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COMPOSITION EMOLLIENTE POUR LE TRAITEMENT
PREVENTIF DE LA DERMATITE ATOPIQUE
La présente invention concerne le domaine de l'atopie et du traitement des
affections qui y sont associées.
L'atopie est définie comme une prédisposition héréditaire à réagir de manière
symptomatique (maladie) à divers allergènes, tels que la poussière de maison,
les
acariens, les pollens, les poils d'animaux, etc. Les affections réputées
atopiques
comprennent la dermatite atopique (DA), l'asthme bronchique allergique et la
rhinite
allergique ou rhume des foins .
La dermatite atopique (ou eczéma atopique) est une maladie dermatologique
fréquente, touchant 10 à 15% des nourrissons en France, en augmentation au
cours
des dernières décennies.
La dermatite atopique est une maladie chronique qui évolue par poussées,
entrecoupées de périodes de rémission durant lesquelles les lésions sont
toujours
présentes mais minimes se manifestant essentiellement par une xérose
(sécheresse
cutanée) et un prurit.
L'inflammation de la peau est caractéristique des poussées qui se traduisent
par des signes et symptômes inflammatoires comprenant des rougeurs (érythème),
des vésicules, des croûtes, un suintement et des démangeaisons.
La maladie débute généralement entre l'âge de 3 mois et 2 ans mais peut
commencer encore plus tôt dès l'âge de 1 mois. Son évolution est souvent bonne
avec une rémission complète intervenant entre 5 et 8 ans dans la majorité des
cas. La
résurgence à l'adolescence ou chez l'adulte jeune est possible. La maladie
peut
persister à l'âge adulte dans 15 à 20 % des cas.
L'évolution vers une autre affection atopique est également possible. La
présence d'une DA dans l'enfance augmente le risque de développer un asthme et
il
existe une corrélation nette entre la fréquence de la DA et la fréquence de
l'asthme.
Le risque de survenue d'un asthme chez un enfant porteur d'une DA est estimé
entre
30 et 40%.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
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Le risque de survenue d'une allergie alimentaire, le plus souvent avant 3 ans,
ou d'une rhinite allergique, d'apparition plus tardive, varie selon les
études.
Concernant la dermatite atopique, il existe une prédisposition génétique
marquée, avec un risque de 30 à 50% de développer la maladie si l'un des
parents est
atteint, et de près de 80% si les deux parents sont atteints. La
prédisposition
génétique implique de nombreux gènes, codant soit pour des déterminants de la
fonction barrière de l'épiderme, soit pour des acteurs de l'immunité innée ou
adaptative. Tenant compte de nombreux travaux récents, on peut émettre
l'hypothèse
que la DA (voire les autres maladies atopiques) soient liées à une anomalie
primitive
de la fonction barrière de l'épiderme, responsable d'une perméabilité accrue
aux
agents environnementaux (allergènes et micro-organismes) responsables de
l'activation immunologique et des manifestations allergiques.
L'anomalie de la perméabilité épidermique se traduit par une xérose cutanée
et une augmentation de la perte insensible en eau et par la mise en évidence
d'un
polymorphisme de gènes codant pour des protéines épidermiques telles que la
filaggrine (FLG), participant à la fonction barrière de l'épiderme (Palmer,
2006).
Une étude récente confirme en France l'association d'un polymorphisme du gène
FLG à la DA, avec un risque relatif supérieur à 3 (Hubiche, 2007).
L'atopie peut être considérée comme une réaction d'hypersensibilité retardée
de contact aux allergènes de l'environnement. Elle se présente généralement en
deux
phases. Une première phase de sensibilisation cliniquement muette et
génératrice de
lymphocytes T spécifiques au niveau cutané. Cette sensibilisation se fait par
pénétration des allergènes de l'environnement au niveau cutané facilitée par
la
xérose. Une seconde phase d'activation des lymphocytes T spécifiques aboutit à
la
production de cytokines pro-inflammatoires.
Globalement, les manifestations de dermatite atopique résultent d'interactions
complexes entre facteurs environnementaux, anormalités pharmacologiques,
disfonctionnements ou altérations des fonctions barrière de la peau,
phénomènes
immunologiques et susceptibilité génétique.
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Parmi les nombreux facteurs, l'hyper réactivité cutanée, la réponse
immunitaire inappropriée à divers micro-organismes ainsi que des infections
secondaires semblent jouer un rôle dans la chronicité de la pathologie.
Le rôle de la flore cutanée dans l'apparition et/ou le maintien d'une
activation
immunitaire favorisant le développement de lésions d'eczéma est de mieux en
mieux
connu. L'altération de la fonction barrière de la peau associée à une certaine
immunodéficience chez les patients atteints de dermatite atopique entraîne une
colonisation par Staphylococcus aureus qui colonise la peau de 90% des
patients
ayant une DA, même en dehors des poussées évolutives de la maladie. (Current
Opinion in Allergy and Clinical Immuno12007, 7, 413).
Il existe une corrélation entre la sévérité de la maladie et, d'une part la
densité
de colonisation staphylococcique, et d'autre part la fréquence de positivité
des IgE
spécifiques anti-toxines staphylococciques (J Allergy Clin Immunol 2006 117,
1141 ,
Am J Clin Dermatol, 2006, 7, 273 ; Clin rev Allergy Immunol, 2007, 33, 167,
Current Opinion Allergy and Clinical Immuno12004, 4, 373).
Ces éléments font suspecter pour le staphylocoque doré un rôle dans le
développement d'une activation immunitaire locale responsable des
manifestations
cutanées de la dermatite atopique et peut-être des sensibilisations
allergiques.
Outre le grattage, il existe de nombreux facteurs favorisant la colonisation
par
Staphylococcus aureus via l'altération du système primaire de défense cutané
et en
premier lieu l'altération de la composition lipidique du Stratum Comeum. Cette
altération de la fonction barrière de la peau est ainsi responsable de la
colonisation
par le staphylocoque et aussi d'un accroissement de la perte en eau au niveau
cutané,
entraînant xérose, irritation, démangeaisons créant ainsi une sorte de cercle
vicieux
physiopathologique.
La prise en charge thérapeutique de la dermatite atopique peut s'envisager à
différents niveaux essentiellement symptomatique mais aussi préventif. Il
n'existe à
ce jour aucun traitement curatif de la maladie.
Outre l'éviction des allergènes identifiés qui est souhaitable autant que
faire
se peut, l'hydratation de la peau en tant que moyen de restauration ou de
maintien de
son rôle barrière vient en complément du traitement symptomatique des poussées
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par la corticothérapie locale qui constitue la thérapeutique de référence de
cette
maladie. D'autres anti-inflammatoires topiques non stéroïdiens (notamment les
inhibiteurs de la calcineurine) peuvent aussi être utilisés pour traiter les
poussées.
Enfin la photothérapie, les immunosuppresseurs per os ou d'autres
thérapeutiques
systémiques lourdes sont réservées aux formes sévères.
Cependant l'utilisation de corticoïdes, d'anti-inflammatoires et/ou
d'immunosuppresseurs même par voie topique, en particulier chez des
nourrissons
ou de jeunes enfants, n'est pas anodine, expose à des effets indésirables et
ne
constituent qu'un traitement symptomatique. .
D'autre part, une phobie existe vis à vis de l'utilisation des corticoïdes ce
qui
ne facilite pas la prise en charge de cette maladie ni la compliance des
patients,
souvent mauvaise.
Enfin, Staphylococcus aureus pourrait induire une résistance aux corticoïdes
(Clin Rev Allergy Immunol 2007 33 167)
Il existe ainsi un besoin et une forte demande pour des alternatives
thérapeutiques et plus particulièrement pour des traitements préventifs. Ces
traitements visent à diminuer la fréquence et/ou l'intensité des poussées
eczémateuses que l'on observe chez les patients atteints de dermatite
atopique. Cette
approche constitue un acte de prévention tertiaire selon la définition de
l'OMS
puisqu'elle tend à éviter les complications (poussées inflammatoires) d'une
maladie
(dermatite atopique) déjà présente.
La demande W02008048076 divulgue l'utilisation de glucosamine ou un de
ses dérivés pour traiter la dermatite atopique.
La demande W02007023226 divulgue l'utilisation d'un probiotique combiné
à un prébiotique pour traiter la dermatite atopique chez les enfants.
On a maintenant constaté de manière tout à fait surprenante et inattendue
qu'une association de type glycérol, vaseline et paraffine liquide sous forme
d'une
émulsion huile dans eau ou eau dans huile permettait de prévenir la dermatite
atopique.
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Les inventeurs ont mis en évidence un effet inhibiteur de cette association
sur
l'adhésion de Staphylococcus aureus à des kératinocytes en culture.
L'association
glycérol, vaseline et paraffine liquide permet donc de prévenir le rôle
infectieux de
Staphylococcus aureus chez le patient atopique ainsi que son rôle sur
l'entretien de la
5 réaction inflammatoire par la production d'IgE spécifiques en inhibant la
colonisation de la peau par Staphylococcus aureus.
En outre, les inventeurs ont montré que cette association restaure le rôle de
barrière protectrice et fonctionnelle de la peau. Pour cela, les inventeurs
ont utilisé un
modèle de peau ex vivo de déshydratation cutanée induite. De plus, ils ont
suivi
l'expression de marqueurs épidermiques et l'activité sérine protéase.
La présente invention a ainsi pour objet une composition à usage topique
comprenant, en tant que principe actif, une association de glycérol, vaseline
et
paraffine liquide, sous forme d'une émulsion huile dans eau ou eau dans huile
pour
son utilisation pour la prévention de la dermatite atopique.
De préférence, la prévention est de type primaire.
Au sens de la présente invention, prévenir , prévention ou traitement
préventif signifie éviter l'apparition d'une maladie, d'un trouble ou d'un ou
plusieurs signes et/ou symptômes.
Au sens de la présente invention, prévention primaire ou traitement
préventif primaire signifie empêcher l'apparition des maladies atopiques
(dermatite
atopique et/ou asthme bronchique allergique et/ou rhinite allergique
communément
appelé rhume des foins ) et/ou des sensibilisations allergiques en agissant
avant
les premières manifestations cliniques de l'atopie c'est à dire dès la
naissance.
Au sens de la présente invention, on appellera association active
l'association glycérol, vaseline et paraffine liquide sous forme d'une
émulsion huile
dans eau ou eau dans huile.
Avantageusement, le glycérol, la vaseline et la paraffine liquide présentent
les
critères décrits et contrôlés selon European Pharmacopeia , hème Edition.
Avantageusement, la vaseline de l'association active présente un point de
goutte compris entre 35 et 70 C, de préférence compris entre 51 et 57 C, de
manière
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particulièrement préférée d'environ 54 C. Le point de goutte est mesuré selon
le
procédé 2.2.17 décrit dans European Pharmacopeia , hème Edition.
Avantageusement, la vaseline de l'association active présente une consistance
comprise entre 175 et 195 1/10 mm, de préférence d'environ 185 1/10 mm
(pénétration au cône à 25 C).
Avantageusement, la vaseline de l'association active présente une viscosité
comprise entre 4 et 5 cSt à 100 C, de préférence d'environ 4,8 cSt à 100 C.
Dans la composition selon l'invention, l'association active est présente selon
une proportion comprise entre 10 et 50 % et préférentiellement entre 20 et 30
% en
poids par rapport au poids total de la composition ; la concentration en
glycérol est
comprise entre 5 et 30 %, préférentiellement entre 10 et 20 % et de manière
particulièrement préférée est d'environ 15% en poids par rapport au poids
total de la
composition, la concentration en vaseline est comprise entre 3 et 20 %,
préférentiellement entre 5 et 10 % et de manière particulièrement préférée est
d'environ 8% en poids par rapport au poids total de la composition et la
concentration en paraffine liquide est comprise entre 0,5 et 5 %,
préférentiellement
entre 1 et 3 % et de manière particulièrement préférée est d'environ 2% en
poids par
rapport au poids total de la composition.
Dans la phase aqueuse, l'eau est comprise entre 30 et 80 % en poids par
rapport au poids total de la composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention comprend environ 15%
de glycérol, environ 8% de vaseline et environ 2% de paraffine liquide en
poids par
rapport au poids total de la composition.
La composition dermatologique selon l'invention comprend, en outre, des
excipients usuels dermatologiquement compatibles.
La composition dermatologique selon la présente invention peut être préparée
sous la forme d'une émulsion eau dans huile (E/H) ou huile dans eau (H/E),
d'une
émulsion multiple comme par exemple, une émulsion eau dans huile dans eau
(E/H/E) ou une émulsion huile dans eau dans huile (H/E/H), ou encore sous la
forme
d'une hydrodispersion ou une lipodispersion, un gel ou un aérosol.
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Les excipients dermatologiquement compatibles peuvent être tout excipient
parmi ceux connus de l'homme de l'art en vue d'obtenir une composition pour
l'application topique sous forme de crème, d'une lotion, d'un gel, d'une
pommade,
d'une émulsion, d'une microémulsion, d'un spray, etc
La composition selon l'invention peut en particulier contenir des additifs et
aides à la formulation, tels que des émulsionnants, des épaississants, des
gélifiants,
des fixateurs d'eau, des agents d'étalement, des stabilisants, des colorants,
des
parfums et des conservateurs.
Des émulsionnants appropriés comprennent l'acide stéarique, la trolamine, le
PEG-40-stéarate.
De préférence, la composition selon l'invention présente environ 5%
d'émulsionnants en poids par rapport au poids total de la composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 1 et 5%
d'acide stéarique, de préférence environ 3% en poids par rapport au poids
total de la
composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 0 et 2% de
trolamine, de préférence environ 0,5% en poids par rapport au poids total de
la
composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 0 et 2% de
PEG-40-stéarate, de préférence environ 0,5% en poids par rapport au poids
total de la
composition.
Des épaississants appropriés comprennent le monostéarate de glycérol, le
PEG.
De préférence, la composition selon l'invention présente environ 5%
d'épaississants en poids par rapport au poids total de la composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 2 et 10%
de monostéarate de glycérol, de préférence environ 5% en poids par rapport au
poids
total de la composition.
Des conservateurs appropriés comprennent le parahydroxybenzoate de
propyle, le chlorocrésol.
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De préférence, la composition selon l'invention présente environ 0,1% de
conservateurs en poids par rapport au poids total de la composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 0,05 et 1%
de parahydroxybenzoate de propyle, de préférence environ 0,1 % en poids par
rapport
au poids total de la composition.
Des agents d'étalement appropriés comprennent la diméthicone, le
polydiméthylcyclosiloxane.
De préférence, la composition selon l'invention présente environ 2% d'agents
d'étalement en poids par rapport au poids total de la composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 0,2 et 2%
de diméthicone, de préférence environ 0,5% en poids par rapport au poids total
de la
composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 1 et 3% de
polydiméthylcyclosiloxane, de préférence environ 2,5% en poids par rapport au
poids total de la composition.
Des fixateurs d'eau appropriés comprennent le polyéthylène glycol, de
préférence le polyéthylène glycol 600.
De préférence, la composition selon l'invention présente environ 8% de
fixateurs d'eau en poids par rapport au poids total de la composition.
Avantageusement, la composition selon l'invention présente entre 2 et 10%
de polyéthylène glycol, de préférence environ 5% en poids par rapport au poids
total
de la composition.
L'eau utilisée pour la phase aqueuse de l'émulsion peut être une eau distillée
ou une eau thermale ayant des propriétés dermato-cosmétique.
Avantageusement, la composition selon l'invention comprend :
- environ 15 % de glycérol,
- environ 8% de vaseline,
- environ 2% de paraffine liquide, et à titre d'excipients :
- environ 1 à 5% d'acide stéarique,
- environ 2 à 10% de monostéarate de glycérol,
- environ 1 à 3% de polydiméthylcyclosiloxane,
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- environ 0,2 à 2% de diméthicone,
- environ 2 à 10% de polyéthylène glycol 600,
- environ 0 à 2% de trolamine,
- environ 0,05 à 1% de parahydroxybenzoate de propyle
- jusqu'à 100% en eau.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une composition
selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir la
dermatite
atopique.
La présente invention est illustrée par les exemples suivants.
EXEMPLES
Exemple 1 : Formulations
Composition A
- 15 g de glycérol,
- 8 g de vaseline,
- 2 g de paraffine liquide,
- 0,5 g de trolamine,
- et à titre d'excipients acide stéarique, monostéarate de glycérol,
polydiméthylcyclosiloxane, diméthicone, polyéthylène glycol (PEG) 600,
parahydroxybenzoate de propyle
- eau jusqu'à 100 g.
Composition A'
- 15 g de glycérol,
- 8 g de vaseline,
- 2 g de paraffine liquide,
- 1,5 g d'acide stéarique,
- 5 g de monostéarate de glycérol,
- 1,5 g de polydiméthylcyclosiloxane,
- 0,5 g de diméthicone,
- 5 g de polyéthylène glycol 600,
- 0,15 g de trolamine,
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- 0,1 g de parahydroxybenzoate de propyle
- eau jusqu'à 100 g.
Composition B
5 - 15 g de glycérol,
- 8 g de vaseline,
- 2 g de paraffine liquide,
- 0,5 g de PEG-40-stéarate,
- et à titre d'excipients acide stéarique, monostéarate de glycérol,
10 polydiméthylcyclosiloxane, diméthicone, polyéthylène glycol 600,
chlorocrésol,
- eau jusqu'à 100 g.
Composition B'
- 15 g de glycérol,
- 8 g de vaseline,
- 2 g de paraffine liquide,
- 3 g d'acide stéarique,
- 5 g de monostéarate de glycérol,
- 2 g de polydiméthylcyclosiloxane,
- 0,5 g de diméthicone,
- 0,1 g de trolamine,
- 3 g de polyéthylène glycol 600,
- 0,5 g de PEG-40-stéarate,
- 0,075 g de chlorocrésol,
- eau jusqu'à 100 g.
Exemple 2 : Test de cytotoxicité
Principe
Le principe du test est basé sur la transformation enzymatique d'un sel de
tétrazolium, le sodium 3,3 [l [(phenyl amino) carbonyl]-3-4-tetrazolium bis
(4-
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methoxy-6nitro)] benzène sulfonic acid hydrate soit XTT, en un produit
coloré, le
formazan.
Le XTT est réduit par la déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes
en
présence d'un agent couplant d'électrons, le coenzyme Q, en un composé
hydrosoluble jaune/orangé, le formazan, dosable par spectrophotométrie à 450
nm.
Traitement par le produit
Les microplaques de 96 puits sont ensemencées à 105 cellules/ml, après 24
heures
d'incubation le milieu de culture est éliminé et les microplaques sont rincées
au PBS.
100 l des différentes dilutions de produit test sont ajoutés dans chaque
cupule de
microplaques. Des témoins sans produit sont réalisés dans les mêmes
conditions.
Les microplaques sont mises à incuber pendant 2 heures à 37 C sous 5 % de C02.
Révélation de la cytotoxicité
Après incubation, les microplaques sont lavées 2 fois au PBS. Ensuite, 100 l
d'un
mélange XTT (lmg/ml)/coenzyme Q (0,2 mg/ml) sont ajoutés dans chaque puits de
la plaque 96 puits.
Après 3 heures d'incubation, 100 l d'une solution de SDS à 10% sont ajoutés
dans
chaque puits.
La lecture immédiate de la densité optique à 450 nm est effectuée au
spectrophotomètre POLARstar (BMG, France).
Expression des résultats
La densité optique relevée est proportionnelle à la population cellulaire
viable.
Ce test nous permet donc d'analyser à partir d'une densité optique
correspondante au
témoin, une cytotoxicité cellulaire lorsque la densité optique est inférieure
à celle du
lot témoin :
% de viabilité = (DO Traité - DO Témoin)/DO Témoin X 10
Le produit est considéré cytotoxique si le pourcentage de viabilité <30%.
Les essais intra-manipulation sont réalisés 8 fois.
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Résultats
En fonction du degré de non cytotoxicité des produits les concentrations
choisies
pour le test d'adhésion sont les suivantes :
- Composition A : 6%, 3%, 1,5%, 0,8% et 0,4%
- Atopiclair : 0,8%, 0,4%, 0,2%, 0,1% et 0,05%
- Physiogel : 6%, 3%, 1,5%, 0,8% et 0,4%
- Composition B : 3%, 1,5%, 0,8%, 0,4% et 0,2%
Exemple 3 : Test d'adhésion
Principe
Marquage des bactéries par l'adénine tritiée (sigma) et détermination du taux
de
bactéries adhérées à la surface des kératinocytes par évaluation du taux de la
radioactivité.
Marquage des bactéries par l'adénine tritiée
Le marquage des bactéries s'effectue en présence de 30 Ci d'adénine tritiée
dans du
milieu de culture adéquat. Après une incubation de 18 heures à 37 C, les
microorganismes sont lavés trois fois dans du PBS pour éliminer la
radioactivité non
incorporée.
Les suspensions sont ajustées à 2x108 microorganismes/ml dans le milieu de
maintien.
Effet inhibiteur d'adhésion
500 l de bactéries marquées en présence de chaque dilution test du produit
sont
déposés à la surface du tapis cellulaire.
Après une incubation de 2 heures (37 C, 5% de C02), 3 lavages au PBS sont
réalisés.
Lyse des cellules
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Les bactéries adhérées aux kératinocytes sont lysées par 500 l d'une solution
d'hydroxyde de sodium 0,5 N à 0,1 % de sodium dodécyl sulfate pendant 18
heures à
37 C.
Le lysat de chaque puits est prélevé et placé dans les tubes de comptage. 2 ml
de
liquide de scintillation sont ajoutés dans chaque tube.
Expression des résultats
La lecture se fait au compteur B qui exprime le taux de radioactivité en cpm
(coups
par minutes).
- Le pourcentage d'inhibition d'adhésion est calculé selon la formule :
% inhibition = ((cpm Essai - cpm Contrôle)/cpm Contrôle) X 100
Le pourcentage d'inhibition d'adhésion est significatif si sa valeur <-30%.
Les essais sont réalisés en quadriplate.
Conclusion
- La composition A inhibe significativement l'adhésion du S. aureus aux
kératinocytes après 2 heures d'incubation à 6% et 3%.
- Le produit Physiogel inhibe significativement l'adhésion du S. aureus aux
kératinocytes après 2 heures d'incubation à 6% et pas à 3%.
- Le produit Atopiclair n'a aucun effet sur l'adhésion du S. aureus aux
kératinocytes
- En présence de la composition B l'adhésion du S. aureus aux kératinocytes
est
anormalement augmentée.
Exemple 4 : analyse de la régulation de la déshydratation cutanée induite
Nous évaluons ici l'activité hydratante de la composition A et l'amélioration
subséquente de la fonction barrière de la peau en utilisant un modèle de peau
ex vivo
de déshydratation cutanée induite.
Nous observons l'expression des marqueurs épidermiques moléculaires
différentiels
par PCR quantitative et immuno-histochimie.
Nous suivons également l'activité des enzymes à serine protéase par
zymographie in
situ et la dégradation de protéines cornéodesmosomales par western blotting.
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La fonctionnalité de la barrière de la peau est analysée en utilisant des
sondes
fluorescentes.
Matériel et méthodes
1. Modèles tissulaires
1. Préparation des explants cutanés
Le laboratoire récupère des prélèvements de peau provenant de déchets
opératoires de chirurgie plastique (diminutions mammaires). L'utilisation de
ces
prélèvements rentre dans le cadre de la déclaration d'activité de
conservation et de
préparation d'éléments du corps humain pour les besoins de programme de
recherche
du groupe Pierre Fabre faite au Ministère de l'Enseignement Supérieur et de
la
Recherche.
Ces prélèvements sont lavés dans 10 bains de PBS puis découpés à l'emporte-
pièce en disques de 2 cm de diamètre. Les explants cutanés sont étalés sur une
grille
dans une boîte de Pétri et un anneau de 1 cm de diamètre est scellé sur la
peau pour
délimiter la zone de traitement.
2. Cinétique des modèles
Pour le modèle de déshydratation induite, la peau est desséchée pendant 2
heures sous la hotte de culture cellulaire dans une boîte sans couvercle puis
est mise
à l'étuve pour un traitement topique avec ou sans association active pendant 2
heures. Le témoin négatif du stress de déshydratation subit la même cinétique
dans
une boîte de Pétri fermée.
3. Prélèvements pour l'analyse
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Après le traitement, 2 biopsies de 6 mm de diamètre sont prélevées pour
l'analyse de l'expression des ARN et une biopsie de 4 mm de diamètre incluse
dans
un bloc de résine Tissue Tek (Sakura Finetek) pour l'histologie. Pour
l'analyse des
protéines, la peau est exposée à un choc thermique dans un bain d'eau à 60 C
5 pendant 5 minutes puis à 4 C pendant 2 minutes afin de séparer l'épiderme du
derme.
Les biopsies et les épidermes sont congelés dans l'azote liquide et stockés à -
80 C avant d'être analysés.
10 II. Analyse du transcriptome par PCR quantitative
Les biopsies de peau sont broyées dans un mortier préalablement refroidi à
l'azote liquide et les ARNs sont extraits grâce à un kit RNeasy (QIAGEN)
selon
les recommandations du fournisseur. L'ARN est ensuite dosé à l'aide d'un
Bioanalyser 2100 (Agilent Technologies) sur puces RNA 6000 Nano LabChip .
15 L'ADNc est obtenu à partir d'l g d'ARN par réaction enzymatique de rétro-
transcription réalisée avec un kit Acces RT-PCR Core Reagents (Promega), à
l'aide
d'amorces oligo dT. Les niveaux d'expression génique sont analysés par PCR
quantitative sur un thermocycleur à. fluorescence ICycler iQ (Biorad) avec
des kits
PCR iQTMSYBR Green Super Mix (Biorad) suivant un protocole de 40 cycles
comprenant une dénaturation à 95 C (15 sec) et une élongation à 60 C (l mm).
L'accumulation du produit de PCR proportionnelle à l'émission de fluorescence
(intercalant SYBR(WGreen) est visualisée cycle après cycle grâce au logiciel
iCycler.
Le logiciel d'analyse iCycler version 3.1 délivre des valeurs brutes de CT
(Cycle Threshold): cycle à partir duquel l'amplification d'ADNc débute.
L'expression de plusieurs gènes de référence est analysée en parallèle à
l'aide du
programme Genorm version 3.4 qui permet de choisir le gène de référence le
plus
stable d'un échantillon à l'autre. Ce gène sert ensuite de référence pour la
normalisation des résultats par le calcul du ACT = CT gène d'intérêt CT gène
de
référence.
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Le facteur d'induction (FI) est ensuite calculé pour chaque traitement par
rapport à la condition contrôle correspondante. FI = 2 - cr où AACT = ACT
traité -
ACT contrôle L'expression des ARNm est évaluée en duplicate pour cinq
expériences provenant de 5 individus différents. Lorsque le facteur
d'induction par
rapport au contrôle est supérieur à 2, on considère que l'expression du gène
est
induite et lorsqu'il est inférieur à 0,5, on considère que l'expression est
réprimée.
L'effet du principe actif sur la réponse au stress causée dans le modèle est
évalué par
le pourcentage d'inhibition calculé avec la formule suivante:
% d'inhibition = 100 * (FI stressé- FI témoin sans stress) - (FI traité - FI
témoin sans stress)
de réponse au stress (FI stressé - FI témoin sans stress)
Par rapport au modèle d'étude, la condition témoin sans stress correspond
au contrôle non desséché; la condition stressé correspond à une biopsie de
peau
qui a été desséchée 2 heures puis qui a passé 2 heures supplémentaire en
condition
contrôle (c'est-à-dire sans traitement topique); enfin la condition traité
est la peau
qui a subi 2 heures de dessèchement suivies de 2 heures de traitement topique
par un
émollient.
III. Analyse de l'expression protéique par Western Blot
Les épidermes traités sont broyés dans un mortier refroidi à l'azote liquide
et
les protéines sont extraites dans un tampon de lyse RIPA (Tris HCI pH8 5OmM;
NaCL l5OmM; Triton X 100 IX; Na+Desoxycholate 1%; SDS 0,1%; EDTA 5mM ;
DTT 100mM; cocktail d'inhibiteur de protéases (référence P8340, SIGMA).
Les protéines sont ensuite dosées par la méthode DC-DC Protein Assay
(Biorad) et analysées par Western Blot. Pour chaque condition, 25 à 40 g de
protéines totales sont déposées sur des gels Tris-Glycine à 7,5% de
polyacrylamide.
Le mélange protéique est séparé par électrophorèse à l'aide du système Mini
Protean
II (Biorad) et les protéines sont transférées sur une membrane de PVDF (Hybond-
P,
Amersham). La protéine d'intérêt est révélée par un anticorps spécifique et un
kit
ECL+ (Amersham). La quantité de protéines et la proportion de forme dégradée
sont
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calculées grâce au logiciel Image Master TotalLab version 1.11 (Amersham)
après
normalisation par rapport à la (3-actine (protéine de référence).
IV. Techniques histologiques
Les biopsies de peau sont sectionnées au cryotome (Leica CM 3050s) en
coupes de 5 m d'épaisseur et déposées sur des lames d'observation
(Starfrost(W).
1. Immunohistochimie
Les cryocoupes sont fixées 10 minutes à l'acétone à 20 C puis réhydratées au
PBS avant d'être analysées par marquage immunochimique. Après fixation et
réhydratation, les coupes de peau sont saturées avec une solution de BSA 3% et
incubées 1 heure avec l'anticorps primaire dirigé contre la protéine
d'intérêt. Dans un
deuxième temps, elles sont incubées pendant 1 heure avec l'anticorps
secondaire
couplé à un fluorochrome Alexa-488 ou Alexa-555 et enfin montées dans du
Mowiol
contenant du DAPI pour marquer les noyaux.
2 Zymographie in situ
Après une fixation de 10 minutes dans l'acétone à -20 C, les coupes sont
rincées dans une solution de lavage (Tween 20 1% dans l'eau) et incubées 2
heures à
37 C avec une solution contenant le substrat spécifique des enzymes d'intérêt
couplé
à un fluorophore (annexe). Lorsque l'enzyme est active, le fluorophore est
clivé,
libérant un signal fluorescent observable au microscope. Les lames marquées
sont
ensuite observées au microscope à épifluorescence (Nikon Eclipse 50i) ou au
microscope confocal inversé Zeiss Axiovert 100.
3 Sonde fluorescente
Après le traitement de déshydratation, les explants cutanés sont incubés
pendant une heure supplémentaire à l'étuve à 37 C avec une sonde fluorescente
Lucifer Yellow Carboxyhydrazide dilithium salt (Invitrogen) à lmM dans du
tampon
HBSS. La peau est ensuite rincée dans un bain d'HBSS pendant 1 minute puis des
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biopsies de 4mm de diamètre sont prélevées et incluses dans de la résine
Tissue
TekR (Sakura Finetek) (Matsuki et al 1998). La peau est ensuite coupée, les
noyaux sont marqués au DAPI et les lames sont observées au microscope à
fluorescence à une longueur d'onde de 450 nm comme décrit ci-dessus.
Résultats
1. Modèle de rupture de la fonction barrière par dessèchement induit
1. Mesure de la perméabilité cutanée par une sonde fluorescente
La première analyse a consisté à étudier un paramètre fonctionnel
fondamental dans la fonction barrière cutanée : la perméabilité des couches
supérieures de l'épiderme. L'incubation de la peau avec une sonde fluorescente
(Lucifer Yellow) après l'expérience de dessèchement a permis de caractériser
la
modulation de la perméabilité cutanée. En condition contrôle, le marquage est
très
faible et superficiel, la sonde pénètre peu à travers la couche cornée et est
éliminée
lors du rinçage. Après deux heures de dessèchement, le marquage est observable
dans les strates plus profondes de la couche cornée. Le dessèchement rend la
peau
plus perméable, sa fonction barrière est détériorée. Le traitement topique par
la
composition A suite aux deux heures de dessèchement restaure l'imperméabilité
du
SC vis à vis de la sonde, le marquage est à nouveau faible et superficiel,
comme dans
la condition contrôle. On peut alors conclure que le traitement hydratant a un
effet
réparateur sur la peau desséchée et sur la fonction barrière cutanée
observable sur le
modèle tissulaire.
2. Effets sur la régulation du transcriptome et du protéome
L'expression de différents gènes potentiellement impliqués dans
l'homéostasie de la fonction barrière épidermique a été mesurée par PCR
quantitative
dans les différentes conditions de stress ou de traitement du modèle de
dessèchement.
L'analyse par immunohistochimie a permis de montrer la réorganisation de
l'expression de certaines protéines en termes de localisation, par exemple les
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jonctions serrées. La dégradation des protéines cornéodesmosomales a été
analysée
par Western-Blot.
Les cibles étudiées à l'aide de ces différentes approches ont été regroupées
selon leur rôle physiologique (voir tableau 1). L'objectif de cette étude est
d'observer
une réponse au stress visualisable et une correction de l'effet du stress par
l'application topique de la composition A.
Le travail réalisé a également permis de mettre en évidence les différents
niveaux de régulation de certaines cibles. Nous avons ainsi pu constater que
les
enzymes de la desquamation n'étaient pas régulées au niveau transcriptionnel
mais
plus spécialement au niveau de leur activité (Cf. Résultats 3.)
Tableau 1 : Récapitulatif des cibles et de la réponse pharmacologique étudiées
dans le modèle de dessèchement.
O=La cible réagit dans le modèle ; O=Oui
X=La cible ne réagit pas dans le modèle N=Non
Inhibition de la réponse au stress par la
Cible Réponse au stress
composition A
Perméabilité cutanée O O
Desmogléine 1 0 0
Cdsn X X
Desmocolline O O
Plakoglobine O X
KLK5 O X
KLK7 X X
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KLK8 X X
Protéases à sérine O O
Cathépsine D X X
ABC A12 O O
ABC G1 X X
B-GC X X
DES 2 X X
Filaggrine O O
Involucrine x X
TG1 X X
TG3 X X
Caspase 14 X X
Elox-3 O X
12R-LOX X X
HAS 2 O X
CD44 X X
AQP3 O O
NHE1 O O
IL-la O O
Occludine O O
Claudine 1 0 0
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Claudine 4 0 0
zO-1 X X
E-Cadherine X X
(3Catenine X X
3. Mesure de l'activité enzymatique liée à la desquamation
L'activité des protéases à sérine a été évaluée par zymographie in Situ sur le
modèle de déshydratation et observée au microscope confocal dans la condition
contrôle après deux heures de dessèchement et après deux heures de
dessèchement
suivies par une incubation de deux heures avec la composition A. Le marquage
est le
plus intense dans la condition contrôle, il correspond à une activité forte
normale. Ce
marquage diminue et devient irrégulier le long de la couche cornée après deux
heures
de dessèchement alors que son intensité est augmentée et la localisation de
l'activité
réorganisée après les deux heures d'incubation avec la composition A. Le
dessèchement a pour effet de diminuer et perturber l'activité enzymatique. Ces
résultats sont cohérents avec la diminution de la dégradation des protéines
cornéodesmosomales que nous observons avec le dessèchement et confirme l'effet
du dessèchement sur la diminution de la desquamation observée sur le modèle
mis au
point. La composition A est capable de restaurer l'activité enzymatique de la
peau
déshydratée ce qui confirme l'effet de cette composition pour un retour de
l'homéostasie de la desquamation.
Ces résultats montrent que la composition A permet de restaurer le niveau
d'expression des cibles moléculaires dont l'expression est accrue par le
stress de
déshydratation cutané induit. La composition A permet également de restaurer
l'activité sérine protéase. En outre, l'application topique de la composition
A permet
de supprimer l'inflammation induite par le stress.
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L'ensemble de ces résultats suggère que la composition A en application
topique permet de restaurer la fonction barrière de la peau, de limiter voire
d'empêcher la colonisation par le staphylocoque doré et constitue ainsi un
traitement préventif primaire empêchant l'apparition des maladies atopiques
(dermatite atopique et/ou asthme bronchique allergique et/ou rhinite
allergique
communément appelé rhume des foins ) et/ou des sensibilisations
allergiques.
