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Complexe constitué d'un polysaccharide et d'une HBP
[0001]. La présente invention concerne la formulation de protéines
thérapeutiques et plus particulièrement la formulation de protéines se liant
à l'héparine dites Heparin-Binding Proteins, HBPs, qui sont associées, in
vivo, à l'héparine sous forme de complexe, ce qui permet leur stabilisation
et le maintien de leur activité in vivo.
[0002]. L'héparine est un polysaccharide naturel porteur de fonctions
carboxylates et sulfates dont la charge globale est anionique. Mais ce
polysaccharide est connu pour son activité anti-coagulante puisqu'il
intervient dans la formation d'un complexe entre la thrombine et l'anti-
thrombine III et cette activité anti-coagulante n'est pas compatible avec
une utilisation thérapeutique, par exemple, dans des traitements de
cicatrisation, de régulation de la croissance, de reconstruction osseuse.
[0003]. Certaines de ces HBPs ont fait l'objet d'un développement
pharmaceutique. Cependant ces protéines sont connues pour être instables
physiquement (aggrégation) et chimiquement (dégradation enzymatique ou
chimique). Cette instabilité peut se manifester dans les formulations et/ou
sur le site d'administration. Elle peut provoquer des réactions
immunoglogiques ou une perte d'efficacité. Pour compenser la perte
d'activité, des solutions comme l'augmentation des doses ou de la
fréquence des administrations sont employées. Elles ne sont pas
satisfaisantes, notamment en raison du prix élevé de ces protéines.
[0004]. Par exemple, la société Genentech a développé une
formulation de VEGF pour la cicatrisation de l'ulcère du pied diabétique.
Une première étude clinique dans laquelle l'administration du traitement se
faisait tous les deux jours a eu lieu. La seconde étude a été réalisée avec
une administration quotidienne, sans doute pour répondre au problème
d'une durée d'action du VEGF trop courte pour une application tous les
deux jours.
[0005]. Il a été par ailleurs démontré qu'il était possible de former des
complexes entre un facteur de croissance et un polymère dans le but de le
stabiliser, d'augmenter sa solubilité et/ou d'augmenter son activité.
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[0006]. Ainsi, dans le brevet FR0509803 de la demanderesse, il a pu
être démontré que la formation de complexe entre le PDGF-BB sous sa
forme court e et un polymère permettait notamment d'augmenter la
solubilité de cette protéine très hydrophobe.
Cependant, le PDGF-BB sous sa forme courte se fixe 100 fois moins que le
PDGF-AA à l'héparine, Lustig F et al, Journal of molecular recognition,
1999, 12,112-120, il ne peut donc pas être considéré comme un facteur de
croissance appartenant à la famille des HBPs.
[0007]. Dans le cas du FGF, connu pour être relativement hydrophile,
il a pu être démontré que la formation d'un complexe avec un polymère
pouvait favoriser son activité cellulaire Rouet et al, Journal of biomédical
materials research, 2006, 78A, 792-797, mais les polymères utilisés étaient
sulfatés puisque fonctionnalisés par de la benzylamine sulfate et donc
présentaient une activité anti-coagulante incompatible avec une
formulation pharmaceutique.
[0008]. Logeart-Avramoglou D et al. décrivent également des dextrans
modifiés par de la benzylamine et/ou des sulfates dans l'article de
Biomédical Pharmacology 2002, 63, 129-137. Ces polymères en solution
forment des complexes avec le TGF béta 1 comme démontré dans un essai
d'interaction par électrophorèse sur gel. Cependant, les polymères non
sulfatés ne présentent pas de réelle interaction même à des ratio
supérieurs à 2000. Dans le cas des polymères sulfatés, une interaction a pu
être démontrée pour des polymères fortement sulfatés qui présentent des
propriétés anti-coagulantes.
[0009]. En outre, il est également connu que la benzylamine peut
présenter une certaine toxicité et peut nuire à la biocompatibilité des
polymères décrits dans les deux brevets cités précédemment.
[00010]. La formulation galénique de protéines à visée thérapeutique
doit obligatoirement répondre à des impératifs d'innocuité des excipients et
pour atteindre ces impératifs, il est indispensable d'utiliser des composés
qui soient biocompatibles mais également d'en limiter la quantité par
rapport au principe actif.
[00011]. Les HBPs appartiennent à huit familles de protéines elles ont
des tailles, des propriétés biochimiques et des activités très différentes,
elles sont cependant toutes susceptibles de s'associer à l'héparine sous
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forme de complexe, Bernfield M. et al., Annu. Rev. Biochem., 1999, 68,
729-777.
[00012]. Parmi celles-ci, on trouve des protéines appartenant
notamment aux familles suivantes
- les hormones,
- les facteurs de croissance,
[00013]. Ces différentes familles peuvent être définies comme suit.
[00014]. Par hormones, on entend des protéines messagères produites
par le système endocrinien. Ces protéines agissent ensuite à distance après
avoir été véhiculées dans l'ensemble de l'organisme par le sang ou la
lymphe ou à l'extérieur de celui-ci. Parmi les hormones, on trouve
l'hormone de croissance (hGH : human growth hormone) et l'hormone
parathyroïdienne (PTH : parathyroid hormone).
[00015]. Par facteurs de croissance, on entend les protéines
normalement produites dans l'organisme stimulant la prolifération des
cellules ou leur différenciation. Parmi ceux-ci, on trouve des protéines
telles
que les facteurs de croissance transformants R1 et 2 (TGF-R: transforming
growth factor bêta), le facteur de croissance analogue à l'insuline de type 2
(IGF-2 : Insulin-like growth factor 2), le facteur de croissance liant
l'héparine et analogue au facteur de croissance épidermique (HB-EGF :
Heparin Binding EGF-like Growth Factor), les facteurs de = croissance
fibroblastiques de type 1 à 14 (FGF : fibroblast growth factors), le facteur
de croissance des kératinocytes (KGF : Keratinocyte Growth Factor), le
facteur de croissance du nerf beta (NGF-beta : Nerve Growth Factor beta ),
le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF : Connective Tissue
Growth Factor), le facteur de croissance placentaire (PIGF : Placental
Growth Factor), les R-spondines 1 à 4 et les facteurs de croissance de
l'endothélium vasculaire A et B (VEGF : Vascular Endothelial Growth
Factors).
[00016]. Tous les complexes décrits ont été réalisés avec des polymères
qui ont une similitude stucturale ou biologique avec l'héparine.
[00017]. Le problème résolu par la présente invention est d'avoir
identifié une famille très restreinte de polysaccharides biocompatibles
capables de former des complexes avec les HBPs afin entre autre, de les
stabiliser et d'augmenter leur solubilité, sans que ce polymère ne présente
l'activité biologique d'anti-coagulation de l'héparine.
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[00018]. De plus il a été observé que pour augmenter l'affinité du
polysaccharide pour les protéines et sa sélectivité vis-à-vis des HBPs, il
n'était pas nécessaire d'augmenter encore l'amphililie du polymère
contrairement à la solution exposée dans la demande FR0509803.
[00019]. De plus pour contrebalancer une hydrophobicité trop
importante une solution exposée dans la demande ci-dessus citée consistait
à greffer des groupements hydrophiles X ou Y sur les chaines
polysaccharidiques en plus des groupements hydrophobes.
[00020]. Ces résultats sont d'autant plus surprenants que par greffage
d'un groupement hydrophobe salifiable ou salifié comme un reste
tryptophane qui possède une fonction acide on augmente l'affinité du
polysaccharide pour la protéine et la sélectivité vis-à-vis des HBPs, sans
diminuer le nombre de fonctions carboxyles du polysaccharide de départ.
[00021]. Par le choix de ces substituants la sélectivité vis-à-vis des
HBPs est considérablement accrue.
[00022]. L'invention concerne donc l'utilisation d'un polysaccharide
susbstitué par un tryptophane ou un dérivé de tryptophane, ledit
trytophane ou dérivé du tryptophane étant salifiable ou salifié pour la
stabilisation des HBPs.
[00023]. Elle concerne plus particulièrement l'utilisation dudit
polysaccharide pour la préparation d'une formulation pharmaceutique de
HBPs stables.
[00024]. Elle concerne également un complexe constitué d'un
polysaccharide et d'une HBP.
[00025]. Les polysaccharides selon l'invention sont constitués de
liaisons glycosidiques de type (1,6), et/ou (1,4), et/ou (1,3) et/ou (1,2).
Ils
peuvent être neutres, c'est-à-dire ne pas être porteurs de fonctions acides
ou, anioniques c'est-à-dire porteurs de fonctions acides.
Ils sont fonctionnalisés par au moins un reste du tryptophane ou un dérivé
du tryptophane, noté Trp :
- ledit dérivé du tryptophane étant greffé ou lié aux polysaccharides
par couplage avec une fonction acide, ladite fonction acide pouvant
être une fonction acide d'un polysaccharide anionique et/ou une
fonction acide portée par un bras de liaison R lié au polysaccharide
par une fonction F, ladite fonction F résultant du couplage entre le
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bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou
anionique,
- F étant soit une fonction ester, thioester, amide, . carbonate,
carbamate, éther, thioéther ou amine,
5 - R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones,
éventuellement branchée et/ou insaturée, comprenant un ou
plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins
une fonction acide,
- Trp étant un reste du tryptophane ou d'un dérivé du tryptophane, L
ou D, produit du couplage entre l'amine du tryptophane et au moins
un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le
polysaccharide anionique, ledit trytophane ou dérivé du tryptophane
étant salifiable ou salifié.
[00026]. Dans un mode de réalisation Trp est un reste du
tryptophane ou d'un dérivé du tryptophane, de configuration D.
[00027]. Dans un mode de réalisation Trp est un reste du
tryptophane ou d'un dérivé du tryptophane, de configuration L.
[00028]. La HPB est choisie dans le groupe constitué par
- les hormones comme l'hormone de croissance (hGH
human growth hormone) ou l'hormone parathyroïdienne (PTH
parathyroid hormone).
- les facteurs de croissance comme les protéines telles que les
facteurs de croissance transformants 01 et 2 (TGF-R: transforming
growth factor bêta), le facteur de croissance analogue à l'insuline de
type 2 (IGF-2 : Insulin-like growth factor 2), le facteur de croissance
liant l'héparine et analogue au facteur de croissance épidermique
(HB-EGF : Heparin Binding EGF-like Growth Factor), les facteurs de
croissance fibroblastiques de type 1 à 14 (FGF : fibroblast growth
factors), le facteur de croissance des kératinocytes (KGF :
Keratinocyte Growth Factor), le facteur de croissance du nerf 3 (NGF-
(3 : Nerve Growth Factor p ), le facteur de croissance du tissu
conjonctif (CTGF : Connective Tissue Growth Factor), le facteur de
croissance placentaire (PIGF : Placental Growth Factor), les R-
spondines 1 à 4 et les facteurs de croissance de l'endothélium
vasculaire A et B (VEGF : Vascular Endothelial Growth Factors).
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[00029]. Selon l'invention, les polysaccharides fonctionnalisés peuvent
répondre aux formules générales suivantes
Polysaccharide [ri] o .
R ~
[Trp In
Formule I
- F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction
-OH du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction
ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou
amine,
- R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18. carbones,
éventuellement branchée et/ou insaturée, comprenant un ou plusieurs
hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction
acide,
- Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du
couplage entre l'amine du tryptophane ou d'un dérivédu tryptophane
et au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté
par le polysaccharide anionique, ledit trytophane ou dérivé du
tryptophane étant salifiable ou salifié.
- n représente la fraction molaire des R substitués par Trp et est
comprise entre 0,2 et 0,7,
- o représente la fraction molaire des fonctions acides des
polysaccharides substituées par Trp et est comprise entre 0,2 et 0,7,
- i représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le
groupement R par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2,
- j représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le
polysaccharide anionique par unité saccharidique et est comprise entre 0
et 1,
- (i + j) représente la fraction molaire de fonctions acides par unité
saccharidique et est comprise entre 0,5 et 2,
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- lorsque R n'est pas substitué par Trp, alors le ou les acides du
groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de.préférence
comme Na+ ou K+,
- lorsque le polysaccharide est un polysaccharide anionique, lorsqu'une
ou des fonctions acides du polysaccharide ne sont pas substituées par
Trp, alors elles sont salifiées par un cation, alcalin de préférence comme
Na ou K,
- lesdits polysaccharides étant à pH neutre.
[00030]. Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate,
un carbamate ou un éther.
[00031]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué
en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6).
[00032]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6) est un dextrane.
[00033]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué
en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4).
[00034]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) est choisi dans le groupe
constitué par le pullulane, l'alginate, le hyaluronane, le xylane, le
galacturonane ou une cellulose soluble dans l'eau.
[00035]. Dans un mode de réalisation, , le polysaccharide est un
pullulane.
[00036]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un
alginate.
[00037]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un
hyaluronane.
[00038]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un xylane.
[00039]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un
galacturonane.
[00040]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est une
cellulose soluble dans l'eau.
[00041]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué
en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3).
[00042]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3) est un curdlane.
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[00043]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué
en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2).
[00044]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2) est une inuline.
[00045]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué
en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3)
[00046]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3) est un glucane.
[00047]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué
en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2).
[00048]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en
majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2) est le
mannane.
[00049]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon
l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes
suivants :
F F F
OO O OOO OO
ou leurs sels de cations alcalins.
[00050]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon
l'invention est caractérisé en ce que le tryptophane ou dérivé du
tryptophane est choisi dans le groupe constitué par le tryptophane, le
tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de
cation alcalin.
[00051]. Ce substituant tryptophane ou dérivé du tryptophane est un
substituant salifiable ou salifié, c'est-à-dire qu'il possède au moins une
fonction hydrophile, anionique ou cationique , à savoir acide, alcool ou
amine susceptible de donner des carboxylates, des alcoolates ou des sels
d'amines.
[00052]. Le polysaccharide peut avoir un degré de polymérisation m
compris entre 10 et 10000.
[00053]. Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation
m compris entre 10 et 1000.
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[00054]. Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de
polymérisation m compris entre 10 et 500.
[00055]. Dans un mode de réalisation, le complexe selon l'invention est
caractérisé en ce que le ratio massique polysaccharide/HBP est compris
entre 0,5 et 500, de préférence entre 1 et 300.
[00056]. Dans un mode de réalisation, le complexe selon l'invention est
caractérisé en ce que le ratio massique polysaccharide/HBP est compris
entre 0,5 et 100, de préférence entre 1 et 10.
[00057]. Dans un mode de réalisation, le complexe selon l'invention est
caractérisé en ce que l'HBP est choisie dans le groupe des hormones
comme l'hormone de croissance (hGH : human growth hormone) ou
l'hormone parathyroïdienne (PTH : parathyroid hormone).
[00058]. Dans un mode de réalisation, le complexe selon l'invention est
caractérisé en ce que l'HBP est choisie dans le groupe des facteurs de
croissance comme les protéines telles que les facteurs de croissance
transformants X31 et 2 (TGF-[3: 'transforming growth factor bêta), le facteur
de croissance analogue à l'insuline de type 2 (IGF-2 : Insulin-like growth
factor 2), le facteur de croissance liant l'héparine et analogue au facteur de
croissance épidermique (HB-EGF : Heparin Binding EGF-like Growth
Factor), les facteurs de croissance fibroblastiques de type 1 à 14 (FGF
fibroblast growth factors), le facteur de croissance des kératinocytes (KGF
Keratinocyte Growth Factor), le facteur de croissance du nerf R (NGF-(3
Nerve - Growth Factor [3 ), le facteur de croissance du tissu conjonctif
(CTGF : Connective Tissue Growth Factor), le facteur de croissance
placentaire (PIGF : Placental Growth Factor), les R-spondines 1 à 4 et les
facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire A et B (VEGF : Vascular
Endothelial Growth Factors).
[00059]. L'invention concerne également un procédé de préparation
desdits polysaccharides par greffage d'un dérivé du tryptophane tel que
précédemment défini sur un polysaccharide neutre, par couplage entre la
fonction amine du tryptophane ou d'un dérivédu tryptophane et une
fonction acide obtenue par greffage d'un groupement R portant au moins
une fonction acide tel que précédemment défini sur une fonction alcool du
polysaccharide, pour obtenir des polysaccharides de formule I, dans
laquelle j=0.
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[00060]. Dans un mode de réalisation, les polysaccharides selon
l'invention sont obtenus par greffage d'un dérivé du tryptophane tel que
précédemment défini sur une fonction acide d'un polysaccharide anionique,
par couplage entre la fonction amine du tryptophane ou d'un dérivédu
5 tryptophane et une fonction acide portée par le polysaccharide anionique,
pour obtenir des polysaccharides de formule I, dans laquelle i=0.
[00061]. Dans un mode de réalisation, lorsque le polysaccharide est un
polysaccharide anionique, des groupements R, peuvent être greffés sur les
fonctions alcools du polysaccharide et le greffage du tryptophane ou d'un
10 dérivédu tryptophane peut être effectué
- soit sélectivement sur les fonctions acides des groupements R, pour
obtenir des polysaccharides de formule I, dans laquelle o=0, par des
réactions de protection déprotection bien connues de l'homme de
l'art ou
- conjointement sur les deux types de fonctions acides, pour obtenir
des polysaccharides de formule I, dans laquelle n>0 et o>0.
[00062]. Dans tous les modes de réalisation ci-dessus décrits, les
réactions de couplage sont suivies de la neutralisation des fonctions acides
n'ayant pas réagi avec un dérivé du tryptophane par salification par une
des méthodes bien connues de l'homme de l'art, pour obtenir un sel de
cation alcalin de préférence Na ou K.
[00063]. L'invention concerne également une composition
pharmaceutique comprenant un complexe selon l'invention tel que décrit
précédemment.
[00064]. L'invention concerne également une composition
pharmaceutique selon l'invention telle que décrite précédemment,
caractérisée en ce qu'elle est obtenue par séchage et/ou lyophilisation.
[00065]. L'HBP peut être exogène c'est à dire qu'elle est apportée par la
composition selon l'invention. Elle peut également être endogène, par
exemple les facteurs de croissance qui vont être sécrétés dans une plaie
pendant la première phase de cicatrisation et qui pourront être stabilisés
par la formation du complexe selon l'invention in vivo dans la plaie.
[00066]. Selon les pathologies visées elle est destinée à un traitement
local ou systémique.
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[00067]. Dans le cas des libérations locale et systémique, les modes
d'administration envisagés sont par voie intraveineuse, sous-cutanée,
intradermique, transdermique, intramusculaire, orale, nasale, vaginale,
oculaire, buccale, pulmonaire etc.
[00068]. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont soit
sous forme liquide, en solution aqueuse, soit sous forme de poudre,
d'implant ou de film. Elles comportent en outre les excipients
pharmaceutiques classiques bien connus de l'homme de l'art.
[00069]. En fonction des pathologies et des modes d'administration les
compositions pharmaceutiques pourront avantageusement comporter, en
outre, des excipients permettant de les formuler sous forme de gel,
d'éponge, de solution injectable, de solution buvable, de lyoc etc.
[00070]. L'invention concerne également une composition
pharmaceutique selon l'invention telle que décrite précédemment,
caractérisée en ce qu'elle est administrable sous forme de stent, de film ou
coating de biomatériaux implantables, d'implant.
Exemples
A - Synthèse des polymères
Exemple 1 : synthèse d'un dextraneméthylcarboxylate de sodium
modifié par le sel de sodium du tryptophane, polymère 1.
[00071]. 70 g (soit 1295 mmol de fonctions hydroxyles) de dextrane de
masse molaire moyenne en poids d'environ 40 kg/mol (Fluka) sont
solubilisés dans de l'eau à 42 g/L. A cette solution sont ajoutés 130 mL de
NaOH 10 N (1295 mmol NaOH). Le mélange est porté à 35 C puis 201 g
(1727 mmol) de chloroacétate de sodium sont ajoutés. La température du
milieu réactionnel est portée à 60 C à 0.5 C/min puis maintenue à 60 C
pendant 100 minutes. Le milieu réactionnel est dilué avec 200 mL d'eau,
neutralisé à l'acide acétique et purifié par ultrafiltration sur membrane PES
de 5 kD contre 6 volumes d'eau. La solution finale est dosée par extrait sec
pour déterminer la concentration en polymère ; puis dosée par dosage
acide/base dans de l'eau/acétone 50 / 50 (V/V) pour déterminer le degré
de substitution en méthylcarboxylates.
[00072]. D'après l'extrait sec : [polymère] = 51,5 mg/g
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[00073]. D'après le dosage acide/base : Le degré de substitution des
fonctions hydroxyles par des fonctions méthylcarboxylates est de 1.04 par
motif saccharidique.
[00074]. La solution de dextraneméthylcarboxylate de sodium est
passée sur une résine Purolite (anionique) pour obtenir le
dextraneméthylcarboxylique acide qui est ensuite lyophilisé pendant 18
heures.
[00075]. 14,5 g de dextraneméthylcarboxylique acide (soit 66 mmol
fonctions acide méthylcarboxylique acide) sont solubilisés dans le DMF à 57
g/L puis refroidis à 0 C. 6,67 g (66 mmol) de NMM et 7,15 g (66 mmol) de
EtOCOCI sont ensuite ajoutés. Après 10 min de réaction, 6,06 g (30 mmol)
de TrpOH sont ajoutés. Le milieu est ensuite chauffé à 10 C et maintenu à
cette température pendant 30 minutes. Une solution d'imidazole à 340 g/L
(8,97 g, 132 mmol) dans l'eau est ensuite ajoutée, le milieu réactionnel est
brièvement chauffé à 30 C. Le milieu réactionnel est ensuite dilué avec 70
mL d'eau, puis filtré sur verre fritté porosité 1 puis sur verre fritté
porosité
3, il est alors limpide. La solution est ultrafiltrée sur membrane PES 10 kD
contre 10 volumes de solution NaCI 0.9% puis 6 volumes d'eau. La
concentration de la solution de polymère 1 est déterminée par extrait sec.
Une fraction de solution est lyophilisée et analysée par RMN 'H dans D20
pour déterminer le DS en tryptophane greffé.
[00076]. D'après l'extrait sec : [polymère] = 54 mg/g
[00077]. D'après la RMN 'H : La fraction molaire des acides modifiés par
le tryptophane est de 0,38.
Exemple 2 : synthèse d'un pullulaneméthylcarboxylate de sodium
modifié par le sel de sodium du tryptophane, polymère 2.
[00078]. 8 g (soit 148 mmol de fonctions hydroxyles) de Pullulane de
masse molaire moyenne en poids d'environ 100 kg/mol (Fluka) sont
solubilisés dans de l'eau à 42 g/L. A cette solution sont ajoutés 15 mL de
NaOH 10 N (148 mmol NaOH). Le mélange est porté à 35 C puis 23 g
(198 mmol) de chloroacétate de sodium sont ajoutés. La température du
milieu réactionnel est portée à 60 C à 0.5 C/min puis maintenue à 60 C
pendant 100 minutes. Le milieu réactionnel est dilué avec 200 mL d'eau,
neutralisé à l'acide acétique et purifié par ultrafiltration sur membrane PES
de 5 kD contre 6 volumes d'eau. La solution finale est dosée par extrait sec
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pour déterminer la concentration en polymère ; puis dosée par dosage
acide/base dans de l'eau/acétone 50 / 50 (V/V) pour déterminer le degré
de substitution en méthylcarboxylates.
[00079]. D'après l'extrait sec : [polymère] = 31.5 mg/g
[00080]. D'après le dosage acide/base : Le degré de substitution des
fonctions hydroxyles par des fonctions méthylcarboxylates est de 1.17 par
motif saccharidique.
[00081]. La solution de pullulaneméthylcarboxylate de sodium est
passée sur une résine Purolite (anionique) pour obtenir le
pullulaneméthylcarboxylique acide qui est ensuite lyophilisé pendant 18
heures.
[00082]. 3.51 g de pullulaneméthylcarboxylique acide (soit 18 mmol
fonctions acide carboxyméthyl) sont solubilisés dans le DMF à 57 g/L puis
refroidis à 0 C. 1.81 g (18 mmol) de NMM et 1.94 g (18 mmol) de EtOCOCI
sont ensuite ajoutés. Après 10 min de réaction, 1.40 g (7 mmol) de TrpOH
sont ajoutés. Le milieu est ensuite chauffé à 10 C et maintenu à cette
température pendant 30 minutes. Une solution d'imidazole (2.43 g, 36
mmol) à 340 g/L dans l'eau est ensuite ajoutée, le milieu réactionnel est
brièvement chauffé à 30 C. Le milieu réactionnel est ensuite dilué avec 70
mL d'eau, puis filtré sur verre fritté porosité 1 puis sur verre fritté
porosité
3, il est alors limpide. La solution est ultrafiltrée sur membrane PES 10 kD
contre 10 volumes de solution NaCI 0.9% puis 6 volumes d'eau. La
concentration de la solution de polymère 2 est déterminée par extrait sec.
Une fraction de solution est lyophilisée et analysée par RMN 'H dans D20
pour déterminer le DS en tryptophane greffé.
[00083]. D'après l'extrait sec : [polymère] = 17,2 mg/g
[00084]. D'après la RMN 'H : La fraction molaire des acides modifiés par
le tryptophane est de 0,40.
Exemple 3 : synthèse d'un dextraneméthylcarboxylate de sodium
modifié par l'ester éthylique du tryptophane, polymère 3.
Le polymère 3 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium
modifié par l'ester éthylique du L-tryptophane obtenu à partir d'un dextrane
de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon
le procédé décrit dans l'exemple 1 en employant l'ester éthylique du L-
tryptophane à la place du sel de sodium du L-tryptophane.
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Exemple 4: synthèse d'un dextraneméthylcarboxylate de sodium
modifié par l'ester éthylique de la phénylalanine, polymère 4.
Le polymère 3 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium
modifié par l'ester éthylique de la L-phénylalanine obtenu à partir d'un
dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol
(Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans l'exemple 1 en employant
l'ester éthylique de la L-phénylalanine à la place du sel de sodium du L-
tryptophane.
B - Mise en évidence de l'affinité d'un polymère pour une protéine
se liant à l'héparine par co-électrophorèse
Exemple 3 : ratio protéine/ polymère 1/500
Préparation du complexe protéine/polymère au ratio 1/500
[00085]. 1,5 pg de protéine sont ajoutés à 750 pg de polymère, à 15 pl
de tampon de migration 10X (tris acétate pH 7). La solution est complétée
à 150pl par de l'H20. Cette solution est incubée à température ambiante
pendant 20 minutes. 5 pl de cette seconde solution contenant 50 ng de
protéine et 25 pg de polymère sont dilués dans 5 pl de tampon de
migration 1X. Des solutions similaires contenant uniquement la protéine ou
le polymère sont préparées à titre de contrôle.
Mise en évidence du complexe entre la protéine et le polymère
[00086]. La solution de protéine/polymère (10 pl) est mélangée à 3 pl
de tampon de charge (glycérol, tris-acétate et bleu de bromophénol dans
de l'eau). Ces 13 pl contenant 50 ng de protéine et 25 pg de polymère sont
déposés dans un puits d'un gel d'agarose 0.8%. Les solutions de contrôle
(protéine ou polymère seuls) sont déposées de façon similaire. La cuve
d'électrophorèse est fermée et le générateur est réglé à 30V. La migration
dure 1 heure.
[00087]. Après migration, le gel est transféré sur une membrane de
PVDF par capillarité avec un système Apelex pendant 2h à température
ambiante. La membrane est ensuite saturée avec du lait écrémé pendant 1
heure à température ambiante puis incubée avec des anticorps primaires
de lapin dirigés contre la protéine (une nuit à 4 C) et enfin incubée avec
des anticorps secondaires, rabbit anti goat HRP (1 heure à température
ambiante). La révélation se fait par réaction de l'HRP sur le Opti-4CN. La
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révélation est stoppée par rinçage dans de l'eau lorsque la coloration est
suffisante puisque le produit de la réaction absorbe dans le visible.
[00088]. Lorsque la protéine est seule ou ne forme pas de complexe
avec le polymère, elle peut migrer si elle est anionique ou rester à l'endroit
5 du dépôt si elle est cationique. La protéine est alors détectée soit au
niveau
des puits de chargement, soit sous la forme d'un spot unique vers 0,3-0,4
cm du dépôt. Lorsque la protéine forme un complexe avec le polymère, le
complexe est entraîné plus fortement par les charges du polymère et se
déplace vers l'anode. Il est détecté sous forme d'un spot unique à 0,7 cm
10 du dépôt.
[00089]. Les résultats obtenus avec le polymère 1, obtenu à l'exemple
1, le polymère 2, obtenu à l'exemple 2, et des protéines choisies dans les
groupes des molécules d'adhésion cellulaire, des hormones, des protéines
de coagulation, des facteurs de croissance liant l'héparine, des protéines se
15 liant aux facteurs de croissance, des cytokines et des protéines du
métabolisme des lipides sont rassemblés dans le tableau I, ci-dessous.
[00090]. Les résultats obtenus avec une protéine ne liant pas l'héparine
(IGF-1) et les polymères 1 et 2, obtenus à l'exemple 1 et à l'exemple 2 et
les résultats obtenus avec les protéines liant l'héparine citées ci-dessus et
un polymère non substitué avec un tryptophane sont également rassemblés
dans le tableau I ci-dessous à titre de contre-exemples.
TABLEAU I
Polymères
Polymère 1 Polymère 2 Contre-
Famille de Protéine (dextranméthyl (pullulaneméthyl
protéines carboxylate carboxylate exemple 1
substitué par du substitué par du (dextranméthyl
tr pto have tr ptophane carboxylate)
Hormones hGH + + -
Facteur de VEGF 165 + + -
croissance FGF-2 + + -
liant
l'héparine NGF-betaç3 + + -
Facteur de
croissance IGF 1 - - -
ne liant pas
l'héparine
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[00091]. Les résultats obtenus montrent que le
dextranméthylcarboxylate substitué par du tryptophane polymère 1
(exemple 1) ou le pullulaneméthylcarboxylate substitué par du tryptophane
polymère 2 (exemple 2) permettent de former un complexe avec des
protéines qui lient l'héparine alors que le dextranméthylcarboxylate non
substitué (contre exemple 1) ne le permet pas.
[00092]. Les résultats obtenus montrent également que le
dextrahméthylcarboxylate substitué ou non par le tryptophane (exemple 1
et contre exemple 1) ne forment pas de complexe avec des facteurs de
croissance ne fixant pas l'héparine.
Exemple 4 : ratio protéine/ polymère 1/1
Préparation du complexe protéine/polymère au ratio 1/1
[00093]. 1,5 pg de protéine sont ajoutés à 1,5 pg de polymère, à 3 pl
de tampon de migration 10X (tris acétate pH 7). La solution est complétée
à 60pl par de l'H20. Cette solution est incubée à température ambiante
pendant 20 minutes. 2 NI de cette seconde solution contenant 50 ng de
protéine et 50 ng de polymère sont dilués dans 8 pl de tampon de
migration 1X.
Mise en évidence du complexe entre la protéine et le polymère
[00094]. La solution de protéine/polymère (10 pl) est mélangée à 3 pl
de tampon de charge (glycérol, tris-acétate et bleu de bromophénol dans
de l'eau). Ces 13 pl contenant 50 ng de protéine et 50 ng de polymère sont
déposés dans un puits d'un gel d'agarose 0.8%. La cuve d'électrophorèse
est fermée et le générateur est réglé à 30V. La migration dure 1 heure.
[00095]. Après migration, le gel est transféré sur une membrane de
PVDF par capillarité avec un système Apelex pendant 2h à température
ambiante. La membrane est ensuite saturée avec du lait écrémé pendant 1
heure à température ambiante puis incubée avec des anticorps primaires
de lapin dirigés contre la protéine (une nuit à 4 C) et enfin incubée avec
des anticorps secondaires, rabbit anti goat HRP (1 heure à température
ambiante). La révélation se fait par réaction de l'HRP sur le Opti-4CN. La
révélation est stoppée par rinçage dans de l'eau lorsque la coloration est
suffisante puisque le produit de la réaction absorbe dans le visible.
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[00096]. Lorsque la protéine est seule ou ne forme pas de complexe
avec le polymère, elle peut migrer si elle est anionique ou rester à l'endroit
du dépôt si elle est cationique. La protéine est alors détectée soit au niveau
des puits de chargement, soit sous la forme d'un spot unique vers 0,3-0,4
cm du dépôt. Lorsque la protéine forme un complexe avec le polymère, le
complexe est entraîné plus fortement par les charges du polymère et se
déplace vers l'anode. Il est détecté sous forme d'un spot unique à 0,7 cm
du dépôt.
[00097]. Les résultats obtenus. avec les polymères 1, 3 et 4 et deux
facteurs de croissance, le FGF-2 et le NGF-beta sont rassemblés dans le
tableau II, ci-dessous.
Tous les complexes Polymère/Protéine sont étudiés au ratio
massique 1/1.
TABLEAU II
NGF-beta FGF-2
Polymère 1 + +
Polymère 3 - -
Polymère 4 - -
[00098]. Ce test permet de mettre en évidence que l'interaction entre le
polymère 1 et les HBPs est suffisamment forte pour permettre la réduction
de la ' quantité de polymère ce qui est favorable dans un but de
développement pharmaceutique. Les polymères 3 et 4 n'ont pas une
interaction suffisamment forte avec les deux HBPs testées pour obtenir un
complexe au ratio 1/1.
C - Mise en évidence de l'affinité d'un polymère pour une protéine
se liant à l'héparine par ITC
Exemple 5: interaction de la PTH (1 -34) avec l'héparine et le
polymère 1.
[00099]. Il a été démontré dans la littérature (Kamerzell 2007) que la
PTH(1-84) se liait à l'héparine avec un Kd de 300 nM lors d'une expérience
d'ITC (Isothermal Tiration Calorimetry, Titration par Calorimétrie
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Isotherme). Dans des conditions identiques, nous avons démontré que la
PTH (1-34) interagissait avec l'héparine avec un Kd de 227 nM.
[000100]. L'héparine est placée dans la cellule à une concentration de 2
pM en tampon 4,8 mM citrate pH=5,3, 42 mM NaCl. La PTH(1-34) est
placée dans la seringue à une concentration de 208,6 pM. 50 injections de
5 pl ont été réalisées et les résultats ont été ajustés à un modèle de n sites
indépendants qui ont permis de calculer un Kd de 227 nM.
[000101]. Dans des conditions similaires, le polymère 1 a été placé dans
la cellule à une concentration de 0,5 pM en tampon 4,8 mM citrate
pH=5,3, 42 mM NaCI. La PTH(1-34) est placée dans la seringue à une
concentration de 191 pM. 50 injections de 5 pl ont été réalisées et les
résultats ont été ajustés à un modèle de n sites indépendants qui ont
permis de calculer un Kd de 6,9 pM démontrant l'interaction du polymère 1
avec la PTH, cette interaction est proche de celle de l'héparine.
D - Exemples de formulations
Exemple 6: Obtention d'un complexe Polymère/ Protéine se liant à
l'héparine
[000102]. Les opérations suivantes sont menées en zone propre. 5 g de
lyophilisat du polymère décrit à l'exemple 1, Polymère 1, sont solubilisés
dans 50 mL d'eau pour conduire à la solution 1 (concentration en Polymère
1 de 100 mg/mL). En parallèle, 10 pg de lyophilisat de VEGF sont
solubilisés dans 5 pL d'eau pour conduire à la solution 2 (concentration en
VEGF de 2 mg/mL). 5 pL de la solution 1 sont mélangés à 5 pL de la
solution 2 à température ambiante pour former une solution 3 contenant le
polymère 1 à la concentration de 50 mg/mL et le VEGF à la concentration
de 1 mg/mL. La solution 3 est filtrée sur filtre 0,22 pm pour conduire à
l'obtention d'une solution stérile. La formation du complexe dans la solution
3 peut être mise en évidence par co-électrophorèse.
[000103]. En conclusion, le complexe entre un polymère selon l'invention
et une protéine se liant à l'héparine est formé par simple mélange de
solutions aqueuses à température ambiante sans ajout de solvant
organique.
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Exemple 7: Obtention d'un complexe Polymère/ Protéine se liant à
l'héparine
[000104]. Les opérations décrites dans l'exemple 6 sont conduites de
façon à obtenir un complexe polymère 1 / VEGF de ratio 1/10, en
employant 1 pL de la solution 1 complétés à 5 pL par de l'eau et 5 pL de la
solution 2. 10 pL d'une solution 4 contenant le polymère 1 à la
concentration de 10 mg/mL et le VEGF à la concentration de 1 mg/mL sont
obtenus.
Exemple 8 : Obtention d'un complexe Polymère / Protéine se liant à
l'héparine
[000105]. Les opérations décrites dans l'exemple 6 sont conduites de
façon à obtenir un complexe polymère 1 / VEGF de ratio 1/2, en employant
0,2 pL de la solution 1 complétés à 5 pL par de l'eau et 5 pL de la solution
2. 10 pL d'une solution 5 contenant le polymère 1 à la concentration de
2 mg/mL et le VEGF à la concentration de 1 mg/mL sont obtenus.
Exemple 9 : Obtention d'un complexe Polymère / Protéine se liant à
l'héparine
[000106]. Les opérations décrites dans l'exemple 6 sont conduites avec
le polymère décrit à l'exemple 2, Polymère 2, et le FGF-2 comme Protéine
se liant à l'héparine. Différentes solutions aqueuses de complexe Polymère
2 / FGF-2 sont obtenues dont les ratios Polymère 2 / FGF-2 varient de 1 à
100.
Exemple 10 : Obtention d'un complexe Polymère / Protéine se liant
à l'héparine
[000107]. Les opérations suivantes sont menées en zone propre. 5 g de
lyophilisat du polymère décrit à l'exemple 2, Polymère 2, sont solubilisés
dans 100 mL d'eau pour conduire à la solution 1 (concentration en
polymère 1 de 50 mg/mL). 10 pL de cette solution sont introduits dans un
flacon de 50 pL. Puis, 10 pg de lyophilisat de VEGF sont ajoutés à cette
solution à température ambiante. La solution obtenue contient le polymère
2 à la concentration de 50 mg/mL et le VEGF à la concentration de
1 mg/mL. Cette solution est limpide après 15 minutes d'agitation douce et
peut être filtrée sur filtre 0,22 pm pour conduire à l'obtention d'une
solution
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stérile. La formation du complexe dans la solution finale peut être mise en
évidence par co-électrophorèse.
[000108]. A l'inverse, la même solution finale est obtenue par ajout de
500 pg de polymère 2 lyophilisé à 10 pL d'une solution de VEGF à
5 1 mg/mL.
[000109]. En conclusion, le complexe entre un polymère selon l'invention
et une protéine se liant à l'héparine peut être formé par simple ajout d'un
lyophilisat de polymère ou de protéine à une solution aqueuse de protéine
ou de polymère à température ambiante sans ajout de solvant organique.
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