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Procédé de recherche d'au moins un analyte
dans un milieu susceptible de le contenir
La présente invention appartient au domaine de la détection d'analyte.
Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour rechercher la
présence d'au moins un analyte dans un milieu susceptible de le contenir.
La détermination de la présence de substances biologiques ou
organiques dans des milieux est une étape importante, entre autre, dans le
diagnostic de nombreuses maladies.
Les méthodes couramment utilisées pour cette détermination sont
basées sur la formation d'une réaction spécifique de liaison entre un analyte,
c'est à dire la substance à détecter, et un complémentaire spécifique de cet
analyte, dit sonde, qui est une substance capable de fixer spécifiquement
l'analyte.
Généralement, la réaction ainsi formée est mise en évidence par un
marqueur associé à l'analyte, par exemple, un marqueur fluorescent.
Après mise en contact de la sonde avec le milieu susceptible de
contenir l'analyte, la réaction spécifique est déterminée en réalisant une
excitation des marqueurs fluorescents puis une détection de la lumière de
fluorescence réémise par les marqueurs.
Cependant, la détection par fluorescence nécessite, en plus de la
présence d'un marqueur, un contrôle négatif des mesures pour déterminer si
une interaction spécifique, c'est à dire un accrochage de l'analyte avec son
complémentaire, a bien eu lieu.
Une autre solution pour mettre en évidence la réaction formée, est
l'utilisation d'un réseau de diffraction.
Il est connu que, lorsqu'un réseau est illuminé par une source
lumineuse, le faisceau lumineux est diffracté par le réseau et une figure de
diffraction est produite. Le champ de diffraction observé dépend entre autres
des caractéristiques du réseau, comme par exemple, la période ou l'épaisseur
du réseau.
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Le brevet américain US 4876208 décrit un exemple de procédé de
détection d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir. Suivant
l'invention, le réseau comportant la sonde est réalisé de sorte à être non
diffractant avant sa mise en contact temporaire avec un milieu susceptible de
contenir l'analyte et à être diffractant si il y a formation de la réaction
spécifique
de liaison avec l'analyte. L'accroche de l'analyte à la sonde va modifier les
caractéristiques du réseau, entre autre son épaisseur, créant ainsi un champ
de
diffraction.
La demande de brevet américain US 2002/0025534 décrit un dispositif
et un procédé de détection d'analyte reposant sur le principe décrit dans le
brevet US 4876208. Les technologies de lithographie utilisées pour la
réalisation du réseau sont micrométriques, la période du réseau présentant une
dimension supérieure au micromètre. Ceci engendre une faible séparation
angulaire entre les différents ordres des faisceaux diffractés conduisant à
une
complexité de réalisation du dispositif de détection. Un autre inconvénient de
l'invention réside dans l'utilisation d'un substrat structuré, donc non plan,
ce qui
complexifie la réalisation du réseau. De plus, l'invention décrit la
possibilité de
réaliser deux réseaux superposés permettant la détection de deux analytes
différents. Les deux réseaux génèrent chacun un champ de diffraction
différent,
avec des ordres de diffraction spatialement différents. Ainsi, une mesure
spécifique des faisceaux de diffraction de chaque champ est nécessaire afin de
détecter les analytes correspondant à chaque réseau.
La présente invention propose un nouveau procédé pour rechercher la
présence d'un analyte lié à une sonde, dans lequel un motif géométrique
périodique, constituant un système diffractant, est formé par une alternance
de
zones comportant une sonde, dite sonde A, et de zones ne comportant pas la
sonde A.
Suivant l'invention, le système diffractant est réalisé pour être diffractant
avant une étape de sensibilisation, c'est-à-dire une étape au cours de
laquelle
une sonde est mise en contact temporairement avec un milieu susceptible de
contenir un analyte et au cours de laquelle l'éventuel analyte se fixe à la
sonde,
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et le procédé comporte au moins les étapes :
a) de mesure d'une puissance Pl d'un faisceau de diffraction d'ordre 1
d'un champ de diffraction produit par le système diffractant, sonde non
sensibilisée,
b) de sensibilisation de la sonde A,
c) de mesure d'une puissance P1a d'un faisceau de diffraction d'ordre 1
d'un champ de diffraction produit par le système diffractant,
d) de comparaison des puissances mesurées Pl et Pla,
lesdites étapes étant réalisées suivant l'ordre énuméré.
Suivant l'invention, la période p du motif géométrique périodique est
comprise entre k et 2X, k correspondant à une longueur d'onde d'illumination
du
système diffractant, de manière à ce que seul le faisceau diffracté d'ordre 1
soit
visible. Les technologies de lithographie utilisées pour la réalisation du
motif
géométrique sont des technologies à l'échelle nanométrique connues.
De préférence, la comparaison est réalisée en déterminant une
variation relative de signal, dite sensibilité S, à partir de la formule S = P
-Pa
P
La sensibilité S est comparée à deux valeurs seuils S1 et S2, et
- la présence de l'analyte sur la sonde A est déclarée si S est
supérieure à S1,
- l'absence de l'analyte sur la sonde A est déclarée si S est inférieure à
S2,
- une incertitude sur la présence ou l'absence de l'analyte sur la sonde
A est déclarée si S est comprise entre S1 et S2.
Dans un mode particulier de mise en oeuvre du procédé, l'étape b) de
sensibilisation réalise également la sensibilisation d'une sonde B, lorsque
les
zones du motif géométrique périodique ne comportant pas la sonde A
comportent essentiellement la sonde B, sensible à un analyte à laquelle la
sonde A n'est pas sensible. La sensibilité S est comparée à deux valeurs
seuils
S1 et S2, et
- la présence d'analyte sur la sonde A est déclarée si S est supérieure
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à si,
- la présence d'analyte sur la sonde B est déclarée si S est inférieure à
S2,
- une incertitude sur la présence ou l'absence d'analyte est déclarée si
S est comprise entre Si et S2.
Dans un mode de mise en oeuvre du procédé, la puissance du faisceau
diffracté d'ordre 1, Pl, respectivement Pla, est normalisée, pendant sa
mesure,
par une puissance d'un faisceau incident P;nc, respectivement Pinca, mesurée
avant, respectivement après, l'étape de sensibilisation.
De préférence, pour améliorer la sensibilité d'un dispositif associé au
procédé, le système diffractant est réalisé de sorte que :
- une période p du motif géométrique périodique est comprise entre k
et 2 k, k correspondant à une longueur d'onde d'illumination du
système diffractant,
- un taux de remplissage r, définissant un rapport entre une largeur
de la zone du motif géométrique périodique comportant la sonde A
et la période p, est inférieur ou égal à 0,5,
- une zone d'un motif géométrique périodique du système diffractant
(2) comportant une sonde est réalisée par une couche d'accroche
de l'analyte, dite couche spécifique (25), d'épaisseur es et
comportant la sonde et une couche d'ancrage de la sonde, dite
couche d'accroche (26), d'épaisseur ec.
En plus d'améliorer la sensibilité du dispositif associé au procédé, le
choix de la période du motif géométrique compris entre k et 2 k permet de
n'obtenir qu'un seul faisceau diffracté d'ordre 1, qui est, de plus, fortement
séparé angulairement de l'ordre 0. Dans un exemple de réalisation, pour une
période du système diffractant de sensiblement 1 pm, et pour une longueur
d'onde de 633nm, l'angle Pl est de sensiblement 40 .
De préférence, la couche d'accroche est réalisée de sorte que
l'épaisseur ec est comprise entre 0 et 500nm.
De préférence, la couche spécifique est réalisée de sorte qu'un rapport
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es est inférieur à 1, où eanalyte est une épaisseur d'une couche d'analyte
eanalyte
déposée sur la sonde, après l'étape de sensibilisation.
Dans un mode de mise en oeuvre du procédé suivant l'invention, les
étapes b) et c) sont réalisées simultanément.
5 Dans un exemple de mise en oeuvre du procédé, le système diffractant
est réalisé dans un matériau apte à réfléchir un faisceau incident.
Dans un autre exemple de mise en oeuvre du procédé, le système
diffractant est réalisé dans un matériau apte à transmettre un faisceau
incident.
De préférence, le système diffractant est illuminé par une source
monochromatique collimatée, par exemple un laser, à une longueur d'onde k
sélectionnée dans le domaine du visible et de l'infra rouge.
L'invention concerne également un système diffractant pour la mise en
oeuvre du procédé et comportant un motif géométrique, comportant au moins
une sonde, sur un substrat.
De préférence, le substrat est plan et est réalisé par exemple dans un
matériau en verre, en silicium ou en plastique.
L'invention concerne également un dispositif de recherche de la
présence d'un analyte lié à une sonde formant un système diffractant qui
comporte des moyens d'illumination du système diffractant par un faisceau
incident cohérent. Le dispositif comporte en outre :
- des moyens de mesure de la puissance du faisceau diffracté d'ordre 1,
après diffraction du faisceau incident par ledit système diffractant,
- des moyens de calcul d'une variation relative de signal, dite sensibilité
S, par comparaison, pour un même système diffractant, de la mesure
de puissance du faisceau diffracté d'ordre 1 avant et après une étape
de sensibilisation, c'est-à-dire une étape au cours de laquelle une
sonde est mise en contact temporairement avec un milieu susceptible
de contenir un analyte et au cours de laquelle l'éventuel analyte se fixe
à la sonde,
- des moyens de présentation de l'information caractérisant la sensibilité
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S.
L'invention est également relative à une puce d'analyse comportant une
pluralité de systèmes diffractants, comportant au moins une sonde, juxtaposés
sur une surface d'un support.
Dans un mode de réalisation, la puce d'analyse comporte au moins deux
systèmes diffractants qui diffèrent par des motifs géométriques périodiques
différents et ou par au moins une de leur sonde.
La description détaillée de l'invention est faite en référence aux figures
qui représentent :
Figure 1, une illustration du principe de diffraction sur un réseau,
Figure 2a, une coupe transversale d'un système diffractant suivant
l'invention avant une étape de sensibilisation,
Figure 2b, une coupe transversale d'un système diffractant suivant
l'invention après l'étape de sensibilisation,
Figure 3a, une illustration d'une puissance du faisceau diffracté en
fonction d'une épaisseur ec d'une couche d'accroche du système diffractant
suivant l'invention, pour des indices différents d'une sonde,
Figure 3b, une illustration d'une sensibilité en fonction de l'épaisseur ec
de la couche d'accroche du système diffractant suivant l'invention, pour des
indices différents de la sonde,
Figure 4, une illustration de la sensibilité en fonction d'un rapport entre
une épaisseur es d'une couche spécifique comportant une sonde et une
épaisseur d'une couche d'analyte eana,yte suivant l'invention,
Figure 5a, une illustration de la sensibilité en fonction d'un taux de
remplissage suivant l'invention,
Figure 5b, une coupe transversale du système diffractant illustrant un
premier exemple d'accroche de l'analyte sur la sonde,
Figure 6, une vue schématique d'un dispositif de mesure pour la
recherche d'un analyte suivant l'invention,
Figure 7a, une illustration schématique d'un système diffractant réalisé
expérimentalement, après l'étape de sensibilisation,
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Figure 7b, une illustration de la sensibilité en fonction de l'épaisseur de
la couche d'accroche du système diffractant de la figure 7a,
Figure 8a, une illustration schématique d'un système diffractant réalisé
expérimentalement, après l'étape de sensibilisation,
Figure 8b, une illustration de la sensibilité en fonction de l'épaisseur de
la couche d'accroche du système diffractant de la figure 8a.
Le procédé suivant l'invention consiste à rechercher la présence d'un
analyte, susceptible d'être contenu dans un milieu, au moyen d'un matériau
récepteur, dit sonde, formant un système diffractant.
Par analyte, on entend un matériau à détecter.
Les analytes qui peuvent être détectés incluent, mais ne se limitent pas,
par exemple à :
- un matériau biologique tel que des bactéries, des levures, des
anticorps, de des sucres, des peptides, des composés organiques
volatiles,
- un matériau chimique ou biochimique, tel que des pesticides, des
sucres, de l'acide désoxyribonucléique (ADN), des molécules
pharmaceutiques.
Par sonde, on entend un complémentaire spécifique de l'analyte, un
matériau présentant une affinité avec l'analyte, apte à fixer spécifiquement
l'analyte. Ce matériau est par exemple :
- un matériau biologique tel que des cellules ou des microorganismes
tels que des bactéries,
- un matériau chimique ou biochimique, tel que des molécules, par
exemple des silanes, des biomolécules, telles que des
oligonucléotides, de l'acide désoxyribonucléique (ADN), des
plasmides, des protéines, des anticorps, des oligosaccharides, des
polysaccharides.
- un matériau synthétique, tel que par exemple un polymère à
empreinte moléculaire (MIP).
- un matériau bistable tel que par exemple les analogues du bleu de
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Prusse, les polymères de coordination à base de fer, par exemple le
(Fe" (pyrazine) (Pt(CN)4 )).
Suivant le procédé, comme illustré sur la figure 1, le système diffractant
2, comportant une sonde, dite sonde A, est éclairé au moyen d'un faisceau
incident cohérent 31, de longueur d'onde k. Le système diffractant 2 est formé
par un motif géométrique périodique 24, comportant une alternance de zones,
en relief, comportant la sonde A, et de zones ne comportant pas la sonde A,
déposé sur un substrat 23 et susceptible de contenir un analyte lié à la sonde
A.
Le faisceau incident 31 forme par rapport à une normale 20 à une
surface diffractante 21 du système diffractant 2, un angle a.
Le faisceau incident cohérent 31 interagit avec le système diffractant 2
qui génère des faisceaux diffractés 41, formant des angles R; avec la normale
20, chaque angle R; correspondant à un ordre de diffraction i du champ de
diffraction produit par le système diffractant 2. (sur la figure 1, pour
exemple,
seul le faisceau diffracté d'ordre 1, d'angle Pl est représenté).
Les faisceaux diffractés sont mesurables par des moyens de mesure
(non représentés) délivrant une valeur d'une puissance mesurée de chaque
faisceau diffracté. La puissance mesurée de chaque faisceau diffracté diminue
au fur et à mesure que l'ordre diffracté augmente.
Le champ de diffraction obtenu après diffraction du faisceau incident
sur le système diffractant est fonction, en autre, des caractéristiques
géométriques du système diffractant, lesdites caractéristiques géométriques
étant variables suivant la présence ou non de l'analyte sur la sonde du
système
diffractant 2.
Suivant le procédé, dans une première étape, une première mesure
d'une valeur d'une puissance Pl du faisceau diffracté d'ordre 1 est réalisée,
lorsque le système diffractant n'a pas encore été soumis à la présence de
l'analyte susceptible de se fixer à la sonde.
Dans une deuxième étape, dite étape de sensibilisation, la sonde A est
temporairement mise en contact avec un milieu susceptible de contenir
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l'analyte. Au cours de ladite étape de sensibilisation, l'éventuel analyte se
fixe à
la sonde A.
L'étape de sensibilisation est réalisée de façon conventionnelle, par
exemple par immersion du système diffractant dans un milieu ou par dépôt par
exemple par une micropipette du milieu sur la sonde puis séchage, et non
décrite ici.
Dans une troisième étape, une mesure d'une valeur d'une puissance
P1a du faisceau diffracté d'ordre 1 est réalisée avec le système diffractant
obtenu après l'étape de sensibilisation.
Au cours de cette troisième étape, le système diffractant 2 est soumis
de nouveau au même faisceau incident cohérent 31, avec le même angle a par
rapport à la normale 20.
Dans un mode particulier de mise en oeuvre du procédé suivant
l'invention, lorsque la deuxième étape, l'étape de sensibilisation, consiste à
immerger la sonde dans un liquide, ladite deuxième et la troisième étape
peuvent être réalisées simultanément sans modifier le résultat desdites
étapes.
Dans une quatrième étape, les deux valeurs mesurées de puissance Pl
et P1a sont comparées pour déduire la présence ou non de l'analyte sur le
système diffractant, et donc par conséquent sa présence dans le milieu.
Les deux valeurs de puissance sont comparées de sorte à déterminer
une variation relative du signal (valeur algébrique), dite sensibilité S,
telle que
SP -PQ (1)
P
De la relation précédente, des valeurs seuils Si et S2 sont déterminées
de sorte que :
- lorsque S > Si, l'analyte est déclaré présent sur la sonde A,
- lorsque S < S2, l'analyte est déclaré absent sur la sonde A,
- lorsque S2 < S < Si, il y a une incertitude qui ne permet de conclure
ni à la présence ni à l'absence de l'analyte sur la sonde A. Dans ce
dernier cas, il convient d'effectuer de nouvelles mesures, si besoin
en modifiant le protocole opératoire.
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Dans un mode de mise en oeuvre particulier de l'invention, les zones du
motif géométrique périodique ne comportant pas la sonde A comporte
essentiellement une sonde B.
Ladite sonde B est sensible à un analyte à laquelle la sonde A n'est pas
5 sensible.
Le procédé suivant l'invention permet de rechercher la présence d'un
des deux analytes, susceptibles d'être contenu dans le milieu.
La détection des deux analytes est réalisée à partir d'un seul et même
faisceau diffracté, le faisceau diffracté d'ordre 1.
10 La détection entre les deux analytes distincts est dite différentielle.
La sensibilité S est toujours définie par la relation (1).
Les valeurs seuils Si et S2 sont déterminées de sorte que
- lorsque S > Si, la présence de l'analyte sur la sonde A est déclarée,
- lorsque S < S2, la présence de l'analyte sur la sonde B est déclarée,
- lorsque S2 < S < Si, il y a une incertitude qui ne permet de conclure
ni à la présence ni à l'absence d'analyte sur la sonde A ou B. Dans
ce dernier cas, il convient d'effectuer de nouvelles mesures, si
besoin en modifiant le protocole opératoire.
Les valeurs seuils Si et S2 peuvent être déterminées de manière
expérimentales, compte tenu du nombre important de paramètres, tels que par
exemple les caractéristiques géométriques du système diffractant, la longueur
d'onde du faisceau incident, l'angle d'incidence, la forme du faisceau
incident,
l'indice du substrat, la rugosité du substrat, qui influent sur la précision
de la
mesure.
De préférence, la valeur seuil Si est sensiblement égale à 5 % et la
valeur seuil S2 est sensiblement égale à -5 %.
Les fluctuations de puissance du faisceau incident émis peuvent
conduire à une incertitude supplémentaire, compte tenu des mesures décalées
dans le temps des puissances du faisceau diffracté avant et après l'étape de
sensibilisation.
Un moyen mis en oeuvre par le procédé pour compenser lesdites
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fluctuations consiste à normaliser chaque valeur de puissance mesurée Pl, P1a
des faisceaux diffractés d'ordre 1 par rapport à une valeur de puissance
mesurée P;nc, Pinca du faisceau incident au moment de chaque mesure, avant et
après l'étape de sensibilisation. Pour réaliser une mesure de la puissance du
faisceau incident simultanément à la mesure de la puissance du faisceau
diffracté, une partie yde la puissance du faisceau incident est prélevée, par
exemple 10 à 20%, pour ne pas trop diminuer la sensibilité du dispositif de
mesure associé au procédé.
Ainsi, la sensibilité S est exprimée sous la forme
Pi Pl
S = '1 inc y'1 inca (2)
Pl
y'1 inc
Les valeurs des angles des faisceaux diffractés, trop proches de la
normale 20 ou entre eux, peuvent conduire à une mise en oeuvre délicate du
procédé.
Un moyen mis en oeuvre par le procédé pour générer des angles de
faisceaux diffractés plus ouverts consiste à utiliser un système diffractant
présentant une période p comprise entre k et 2X, de préférence 1 pm, compte
tenu des longueurs d'onde utilisées comprises de préférence entre 400nm et
1200 nm.
De préférence, si le faisceau incident 31 est, de plus, émis en incidence
normale (a = 0) par rapport au système diffractant 2, seul le faisceau
diffracté
d'ordre 1 est visible. L'angle Pl du faisceau diffracté d'ordre 1 est
suffisamment
ouvert (par exemple, pour une période du système diffractant de sensiblement
1 pm, et pour une longueur d'onde de 633nm, l'angle Pl est de sensiblement
40 ) pour permettre un découplage angulaire et spatial des faisceaux réfléchi
et
diffracté.
En n'obtenant seulement que le faisceau diffracté d'ordre 1, le
maximum de la puissance diffractée est localisé sur le faisceau diffracté
d'ordre
1, ce qui améliore le rapport signal sur bruit.
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De plus, les variations des caractéristiques géométriques du système
diffractant suite à l'étape de sensibilisation, caractéristiques de la
présence de
l'analyte sur la sonde, se répercutent uniquement au niveau de la puissance du
faisceau d'ordre 1, et ne sont pas dispersées sur plusieurs faisceaux d'ordre
supérieur.
Un système diffractant 2 pour la mise en oeuvre du procédé comporte,
comme illustré sur la figure 2a, le motif géométrique périodique 24, formé par
une alternance de zones comportant la sonde A, en relief, et de zones ne
comportant pas la sonde A, déposé sur une face 231 du substrat 23, d'indice
nsub.
Le système diffractant est décrit de manière détaillée dans le cas d'un
réseau de lignes parallèles 24, en relief, comportant la sonde A. Ce choix
n'est
pas limitatif et d'autres systèmes diffractants comportant des motifs
géométriques périodiques tel qu'un réseau 2D, par exemple une grille, ou une
figure géométrique complexe apte à diffracter la lumière, peuvent aussi être
utilisés.
De préférence, afin d'augmenter la sensibilité du procédé, les lignes du
réseau présentent une dimension nanométrique.
Dans un mode préféré de réalisation, comme illustré sur les figures 1 à
2b, le substrat 23 présente une face 231 plane.
Le substrat 23 est, par exemple, réalisé dans un matériau en verre, en
silicium ou en or.
De préférence, les lignes, comportant la sonde A, ont une section droite
en forme de créneau. Mais d'autres sections droites sont également possibles,
telles que par exemple des sections droites de forme sinusoïdale ou
triangulaire.
Le réseau présente la période p telle que précédemment définie, une
largeur de ligne I, un taux de remplissage r, défini comme un rapport entre la
largeur de ligne I et la période p, r = l .
P
Le taux de remplissage r constitue un compromis entre la sensibilité S
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et la puissance du faisceau diffracté. Si le taux de remplissage r diminue, la
sensibilité S augmente mais la puissance du faisceau diffracté diminue rendant
la mesure de puissance plus délicate à réaliser.
De préférence, pour améliorer la sensibilité S du procédé tout en
conservant une valeur suffisante de la puissance du faisceau diffracté, le
réseau est dimensionné de sorte que le taux de remplissage r soit inférieur à
0,5.
Les lignes parallèles en relief 24 comportent une première couche, dite
couche d'accroche 26, d'épaisseur ec et d'indice nc.
La couche adhésive comporte un matériau apte à permettre l'ancrage
de la sonde A.
Pour améliorer la sensibilité S du dispositif, le matériau de la couche
d'accroche 26 est choisi de sorte à permettre une accroche surfacique de la
sonde A sur la couche d'accroche. Par accroche surfacique, on entend une
accroche sur une face supérieure 261, opposée au substrat 23, de la couche
d'accroche, ainsi que sur des faces latérales 262 de ladite couche d'accroche.
Ce matériau est par exemple :
- un silane, si le substrat est en silicium,
- un thiol, si le substrat est en or,
- un sucre,
- un dendrimère,
- un nano îlot métallique,
- une nanoparticule,
- un MIP,
- un matériau bistable.
L'épaisseur ec de la couche adhésive constitue un compromis entre la
sensibilité S et la puissance du faisceau diffracté. Plus l'épaisseur ec
augmente,
plus la puissance du faisceau diffracté augmente mais plus la sensibilité S
diminue.
Avantageusement, l'épaisseur ec est comprise entre 0 nm et 500 nm,
de préférence sensiblement de l'ordre de 5 nm.
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Les lignes parallèles en relief 24 comportent une deuxième couche,
d'épaisseur es et d'indice n, dite couche spécifique 25, d'accroche de
l'analyte
et comprend la sonde A.
L'épaisseur es est dimensionnée par rapport à une épaisseur eana,yte
d'une couche d'analyte 28 (figure 2b), susceptible d'avoir été déposée sur la
couche spécifique 25, après l'étape de sensibilisation. Un rapport
es constitue un compromis entre la sensibilité S et la puissance du faisceau
eanalyte
diffracté. Si le rapport es diminue, la sensibilité S augmente mais la
eanalyte
puissance du faisceau diffracté diminue.
De préférence, pour améliorer la sensibilité S du dispositif tout en
conservant une valeur suffisante de la puissance du faisceau diffracté,
l'épaisseur es de la couche spécifique est dimensionnée de sorte que le
rapport
es soit inférieur à 1.
eanalyte
Avantageusement, l'épaisseur es de la couche spécifique 25 est
comprise entre 0,5nm et 150nm, de préférence sensiblement de l'ordre de
1Onm.
Dans un premier mode de réalisation, comme illustré sur la figure 2a et
2b, le réseau 2 comporte, entre les lignes parallèles 24, une couche,
recouvrant
le substrat 23, dite couche de passivation 27, d'épaisseur ep. Ladite couche
de
passivation comporte un matériau apte à augmenter la sélectivité de l'adhésion
de la sonde avec l'analyte. En augmentant la sélectivité de l'adhésion de la
sonde avec l'analyte, la sensibilité du dispositif est améliorée.
Dans un exemple de réalisation, la couche de passivation est un
polyéthylène glycol (PEG), une albumine de sérum bovin (BSA), un
octadecyltrichlorosilane (OTS), une éthanolamine.
L'épaisseur ep de la couche de passivation est de dimension petite
devant l'épaisseur ec de la couche d'accroche, par exemple de l'ordre de
quelques angstrôms, afin de ne pas diminuer la surface d'accroche de la
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couche d'accroche.
Dans un mode de réalisation plus complexe et non illustré, le réseau 2
comporte, entre les lignes parallèles 24, et recouvrant le substrat, une
couche,
dite seconde couche spécifique, d'accroche d'un analyte pour lequel la sonde A
5 n'est pas sensible, et comportant la sonde B et une couche d'ancrage de la
sonde B.
De préférence, afin d'exploiter efficacement la détection différentielle
entre les deux analytes, l'épaisseur eana,yte de la couche d'analyte 28
déposée
sur la sonde A présente une épaisseur au moins inférieure d'un nanomètre ou
10 au moins supérieure d'un nanomètre à une épaisseur d'une couche d'analyte
déposée sur la sonde B.
Avantageusement, dans ce mode de réalisation, le taux de remplissage
r est sensiblement égal à 0,5.
Dans un mode de réalisation, le réseau de lignes est un réseau de
15 lignes par réflexion et le substrat est de préférence, optiquement
transparent, à
la longueur d'onde k utilisée.
Dans un autre mode de réalisation, le réseau de lignes est un réseau
de lignes par réflexion et le substrat est de préférence, non optiquement
transparent, à la longueur d'onde k utilisée.
Exemple 1 : simulation de l'épaisseur ec de la couche d'accroche
L'exemple 1 illustre, à partir des figures 3a et 3b, le compromis entre la
sensibilité S et la puissance normalisée du faisceau diffracté d'ordre 1 P
avant
Pnc
l'étape de sensibilisation, pour différentes épaisseurs ec de la couche
d'accroche 26 et pour les paramètres suivants
X 633nm a, 00
indice nSUb du substrat 1,45
indice ne de la couche 1,5 épaisseur ec de la couche de 0,5 à 120nm
d'accroche d'accroche
indice ns de la sonde A de 1,05 à 1,45 épaisseur ec de la sonde A 10nm
Quelque soit l'indice ns de la sonde A, lorsque l'épaisseur ec de la
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couche d'accroche augmente, la puissance normalisée du faisceau diffracté
d'ordre 1 P avant l'étape de sensibilisation augmente (figure 3a) au contraire
inc
de la sensibilité S qui décroît rapidement (figure 3b).
Exemple 2 : simulation de la sensibilité S en fonction du rapport es
eanalyte
L'exemple 2 illustre, à partir de la figure 4, la sensibilité S en fonction du
rapport es du système diffractant, pour différentes épaisseurs es de la
eanalyte
couche spécifique et pour les paramètres suivants
X 633nm 00
indice nSUb du substrat 1,45
indice ne de la couche 1,5 épaisseur ec de la couche Onm
d'accroche d'accroche
indice ns de la sonde A 1,3 épaisseur ec de la sonde A de 0,5 à 100nm
indice nanaiyte de l'analyte 1,3 épaisseur eanalyte de l'analyte de 0,5 à
100nm
Les différentes courbes présentent le même profil et on constate que la
sensibilité S est améliorée si le rapport es est inférieur à 1.
eanalyte
Exemple 3 : simulation du taux de remplissage r et sensibilité S
L'exemple 3 illustre, à partir de la figure 5a, la sensibilité S en fonction
du taux de remplissage du système diffractant pour différentes périodes p et,
pour les paramètres suivants :
X 633nm a, 00
indice nSUb du substrat 1,45 taux de remplissage r de 0,01 à 0,85
indice ne de la couche 1,5 épaisseur ec de la couche 14nm
d'accroche d'accroche
indice ns de la sonde A 1,35 épaisseur ec de la sonde A 10nm
indice nanaiyte de l'analyte 1,35 épaisseur eanalyte de l'analyte 10nm
période p de 700 à
1200nm
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La courbe 1 illustre le cas où l'accroche de la sonde A sur la couche
d'accroche est réalisée uniquement sur la partie supérieure de ladite couche
d'accroche (cas illustré sur la figure 5b). On constate que quelque soit le
taux
de remplissage et la période du système diffractant, la sensibilité S reste
constante.
La courbe 2 illustre le cas où l'accroche de la sonde A sur la couche
d'accroche est réalisée sur toute la surface (la partie supérieure et les
faces
latérales) de ladite couche d'accroche (cas illustré sur la figure 2b). On
constate
que la sensibilité S est améliorée si le taux de remplissage r est inférieur à
0,5,
quelque soit la période p du système diffractant.
Exemple 4 : mesure expérimentale de la sensibilité S
L'exemple 4 illustre, à partir des figures 7a et 7b, la sensibilité S
obtenue expérimentalement pour plusieurs épaisseurs de la couche d'accroche
et, pour les paramètres suivants :
X 632nm 00
indice nSUb du substrat 1,52 taux de remplissage r 0,5
indice ne de la couche 1,41 épaisseur ec de la couche de 2,5 à 1,5nm
d'accroche d'accroche
indice ns de la sonde A 1,35 épaisseur ec de la sonde A 1nm
période p 1 pm Puissance laser 5mW
Pour cet exemple 4, le substrat est un verre silanisé. La couche
d'accroche est une couche de streptavidine. La sonde A est une protéine A
biotinylée. L'analyte est un anticorps anti-protéine A.
L'angle du faisceau diffracté d'ordre 1 est de 40 .
La figure 7a illustre schématiquement le système diffractant réalisé pour
la mise en oeuvre du procédé. Le système diffractant a une période de 1000nm
et est composé de 400 lignes de 500 nm de largeur. La première étape pour
réaliser le système diffractant consiste à déposer par tamponnage moléculaire
la couche d'accroche 26. La deuxième étape consiste à incuber la molécule
sonde, suivi d'un rinçage par un tampon phosphate salin, dit tampon PBS. La
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dernière étape consiste à incuber l'analyte suivi d'un rinçage avec un tampon
PBS.
Deux interactions sont observées
- une première interaction entre l'analyte et la sonde A (interaction
spécifique),
- une deuxième interaction entre l'analyte et le substrat.
La figure 7b illustre la sensibilité obtenue pour quatre réseaux
présentant des épaisseurs ec différentes de la couche d'accroche (l'épaisseur
varie de 1.5 nm à 2.5nm).
On constate que, comme dans les simulations (figure 3b), que lorsque
l'épaisseur ec de la couche d'accroche diminue, la sensibilité S augmente. De
plus, la sensibilité S est positive.
Exemple 5 : mesure expérimentale de la sensibilité S
L'exemple 5 illustre, à partir des figures 8a et 8b, la sensibilité S
obtenue expérimentalement pour plusieurs épaisseurs de la couche d'accroche
et, pour les paramètres suivants :
X 632nm 00
indice nSUb du substrat 1,52 taux de remplissage r 0,5
indice ne de la couche 1,41 épaisseur ec de la couche de 2,5 à 1,5nm
d'accroche d'accroche
épaisseur ec de la sonde A 0
période p 1 pm Puissance laser 5mW
Pour cet exemple 5, le substrat est un verre silanisé. La couche
d'accroche est une couche de streptavidine. L'analyte est un anticorps anti-
protéine A.
L'angle du faisceau diffracté d'ordre 1 est de 400.
La figure 8a illustre schématiquement le système diffractant réalisé pour
la mise en oeuvre du procédé. Le système diffractant a une période de 1000nm
et est composé de 400 lignes de 500 nm de largeur. La première étape pour
réaliser le système diffractant consiste à déposer par tamponnage moléculaire
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la couche d'accroche 26. La deuxième étape consiste à incuber l'analyte suivi
d'un rinçage avec un tampon PBS. Il n'y a pas eu d'étape d'incubation de la
molécule sonde.
Deux interactions sont observées
- une première interaction entre l'analyte et la couche d'accroche,
- une deuxième interaction entre l'analyte et le substrat.
La figure 8b illustre la sensibilité obtenue pour six réseaux présentant
des épaisseurs ec différentes de la couche d'accroche (l'épaisseur varie de
1.5
nm à 2.5nm).
On constate que la sensibilité S est négative. En effet, l'interaction entre
l'analyte et la couche d'accroche est sensiblement inexistante. L'interaction
entre l'analyte et le substrat est alors majoritairement observée. Ainsi,
lorsqu'il
n'y a pas d'interaction entre les lignes et l'analyte, la sensibilité S est
négative.
Par cet exemple, on montre qu'il est possible de mesurer deux
interactions en une mesure.
Un dispositif de mesure 1 pour la recherche d'un analyte dans un milieu
susceptible de le contenir, comme illustré sur la figure 6, ledit analyte
étant lié à
une sonde formant un système diffractant 2 comporte :
- des moyens d'illumination 3 du système diffractant 2 par le faisceau
incident cohérent 31,
- des moyens de mesure 5 de la puissance du faisceau incident 31
d'ordre 1,
- des moyens de mesure 4 de la puissance du faisceau diffracté 41
d'ordre 1, après diffraction du faisceau incident 31 par le système
diffractant 2,
- des moyens de calcul 6 de la sensibilité S,
- des moyens 7 de présentation de l'information.
Lorsque le système diffractant (2) est réalisé avec la période p du motif
géométrique périodique comprise entre k et 2X, de manière à ce que seul le
faisceau de diffraction d'ordre 1 est visible, il n'y a pas lieu d'utiliser
d'optique
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séparatrice, tel que par exemple un prisme, pour séparer les faisceaux
diffractés. Le dispositif de mesure gagne ainsi en coût et en simplicité de
réalisation.
Les moyens d'illumination 3 comportent une source lumineuse 32.
5 Avantageusement la source lumineuse a une longueur d'onde k
comprise dans le domaine du visible et de l'infrarouge.
Dans un exemple de réalisation, la longueur d'onde k de la source
lumineuse est sensiblement de l'ordre de 633nm.
Dans un exemple de réalisation, la source lumineuse 32 est une source
10 monochromatique continue ou pulsée.
De préférence, la source lumineuse 32 est un laser, tel que par
exemple une diode laser ou un laser Hélium-Néon.
Dans un autre exemple de réalisation, la source lumineuse 32 est une
lumière blanche. Les moyens d'illumination 3 comportent en outre au moins un
15 filtre de sélection (non représenté) de la longueur d'onde désirée et des
optiques de collimation (non représentées) pour générer le faisceau incident
collimaté.
Les moyens de mesure 4, 5 comportent au moins un détecteur 42, 51,
un détecteur 51 interceptant le faisceau incident, par exemple au moyen d'une
20 lame semi-réfléchissante 9, et un détecteur 42 interceptant le faisceau
diffracté
d'ordre 1.
Chaque détecteur 42, 51 est relié à des moyens de traitement 43, 53
apte à traiter un signal de mesure transmis par le détecteur. Les moyens de
traitement 53 délivrent la valeur de la puissance du faisceau incident et les
moyens de traitement 43 délivrent une valeur d'une puissance du faisceau
diffracté d'ordre 1.
Les détecteurs sont par exemple un élément photosensible, tel que une
photodiode, ou au moins un photomultiplicateur ou une matrice à couplage de
charges CCD.
Dans un exemple de réalisation, les faisceaux sont dirigés à travers un
guide d'onde, tel que par exemple une fibre optique, vers le détecteur.
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Dans un mode de réalisation, un moyen de mesure unique assure la
fonction des deux moyens de mesure 4, 5 en mesurant la puissance du
faisceau incident et la puissance du faisceau diffracté.
Les moyens de calculs 6 sont reliés aux moyens de mesure 4 et 5 et
déterminent la valeur de la sensibilité S.
Par exemple, les moyens de calculs comportent au moins un
calculateur, apte à calculer la sensibilité S.
Les moyens 7 de présentation de l'information sont reliés aux moyens
de calculs 6 et caractérisent entre autre la sensibilité S.
Les moyens 7 de présentation de l'information comportent par exemple
des moyens d'affichage 71, qui signalent la présence, l'absence ou
l'incertitude
sur la présence de l'analyte.
Dans un exemple de réalisation, lorsque le système diffractant
comporte la sonde A, les moyens d'affichage 71 sont un jeu de trois diodes,
clignotantes ou non, qui s'illuminent suivant la valeur de la sensibilité S :
- la diode verte s'illumine pour signaler la présence de l'analyte sur la
sonde A,
- la diode rouge s'illumine pour signaler l'absence de l'analyte sur la
sonde A,
- la diode jaune s'illumine pour signaler l'incertitude sur la présence
ou l'absence de l'analyte.
Lorsque le système diffractant comporte la sonde A et la sonde B, les
moyens d'affichage 71 sont un jeu de trois diodes, clignotantes ou non, qui
s'illuminent suivant la valeur de la sensibilité S :
- la diode verte s'illumine pour signaler la présence d'analyte sur la
sonde A,
- la diode rouge s'illumine pour signaler la présence d'analyte sur la
sonde B,
- la diode jaune s'illumine pour signaler l'incertitude sur la présence
ou l'absence d'analyte sur la sonde A ou B.
De préférence, les moyens 7 de présentation de l'information
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comportent en outre un indicateur de la qualité de la diffraction indiquant un
rapport signal sur bruit avant l'étape de sensibilisation.
Dans un autre exemple de réalisation, les moyens d'affichage 71 sont
une image du système diffractant avec un code de couleur selon l'intensité du
faisceau diffracté, tel que par exemple une couleur bleue dont l'intensité
augmente avec l'intensité du faisceau diffracté dans le cas où la sensibilité
S
est supérieure à Si, une couleur rouge dont l'intensité augmente lorsque
l'intensité du faisceau diffracté diminue dans le cas où la sensibilité S est
inférieure à S2 et une couleur noire dans le cas où la sensibilité est
comprise
entre Si et S2.
Dans une forme de réalisation de l'invention, afin de permettre la
réalisation d'analyses (recherche de la présence d'au moins un analyte lié à
une sonde) sur un grand nombre de systèmes diffractants en un minimum de
temps, une puce d'analyse comporte une pluralité de systèmes diffractants
juxtaposés sur une surface d'un support, suivant des agencements particuliers,
en général réguliers, tels que par exemple sous la forme de matrices de lignes
et de colonnes. Lesdits systèmes diffractants sont analysés individuellement
suivant le procédé de l'invention, par exemple au moyen du dispositif de
mesure précédemment décrit qui balaie successivement à la surface du support
la pluralité de systèmes diffractants, soit par un mouvement du dispositif de
mesure, soit par un mouvement du support, soit par une combinaison des deux
mouvements. Chaque système diffractant comporte au moins une sonde et
présente des caractères propres.
Dans un premier exemple, pour obtenir des mesures de redondance,
les systèmes diffractants sont identiques entre eux.
Dans un deuxième exemple, au moins deux systèmes diffractants
diffèrent par leurs motifs géométriques périodiques.
Dans un troisième exemple, pour permettre de rechercher la présence
de différents analytes, au moins deux systèmes diffractants diffèrent au moins
par l'une de leur sonde. Par exemple, un premier système diffractant est
réalisé
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avec une sonde liée à un premier analyte et un deuxième système diffractant
est réalisé avec une sonde liée à un analyte différent et non sensible au
premier
analyte. Ce troisième exemple permet, par un choix approprié des sondes, de
multiplier le nombre d'analytes qu'il est possible de rechercher sur une même
puce.
Dans un quatrième exemple, au moins deux systèmes diffractants
diffèrent d'une part par leurs motifs géométriques périodiques et d'autre part
par
au moins par l'une de leur sonde.
De préférence, une cartographie du support comportant l'ensemble des
systèmes diffractants est réalisée, chaque zone colorée de la cartographie
correspondant à un emplacement d'un système diffractant. Dans un exemple
de réalisation, la coloration correspond à un code de couleur selon
l'intensité du
faisceau diffracté, tel que par exemple une couleur bleu dont l'intensité
augmente avec l'intensité du faisceau diffracté dans le cas où la sensibilité
S
est supérieure à Si, une couleur rouge dont l'intensité augmente lorsque
l'intensité du faisceau diffracté diminue dans le cas où la sensibilité S est
inférieure à S2 et une couleur noire dans le cas où la sensibilité est
comprise
entre Si et S2.
