se retrouve pas à l'identique dans le matériel
nucléotidique
des isolats Greer, Toshiba et V98 (au moins une différence nucléotidique).
On choisira de préférence des paires d'amorces :
- qui contiennent de 14 à 30 nucléotides,
- dont le contenu en G+C est de 20 à 80%,
- dont la température de fusion (Tm) est de 58 C à 60 C pour chaque
amorce, et
- dont les cinq derniers nucléotides à l'extrémité 3' de chaque amorce ne
comprennent pas plus de deux bases G et/ou C.
La construction de paires d'amorces est une technique connue de la personne du
métier. Des moyens automatisés sont d'ailleurs disponibles à cette fin, tels
que le
logiciel Primer Express version 3 ou supérieure, commercialisé par Applied
Biosystems.
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Les séquences des paires d'amorces appropriées peuvent être celle d'un
fragment
5' de la séquence amplifiée à partir de l'un au moins des cinq virus de
l'invention,
et celle d'un fragment 5' de la séquence complémentaire de cette séquence
amplifiée (fragments 5' comprenant le tout premier nucléotide à l'extrémité
5').
Dans ce cas, les séquences des paires d'amorces appropriées sont celle d'un
fragment de ia séquence de l'un au moins des cinq virus de l'invention, et
celle
d'un fragment de la séquence complémentaire de cette séquence virale.
Les séquences des paires d'amorces appropriées peuvent également être des
séquences variantes de tels fragments, susceptibles d'être obtenues par
substitution et/ou addition et/ou délétion d'au moins un nucléotide de la
séquence
de ces fragments, et qui ont conservé la capacité à amplifier au moins l'un
des cinq
virus de l'invention, sans amplifier Toshiba, Greer et V98. De préférence, de
telles
séquences variantes ont conservé au moins une différence nucléotidique par
rapport à l'ensemble de leurs cibles potentielles dans chacun des isolats
Greer,
Toshiba, et V98.
Il est préférable d'extraire l'ARN des virus avant de les mettre en contact
avec la
paire d'amorces testée, de sorte à rendre cet ARN facilement accessible à
cette
paire d'amorces. Des moyens permettant d'extraire le matériel ARN de virus
sont
connus de la personne du métier. Par exemple, un échantillon de virus peut
être
traité par un tampon d'extraction contenant du thiocyanate de guanidium 4M, de
la
N-lauryle sarcosine 0,5%, du dithiothréitol 1 mM, du citrate de sodium 25 mM,
et du
glycogène à 0,1 mg par mL, puis par précipitations à l'isopropanol et à
l'éthanol
70%.
De préférence, ladite paire d'amorces amplifie un acide nucléique de chacun
des
cinq virus particuliers déposés par les inventeurs auprès de la CNCM sous les
numéros 1-3761 à 1-3765.
Avantageusement, une paire d'amorces de l'invention est telle que :
- la séquence de l'une des amorces de ladite paire est celle d'un fragment 5'
de 14
à 30 nucléotides d'un acide nucléique temsp réel de l'invention, et en ce que
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- la séquence de l'autre amorce de ladite paire est celle d'un fragment 5' de
14 à
30 nucléotides de la séquence qui est complémentaire du même acide nucléique
temps réel sur toute la longueur de cet acide nucléique,
lesdits fragments 5' étant des fragments qui comprennent le premier nucléotide
à
l'extrémité 5' de la séquence dont ils sont le fragment.
De préférence, une paire d'amorces de l'invention est capable d'amplifier un
acide
nucléique de chacun des cinq virus particuliers déposés par les inventeurs,
sans
amplifier un acide nucléique des isolats HPIV Greer, Toshiba, et V98.
Dans une paire d'amorces de l'invention, chacun desdits fragments 5' est
(indépendamment l'un de l'autre) constitué de (14 à 30 nucléotides, de
préférence
de) 18 à 23 nucléotides.
De préférence, une paire d'amorces de l'invention est constituée (cf. tableaux
8 et
9 ci-dessous) :
- d'une amorce de SEQ ID NO: 87, et d'une amorce de SEQ ID NO : 88, ou
- d'une amorce de SEQ ID NO : 91, et d'une amorce de SEQ ID NO : 92, ou
- d'une amorce de SEQ ID NO : 95, et d'une amorce de SEQ ID NO : 96.
La présente demande est également relative à tout ensemble d'amorces qui
comprend au moins une paire d'amorces selon l'invention.
La présente demande est également relative à toute amorce, qui est telle que
choisie au sein d'une paire d'amorces de l'invention.
La présente demande est également relative à une sonde pouvant être mise en
oeuvre en amplification temps réel avec une paire d'amorces selon l'invention,
pour
la détection spécifique d'au moins un virus du groupe ou sous-groupe
phylogénique de l'invention.
Avantageusement, une telle sonde temps réel présente une séquence
(d'hybridation) qui est :
- celle est celle d'un fragment de 14 à 30 nucléotides d'un acide nucléique
temps
réel de l'invention, ledit fragment ne comprenant de préférence pas le premier
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nucléotide à l'extrémité 5' de cet acide nucléique, et de préférence pas non
plus le
dernier nucléotide à l'extrémité 3' de cet acide nucléique, ou
- celle de la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la
longueur
de ce fragment. -
De préférence, ledit fragment d'acide nucléique est constitué de 14 à 30
nucléotides, de préférence de 23 à 28 nucléotides.
Avantageusement, une telle sonde temps réel est choisie parmi les
séquences
de SEQ ID NO: 89, 90, 93, 94, 97, 98 (cf. tableaux 8 et 9 ci-dessous).
Une telle sonde peut porter un marquage, par exemple pour faciliter sa
détection,
tel qu'un marquage radioactif, fluorescent ou enzymatique.
Une telle sonde peut avantageusement porter un marquage fluorescent et un
quencher, de sorte à être adaptée à une utilisation en tant que sonde type
Taqman ou de type beacon ou de type Scorpion . Une telle sonde pourra alors
comporter des bras qui ne s'hybrident pas aux virus HPIV2, et qui sont
destinés à
former des bras beacon.
La présente demande est également relative à un ensemble d'oligonucléotides,
qui
comprend au moins une paire d'amorces temps réel selon l'invention et au
moins une sonde temps réel selon l'invention.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de
SEQ ID NO : 87-88, et la sonde de SEQ ID NO : 89 ou 90.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de
SEQ ID NO: 91-92, et la sonde de SEQ ID NO : 83 ou 94.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de
SEQ ID NO : 95-96, et la sonde de SEQ ID NO : 87 ou 98.
Un ensemble selon l'invention peut par exemple comprendre au moins une paire
d'amorces selon l'invention, et au moins deux sondes temps réel selon
l'invention.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de
SEQ ID NO : 87-88, la sonde de SEQ ID NO: 89 et la sonde de SEQ ID NO : 90.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de
SEQ ID NO : 91-92, la sonde de SEQ ID NO: 83 et la sonde de SEQ ID NO : 94.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de
SEQ ID NO : 95-96, la sonde de SEQ ID NO: 87 et la sonde de SEQ ID NO : 98.
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La présente demande est également relative à un kit pour le diagnostic d'une
affection ou d'une infection respiratoire, qui comprend au moins une paire
d'amorces selon l'invention et/ou au moins une sonde selon l'invention.
5
La présente demande est également relative à un système d'amplification, qui
est
spécialement adaptée à une amplification temps réel, qui comprend au moins une
paire d'amorces de l'invention et au moins une sonde selon l'invention, et
plus
particulièrement au moins une paire d'amorces selon l'invention et au moins
une
10 sonde selon l'invention qui est capable de s'hybrider sur l'amplicon
produit par
cette paire d'amorces à partir de l'acide nucléique d'un virus du groupe, ou
sous-
groupe, phylogénique variant de l'invention.
La présente demande est également relative à toute composition et plus
15 particulièrement à toute composition pharmaceutique ou biologique, qui
comprend
au moins une paires d'amorces et/ou au moins une sonde et/ou au moins un
système temps réel de l'invention.
La présente demande est également relative à un kit qui est spécialement
adapté
20 à la détection de HPIV2, plus particulièrement à son diagnostic, qui
comprend au
moins une paires d'amorces et/ou au moins une sonde et/ou au moins un système
temps réel de l'invention.
Un tel kit de diagnostic peut en outre comprend des moyens pour la détection
d'autres microorganismes, et notamment :
25 - des moyens pour la détection des HPIV2 qui ne font pas partie du groupe,
ou le
cas échéant sous-groupe, phylogénique variant de l'invention, tels que les
HPIV2
Greer, Toshiba, V98, et/ou
- des moyens pour la détection de HPIV autres que HPIV2, tels que HPIV1,
HPIV3,
HPIV4, et/ou
30 - des moyens pour la détection de microorganismes qui ne sont pas de HPIV,
tels
que des microorganismes, et plus particulièrement, des virus impliqués dans
des
affections ou infections respiratoires (systèmes respiratoires inférieurs
et/ou
supérieurs), telles que la pneumonie, la bronchiolite, la grippe.
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La présente demande est également relative à une méthode pour la détection,
plus
particulièrement pour le diagnostic, de HPIV2 qui comprend la mise en contact
d'un échantillon susceptible de contenir au moins un virus HPIV2, avec au
moins
une paire d'amorces et au moins une sonde de l'invention, dans des conditions
adaptées à une amplification temps réel, par exemple une PCR temps réel.
La détection de la présence d'un amplicon produit par cette paire d'amorces et
détecté par cette sonde est indicatif de la présence d'un virus HPIV2 faisant
partie
du groupe, ou le cas échéant sous-groupe, phylogénique de l'invention.
La présente demande est également relative à tout amplicon susceptible d'être
obtenu par amplification à l'aide d'une paire d'amorces de l'invention d'un
acide
nucléique d'un virus du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique
variant de l'invention.
Sondes, spécialement adaptées à une mise en ceuvre sur puce :
La présente demande décrit la sélection d'acides nucléiques qui sont
spécialement
adaptés à la construction et à la production de sondes, qui sont spécialement
adaptées à une mise en oruvre sur puce (acides nucléiques puces ci-dessus).
La présente demande est donc relative à une sonde qui est spécialement adaptée
à une mise en oeuvre sur puce, et qui est capable de s'hybrider à un acide
nucléique d'un ou plusieurs virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de
l'invention, sans s'hybrider à un acide nucléique des isolats HPIV2 Greer,
Toshiba,
V98.
De préférence, une telle sonde est un acide nucléique qui s'hydride en
conditions
de forte stringence à un acide nucléique d'un ou plusieurs virus du groupe ou
sous-groupe phylogénique de l'invention, sans s'hybrider à un acide nucléique
des
isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98, dans les mêmes conditions de forte
stringence.
Des conditions de forte stringence sont connues de la personne du métier, et
un
exemple de telles conditions a été décrit ci-dessus.
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Avantageusement, une telle sonde est telle que sa séquence est celle d'un
fragment d'un acide nucléique puce de l'invention, ou celle de la séquence qui
est
la complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment.
La présente demande est plus particulièrement relative à des sondes capables
de
s'hybrider à au moins l'un des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de
l'invention, sans s'hybrider au virus HPIV2 de souche Greer, caractérisée en
ce
que sa séquence est celle d'un sous-fragment (de 14 à 30, de préférence de 18
à
23 nucléotides) des fragments suivants :
- les fragments 241-420 de séquences codant F,
- les fragments 259-395 de séquences codant F,
- les fragments 181-480 de séquences codant HN,
- les fragments 234-443 de séquences codant HN,
- les fragments 1381-1716 de séquences codant HN,
- les fragments 1466-1673 de séquences codant HN,
- les séquences qui sont complémentaires de ces séquences sur toute la
longueur
de ces séquences.
Avantageusement, une telle sonde est choisie parmi les séquences de SEQ ID
NO : 99 à 117 (cf. tableau 11 ci-dessous).
La présente demande est également relative à tout support solide adapté à la
circulation d'un flux microfluidique, tel qu'une puce, qui comprend au moins
une
telle sonde.
De préférence, cette sonde est fixée sur le supportd e cette puce.
Cette puce peut être sous forme congelée, voire lyophilisée.
Des exemples de puces sont connus de la personne du métier. Des puces sont
par exemple décrites dans Korimbocus et al. 2005, Journal of Clinical
Microbiology
43(8) : 3779-3787, ou commercialisées par la société Affymetrix (Califormie,
USA).
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Dans la présente demande, le terme "comprenant", avec lequel "incluant" ou
"contenant" est synonyme, est un terme ouvert, et n'exclut pas la présence
d'un ou
plusieurs élément(s), ingrédient(s) ou étape(s) de méthode additionnel(s) qui
ne
5 serait(seraient) pas explicitement indiqué(s), tandis que le terme
"consistant" ou
"constitué" est un terme fermé, qui exclut la présence de tout autre élément
additionnel, étape, ou ingrédient qui ne serait pas explicitement exposé. Le
terme
"consistant essentiellement" ou " essentiellement constitué" est un terme
partiellement ouvert, qui n'exclut pas la présence d'un ou plusieurs
élément(s),
10 ingrédient(s) ou étape(s) additionnel(s), dans la mesure où ce(s)
élément(s),
ingrédient(s) ou étape(s) additionnel(s) n'affecte(nt) pas matériellement les
propriétés de base de l'invention.
Par conséquent, le terme "comprenant" (ou "comprend(comprennent)") inclut les
termes "consistant", "constitué", aussi bien que les termes "consistant
15 essentiellement" et " essentiellement constitué".
Le contenu des documents et références bibliographiques qui sont cités dans la
présente demande est incorporé par référence.
Les exemples qui suivent sont donnés à titre purement illustratif, ils ne
limitent
20 l'invention en aucune façon.
EXEMPLES
Matériels et Méthodes
25 Isolats variants de HPIV-2
Çinq isolats "atypiques" de HPIV-2 ont été isolés sur des cellules LLC-MK2 à
partir
d'échantillons respiratoires, d'aspirats nasaux ou de lavages broncho
alvéolaires
collectés sur quatre patients hospitalisés (cf. tableau 1 ci-dessous). Ces
patients
(un enfant et trois adultes) ont été admis pour hospitalisation du fait
d'infections.
30 respiratoires.
Cinq isolats ont été référencés sous la désignation isolats Lyon/18620/2001,
Lyon/20283/2001, Lyon/20435/2001, Lyon/26056/1997 et Lyon/26632/1997.
Dans la présente demande, ces isolats peuvent, par simplification, être
également
appelés 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement.
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Ces cinq isolats ont été déposés auprès de la C.N.C.M. aux fins du Traité de
Budapest (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ; C.N.C.M. ;
Institut Pasteur ; 25, rue du Docteur Roux ; F-75724 PARIS Cedex 15 ; France).
Tableau 1 :
isolat Numéro de dépôt C.N.C.M. Date de dépôt C.N.C.M.
18620 1-3763 10 mai 2007
20283 1-3764 10 mai 2007
20435 1-3765 10 mai 2007
26056 1-3761 10 mai 2007
26632 1-3762 10 mai 2007
Souches prototypes
La souche HPIV-2 Greer (Numéro ATCC VR-1381) a été isolée en 1955 (USA) sur
un enfant de 11 mois. Tous les essais ont été réalisés à partir d'un stock
congelé à
-80 C (10',5 TICD 50/50 L).
Culture virale
Pour l'isolement de virus, des cellules LLC-MK2 (cellules de rein de singe,
ATCC
CCL-7) ont été placées en culture dans des flacons à échantillons cylindriques
( shell-via/s , plaques à 24 puits). Les cellules ont été maintenues sur du
Milieu
Essentiel Minimum d'Eagle complémenté avec de la strypsine (2 (g/mL). Après
inoculation, les plaques ont été centrifugées (400 g pendant 30 min à 34 C),
les
milieux de cultures ont été renouvellés, et les plaques ont alors été placées
en
incubation à 34 C sous CO2 à 5%. L'effet cytopathique du virus a été contrôlé
régulièrement pendant 10 jours.
Test d'immunofluorescence (test d'IF)
Les tests d'IF ont été réalisés avec des anticorps monoclonaux spécifiques de
chacun des quatre types d'HPIV (anticorps monoclonal anti-HIPV1, anticorps
monoclonal anti-HPIV2, anticorps monoclonal anti-HPIV3 et anticorps monoclonal
anti-HPIV4). De tels anticorps peuvent être produits par la personne du
métier, ou
sont disponibles dans le commerce. Par exemple, un anticorps monoclonal
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spécifique du type HPIV4 est disponible auprès de Chemicon (Temecula,
California, USA) sous la référence mAb 8780 .
D'autres tests d'IF ont été réalisés avec des anticorps monoclonaux
spécificiques
de HPIV-2. Les anticorps monoclonaux anti-HPIV2 utilisés reconnaissent HN ou
une protéine de structure (protéines internes). De tels anticorps peuvent être
produits par la personne du métier, ou sont disponibles dans le commerce. Par
exemple, un anticorps monoclonal anti-HPIV2, qui cible la protéine HN de
HPIV2,
est disponible auprès de ARGENE S.A. (Parc Technologique Delta Sud
09120 Varilhes ; France) sous la référence 12E12G9.
Extraction et RT-PCR
L'ARN viral a été extrait à partir de 100 pL de surnageant de culture de
cellules
LLC-MK-2 avec le kit "Absolutely RNA Micropep" (Stratagene, USA) en suivant
les
instructions du fabricant. La transcription inverse a été réalisée en
utilisant
l'hexamère pd(N)6 aléatoire (Amersham Biosciences, Grande-Bretagne).
Brièvement, 5 pL de suspensions d'ARN précédemment extraits ont été placés en
incubation avec 1 pL de pd(N)6 (1 (g/pL). Un mélange de 4 pL de tampon AMV-RT
(Promega Corporation, USA), 7,5 pL d'eau stérile, 1 pL de dNTP (20 mM)
(Eurogentec, Belgique), 0,5 pL d'inhibiteur de Rnase (40 U/pL) (Promega
Corporation, USA), et 1 NL de transcriptase inverse AMV (10 U/pL) (Promega
Corporation, USA) ont été ensuite ajoutés. La transcription inverse a été
réalisée
par incubation à 37 C pendant 1 heure et stoppée par chauffage à 95 C pendant
5
minutes.
De sorte à obtenir les séquences complètes des gènes F et HN, les
amplifications
PCR ont été réalisées avec 6 paires d'amorces (présentées en Tableau 2 ci-
dessous) construites suivant la séquence nucléotidique de l'isolat HPIV-2
disponible, à savoir l'isolat HPIV-2 Greer .(numéro d'accession GenBank
NC_003443).
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Après optimisation des conditions PCR, l'amplification a été réalisée en
ajoutant 5
L d'ADNc précédemment synthétisé dans un tube contenant 45 L du mélange
PCR suivant : 24,5 L d'éau stérile, 5 L de tampon PCR (15 mM MgC12) (Applied
Biosystems, Roche, USA), 5 L de dNTP (20 mM), 5 L de chaque amorce (sens
et antisens) (20 pM) (Eurogentec, Belgique) et 0,5 L d'ADN polymérase Taq (5
U/ L) (Applied Biosystems, Roche, USA). La souche prototype HPIV-2 et l'eau
stérile ont été utilisées comme témoins positif et négatif, respectivement.
L'amplification a été réalisée en suivant le protocole suivant : 95 C pendant
5
minutes, suivi de 40 cycles (95 C pendant 30 secondes, 58 C pendant 30
secondes, 72 C pendant 1 minute et 30 secondes) et une étape d'élongation
finale
de 10 minutes à 72 C.
Séguencape
Les produits PCR ont été purifiés à l'aide du kit de purification GFX
(Amersham
Biosciences, Grande-Bretagne) en suivant les instructions du fabricant. Une
quantité de 20 ng/100 bp de chaque produit a été envoyée pour séquençage à la
Compagnie MWG Biotech (Ebersberg, Allemagne).
Analyse phylogénétipue
Les alignements ont été obtenus avec le programme ClustalX (http://www-igbmc.u-
strasbg.fr/Bioinfo/clustalX/Top.html). La matrice de distance a été calculée
sur
DNADIST du lot de programmes Phylip (version 3.64) (Felsenstein J., 1993,
PHYLIP Phylogeny Interference Package version 3.64, Département de
Génétique, Université de Washington, Seattle, USA). Les arbres phylogénétiques
ont été construits en utilisant l'algorithme du voisin le plus proche
(algorithme
"Neighbour-Joining" ou NJ, ou de Saitou et Nei) du programme NEIGHBOR du lot
de programmes Phylip. L'analyse "bootstrap" sur 1000 réplications a été
réalisée
en utilisant SEQBOOT et CONSENSE du lot de programmes Phylip. Les arbres
enracinés ont été édités avec le logiciel Njplot (IBCP, Lyon).
Prédiction de structure secondaire et analyse de modélisation moléculaire
Les structures secondaires ont été prédites avec le logiciel en ligne SECCONS.
(http://Seccons.pbil.ibcp.fr) (IBCP, Lyon, France) (Combet et al. 2000, Trends
Biochem Sci, 25:147-150). Ce logiciel donne la structure secondaire consensus
telle que déterminée par une unité de 8 logiciels différents de prédiction de
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structure secondaire. La modélisation moléculaire automatique a été réalisée
avec
le logiciel GEN43D (http://geno3D-pbil.ibcp.fr) (Combet et al. 2002,
Bioinformatics,
18:213-214) et l'interface graphique Rasmol (Rasmol molecular graphics,
version
2.7.1). Les domaines susceptibles de participer à des torsades d'hélice
("coiled-coil
5 domains") (HR1 et 2) ont été prédits à l'aide du logiciel Learncoil-VMF
(http://web.wi.mit.edu/kim) (Singh M et al. 1999, J. Mol. Biol., 290:1031-
1041).
Résultats
Isolement et identification des virus
10 Cinq souches ont été isolées à partir d'échantillons respiratoires,
d'aspirats nasaux
ou de lavages broncho alvéolaires collectés sur quatre patients hospitalisés.
Ces
cinq isolats ont été déposés auprès de la C.N.C.M. aux fins du Traité de
Budapest
(cf. tableau 1 ci-dessus).
Les 5 isolats ont une bonne croissance sur les lignées cellulaires LLC-MK2 et
ont
15 présenté un effet cytopathogène syncytial important apparaissant 3 à 7
jours après
l'infection. Les tests d'immunofluorescence en routine ont été aussi réalisés
sur les
5 échantillons en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques des 4 types
de
HPIV et d'autres pathogènes respiratoires. Tous ces tests ont donné des
résultats
négatifs. Les isolats de l'invention ne sont pas détectés par ces anticorps
anti-
20 HPIV de l'art antérieur.
Par contre, les isolats ont tous donnés un résultat HPIV-2 positif, lorsqu'ils
ont été
testés par RT-PCR spécifique d'HPIV. Les cinq isolats apparaissent donc comme
des isolats HPIV-2 "atypiques", par rapport à la souche de référence HPIV-2
Greer.
25 Réactivité avec les anticorps monoclonaux
Des tests d'immunofluorescence ont été réalisés sur les 5 isolats en utilisant
8
anticorps monoclonaux spécifiques de HPIV-2. Seuls les tests réalisés avec les
anticorps monoclonaux contre les protéines internes ont donné des résultats
positifs. Les tests d'immunofluorescence réalisés avec des anticorps
monoclonaux
30 dirigés contre l'hémagglutinine-neuraminidase de l'art antérieur ont donné
des
résultats négatifs (les résultats de ces tests d'immunofluorescence sont
présentés
en Tableau 3 ci-dessous). En tant que témoin positif, tous les anticorps
monoclonaux ont réàgi avec la souche HPIV-2 prototype Greer.
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Tableau 3:
Anticorps monoclonaux dirigés Anticorps
contre des protéines internes monoclonaux
dirigés contre
HN
6C10 6E7F 1B4 5E3 6D10 2B6 12E12 5C4
E4 3 G6 D7 F2 F7 B8F3 E8
H PI V-2 ++ ++ ++ ++ ++ + - -
Lyon/26056/1997
H P I V-2 + + ++ ++ ++ ++ - -
Lyon/26632/1997
H P I V-2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ - -
Lyon/18620/2001
HPIV-2 ++ ++ + + ++ + - -
Lyon/20283/2001
HPIV-2 + + + ++ ++ + - -
Lyon/20435/2001
H P I V-2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
Greer/1 955
Virus simien SV5 + + + ++ + + - -
- réaction négative
+ réaction positive
++ importante réaction positive
Caractérisation moléculaire
Après assemblage des différents fragments, les séquences nucléotidiques
consensus complètes des gènes F et HN ont été établies pour les isolats HPIV-2
Greer, 18620, 20283, 20435, 26056 et SV5, et la séquence nucléotidique
consensus complète du gène F a été établie pour l'isolat HPIV-2 26632.
En tant que témoin, la séquence nucléotidique consensus complète obtenue pour
la souche prototype (séquence nucléotidique SEQ ID NO : 45 ; séquence
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aminoacide SEQ ID NO : 46) a été comparée à la séquence équivalente disponible
sur la base de données GenBank/EMBL. Les deux séquences présentent un
pourcentage d'homologie de 99,9%. L'homologie est complète pour les protéines
F
et HN.
Tableau 4:
Type Souche Numéro
d'accession
Genbank
Greer/1955/(USA) NC_003443
Vanderbilt 9412-6 AF533010
(V94)/1994 (USA)
HPIV-2 Vanderbilt 9811-18 AF533011
(V98)/1998 (USA)
Lyon/18620/2001 DQ072586
(gènes F et HN ;
HPIV-2 de CDS F; protéine F;
l'invention CDS HN; protéine
HN)
Lyon/20283/2001 D0072587
(gènes F et HN ;
CDS F ; protéine F ;
CDS HN; protéine
HN)
Lyon/20435/2001 DQ072588
(gènes F et HN ;
CDS F ; protéine F ;
CDS HN ; protéine
HN)
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Lyon/26056/1997 DQ072589
(gènes F et HN ;
CDS F ; protéine F ;
CDS HN; protéine
HN)
Lyo n/26632/ 1997 D0072590
(gène F; CDS F ;
protéine F)
Le contenu correspondant aux numéros d'accesion Genbank DQ072586,
DQ072587, DQ072588, DQ072589, DQ072590 est reproduit ci-après en partie
description de séquences .
Les séquences nucléotidiques du gène F des isolats HPIV-2 "atypiques" ont été
comparées à leur contrepartie dans la souche prototype. L'alignement obtenu
met
en évidence 57 changements communs à l'ensemble des isolats HPIV-2
"atypiques" sur un total de 1656 nucléotides (3,4%). Ces différences communes
représentent la grande majorité (85%) des différences observées. Ces
changements conduisent à 11 substitutions d'aminoacides (cf. description de
figures 4 et 7), c'est-à-dire 2% de substitutions.
Les séquences nucléotidiques du gène HN des virus HPIV-2 "atypiques" ont aussi
été comparées avec la souche de référence. Ainsi, 79 changements communs à
l'ensemble des virus "atypiques" ont été mis en évidence sur un total de 1716
nucléotides (4,6%). Ces différences communes représentent aussi la majorité
des
différences observées (80%). Ces changements conduisent à 20 changements
communs (cf. description de figure 8), c'est-à-dire 3,8% de substitutions.
Protéine d'attachement HN
L'analyse des sites de glycosylation potentiel (N-X-S/T) dans le gène HN
montre
que l'ensemble des 5 variants HPIV-2 ont en commun une substitution S316N
responsable de l'apparition d'un nouveau site de glycosylation qui est absent
dans
la souche prototype. Les principales différences entre les variants et la
souche
prototype ont été observées dans la partie carboxy-terminale de la protéine.
Les modèles tridimensionnels des protéines HN de la souche HPIV-2 Greer et des
' isolats "atypiques", construits sur des homologies structurelles,
présentent' une
similarité très forte. L'organisation en 6 couches caractéristiques de la
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neuraminidase a été observée (cf. figure 1). Par analogie avec les structures
connues des protéines HN de NDV, SV5 et HPIV-3, la position et la conformation
du site catalytique semblent être identiques entre les différents isolats HPIV-
2. Les
modèles obtenus permettent de constater que le site de glycosylation, qui est
seulement présent chez les isolats variants "atypiques" de HPIV-2, est
localisé
dans une boucle dirigée vers l'extérieur de la protéine. La substitution S316N
ne
semble pas changer la structure de cette boucle. Les acides aminés qui
constituent le pic hydrophobe précédemment décrit sur la souche de référence
HPIV-2 Greer (positions 512-515) forment une boucle qui est dirigée vers
l'intérieur
de la protéine (cf. boucle signalée par A dans le modèle de gauche de la
figure 1),
ce qui n'est pas le cas pour les isolats variants "atypiques" de HPIV-2 (cf.
boucle
signalée par A' dans le modèle de droite de la figure 1).
Protéine de fusion F
L'alignement des 20 acides aminés qui constituent le peptide de fusion de
Paramyxovirus présente une différence d'un acide aminé entre les isolats
variants
HPIV-2 et la souche prototype (figure 2). Le peptide de fusion des souches V94
et
V98 est similaire au peptide de fusion des virus HPIV-2 "atypiques" et au
peptide
de fusion de la souche HPIV-2 prototype, respectivement (figures 2 et 4).
Les alignements d'autres domaines structurellement significatifs (HR1 et 2, TM
et
CS, figure 4) des isolats HPIV-2 ne présentent aucune différence importante,
exception faite des domaines CS et HR1. Dans les isolats Greer et V98, le site
de
clivage est KTRQER (SEQ ID NO : 13) ou KTRQKR (SEQ ID NO : 118), au lieu de
KPRRER (SEQ ID NO : 14) pour les autres isolats.
Analyse ghylociénétigue
Les séquences nucléotidiques des gènes F et HN des isolats HPIV-2 atypiques de
la souche prototype HPIV-2 Greer et de SV5, ont été alignées avec leurs
contreparties disponibles dans la base de données GenBank. Cette analyse
montre un diagramme d'évolution similaire pour les protéines F et HN montrant
que l'évolution des protéines F et HN des virus atypiques divergent de celles
de la
souche prototype, formant ainsi deux groupes (ou groupements) distincts. Selon
la
topologie des branches internes, les deux arbres présentent le même profil
d'évolution (figure 3). Les protéines d'enveloppe de deux souches HPIV-2
provenant des Etats-Unis correspondent bien également à cette évolution
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divergente, chaque souche étant présente dans un des deux groupements (figure
3).
Discussion
5 L'objectif de cette étude est de caractériser des isolats HPIV-2 cliniques
qui
présentent une réactivité antigène atypique vis-à-vis des anticorps
monoclonaux
utilisés pour le diagnostic. Pour ce qui concerne les virus HPIV-2, quelques
rares
études, déjà anciennes, ont mis en évidence une variation antigénique entre
les
isolats (Numazaki Y et ai. 1968, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 127 :992-996 ; Ray
et
10 a/. 1992, Virus Res. 24:107-113). Mais le lien entre la variation
antigénique et la
variation génétique n'avait pas jusqu'alors été analysé.
Les protéines F et HN des virus HPIV-2 "atypiques" présentent un pourcentage
marqué de substitutions par rapport à la souche prototype : 2% pour le gène F
et
3,8% pour le gène HN. Par comparaison, un variant HPIV-3, décrit en 1995,
15 présentait au niveau de la protéine HN seulement 4 substitutions d'acides
aminés
dont 2 au niveau de sites antigéniques connus (0,7% de substitution). La
position
des sites antigéniques n'a pas encore été déterminée pour HPIV-2, mais il
serait
surprenant qu'aucune des 22 substitution d'acides aminés observées sur le gène
HN des virus HPIV-2 "atypiques" ne soient localisée dans des sites
antigéniques.
20 Hémagglutinine-neuramidase
Parmi les substitutions observées, la substitution S316N est à l'origine d'un
nouveau site potentiel de glycosylation qui est absent dans la protéine HN de
la
souche prototype HPIV-2. Les modèles tridimensionnels de la protéine HN
montrent que ce site est localisé dans une boucle qui est dirigée vers
l'extérieur de
25 la protéine, c'est-à-dire une zone exposée qui pourrait correspondre à un
site
antigénique. Une glycosylation est susceptible de masquer un épitope et
pourrait
expliquer l'absence de réaction avec certains anticorps. Les autres sites
potentiels
de glycosylation restent inchangés.
Les différences observées dans la structure primaire de la protéine HN des
isolats
30 atypiques ont potentiellement des conséquences sur la structure secondaire
dans
la partie carboxy-terminale de la protéine. Les résultats présentés, qui ne
sont pour
l'instant que des prédictions, ne mettent en évidence aucun changement
structurel
significatif, en particulier à la surface de la protéine ou au niveau du site
catalytique. Toutefois, ces changements mineurs de structure sans perturbation
de
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la fonction pourraient être responsables de la disparition d'épitopes
conformationnels.
Protéine de fusion
L'analyse des peptides de fusion des isolats HPIV-2 "atypiques" montre
l'existence
d'une différence d'un acide aminé par rapport à la protéine F de la souche
prototype. Le domaine hydrophobe constitué par le peptide de fusion est
présenté
comme étant la zone la plus préservée de la protéine F au sein de la famille
des
Paramyxoviridae. Ceci suggère que sa structure et sa fonction sont soumises à
une pression de sélection plus intense que les autres domaines de la protéine.
L'analyse des changements spécifiques conservatifs et non conservatifs qui a
été
réalisée pour SV5 et NDV a montré que la séquence peptidique est importante
pour l'activité de fusion (Horvath CM 1992, Sergel TA et al., 2001). La
différence
d'un acide aminé que nous observons entre les virus "atypiques" et la souche
prototype du même type ne semble donc pas être négligeable. Il a été montré
que
des changements qui augmentent l'hydrophobicité du peptide de fusion,
favorisant
ainsi les interactions avec les lipides de la membrane cellulaire avait pour
conséquence une augmentation de la formation des structures syncytiales. Dans
le
cas présent, la substitution d'une valine par une isoleucine ne modifie
pratiquement
pas l'hydrophobicité. Cette substitution rapproche les peptides des virus
"atypiques" et du SV5, un virus dont l'effet cytopathogène sous la forme de
structure syncytiale sont similaires. Cependant, la corrélation entre la
substitution
observée et une fusion plus significative n'est pas encore établie.
Les isolats variants HPIV-2 possèdent un site de clivage plus basique que la
souche prototype. Ceci pourrait aussi expliquer la différence en terme
d'activité de
fusion. Dans le cas de NDV (gène F) et d'Influenza (gène HA), l'importance du
site
de clivage pour la virulence virale et la pathogénicité a été étudiée. Des
souches
qui présentent des résidus multibasiques au niveau du site de clivage sont
virulentes et se disséminent facilement au sein de l'hôte. Chez certaines
souches
d'influenza non-pathogènes, il a été montré que des substitutions Arginine ou
Lysine au niveau du site de clivage du gène HA, aux positions 5 ou 6,
conduisent à
l'acquisition d'une pathogénicité. De plus amples analyses seront réalisées
pour
déterminer la relation entre la basicité du site de clivage, l'activité de
fusion et la
virulence des isolats variants "atypiques" de HPIV-2:
Analyse phylogénétique
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Les analyses phylogénétiques suggèrent deux groupes distincts ("clusters") au
sein de HPIV-2, chaque groupe ayant des propriétés antigéniques différentes.
A la connaissance des inventeurs, c'est la première fois que des analyses
phylogénétiques basées-sur les gènes F et HN des séquences HPIV-2 sont
réalisées en parallèle. Les deux arbres phylogénétiques (figure 3) présentent
une
très forte similarité en terme de topologie, même si la protéine HN semble
évoluer
sensiblement plus rapidement que la protéine F. La co-évolution des deux
glycoprotéines de HPIV-2 pourrait être expliquée par une exposition
équivalente à
la pression de sélection, une pression qui est plus marquée que pour les
autres
protéines de structure.
Le diagnostic en laboratoire de HPIV est communément réalisé par isolement
conventionnel en culture cellulaire, centrifugation de la culture dans des
flacons
cylindriques et marquage par immunofluorescence (coloration directe des
échantillons rhino-pharyngiens). Les données de séquençage démontrent
clairement la présence de souches HPIV-2 nouvelles non encore décrites. On ne
sait pas encore si ces variants que nous venons d'isoler sont prédominants au
sein
de la population des patients. Des études de séquençage sont en cours pour
analyser les variations des gènes F et HN dans d'autres isolats clinique de
HPIV-2
disponibles au sein de notre laboratoire, notamment pour déterminer si des
variants de HPIV-2 viennent d'émerger,
Une surveillance virale continue est importante pour surveiller les
changements
antigéniques qui peuvent se produire dans la nature, plus particulièrement par
rapport à la sélection de souches pour un développement vaccinal ainsi que
pour
la réalisation d'essais diagnostics mis à jour.
