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PROCEDE DE DETECTION D'ANOMALIES CHROMOSOMIQUES
L'invention concerne la détection d'anomalies chromosomiques par hybridation
de sondes
d'acide nucléique spécifiques.
Arrière-plan technologique :
Les anomalies chromosomiques, qu'elles soient constitutionnelles ou acquises,
sont à
l'origine de nombreuses pathologies. Elles peuvent être équilibrées (c'est-à-
dire ne
s'accompagnant pas de perte de matériel chromosomique) ou déséquilibrées,
c'est-à-dire
s'accompagnant de pertes ou de gains de matériel chromosomique. On parle alors
de
déséquilibres génomiques. Avec les techniques dont on dispose aujourd'hui en
routine
(caryotype en bande et hybridation in situ fluorescente), on estime que les
anomalies
chromosomiques, sont responsables de 10 à 15% des retards mentaux et des
malformations
congénitales. Par ailleurs, elles sont très fréquemment retrouvées associées
dans les cellules
cancéreuses. Dans de très nombreux cas, elles en déterminent le pronostic, et
elles permettent
d'en comprendre la cause moléculaire et d'envisager des traitements ciblés.
C'est pourquoi
que ce soit en pathologie constitutionnelle ou dans les cancers, le diagnostic
des anomalies
chromosomiques est fondamental tant pour le traitement que pour la recherche.
Les anomalies chromosomiques peuvent être visibles au microscope ou non.
Lorsqu'elles le
sont, leur détection est assurée par les techniques classiques du caryotype.
Mises au point
dans les années 60, elles permettent de visualiser les chromosomes avec une
succession, le
long de leur axe longitudinal, de bandes claires et plus sombres
caractéristiques de chaque
paire de chromosomes. L'examen de la morphologie globale des chromosomes et de
l'ordonnancement des différentes bandes permet d'établir le caryotype. La plus
petite des
bandes observables est de 5 millions de paires de bases (5 mégabases ou Mb).
Ceci est une
première limite à cette technique. Une deuxième est que des échanges de
régions
télomériques, de même taille et dont la teinte (en générale noire) est
identique, ne peuvent être
détectés par les techniques classiques du caryotype. Ces anomalies non
détectables par les
techniques de bandes sont dites cryptiques.
Une approche pour détecter ces anomalies chromosomiques cryptiques met en
oeuvre des
sondes fluorescentes spécifiques qui hybrident sur les chromosomes. Cette
technique, appelée
FISH pour fluorescence in situ hybridization (FISH), consiste à hybrider
sur l'ADN cible
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un fragment d'ADN complémentaire dans lequel a été introduit un fluorochrome
(opération
dite de marquage). Un tel fragment d'ADN est appelé sonde. L'hybridation in
situ en
fluorescence peut être mise en oeuvre sur des chromosomes métaphasiques,
auquel cas elle
utilise des sondes spécifiques d'un chromosome, d'un bras, d'une région
chromosomique, d'un
locus donné. La révélation des anomalies chromosomiques s'effectue par une
visualisation au
microscope des sites fluorescents correspondant aux sites de l'ADN cible
s'étant hybridés avec
les sondes.
L'une des indications majeures de la FISH est la détection des anomalies
cryptiques
télomériques. Ces anomalies occasionnent à elles seules près de 5% des retards
mentaux avec
malformations. Par ailleurs, dans les cancers, il a été décrit des anomalies
télomériques
(équilibrés dans ces pathologies) dont la fréquence est importante. C'est
ainsi que la t(12 ;21)
des leucémies aiguës de l'enfant est invisible par les techniques classiques
de cytogénétique
alors qu'elle est l'anomalie génétique la plus fréquente dans cette pathologie
(Romana et al,
Genes Chromosomes Cancer, 1994, 9(3):186-91). Les systèmes de détection des
anomalies
chromosomiques disponibles pour l'instant dans le commerce sont composés d'un
ou deux
sondes représentant les extrémités télomériques d'une ou de deux paires
chromosomiques.
Cela suppose, si l'on veut étudier l'ensemble des extrémités, d'hybrider ces
sondes sur une ou
plusieurs lames, en les déposant sur différentes parties de ces lames. Ce
système suppose des
préparations chromosomiques riches en métaphases pour que des mitoses soient
présentes sur
toutes les parties de la lame où seront déposées les différentes sondes. Ces
prés requis ne
peuvent être atteints pour les préparations de chromosomes venant de cultures
d'amniocytes
en cytogénétique constitutionnelle prénatale, ni dans les cancers. Pour ces
deux situations, il
restait nécessaire de développer un système permettant l'étude de l'ensemble
des extrémités
chromosomiques sur une ou deux mitoses.
C'est ce à quoi Brown et al (Nature Medicine, 7(4) :497-501) ont voulu
répondre en
développant le système M-Tel. Dans ce système, les sondes télomériques d'un
chromosome
sont marquées avec une combinaison spécifique de fluorochrome. Ainsi, ils
purent fabriquer
des sondes spécifiques de 12 chromosomes, détectables chacune après
l'hybridation sur une
seule métaphase. En utilisant deux lots de sondes, l'ensemble des 23 paires
chromosomiques
pouvait être exploré en étudiant deux mitoses. Ce test, utilisé ensuite dans
l'étude Brown et al,
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2002, Blood, 99(7) :2526-253 1, présente néanmoins certains inconvénients. En
particulier, les
sondes utilisées produisent un signal faible, avec un rapport signal/bruit
bien trop élevé.
Il existait toujours un besoin d'un test de détection des anomalies
télomériques cryptiques, qui
soit rapide, pratique, et fiable. Le test proposé par les inventeurs répond à
ces exigences et est
en outre utilisable non seulement pour le diagnostic des pathologies
chromosomiques
constitutionnelles prénatale et postnatale, mais aussi pour le diagnostic de
celles associées aux
cancers. Ce test est également particulièrement adapté à la détection
d'anomalies
chromosomiques équilibrées.
Résumé de l'invention
L'invention fournit un procédé in vitro pour détecter des anomalies
chromosomiques chez un
animal, de préférence un vertébré, de manière plus préférée un mammifère,
comprenant :
- l'hybridation in situ de n chromosomes d'une préparation de chromosomes
métaphasiques
avec des ensembles d'une pluralité d'acides nucléiques, chaque ensemble
hybridant sur une
longueur de 700 000 à 3 000 000 pb, de manière spécifique aux extrémités
subtélomériques
spécifiques desdits chromosomes, chaque ensemble étant marqué de manière
détectable par
un fluorochrome, de telle sorte que chaque chromosome est distinguable par un
fluorochrome
particulier ou une combinaison particulière de fluorochromes,
n étant un nombre entier compris entre 2 et le nombre total de chromosomes du
dit animal,
le nombre total de fluorochromes utilisés étant un entier inférieur à n,
- la détection de la fluorescence émise par les fluorochromes, par ce en quoi
des anomalies
chromosomiques sont détectées.
Légende de la Figure :
La Figure montre un protocole général de l'obtention de l'ADN des clones
télomériques.
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Description détaillée de l'invention
Définitions :
Une extrémité subtélomérique spécifique est la région spécifique d'un
chromosome la
plus proche de la séquence consensus télomérique d'un chromosome (commune à
tous les
chromosomes). Elle se situe en générale entre 100 à 300 kb des séquences
consensus.
Un télomère ou extrémité télomérique est une région hautement
répétitive, non
codante, d'ADN à l'extrémité d'un chromosome. Chez l'homme, la séquence TTAGGG
est
spécifique des télomères et est répétée plusieurs centaines de fois. Cette
séquence est
commune à tous les chromosomes.
Par hybridation spécifique on désigne la capacité d'un ensemble d'une
pluralité de
nucléotides à s'hybrider à une séquence d'ADN donnée. En d'autres termes, un
ensemble
s'hybridant de manière spécifique à une extrémité subtélomérique d'un
chromosome ne
s'hybride pas à une autre extrémité subtélomérique. Par exemple, un ensemble
s'hybridant de
manière spécifique à l'extrémité subtélomérique du bras long du chromosome 1
ne
s'hybridera pas à l'extrémité subtélomérique du bras court du chromosome 1, ni
à aucune
autre séquence de ce chromosome ou d'un autre chromosome.
Pour des raisons de commodité, on appelle dans ce qui suit "chromosome cible",
le
chromosome suspecté d'être affecté par une anomalie.
Préparation des échantillons
Les échantillons à tester sont des préparations de liquides ou tissus
biologiques contenant des
chromosomes métaphasiques d'un animal. De préférence il s'agit d'échantillons
sanguins, de
liquide amniotique dans le cas de diagnostic prénatal ou de moelle osseuse
pour les
hémopathies malignes.
De préférence l'animal est un mammifère, de préférence un humain, quel que
soit son sexe ou
son âge. Il peut s'agir d'un embryon, d'un foetus, d'un nouveau-né, d'un
enfant, d'un
adolescent, ou d'un adulte.
Les échantillons sont préparés comme pour une analyse cytogénétique classique
sur lame,
qu'il s'agisse de prélèvements mis en culture ou analysés directement.
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Une procédure générale pour préparer des chromosomes métaphasiques consiste à
mettre en
culture, si possible, les cellules contenant les chromosomes à analyser et à
les arrêter en
mitose avec un inhibiteur du fuseau mitotique, par exemple avec de la
colchicine. Les
chromosomes sont ensuite fixés avec un mélange acide acétique/méthanol, puis
étalés sur
5 lame.
Sondes utilisées :
Le procédé de l'invention utilise des sondes d'acides nucléiques qui couvrent
une longueur de
700 000 à 3 000 000 bases (pb) contiguës d'au moins une extrémité
subtélomérique de chaque
chromosome cible. De préférence, les sondes couvrent au moins 800 000 pb, de
préférence
encore au moins 1 Mb, de manière encore préférée 1 à 1,5 Mb, des extrémités
subtélomériques spécifiques des chromosomes.
Les sondes sont constituées par un ensemble d'une pluralité d'acides
nucléiques (ci-après
un ensemble ) recouvrant tout ou parties de l'extrémité subtélomérique
spécifique du bras
long ou du bras court du chromosome cible. La pluralité d'acides nucléiques
est composée
d'acides nucléiques complémentaires de parties contiguës de l'extrémité
subtélomérique dont
l'ensemble est spécifique. Ces parties contiguës peuvent éventuellement être
légèrement
chevauchantes.
L'extrémité subtélomérique à laquelle hybrident les sondes n'est pas celle
d'un bras court
d'un chromosome acrocentrique (i.e. les chromosomes 13,14,15,21 et 22 chez
l'être humain).
Comme illustré dans le tableau 2, les ensembles d'acides nucléiques hybrident
à une distance
variable du télomère, selon le chromosome visé. Par exemple, les ensembles
d'acides
nucléiques utilisés dans les exemples hybrident à une distance de 4110 pb de
l'extrémité
proximale du télomère 21q, ou 828 698 pb de l'extrémité proximale du télomère
lp. Cette
distance est liée à l'impératif de spécificité de la sonde. En effet,
certaines régions même
subtélomériques d'un chromosome donné peuvent avoir des séquences d'ADN
communes
avec d'autres chromosomes. La taille de ces séquences partagées peut être
variable selon les
chromosomes. C'est ce qui explique la variabilité, selon les chromosomes, de
la distance qui
existe entre la séquence consensus télomérique et l'extrémité distale de la
sonde
subtélomérique spécifique.
Le nombre total de chromosomes présents dans les cellules normales d'un animal
donné est
fixe et connu. Ainsi, les cellules d'un être humain comprennent normalement 23
paires de
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chromosomes, dont une paire correspond aux chromosomes XX ou XY. Dans le
procédé de
l'invention, n chromosomes sont analysés de manière simultanée, n étant un
nombre entier
compris entre 2 et le nombre total de chromosomes de l'animal. De préférence,
au moins 12
chromosomes sont analysés simultanément.
Selon un mode préféré de l'invention, l'ensemble d'une pluralité d'acides
nucléiques est
produit par amplification d'un ou plusieurs BAC dans lesquels est inséré un
fragment de
l'extrémité subtélomérique du chromosome cible. Différents sites Internet
permettent de
visualiser la position de ces BACs le long de chaque chromosome. Par exemple,
sur le site de
l'UCSC (http://genome.ucsc.edu/)
L'amplification peut être réalisée par tout moyen d'amplification d'ADN connu
de l'homme
du métier. A titre exemple, on peut citer une amplification par PCR ou une
amplification du
type Rolling-Circle Amplification (RCA).
Marquage des sondes :
Dans le procédé de l'invention, chaque ensemble est marqué de manière
détectable par un
fluorochrome, de telle sorte que chaque chromosome est distinguable des autres
chromosomes
par un fluorochrome particulier ou une combinaison particulière de
fluorochrome.
Les acides nucléiques composant l'ensemble d'une pluralité d'acides nucléiques
peuvent être
marqués avec des nucléotides conjugués avec une molécule fluorescente, ou
fluorochrome
(marquage direct).
L'incorporation de nucléotides conjugués avec un fluorochrome dans les sondes
de
l'invention peut être réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier,
notamment par
nick-translation ou PCR.
De manière alternative, les acides nucléiques peuvent être marqués avec des
nucléotides
conjugués avec une molécule reconnue spécifiquement par un ligand, de
préférence un
anticorps conjugué à un fluorochrome (marquage indirect).
Plus particulièrement, le marquage indirect des sondes utilisées pour
l'hybridation in situ du
chromosome cible est réalisé par un couplage de chacune d'elles à un haptène,
et par une
réaction d'affinité entre cet haptène et un ligand apte à se lier
spécifiquement au dit haptène et
qui est, soit conjugué à un fluorochrome, soit rendu fluorescent par réaction
avec un contre-
ligand conjugué à un fluorochrome.
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A titre d'exemples d'haptènes susceptibles d'êtres employés pour un marquage
indirect des
sondes utiles dans la présente invention, on peut notamment citer :
-la digoxigenine, le dinitrophénol et le 2-acetylaminofluorène, auquel cas la
réaction d'affinité
haptène/ligand est avantageusement réalisée au moyen d'anticorps dirigés
contre ces
composés et conjugués à un fluorochrome ;
-la biotine, auquel cas la réaction d'affinité haptène/ligand est
avantageusement réalisée au
moyen d'avidine conjuguée à un fluorochrome, ou en utilisant des anticorps
anti-biotine, puis
des anticorps dirigés contre ces derniers et qui sont conjugués à un
fluorochrome.
Les fluorochromes utilisés peuvent être indifféremment choisis parmi
différents composés
fluorescents utilisés pour le marquage de sondes nucléiques tels que la
fluorescéine
(fluorescéinate de sodium) et ses dérivés tels que l'isothiocyanate de
fluorescéine (FITC); la
rhodamine et ses dérivés tels que la tetraméthyl rhodamine isothiocyanate
(TRITC); le
diaminidophényl indo (DAPI); l'acridine; les colorants fluorescents à amines
réactives tels
que l'ester succinimidylique de l'acide 6-((725 ami no-4-mhétylcoumnarin-3-
acétyl)amino)
hexanoque (A. NICA); les colorants fluorescents vendus sous les dénominations
commerciales BODIPY telles que BODIPY'J, FR-Br, BODIPY R6G, BODIPY TMR,
BODIPY TR et les BODIPY 530/550 vendus par la société Bio-Rad Inc. (USA), les
colorants
Cascade Blue (Trilink BioTechlnologies USA), Cy2, Cy3. Cy3.5. CYS, Cy5.5, et
Cy7 (Bio-
Rad Inc., USA), DABCYL et EDANS (Eurogentec, BE); l'Eosine; l'Erythrosine; le
6-Farn et
le Texas Red. La coumarine et son dérivé la diéthyl aminométhyl coumarine
(DEAC) sont des
fluorochromes également préférés.
Le procédé selon l'invention est un procédé en multi-fluorescence. En d'autres
termes, le
nombre de fluorochromes utilisés pour la détection des anomalies
chromosomiques est
inférieur au nombre n de chromosomes analysés. Les chromosomes sont donc
marqués de
manière combinatoire pour pouvoir les distinguer les uns des autres. Ce
marquage des
chromosomes est réalisé par chaque ensemble d'une pluralité d'acides
nucléiques.
De préférence, les extrémités subtélomériques des bras courts et longs (p et
q, respectivement)
d'un même chromosome sont marquées avec le même fluorochrome ou la même
combinaison
de fluorochromes.
Dans un mode de réalisation préféré, on utilise au moins quatre fluorochromes
(par exemple
un marquage direct par les fluorochromes FITC, rhodamine, Coumarine, et un
marquage
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indirect par la Biotine, cette dernière étant révélée par de la streptavidine
marquée au Cy5), ce
qui permet 15 combinaisons différentes de fluorochromes (24-1). Pour détecter
des anomalies
sur l'ensemble des chromosomes d'un animal ayant plus de 15 chromosomes, on
peut alors
utiliser deux lots de sondes (pour 12 chromosomes pour l'un et 11 chromosomes
pour l'autre
pour l'étude de chromosomes humains, pour un total de 41 sondes qui hybrident
toutes les
extrémités des bras longs et courts des chromosomes humains, sauf les bras
courts des
chromosomes acrocentriques). Ainsi peuvent être étudiées, à partir de
l'analyse d'une mitose
choisie sur deux zones différentes d'une lame sur laquelle ont été déposés les
deux lots de
sondes, toutes les extrémités télomériques. De préférence, les lots de sondes
sont regroupées
de manière à éviter d'analyser dans un même groupe des chromosomes se
ressemblant du
point de vue cytogénétique (par exemple, les chromosomes 21 et 22 humains sont
de
préférence analysés par 2 lots différents).
Le tableau 1 ci-dessous illustre de manière théorique les 15 combinaisons
possibles pour 4
fluorochromes différents :
Tableau 1 :
Marquage FITC Rhodamine Coumarine Biotine
1 X
2 X
3 X
4 X
5 X X
6 X X
7 X X
8 X X X
9 X X X
10 X X X
11 X
12 X X
13 X X
14 X
15 X X
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Hybridation :
L'hybridation est réalisée selon les conditions classiques d'hybridation in
situ (Romana et al.
1994, supra) ; A titre indicatif, les chromosomes métaphasiques en suspension
dans un
mélange acide acétique/méthanol (1/3-2/3) sont étalés sur des lames. Après
avoir été séchées
à l'air, elles sont plongées 5 minutes dans une solution saline 2XSSC,
déshydratées dans des
solutions d'alcool de concentration croissante (60% à 100%) et séchées à
l'air.
Les deux lots de sonde sont ensuite dénaturés pendant 10 minutes à 70 C dans
50%
Formamide (FLUKA) /2XSSC (Standard Sodium Citraté) à pH 7. Les sondes
dénaturées sont
déposées sur la lame à deux emplacements différents et recouvertes par deux
lamelles scellées
hermétiquement avec une colle type rubber cement . L'ensemble est mis sur
une plaque
chauffante pendant 3 à 4 minutes. L'ensemble est ensuite mis à hybrider durant
18 heures à
37 C dans une chambre humide. Les lavages post-hybridation sont effectués à 72
C pendant 5
minutes dans du tampon 1XSSC.
Dans le cas d'utilisation de sondes marquées à la digoxigénine ou à la biotine
notamment, la
détection des sondes se fait par une utilisation d'anticorps couplés à des
fluorochromes
différents.
Dans le cas d'utilisation de sondes directement marquée avec des
fluorochromes, on peut
procéder tout de suite à la contre-coloration des chromosomes avec du DAPI (l
g/ml,
Molecular Probes) et au montage des lames dans du p-phenyl-diamine.
Des variations de ces modes opératoires sont présentées dans la partie
expérimentale.
Visualisation :
La révélation se fait généralement après 18 heures d'incubation à 37 C.
Les lames sont observées à l'aide d'un microscope à épifluorescence équipé
d'une caméra
CCD et de filtres appropriés. Les images sont analysées à l'aide d'un système
informatique de
traitement d'image.
Une anomalie chromosomique sera détectée en cas d'absence de signal au niveau
d'une
extrémité subtélomérique d'un chromosome cible, ou en cas de signal qui n'est
pas localisé au
niveau du chromosome correspondant à la sonde.
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Applications :
Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre pour la détection de deux
chromosomes ou
plus ou, de préférence, pour l'ensemble des chromosomes de la préparation de
chromosomes.
Le procédé de l'invention est utilisable non seulement pour le diagnostic des
pathologies
5 chromosomiques constitutionnelles, mais aussi pour le diagnostic des
cancers. Ce test est
également particulièrement adapté à la détection d'anomalies chromosomiques
équilibrées.
Il est notamment utile en diagnostic de routine, pour la vérification des
anomalies
chromosomiques suspectées par un examen chromosomique par les techniques de
bandes.
Par ailleurs, il peut être mis en oeuvre pour le diagnostic des anomalies
chromosomiques
cryptiques en pathologie chromosomique constitutionnelle prénatale et
prénatale et dans les
cancers, notamment dans les hémopathies malignes (où elles sont souvent
équilibrées).
10 La zone d'hybridation entre l'extrémité subtélomérique analysée et
l'ensemble d'une pluralité
d'acides nucléiques qui lui est spécifique permet la détection d'un signal de
forte intensité.
Ceci a pour principal avantage d'augmenter le rapport signal/bruit.
En outre, le marquage fluorescent combinatoire est particulièrement avantageux
si la quantité
d'échantillons disponible pour le diagnostic est restreinte. En effet, comme
indiqué ci-dessus,
l'utilisation d'une combinaison de 4 fluorochromes permet une analyse sur deux
mitoses.
Les exemples et figures illustrent l'invention sans en limiter la portée.
EXEMPLES
Exemple 1 : Construction de 41 sondes télomériques
Les sondes sont préparées à partir de BACs (Bacterial Artificial Chromosome).
Un BAC est
un fragment d'ADN humain, de taille comprise généralement entre 150.000 et
200.000 paires
de bases (150kb - 200kb), inséré dans un plasmide transfecté dans E. Coli.
Différents sites Internet permettent de visualiser la position de ces BACs le
long de chaque
chromosome. En consultant le site UCSC (http://genome.ucsc.edu/), les
inventeurs ont
sélectionné 286 BACs situés au niveau des régions subtélomériques spécifiques
des bras
longs et courts de tous les chromosomes, à l'exception de celles des bras
courts des 5
chromosomes acrocentriques (13, 14, 15, 21 et 22) qui sont composés de
séquences répétées
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communes à ces 5 chromosomes. Pour les 41 extrémités (23 paires chromosomiques
moins
5), les BACs ont été choisis en contiguïté sur une distance d'au moins 800 000
paires de bases
(800 kb) de façon à obtenir une sonde générant un signal puissant.
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O M CO
Z N _ CD cq
C L~L J N m m X N N Lu (D O (n J J
C ) C> O Z Q Cf) oLU LU _ Q Z Z m LU 0
Q _ U U
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0) r N O M M M CO LO LO f- N O CO O N M O
3 r Ln O M CO M N CO O M N N O N r- O N M
C7 N (n C7 O (n
W
c
Cf) Cf) M Cf) Cf)
ns O U 2 O = 2 O O 2 U = N N 2 2 Z N 2 N N
= D D O U) _ D D D D 0 D D
Cf) Cf)
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r U U 2 0 C~ U LL U 2 O_ m 2 Z Y W U 2 U 2 Y
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O 00 (M 00 M O CO O L() O N- O O O LO 00 O
t) N 00 f~ Lf) O M O N N M O O O M
C 0_ 0_ 0_ r 0_ 0_ 0_ 0- r 0_ 0_ 0_ 0_ 0_ 0_
c
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03 COD Q. Ln 00 M
Q
O 00 N Ln Q. 00 N Ln Co 00
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N
r r r y r r y
E y y d y
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H r H r H N H N H M
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H H H J 2 U Y X~ J c m W
W LL LL LL
UUU~ z z
N N LL LL
N Lf) LO N
LL N p O O N CO O O) 00 LO M N N O N N CO CO
X CO N N O) r 4 N N- M r 0 00 O Ln Ln m M CO O) Lf) CO O O o0 Lf)
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O r W W N W N W N- M _ rl- O) O) Ln O7 Ln Ln
Ln (n (n
N (n C.1 (~ U C.1 U _ CO CO (n N U) cq U) U)
M U 2 2 M 2 M 2 2 2 2 2
~ O O O O 0 0 0 0 0 ~ 0 0
W 0 = 2_ 0 0 0 0 0 D 0
Q
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M M N O) r Ln r r O M N Ln CO CO M O) N O) r N CO O) Ln CO r
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r- O N- N CO Ln M N CO M N M O O O o0 M CO O O M O Ln r- -
00 O) co N M N N- Lf) r N O M CO M l CO - M N N N r CO O) N co M r
O O O O O O M M M C O O O O C O Ln N Ln C O Ln Ln Ln M O C O O N-
U U U U U U c a c a o D U U U 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00000
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
CO O) M M O M N N_ N C4 C4 N O - O) M C4 O C4 Ln N O N
M M O Ln M O N CO CO O co co CO
N m Ln O) CO CO O) N-
N- O N Lf) N CO - O N- co C4 N O O) O) M O co m co Lf) Lf) - CO - O - O W
CO O) N CO O co N M N- W N C4 O N O N- Ln (M co CO co M
O) 00 Ln O) N- O) N- W O) N- M O W O N CO co O O) W
N N N N N N
r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r
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M N CO Ln Ln CO O) M N O M N N
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O N- Ln Ln CO C4 _ N _ Ln co CO O) M
O) CO O) O CO co O) O N- C4 N O) O O O C4 co N O
rl- N- O O) M oo M N N M r- M Lf) O) O W W O N W O O O Ln o0 C4 Ln o0 Ln C4 rl-
N Ln O N N o0 Lf) M O oo CO Ln m O) N O r- N M N C4 Ln M O)
M co Ln N CO O 00 00 00 co r- N- N- N W O M N- O O O O O O
r- Ln O N Ln O) O) O) O) (M O) O) O) O) M O M N O NO r N Lf) O) O) O) O) 00
N- O) N N Ln CO N-
r- r O) r r N N Ln m N r O N- Ln Lf) r r r m O m O m
C O M O M O ) f ~ Lf) f ~ M N M O MN O N O ) O ) M oo Ln O M O M
f- M O O) m m O) N N 00 CO 00 00 rl- O N O 00 O)
CO co 00 co Ln O) CO CO O O) N r Ln co 00 O) Ln O O M f~ O CO O) 00 00
r- C4 Ln CD co M Ln m O) O co O LO Ln Ln O M M O co N CO r- Ln N
Ln N- O N M O CO M oo N- Ln M r N M CO O O r N Ln M O N
O O) 00 00 00 r- N- N- N- N O O O O O O) O)
O) O) O) O) O) O) O) O) O) O) O) O) 00 00
M N O N N O) N- N O C4 O N_ N N
N M co f- co M O N N- N N Ln N M N
U U Z O W J Z (j U m U LL W W Q N Z m 2 O
Ln CO O LOn N N 0 C4 N- Ln Ln O) W N M N O N LLO O
00 N Ln 00 O
'nt 00 O N f~ N M M Ln Ln N N O) 00 N- O) N N ~, M O
M M r
Ln Q) Ln r N
r ~D N r CD CD
M O CO
O CO O r O
r
r 3 r 3 r 3 r 3
y ~ r ~ r ~ r
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Q O (V H Q N- 00 N O N N O N r- r- N Q Q
= 0 0 0 CO
oc~ X J O~ 0 0 i c CO H ouz
C w m z H Cf) m O w w z w
o co
00
W 00 W W M M N O O CO O O r- M O O
CCO N LL LL CO 00 CO N- N cl CO CO N- O O N- N 0) Ln
_ M CO CO CD Ln N- 0) 0) It N 00 O LO O r- CD N-
0) N N r N N r N W M LO r- N- N- N- O CD LC) r N N
C7 M N N U) U) (n CO M M M M CO U Cû Cû
en = en en Ln Ln U U LO Ln U 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 U N- N- 2
Cf) Cf) Cf) Cf)
CD M O) O) N- N- N- LO Ln N N- W N- N- M Ln W LO CO O O CD O
N C0 Ln r- N M N W 0) O) CD N- M O N- N Lf) C4
M M Ln W 0) N- M Lf) N- N- CD - N ao N CO N CD O N CD O) Ln
CD M Ln CD 0) C0 Ln CO N M N- O O CO LO N O O
M CO CO M CO CO CD O N O CO N N- CD CD Ln C4 M W M M W t 0-) Ln CO M N Ln N M
Ln L() M CD CD N Ln m M Ln M L() O N
U U U N J J U
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
r- O Lf) M M Ln CO N- M M N- Ln m Ln O r- M CO Ln N- N W N- N
W O r M 0) M O) M O) N ao m O N- N r M CD M Ln r- N M C4 r
M Ln r M N- r O r - O ) r O r ao m CD M M_ N N M r Ln r W N
Ln Ln M N M O) CD N O CD Ln O) N O) N- Ln O N ao r N- N N W
CD m
N N O O O o0 N O N- O CO N- N o0 N- 00 N CO o0 r Ln O N O
O M N
W N- CD Ln O O CO M CO O C0
e O Lf) Ln m M r CD
N O) O) N N C0 Ln W rl- LO N O C0
O) CO O) M O) M O O CO CO O Ln N W LO O M C4 C4 (M M M O M
M r- M M 0) (4 O) O) CO O C0 0) Ln W N O M O) CD O
r- CO M W N O Ln CO M O W C4 C4 O N M O N- C4 M O M
O) M N- N N CO O O O O) O) N M CD O C0 O 0) O 0) 0) 0) O W
00 O 00 N- N Ln O) W 00 OO f~ N N Ln O N CO CO CO CO CO M O Lf)
O N- O O Ln O O O O O O O
r N O r O) Lf') r O) O O N M m Ln M LO r r O M C4 r-L M LO Ob r-
CO M W O N O N- Ln O N M C0 O) W W N LO N r- O) CD O) C4 M
N- O 00 M O Ln O CO N O _ O CO (M CD O N Ln N OO OO O Ln
M N- M N O r- Ln O) O O) N- N O CD N O N m O C0 f~ O
Ln W O N- N CD N- O) N N N- N CD LO Ln CD W W M M N O
Ln M C0 N- O N M N W CD M CD W 0. O N- Ln N O) O W r_ 't 0) O O 0) 0) 0) O) O)
O) O OD
00 00 00 N- N- N- CD CD CD CD CD
M M O CO M N LO N M " O CO (N N r- M O N r ao W
pp D_ Y U 2 U m N 2 ND 2 = Z w W w
O CO CO O O N- Z O N N O O) O) Ln Ln O W ao
M M M O CO
O C~0 N O N N O LOf) M LO
N N N M
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C
M r co
O Q. n co N O.
00 LN LLnn O Ln m
M M O N LM M CD O O
n O O n O rr O 0000
Li) r .+yr .+yr O r
r r r r
Cu y 03 y Q Cu Cu y Q 03
Ln H Lf) H LD H LD H N- H
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N J Y N N Ln Z Z Z = D_ D_ N CD
N Y D H H H H
DZ << 0_ 0_ N --- U U' U' z LUi O W U I I Z-Q,
D D_ D_ D_ J N Z O O 2 2
N >> J--- W D D Y m D D D D W W
N LO N-
O Ln O O O N- N- CO M N N O W M W Ln O f- LO
CO N CO M O O C4 D O O CO N 000 r- (M N N
CO N (n (n CO Lo Cf) cf) U r: LO r O r 000 CD fl N M 0-) M O O
rl- = 00 U U OD U 2 2 0 2 0 2 2
2 2 2 2 r~
D D D D D D 0 Q 0 D 0_
Cf) Cf) Cf)
O CO Ln Ln Ln Ln O M CO N W Lf) r O Ln W O N N r
CO r- M N W N- O Ln N- N W M W N W N Ln CO M M O N L()
N O O M N CO r- O M M r M CO CO CO CO N M M N N O CO
r M Ln r- r O O O M O r O ô0 r r O O M Ln r M CO r N r
N O O M O W W C O N N " M t O Ln M t Ln CO O CO
r- N- N N- CO M N O O CO M C4 r N Ln r- r r N- N- M Ln N r
Q Q Q < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < <
N Ln O O W C4 O C4 C4 O r Lf) W W LO r- O N N N- N CO N- O
O W Ln r- O O N N N- O N N O O N Ln CO CO Ln CO M
O M O Ln N O CO M N CO N N O 0 CO p M N- W N- O O W
N N r- LO N LO r Ln N r- CO Ln O r- M M Ln O M r- W O N
CO O N W O C4 Lf) O W N- C4 M O C4 C4 Ln O O O O N O O
r r r r r r r r r r r r r r
N N N N N N N N N N N N N
O O M r- N O N W LO O O W
Ln r- Lf) M N g W r O Ln CO M O
CO M N- O N CO O CD CD CO N_ N N O N- O
M N O W Ln W It It CD W C4 O r W O W N O O M CD
It C O W O Lf) C O Ln O O r0 M LO M_ N- O N C O O O O O N
O N r- Ln O O N- M C4 C4 C4 Ln O N- N O Ln O O N-rl-
CO Ln CO ao ao ao W W M N O CD CD Lf) Ln Ln LO W N O m O O O
N CO Ln Ln Ln Ln Ln Ln Ln CO M N CO LO N M M M
CO 00 O 1? 00
ob M O O M OO m r Ln N r O) CO Ob r r-L N O) O) O O r Oô Oô
M Ln O r- C4 00 M Ln M N N Ln O O O r M O CO N
O N O N O C4 N M O N O M N CO M rl- C4 M O Ln
CO L() N N N O CO CO O r- O M Ln CO M N CO N CO M W Ln M
O LO M O O W O LO N- O Lf) N- LO 00 CO N M O O M LO N- O M N
r N CO O O r- L() CO O O N O O Ln O N CO O N- CO Lf)
m m W N- N- N ao r LO LO LO LO LO O r O O O
Ln Ln Ln Ln Ln Ln e e e e e M M M
r r r r r r r r r r r r r r
LO CD CD
LL -J M = N r N Cj O r 2 0 CO N 0 Q J r Q
aD N N Lf) M m 0 r-- CO M M M CO CD O N L j CD m CO p N- N- Z r-
O N r C4 Ln O CO O N CO O M m O N O O M M N
N CD CO Ln CO Ln CO N O O CO CO O Ln
r r r N r r r r r N N r r r M M r r N
D_ D_ r D_ D_ D 0 r r 0 0 r D_ D_ D_ D_ D_
LD Q. N Q. Q. Q.
N O
r- CD m CD CD
Ln M C L) CD m
(ue - N M
00 O CD 0 00
O
m .2 O n
O O
r ~ r ~ r ~ r ~ r
H CD H CD H O H ilu H
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N N f~ O r LC) M W Q Q Q M O N D- N CO
J Q O
L~ J p M p N N o_ U Lc ) Lc ) Ln
Q Y o_
W C) Ur U- X cq 0-
Q= M Z (n ~_ W W D_ J M
Z LU Q W LU U m Nm 0 0 J ?~ U Z Z Z LL D O J Q D m D
rN- O LC) O O CO N M O M O C N CD N CO O N LO M OD
N CO N-
(N N- CD M N N N CO C_ _ r M CO Ln
rl- O() f~ CO M O LC) N t Z) M z N N M M CO0 M r r m
Ln
N r- O O C4 N O O O Cn Cn O f~ O
U) U)
Ln U O O O (n (n
CO N- CO
(7 L
t O r
O LO U = = O O = O r = _ = r = U r
Cf) Cf) Cf) Cf)
M r- O O O N N N O M O M M N LC) LC) LC) CO O
O LC) N- O N O CD M O O M N- M CO W O N- O O N- CO M CO LC) CO CO
LC) CO LC) N LO M N- N O O o0 O CO O r CO O CO O M Ln CO N
Ln CO O O N- N O O O M M N- N O M CD N O N CD C4 N N O O N
CO r m O O 0 0 M O N o0 M N CO O O LC) M M M LC) CO N O M
M CO M LO LC) CO r- LO LO M M N- M M M Ln O M N O
J 0 0 0 0 0 J J 0 = J 0 0 0 0 0 J 0 0 J J 0 U U U 0 0 0) C~ 0
< < < < < < Q Q < < Q Q Q < Q Q < < Q Q < < < < < < Q Q <
O N N CO N LC) N M m r- O O Ln m N- O M r N N M M M
O N CO O N- O r N- M Lc) CO C4 m M r r CO CO LC) O N O C4 r CO CO
O N O r- O O CO CO r- O N r N CO M m m O CO M O O r r O LC) O M
N r r O O CO O O O r- M_ N CO r C4 N O CO N CO O O LO O C4 C4 M N-
N- M O O O W LC) O N- N- N LC) N CO O N- O W W LC) N- N- O W O
r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r
N N r N N N N N N
N- C4 O N CO O r O_ N O N M O M O N
CO M r- O 0 m r O O O O r O M O
LC) N W N N N O CO N CO O O O LO rl- O
O O OD C O t o') C 4 O N- CO O O LO O N M CO O C O O O C O O N LO CO N
M N N LO LO LO r- N_ O N N LC) Ln LO f~ O M M
CO t N O N- Ln N N- N O N N M N O O O N- LO() N N O LO O CO N O
O O O O W CO CO CO CO CO LO CD CO LO LO CO r- O N r CO CO CO
M M M M M M M M M N- C4 M LC) O N M M M M M M LC) r N CO
O CO M LC) f-~ O
M N Lf) O N C) O N O) M M N- O r N Ln O N W N W W N- O
r- M O Lc) O LC) O O r- C4 O m m m m M LC) M m N O O
LO O M LO M CO r- r O CO CO O O O O N- N O M m N fl O O M M
O f~ O O O O O N O N CO LO M r- O OD O LO CO Ln O O N
LC) O N M LC) N- N_ N O O CO O M rl- LO O O N O O CD O CD N O O O
N O O N- LO M O O N CO O O O r- CD M N O N M LO N O N
O O W W CO CO CO N LO
M M M M M2 M M M M M M M M M M
r r r r r r r r r r r r r r r
N LC) M O O O r r M N r N O M ~_ N O LC) N
0 D_ W Z N 2 W N m U U U'
U f~ CD M 0 W Z Z N m CO OO Z Q Y Y N O 0 CO N- m J M N LL W O CO M O
i 7
rl- r- W O O
W N N r- O O N O O O Lm
M M O LC) O o0
M CO LAC) OD O_ M N O N O O N L?
N _ r M O
D_ D_ r D_ D_ D_ D_ D_ r D_ D_ D_ r O. Q. F- O r
Q Q Q
Q. ~ Q N r le
00 O CD M M O
N Ln m O
O N
M O m O M O
r r r r (V r
r ~ r
A2 CD Cu Cu
r I- = r I- = r --
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N O) Q N N ', LO _
< z >- < H cQo p z z p U- U X U cQ ~ O o_
z 2 O<< U z m m m z z z 2 0 p p p Q Cf)
D_ U
CO Y H < en en < Z I1 N N U D_ p D_ U C~ J
M O
LO M O LO f~ CO O N L() M O) N- O) L() O) O) L() CO O LO N N M O
O N W CO LC) CD L() N L() r M a7 a7 CO r- O N O) CO N N O
rl- rl- r O O LO N O O) N M M O CO CO r L() N N CO
O (n (n (n r U) U) U) (n cq Ln. U) (n (n CO (J) C4 (n (n CO CO r O) O O M
r U r r r (V U N N N N N CO N N O) U M O) M Ln
~ p O O= p p p p 2 p p p~ p p~ p p~~_~~ ~~ p~
Cf) Cf) Cf)
CO N O) m O O O O L() M N m O CO T O N- CO N- O O O) LC)
M L() CO O) O O O O m m O N m M CO f- O) N N (O O) N N
r m O O) m fN- N O) CO fl- CO O) (M O N (M CO CO M N- L() N
LO M M N N L() M O M m M N- O) CO r- O O N N CO
M O) M O O r- N m CO r L() O O f- M CO L() N N- N O N- CO CO CO f- M
LO L() O O O M LO M O O M l~t N O O N N N O
00 0 0-0-0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 U U U C'J C'J C' 0 J J X J J
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
O O ) f , - O O ) N- N W M L() N Ln W W W C O L() Ln C O N m m m W
O) O O O) N- M m O M O) f~ m m N r- O) O O) M O M
N- M N- L) O CO CO l~t O L() r- M l CO N- CO N O M M CO O CO
CO LO r- N L() LO O) r- CO r O M CO N r- O M N- N N N O
O rl- CO N O O CO N- O L() Lf) CO O O) CO W W O N CO N CO N
r r r r r L r r r r r r r r r r r
N OO N N N N N N N
O N- N- Co (M Co Co CO CO O L() M M M
r O) O) CO r Co M M r- CO C4 C4 O CO r O)
f~ O O C4 O C4 M N L() Ln N O C4 O N Co O N
O CO o0 N o0 O) o0 N- L() CD CD O) O O) Co CO O) LO N O M N L()
00 O M L() O( r O a7 O) O) ) N- Co Co L() Co r- M LO N- N- O M L() N
M N- O L() N O N- N O O) CO M O
CO M M M M LO O) O N O N- Ln O) N N N M M M M
N CD M M M M M M M O O m O N l~t Ln M M M M M M M
N- N O) O ob m N m rl- m m N r N 4 r-L M O O a7 r O N Ob Ln Ln N
LO CO O O) O) m m O Ln CO O m m 4 N O O N- L() N O L() O) O O
CO N- O) Lo CO O) O O) N l~t O O N C4 N N O) M N_ N O) m l~t m C4 C4
CO M M N r- m N o0 O o0 O L() L() CO M M Co L() CO t L() O O M CO O)
CO CO M M N ~t r- M O) O O CO O) N M M CO Ln f~ M N- N- O O)
N l~t (M Co LO M r M N- r N L() O CD Lf) M O M O) fM- M O)N
N N M M M M M M O N Nr M
M M M M M M M M M M M M M
O) _
00 N CO N CD Ln r M N o0 CO N_ 00 r N N o0 r N CO O O) r CO o0 N_
M M 0 0) ao 2 N P U Q m z (m 5 m C0 = 2 U 0) N O) m O LL.
f~ O) LO CO m m 'It m O CO f- LO O
N O O O N LO O N O O)
M O N r M L() LO M ao L() Ln N- CO M M m L() L() L() M m
CO N N M M f~ N M ao N N N N M
O L() C n
Q Q a) O M
C M n
N O co co
r Ln O M r O M O
r (O r (O LO Ln m
N O LN O r b N O
r . LO .d .d M .d
r J=+ r J=+ r J=+ r J=+
a =~ N =~ N 7,1 M =~
r I r I r I r I
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N N N M
O Q M N O N W D L N MU- -J
0 -i X Cf)
C7 O O 0 CO 2 j O M X 0- m O W Q D LaL 0-
00 0- Q H~ O J J Q (n ' (n Z O >
O
H Q W <
' M M CCD
CO O N- m N- N- C4 M N O O N LO W LO N CO O O O CO Co
CO LO l~t Ln 00 O N- Co Z Co O N LO O LO CO
r- O O 00 CO N- O 00 00 M N- O D LO C4 Lf) M LO CO Ln
m 00 CO M M LC) Ln CI) CO O CO o O - r O r r r
Cf)
O CO
N- C4 Lf) Q Lf) N- N Lf) N- C4 Lf) N- LO
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2= 2 2 D 2 2 2 0 U= U U r~
Cf) 27) Cf) Cf)
O N- N Ln C4 N N- Ln N N- C4 N- O N- N CO M N- O O r N
N N_ Ln Ln Ln CO N N N M Lc) N- M Ln N LC) Cp N- Ln N- O O_
N- O M M N- N- O M O C4 O O M Ln N 00 O O Ln f~ O
N CD N N O M O N M O O_ C4 M Lf) O CO M O CO O
N N CO CO CO O O CO CO N CO M O N- Co O M M N
M~ O O Lf) Ln CO LO O M LO N CO M M O CO N O Ln CO CO N- CO
J J N J J M J O N C'J C'J C'J O oo C'J C'J U C'J C'J N N C'J C'J C'J U O
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
O N- O M C4 t C4 O r 0 O O N CO O CO CO M O N O O N W
CO O M O ao m l~t M C4 O M_ O Lf) l~t M N- L() N N M N N O
W N Lc) C4 O l~t W C4 C4 N W W LC) C4 C4 LO O N O O
N O CO O W W LO CO r- M N- N M N O N N O
C O C O N- O O Lf) Lf) O W C 4 W N M ao ao O O O O O C DNL OM CD m C0
N N N N N N OD (M N- LOC) OMO N- r O C4 M O C4 O N- O Co N
00 O CO N r M O O LC) N- N N- L) l~t W l~t LC)
N- LO O C4 r m C4 O N- O Ln CO W rl- W O L() t W O N O N
O OD W LMf) M N Ln N O ao N M N- Ln N- Ln N
CO N Ln M O W C4 N- N 00
rl-
N LO L() - - CD O N- LC) N O - C O O ao Ln Co N N O W N- N-
00
0 0 0 0 0 0 0 0 00 )
)0O CO N LO M W W W W
rl-
O O O O N O 00 00 00 CO CO CO CO
O a7 C4 C4 N N M ~,:) N M M CO m O M m m N W m l~t O
l~t r- M l~t O M O CO O N- O N- C4 O O LC) N M N
N- M 00 r N- C4 LO CO M CO W C4 M C4 Lf) LO W M O O C4 N N-
N- N 00 N- N O Co O Co O O M CO L() L() CO rl M
N- C4 ao rl- LO ao M O LO N N r- N C4 O Lf) CO O ao N CO O l~t
N- N O N- Co Ln m N- LC) M O N N LO W r l~t N O W rl- Ln Ln
N Ln LO It : O O O O O W W W N- N- N-
O O O O O O O O O O O O CO CO CO CO CO CO
M L2 N O r N O O M CD M cli W LL N M J LN W 0 O N r W Z N N O N N cli LO W rl-
Z N O L O N r f~ 0 W N O M Q O O LO
W M O 00 ao N M O O N- C4 O N Ln Ln W W
CO LO N LO N O N Ln LO N LLO O W
N M M N M N _
O O O O O O
N N O M
M Q Lf) Lf) 00
le 00 Q. O Q. r Q. n
r- r LL) N r O n r m
r M r O O M LD 00
r. O y O Ln r N r
Co f- Co O O r O M O 00
M , y O , m O
r y r y r y r y
a r a } y_I Q y a y Q
A2 y_ Co Cu r I r I r I r I r
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19
z Q 0_ Q 0 ô 0 0 0 U U U) c~o U
X m m m 0 _ U U U 0 w w L z 0 0 0_ 0_ w LU - z Q Q Cf) â) H H H en Q 0 0 H} Q
X 0 0 LL
z Q Q
~
Q U U
rl- CO
LC) LC) CO W O CO CO LO O W N N N r-- 't ~2 O O O N
m O) m m O N- N O O N N LC) O O O O CO O O O O O
N N M O CO O ' N- L() N f~ N LO LO rl-
CO O O
Cf)
CO N LO CO U) U) LO LO Cf)
r~ r` 2 2 2 2 2 U 2 2 = 00 = COO COO OD Cho = 2 r 2 U
~~o'ôo'o'o'o' =ôo'ôôo'~ o'ô~o'ôô ôo'ô~o'~o' _
Cf) Cf)
M f - C 4 O O LC) O LC) N O CO M CO LC) N-
CO M CO W O M N- O O O W M O C4 W- CO O O
CO N O O M CO CO CO CO M N- O C4 O O LO r- CD N O Ln N- O N CO O N
LO r r- N O N O O N M N- M r r LC) O M O O CO M N LO CO CO CO
O
M O O M M M O O r- N N M LC) - O M l~t N l~t N- C4 N LO N r N LO
LO CO O O O N O O O LC) O N M N- C4 O M LO O CO M
0 0 0 0 0 0 0 0 a 0 0 0 O CJ O 0_ a a a a a 0 0 0 0 0 0 0 N
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q <
O O M OO M N OO LO M N- O M LO OO O M OO OO r N O O r
OO O W l~t C4 N N LO N W N- N- O N LC) M O O C4 M
M ao m N N m OO N N OO l~t O O O r- CD Lf) m M ao M N O
N OO r0 O N CD N- r O O LO N LO C4 N- N O CD LC) C4 N O M
N- OO O O N m C4 N CD LO
r C4 O M CO N- ao O CO LC) LC) N- C4 N C4 O
r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r
M M M LO r r- LO N- r O r O r
LC) M OO N- OO r- Ln CD N- N _ LC) CO O N M
LO (O N W C4 m m t C4 N- Ln N O O O N N- N _ C4
M O M r- M N OO r N O O N O M O N- l~t O M LC) rl- M m m O l~t O N- C4 N M O N
O C4 M C4 LC) N O O O l~t m O N N m O
O O O CO ao N LC) LC) CO LC) O O M CO O N- C4 M O
OO OO N C O N- W O W OO W W N N N- O Or CO LC) LC) LC) LC) LC) LC) N
CO C) Or N N- N- N- N- N- N- N M LC) N- O ) N- N- N- N- N- N- N- M
Lf') f- N Ln CO m m N O m m m N r-L r C4 N r M O) O fl- m m fl- m
L C ) O O M O M_ N C D m N N- C4 N M O N- M C4 M N- N- N
N- N_ CO Lf) LC) LC) ao O LC) M ao O ao l~t Lf) M LC)
O m m O OO N LO M
N- M O O LO LC) N LO O O O M O C) C4 O M N O O O
O O O M f~ M O N N- N O O L) O r- O N O M O O M CO OO N O
r- N O O l~t O N- OO M N l~t r- LO M O N M LO N O O N- CD l~t N O O N
O r OO OO r- N- N- N- C4 LO LC) LC) LC) LC) LC)
ao m LO O_ N_ N O ~_ M O) N ao M N M N O
N M
CIJ W O Q OO LO Y Y U J r- J O J N 0 m N m 0 LL W Z m N 1;
O W CO 'O O OO LO CO = LC) M M M LC) LO M O M m N LO
M M CO O CO ao N O M O ao m O OO C4 O r W O r O
O N ao O N CO N M LO CO CO N LC) r,) ao N-
Q. N rL Q.
m le
M Ln CD Ln 00
le N LC) CD r
CO O
O a b a CD N
Ln
Ln C
r r r r r
r 3 T 3 T 3 T 3
Cu r- Cu A2 Cu Ln m
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N = Q 0 J Q
pOj r- N OD W Lof) Ln N N_ Q
CIJ
rl- Q Z J Q O Q m U' M LL Lf) Lf) M X Y LO C14 0 U Q U Q N< M Z LL Z LL LL 1
LL C~ Z > p LL
< 2 0_ Q O Q U N N Q N N N N O O U 0 Q 0 w
Cf) LL
N O Lf) O O N N M O N. t r-- N O M LO O N N. CCD CCD O f~ Lf) M
M (O N r N. M O N N M M O N O O O O O rl- (V M
N. rl- N LO N. CO O O CO CO M Lf) N Ot LO M N N Lf) M CO O
Lf) f/) Ln Ln N. N. r O N Lo Lf) O CO CO N (J) N. N N Lf) M M CO N N _ CO CO
Lf) N. N r N M LO LO N. O O M p m CO r N. O O O O O O
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 N 2= 2 2 2 0 0 0 w 2 2 2
fn fn
CO N. W M O M LO CO r N O r (O CO (D r N W N O M N CO r N
O r O (O M M M Lf) (O - O N M N r O O M (O M r (O M N. O O O N.
O (O O N. (O O O O O r M M N CO O N CO M CO r L() O O (O N r CO
N. O O (O O N O- (O M O M M O M N CO CO CO (O N. O O r M CO N L()
N N. O (O O O M O N N CO r (O N (D O O O O CO N. O O LO N N O r
M r N N. Lf) N. O L() O N O (O M N Lf) r (O M r N. N r
0 0 caccaccac 0 0 0 0< < < < l 0 0 a Q 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 c o c o
N. Lf) M O M O N. O M M M M N. M Lf) CO CO N. N. M W W O M M
M O O O O Ln O (O (O O O Lf) O N. Lf) Lf) CO CO M (O O (O O Ln N.
CO CO O r 00 O N. (O W O W O O 00 N O 00 CO N. O
O M CO N O rl- N M 't
LO M N. LO O O Lf) CO N. N CO O (p CO M
N O CO O CO N M O (N CO M CO CO CO N. O W O Lf) N. N O O O O
M M N M M O
_ M M rl- O M N CO LO r M O Lf) LO O CO O O O O
CO M O O O rl- 1t M O O O N rl- N N N O O~ N O O (O
M C') _ N O N O M LO LO LO O CO r N. N N O O N. O N M N. O N.
M N. L N Ln N M N. M W OD O M N. O O M W N (O N N. N
O M LO ' Lf) O CO N. O N. M O N M r M (O N Ln 't M O N.
N LO O r r. M M M M M M N O M M O r M CO N N
L? (O CO N N CO CO CO CO CO CO CO N Lf) r` CO CO CO CO
r- (D Lf) N Lf) O O r~ O N N W M M N (O O M M
O M M N N O M N. O Lf) N. O N O r 0 0 CO 1t 1t M N. r O N
CO (O LO LO r_ N M N. N O N (O O M M N O O LO (O (O N Lf) O O
O O O LO (O M r CO LO LO M W W O (D O O O Lf) Ln Ln N. Ln
N.
O N O O M LO O M CO N Ln O M
CO O M M M M N. O O rl- M N N O O
N N M M N N N M LO N r fV O CO Lf)
O O O O O O O O O O O
O O M r W N r N N O r ~_ M N O O M N (O N N r N N N M
R LL < 2 M 2 O O Y w (D Q rn 0 (w0 ô O p O C" O Z rn= Z
CD r- LO CO r- r- O 't M rl- LO O CMO M MO O O O O rl- LMf) O M N N rl_ N LO M
O LO M f~ O? LO O LO M f- (O O r N ~, CO O O N
N N r M M CO CO ~,.) N N N N N M
(D Q Q
N 00 r Q
Q M Q r = r n
O r 00 N r
O N r (D f- r
N N C r M CD
M O O O n
CD
N 3 r 3 r 3 r
CD A2 CD
H r H N 1 N H
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M _ CO
O
Ln Q Q Q M M D_ J X J H H M LU U `t W Y
w m 0 U O D U m m O w CO CO Co CO X U-
U D D 0_ U O m m en O m Cf) Q Q Q Cf) en
U H U
Q M U
O M r- Ln r- M M N r- N m cli p p O LU W O
rl- Ln CO N- O O O N O Lf) LO LO N C2_ M N
O W N O O W O O (n (n Co MO Lf) Ln Op O O O O
N f~ CO N_ U) U) U) CO >
CO CO CO ~_ ~_ Ln Co Co } } (n CO (n (n Co CO CO CO
2 2 2 2 N 2 N N N N 2 2 N N X X} CO X}} X CO X=
0 0 0 0 0 0 0 D O Q U 0 0 0 D O 0 co co co
Cf) Cf) Cf)
N- N- M C4 m m N- N O C4 M O N M C4 O O N O N r- N r-
N O O Ln N M O CO N O N CO N- O N N- M O N Ln M O CO N
Cp M M N Ln O O N- N N O O m CO M N O r CO N- M
r N- r Lf') r M M N M LC) LO r M M O O M r O CO r Ln Ln
N M M o0 N N O O r - C 4 Ln CO N O CO M_ N N O
CO N- O C4 M N N Ln O N Ln CO O O N O O )CCD
J 00 0000000 0000 0000) 00 000N OJ 0
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
r Ln O M m m M C O C O M 0 0 O O O CO N O N M M CO r O O N
N r - O r r N O LC) O N Ln r Ln m CO M O CO M N N N- C4 r M
N O LC) N r Ln CO M r- O N- M LC) O r N M M N- C4 N r O r- r N
O O CO N r N- r N M N Ln r CO O N N CO O O r M Ln
m m O r O CO r N- W W N- O LC) M W N N C4 Ln N Ln CO N- CO M
r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r
N N N N N N N N
f~ O N M CO LC) M N O M r O LL() m mm C0 M Lf)
r O O r N- O C4 O N- N C4 M O r M r O N r- O M Ln M
Ln O r N r C O r - M O N O Ln Ln M r LC) N r M CO N M O Ln r M O
CO O N O M N r O r N Ln r O M O M r- M M O r CO O m N- N O
r M M O T O Lf) N l CO CO N O N N O O N N O N- Ln N O O CO
Ln N O O O LO M N r O M O O CO r~ O N N CO r m M
CO CO CO CO CO CO CO O O O O N- M C4 N- O LO LO LO LO LO LO LC)
CO M O O O O OO rl- CO L(') M f~ Lf') CO O CO 4 O N O) Lf') Lf')
O CO N- N m m LC) N- N- C4 LC) O O LC) O O m m m O N N M M N r N
N O C O O O r M r - Ln O o0 r N- N- r LC) O O r Ln M m O m r
N W N M O r m O W r C4 N m N M M W N- O Ln M M W r C4 W Ln
M M N O CO r- M O O O r N- M O LC) r O O M O r O O M
M O W N- Co M r O O W r W N- Ln N CO r m C4 N LO M r W C4
r O CO CO CO CO CO LC) Ln O O O O It It I M M
CO CO CO Ln Ln Ln Ln Ln Ln Ln
r N CO f~ 00 M M O_ O M Ln o0 N_ N O M C4 M
N N Ln Ln N N N
z D Z C) Q w N w J w Z 0 Y m J w m z 0 C~
f~ 0 M O O CD N Cp N- O O Lo Ln fl M '0 't CO Ln CD O O N N O O M r- r O O O N
O
c'i M M M N O W O W N M M N Ln
N
Co CD Co rL
Co rL Co Ln
O Q. Q. O
Co Co f-
r Ln O N O r
r. Co m Ln
CD O r 0 O O Co O
r r r N r Co
r r
7 r 7 Co
7 r 7 r 7
N H N H Cu Ln n
X H X H
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1.1. Culture des BACs
Les BACs sont commandés au Centre National de Séquençage à Evry (Génoscope),
qui les
fournit sous forme de colonies dans des boîtes de Pétri.
Chaque BAC est mis en culture selon le protocole suivant : S00 1 de milieu de
culture TB
contenant du chloramphénicol (25 g/ml) est déposé dans chacun des puits de la
plaque 96
puits. Puis une colonie de chaque clone bactérien est mise en culture par
puits. Les plaques
sont incubées pendant 24 heures à 37 C sous agitation. Les cultures sont
arrêtées en ajoutant
S00 1 de milieu TB/30% de glycérol. Ceci formera la plaque Glycérol Stock, à
partir de
laquelle 3 répliques seront générées : la plaque M (Mère), la plaque S
(Sauvegarde) et la
plaque T (Travail) chacune contenant 150 i de culture. La plaque T sert à
l'obtention de
l'ADN. Les plaques sont stockées à -80 C dans des congélateurs différents.
1.2. Amplification de l'ADN par RCA (Rolling Circle Amplification) :
C'est l'étape de la production d'ADN
a) Principe
L'amplification de l'ADN par RCA est basée sur la réplication à température
constante de
courts segments d'ADN circulaires simple brin. La réaction consiste en
l'extension d'amorces
hexamériques aléatoirement liées à la matrice d'ADN permettant d'obtenir des
copies d'ADN
simple brin linéaire, pouvant à leur tour servir de matrice pour l'hybridation
d'autres amorces.
Ceci permet d'éviter les étapes classiques d'extraction type phénol-
chloroforme.
b) Protocole : Kit GE Healthcare Europe: ref 25-6400-80
Cette étape utilise le protocole fourni avec le kit de RCA. Elle s'effectue en
plaque 96 ce qui
permet la production simultanée d'ADN (10 g) à partir de 4 i de culture de 96
clones
différents.
On obtient une concentration finale d'ADN de 100ng/ l (10 g dans l00 1 d'eau).
La
vérification de l'amplification se fait sur gel d'agarose.
1.3. Marquage
C'est l'étape qui va permettre l'incorporation de molécules fluorescentes à
l'ADN.
Chaque produit de RCA est marqué par le principe de la nick-translation.
On obtient en 2h30 une solution à 20 ng/ l d'ADN marqués par un fluorochrome.
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Les marquages sont vérifiés comme suit :
4m1 de la réaction de marquage sont déposés sur gel d'agarose à 1% afin de
visualiser sous
UV, l'ADN dans lequel se sont intégrés les fluorochromes. Ceci permet
d'apprécier la qualité
du marquage.
1.4. Précipitation des sondes
Cette étape permet la fabrication de la sonde prête à l'emploi.
200ng de chacune des sondes sont précipités en présence de 50X (soit 10 g)
d'ADN Cotl
(ADN riche en séquences répétées qui bloqueront les séquences répétées
existantes dans la
sonde), avec 0,15M de NaC1 3M et 3 volumes d'éthanol 100%. Le culot est
ensuite repris
dans 6 l de tampon d'hybridation (50% formamide, 2X SSC, 0,1% SDS, 40mM
NaH2PO4/NaHPO4). La concentration d'utilisation de la sonde est donc d'environ
30ng/ l.
1.5. Vérification de la localisation des sondes par FISH
Avant de constituer un contig de sonde, chaque sonde (BACs) a été vérifiée par
FISH sur
métaphase. Tous les BACs générant un signal sur plusieurs chromosomes, ou non
en place sur
le chromosome attendu, ont été remplacés.
1.6. Formation du " pool "
Ceci permet de simplifier considérablement le processus en ne manipulant que
41 ADN pools
en place des 286 clones le constituant.
La plaque "pool" est formée à partir de la plaque de travail. Pour chaque
extrémité
chromosomique, 20 1 de TB/glycérol, de chaque clone bactérien correspondant à
un BAC
constituant le contig, sont prélevés puis mélangés dans un seul puit d'une
plaque 96. Ainsi est
constituée une plaque contenant 41 mélanges de clones bactériens à partir
desquels sont
fabriquées très rapidement, selon les procédés décrits précédemment (culture,
RCA,
marquage, et vérification par FISH), des sondes spécifiques de chacune des 41
extrémités
chromosomiques.
A partir de la plaque T (20gl de chaque BAC)
lp lq 2p 2q 3p 3q 4p 4q 5p 5q 6p 6q
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7p 7q 8p 8q 9p 9q l0p l0q llp llq l2p 12q
13q 14q 15q l6p 16q l7p 17q l8p 18q 19p 19q 20p
20q 21q 22q XYp XYq
Plaque 41 extrémités = plaque "pool"
Exemple 2 : Fabrication du système MTP ( Mega telomeric probes )
La stratégie adoptée a conduit à la fabrication de 41 sondes qui sont marquées
grâce à une
combinaison de 5 fluorochromes : FITC, rhodamine, DEAC, biotine (révélée par
la
streptavidine-Cy5) et digoxygénine (révélée en Cy5.5).
Les extrémités d'un même chromosome sont marquées par la même combinaison de
couleurs.
2.1 Marquage des deux groupes
Chaque groupe a été construit de façon à éviter de rassembler des chromosomes
se
ressemblant du point de vue cytogénétique (le 21 et le 22, dans deux groupes
différents, par
exemple).
Toutes les extrémités qui contiennent le même fluorochrome sont marquées
ensemble par
nick-translation et selon les Tableaux 3A et 3B ci-dessous. Pour le groupe I,
1960ng d'ADN
ont été marqués en FITC, 2120ng en rhodamine, 1050ng en coumarine, 1983ng en
Biotine, et
1860ng en digoxygénine dans des volumes respectifs de 83, 98, 50, 88 et 84 l.
Pour le groupe
II, l8lOng ont été marqués en FITC, 1860ng en Rhodamine, 1607ng en Biotine, et
1944ng en
digoxygénine. Cette différence de quantité d'ADN marqué vise à renforcer le
signal de
certaines extrémités plus faibles.
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Tableaux 3A et 3B : Tableaux de marquage des deux groupes avec table
combinatoire
A- B-
GROUPE I FITC Rhoda Courra C Y5 C Y5.5 GROUPE II FITC Rhoda C Y5 C Y5.5
1 /1 vert jaune 3p/3q vert rouge
2p/2q vert 5p/5q 'aune
4p/4q jaune fushia 9p/9q rouge
6p/6q vert rouge jaune fushia
7p/7q bleu 10p/10q rouge jaune fushia
12p/12q vert jaune fushia
8p/8q rouge jaune
11 p/l jaune 14g vert rouge jaune fushia
13g vert rouge jaune 16p/16g vert aune
15g vert rouge 18p/18g rouge jaune
17p/17g rouge jaune fushia 20p/20g jaune fushia
19p/19g rouge 22g vert rouge jaune
,21g vert jaune fushia X Y /X Y vert
5 2.2. Précipitation des groupes
Pour une hybridation et par groupe, l'ensemble des sondes marquées est
précipité
simultanément et repris dans 6 l de tampon d'hybridation.
2.3. Hybridation des sondes
10 L'hybridation des sondes dites Mega telomeric probes (MTP) se réalise
selon le même
protocole que pour les BACs, mais nécessite des lames à deux dépôts pour
traiter
simultanément les deux groupes de chromosomes.
2.4. Révélation des lames et analyse
15 Les lames sont lavées dans un bain de 1XSSC à 72 C pendant 5min, puis
révélées par deux
couches d'anticorps pour révéler les sondes marquées à la biotine et la
digoxygénine. La
première couche d'anticorps (50 l de bicarbonate de soude 1X + 2 l d'anti
streptavidine Cy5
(lmg/ml) pour la biotine + 0,5 1 d'anti-digoxygénine souris et la deuxième
couche (50 l de
bicarbonate de soude 1X+ l 1 d'anti souris Cy5.5 (lmg/ml)) permet la
révélation de la
20 digoxygénine.
Les lames sont montées avec lO 1 d'une solution de DAPI/Vectashield (Vector
Laboratories) puis recouvertes d'une lamelle 24x60.
Les lames sont observées à l'aide d'un microscope à épi fluorescence équipé
d'une caméra et
de filtres appropriés et les métaphases analysées à l'aide d'un système
d'analyse.
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Exemple 3 : Mise en évidence d'une translocation équilibrée subtélomérique
t(5 ;11)(q35 ;pl5)
Pour tester la résolution des sondes, les inventeurs ont réalisé une
hybridation de celles-ci
chez un patient ayant une leucémie aiguë myéloïde associée à une anomalie
télomérique
cryptique, la t(5;11)(g35;p15) invisible donc en cytogénétique classique.
Cette translocation recombine les gènes NUP98 codant pour une nucléoporine de
98 kDa
situé à 3Mb du télomère du bras court du chromosome 11 et le gène NSD1 codant
pour le
nuclear receptor SET domain proteine situé à 4 Mb du télomère du bras long du
chromosome
5.
La résolution du caryotype en bandes est de 5 à 10 Mb (souvent 10Mb pour les
chromosomes
des cellules leucémiques). Le système MTP de l'invention a permis de détecter
aisément cette
anomalie.
Pour confirmer qu'il s'agit bien d'une translocation remaniant l'extrémité
distale du bras long
d'un chromosomes 5 et celle du bras court d'un chromosome 11, les inventeurs
ont hybridé
les sondes spécifiques des bras court et long du chromosome 11 (respectivement
marquées
par de la coumarine (en bleu) et de la biotine révélée par de la streptavidine
Cy5 (jaune) et
celle des bras courts (marqués par du FITC, vert) et longs (marqués par de la
Rhodamine,
rouge) du chromosome 5. Les inventeurs ont ainsi pu visualiser une
translocation
t(5;11)(gter;pter).
