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TITRE DE L'INVENTION
Nouvelles utilisations du fibrinogène
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine du traitement des hémorragies
aiguës
sévères, y compris mais non limité aux hémorragies du post-partum, hémorragies
aiguës
sévères post-traumatiques et chirurgicales (péri-opératoires)
ART ANTERIEUR
Les hémorragies aiguës sévères (HAS) se définissent par la perte rapide - en
quelques
heures - d'au moins 20 à 30% de la masse sanguine d'un individu. Les
principales situations
d'HAS se rencontrent notamment en obstétrique (hémorragies du post-partum
essentiellement),
en traumatologie et en chirurgie, sans se limiter à ces situations.
Les troubles de la coagulation (coagulopathies) sont fréquents en situation
d'HAS et
sont directement ou indirectement liés à l'hémorragie. Parmi les facteurs de
coagulation, le taux
plasmatique de fibrinogène est chronologiquement le premier à chuter pour
atteindre des
valeurs critiques (Hippala et al., 1995, Anesth Analg, Vol. 81 : 360-365 ;
Torrielli et al., 1988,
Rev Fr Gynecol Obstet, Vol. 83 : 7-9). Ces valeurs-seuils sont classiquement
situées entre 0.5
et 1g/1 et correspondent aux concentrations permettant d'obtenir une
coagulation sanguine
satisfaisante, en situation stable non-hémorragique. Les mécanismes impliqués
dans la baisse
du taux de fibrinogène sont : 1/ les pertes directes, 2/ la dilution par les
solutés de remplissage
vasculaire, et 3/ la consommation de fibrinogène pour la formation de
caillots.
Outre le fait que le fibrinogène est le premier facteur de la coagulation dont
le taux
sanguin chute, il a été montré que la baisse du taux de fibrinogène est un
facteur de mauvais
pronostic clinique, et cette baisse est associée à une évolution des patients
d'autant plus
sévère que la concentration en fibrinogène est basse (Charbit et al., 2006,
Journal of
Thrombosis and Haemostasis, Vol. 5 : 266-273 ; Karlsson et al., 2008,
Transfusion, Vol. 48
(10) : 2152-2158).
Les conditions de prise en charge d'une HAS, en urgence, sont adaptées à
chaque cas
individuel mais comportent des objectifs communs, incluant le traitement des
troubles de la
coagulation lorsqu'ils existent, ce qui est fréquent. Actuellement,
l'administration de fibrinogène
est recommandée lorsque le dosage de fibrinogène plasmatique atteint les
valeurs critiques
citées précédemment. Cette approche substitutive vise à corriger des
situations de
coagulopathies constituées, lesdites coagulopathies étant souvent au stade de
coagulation
intra-vasculaire disséminée (CIVD). Cette approche substitutive est tardive
car elle est
dépendante du délai nécessaire à l'obtention des résultats d'examens de
laboratoire répétés,
parfois longs à obtenir (près d'1 heure) pour diagnostiquer un déficit acquis
en fibrinogène et
documenter son évolution au cours du temps. De plus, selon cette approche
substitutive,
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l'administration de fibrinogène est répétée dans le temps car elle est
conditionnée aux résultats
des dosages répétés de fibrinogène. La dose de fibrinogène peut être
administrée en plusieurs
perfusions, chacune étant conditionnée par le rapport entre le déficit
quantifié de fibrinogène et
la valeur-seuil de fibrinogène sanguin à atteindre. Le fibrinogène est
administré à un débit lent
recommandé inférieur à 5m1/minute, ce qui est mal approprié à une situation
d'urgence.
Lorsque le taux circulant de fibrinogène est inférieur à 1 g/L, du fibrinogène
exogène est
administré afin de permettre la formation d'un caillot normal. L'apport de
fibrinogène exogène
varie de 2 à 4 grammes, l'apport requis étant calculé au cas par cas et en
temps réel en
fonction des résultats des bilans successifs des paramètres de la coagulation
décrits
précédemment. Plus précisément, la quantité de fibrinogène à injecter est
classiquement
calculée selon la formule suivante : Quantité de fibrinogène exogène (en
grammes) = [taux de
fibrinogène circulant à atteindre (en g/L)] - [taux de fibrinogène circulant
avant traitement (en
g/L)] x 0,04 x [poids du malade (en kg)]. Ainsi, les quantités de fibrinogène
à administrer
successivement au cours du traitement sont calculées en fonction des bilans
des paramètres
de la coagulation également successifs dans le temps. On notera que le calcul
précis de la
quantité de fibrinogène exogène à administrer est considéré comme essentiel,
afin d'éviter un
excès de fibrinogène circulant, par exemple un taux de fibrinogène circulant
supérieur à 5 g/L,
susceptible de provoquer des thromboses.
On peut citer aussi l'administration d'un concentré plaquettaire comme moyen
de
traitement additionnel aux moyens de traitement décrits ci-dessus, en
particulier dans les
situations dans lesquelles le saignement persiste malgré l'apport de
fibrinogène.
Les protocoles de traitement des hémorragies du post-partum qui sont
actuellement
pratiqués sont globalement satisfaisants. Toutefois, compte tenu du risque
important de
mortalité ou de morbidité lié à ces hémorragies aiguës sévères, il existe un
besoin constant
dans l'état de la technique pour des solutions techniques alternatives ou
améliorées par rapport
aux solutions existantes.
La nécessité de trouver des moyens de traitement alternatifs ou améliorés pour
d'autres
types d'hémorragies sévères aiguës, y compris des hémorragies sévères
provoquées par des
gestes chirurgicaux ou encore du fait de traumatismes physiques violents. Les
autres
hémorragies aiguës sévères présentent des points communs avec les hémorragies
du post-
partum, y compris des troubles de l'homéostasie.
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention a pour objet l'utilisation du fibrinogène pour la
fabrication d'un
médicament utilisé dans le traitement d'une hémorragie aiguë sévère, ledit
médicament
apportant précocement et rapidement une quantité suffisante de fibrinogène
permettant de
restaurer la capacité coagulante du sang, indépendamment du taux de
fibrinogène initial. Par
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exemple, une quantité au moins égale à 4,5 g peut être administrée selon une
durée
d'administration inférieure à 30 minutes.
Selon l'invention, les hémorragies aiguës sévères englobent, sans se limiter à
ces
domaines, les hémorragies du post-partum, les hémorragies péri-opératoires et
les hémorragies
post-traumatiques.
Le fibrinogène qui est administré concerne tout fibrinogène, quelle que soit
son origine
et sa nature
L'invention est aussi relative à des compositions pharmaceutiques, préventives
ou
curatives, comprenant du fibrinogène, qui sont spécialement adaptées pour la
mise en oeuvre
des utilisations et des procédés ci-dessus.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 illustre la succession d'étapes dans le temps du protocole
expérimental in
vivo chez les porcs. La ligne horizontale représente le temps. Les barres
verticales numérotées
représentent les étapes successives du protocole. 1 : Etape d'anesthésie et
d'instrumentation
des animaux. 2 : Réalisation des mesures initiales de base ( baseline ) des
paramètres
explorés, respectivement HR (vitesse cardiaque pour Heart Rate ), MAP
(pression moyenne
artérielle pour Mean Arterial Pressure ), PAP (pression artérielle
pulmonaire pour
Pulmonary Arterial Pressure ), PCWP (pression centrale de la clavette
pulmonaire pour
Pulmonary Central Wedge Pressure ), CVP (pression veineuse centrale pour
Central
Venous Pressure ), ROTEM , tests standard de la coagulation, hémoglobine,
hématocrite,
plaquettes. 3 : Etape de réalisation de l'hémodilution, au cours de laquelle
on prélève 60% du
volume sanguin, que l'on remplace par une composition de HES 130/0,4 (Voluven
), dans
l'objectif d'atteindre une valeur de MCF inférieure à 40 mm. 4 : Etape de re-
transfusion des
globules rouges lavés, dans l'objectif d'atteindre une valeur d'hémoglobine de
5 à 6 g/dl. 5 :
Réalisation de l'étape de blessure osseuse. 7 : Réalisation des mesures des
paramètres HR,
MAP, PAP, PCWP, ROTEM , des tests de coagulation standard, de l'hémoglobine,
de
l'hématocrite, des plaquettes et de la perte sanguine aux temps respectifs de
15 minutes, 1
heure, 2 heures et 4 heures suivant l'administration du médicament
(fibrinogène à différentes
doses et composition placebo). 9 : Réalisation de l'étape de blessure
hépatique. 9 : Etape de fin
de l'expérimentation, 2 heures après la blessure hépatique, au cours de
laquelle on mesure les
paramètres HR, MAP, PAP, CVP, PCWP, ROTEM, les tests standard de coagulation
sanguine,
l'hémoglobine, l'hématocrite, les plaquettes et la perte sanguine.
La Figure 2 illustre les résultats de la mesure du temps de coagulation (CT)
INTEM
selon la méthode ROTEM . Sur la partie supérieure de la Figure 2 sont
représentés les
résultats obtenus avec les animaux auxquels on a administré respectivement :
(i) une
composition placebo, représentés par des losanges pleins, (ii) 37,7 mg/kg de
fibrinogène
humain, représentés par des carrés pleins, (iii) 75 mg/kg de fibrinogène
humain, représentés
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par des triangles noirs pleins et (iv) 150 mg/kg de fibrinogène, représentés
par des triangles
inversés gris. Sur la partie inférieure de la Figure 3 sont représentés les
résultats obtenus avec
les animaux auxquels on a administré respectivement : (i) une composition
placebo,
représentés par des losanges pleins, (ii) 300 mg/kg de fibrinogène humain,
représentés par des
carrés pleins, (iii) 450 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des
triangles gris pleins et
(iv) 600 mg/kg de fibrinogène, représentés par des triangles inversés gris. En
ordonnées :
temps de coagulation (CT), exprimé en secondes. En abscisse, les différentes
étapes
successives de l'expérimentation in vivo, de gauche à droite respectivement :
(i) après
instrumentation et avant traitement des animaux, (ii) après hémodilution,
(iii) 15 minutes après
administration du médicament, (iv) 1 heure après administration du médicament,
(v) 2 heures
après administration du médicament, (vi) 4 heures après administration du
médicament et (vii) 2
heures après avoir réalisé la blessure hépatique ou avant la mort.
La Figure 3 illustre les résultats de la mesure du maximum de fermeté du
caillot (MCF)
INTEM selon la méthode ROTEM . Sur la partie supérieure de la Figure 3 sont
représentés les
résultats obtenus avec les animaux auxquels on a administré respectivement :
(i) une
composition placebo, représentés par des losanges pleins, (ii) 37,7 mg/kg de
fibrinogène
humain, représentés par des carrés pleins, (iii) 75 mg/kg de fibrinogène
humain, représentés
par des triangles noirs pleins et (iv) 150 mg/kg de fibrinogène, représentés
par des triangles
inversés gris. Sur la partie inférieure de la Figure 3 sont représentés les
résultats obtenus avec
les animaux auxquels on a administré respectivement : (i) une composition
placebo,
représentés par des losanges pleins, (ii) 300 mg/kg de fibrinogène humain,
représentés par des
carrés pleins, (iii) 450 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des
triangles gris pleins et
(iv) 600 mg/kg de fibrinogène, représentés par des triangles inversés gris. En
ordonnées :
maximum de fermeté du caillot (MCF), exprimé en millimètres. En abscisse, les
différentes
étapes successives de l'expérimentation in vivo, de gauche à droite
respectivement : (i) après
instrumentation et avant traitement des animaux, (ii) après hémodilution,
(iii) 15 minutes après
administration du médicament, (iv) 1 heure après administration du médicament,
(v) 2 heures
après administration du médicament, (vi) 4 heures après administration du
médicament et (vii) 2
heures après avoir réalisé la blessure hépatique ou avant la mort.
La Figure 4 illustre les résultats de la mesure du maximum de fermeté du
caillot (MCF)
PLASMA EXTEM (FibTEM modifié) selon la méthode ROTEM . Sur la partie
supérieure de la
Figure 4 sont représentés les résultats obtenus avec les animaux auxquels on a
administré
respectivement : (i) une composition placebo, représentés par des losanges
pleins, (ii) 37,7
mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des carrés pleins, (iii) 75 mg/kg
de fibrinogène
humain, représentés par des triangles noirs pleins et (iv) 150 mg/kg de
fibrinogène, représentés
par des triangles inversés gris. Sur la partie inférieure de la Figure 4 sont
représentés les
résultats obtenus avec les animaux auxquels on a administré respectivement :
(i) une
composition placebo, représentés par des losanges pleins, (ii) 300 mg/kg de
fibrinogène
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humain, représentés par des carrés pleins, (iii) 450 mg/kg de fibrinogène
humain, représentés
par des triangles gris pleins et (iv) 600 mg/kg de fibrinogène, représentés
par des triangles
inversés gris. En ordonnées : maximum de fermeté du caillot (MCF), exprimé en
millimètres. En
abscisse, les différentes étapes successives de l'expérimentation in vivo, de
gauche à droite
respectivement : (i) après instrumentation et avant traitement des animaux,
(ii) après
hémodilution, (iii) 15 minutes après administration du médicament, (iv) 1
heure après
administration du médicament, (v) 2 heures après administration du médicament,
(vi) 4 heures
après administration du médicament et (vii) 2 heures après avoir réalisé la
blessure hépatique
ou avant la mort.
La Figure 5 illustre les résultats des mesures de la concentration en
fibrinogène
plasmatique. Les courbes représentent les résultats obtenus avec les animaux
auxquels on a
administré respectivement : (i) une composition placebo, représentés par des
losanges pleins,
sur la courbe inférieure de la figure 5, (ii) 37,5 mg/kg de fibrinogène
humain, représentés par
des carrés pleins sur la courbe immédiatement supérieure à la courbe
précédente, (iii) 75
mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des triangles noirs pleins sur la
courbe
immédiatement supérieure à la courbe précédente, (iv) 150 mg/kg de
fibrinogène, représentés
par des triangles inversés gris sur la courbe immédiatement supérieure à la
courbe précédente,
(v) 300 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des carrés pleins sur la
courbe
immédiatement supérieure à la courbe précédente, (vi) 450 mg/kg de fibrinogène
humain,
représentés par des triangles gris pleins sur la courbe immédiatement
supérieure à la courbe
précédente, et (vii) 600 mg/kg de fibrinogène, représentés par des triangles
gris sur la courbe
immédiatement supérieure à la courbe précédente et qui est aussi la courbe
supérieure de la
Figure 5. En ordonnées : concentration plasmatique en fibrinogène, exprimée en
mg/dl. En
abscisse, les différentes étapes successives de l'expérimentation in vivo, de
gauche à droite
respectivement : (i) après instrumentation et avant traitement des animaux,
(ii) après
hémodilution, (iii) 15 minutes après administration du médicament, (iv) 1
heure après
administration du médicament, (v) 2 heures après administration du médicament,
(vi) 4 heures
après administration du médicament et (vii) 2 heures après avoir réalisé la
blessure hépatique
ou avant la mort.
La Figure 6 illustre les résultats des mesures de maximum de fermeté du
caillot (MCF)
INTEM selon la méthode ROTEM en fonction de la dose de fibrinogène
administrée aux
animaux. En ordonnées : valeur de maximum de fermeté du caillot (MCF),
exprimée en
millimètres. En abscisse, concentration en fibrinogène humain, exprimée en
mg/dl.
La Figure 7 illustre les mesures de perte sanguine et de capacité de
coagulation. En
ordonnées : valeur de perte sanguine et valeur de taille du caillot, exprimée
en ml/kg. Sur la
figure 7, les valeurs respectives de taille du caillot (< clot ) et de perte
sanguine ( liquid )
sont représentées par des barres adjacentes, pour chacune des concentrations
croissantes de
fibrinogène humain administrées aux animaux et pour la composition placebo. De
la gauche
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vers la droite de la figure 7, chaque paire de barres adjacentes (clot/liquid)
représente les
valeurs respectives pour (i) 37,5 mg/kg de fibrinogène, (ii) 75 mg/kg de
fibrinogène, (iii) 150
mg/kg de fibrinogène, (iv) 300 mg/kg de fibrinogène, (v) 450 mg/kg de
fibrinogène, (vi) 600
mg/kg de fibrinogène et (vii) la composition placebo.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
De manière surprenante, on a montré selon l'invention que dans le traitement
des
hémorragies aiguës sévères, même en l'absence d'un déficit avéré en
fibrinogène,
l'administration précoce et rapide d'une forte dose unique de fibrinogène est
capable de
contrôler l'hémorragie aiguë sévère et de prévenir son évolution vers une
hémorragie
incontrôlable.
Selon l'invention, une dose forte de fibrinogène exogène, administrée d'une
manière
précoce et rapide, permet d'interrompre, en cas d'hémorragie aigüe sévère,
l'évolution d'une
coagulopathie débutante et occulte, constituée en majeure partie par une
diminution
progressive de la capacité coagulante du sang, elle-même provoquée
principalement par la
diminution du fibrinogène endogène, vers une coagulopathie constituée qui peut
être à l'origine
d'une hémorragie incontrôlable.
L'administration du fibrinogène exogène, dans les conditions précisées dans
cette
invention, constitue de cette manière à la fois un traitement de l'hémorragie
aigüe sévère et une
prévention de son évolution néfaste vers une hémorragie incontrôlable.
Selon l'invention, une quantité prédéterminée de fibrinogène exogène permet de
contrôler une hémorragie aiguë sévère sans nécessité de réaliser un dosage
préalable du taux
de fibrinogène circulant. En effet le principe du traitement selon l'invention
n'est pas de combler
un déficit en fibrinogène, c'est-à-dire d'apporter une quantité de fibrinogène
à partir d'une valeur
seuil sanguine prédéterminée comme étant critique pour atteindre une valeur-
cible sanguine
présupposée efficace, mais de restaurer le plus rapidement possible la
capacité coagulante du
sang.
Or, tenir compte du dosage de fibrinogène pour déterminer la nécessité
d'administrer du
fibrinogène, et pour déterminer la quantité du fibrinogène qui doit être
administrée, impose que
les résultats de mesure du taux sanguin de fibrinogène soient disponibles pour
l'équipe
médicale. On précise que les résultats de la mesure du taux sanguin de
fibrinogène ne sont en
général disponibles qu'après au moins 45 minutes à 1 heure suivant le
prélèvement sanguin,
même en situation d'urgence. Cette perte de temps dans l'administration du
traitement d'une
urgence thérapeutique peut entraîner que la valeur du taux sanguin de
fibrinogène du patient,
au moment où les résultats de mesure sont disponibles, soit inférieure à la
valeur-seuil précitée,
ce qui peut dans certains cas significativement affecter les chances de survie
du patient.
Or, il a été montré dans l'invention que l'administration de fibrinogène était
efficace sans
la nécessité de connaître au préalable le taux sanguin initial de fibrinogène.
On a donc montré
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que le traitement d'une HAS peut être réalisé par une administration précoce
de fibrinogène,
sans mesure préalable du taux sanguin, dès la réalisation d'un diagnostic
clinique d'hémorragie
aiguë sévère
On a ainsi montré selon l'invention que l'administration de fibrinogène à des
patients
affectés d'une hémorragie aiguë sévère peut être réalisée avec une quantité
unique de
fibrinogène, afin de restaurer d'emblée la capacité coagulante du sang, donc
sans nécessiter
une adaptation de la quantité de fibrinogène en fonction du patient à traiter.
En particulier, on a montré selon l'invention que l'on peut traiter avec
succès les
hémorragies aiguës sévères par administration d'une quantité prédéterminée de
fibrinogène
exogène, sans nécessité de réaliser un dosage préalable du taux de fibrinogène
circulant.
De manière surprenante, on a montré selon l'invention que l'administration
précoce et
rapide à un patient affecté d'une hémorragie aiguë sévère, d'une forte dose
unique de
fibrinogène sans dosage du taux de fibrinogène circulant préalablement à
l'administration,
permet d'améliorer ou de prévenir l'aggravation de troubles de l'hémostase
irréversibles qu'est
susceptible de subir ledit patient, et ceci, sans provoquer de thrombose.
De plus, il a également été montré selon l'invention que le traitement d'une
hémorragie
aiguë sévère peut être réalisée par administration précoce et rapide d'une
dose unique
importante de fibrinogène, d'une quantité au moins égale à 4,5 g, c'est à dire
sans nécessiter la
réalisation de plusieurs administrations séquentielles de fibrinogène exogène
durant la totalité
de la période de traitement et/ou de suivi du patient, liée à l'adaptation de
la quantité de
fibrinogène en fonction des taux de fibrinogène.
Les exemples illustrent une étude chez l'animal chez lesquels a été
administrée une
gamme de doses de fibrinogène allant de 37,5 mg/kg à 600 mg/kg, suivant une
modèle
d'hémodilution provoqué par un choc traumatique avec une perte de 60% du
volume sanguin,
qui est ensuite remplacé par une solution à 6% d'amidon hydroxyéthylé (HES).
Les résultats
montrent que le temps de coagulation et le maximum de fermeté du caillot sont
significativement affectés par l'hémodilution. L'administration de fibrinogène
induit une
augmentation de toutes les mesures de la fermeté du caillot, de manière dose-
dépendante. Les
résultats des exemples montrent qu'un traitement des animaux ayant subi une
hémorragie par
une dose de fibrinogène de 50 mg/kg restaure totalement les valeurs de maximum
de fermeté
du caillot dés 15 minutes suivant la fin de l'infusion de fibrinogène, cet
effet étant maintenu
jusqu'à la fin de l'expérimentation. Avec des doses plus importantes de
fibrinogène, on atteint
un plateau pour les valeurs EXTEM MCF (test ROTEM ). En revanche, avec des
doses
croissantes de fibrinogène, les valeurs de INTEM MCF (test ROTEM : -
coagulation
indépendante des plaquettes) continuent à augmenter, comme cela est illustré
sur la figure 6.
Les résultats des exemples montrent que la production de thrombine chez les
animaux
auxquels on a administré le fibrinogène ne diffère pas de la production de
thrombine dans le
groupe d'animaux témoin. Une analyse statistique de la perte sanguine montre
un effet dose-
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réponse significatif (p = 0.02), ce qui indique une réduction de la perte
sanguine totale avec les
doses croissantes de fibrinogène jusqu'à 400 mg/kg, un plateau étant atteint
pour une dose de
fibrinogène de 600 mg/kg, comme cela est illustré dans la figure 7. Les
résultats des exemples
montrent que la concentration de fibrinogène obtenue chez les animaux ayant
reçu 300 mg/kg
de fibrinogène était proche de la valeur de base obtenue chez les animaux
témoins n'ayant pas
subi d'hémorragie. La concentration de fibrinogène chez les animaux ayant été
traités avec 400
mg/kg de fibrinogène était même supérieure au même groupe d'animaux témoins.
De manière importante, on a montré dans les exemples que, même avec les fortes
doses de fibrinogène, aucun signe d'hypercoagulation n'a été observé après
analyse des
paramètres biologiques ou histologiques.
Les résultats des exemples confirment que la fermeté du caillot est affectée
par des
niveaux faibles de fibrinogène, les niveaux faibles de fibrinogène étant
provoqués dans le
modèle expérimental utilisé par une coagulopathie de dilution. Les résultats
des exemples
confirment le rôle clé du fibrinogène dans ce type de coagulopathie. Le rôle
du fibrinogène est
encore confirmé part le fait que la seule administration de fibrinogène a un
potentiel intrinsèque
de corriger les effets de la coagulopathie, de manière dose-dépendante.
Egalement, les résultats des exemples montrent qu'au moins la restauration
complète
de la concentration de fibrinogène jusqu'aux niveaux normaux (test ROTEM ,
EXTEM MCF) ou
même jusqu'à des niveaux légèrement supérieurs à la normale (INTEM MCF et
poids du caillot)
est nécessaire pour que la coagulation optimale soit rétablie.
Comme déjà mentionné, il est remarquable que même aux fortes doses de
fibrinogène,
aucun signe d'hypercoagulation potentielle n'ait pu être mis en évidence.
Ainsi, les résultats des exemples montrent que l'administration d'une forte
dose unique
de fibrinogène, sans dosage du taux de fibrinogène circulant préalable à
l'administration,
permet de prévenir l'aggravation de troubles de l'hémostase, et ceci en toute
sécurité pour le
patient puisque, de manière tout à fait surprenante, aucun effet potentiel
d'hypercoagulation
n'est observé, même avec des fortes doses de fibrinogène.
De plus, on a montré que l'administration d'une dose unique élevée de
fibrinogène
conformément à l'invention n'induisait pas de réaction d'hypersensibilité
(mesure des niveaux
d'histamine plasmatique). Les niveaux d'histamine plasmatique sont restés
stables, pour toutes
les doses de fibrinogène (37,5 mg/kg à 600 mg/kg).
De plus, les concentrations plasmatiques de TNF-a ont été réduites ou sont
demeurées
stables après l'administration du fibrinogène. Enfin, il n'a jamais été
détecté d'endothéline-1.
L'ensemble de ces résultats confirment le caractère d'innocuité pour le
patient de
l'administration de fibrinogène en une dose unique importante et de façon
rapide pour le
traitement d'une hémorragie aigüe sévère.
La présente invention est relative à l'utilisation du fibrinogène pour la
fabrication d'un
médicament pour son utilisation dans le traitement d'une hémorragie aiguë
sévère, ledit
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médicament étant destiné à l'administration d'une quantité au moins égale à
4,5 g de
fibrinogène, en une dose unique.
L'invention concerne aussi le fibrinogène pour son utilisation dans le
traitement d'une
hémorragie aiguë sévère, destiné à l'administration par voie parentérale,
préférentiellement par
voie intraveineuse.
L'invention a également trait à une méthode pour la prévention ou le
traitement d'une
hémorragie aiguë sévère, comprenant une étape d'administration de fibrinogène
en une
quantité au moins égale à 4,5 g.
Il a été montré qu'une étape unique d'administration de la quantité
prédéterminée au
moins égale à 4,5 g de fibrinogène était suffisante pour la prévention ou le
traitement des
hémorragies aiguës sévères.
On a montré dans les exemples que l'administration d'une quantité
prédéterminée au
moins égale à 4,5 g de fibrinogène est efficace et n'entraîne pas d'effet
indésirable lorsque la
durée d'administration du fibrinogène est rapide. En particulier, dans le
modèle expérimental
du porc illustré dans les exemples, une quantité de 600 mg/kg de fibrinogène
pouvait être
administrée selon une durée de l'étape d'administration de 30 minutes.
Transposés chez
l'homme, les résultats des exemples montrent qu'une dose de 6 g de fibrinogène
peut être
administrée très rapidement, selon une durée de l'étape d'administration
inférieure à 30
minutes.
Selon l'invention, une durée de l'étape d'administration du fibrinogène
inférieur à 30
minutes, englobe les durées inférieures à 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21,
20, 19, 18, 17, 16,
15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, ou 6 minutes.
Dans le cas spécifiquement illustré dans les exemples, l'étape
d'administration d'une
quantité de 6 g de fibrinogène est de cinq minutes, sans provoquer d'effet
indésirable au
patient.
Selon l'invention, une durée de l'étape d'administration du fibrinogène
inférieure à 30
minutes englobe une durée de l'étape d'administration supérieure à 1 minute.
Avec l'utilisation du fibrinogène selon l'invention, on évite le recours
obligatoire à un
dosage du taux de fibrinogène circulant chez le patient antérieurement à
l'administration du
fibrinogène, ce qui constitue un avantage technique important pour la
prévention ou le
traitement de situations d'urgence clinique des patients, patients pour
lesquels une intervention
préventive ou thérapeutique rapide peut être déterminante concernant les
chances de survie du
patient.
Ainsi, l'utilisation du fibrinogène selon l'invention est en outre
caractérisée en ce que le
médicament est destiné à l'administration d'une quantité au moins égale à 4,5
g de fibrinogène
en une dose unique, sans contrôle ou dosage du taux circulant de fibrinogène
préalablement à
son administration au patient. En conséquence, la méthode de prévention ou de
traitement de
l'invention peut être en outre caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas
d'étape de contrôle ou
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WO 2010/100385 10 PCT/FR2010/050380
de dosage du taux de fibrinogène circulant, préalablement à l'étape
d'administration du
fibrinogène.
Egalement, l'utilisation du fibrinogène selon l'invention est en outre
caractérisée en ce
que le médicament est destiné à l'administration d'une quantité au moins égale
à 4,5 g de
fibrinogène en une dose unique, sans contrôle ou dosage du taux circulant de
fibrinogène
postérieurement à son administration au patient. En conséquence, la méthode de
prévention ou
de traitement de l'invention peut être en outre caractérisée en ce qu'elle ne
comprend pas
d'étape de contrôle ou de dosage du taux de fibrinogène circulant,
postérieurement à l'étape
d'administration du fibrinogène.
Très subsidiairement, l'absence de dosage du taux de fibrinogène circulant
représente
aussi un avantage économique concernant le coût global de l'acte médical
préventif ou curatif.
La quantité de fibrinogène peut être d'au moins 4,5 g, 4,6 g, 4,7g, 4,8 g, 4,9
g, 5 g, 5,1
g, 5,2 g, 5,3 g, 5,4 g, 5,5 g, 5,6 g, 5,7 g, 5,8 g ou 5,9 g.
Bien que la quantité maximale de fibrinogène à administrer ne soit pas une
caractéristique essentielle, ladite quantité préférentielle de fibrinogène est
préférentiellement
d'au plus 15 g et de manière tout à fait préférée d'au plus 12 g.
Préférentiellement, la quantité de fibrinogène est d'environ 6 g, ce qui
englobe une
quantité de fibrinogène allant de 5,5 g à 6,5 g, y compris de 5,8 g à 6,2 g.
L'utilisation du fibrinogène selon l'invention est adaptée à la fois à la
prévention et au
traitement de certaines hémorragies aiguës sévères.
A titre d'exemple, l'utilisation du fibrinogène selon l'invention est adaptée
au traitement
des hémorragies du post-partum.
Au sens conventionnel médical, une hémorragie du post-partum est définie comme
un
saignement d'un volume de plus de 500 mL pendant la période de 24 heures qui
suit
l'accouchement.
On connaît aujourd'hui divers facteurs de risque d'hémorragie du post-partum,
parmi
lesquels une anémie persistante, l'existence d'une pathologie congénitale de
l'hémostase, des
situations à risque d'atonie utérine (p. ex. multiparité, sur-distension
utérine, travail long ou au
contraire trop rapide, l'existence d'une chorioamniotite), des situations à
risque d'anomalie de
rétraction de l'utérus (p. ex. rétention placentaires ou caillots, utérus
fibromateux ou malformé,
placenta accreta), des troubles acquis de l'hémostase, des lésions de la
filière génitale y
compris l'épisiotomie, une inversion utérine, une rupture utérine ou encore
une césarienne.
Ainsi, chez des patientes chez lesquelles existe un risque significatif de
déclenchement
d'une hémorragie du post-partum, l'utilisation du fibrinogène selon
l'invention peut être
effectuée à titre préventif.
Toutefois, l'utilisation du fibrinogène selon l'invention est principalement
effectuée à titre
curatif, chez des patients ayant effectivement déjà déclenché une hémorragie
du post-partum.
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WO 2010/100385 11 PCT/FR2010/050380
Similairement, l'utilisation du fibrinogène selon l'invention est adaptée à la
prévention et
au traitement des hémorragies provoquées lors d'une intervention chirurgicale.
En effet, le
chirurgien praticien peut déterminer à l'avance, de par son expérience, les
actes chirurgicaux
pour lesquels les risques de provoquer une hémorragie aiguë sévère sont
importants.
C'est la raison pour laquelle l'utilisation du fibrinogène selon l'invention
est également
adaptée à la prévention ou au traitement des hémorragies aiguës sévères
provoquées lors d'un
acte chirurgical, c'est-à-dire lors d'une intervention chirurgicale.
Une autre situation d'hémorragie aiguë sévère de grande urgence est
représentée par le
choc hémorragique traumatique, provoqué à la suite d'un traumatisme physique
important, qui
est souvent associé à une chute brutale de la volémie et à une anémie aiguë.
Dans le cas de
choc hémorragique traumatique, le pronostic vital du patient est directement
relié au volume de
perte sanguine et à la rapidité de la prise en charge thérapeutique. Il s'agit
d'une autre situation
d'hémorragie aiguë pour laquelle un aspect primordial de la stratégie
thérapeutique est de
rétablir l'hémostase.
Ainsi, selon un autre aspect, l'utilisation du fibrinogène selon l'invention
est adaptée au
traitement des hémorragies aiguës sévères provoquée par un traumatisme
physique, appelées
aussi chocs hémorragiques traumatiques.
De manière tout à fait préférée, le fibrinogène consiste en du fibrinogène
humain.
Dans certains modes de réalisation de l'utilisation selon l'invention, le
fibrinogène
consiste en un fibrinogène purifié d'origine naturelle.
Dans d'autres modes de réalisation de l'utilisation selon l'invention, le
fibrinogène
consiste en un fibrinogène recombinant. On peut utiliser par exemple un
fibrinogène
recombinant préparé selon l'un quelconque des procédés décrits dans les
demandes
internationales PCT publiées sous les n WO-207/103447, WO-2005/010178, WO-
1996/07728
ou encore WO-1995/022249. Ledit fibrinogène recombinant peut se présenter sous
la forme
d'une composition pharmaceutique dans laquelle les molécules de fibrinogène
recombinant
sont combinées à un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
Dans les modes de réalisation de l'utilisation selon l'invention dans lesquels
le
fibrinogène consiste en du fibrinogène purifié d'origine naturelle, ledit
fibrinogène est purifié à
partir de plasma humain et est le cas échéant combiné à un ou plusieurs
excipients
pharmaceutiquement acceptables.
On peut par exemple utiliser du fibrinogène purifié d'origine naturelle
préparé comme
décrit dans la demande de brevet européen publiée sous le n EP 1 739 093. Il
s'agit d'un
fibrinogène purifié d'origine naturelle se présentant sous la forme d'un
concentré de fibrinogène
obtenu par un procédé de purification à partir d'une fraction de plasma humain
solubilisée qui
comprend les étapes successives de :
a) purification chromatographique comprenant les étapes de i) chargement d'un
échangeur
d'anions de type base faible en ladite fraction solubilisée, préalablement
équilibré par un
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WO 2010/100385 12 PCT/FR2010/050380
tampon de force ionique prédéterminée de pH basique, ii) élution d'une colle
biologique par
augmentation de la force ionique dudit tampon,
b) séparation du Facteur XIII à partir du fibrinogène par ajout dans au moins
une partie de
l'éluat de colle biologique d'au moins un agent chimique précipitant du
Facteur XIII, et
récupération de la solution résultante de surnageant de fibrinogène purifié,
et
c) diafiltration des solutions de fibrinogène, de colle biologique et de FXIII
remis en solution,
suivie d'une lyophilisation desdites solutions.
On peut aussi utiliser du fibrinogène purifié d'origine naturelle préparé
comme décrit
dans la demande PCT n WO-2005/004901. Il s'agit d'un fibrinogène purifié
d'origine naturelle
se présentant sous la forme d'un concentré de fibrinogène obtenu par un
procédé de
purification comprenant une étape d'inactivation virale par traitement
thermique d'un lyophilisat
de protéines cryoprécipitables du plasma humain. Le procédé décrit dans la
demande PCT n
WO-2005/004901 est caractérisé notamment par l'ajout, avant la mise des
protéines
cryoprécipitables sous la forme d'un lyophilisat, d'une formulation
stabilisante et solubilisante
comprenant un mélange d'arginine, d'au moins un acide aminé hydrophobe et de
citrate tri-
sodique.
On peut aussi utiliser du fibrinogène purifié d'origine naturelle préparé
selon le procédé
général décrit dans la demande de brevet européen n EP 1 739 093 et qui
comprend une
étape d'inactivation virale du type de celle décrite pour le procédé divulgué
dans la demande
PCT n WO-2005/004901.
Le fibrinogène purifié d'origine naturelle obtenu sous la forme d'un concentré
de
fibrinogène de plasma humain par un procédé choisi parmi les procédés décrits
dans la
demande de brevet européen n EP 1 739 093 ou dans la demande PCT n WO-
2005/004901
possède l'avantage de comprendre une forte concentration de fibrinogène
humain, de l'ordre de
15g/I à 20g/I.
Un tel concentré de fibrinogène humain, qui peut aussi être désigné FGT1
dans la
présente description, est particulièrement bien adapté aux utilisations du
fibrinogène selon
l'invention qui requièrent l'administration d'une quantité importante de
fibrinogène au moins
égale à 4,5g, préférentiellement dans une dose unique, du fait d'un fort taux
de récupération en
fibrinogène de ce type de concentré. Un autre avantage de ce type de concentré
de fibrinogène
humain d'origine plasmatique est la faible teneur dudit concentré en les
autres protéines
plasmatiques, ce qui réduit considérablement la quantité totale de protéines
plasmatiques qui
sont administrées au patient.
Un avantage supplémentaire est le haut degré de sécurisation virale de ce type
de
concentré de fibrinogène humain.
Dans certains modes de réalisation préférés, le fibrinogène se présente sous
la forme
d'un lyophilisat, le cas échéant en combinaison avec un ou plusieurs
excipients
pharmaceutiquement acceptables.
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WO 2010/100385 13 PCT/FR2010/050380
Dans certains modes de réalisation préférés, le fibrinogène se présente sous
la forme
d'un lyophilisat, le cas échéant en combinaison avec un ou plusieurs
excipients
pharmaceutiquement acceptables, contenu dans un récipient dont l'atmosphère
intérieure est
maintenue à une pression inférieure à la pression atmosphérique.
Avantageusement, le volume
intérieur du récipient est maintenu sous une dépression de vide partiel.
Préférentiellement, ledit concentré de fibrinogène lyophilisé est contenu dans
un
dispositif de reconstitution sous vide. La solution de fibrinogène à
administrer au patient peut
être préparée extemporanément par ajout dans le flacon sous vide du volume
approprié d'un
solvant adapté, par exemple de l'eau ou une solution saline, stérile et
apyrogène. De manière
générale, la solution de fibrinogène obtenue après reconstitution à partir du
concentré lyophilisé
de fibrinogène est conservée au plus pendant 7 jours, préférentiellement au
plus 24 heures, à
25 C ou préférentiellement au plus 6 heures, à 25 C.
Dans certains modes de réalisation de l'utilisation selon l'invention, le
fibrinogène purifié
ou le fibrinogène recombinant se présente sous la forme d'une composition
pharmaceutique
dans laquelle ledit fibrinogène est combiné avec un ou plusieurs excipients
choisis parmi le
chlorhydrate de lysine, le trometamol, la glycine, le citrate de sodium et le
chlorure de sodium.
Dans certains modes de réalisation, ledit fibrinogène est combiné avec la
totalité des excipients
suivants : le chlorhydrate de lysine, le trometamol, la glycine, le citrate de
sodium et le chlorure
de sodium. De préférence, pour la reconstitution de la composition
pharmaceutique liquide à
administrer, le solvant utilisé consiste en de l'eau pour préparations
injectables.
Dans d'autres modes de réalisation de l'utilisation selon l'invention, le
fibrinogène purifié
ou le fibrinogène recombinant se présente sous la forme d'une composition
pharmaceutique
dans laquelle ledit fibrinogène est combiné avec un ou plusieurs excipients
choisis parmi le
chlorhydrate d'arginine, l'isoleucine, le chlorhydrate de lysine, la glycine,
et le citrate de sodium.
Dans certains modes de réalisation, ledit fibrinogène est combiné avec la
totalité des excipients
suivants : le chlorhydrate d'arginine, l'isoleucine, le chlorhydrate de
lysine, la glycine, et le
citrate de sodium. De préférence, pour la reconstitution de la composition
pharmaceutique
liquide à administrer, le solvant utilisé consiste en de l'eau pour
préparations injectables.
Un flacon de concentré de fibrinogène FGT1 à reconstituer avec 100 ml
d'eau PPI
est constitué de 1.5 g de fibrinogène, 4 g d'Arginine, l g d'Isoleucine, 0,2 g
d'hydrochloride de
Lysine, 0,2 g de Glycine et 0,25 g de citrate de sodium
Dans encore d'autres modes de réalisation de l'utilisation selon l'invention,
le fibrinogène
purifié ou le fibrinogène recombinant se présente sous la forme d'une
composition
pharmaceutique dans laquelle ledit fibrinogène est combiné avec un ou
plusieurs excipients
choisis parmi l'albumine humaine, le chlorure de sodium, le chlorhydrate
d'arginine, le citrate de
sodium, et l'hydroxyde de sodium. Dans certains modes de réalisation, ledit
fibrinogène est
combiné avec la totalité des excipients suivants : l'albumine humaine, le
chlorure de sodium, le
chlorhydrate d'arginine, le citrate de sodium, et l'hydroxyde de sodium. De
préférence, pour la
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WO 2010/100385 14 PCT/FR2010/050380
reconstitution de la composition pharmaceutique liquide à administrer, le
solvant utilisé consiste
en de l'eau pour préparations injectables.
De préférence, l'étape d'administration du fibrinogène à une quantité au moins
égale à
4,5 g est réalisée avec un médicament adapté à une injection par voie
parentérale, du type des
compositions pharmaceutiques décrites ci-dessus.
Dans les modes de réalisation préférés de l'utilisation du fibrinogène selon
l'invention,
celle-ci est réalisée avec un médicament adapté à une administration par la
voie intraveineuse
(IV). Ainsi, dans des modes de réalisation préférés d'une méthode de
traitement préventif ou
curatif selon l'invention, l'étape d'administration du fibrinogène en une
quantité au moins égale
à 4,5 g consiste en une étape d'administration par voie intraveineuse.
Dans certains modes de réalisation de l'utilisation selon l'invention, on
utilise des
récipients sous vide renfermant un concentré lyophilisé de fibrinogène
comprenant une quantité
de 1,5 g de fibrinogène, ce qui signifie que le contenu de quatre récipients
sont utilisés pour
préparer l'administration de la quantité désirée de fibrinogène en une dose
unique d'environ 6
g.
Dans certains modes de réalisation préférés, la composition liquide
reconstituée
contenant le fibrinogène humain est administrée par voie intraveineuse selon
un débit
d'administration allant de 5 mUminute à 30 mUminute. De préférence, la
composition liquide
reconstituée de fibrinogène humain est administrée par voie intraveineuse
selon un débit
d'environ 20 mUminute, ce qui englobe de 15 mUminute à 25 mUminute. Un débit
important
d'administration de ce type est justifié par l'urgence à réduire les troubles
de l'homéostasie chez
les patients affectés d'une hémorragie aiguë sévère.
La présente invention est également relative à une composition pharmaceutique
comprenant, à titre de principe actif, du fibrinogène, ladite composition
pharmaceutique étant
caractérisée en ce qu'elle est adaptée à l'administration par voie parentérale
d'une dose
unique comprenant une quantité de fibrinogène au moins égale à 4,5 g,
préférentiellement
d'environ 6 g, de fibrinogène.
La présente invention est en outre illustrée, sans y être limitée, aux
exemples suivants.
EXEMPLES
Exemple 1 : Traitement d'hémorragies du post-partum
A. Matériels et méthodes
Patients
La présente étude porte sur 320 patientes ayant donné naissance par voie
vaginale ou
par césarienne, à plus de 27 semaines de grossesse et présentant une
hémorragie post-partum
sévère.
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WO 2010/100385 15 PCT/FR2010/050380
L'hémorragie post-partum sévère se caractérise par un volume d'hémorragie
supérieur
ou égal à 1000 mL et résistante à 2 lignes de traitement utérotonique.
Concentré de fibrinogène humain plasmatique
Les patientes sont traitées par une simple administration d'un bolus de 6 g de
FGT1,
injecté par voie intraveineuse, immédiatement après reconstitution. Le
concentré de fibrinogène
humain contient 1,5g de fibrinogène
Protocoles de traitement
L'administration du bolus de 6 g de fibrinogène est réalisée sans dosage
préalable du
taux de fibrinogène circulant.
Observations cliniques après traitement
Le volume de sang perdu après administration du FGT1 est suivi après
l'administration
du traitement consistant en 6g de FGT1 administré par voie intraveineuse
rapide ainsi que le
temps écoulé entre l'administration du FGT1 et la fin de l'hémorragie. Le
succès de la
thérapeutique sera évalué sur l'absence de recours à des ressources ultimes,
de transfusion
massive et de décès au bout de 12 heures.
Exemple 2 : Efficacité dans un modèle de porc hémorragique
A. Matériels et méthodes
A.1. Objectif de l'étude
L'étude de l'exemple 2 a consisté à comparer l'efficacité de différentes doses
(de 37,5
mg/kg à 600 mg/kg) de compositions de fibrinogène (compositions de concentré
de fibrinogène
humain désignées "FGT1 ") chez les porcs. L'effet sur l'hémostase et sur la
perte sanguine a été
mesuré chez les animaux après l'application de blessures osseuses et
hépatiques
standardisées.
Objectifs
Les objectifs de l'étude de l'exemple 2 étaient de déterminer:
- si l'efficacité d'un traitement pro-coagulant avec différentes
concentrations de
fibrinogène induisait des effets différents sur l'hémostase et la perte
sanguine;
- si une administration unique de doses croissantes de concentré de
fibrinogène
induisait des niveaux de fibrinogène plasmatique distincts et/ou entraînait
des temps
de demi-vie plasmatique distincts pour le fibrinogène; et
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WO 2010/100385 16 PCT/FR2010/050380
- si le traitement pro-coagulant avec le concentré de fibrinogène induisait
une
situation d'hypercoagulation associée à des complications thrombo-emboliques
subséquentes.
A.2. Animaux
Cette étude a été réalisée chez quarante-deux porcs sains âgés de 12 à 14
semaines et
ayant un poids corporel allant de 25 à 35 kg. Le modèle animal a été utilisé
afin de déterminer
la dynamique de fermeté du caillot et de perte sanguine dans une situation où
du fibrinogène
est administré après l'induction d'une coagulopathie de dilution.
A.3. Anesthésie
La pré-médication des animaux a été réalisée avec de l'azaperone (4 mg/kg,
injection
intra-musculaire-StresnilTM, Janssen, Vienne, Autriche) et de l'atropine (0,1
mg/kg par injection
intra-musculaire) une heure avant le début de l'expérience. L'induction et le
maintien de
l'anesthésie ont été réalisés avec du propofol (1-2 mg/kg par injection
intraveineuse). Pour
l'induction de l'analgésie, on a injecté du piritramide (30 mg, opioïde avec
un temps de demi-
vies d'environ 4 à 8 heures-DipidolorTM, Janssen, Vienne, Autriche). La
relaxation musculaire a
été réalisée par l'utilisation de 0,6 mg/kg par heure de rocuronium après
anesthésie
endotrachéale.
Après l'obtention de l'anesthésie endotrachéale, on a anatomiquement préparé
l'artère
fémorale, les deux veines fémorales ainsi que l'artère sous-clavière. Le
besoin de base pour le
remplacement de liquide (4 mg/kg de poids corporel) a été réalisé au cours de
l'essai avec des
cristalloïdes (solution de lactate de Ringer). Puis on a placé dans ces
vaisseaux les cathéters
invasifs suivant:
- un cathéter de large diamètre (accès veineux à double lumière avec une
longueur
de 20 cm),
- un cathéter de Swan-Ganz, et
- un moyen de mesure invasif de la pression sanguine artérielle.
Puis, les mesures initiales des valeurs de base ont été réalisées (repère de
temps n 2
sur la figure 1).
A.4. Hémodilution
Après avoir été instrumentés comme décrit ci-dessus, les animaux ont subi une
hémodilution normovolémique avec une solution à 6% de HES 130/0,4 (Voluven ,
Fresenius
co., Bad Homburg, Allemagne).
Le sang a été prélevé chez les animaux, étape par étape, en utilisant les
cathéters
larges et le sang a été remplacé avec la solution colloïdale dans un rapport
de 1:1. Pour
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WO 2010/100385 17 PCT/FR2010/050380
l'obtention d'une perte totale sanguine estimée d'environ 60%, les animaux
avec un poids de
par exemple 30 kg ont été infusés avec 1700 ml de solution HES à 6%: 130/0,4
(Voluven ,
Fresenius co., Bad Homburg, Allemagne). Après réalisation de l'hémodilution,
le sang collecté a
été traité dans un système de type cell saver (Cats , Fresenius), a été
concentré et
transfusé à nouveau, afin de prévenir une anémie liée à l'hémodynamique.
L'hémodilution
normovolémique a été atteinte lorsque la coagulopathie résultante a atteint
une valeur de
fermeté maximale du caillot (MCF) inférieure à 40 mm, comme cela était mesuré
par
thromboélastométrie (repères de temps n03 et 4 sur la figure 1).
A.5. Blessure osseuse standardisée
On a réalisé une blessure osseuse standardisée par forage d'un trou de 3 mm
dans la
tête du tibia à une profondeur requise pour pénétrer la moelle osseuse, cinq
minutes avant
l'administration du médicament testé. Cinq minutes après la blessure osseuse,
on a réalisé une
mesure de fibrinogène (repère de temps n 5 sur la figure 1), suivie par une
administration du
médicament de test (repère de temps n 6 sur la figure 1). L'excès sanguin a
été éliminé par
succion de la surface de la blessure entre l'os et le muscle et réuni dans une
cuve de collecte.
On a également déterminé la durée jusqu'à l'hémostase. Dans le cas où la perte
sanguine due
à la blessure osseuse a excédé 500 ml, l'hémorragie a été stoppée par
compression en utilisant
un bandage de gaz standard, afin de s'assurer que le porc était stable d'un
point de vue
hémodynamique pour les quatre heures suivantes d'observation.
Quinze minutes après l'administration du médicament testé, on a réalisé des
déterminations additionnelles de tous les paramètres mesurés (paramètre de
temps n 4). De
plus, une heure, deux heures et quatre heures après l'administration du
médicament testé, on a
réalisé des mesures de tous les paramètres (repère de temps n 7 sur la
figure 1).
A.6. Blessure hépatique standardisée
Quatre heures après l'administration du fibrinogène, on a réalisé une blessure
hépatique
standardisée en pratiquant une incision centrale du ligament falciforme au-
dessus du lobe
hépatique central, en utilisant un gabarit. L'incision hépatique résultante a
une longueur
d'environ 8 cm et une profondeur d'environ 2 cm (repère de temps n 8 sur la
figure 1). Aucun
effet sur la circulation médiée par les catécholamines n'est intervenu. La
réalisation d'une
blessure hépatique standardisée a été choisie de manière à démontrer que la
coagulation
altérée affectait négativement la mortalité.
Deux heures après avoir réalisé la blessure hépatique ou immédiatement avant
la mort
suspectée, on a réalisé des mesures de tous les paramètres (repère de temps n
9 sur la figure
1). Deux heures après le traumatisme hépatique, les animaux survivants ont été
euthanasiés en
leur administrant une infusion de potassium. Conformément aux résultats d'une
étude pilote
antérieure, une évaluation de suivi pendant deux heures a été considérée comme
étant
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suffisante (Fries et al., 2006, Br. J. Anaesth., Vol. 97 (4) : 460-467 ; Fries
et al., 2005, Br. J.
Anaesth., Vol. 95 (2) : 172-177).
On précise que l'étude a été réalisée en aveugle.
A.7. Distribution aléatoire des animaux ( randomization )
En utilisant un programme d'ordinateur approprié, les animaux ont été
distribués de
manière aléatoire (randomisés) dans les groupes 1 à 6 (1 : 37,5 mg/kg, 2 : 75
mg/kg, 3 : 150
mg/kg, 4: 300 mg/kg, 5: 450 mg/kg et 6: 600 mg/kg).
A.8. Protocole expérimental
Le protocole expérimental est notamment illustré par la figure 1 et par le
Tableau ci-
dessous, dans lequel les détails du traitement des 42 porcs inclus dans
l'étude sont décrits.
Tableau 1
Dose de Volume de Vitesse Nombre
fibrinogène la dose de d'infusion d'animaux
(mg/kg) fibrinogène (mUmin)*
(mUkg) ou
de NaCI
Placebo (0 40 de NaCI 40 6
mg/kg)
37,5 2,5 2,5 6
75 5 5 6
150 10 10 6
300 20 20 6
450 30 30 6
600 40 40 6
* pour un porc de 30 kg.
L'administration de fibrinogène a été réalisée par infusion pendant 30
minutes.
A.9. Échantillonnage du sang et méthodes d'analyse
Tous les échantillons de sang ont été collectés à partir de l'artère fémorale
et le premier
volume de 5 ml de sang a été éliminé. Les échantillons de sang pour l'étude
ROTEM et
l'analyse de la coagulation ont été collectés dans des tubes de 3 ml contenant
0,3 ml (0,106
mol/L de tampon citrate de sodium à pH 5,5 (Sarstedt, Nuermbrecht, Allemagne).
Les
échantillons de sang pour les besoins du comptage des cellules sanguines ont
été collectés
dans des tubes de 2,7 ml contenant 1,6 mg d'EDTA/ml (Sarstedt, Nuermbrecht,
Allemagne).
Tous les tests ont été réalisés par le même expérimentateur. Le temps de
prothrombine (PT), le
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WO 2010/100385 19 PCT/FR2010/050380
temps de génération de thombine (TGT), le temps de thromboplastine partielle
(PTT-LA1), la
concentration de fibrinogène, l'antithrombine (AT) et la thrombine-
antithrombine (TAT) ont été
déterminés par des méthodes de laboratoire standards en utilisant les tests
appropriés de Dade
Behring, Marburg, Allemagne et l'appareil de coagulométrie Amelung (Baxter,
Royaume-Uni).
Pour les mesures de D-dimer, on a utilisé le test D-dimer-0020008500
(Instrumentation
Laboratory Company, Lexington, Etats-Unis). Le comptage des cellules sanguines
a été réalisé
en utilisant le compteur Sysmex Poch-100i (Sysmex, Lake Zurich, Illinois,
Etats-Unis).
A.10. Thromboélastrométrie rotative (ROTEM )
ROTEM est un outil de diagnostic du type "point d'intervention" ("Point of
care"), qui
permet un test de la coagulation sur le sang total sans nécessiter de test de
laboratoire coûteux
en temps. De plus, et au contraire des tests de coagulation standard, cette
méthode permet
d'évaluer l'information sur la qualité du caillot, et tout spécialement sur la
fermeté du caillot.
ROTEM consiste en une modification du concept de thromboélastographie qui a
été
développé à l'origine par Hartert en 1948. La méthode consiste en un capteur
cylindrique qui
est immergé dans une cuvette contenant l'échantillon de sang. Le capteur est
en rotation à un
degré de 4,75 selon son axe longitudinal. Ce mouvement est altéré dés que les
brins de fibrine
commencent à se former entre la cuvette et le capteur. Cette inhibition est
détectée par un
changement du facteur de réflexion lumineuse qui est détectée en continu et
transformée en
une courbe classique typique de type ROTEM dans laquelle sont déterminés les
paramètres
suivants:
- CT, qui signifie le temps de coagulation ("Clotting time"), exprimé en
secondes, qui
est le temps écoulé jusqu'au début de la coagulation,
- CFT, qui signifie le temps de formation du caillot ("Clot Formation Time"),
exprimé
en secondes, et qui le temps écoulé entre le début de la coagulation et le
moment
où une amplitude de 20 mm est atteinte,
- MCF, qui signifie le maximum de fermeté du caillot ("Maximum Clot
Firmness"), qui
est exprimé en millimètres, et qui est l'amplitude maximale, et
- le pourcentage de lyse maximum ("Maximum Lysis (%)"), qui est le pourcentage
d'amplitude (MCF), 60 minutes après le début de la coagulation.
Tests ROTEMM
Différents tests d'agents activateurs de la coagulation sont disponibles,
comme
détaillé ci-dessous. Les tests utilisés dans l'exemple 2 sont le test INTEM et
le test FIBTEM
modifié.
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- INTEM: lorsqu'on réalise un test INTEM, la coagulation est activée via la
voie
intrinsèque. Le réactif INTEM contient de l'acide ellagique qui est un
activateur fort
de la voie de la coagulation intrinsèque.
- EXTEM: lorsqu'on réalise un test EXTEM, la coagulation est activée par le
facteur
tissulaire.
- FIBTEM: le test FIBTEM active la coagulation avec le facteur tissulaire. Au
même
moment, la fonction des thrombocytes est altérée en ajoutant de la
cytochalasine D.
Cela résulte en la formation d'un caillot qui est uniquement induit par le
fibrinogène.
- Le test FIBTEM modifié a été utilisé du fait que des expériences antérieures
ont
montré que les thrombocytes de porc ne peuvent pas être complètement bloqués
par la cytochalasine D. Pour cette raison, les thrombocytes ont été
complètement
éliminés de ce test en réalisant un test EXTEM sur un échantillon plasmatique
au
lieu de sang total (FIBTEM modifié).
A.11. Echantillonnage de tissus, conservation, préparation des lames d'essais
et examen
microscopique
Les échantillons des tissus provenant des organes (poumons, coeur, reins,
intestins et
foie) ont été prélevés à la fin de chaque expérience après dissection de
l'animal. Les
échantillons ont été immédiatement immergés dans une solution de formaline à
10%. Après
déhydratation par une séquence ascendante d'étapes mettant en oeuvre des
échantillons
d'alcool, les échantillons ont été inclus dans de la paraffine et coupés selon
des tranches de 7
m d'épaisseur. Les lames d'essais ont été colorées par la technique de
coloration classique
hématoxyline/éosine, puis ont été examinées.
A.12. Analyse statistique
Le test de Shapiro Wilks a été utilisé afin de vérifier la normalité de la
distribution des
variables de l'étude. La présomption de normalité de la distribution a été
rejetée pour les
variables suivantes: ZVD, WEDGE, SPO2, CT, ALPHA.
Pour ces variables, seuls des tests non paramétriques sont valides.
Tests paramétriques: on a utilisé l'analyse de variance (ANOVA) pour des
mesures
répétées afin d'évaluer les différences entre les groupes de test . Une valeur
de signification de
0,05 a été retenue pour les groupes d'effets, les mesures, et la mesure du
groupe x.
Des comparaisons multiples ont été évaluées contre le groupe placebo en
utilisant le
protocole de Dunnett.
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Un test non paramétrique a été réalisé en utilisant le test de Kruskal-Wallis:
on a
comparé tous les groupes dans un seul test. Un niveau de signification
statistique de 0,05 a été
retenu.
Le test de Wilcoxon a été comparé pour chaque groupe de test, avec le groupe
placebo.
Du fait du protocole de comparaison multiple de Bonferroni, seules des valeurs
de P
inférieures à 0,0084 (0,05 divisé par le nombre de comparaisons (6)) ont été
retenues comme
valeurs statistiquement significatives.
Un test de Jonckheere-Terpstra a été utilisé afin d'évaluer si la perte
sanguine totale
diminuait avec les doses croissantes de fibrinogène. Du fait que la
distribution de la perte
sanguine totale n'est pas normale, ce test non paramétrique pour des
différences ordonnées
dans les groupes de traitement est approprié (non parametric statistical
methods, Hollander and
Wolfe, 1973). Le test de Jonckheere-Terpstra teste l'hypothèse nulle que la
distribution de la
perte totale sanguine ne diffère pas selon les groupes ayant reçu des doses
distinctes de
fibrinogène (respectivement témoin, 37,5 mg/kg, 75 mg/kg, 150 mg/kg, 300
mg/kg, 450 mg/kg
et 600 mg/kg).
On a utilisé le test de Student afin de comparer les paramètres spécifiques
aux valeurs
témoins de base après hémodilution.
B. Résultats
B.1. Paramètres de la coagulation
1) Paramètres ROTEMM
Les paramètres ROTEM ont été significativement affectés après l'hémodilution
avec
Voluven . Le temps de coagulation a augmenté et la valeur du maximum de
fermeté du caillot
a diminué significativement après l'infusion de Voluven (p<0,0001). De la
même manière,
l'angle a a diminué significativement et la durée de formation du caillot
significativement
augmenté (p<0,001). L'administration de fibrinogène n'a pas significativement
raccourci la
durée prolongée de coagulation mais a significativement accru le MCF (p<0,001
contre le
placebo pour les groupes correspondants aux doses 150 mg/kg à 600 mg/kg, 15
minutes après
achèvement de l'infusion de fibrinogène) et l'angle a (p<0,05 contre le
placebo pour tous les
groupes de dosage 15 minutes après achèvement de l'infusion de fibrinogène).
Dans le cadre
d'une hémodilution à 60%, les résultats montrent que le traitement avec une
dose de 150 mg/kg
de fibrinogène est capable de restaurer complètement les valeurs de MCF de
base initiales.
Des doses plus importantes de fibrinogène ont induit un accroissement des
valeurs de INTEM
MCF jusqu'à un maximum de 80 mm, valeur à laquelle un plateau est atteint
(figures 2-4 et 6).
2) Tests standard de coagulation
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La valeur de PT a augmenté significativement de 11,11 +/- 0,7 Is à 17,43 +/-
1,9 Is après
hémodilution (p<0,0001 contre valeur de base initiale ou BL pour
BaseLine ). Après
l'administration de fibrinogène, les valeurs de PT ont augmenté
significativement jusqu'à 14,54
+/- 1,44 s, comparées à l'hémodilution (p<0,0001); cependant, il n'y a pas eu
de différence
significative entre les groupes.
Les valeurs de aPTT ont augmenté significativement de 10,94 +/- 3,34 s
initialement
jusqu'à 21,7 +/- 2,72 s après hémodilution (p<0,001).
Après administration du fibrinogène, la valeur de aPTT est restée élevée
comparée à la
valeur initiale. Il n'y avait pas de différence entre les groupes, à
l'exception du groupe F qui a
présenté une valeur significativement accrue de aPTT, comparé au groupe
placebo et aux
autres groupes de dosage, à tous les temps après l'administration du
médicament.
La valeur de D-dimer a été significativement accrue comparée au placebo, au
temps
quatre heures après l'administration de fibrinogène pour les groupes E et F
(p<0,01). Pour les
groupes A, D, E et F, on a montré un accroissement significatif de la valeur
de D-dimer à la fin
de l'expérience (p<0,05 pour le groupe A et p<0,001 pour les groupes D, E et
F).
Les valeurs de TAT et de génération de thrombine (méthode Calatzis) ne se
distinguaient pas des valeurs du groupe placébo.
3) Concentration en fibrinogène plasmatique
La concentration en fibrinogène plasmatique a significativement diminué après
l'hémodilution, comparé à la valeur de base (p<0,0001) comme cela est illustré
sur la figure 5.
Tous les animaux traités avec des doses de fibrinogène de 150 mg/kg ou plus
ont présenté un
accroissement significatif des niveaux de fibrinogène plasmatique comparés au
placebo, aux
temps 15 minutes, 1 heure, 2 heures et 4 heures après le traitement (p<0,001).
Le groupe B a présenté une augmentation significative de la concentration en
fibrinogène seulement 15 minutes, 1 heure et 4 heures après le traitement
(p<0,05). Tous les
groupes ont présenté une réduction dans les niveaux de fibrinogène 2 heures
après la blessure
hépatique ou juste avant la mort. Cependant, les animaux traités avec des
doses de 300 mg/kg
ou plus de fibrinogène ont présenté des niveaux de fibrinogène
significativement accrus au
temps 2 heures, comparés au placebo.
B.2. Comptage sanguin
Après le prélèvement de 60% du volume total sanguin et le remplacement du sang
avec
du Voluven , les valeurs d'hémoglobine ont significativement chuté à des
niveaux entre 3-4 g/dl
(p<0,0001, contre la valeur de base initiale BL ). L'hématocrite a
significativement chuté de
manière parallèle à des valeurs entre 11% et 13% (p<0,0001). Après re-
transfusion des
globules rouges, les valeurs d'hémoglobine et d'hématocrite ont
significativement augmenté
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jusqu'à 5-6 g/dl et jusqu'à 18-20% respectivement (p<0,0001 contre la valeur
de base initiale
BL pour les deux paramètres).
B.3. Hémodynamique et saturation mixte en oxygène
La saturation mixte en oxygène veineux a significativement augmenté après
hémodilution (p<0,0001 contre la valeur de base initiale de base BL ) et a
augmenté à
nouveau après la re-transfusion des globules rouges (p<0,01 après
hémodilution). Il y a eu une
augmentation significative dans la saturation mixte de l'oxygène veineux
(p<0,001), 2 heures
après la blessure hépatique/ ou juste avant la mort des animaux, comparé au
temps après re-
transfusion des globules rouges.
B.4. Perte sanguine
La perte totale sanguine après la blessure osseuse et la blessure hépatique
était de:
- 42,12 +/- 18,792 ml/kg dans le groupe placebo,
-41,55+/- 13,944 ml/kg à 37,5 mg/kg de fibrinogène,
-34,30+/- 13,593 ml/kg à 75 mg/kg de fibrinogène,
- 29,41 +/- 12,508 ml/kg à 150 mg/kg de fibrinogène,
-29,79+/- 10,155 ml/kg à 300 mg/kg de fibrinogène,
-26,59+/- 16,250 ml/kg à 450 mg/kg de fibrinogène, et
-28,02+/- 10,325 ml/kg à 600 mg/kg de fibrinogène.
L'analyse statistique a montré un effet dose-réponse significatif (p=0,02),
indiquant une
réduction de la perte totale sanguine pour des doses croissantes de
fibrinogène.
Les animaux qui ont reçu 150 mg/kg de fibrinogène ou des doses plus grandes
ont
présenté une augmentation significative dans la capacité de formation du
caillot, comme cela
est illustré par un accroissement significatif de la taille du caillot, formé
à la surface du foie
après la blessure (150 mg/kg: p<0,05 contre placébo; 300-600 mg/kg: p<0,01
contre placébo),
comme cela est illustré sur la figure 7.
B.6. Examen histologique
L'examen histologique des reins, des intestins, de la rate, des poumons, du c
ur et du foie des
animaux n'a pas permis de montrer une quelconque thrombose microvasculaire
dans les
vaisseaux.
Conclusion
Il est connu que, en raison d'une hémorragie massive, la concentration
plasmatique en
fibrinogène a atteint des niveaux critiques avant n'importe quel autre facteur
de coagulation.
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La première ligne de traitement pour une hémorragie sévère consiste en
l'administration
de liquides cristalloïdes et colloïdes afin de maintenir la normovolèmie.
Cependant, les colloïdes
et tout spécialement l'amidon hydroxyéthylé (HES) sont connus pour affecter la
polymérisation
de la fibrine.
La conséquence est une résistance diminuée du caillot qui peut conduire à une
perte
sanguine subséquente.
Le premier résultat principal de l'étude de l'exemple 2 est que
l'administration de
fibrinogène est capable de réverser la coagulopathie de dilution de manière
dose-dépendante.
Les mesures ROTEM ont clairement montré que le maximum de fermeté du caillot
(MCF) était
augmentée et normalisée après l'administration de fibrinogène.
Les valeurs de INTEM ont montré que l'administration de 150 mg/kg de
fibrinogène
étaient capables de restaurer complètement les valeurs de MCF initiales.
Le test FIBTEM modifié a montré la même tendance concernant les valeurs de MCF
cependant, pour les dosages de 300, 450 et 600 mg/kg, les valeurs de MCF ont
augmenté bien
au-delà des niveaux initiaux.
Tous les animaux ont présenté un accroissement dose-dépendant de la
concentration
du fibrinogène plasmatique, qui était stable pendant la totalité de la durée
de l'expérience.
Il est important de noter que, même si la concentration de fibrinogène
plasmatique a
augmenté au-delà des niveaux initiaux, les valeurs de MCF INTEM n'ont pas
suivi cette
augmentation de manière linéaire : à des concentrations de fibrinogène
plasmatique de 350
mg/dl, les valeurs de MCF ont atteint un plateau ; un accroissement
supplémentaire de la
concentration de fibrinogène n'a pas conduit à une augmentation des valeurs de
MCF.
Ces résultats suggèrent l'existence d'un mécanisme de sauvegarde qui prévient
une sur-
réaction du processus de coagulation dans une situation de biodisponibilité en
excès du
fibrinogène. La présence de plaquettes semble être cruciale pour la mise en
place de ce
mécanisme, puisque les données de EXTEM plasmatique (ou les plaquettes sont
pratiquement
absentes) ne suggère pas un tel comportement : tout spécialement dans les
groupes à haut
dosage (300-600 mg/kg) les valeurs de MCF augmentent bien au-delà de la valeur
de base
initiale ( baseline ).
De manière surprenante, les résultats à l'exemple 2 montrent que le
fibrinogène n'induit
pas d'état d'hyper-coagulation, ni n'induit d'évènements thrombo-emboliques.
En particulier, on
n'a pas détecté de signes d'évènements thrombo-emboliques, que ce soit du
point de vue
macroscopique ou du point de vue microscopique.
Le fibrinogène n'a affecté ni la production de trombine, ni le TAT.
A la connaissance du demandeur, les résultats présentés dans l'exemple 2 sont
les
premiers à montrer que des doses de fibrinogène aussi élevées que 12 fois le
dosage de
fibrinogène recommandé chez l'humain (selon la Société autrichienne
d'Anesthesiologie,
Reanimation and Intensive Care Medicine, accessible sur internet à l'adresse
suivante :
CA 02754399 2011-09-02
WO 2010/100385 25 PCT/FR2010/050380
http:,,',/www.oeagri.at/dateîarchiv,,'l 16/Traumainduziertes%2OGerinnun smana
ement. df,
peuvent être administrées in vivo.
Les résultats de l'exemple 2 ont aussi montré une réduction de la perte
sanguine après
l'administration de fibrinogène et un accroissement, dose-dépendant, de la
taille du caillot après
blessure hépatique.
Ces résultats sont à mettre en parallèle avec les données concernant une
augmentation
des valeurs de MCF après le traitement par le fibrinogène et ont montré
clairement que la
capacité de formation du caillot était améliorée après administration du
fibrinogène.
Notamment, des doses de fibrinogènes de 150mg/kg ou supérieur ont
significativement accru la
taille du caillot.
En résumé, l'étude de l'exemple 2 confirme que l'administration d'un concentré
de
fibrinogène humain (FGTW) est capable de réverser la coagulopathie de dilution
de manière
dose-dépendante. Un traitement a une dose de 150mg/kg est capable de restaurer
complètement les valeurs de MCF jusqu'au valeur initiale de base. Les
résultats de l'exemple 2
montre également que les valeurs de MCF INTEM atteignent un plateau à des
concentrations
de fibrinogène plasmatique de 350 mg/dl. Des concentrations plus importantes
de fibrinogène
plasmatique n'augmentent pas davantages les valeurs de MCF. L'administration
de fibrinogène
réduit significativement la perte sanguine après blessure hépatique et
augmente la capacité de
coagulation de manière dépendante de la dose.
Ces résultats suggèrent que des doses encore plus importantes de fibrinogène
sont
d'une totale innocuité chez l'homme, du fait que l'on pas détecté
d'hypercoagulabilité. Un
traitement à des doses douze fois supérieures à la dose recommandée chez
l'homme ne
produit aucun effet indésirable telle que la thrombose ou une embolie
pulmonaire.
Les résultats des exemples montrent également qu'une dose importante de
fibrinogène
peut être administrée selon une durée de l'étape d'administration qui est très
courte, sans
provoquer d'effet indésirable.
Comme cela est détaillé ci-dessous, les résultats de l'exemple 2, lorsqu'ils
sont
transposés à une administration de fibrinogène chez l'homme, indiquent qu'une
dose de 6 g de
fibrinogène peut être administrée selon une durée de l'étape d'administration
de cinq minutes,
l'administration de fibrinogène ayant pour effet de prévenir ou stopper une
hémorragie, sans
simultanément entraîner d'effet indésirable pour le patient. Plus précisément,
les résultats de
l'exemple 2 montrent que les effets bénéfiques attendus sur le rétablissement
des paramètres
hémodynamiques, sans provoquer d'effet indésirable, sont obtenus en
administrant au modèle
expérimental de porc qui est illustré une quantité de fibrinogène de 600 mg/kg
avec une durée
de l'étape d'administration de 30 minutes, c'est-à-dire une dose de
fibrinogène de 0,02
g/kg/min. On précise que la composition de concentré de fibrinogène qui a été
utilisée à
l'exemple 2 (composition FGT1 ) a une concentration en fibrinogène humain
de 15 g/l, soit
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0,015 g/ml. Pour obtenir une dose de fibrinogène de 0,02 g/kg/min, on
administre aux porcs une
dose de la composition FGT1 précitée de 1,33 ml/kg/min. Transposée à un
patient humain
ayant un poids de 60 kg, l'administration d'une dose de composition FGT1
de 1,33
ml/kg/min consiste à administrer la composition FGT1 audit patient selon
une vitesse
d'administration de 80 ml/min. Ainsi, pour une dose de fibrinogène de 6 g à
administrer audit
patient humain, en utilisant la composition FGT1 , il est nécessaire
d'administrer un volume
de 400 ml de la composition FGT1 audit patient, à la vitesse
d'administration de 80 ml/min.
En conséquence, la dose de 6 g de fibrinogène, avec la vitesse
d'administration précitée, peut
être administrée audit patient humain en cinq minutes.
