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DISPOSITIF ET PROCEDE POUR LA FORMATION DE MICRO DEPOTS
La présente invention concerne l'analyse d'échantillons, et en particulier des
méthodes et
appareils pour la formation de multiples micro-dépôts sur des surfaces à
partir d'un échantillon.
L'invention concerne plus spécifiquement un dispositif pour la formation de
microdépôts d'un
échantillon liquide, comprenant une pluralité de réservoirs et d'aiguilles,
assurant la formation
commandée et régulière de microdépôts selon un dessin défini.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
La possibilité de réaliser plusieurs centaines d'analyses multiplexées d'un
même
échantillon, en utilisant des micro-dépôts de réactifs sur des surfaces
planes, est aujourd'hui
largement démontrée. L'analyse de l'expression génétique d'un même échantillon
fait notamment
appel aux micro-dépôts de séquences nucléotidiques. Des micro-dépôts
d'antigènes servent
également à mettre en évidence les anticorps de sujets en situation
d'infection ou de vaccination
dans le domaine de l'immunochimie.
L'analyse multiplexée d'échantillons est actuellement cantonnée au domaine de
la
recherche en raison du coût et de la lenteur des procédés de micro dépôt.
Cependant, une telle
analyse multiplexée présente de nombreuses applications dans le domaine du
diagnostic. Il est
notamment utile de pouvoir soumettre un prélèvement à plusieurs réactifs. En
outre, un même
réactif doit fréquemment être appliqué sur un grand nombre de prélèvements
distincts.
Des techniques de dépôt ont été conçues pour la formation de puces à ADN. Une
puce
ADN est une petite plaque en verre, en silicium ou en plastique, sur laquelle
sont déposées des
séquences nucléiques qui sont caractéristiques de certains gènes et qui, dans
un mélange de
molécules, en s'appariant avec des séquences nucléiques complémentaires,
permettent de
détecter la présence des mêmes gènes dans des cellules soumises à l'analyse.
Cependant, en raison de leur coût trop élevé et de leur faible cadence de
réalisation, ces
techniques ne sont pas transposables pour des applications de diagnostic à
grande échelle.
Un appareil pour la fabrication de puces à ADN a été par exemple décrit dans
la
demande de brevet EP 1618948. Cet appareil comprend un plateau avec des
substrats, des
moyens pour stocker une solution et des moyens pour prélever la solution et la
déposer sur ces
substrats. Ce document ne décrit pas un appareil comprenant une pluralité de
réservoirs et
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d'aiguilles ainsi qu'un dispositif de montée-descente permettant une
pénétration des aiguilles
dans les puits selon la direction perpendiculaire, pour la formation de
microdépôts d'un
échantillon liquide.
D'autres machines de formation de micro dépôts sont connues pour réaliser les
puces
ADN. Ces machines sont conçues pour former des points de dépôts ou points
d'échantillon sur
des lames de microscope. On dépose sur un plateau un certain nombre de lames
de verre au
format du microscope (25 x 75 mm). Les solutions à déposer sont contenues dans
une plaque à
alvéoles formant un réservoir. Une tête de dépôt aspire les solutions dans la
plaque à alvéoles.
La tête de dépôt se déplace au dessus des lames pour y déverser les solutions
et est entraînée
par une mécanique X. Y. Z. très précise.
Ces machines sont optimisées pour réaliser un grand nombre de dépôts
différents sur un
nombre réduit de lames. Toutefois, il y a un grand gaspillage des solutions à
déposer car la
fréquence de réutilisation de la tête de dépôt implique de nombreux rinçages.
De plus, ces
machines sont incapables de former des dépôts sur des plaques de diagnostic.
Le standard des
plaques de diagnostic comprend 96 puits répartis sur huit lignes et 12
colonnes avec un pas de 9
mm et une profondeur de 8 mm qui rend impossible la mise en place de dépôts
avec les
machines actuelles.
En particulier, la société Genetic Microsystems fabrique une machine de dépôt
sous la
référence Arrayer 417. Cette machine utilise une technologie du type pin and
ring . Seule cette
technologie permet actuellement de réaliser des dépôts à partir de suspensions
bactériennes
sans colmatage. Elle a donné lieu au brevet US 6,269,846 portant sur le
guidage de l'aiguille.
On constate en pratique que la taille des dépôts est variable en fonction de
la position de
la lame. Par ailleurs, la décantation et l'évaporation de la solution à
déposer ne sont pas
maîtrisées, ce qui entraîne la variation de sa concentration. Cette machine
effectue des lavages
répétés de la tête de dépôt, ce qui induit en pratique une perte de l'ordre de
95 % de la solution à
déposer.
L'invention vise à résoudre un ou plusieurs de ces inconvénients. L'invention
fournit en
effet des procédés et appareils permettant de réaliser des micro-dépôts d'un
échantillon sur un
support adapté, de manière stable, reproductible et fiable. L'invention permet
notamment de
réaliser de grandes séries de micro-dépôts et est applicable à tout type
d'échantillon.
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RESUME DE L'INVENTION
La présente invention concerne un dispositif pour la formation de microdépôts
d'un
échantillon liquide sur un support (ou sur une surface), comprenant une
pluralité de réservoirs et
d'aiguilles.
Plus particulièrement, l'invention porte sur un dispositif pour la formation
de microdépôts
d'un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend :
- un réservoir destiné à recevoir un échantillon liquide à déposer, le fond du
réservoir étant
pourvu d'un trou débouchant, le trou étant dimensionné pour maintenir
l'échantillon dans le
réservoir par capillarité ;
- une aiguille présentant une pointe montée mobile jusqu'à une position où
elle traverse le
trou pour faire saillie à l'extérieur du réservoir et entraîner une fraction
de l'échantillon hors
du réservoir; et
- un organe de commande commandant le déplacement de la pointe jusqu'à ladite
position.
L'invention concerne avantageusement un dispositif pour la formation de
microdépôts d'un
échantillon liquide sur un support, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une pluralité de réservoirs (11) destinés à recevoir un échantillon liquide
(12) à déposer, le
fond de chaque réservoir étant pourvu d'un trou débouchant, le trou étant
dimensionné pour
maintenir l'échantillon dans le réservoir par capillarité ;
- une pluralité d'aiguilles (3), chaque aiguille étant associée à un réservoir
et présentant une
pointe (34) montée mobile jusqu'à une position où elle traverse le trou pour
faire saillie à
l'extérieur de son réservoir associé (11) et entraîner une fraction de
l'échantillon hors du
réservoir ; et
- un organe de commande (5-), commandant le déplacement de la pointe jusqu'à
ladite
position.
Selon une variante particulièrement préférée, le dispositif comprend en outre
- un support (91) (par exemple une plaque) dans lequel des puits (92) sont
ménagés ; et
- l'organe de commande comprend un dispositif de montée-descente permettant
une
pénétration des aiguilles dans les puits (92) ;
ladite pluralité d'aiguilles et le support (91) étant assujettis à des
mouvements relatifs
perpendiculaires.
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Dans un mode tout préféré du dispositif de l'invention, ladite pluralité de
réservoirs et
d'aiguilles est disposée de manière à reproduire le dessin des microdépôts à
effectuer, lors du
déplacement du support ou de la pluralité d'aiguilles.
Dans des modes de réalisation préférés, le dispositif de l'invention comporte
en outre une ou
plusieurs des caractéristiques suivantes :
- la pointe (34) est montée mobile entre une position où elle est logée à
l'intérieur du
réservoir et ladite position où elle fait saillie à l'extérieur du réservoir ;
- le trou est de forme circulaire et présente un diamètre compris entre 0,3 et
0,6 mm
- la pointe (34) présente un diamètre compris entre 0,10 mm et 0,3 mm ;
- la pointe présente plusieurs parties successives de sections croissantes en
partant de
l'extrémité libre de la pointe (34) ;
- le réservoir (11) présente une contenance comprise entre 5 et 100
microlitres, de
préférence entre 5 et 50 microlitres ;
- le réservoir présente un alésage cylindrique dans sa partie supérieure (13),
et un
alésage conique dans sa partie inférieure (14) joignant l'alésage cylindrique
au trou
débouchant;
- la partie extérieure du réservoir entourant le trou débouchant est
recouverte d'un
revêtement hydrophobe ;
- le poids de l'aiguille (3) entraîne la pointe vers la position ou elle est
en saillie à
l'extérieur du réservoir, et l'organe de commande comprend un moteur (52) et
un levier
(53) actionné par le moteur entraînant l'aiguille vers la position où la
pointe (34) est
logée à l'intérieur du réservoir ;
- le dispositif comprend plusieurs réservoirs et aiguilles associés, les
réservoirs étant
séparés par un même pas. Le levier entraîne les pointes desdites aiguilles
vers la
position où ces pointes sont logées à l'intérieur de leurs réservoirs associés
- les réservoirs sont ménagés dans un même composant monobloc (1) ;
- le dispositif comprend un guide (2), et l'aiguille comprend un corps (32,33)
surplombant
et solidaire de la pointe, le corps étant guidé en translation par le guide
(2)
- le guide (2) est solidaire du réservoir (11) ;
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- le réservoir (11) présente une paroi extérieure de forme cylindrique vissée
dans un
alésage inférieur du guide (2) ;
- le guide forme un épaulement (23) en saillie radialement au-delà de la paroi
extérieure
du réservoir (11) ;
5 - le dispositif comprend une pluralité d'aiguilles groupées en damier
reproduisant le
patron des micro-dépôts à effectuer, une plaque (91) dans laquelle des puits
(92) sont
ménagés, un dispositif de montée-descente permettant une pénétration des
aiguilles
dans les puits (92), la pluralité d'aiguilles et la plaque (91) étant
assujetties à des
mouvements relatifs perpendiculaires ;
- l'aiguille forme un renflement (35) en saillie radialement à l'intérieur du
guide (2) sous
le palier (21) ; et/ou
- le dispositif comprend en outre un organe de placement et de retrait d'un
support à
l'aplomb de la pointe (34).
Un autre objet de l'invention concerne un dispositif comprenant:
-un convoyeur d'entraînement de supports selon une direction de traitement ;
-un dispositif de chargement de supports sur le convoyeur ;
-un dispositif de formation de micro-dépôts d'échantillon tel que défini ci-
dessus, disposé à
l'aplomb de supports placés sur le convoyeur en aval du dispositif de
chargement, le
dispositif formant des dépôts sur les supports de façon synchronisée avec
l'entraînement par
le convoyeur ; et
-un dispositif de déchargement (87) de support du convoyeur, disposé en aval
du dispositif
de formation de dépôts.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour la formation de dépôts
d'un
échantillon liquide sur un support, comprenant l'application des dépôts au
moyen d'un dispositif
tel que défini ci-dessus.
L'invention concerne également l'utilisation d'un dispositif tel que défini ci-
dessus pour la
formation de microdépôts d'un ou plusieurs échantillons liquides sur un
support.
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L'invention concerne encore un procédé de production de supports comportant
des
microdépôts d'échantillon, le procédé comprenant l'application des microdépôts
au moyen d'un
dispositif tel que défini ci-dessus.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront clairement
de la
description qui en est faite ci-après, à titre indicatif et nullement
limitatif, en référence aux dessins
annexés, dans lesquels :
-la figure 1 est une vue en coupe de côté d'un premier mode de réalisation
d'une
machine de micro dépôts ;
-la figure 2 est une vue schématique de dessus d'une ligne de dépôt sur des
lames de
verre, utilisant la machine de la figure 1;
-la figure 3 est une vue de dessus d'un deuxième mode de réalisation d'une
machine de
micro dépôts durant son fonctionnement ;
-les figures 4A et 4B sont des vues en coupe de côté d'aiguilles de la machine
de la
figure 3 durant différentes étapes de fonctionnement ;
-la figure 5 est une vue en coupe de la machine de la figure 3 durant son
fonctionnement ;
-la figure 6 est une image de fluorescence de dépôts réalisés avec une machine
selon
l'invention.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente demande concerne des procédés et dispositifs pour la formation de
micro-
dépôts (ou points de dépôt) d'un ou plusieurs échantillons sur la surface d'un
support approprié.
Comme il sera décrit plus en détail dans la suite du texte, l'invention est
applicable à tout type
d'échantillon liquide, c'est-à-dire notamment toute solution ou suspension,
par exemple aqueuse.
L'échantillon peut être de nature variée, comme par exemple un échantillon de
nature
polypeptidique (peptides, polypeptides, protéines, anticorps, etc.), nucléique
(ADN, ARN, etc),
cellulaire, virale, lipidique, biologique, etc. L'invention permet la
formation de microdépôts, c'est-
à-dire typiquement de dépôts présentant un volume inférieur à 50 nl,
typiquement compris entre
0,01 et 10n1, cette quantité étant ajustable par l'homme du métier.
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L'invention permet de former des dépôts sur tout type de support approprié. Il
s'agit de
préférence de supports comprenant une surface essentiellement plane (comme une
lame, une
membrane, un filtre, etc.). Il peut également s'agir de supports présentant
une ou des surfaces
planes séparées par des cloisons, ou une surface plane dans laquelle sont
ménagés des
alvéoles, par exemple une plaque multi-puits. Le support peut être en tout
matériau adapté
(verre, plastique, tout polymère compatible, métal, silice, céramique, corail,
etc.). Il s'agit
typiquement d'une plaque multi-puits, comme par exemple une plaque 12, 24 ou
96 puits, ou
plus. Il peut également s'agir d'une lame de verre.
Selon un mode de réalisation préféré, le dispositif selon l'invention comprend
:
- une pluralité de réservoirs (11) destinés à recevoir un échantillon liquide
(12) à déposer, le
fond de chaque réservoir étant pourvu d'un trou débouchant, le trou étant
dimensionné pour
maintenir l'échantillon dans le réservoir par capillarité ;
- une pluralité d'aiguilles (3), chaque aiguille étant associée à un réservoir
et présentant une
pointe (34) montée mobile jusqu'à une position où elle traverse le trou pour
faire saillie à
l'extérieur de son réservoir associé (11) et entraîner une fraction de
l'échantillon hors du
réservoir ; et
- un organe de commande (5-), commandant le déplacement de la pointe jusqu'à
ladite
position ;
ladite pluralité de réservoirs et d'aiguilles étant disposée de manière à
reproduire le dessin
des microdépôts à effectuer, lors du déplacement du support ou de la pluralité
d'aiguilles.
Selon un particulièrement préféré, le dispositif comprend en outre :
- un support (91) (par exemple une plaque) dans lequel des puits (92) sont
ménagés ; et
- l'organe de commande comprend un dispositif de montée-descente permettant
une
pénétration des aiguilles dans les puits (92) ;
ladite pluralité d'aiguilles et le support (91) étant assujettis à des
mouvements relatifs
perpendiculaires.
Le dispositif peut comprend un nombre varié de réservoirs et d'aiguilles
associées. Ainsi, le
terme pluralité désigne typiquement un nombre compris entre 2 et 50, de
préférence entre 4 et
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50, plus préférentiellement entre 9 et 50. Dans des exemples particuliers, le
dispositif comprend
2, 4, 6, 8, 9, 12, 15, 25 ou 36 réservoirs et aiguilles associées.
De préférence, les réservoirs et les aiguilles sont disposés en damier ou
selon une matrice
géométrique prédéfinie (par exemple une matrice carrée ou rectangulaire)
permettant de
reproduire le profil des microdépôts et un agencement en ligne le long d'une
chaîne de
production industrielle en continu, conduisant au maintien de l'alignement des
dépôts réalisés
parallèlement par plusieurs dispositifs éloignés. Selon un mode particulier de
mise en oeuvre, les
réservoirs et les aiguilles sont disposés en damier selon une matrice carrée
6x6, 5x5, 4x4 ou 3x3.
Selon des modes de réalisation particuliers de l'invention, la pointe (34) :
- est montée mobile entre une position où elle est logée à l'intérieur du
réservoir et ladite
position où elle fait saillie à l'extérieur du réservoir, et/ou
- présente un diamètre compris entre 0,10 mm et 0,3 mm, et/ou
- présente plusieurs parties successives de sections croissantes en partant de
l'extrémité libre de la pointe (34).
Selon un mode particulier de l'invention, le trou, prévu pour maintenir
l'échantillon dans le
réservoir, est de forme circulaire et présente un diamètre compris entre 0,3
et 0,6 mm.
L'invention concerne également un dispositif dans lequel le réservoir (11)
présente une
contenance comprise entre 5 et 100 microlitres, de préférence entre 5 et 50
microlitres. Le
réservoir selon l'invention peut présenter un alésage cylindrique dans sa
partie supérieure (13),
et un alésage conique dans sa partie inférieure (14) joignant l'alésage
cylindrique au trou
débouchant. La partie extérieure du réservoir entourant le trou débouchant
peut être recouverte
d'un revêtement hydrophobe.
Un aspect particulier de l'invention concerne un dipositif, dans lequel le
poids de l'aiguille
(3) entraîne la pointe vers la position où elle est en saillie à l'extérieur
du réservoir, et dans lequel
l'organe de commande comprend un moteur (52) et un levier (53) actionné par le
moteur
entraînant l'aiguille vers la position où la pointe (34) est logée à
l'intérieur du réservoir.
Un autre aspect concerne un dispositif comprenant plusieurs réservoirs et
aiguilles associés, les
réservoirs étant séparés par un même pas, le levier entraînant les pointes
desdites aiguilles vers
la position où ces pointes sont logées à l'intérieur de leurs réservoirs
associés. De préférence, les
réservoirs sont ménagés dans un même composant monobloc (1).
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Un autre objet de l'invention concerne un dispositif comprenant un guide (2),
solidaire du
réservoir (11), dispositif dans lequel l'aiguille comprend un corps (32,33)
surplombant et solidaire
de la pointe, le corps étant guidé en translation par le guide (2). Ledit
réservoir (11) peut
présenter une paroi extérieure de forme cylindrique vissée dans un alésage
inférieur du guide (2)
et ledit guide peut former un épaulement (23) en saillie radialement au-delà
de la paroi extérieure
du réservoir (11).
Un objet particulier de l'invention concerne un dispositif dans lequel
l'aiguille forme un
renflement (35) en saillie radialement à l'intérieur du guide (2) sous un
palier (21).
Le dispositif selon l'invention peut en outre comprendre un organe de
placement et de
retrait d'un support à l'aplomb de la pointe (34). Ledit dispositif peut
également comprendre :
-un convoyeur d'entraînement (7) de supports (6) selon une direction de
traitement ;
-un dispositif de chargement (81) de supports sur le convoyeur (7);
-un dispositif de formation de microdépôts d'échantillon (85) tel que défini
précédemment,
disposé à l'aplomb de supports placés sur le convoyeur en aval du dispositif
de chargement, le
dispositif formant des dépôts sur les supports de façon synchronisée avec
l'entraînement par le
convoyeur; et
-un dispositif de déchargement (87) de support du convoyeur, disposé en aval
du dispositif
de formation de dépôts.
Selon d'autres modes de réalisation de l'invention, le dispositif de
l'invention peut être
équipé, à la place des réservoirs et aiguilles, d'une pluralité de têtes
conventionnelles de type
pipette avec expulsion de gouttes par striction piézo-électrique (par exemple
Piezoarray de
Perkin-Elmer) ou par micro-ébullition (par exemple selon la méthode décrite
dans le brevet US
5,551,883), agencées comme décrit ci-dessus.
Un autre objet de l'invention concerne des procédés pour la formation de
dépôts d'un
échantillon liquide sur un support, qui comprennent l'application des dépôts
au moyen d'un
dispositif selon l'invention.
Comme indiqué ci-dessus, l'invention concerne des dispositifs pour la
formation de
dépôts à partir d'un échantillon liquide (par exemple une solution aqueuse)
contenu dans un
réservoir. Une caractéristique des dispositifs de l'invention réside dans le
fait qu'un trou
débouchant est ménagé dans le fond du réservoir, le trou étant dimensionné
pour maintenir
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l'échantillon liquide dans le réservoir par capillarité. Le dispositif
comprend une pointe d'aiguille
apte à entraîner l'échantillon à travers le trou.
Le dispositif de formation de dépôts illustré à la figure 1 comprend une bande
7 de
convoyage de lames de verre 6. Les lames 6 successives sont disposées sur la
bande 7 avec un
5 pas prédéfini, par exemple de 35 mm. Les lames 6 pourront par exemple être
positionnées en X.
et Y. au moyen d'un gabarit. Deux faces perpendiculaires d'une lame 6 sont en
contact avec
deux faces respectives d'un gabarit. La bande 7 entraîne les lames 6 selon la
direction X. Le
dispositif comprend une plaque 1 surplombant la bande 7. Plusieurs réservoirs
11 sont ménagés
dans la plaque 1 et présentent un trou débouchant dans leur fond. Ces
réservoirs 11 sont remplis
10 de solutions 12 à déposer sous forme de dépôts. Chaque trou est dimensionné
pour maintenir la
solution dans le réservoir 11 par capillarité. Les réservoirs présentent
typiquement une
contenance comprise entre 5 et 100 microlitres, de préférence entre 5 et 50
microlitres, même si
celle-ci peut être adaptée par l'homme du métier, et variable d'un réservoir à
un autre. La plaque
1 est surplombée par un plateau 4 qui sert de couvercle et de guide. Le
plateau 4 est fixé de
façon amovible sur la plaque 1, par exemple pour réaliser des opérations de
maintenance ou
faciliter le remplissage des réservoirs 11. Le plateau 4 présente des alésages
filetés disposés à
l'aplomb de réservoirs respectifs 11 de la plaque 1. Des supports de guidage 2
sont fixés dans
les alésages du plateau 4. Des aiguilles 3 sont guidées en translation selon
l'axe Z par le support
de guidage 2. Les aiguilles 3 présentent une pointe 34 au niveau de leur
extrémité inférieure,
disposée à l'intérieur d'un réservoir respectif 11 dans la position illustrée.
Le dispositif comprend
de plus un levier 53 définissant la course en translation de la pointe 34.
En abaissant une pointe 34 selon la direction Z, cette pointe entraîne une
fraction de la
solution 12 présente dans le réservoir 11 à travers le trou débouchant, pour
la déposer sur la
plaque de verre 6 se trouvant à l'aplomb.
L'invention permet de réaliser un grand nombre de dépôts avec une cadence
élevée à
partir de la solution 12 présente dans le réservoir 11, en limitant
l'évaporation de cette solution
12. Par ailleurs, la pointe 34 forme un piston traversant le trou du réservoir
11 et évite ainsi son
colmatage. La pointe 34 garantit une grande reproductibilité des dépôts
formés. Par ailleurs,
durant tout le processus de formation des dépôts, les solutions et les
aiguilles 3 sont isolées de
l'extérieur ce qui élimine les risques de contamination.
La plaque 1 présente plusieurs réservoirs 11 destinés à recevoir des solutions
12 à
déposer sur les lames de verre 6. Ces réservoirs 11 pourront être réalisés par
usinage d'une
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même plaque métallique. Les réservoirs 11 sont disposés avec un pas
correspondant aux pas
entre les lames 6 successives sur la bande 7.
Avantageusement, les réservoirs 11 et la bande 7 pourront être déplacés
relativement
l'un par rapport à l'autre selon la direction Y, de façon à former plusieurs
dépôts selon la plus
grande dimension d'une lame de verre 6. La plaque 1 pourra notamment être
motorisée afin
d'être déplacée selon les axes X et Y par rapport à la bande 7. Des lames de
verre 6 présentant
chacune jusqu'à 18 zones de dépôt entourées par des délimitations hydrophobes
pourront être
utilisées.
Un alésage est ménagé dans chaque réservoir 11 et présente une partie
supérieure 13
de forme cylindrique, et une partie inférieure 14 de forme conique formant le
fond du réservoir 11.
Le trou débouchant est formé dans la partie inférieure 14. Le réservoir 11
présentera typiquement
une hauteur de plusieurs millimètres, par exemple comprise entre 2 et 4
millimètres. La partie
supérieure 13 présentera un diamètre de plusieurs millimètres. Le trou
débouchant ménagé dans
la partie inférieure 14 présente avantageusement un diamètre compris entre 0,3
et 0,6
millimètres. Un tel diamètre est suffisant pour permettre le passage des
particules présentes
dans la solution 12. Pour la plupart des solutions à déposer, un tel diamètre
du trou permet de
maintenir la solution 12 dans le réservoir 11 sans couler, du fait de la force
capillaire. Ainsi, il
n'est pas nécessaire de faire appel à un mécanisme complexe de retenue de la
solution. Afin de
renforcer la force capillaire sur la solution 12, la partie inférieure 14 du
réservoir 11 est
avantageusement recouverte par un revêtement hydrophobe, par exemple du
silicone ou du
polytétrafluoroéthylène.
Le support de guidage 2 est réalisé sous forme de cylindre creux. Il supporte
les paliers
de guidage supérieur et inférieur de l'aiguille, qui sont soit usinés dans la
masse, soit constitués
de bagues rapportées. Le support de guidage est solidaire du réservoir.
Dans un mode de réalisation particulier, la partie inférieure du support de
guidage est
taraudée et le réservoir est fileté. Ce mode est particulièrement adapté à la
formation de
microdépots sur plaques multipuits, par exemple sur plaques 96 puits. En
effet, avec ce type de
supports il est avantageux que le réservoir puisse se déplacer en hauteur pour
pénétrer dans le
puits, ce qui est obtenu par exemple en le suspendant à l'aiguille.
Dans un autre mode de réalisation, la surface extérieure de la partie
inférieure du support
de guidage 2 est filetée et le réservoir est surmonté d'un alésage taraudé.
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Dans une autre réalisation, avantageuse pour associer plusieurs réservoirs, la
partie
inférieure du support de guidage est vissée dans l'alésage taraudé
correspondant du plateau 4.
Le positionnement radial et le guidage en translation de l'aiguille 3 sont
assurés par
l'intermédiaire du palier supérieur 21 ménagé dans le support de guidage et
par l'intermédiaire du
palier inférieur 22 ménagé dans le plateau 4. Le palier supérieur 21 est
réalisé dans un
épaulement ménagé dans la partie supérieure du support de guidage 2. Le palier
inférieur 22 est
réalisé dans un épaulement ménagé dans le fond d'un alésage taraudé du plateau
4. On pourrait
également envisager de réaliser le palier inférieur 22 dans le support de
guidage 2. Cet
épaulement forme également un couvercle pour le réservoir 11. Les paliers
supérieur 21 et
inférieur 22 sont séparés par une distance d'environ 20 mm. Les paliers
inférieur et supérieur
pourront être munis d'une bague cylindrique en polytétrafluoroéthylène.
L'aiguille 3 présente une pointe 34 immergée dans la solution 12 et dont
l'extrémité
inférieure est destinée à amener une fraction de cette solution en contact
avec la lame de verre
6. La pointe 34 présente avantageusement un diamètre compris entre 0,1 et 0,3
mm. La partie
inférieure de la pointe 34 est de préférence polie. La pointe 34 est surmontée
par une première
partie de guidage en translation 33. La pointe 34 pourra présenter une section
croissante entre
son extrémité libre et sa jonction avec la première partie de guidage 33, afin
d'accroître l'agitation
de la solution 12 et ainsi assurer l'homogénéité de cette solution pour les
différents dépôts
réalisés. La pointe 34 pourra également présenter plusieurs sections de
diamètres distincts et
croissants en partant de l'extrémité libre jusqu'à la première partie de
guidage 33. La pointe
pourra notamment présenter une section d'un diamètre de 0,3 mm joignant
l'extrémité libre à la
première partie de guidage 33. Cette partie de guidage 33 présente un diamètre
d'environ 1 mm
et est montée selon un ajustement glissant par rapport au palier 22. La
première partie de
guidage 33 est surmontée d'une deuxième partie de guidage en translation 32.
La partie de
guidage 32 présente un diamètre d'environ 4 mm et est montée selon un
ajustement glissant par
rapport au palier 21 du support de guidage 2. La deuxième partie de guidage 32
est surmontée
par une butée 31 présentant un diamètre supérieur à cette deuxième partie de
guidage 32.
L'aiguille 3 peut être réalisée en acier inoxydable et présenter un poids
compris entre 4 et 6
grammes approximativement. L'aiguille 3 pourra présenter une hauteur comprise
entre 30 et 50
mm. Les surfaces de l'aiguille 3 guidées en translation par les paliers 21 et
22 sont
avantageusement polies pour limiter les frottements. Les efforts de frottement
durant la
translation de l'aiguille 3 seront avantageusement inférieurs à 0,01 N.
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Des essais ont été mis en oeuvre avec une aiguille 3 présentant les dimensions
suivantes:
-une pointe 34 munie d'une extrémité libre d'un diamètre de 0,15 mm et d'une
hauteur de
0,8 mm, et munie d'une partie de jonction d'un diamètre de 0,3 mm et d'une
hauteur de 3,2 mm ;
-une première partie de guidage 33 d'un diamètre de 1 mm et d'une hauteur de
17 mm ;
-une deuxième partie de guidage 32 présentant une première section de 2,32 mm
diamètre et 8,02 mm au et une deuxième section de 4 mm de diamètre et de 8 mm
de haut;
-une butée 31 de 8 mm de diamètre et de 8 mm de haut.
Une telle aiguille 3 s'est avérée très accessible et aisément démontable pour
procéder à
son nettoyage.
La précision du centrage de l'aiguille 3 par rapport au support de guidage 2,
et la
précision de centrage du support de guidage 2 par rapport à la plaque 4 permet
de maintenir un
jeu entre la pointe 34 et le trou débouchant du réservoir associé. Ce jeu sera
de préférence
inférieur à 100 pm. Un centrage approprié de l'aiguille permettra de définir
la position du dépôt
avec une précision de 50 pm.
Le dispositif pourra comprendre un agitateur de l'échantillon liquide à
déposer.
Un levier 53 définit la course en translation des aiguilles 3. Ce levier 53
est monté
pivotant autour de deux axes 51. Le levier 53 est entraîné par un moteur 52
associé à une came.
La came présente une partie saillante excentrique, supportant le levier 53.
Lors d'une rotation de
la partie saillante, le levier 53 s'abaissera sous l'effet de son poids
propre. On pourra également
utiliser un roulement à billes monté à rotation excentrée par rapport à son
axe, afin de limiter
l'usure. Le moteur 52 limitera la vitesse de descente de l'aiguille 3 à
environ 10 à 20 mm par
seconde. Le moteur 52 pourra être commandé de façon à assurer une durée de
contact entre la
pointe 34 et la lame de verre 6 comprise entre 0,05 et 0,15 secondes. La durée
de contact pourra
notamment être définie par la différence entre la course de l'extrémité du
levier 53 et la course de
l'aiguille 3. Dans ce mode de réalisation, l'aiguille 3 est entraînée vers le
bas par son poids
propre. Le levier 53 est alors utilisé pour contrôler la vitesse de descente
de l'aiguille 3. Le levier
53 retient l'aiguille 3 par l'intermédiaire de la butée 31. La course
descendante du levier 53 peut
se poursuivre au delà du contact entre la pointe 34 et la lame de verre 6, la
force de contact étant
alors uniquement définie par le poids de l'aiguille 3, garantissant une grande
régularité de la force
d'appui sur la lame de verre 6. La course en translation de la pointe 34 sera
par exemple
comprise entre 4 et 7 mm. Le levier 53 maintient la pointe 34 dans le
réservoir 11 jusqu'à une
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commande de dépôt. Lors d'une commande de dépôt, le levier 53 pivote pour
autoriser la
descente de la pointe 34 jusqu'au contact avec une lame de verre 6. La pointe
34 entraîne une
goutte de la solution 12 et la dépose alors sur la lame de verre 6. Pour
opérer la remontée de
l'aiguille 3, le moteur 52 continue sa course de façon à faire pivoter le
levier 53 en sens inverse,
de sorte que l'aiguille 3 est entraînée vers le haut par l'intermédiaire de la
butée 31.
Selon une variante, on peut envisager que le levier 53 soit solidarisé à
l'aiguille 3 par
l'intermédiaire d'un ressort. Si le levier 53 est entraîné après que la pointe
34 soit entrée en
contact avec la lame de verre 6, le ressort limite la force de contact
transmise entre le levier 53 et
la pointe 34.
Selon une autre variante, la tête de l'aiguille repose sur le levier 53 par un
appui conique,
en sorte que le guidage de l'aiguille est assuré par ledit levier 53, rendant
inutile le support de
guidage 2 qui est alors supprimé.
La descente de l'aiguille 3 peut être définie par d'autres mécanismes de
commande. La
descente peut notamment être définie par l'intermédiaire d'un moteur pas à
pas, par
l'intermédiaire d'une came transformant un mouvement circulaire en mouvement
linéaire, par une
crémaillère, ou un dispositif à vis sans fin. On peut utiliser un moteur 52 du
type pas-à-pas avec
repérage de l'origine. Selon une variante, on utilise un moteur 52 de type
asynchrone, avec un
même repérage de position.
La figure 2 est une vue schématique de dessus d'une ligne de formation 8 de
dépôts sur
des lames de verre 6, utilisant une machine du type détaillé à la figure 1. La
ligne de dépôt 8
comprend une bande 7 de convoyeur défilant selon une direction suivant
laquelle les lames de
verre 6 subissent des traitements. La ligne de dépôt 8 comprend un dispositif
81 de placement
des lames de verre 6 sur la bande 7. Le dispositif 81 comprend des vérins 82
plaçant les lames
de verre 6 sur la bande 7 à intervalles réguliers. Une rampe de lavage 83 est
disposée dans la
course des lames de verre 6 entre le dispositif 81 et la bande 7. Un
dispositif de séchage 84 est
disposé en aval au-dessus de la bande 7, de façon à éliminer l'eau résiduelle
déposée par la
rampe de lavage 83 sur les lames de verre 6.
La ligne de dépôt 8 comprend plus en aval plusieurs machines de dépôt 85 de
dépôts,
du type détaillé auparavant. Chaque machine de dépôt 85 comprend un levier 53
monté pivotant
autour d'un axe 51 et un moteur 52 commandant les montées ou les descentes du
levier 53.
Chaque levier 53 commande les montées ou les descentes de six aiguilles 3
alignées selon la
direction de défilement du convoyeur, comme détaillé auparavant. A l'aplomb de
chaque machine
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de dépôt 85, et solidaire de la dite machine, on trouve un gabarit, non
représenté sur la figure 2,
qui permet de bloquer les lames à la position exacte voulue pour le dépôt. La
ligne de dépôt 8
pourra présenter le nombre d'aiguilles nécessaires pour déposer différentes
solutions sur une
lame 6. Un organe de contrôle 86 analyse la conformité des dépôts formés sur
les lames de verre
5 6 en aval des machines de dépôt 85. L'organe de contrôle 86 extrait les
lames de verre 6 jugées
non conformes hors de la bande 7. En aval de l'organe de contrôle 86, un
dispositif de
manipulation 87 comprend un vérin 88. Le vérin 88 place les lames de verre 6
dans un boîtier de
rangement 89 destiné à recevoir une multitude de lames de verre 6. La bande 7
est entraînée de
façon à déplacer les lames de verre 6 d'incréments de distance correspondant
aux pas entre les
10 plaques 6. La bande 7 du convoyeur peut être remplacée par un transporteur
rigide, à griffes ou à
encoche, qui prend et relâche les lames en un mouvement cyclique, leur faisant
faire un pas et
les déposant dans un gabarit fixe où elles seront maintenues en position
convenable.
La figure 3 est une vue de dessus d'un autre mode de réalisation d'une machine
de
15 formation de dépôts en utilisant des plaques de diagnostic standard. Des
plaques de diagnostic
91 comprennent 96 puits 92 répartis sur huit lignes et douze colonnes avec un
pas de 9 mm,
conformément aux standards. Les plaques de diagnostic 91 sont disposées sur un
convoyeur 94
apte à les entraîner selon la direction X. La machine comprend par ailleurs
deux rails 93 orientés
selon la direction Y. Une tête 95 est montée coulissante sur les rails 93. Un
moteur non illustré
positionne la tête 95 selon la direction Y. La tête 95 supporte une pluralité
de réservoirs et
d'aiguilles 3 guidées et disposées selon une matrice carrée de 6 x 6 par
exemple, disposition dite
en damier. Les aiguilles 3 illustrées par des cercles pleins sont descendues
selon la direction Z
verticale dans des puits 92. Les aiguilles 3 illustrés par des cercles vides
ne sont pas descendues
dans des puits. La disposition des aiguilles et des réservoirs associés
reproduit le même patron
que celui à réaliser pour les microdépôts au fond des puits.
Les figures 4a et 4b représentent une aiguille 3 dans deux positions de
fonctionnement.
Dans la position illustrée à la figure 4a, la pointe 34 est logée à
l'intérieur du réservoir 11 et
plonge dans la solution 12. Dans la position illustrée à la figure 4b, la
pointe 34 fait saillie hors du
réservoir 11 et entraîne une fraction de la solution 12 pour réaliser un
microdépôt sur un support.
L'aiguille 3 est montée coulissante dans un support de guidage 2, de façon
similaire à la figure 1.
Le support de guidage 2 présente dans sa partie inférieure un alésage fileté.
Le réservoir 11
présente une forme extérieure cylindrique. La surface extérieure du réservoir
11 est filetée. Le
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réservoir 11 est vissé dans l'alésage fileté du support de guidage 2. Afin de
pouvoir pénétrer
dans les puits 92, les réservoirs 11 pourront présenter un diamètre extérieur
inférieur ou égal à 8
mm. En permettant la descente du réservoir 11 dans le puits 92, on peut
limiter la course de la
pointe 34 nécessaire au-delà du trou débouchant. La course de la pointe 34 au-
delà du trou
débouchant pourra par exemple être limitée à 2 mm. La partie inférieure du
support de guidage 2
forme un épaulement 23 par rapport à la surface extérieure du réservoir 11.
Cet épaulement 23
est utilisé comme butée pour limiter la descente du réservoir 11 à l'intérieur
d'une alvéole 92.
L'épaulement dans lequel le palier inférieur 22 est ménagé forme un couvercle
au dessus du
réservoir 11. L'aiguille 3 présente un renflement 35 apte à entraîner
l'épaulement supérieur
lorsque l'aiguille 3 est remontée. Ainsi, par une traction sur la butée 33, on
peut extraire le
réservoir 11 d'une alvéole 92. L'aiguille 3, son guide et le trou débouchant
pourront être
légèrement décentrés par rapport à l'axe du puits de façon à obtenir un
écartement adéquat entre
les dépôts.
La figure 5 est une vue en coupe de la machine au niveau des puits 92 d'une
plaque de
diagnostic 91. Un substrat de dépôt tel qu'une feuille transparente de verre
ou de plastique 96 est
disposé en appui contre le fond de la plaque 91. Le substrat 96 est surmonté
par un quadrillage
dans lequel les puits 92 sont formés.
La machine présente une plaque de contrôle 54 munie d'électroaimants 55a à
55e. Les
électroaimants 55a à 55e permettent de retenir ou de libérer respectivement
les aiguilles 3a à 3e.
En position relevée, l'extrémité supérieure des aiguilles 3a à 3e est
maintenue par la plaque de
contrôle 54. L'extrémité supérieure des aiguilles 3a à 3e est soutenue par une
plaque de
commande 56. Les réservoirs des aiguilles 3b à 3e sont alors disposés dans les
puits 92. La
partie supérieure 97 du quadrillage est à une hauteur prédéfinie, et forme une
butée pour
l'épaulement 23 durant la descente des aiguilles 3. La plaque de commande 56
est mobile
verticalement entre une position haute illustrée en pointillés, et une
position basse illustrée en
traits pleins. Dans sa position basse, la plaque de commande 56 permet la
descente des aiguilles
jusqu'à ce qu'une pointe 34 sorte au-delà du trou débouchant de son réservoir
et forme un dépôt
sur le substrat 96.
L'aiguille 3a est disposée hors de la zone du quadrillage, et le réservoir qui
lui est
associé est au dessus d'une surface périphérique 98 de la plaque 91. Par
ailleurs, l'aiguille 3a et
l'aiguille 3e sont maintenues en position relevée par l'électroaimant 55a.
L'épaulement 23 des
guides des aiguilles 3b à 3d est en butée contre la partie supérieure 97 de la
plaque quadrillée.
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Le réservoir et le guide de ces aiguilles sont donc immobilisés verticalement.
Une commande de
descente de la plaque de commande 56 ayant été appliquée, la pointe 34 des
aiguilles 3b à 3d
fait saillie hors de leur réservoir et vient en contact avec le substrat 96 de
façon à former un
microdépôt. Comme dans l'exemple de la figure 1, les aiguilles 3 viennent en
contact avec le
substrat 96 sous l'effet de leur poids propre.
Des essais ont été réalisés avec un réservoir 11 présentant un diamètre de 2
millimètres
et une hauteur de 5 mm. 10 microlitres d'une solution d'albumine bovine
marquée à
l'aminométhyle coumarine ont été placés dans ce réservoir. Un volume mort de
quatre microlitres
a été conservé. Les essais font apparaître une évaporation réduite. Cette
solution a permis de
réaliser 6500 dépôts sans recharger le réservoir. En l'absence de volume mort,
un tel réservoir
peut donc comprendre environ 15 microlitres de solution et permettre la
formation de 10 000
dépôts. La figure 6 présente une image de fluorescence bleue de 81 dépôts de
BSA*AMCA,
obtenue avec une excitation de 365 nm. On note que ces dépôts sont assez
homogènes entre
eux, ce qui confirme que le mouvement de l'aiguille à l'intérieur du réservoir
entretien une
agitation régulière de la solution. Le CV intralame est compris entre 10 et 13
% (n=81 %). Le CV
de la moyenne interlame est de 5,62 % (n=14).
A partir des images moyennes de la fluorescence des dépôts, on quantifie la
fluorescence bleue des microdépôts d'échantillon, leur écart type et le CV
pour chaque lame
dans les différentes conditions d'essai. On a notamment constaté que
l'utilisation de différentes
aiguilles présentant des poids variant de 6,48 g à 12,56 g n'induisait pas de
variation de la taille
ou de la fluorescence des dépôts. On en déduit donc que des dépôts peuvent
être formés à
pression réduite, ce qui favorise notamment le dépôt de cellules.
