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LAPINS TRANSGENIQUES PRODUCTEURS DE FACTEUR VII HUMAIN
La présente invention se rapporte à la production de facteur VII humain
recombinant dans le lait de lapines transgéniques.
Le facteur VII est une protéine plasmatique impliquée dans le processus
de la coagulation sanguine, et notamment dans l'initiation de la voie
extrinsèque de
coagulation. Le facteur VII, qui est une glycoprotéine vitamine K-dépendante,
est
synthétisé dans le foie sous forme d'un précurseur de 466 acides aminés
comprenant un
peptide signal (résidus 1-20) et un propeptide (résidus 21-60). Le facteur VII
circulant dans
le plasma sanguin est un zymogène (ou proenzyme) constitué d'une chaîne
peptidique de
53kDa contenant 406 résidus. Il résulte de plusieurs modifications post-
traductionnelles :
le clivage du peptide signal et du propeptide, la gamma-carboxylation des dix
premiers
acides glutamiques N-terminaux en position 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 et
35, la (3-
hydroxylation partielle de l'acide aspartique en position 63, la 0-
glycosylation des sérines
en position 52 et 60, respectivement par un motif glucose(xylose)0_2 et par un
motif fucose,
et la N-glycosylation des asparagines en position 145 et 322 par des
structures complexes,
majoritairement bi-antennées et sialylées. Le facteur VII est activé en
facteur Vila par
clivage protéolytique entre l'arginine en position 152 et l'isoleucine en
position 153 : le
facteur Vila est composé d'une chaîne légère de 152 acides aminés dérivée de
l'extrémité
N-terminale d'une masse moléculaire d'environ 20 kDa et d'une chaîne lourde de
254
acides aminés dérivée de l'extrémité C-terminale d'une masse moléculaire
d'environ 30
kDa, qui sont liées entre elles de manière covalente par un pont disulfure
entre les
cystéines en position 135 et 262.
Le facteur VII circulant peut se complexer avec le facteur tissulaire (FT)
produit par les fibroblastes sous-endothéliaux, lorsque celui-ci est libéré à
l'occasion d'une
brèche dans l'endothélium vasculaire. La formation de ce complexe s'accompagne
de
l'activation du facteur VII en facteur VIla. Le complexe TF-VIIa active les
facteurs IX et
X, entraînant la formation des facteurs IXa et Xa, qui activent à leur tour la
conversion de
la prothrombine en thrombine, qui permet la conversion du fibrinogène en
fibrine,
aboutissant à la formation du caillot.
Le facteur VIT/VIIa est utilisé depuis de nombreuses années pour traiter
des patients présentant différents troubles de l'hémostase (à titre d'exemple
on citera
l'hémophilie de type A qui correspond à un déficit en facteur VIII,
l'hémophilie de type B
qui correspond à un déficit en facteur IX, ou des déficits héréditaires en
facteur VII/VIIa),
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ainsi que des accidents hémorragiques d'origines diverses comme par exemple
les
accidents vasculaires cérébraux, ou les traumatismes hémorragiques.
Initialement, les préparations de facteur VII utilisées ont été obtenues à
partir de plasmas humains. Cependant, du fait des difficultés de purification,
des risques
sanitaires associés à l'utilisation de produits dérivés du sang, et de la
limitation des
approvisionnements en plasma humain on leur préfère actuellement des
préparations de
facteur VII recombinant, produit par des cellules de mammifères transformées
pour
exprimer le facteur VII humain, comme décrit par exemple dans la Demande EP
0 200 421.
Une alternative à la production de protéines d'intérêt thérapeutique par
des cultures de cellules transformées, est leur production par des animaux
transgéniques, et
notamment dans le lait de ceux-ci. Cette approche présente théoriquement de
nombreux
avantages, et notamment un rendement plus élevé, un coût de production plus
faible que la
production en cultures de cellules, et une montée en puissance de la
production plus aisée
et plus flexible au niveau industriel. Cependant, bien que la possibilité de
produire dans du
lait de souris transgénique une protéine recombinante, l'inhibiteur de
plasininogène (tPA),
possédant des propriétés biologiques similaires à celles de la protéine
humaine native ait
été démontrée il y a de nombreuses années (Gordon et al. Bio Technol, 5, 1183-
7, 1987),
le nombre de protéines qui ont pu être produites avec succès dans le lait
d'animaux
transgéniques dans des conditions compatibles avec le développement et la
production
industrielle d'un médicament à usage humain demeure encore très limité. En
effet, de
nombreux facteurs, propres d'une part à la protéine d'intérêt à exprimer, et
d'autre part à
l'espèce hôte chez laquelle on souhaite l'exprimer, peuvent conditionner le
succès ou
l'échec pour une combinaison protéine d'intérêt/espèce hôte déterminée.
Parmi ces facteurs figure notamment la capacité de l'espèce hôte à
produire en quantité industrialisable, des protéines présentant des
modifications post-
traductionnelles similaires à celles de la protéine humaine native. Ce facteur
est
particulièrement critique si l'on envisage de produire sous forme recombinante
dans le lait
des protéines comme le facteur VII, dont les modifications post-
traductionnelles sont
multiples et variées (clivage du peptide signal et du propeptide, y-
carboxylation, (3-
hydroxylation, 0-glycosylation et N-glycosylation), et qui sont naturellement
produites
dans le foie. En effet, les cellules de la glande mammaire ont des capacités
de
modifications post-traductionnelles différentes de celles des cellules
hépatiques.
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Il a par exemple été observé que des souris transgéniques exprimant la
protéine C humaine dans leurs glandes mammaires ne pouvaient pas effectuer
correctement le clivage du propeptide et la y-carboxylation (Drohan et al..,
Transgenic
Res., 355-64, 1994). Des observations similaires ont été effectués chez des
porcs
transgéniques, pour la protéine C et pour le facteur IX (Lee et al., J
Biochem., 118, 81-7,
1995 ; Van Cott et al., Genet Anal., 15, 155-60, 1999).
D'autre part, la O-glycosylation et la N-glycosylation des protéines peut
varier, qualitativement et quantitativement selon l'espèce de mammifères
concernée. Ainsi,
les protéines humaines ne comportent pas de motif galactosyl galactose a(1-3)
galactose
(motif Galal-3Gal), du fait que le gène codant pour l'alpha 1,3
galactosyltransférase,
responsable de la synthèse de ce motif, est inactivé chez l'homme et les
singes de l'Ancien
Monde (Europe, Asie) alors qu'il est présent chez les autres mammifères.
Ce motif (également dénommé épitope a-Gal) est en conséquence très
immunogène chez l'homme (GALILI et al., Blood, 82(8) : 2485-2493, 1993). Une
protéine
humaine glycosylée produite sous forme recombinante chez des mammifères
possédant
une alpha 1,3 galactosyltransférase active est donc susceptible de porter une
quantité
importante de motifs Galal-3Gal et risque d'entrainer d'importantes réactions
immunitaires indésirables.
Or, les Inventeurs ont maintenant trouvé que, de façon surprenante, des
lapines transgéniques exprimant dans leurs glandes mammaires une séquence
codant pour
du facteur VII humain produisaient dans leur lait un facteur VII recombinant
correctement
clivé, et en outre ne contenant pas ou ne contenant que très peu de motifs
Galal-3 Gal.
La présente invention a en conséquence pour objet un lapin transgénique
exprimant un facteur VII humain dans son lait.
Un lapin transgénique conforme à l'invention contient dans son génome
une ou plusieurs copies d'un transgène comprenant un polynucléotide codant
pour un
facteur VII humain, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur
permettant son
expression spécifique dans les cellules des glandes mammaires dudit lapin.
On entend par transgène une construction d'acide nucléique insérée
de façon stable dans le génome d'un organisme hôte, qui se transmet à sa
descendance de
génération en génération. Dans le cas présent, le transgène permet
l'expression d'une
protéine d'intérêt (le facteur VII) dans le lait de l'animal-hôte
transgénique.
Des promoteurs permettant l'expression spécifique dans les cellules de la
glande mammaire du lapin sont connus en eux-mêmes. Il peut s'agir par exemple
des
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promoteurs de gènes de caséines ou de protéines sériques du lait : on citera
notamment les
promoteurs des caséines a, P, ou x, le promoteur de la (3-lactoglobine, le
promoteur de l'a-
lactalbumine, celui de la WAP (whey acidic protein), ou celui de la
lactoferrine. Il peut
s'agir d'un promoteur provenant du lapin, comme par exemple le promoteur de la
WAP
décrit dans la Demande EP0527063, ou d'un promoteur provenant d'une autre
espèce de
mammifère.
Le polynucléotide codant pour le facteur VII humain est de préférence un
ADNc, ou la portion codante (ORF) de celui-ci. Il peut s'agir de l'ADNc
naturel du facteur
VII, dont la séquence est connue en elle-même, et disponible sur les bases de
données, par
exemple sous le numéro d'accès M13232, ou d'une séquence codant pour un
variant de
facteur VII humain modifié notamment pour augmenter son activité et/ou
supprimer ses
effets indésirables ; à titre d'exemples on peut citer les variants décrits
dans la Demande
2008/0010693 ou celui décrit dans la publication de Sorensen et al. (Br. J.
Haematol.,
137(2) : 158-65, 2007).
On peut avantageusement utiliser une séquence d'ADN optimisée pour
l'expression dans les glandes mammaires de lapines. Une telle séquence peut
être obtenue
in silico par des techniques bien connues par l'homme de l'art, afin
d'éliminer les sites
cryptiques d'épissage, les séquences riches en A/T, déstabilisatrices des
ARNm, les sites
de polyadenylation ainsi que les boites TATA potentiellement parasites, et les
ilots CpG, et
d'optimiser les codons pour refléter les préférences des cellules de la glande
mammaire des
lapines pour produire les protéines du lait.
Avantageusement le transgène contient, outre le promoteur et la séquence
codant pour le facteur VII, d'autres éléments destinés à optimiser la
transcription et/ou la
traduction de la protéine recombinante. De tels éléments sont connus en eux-
mêmes de
l'homme de l'art (cf par exemple Houdebine et al., in: Carl A. Pinkert (ed),
Vector Design
for Transgene Expression Transgenic Animal Technology, 2nd edn, New York:
Academic
Press., 419-458, 2002).
Il peut s'agir notamment :
- d'un isolateur fort, placé en 5' du promoteur, garantissant un niveau
d'expression de la protéine dépendant du nombre de copies de transgène
intégrées et
indépendant du site d'intégration du transgène dans le génome de l'animal : on
citera par
exemple la région 5'HS4 du gène de la béta-globine de poulet (Taboit-Dameron
et
al., Transgenic. Res., 8 : 223-235, 1999; Rival-Gervier et al., Transgenic.
Res., 12 : 723-
730, 2003).
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- d'un ou plusieurs couples exon/intron pouvant contenir un /ou plusieurs
amplificateurs (enhancer) de transcription ou de traduction : à titre
d'exemples on peut
citer : les introns des gènes tardif et précoce du génome du virus SV40, le
premier intron
d'un gène de beta-globine, les introns du gène EF1 alpha, les introns du gène
de l'alpha-sl
5 caséine, les introns du gène WAP, les introns des gènes de l'hormone de
croissance
humaine et bovine ; les séquences enhancer peuvent notamment être choisies
parmi
celles présentes dans les séquences LTR du virus HTLV, ou du virus MMTV (virus
de la
tumeur mammaire murine), la séquence enhancer du gène des immunoglobines,
la
séquence enhancer du gène de l'alpha s-1 caséine, la séquence enhancer
de la béta-
globine. La séquence enhancer peut également être la région distale en
amont (jusqu'à
140 kpb) du gène WAP ou la région distale en aval (au moins 10 kpb) du gène
WAP, telles
qu'elles sont décrites par Rival-Gervier et al. (Mol. Reprod. Develop., 63 :
161-167, 2002),
dans la Demande EP 1 217 071
- un terminateur fort garantissant une terminaison efficace de la
transcription : à titre d'exemples, on citera les terminateurs des gènes
précoce ou tardif du
virus SV40, ceux des gènes de béta-globine, des gènes WAP, des gènes de
l'hormone de
croissance humaine ou bovine.
La transgénèse peut s'effectuer par les méthodes classiques connues en
elles-mêmes. Avantageusement, le transgène est introduit par microinjection
dans les
pronucléi d'embryons fécondés qui sont ensuite réimplantés chez des femelles
porteuses.
L'obtention des animaux transgéniques est également possible par clonage par
transfert de
noyau suivi par transfert d'embryon dans des femelles receveuses.
La présente invention a également pour objet le lait produit par les
lapines transgéniques conformes à l'invention, et l'utilisation de ce lait en
tant que matière
première pour la purification de facteur VII humain recombinant.
Le facteur VII humain recombinant peut être purifié à partir de ce lait par
des méthodes connues en elles-mêmes, par exemple comme décrit dans le Brevet
US
6268487.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de
description qui va suivre qui se réfère à des exemples non-limitatifs
décrivant l'obtention
de lapines transgéniques exprimant le facteur VII dans leur lait.
EXEMPLE 1: CONSTRUCTION D'UN VECTEUR DE TRANSGENESE
CONTENANT LA SEQUENCE CODANT POUR LE FACTEUR VII HUMAIN.
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Clonage de l'ADNc du facteur VII par PCR dans un vecteur intermédiaire
Une séquence d'ADN codant pour le facteur VII humain, bordée des
sites de restrictions uniques Mlul en position 5' et NheI en position 3', a
été synthétisée et
clonée dans un vecteur plasmidique dérivé du plasmide pUc, contenant le gène
de
résistance à l'ampicilline ainsi que l'origine de réplication bactérienne Col
El.
Vecteur de transgénèse
Le vecteur de transgénèse utilisé pour le clonage est dérivé du plasmide
pPolyllI, possédant un gène de résistance à l'ampicilline ainsi que l'origine
de réplication
bactérienne Col El. Ce vecteur de transgénèse contient une cassette
d'expression
comprenant : un dimère de la séquence de l'isolateur 5'HS4 du gène de la béta-
globine de
poulet (Genbank U78775) (Recillas-Targa et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 10 :
6883-6888,
2002) en amont du promoteur WAP (whey acidic protein ; Genbank X52564) de
lapin de
6,3 kpb (Rival-Gervier et al., Transgenic Res., 6 :723-730, 2003), le premier
intron du
gène de beta-globine de lapin (Genbank V00882) contenant un amplificateur de
transcription ; un second amplificateur de transcription (SUR 1.2.3) contenant
la séquence
5'UTR des gènes précoces de SV40 fusionnée avec la région R et le début de la
région U5
de HTLV-1 (Attal et al.. FEBS Lett. , 392, 220-224, 1996); un troisième
amplificateur de
transcription (Ig 2), dérivé de la région mu de la chaîne lourde d'IgG de
souris (Genbank
J00440) (Gillies et al.. Cell 33, 717-728, 1983) et le terminateur de
transcription de
l'hormone de croissance humaine (Genbank M13438). Cette cassette contient un
site MluI
et un site NheI localisés entre le second et le troisième amplificateur de
transcription ; elle
est flanquée de part et d'autres de sites Notl permettant l'excision des
séquences du
plasmide pPolyllI.
L'insert d'ADN codant pour le facteur VII, récupéré par digestion
Mlul/NheI à partir du vecteur intermédiaire a été inséré entre les sites Mlul
et NheI de la
cassette d'expression.
Le vecteur de transgénèse résultant est représenté sur la Figure 1. Il
contient un insert qui est constitué dans son orientation 5' vers 3' par i) le
dimère de la
séquence de l'isolateur 5'HS4 du gène de la béta-globine de poulet, ii) le
promoteur WAP
(whey acidic protein) de lapin de 6,3 kpb, iii) l'intron contenant le premier
amplificateur
de transcription, iv) le second amplificateur de transcription, v) l'ADNc du
facteur VII
humain, vi) le troisième amplificateur de transcription, et vii) le
terminateur de
transcription.
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Comme précédemment, les colonies contenant le vecteur recombinant
sont sélectionnées sur la base de leur résistance à l'ampicilline, puis la
présence de l'insert
est contrôlée par analyse des fragments de restrictions, puis par séquençage.
EXEMPLE 2: PRODUCTION DE LAPINES TRANSGENIQUES EXPRIMANT LE
FACTEUR VII HUMAIN DANS LEURS GLANDES MAMMAIRES
Les lapines transgéniques ont été obtenues par la technique classique de
micro-injection (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82 : 4438-4442,
1985).
Préparation des inserts pour la transgenèse
Le vecteur de transgènese contenant la séquence codant pour le facteur
VII recombinant a été digéré par l'enzyme de restriction Notl et l'insert
contenant le
transgène a été isolé sur gel d'agarose puis purifié sur ElutipD (Schleicher-
Schuell,
Ecquevilly, France) conformément aux instructions du fabricant, précipité à
l'éthanol puis
repris dans un tampon 10 mM Tris-HCI, 0.1 mM EDTA, pH 7.4.
Préparation des lapines donneuses et receveuses
Des lapines Néo-zélandaises donneuses d'embryons, âgées de 16-30
semaines, sont traitées de manière sous-cutanée pendant 3 jours par de la FSH
porcine
(Follicular Stimulating Hormone) pour stimuler le développement folliculaire.
Au
troisième jour, les lapines reçoivent une injection intraveineuse d'hormone
hCG (human
Choroidic Hormone), puis les femelles sont accouplées.
Les lapines receveuses sont âgées de 18-20 semaines. Une
pseudogestation synchronisée est induite soit en gardant les femelles une
semaine en cycle
de jours longs (16 h de lumière) avant de les accoupler avec des mâles
vasectomisés, soit
par un traitement hormonal (superovulation FSH/LH).
Micro-injection des oocytes prélevés et implantation
Au 4ème jour, 18-19h après l'accouplement, les embryons sont prélevés
sur les lapines donneuses pour procéder à la micro-injection d'ADN : la micro-
injection
d'ADN se déroule juste après les prélèvements (15-25 h après l'accouplement).
Les
embryons au stade une cellule sont placés dans une micro-goutte de milieu sous
un
microscope inversé équipé d'objectifs Normarsky et de micro-manipulateurs. Des
embryons individuels sont positionnés et sécurisés en utilisant une pipette.
Le transgène
dilué à une concentration pouvant varier de ing/ l à 6ng/ l, dans du tampon 10
mM Tris-
HCI, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 est micro-injecté préférentiellement dans le
pronucléus mâle
de l'embryon à l'aide d'une pipette d'injection.
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Suite à la micro-injection, les embryons sont maintenus en culture in
vitro pendant 1 à 5 h (35 à 40 C, 3 à 7% C02 dans l'air). La qualité des
embryons micro-
injectés est alors rapidement évaluée sous stéréomicroscope. Les embryons
unicellulaires
intacts sont alors réimplantés sous anesthésie générale dans le lumen des
oviductes des
lapines receveuses synchronisées (10 embryons dans chaque oviducte), en
utilisant une
procédure chirurgicale (les oviductes sont extériorisés par laparotomie). La
parturition peut
intervenir naturellement 29-31 jours après le transfert d'embryons. Si
nécessaire, on
procède au déclenchement par injection d'ocytocine le 31ème jour. Le nombre de
lapereaux nés par rapport au nombre d'embryons réimplantés est de l'ordre 5 à
20%.
EXEMPLE 3: SELECTION ET CARACTERISATION DES LAPINS
TRANSGENIQUES
Pendant le processus d'embryogenèse, l'ADN recombinant micro-injecté
intègre le génome de manière aléatoire. Les lapins nouveau-nés (10 jours) sont
testés pour
la présence du transgène par une biopsie de l'oreille. L'ADN génomique est
extrait et une
analyse PCR (Polymerase Chain Reaction) est réalisée en utilisant des amorces
spécifiques
de l'insert recombinant.
Les lapins pour lesquels le transgène a été mis en évidence sont appelés
"Fondateurs F0".
Les lignées des fondateurs FO ont été en outre caractérisées par i) analyse
du nombre de copies de transgène intégrées dans leur génome, et ii)
détermination du
nombre de sites d'intégration.
Le nombre de copies du transgène intégrées dans le génome de chaque
lignée de fondateur FO a été déterminé par PCR quantitative et par transfert
de Southern.
Ce nombre varie, selon la lignée, de 1 copie par cellule à plus de 200 copies
par cellule
Le nombre de sites d'intégration a également été déterminé par transfert
de Southern. Ce nombre varie, selon la lignée, de 1 à plus de 5 sites par
génome.
EXEMPLE 4: EVALUATION DE L'EXPRESSION DE FACTEUR VII HUMAIN
RECOMBINANT DANS LE LAIT DES LAPINES TRANSGENIQUES
Les lapins FO matures sexuellement (4 mois pour les femelles, 5 mois
pour les mâles) ont été croisés avec des animaux non-transgéniques par
insémination
artificielle afin d'obtenir des descendants F1 hémizygotes, et le niveau
d'expression du
facteur VII humain dans le lait a été évalué pour différentes lignées de
fondateurs FO et de
descendants F1.
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Pour ce faire, un échantillon de lait provenant de chacune des femelles
FO et F1 sélectionnées a été centrifugé à 5000 x g pendant 20 minutes à 4 C
afin de séparer
les composés du lait des matières grasses. Un échantillon de lait écrémé a été
dilué dans un
tampon Laemmli, porté à ébullition pendant 5 minutes, puis séparé par
électrophorèse en
gel SDS-PAGE. Les protéines ont alors été transférées sur membranes PVDF, puis
une
analyse par Western blot a été réalisée en utilisant un anticorps anti-facteur
VII humain. La
détection a été effectuée par chimioluminescence (Amersham Biosciences) afin
de
déterminer la concentration en facteur VII humain pour chacun des laits
obtenus. Un
niveau d'expression du facteur VII variant entre 90 gg/ml et 11 mg/ml a été
observé.
L'influence du nombre de copies du transgène sur le niveau d'expression
a également été recherchée. Les résultats sont illustrés par la Figure 2, et
montrent une
corrélation entre le nombre de copies de transgène et le niveau d'expression
du facteur VII
dans le lait des animaux transgéniques
