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POLYPEPTIDES POUR L'EVALUATION IN VITRO DU POTENTIEL SENSIBILISANT D'UN
COMPOSE TEST
La présente invention se rapporte à de nouveaux polypeptides et à leur
utilisation pour
l'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test, à une
méthode
d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test, à une
méthode in vitro
pour la sélection d'un composé apte à diminuer la sensibilisation, ainsi qu'à
des trousses
pour la mise en oeuvre de telles méthodes.
Les industries de la parfumerie et de la cosmétique se doivent de rester
compétitives et
performantes et continuer à proposer régulièrement des produits nouveaux, avec
comme
contrainte de répondre aux normes de sécurité pour l'homme et son
environnement
attachées à leur utilisation. Or l'allergie de contact est l'un des risques
majeurs associés
à l'utilisation d'un parfum ou d'un produit cosmétique.
L'allergie cutanée de contact (ou dermatite atopique) est un problème de santé
publique
majeur chez l'homme. Elle représente une manifestation immunotoxique
environnementale sérieuse, contraignante, dont il est important d'anticiper
les effets
lorsque l'on met sur le marché des produits susceptibles de la provoquer. La
sensibilisation cutanée et, par conséquent la manifestation allergique
associée, est le
résultat dans un premier temps de l'interaction d'une molécule allergénique
avec des
cellules spécialisées de l'épiderme, les cellules présentatrices de l'antigène
(cellules de
Langerhans, cellules dendritiques) puis dans un second temps de leurs
présentations par
ces cellules à des lymphocytes effecteurs T CD4+ et CD8+. Ce sont ces derniers
qui sont
à la base de la réaction allergique et inflammatoire. Néanmoins, les
allergènes, en
particulier ceux qui peuvent être présents dans un parfum ou un produit
cosmétique,
sont des petites molécules qui ne peuvent pas être reconnues directement. Leur
reconnaissance nécessite leur association préalable avec des protéines du soi.
Ainsi,
c'est le complexe hétérodimérique néoformé dans la peau qui sera
ultérieurement
présenté aux cellules T dans les ganglions proximaux. Par conséquent, la
faculté d'une
molécule chimique (composé de parfum ou ingrédient cosmétique) à s'associer à
une
protéine de l'utilisateur de ce parfum est un préalable obligatoire à
l'induction de la
réaction pathologique consécutive.
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Jusqu'à présent, des animaux étaient utilisés pour identifier les molécules
sensibilisantes
au niveau cutané et le LLNA (local lymph node assay) basé sur la prolifération
induite
des lymphocytes ganglionnaires après contact avec le sensibilisant a été
développé. Ce
test a été adopté comme Testing guideline 429 par l'Organisation de
coopération et
de développement économiques (OCDE) et est considéré encore à ce jour comme le
test
de référence pour la détermination d'un agent chimique sensibilisant.
Les nouvelles contraintes européennes imposent désormais l'utilisation de
méthodes
n'utilisant pas d'animaux et il est donc indispensable de mettre au point des
méthodes
alternatives permettant de déterminer si une composition parfumante nouvelle
est
susceptible de représenter un danger pour l'homme par ses propriétés
sensibilisantes.
De manière surprenante, les Inventeurs ont montré que des séquences de deux
enzymes
de la famille des lipocalines, présentes dans la peau et présentant des
séquences
homologues importantes, permettaient de cribler in vitro des composés
susceptibles de
se comporter comme des allergènes. Ces enzymes sont la neutrophil gelatinase
associated lipocalin (NGAL, également appelée lipocaline 2) (SEO et al.,
Expression
of neutrophil gelatinase-associated lipocalin in skin epidermis, J. Invest.
Dermatol.,
126, 510-412 ; 2006), et la prostaglandine D synthase (L-PGDS) (TAKEDA et
al.,
Lipocalin-type prostaglandin D synthase as a melanocyte marker regulated by
MTIF,
BBRC, 339, 1098-1106 ; 2006).
NGAL a été identifiée à l'origine comme une protéine de 25kDa associée de
manière
covalente avec la neutrophil gelatinase de 92kDa (ou gélatinase B, MMP-9).
L'analyse crystallographique a montré que les ligands naturels de cette enzyme
sont une
variété de sidérophores ferriques bactériens agissant ainsi comme un
bactériostatique.
Dans le rein, cette enzyme joue le même rôle en délivrant le fer dans les
cellules du
néphron. NGAL est induit par le calcium dans les kératinocytes en culture et
sa
présence dans la peau humaine et murine a été confirmée, particulièrement au
niveau de
l'épiderme (dans les kératinocytes exclusivement) et des follicules pileux,
par
hybridation in situ.
L-PGDS dont le rôle initialement décrit est d'isomériser la prostaglandine H2
en
prostaglandine D2, fonctionne également comme une protéine lipophile des
espaces
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extracellulaires dont les ligands connus sont la bilirubine, le rétinaldéhyde
et l'acide
rétinoïque. Des études récentes ont montré que L-PGDS est présente dans les
cellules de
Langerhans, les mélanocytes, les mastocytes, les histiocytes et les
macrophages (mais
pas dans les kératinocytes) chez le rat.
Les Inventeurs ont alors identifié des séquences particulières de ces
lipocalines ou
dérivées de celles-ci, pour la mise au point de méthodes d'évaluation in vitro
du
potentiel sensibilisant de composés susceptibles de se comporter comme des
allergènes.
Ainsi, la présente invention se rapporte à un polypeptide isolé comprenant une
séquence
choisie parmi la séquence SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et
13 et des
dérivés celles-ci, de préférence à un polypeptide isolé comprenant une
séquence choisie
parmi la séquence SEQ ID NO :1, 2, 3, et 4, encore plus préférentiellement un
polypeptide
isolé comprenant la séquence SEQ ID NO: l ou la séquence SEQ ID NO :3, et
encore
préférentiellement un polypeptide isolé comprenant la séquence SEQ ID NO 1.
Lesdites séquences sont listées ci-dessous :
XIACAX2DELX3EX4 (SEQ ID NO: 1)
X1EX2LEDX3ACAX4 (SEQ ID NO :2)
ECGXIDELX2EX3 (SEQ ID NO :3)
X1EX2LEDX3GCE (SEQ ID NO :4),
LYGRTXIELTSELX2ENFIRFSX3SLGLPEN (SEQ ID NO :5)
LYSRSQNPRAEVXIEHFTTFAX2SLGFTEE (SEQ ID NO :6)
LYGRTXIELSPELX2ERFTFAX3SLGLX4 (SEQ ID NO :7)
LYSRTQTLXIDELX2EX3FTTFSX4AQGLT (SEQ ID NO: 8)
RQNQCETXI (SEQ ID NO :9)
TLYGRTXIEL (SEQ ID NO: 10)
XIERFTRFAX2 (SEQ ID NO :11)
X1EX2FTTFSX3 (SEQ ID NO: 12)
LYGRTXIELS (SEQ ID NO: 13)
où Xl, X2, X3 et X4 sont indépendamment choisis parmi la lysine, l'omithine,
le
diaminobutyrate ou le diaminopropionate, de préférence la lysine.
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Avantageusement, chacun des groupes Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun une
lysine.
Ainsi, avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO: 1, Xl, X2, X3 et X4
représentent
chacun un groupement lysine, et correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 20
suivante :
KACAKDELKEK (SEQ ID NO :20).
Préférentiellement, ladite séquence SEQ ID NO:20 présente un groupement amine
(NH2)
à son extrémité C-Terminale.
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :2, Xl, X2, X3 et X4 représentent
chacun
un groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO
: 21
suivante
KEKLEDKACAK (SEQ ID NO :21)
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :3, Xl, X2 et X3 représentent
chacun un
groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO :
22
suivante
ECGKDELKEK (SEQ ID NO :22)
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :4, Xl, X2 et X3 représentent
chacun un
groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO :
23
suivante
KEKLEDKGCE (SEQ ID NO :23)
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :5, Xl, X2 et X3 représentent
chacun un
groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO :
24
suivante
LYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPEN (SEQ ID NO :24)
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :6, Xl et X2 représentent chacun
un
groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO :
25
suivante :
LYSRSQNPRAEVKEHFTTFAKSLGFTEE (SEQ ID NO :25)
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :7, Xl, X2, X3 et X4 représentent
chacun
un groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO
: 26
suivante
LYGRTKELSPELKERFTFAKSLGLK (SEQ ID NO :26).
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :8, Xl, X2, X3 et X4 représentent
chacun
un groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO
: 27
suivante
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LYSRTQTLKDELKEKFTTFSKAQGLT (SEQ ID NO :27).
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :9, Xl représente un groupement
lysine,
et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 28 suivante :
RQNQCETK (SEQ ID NO :28)
5 Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :10, Xl représente un groupement
lysine,
et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 29 suivante :
TLYGRTKEL (SEQ ID NO :29)
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :11, Xl et X2 représentent chacun
un
groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO :
30
suivante :
KERFTRFAK (SEQ ID NO :30)
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :12, Xl, X2 et X3 représentent
chacun un
groupement lysine, et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO :
31
suivante :
KEKFTTFSK (SEQ ID NO :31)
Avantageusement, dans la séquence SEQ ID NO :13, Xl représente un groupement
lysine,
et la séquence correspond ainsi à la séquence SEQ ID NO : 32 suivante
LYGRTKELS (SEQ ID NO :32)
Avantageusement, les séquences SEQ ID NO :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12 et 13
peuvent présenter un groupement acétyl à leur extrémité N-Terminale.
Avantageusement, les séquences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12 et 13
peuvent présenter un groupement amine (NH2) ou amide (CONH2) à leur extrémité
C-
Terminale. De préférence, les séquences SEQ ID NO : 1 SEQ ID NO : 3,
présentent un
groupement amine ou amide à leur extrémité C-Terminale.
Ledit polypeptide isolé selon la présente invention peut être sous la forme L
ou sous la
forme D.
De préférence, les polypeptides selon la présente invention ont une longueur
inférieure à
100 acides aminés, de manière préférée inférieure à 80, de manière encore
préférée
inférieure à 50, de manière encore préférée inférieure à 40 et de manière
préférée entre
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toute inférieure à 30 acides aminés.
On entend par dérivés , un polypeptide présentant une ou plusieurs
mutations de
séquence ne modifiant pas l'activité dudit polypeptide, notamment un
polypeptide
présentant une ou plusieurs mutations dites `conservatives' et les mutations
n'affectant pas
les valeurs de pKa du thiol du résidu de cystéine et/ou de lysine et/ou ayant
un pourcentage
d'identité d'au moins 80% avec la séquence complète de la séquence SEQ ID NO
:1 à 13,
de préférence au moins 90%, et encore préférentiellement d'au moins 95%.
On entend par mutation conservative , une mutation choisie parmi la
substitution d'un
résidu d'acide aminé basique par un autre résidu d'acide aminé basique, d'un
résidu
d'acide aminé acide par un autre résidu d'acide aminé acide, d'un résidu
d'acide aminé
neutre par un autre résidu d'acide aminé neutre, d'un résidu d'acide aminé
aliphatique par
un autre résidu d'acide aminé aliphatique ou aromatique, d'un résidu d'acide
aminé
aromatique par un autre résidu d'acide aminé aromatique ou aliphatique, d'un
résidu
d'acide aminé amidé par un autre résidu d'acide aminé amidé, d'un résidu
d'acide aminé
alcoolique par un autre résidu d'acide aminé alcoolique.
On entend par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides aminés,
les
pourcentages d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer,
obtenus
avec le meilleur alignement desdites séquences, ce pourcentage étant purement
statistique
et les différences entre les deux séquences étant aléatoirement réparties dans
les séquences
d'acides aminés. On entend par meilleur alignement , l'alignement pour
lequel le
pourcentage d'identité est le plus élevé. La comparaison de séquence entre
deux séquences
d'acides aminés est en général réalisée en comparant ces séquences
préalablement alignées
selon le meilleur alignement ; cette comparaison est réalisée sur des segments
de
comparaison afin d'identifier et comparer les similarités de régions. Le
meilleur
alignement de séquences peut être réalisé, outre manuellement, par
l'utilisation de
l'algorithme d'homologie global développé par SMITH et WATERMAN (Ad. App.
Math.,
vol.2, p:482, 1981), l'algorithme d'homologie local développé par NEDDLEMAN et
WUNSCH (J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970), en utilisant la méthode des
similarités
développée par PEARSON et LIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444,
1988),
en utilisant des logiciels utilisant de tels algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST
P, BLAST
N, FASTA, TFASTA dans le "Wisconsin Genetics software Package , Genetics
Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), en utilisant les
algorithmes
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d'alignements multiples MUSCLE (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol.
32,
p: 1792, 2004). Afin d'obtenir le meilleur alignement local, il peut être
préférable d'utiliser
le logiciel BLAST, avec la matrice BLOSUM 62 ou la matrice PAM 30. Le
pourcentage
d'identité entre deux séquences d'acides aminés est déterminée en comparant
ces deux
séquences alignées de façon optimales, les séquences d'acides aminés pouvant
comprendre
des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence afin
d'obtenir un
alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité est
calculé en
déterminant le nombre de positions identiques entre les deux séquences, et en
divisant ce
nombre par le nombre total de positions comparées, et en multipliant ce nombre
par cent.
Selon un mode de réalisation préféré, ledit polypeptide isolé consiste en une
séquence
choisie parmi la séquence SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et
13 et des
dérivés de celles-ci, de manière préférée en une séquence choisie parmi la
séquence SEQ
ID NO :1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO : 4, et des dérivés de
celles-ci, de
préférence en une séquence choisie parmi la séquence SEQ ID NO: l et SEQ ID NO
:3,
encore plus préférentiellement en la séquence SEQ ID NO :1.
Le polypeptide isolé consistant en la séquence SEQ ID NO :1, et encore
préférentiellement
en la séquence SEQ ID NO :20, est particulièrement préféré car sa synthèse et
sa
purification sont aisées, il présente une excellente solubilité et est facile
à manipuler car
peu électrostatique, il n'est que très faiblement dimérisé ce qui facilite son
utilisation dans
les méthodes selon la présente invention, et enfin il permet de détecter les
allergènes fixés
sur ladite séquence en une seule étape réactionnelle.
Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à une séquence
nucléotidique
comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide tel que
défini ci-
dessus.
La séquence nucléotidique selon la présente invention peut être sous forme
d'ARN ou
d'ADN, de préférence sous forme d'ADN.
Ledit ADN peut être sous forme double brin ou simple brin.
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Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à une méthode
d'évaluation in vitro
du potentiel sensibilisant d'un composé test, comprenant les étapes de:
a) mise en contact d'un composé test avec un polypeptide isolé comprenant une
séquence
choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15,
16 et 17 et des dérivés de celles-ci;
b) mesure de la liaison éventuelle dudit composé test avec ledit polypeptide.
Bien entendu, la méthode d'évaluation pourra également être réalisée ex vivo.
La séquence SEQ ID NO :14 représente la séquence polypeptidique de la
lipocaline 2
humaine :
MPLGLLWLGLALLGALHAQAQDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQGKWYVV
GLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCDYWIRTFVPGCQP
GEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVV STNYNQHAMVFFKKV SQNREYFKITLYGRTKELT
SELKENFIRFSKYLGLPENHIVFPVPIDQCIDG (SEQ ID NO: 14)
La séquence SEQ ID NO :15 représente la séquence polypeptidique de la
lipocaline 2 de
souris :
MALSVMCLGLALLGVLQSQAQDSTQNLIPAPSLLTVPLQPDFRSDQFRGR
WYVVGLAGNAVQKKTEGSFTMYSTIYELQENNSYNVTSILVRDQDQGCRYWIRT
FVPSSRAGQFTLGNMHRYPQVQSYNVQVATTDYNQFAMVFFRKTSENKQYFKITL
YGRTKELSPELKERFTRFAKSLGLKDDNIIFSVPTDQCIDN (SEQ ID NO: 15)
La séquence SEQ ID NO :16 représente la séquence polypeptidique de la
prostaglandine D
synthase humaine :
MATHHTLWMGLALLGVLGDLQAAPEAQVSVQPNFQQDKFLGRWFSAGLASNSS
WLREKKAALSMCKSVVAPATDGGLNLTSTFLRKNQCETRTMLLQPAGSLGSYSY
RSPHWGSTYSVSVVETDYDQYALLYSQGSKGPGEDFRMATLYSRTQTPRAELKEK
FTAFCKAQGFTEDTIVFLPQTDKCMTEQ (SEQ ID NO: 16)
La séquence SEQ ID NO :17 représente la séquence polypeptidique de la
prostaglandine D
synthase de souris :
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MAALRMLWMGLVLLGLLGFPQTPAQGHDTVQPNFQQDKFLGRWYSAGLASNSS
WFREKKAVLYMCKTVVAPSTEGGLNLTSTFLRKNQCETKIMVLQPAGAPGHYTY
SSPHSGSIHSVSVVEANYDEYALLFSRGTKGPGQDFRMATLYSRTQTLKDELKEKF
TTFSKAQGLTEEDIVFLPQPDKCIQE (SEQ ID NO: 17)
Avantageusement, un ou plusieurs des résidus lysine des séquences SEQ ID NO:
14, SEQ
ID NO :15, SEQ ID NO :16 et SEQ ID NO :17 peuvent être remplacés par
l'omithine, le
diaminobutyrate ou le diaminopropionate.
De préférence, le polypeptide isolé comprend une séquence choisie parmi les
séquences
SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 et des dérivés de
celles-ci.
La mesure de la liaison éventuelle obtenue à l'étape b) peut éventuellement
être comparée
à un contrôle négatif réalisé en l'absence du composé test ou en présence d'un
composé
connu comme non sensibilisant, comme par exemple le chlorobenzène (Cbz) ou
l'acide
lactique (LA), ou à un contrôle positif réalisé avec un ligand connu dudit
polypeptide.
Ainsi, ladite méthode selon la présente invention peut comprendre en outre une
étape c) de
détermination du potentiel sensibilisant d'un composé test. Plus le
pourcentage de liaison
sera important, plus le potentiel sensibilisant sera important.
Ladite liaison peut par exemple être une liaison covalente, hydrogène, saline,
électrostatique, de Van der Waals, une attaque radicalaire... De préférence,
ladite liaison
est une liaison covalente.
La mesure de la liaison peut être réalisée par toute technique de mesure d'une
liaison bien
connue de l'homme du métier. A titre d'exemple, on peut citer la mesure d'une
liaison à
l'aide d'un marquage, qui peut être de type antigénique, fluorescent,
enzymatique,
radioactif, une séparation par chromatographie en phase liquide (HPLC),
l'utilisation de la
technique de résonance plasmonique de surface, etc...
Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide est lié à un marqueur
antigénique et la
mesure de la liaison dudit composé test avec ledit polypeptide est réalisée
par le biais d'un
anticorps détectable et dirigé contre ledit marqueur antigénique.
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Ce marqueur antigénique peut être tout type de marqueur connu de l'homme du
métier et
peut être notamment choisi parmi une séquence d'acides aminés polyhistidine
(polyHis), un
élément cMyc, Flag ou d'une séquence isolée de l'hémaglutinine ou de la
protéine V5. La
séquence polyHis contient de préférence de 4 à 6 résidus Histidine.
Préférentiellement, le
5 marqueur antigénique est une séquence d'acides aminés polyhistidine
(polyHis).
Les anticorps utilisés pour détecter ce marqueur antigénique peuvent être
polyclonaux ou
monoclonaux. Ils peuvent être produits par des techniques conventionnelles
connues de
l'homme du métier. Il peut s'agir d'anticorps commerciaux. Parmi ceux-ci, on
peut citer
l'anticorps penta-His HRP conjugate (QIAGEN), l'anticorps de lapin anti-6x His
Abcam
10 9108, l'anticorps de lapin -6x His marqué à la HRP (peroxidase de raifort)
Abcam 1187,
l'anticorps de souris -anti- 5x His Qiagen 34698, l'anticorps de souris -anti-
poly-His Sigma
H-1029.
Les anticorps peuvent être couplés à des marqueurs détectables, connus de
l'homme du
métier, tels que des enzymes (par exemple la peroxidase de raifort HRP), des
marqueurs
radioactifs, des agents fluorescents, des particules magnétiques, etc.
Préférentiellement,
l'anticorps est couplé à la HRP (HorseRadish Peroxydase).
L'immunodétection peut être réalisée par n'importe quelle technique adaptée,
par exemple
un Western Blot, Dot Blot, etc...
Dans un autre mode de réalisation préféré, le polypeptide est lié à un
marqueur fluorescent
et la mesure de la liaison dudit composé test avec ledit polypeptide est
réalisée par
fluorométrie. Le marquage fluorescent peut être direct ou indirect, le
fluorophore étant fixé
directement sur le polypeptide ou par l'intermédiaire d'un autre marqueur. Le
marqueur
fluorescent peut être par exemple la fluorescéine, la RPE (R-Phycoerythrin),
la GFP
(Green Fluorescent Protein), l'APC (AlloPhycoCyanin), les cyanines ou
l'Europium.
Dans un autre mode de réalisation préféré, le polypeptide est lié à un
marqueur
enzymatique et la mesure de la liaison dudit composé test avec ledit
polypeptide est
réalisée par fluorométrie, luminescence ou colorimétrie, en fonction du
substrat utilisé lors
de la réaction enzymatique.
La mesure de la liaison dudit composé test avec ledit polypeptide peut
notamment être
effectuée à l'aide d'un substrat colorimétrique (p-Nitrophenyl Phosphate ou
pNPP),
fluorescent (Fluorescein DiPhosphate ou FDP) ou luminescent (Lumi-PhosTM), la
mesure
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de l'interaction étant alors effectuée respectivement par spectrophotométrie à
405 nm, par
fluorimétrie (exitation : 485 nm ; émission : 535 nm) ou par luminescence.
Le polypeptide peut être fixé sur un support. Le support préférentiellement
utilisé pour la
mise en oeuvre de la méthode selon la présente invention est une plaque, une
bille ou une
puce.
Les polypeptides utilisés dans la méthode selon la présente invention peuvent
être préparés
par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par synthèse
artificielle et
plus particulièrement par synthèse en phase solide.
Le composé test peut être un composé de nature, structure et origine variées,
notamment un
composé biologique, un composé chimique, synthétique, etc.
Le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée
ou en mélange
avec d'autres produits. Le composé test peut être défini en termes de
structure et/ou de
composition ou être défini sur le plan fonctionnel. Le composé test peut, par
exemple, être
un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure
indéfinie, un
mélange de produits connus et caractérisés ou une composition comprenant un ou
plusieurs
produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi être testés, en mélange ou de
manière
séparée.
De telles compositions peuvent être, par exemple, des échantillons d'un
produit
cosmétique ou dermatologique.
Le composé test peut être d'origine naturelle ou synthétique.
La présente invention est particulièrement adaptée à l'identification d'un
nombre important
de composés. Ce criblage simple et efficace peut être accompli en un laps de
temps très
court. Les méthodes décrites peuvent en particulier être partiellement
automatisées,
autorisant ainsi le criblage efficace et simultané de composés divers et
nombreux, soit sous
forme de mélange soit sous forme séparée.
Préférentiellement, la méthode selon l'invention est réalisée en HTS (High
Throughput
Screening) ou en MTS (Medium Throughput Screening).
Au sens de la présente invention, on entend par polypeptide une séquence
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comprenant au moins deux acides aminés, et les termes polypeptide ,
peptide et
protéine peuvent être indifféremment utilisés.
On entend par potentiel sensibilisant , le risque pour le composé test de
provoquer
une réaction immunologique lors de sa mise en contact avec un mammifère, de
préférence un humain. Ainsi, le potentiel sensibilisant peut être considéré
comme le
risque de développer une allergie au contact du composé test.
De préférence, ledit composé test est apte à être appliqué sur la peau. Ainsi,
le potentiel
sensibilisant correspond au risque de développer une allergie cutanée.
De préférence, ledit composé test est apte à entrer dans la composition d'une
composition dermatologique ou cosmétique.
De préférence, la méthode selon la présente invention permet d'évaluer si le
composé
test est susceptible de provoquer une allergie de contact ou dermatite
atopique.
De préférence, la méthode selon la présente invention est réalisée dans une
solution
tampon ayant un pH compris entre 7.3 et 9.3, de manière encore préférée entre
7.8 et
8.8, et de manière particulièrement préférée la solution tampon ayant un pH de
8.3.
De préférence, la méthode selon la présente invention est réalisée à une
température
comprise entre 20 C et 40 C, de manière encore préférée entre 25 C et 35 C, de
manière encore préférée entre 28 C et 32 C, et de manière préférée entre toute
à 30 C.
De préférence, la méthode selon la présente invention est réalisée dans
l'obscurité.
De préférence, la concentration de polypeptide utilisée pour la mise en oeuvre
du
procédé selon la présente invention est comprise entre 0.2 et 1.5 mM, de
manière encore
préférée entre 0.4 et 1.2 mM, de manière encore préférée de 1 MM.
De préférence, la concentration du composé test pour la mise en oeuvre du
procédé selon
la présente invention est comprise entre 1 et 10 mM, de manière encore
préférée entre 3
et 7 mM, de manière encore préférée entre 4 et 6 mM et de manière préférée
entre toute
de 5mM.
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13
Dans un mode de réalisation particulier selon la présente invention, le
composé test peut
être mis au contact de plusieurs polypeptides isolés présentant des séquences
différentes.
Dans mode de réalisation particulier, la méthode d'évaluation selon la
présente
invention peut être un test de compétition, dans laquelle le composé test
entre en
compétition avec un composé identifié comme sensibilisant. Ledit composé
identifié
comme sensibilisant pourra être mis en contact avec ledit polypeptide isolé
préalablement à l'étape a), ou simultanément à l'étape a). Un tel mode de
réalisation
permet de comparer le potentiel sensibilisant d'un composé test à celui d'un
composé
identifié comme sensibilisant.
Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à une méthode in
vitro pour la
sélection d'un composé apte à diminuer la sensibilisation, comprenant les
étapes de :
a) mise en contact d'un composé identifié comme sensibilisant, d'un
polypeptide isolé
comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 et des dérivés de celles-ci, et d'un composé
candidat pour
diminuer la sensibilisation;
b) mesure de la liaison éventuelle du composé identifié comme sensibilisant
avec ledit
polypeptide.
Ladite méthode pour la sélection d'un composé apte à diminuer la
sensibilisation peut être
réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment pour la
méthode
d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test.
On entend par composé apte à diminuer la sensibilisation , un composé
capable de
réduire le potentiel sensibilisant d'un composé identifié comme sensibilisant.
En d'autres
termes, on entend par composé apte à diminuer la sensibilisation , un
composé
diminuant le risque de provoquer une réaction immunologique en présence d'un
composé
identifié comme sensibilisant. On pourra également employé le terme composé
désensibilisant pour définir le composé apte à diminuer la sensibilisation
.
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De préférence, on conclura qu'un composé est apte à diminuer la
sensibilisation s'il permet
de réduire le potentiel sensibilisant d'un composé identifié comme
sensibilisant d'au moins
10%, de préférence d'au moins 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, et de
manière préférée 100% par rapport au potentiel sensibilisant observé en
l'absence dudit
composé désensibilisant.
On entend notamment par composé identifié comme sensibilisant , un composé
susceptible d'être identifié par la méthode de la présente invention, soit, en
d'autres termes,
un composé identifié comme présentant un potentiel allergène.
Le composé susceptible d'être identifié à l'aide de la méthode selon
l'invention peut être un
composé de nature, structure et origine variées, notamment un composé
biologique, un
composé chimique, synthétique, etc.
De préférence, le composé identifié comme sensibilisant est choisi parmi la
diphénylcyclopropénone (DPCP), le lauryl gallate (LG), la 3-3-
dimethylaminopropylamine
(3-DMAPA), l'aldéhyde cinnamique (CA), le citral (Cal), la 1,4-hydroquinone
(HQ), le
glutaraldéhyde (GA), la 1,2-benzisothiazo lin-3 -one (Ben), la
phénylacetaldéhyde (PA) et le
lilial (Li), préférentiellement parmi la diphénylcyclopropénone, le lauryl
gallate, la 1,4-
hydroquinone et le glutaraldéhyde, et de manière particulièrement préférée est
la
diphénylcyclopropénone.
La diphénylcyclopropénone est un sensibilisant extrêmement fort ; le lauryl
gallate, la 1,4-
hydroquinone et le glutaraldéhyde sont des sensibilisants forts ; la 3-3-
dimethylaminopropylamine, l'aldéhyde cinnamique, le citral, la 1,2-
benzisothiazolin-3-one
et la phénylacetaldéhyde sont des sensibilisants modérés, et le lilial est un
sensibilisant
faible.
Le composé candidat pour diminuer la sensibilisation peut être tout produit
qui se présente
sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé
candidat pour
diminuer la sensibilisation peut être défini en termes de structure et/ou de
composition ou
être défini sur le plan fonctionnel. Le composé candidat pour diminuer la
sensibilisation
peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un
produit isolé de
structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une
composition
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comprenant un ou plusieurs produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi
être testés,
en mélange ou de manière séparée.
Le composé test peut être d'origine naturelle ou synthétique.
5
La capacité d'un composé candidat à diminuer ou à inhiber la liaison, peut
être évaluée en
comparant la capacité de liaison d'un polypeptide comprenant au moins une
séquence
choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16
et 17 et des dérivés de celles-ci, avec un composé identifié comme
sensibilisant en
10 présence dudit composé candidat, à la capacité de liaison dudit polypeptide
avec ledit
composé identifié comme sensibilisant en l'absence dudit composé candidat.
Ainsi, si une diminution ou une inhibition de la capacité de liaison est
observée en
présence dudit composé candidat, on pourra en conclure que ledit composé
candidat est un
composé apte à diminuer la sensibilisation.
De préférence, ledit composé candidat est apte à être utilisé sur la peau et
peut être utilisé
dans une composition cosmétique ou dermatologique.
L'étape a) peut être réalisée :
i) par mise en contact préalable du composé identifié comme sensibilisant et
du
polypeptide isolé tel que défini précédemment, suivi optionnellement d'une
première
mesure de la liaison du composé identifié comme sensibilisant avec ledit
polypeptide
isolé, puis mise en contact avec le composé candidat pour diminuer la
sensibilisation
avec le composé identifié comme sensibilisant lié au polypeptide isolé ,
ii) par mise en contact préalable du composé identifié comme sensibilisant et
du
composé candidat pour diminuer la sensibilisation puis mise en contact du
polypeptide
isolé tel que défini précédemment avec le composé identifié comme
sensibilisant et le
composé candidat pour diminuer la sensibilisation ; ou
iii) par mise en contact simultanée du composé identifié comme sensibilisant,
du
composé candidat pour diminuer la sensibilisation et du polypeptide isolé tel
que défini
précédemment.
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16
De préférence, le polypeptide isolé comprend une séquence choisie parmi les
séquences
SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 et des dérivés de
celles-ci.
La présente invention se rapporte également à une trousse pour la mise en
oeuvre d'une
méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test
selon la
présente invention, comprenant au moins un polypeptide isolé comprenant une
séquence
choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15,
16 et 17 et des dérivés de celles-ci.
De préférence, ledit polypeptide isolé comprend une séquence choisie parmi les
séquences
SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 et des dérivés de
celles-ci,
préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, et encore plus
préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :3.
Selon un autre aspect, la présente invention a également pour objet une
trousse pour la
mise en oeuvre d'une méthode de la sélection de composés aptes à diminuer la
sensibilisation selon la présente invention, ladite trousse comprenant au
moins un
polypeptide comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1,
2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 et des dérivés de celles-ci,
et au moins un
composé identifié comme sensibilisant.
De préférence, le composé identifié comme sensibilisant est choisi parmi la
diphénylcyclopropénone, le lauryl gallate, la 3-3-dimethylaminopropylamine,
l'aldéhyde
cinnamique, le citral, la 1,4-hydroquinone, le glutaraldéhyde, la 1,2-
Benzisothiazolin-3-
one, la phénylacetaldéhyde et le lilial, préferentiellement parmi la
diphénylcyclopropénone, le lauryl gallate, la 1,4-hydroquinone et le
glutaraldéhyde, et de
manière particulièrement préférée est la diphénylcyclopropénone.
De préférence, ledit polypeptide isolé comprend une séquence choisie parmi les
séquences
SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 et des dérivés de
celles-ci,
préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, et encore plus
préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :3.
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Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'un
polypeptide
comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17 et des dérivés de celles-ci, pour
l'évaluation in vitro du
potentiel sensibilisant d'un composé test.
De préférence, ledit polypeptide isolé comprend une séquence choisie parmi les
séquences
SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13 et des dérivés de
celles-ci,
préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, et encore plus
préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :3.
Exemples
Exemple 1
Un test avec 0.5mM de polypeptide et 5 mM de composé test a été réalisé dans
les
conditions suivantes :
Le mélange réactionnel contenant 40 L de solution peptidique (solution mère à
1.25mM dans un tampon acétate d'ammonium à 100mM à pH 10,2 et le polypeptide
de
séquence SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO : 7 dans laquelle Xl, X2, X3 et X4
représentent
chacun une lysine, ou SEQ ID NO : 8 dans laquelle Xl, X2, X3 et X4
représentent
chacun une lysine), 35 L de solution tampon acétate d'ammonium à 100mM, à pH
10,2, 20 L d'acétonitrile et 5 L de solution à tester (solution mère à 100mM
dans de
l'acétonitrile ou un mélange 50% acétonitrile 50% DMSO) a été préparé puis mis
sous
agitation.
La séquence SEQ ID NO :18, qui n'est pas un dérivé de lipocalines, a servi de
contrôle
positif. Cette séquence correspond à la séquence suivante :
Ac-RFAAKAA-NH2 (SEQ ID NO :18)
Le mélange réactionnel a ensuite été mis à incuber à 30 C pendant 4h et dans
l'obscurité.
Une analyse par HPLC a ensuite été réalisée à un gradient de 10% à 45% de
tampon B
(acétonitrile + 0.08% de acide trifluoroacetique (TFA)) en 20 min (tampon A :
eau +
0.1% de TFA), débit 1 ml/min. La détection a été réalisée sous UV à 230 nm.
Le contrôle sans allergène est constitué de 40 L de solution tampon.
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Les réactifs de synthèse (Fmoc-acides aminés, résine de synthèse) ont été
obtenus chez
IRIS BIOTECH (Allemagne), les solvants organiques ont été obtenus chez
SDS/CARLO ERBA (France) et l'acétonitrile a été obtenu chez FISHER BIOBLOCK
(France).
Les résultats sont présentés dans le tableau 1.
Tableau 1
SEQ ID NO: SEQ ID NO:
7, dans 8, dans
laquelle Xl, laquelle Xl,
de fixation SEQ ID NO: X2, X3 et X4 X2, X3 et X4
18
représentent représentent
chacun une chaucn une
lysine lysine
LG (lauryl gallate) 62% 100% 63%
CA (aldéhyde cinnamique) 17% 100% 30%
Cbz (contrôle négatif) 0% 0% 0%
Des résultats similaires ont été observés lorsque dans la séquence SEQ ID NO
:7 et dans
la séquence SEQ ID NO :8, Xl, X2, X3 et X4 sont indépendamment choisis parmi
la
lysine, l'omithine, le diaminobutyrate ou le diaminopropionate, et au moins un
parmi
Xl, X2, X3 et X4 n'est pas de la lysine.
On observe un pourcentage élevé de fixation du lauryl gallate qui possède un
pouvoir
sensibilisant fort pour les 3 séquences étudiées, un pourcentage élevé de
fixation de
l'aldéhyde cinnamique, qui possède un pouvoir sensibilisant modéré, pour la
séquence
SEQ ID NO : 7 et modéré pour les séquences SEQ ID NO : 8 et SEQ ID NO : 18.
Exemple 2
Un test avec 0.5mM de polypeptide de séquence SEQ ID NO : 29 et 5 mM de
composé
test a été réalisé selon le même protocole que celui décrit pour l'exemple 1.
La séquence SEQ ID NO :19, qui n'est pas un dérivé de lipocalines, a servi de
contrôle
positif. Cette séquence correspond à la séquence suivante :
Ac-RFAACAA-NH2 (SEQ ID NO: 19)
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Le tampon utilisé était le TRIS-HCI à 1 OOmM à pH8.3.
Tableau 2
de fixation SEQ ID NO : 19
DPCP 96%
LG 100%
3-DMAPA 25%
CA n/a
Cal 70%
Cbz (contrôle
0%
négatif)
Exemple 3
Un test avec deux fois 0.5mM de polypeptide de séquence SEQ ID NO : 19 et SEQ
ID
NO : 8, dans laquelle Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun une lysine, et 5 mM
de
composé test, a été réalisé selon le même protocole que celui décrit pour
l'exemple 1.
Le tampon utilisé était le TRIS-HCI à l OOmM à pH8.3, pH 9.2 et pH8.8.
Les résultats sont présentés dans le tableau 3.
Tableau 3
pH 8.3 pH 9.2 pH 8.8
SEQ ID SEQ ID SEQ ID
NO : 8, NO : 8, NO : 8
dans dans dans
SEQ ID laquelle Xl, SEQ laquelle Xl, SEQ ID laquelle Xl,
NO : 19 X2, X3 et ID NO X2, X3 et NO : 19 X2, X3 et
X4 :19 X4 X4
représentent représentent représentent
chacun une chacun une chacun une
lysine lysine lysine
HQ 100% 100% n/a Fixation n/a 100%
GA 22% 50% 33% 50% Fixation 100%
Ben Fixation 100% n/a 0% Fixation 100%
PA 100% Fixation 86% 21% n/a 0%
Li 36% 0% 0% n/a n/a n/a
LA
(contrôle 0% 0% 0% 0% 0% 0%
négatif)
CA 02760685 2011-10-31
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Le terme fixation indique qu'une fixation existe, mais que celle-ci n'est
pas quantifiable.
n/a : fixation non déterminable à un temps de rétention identique.
On observe que de meilleurs résultats sont obtenus à un pH de 8.3.
5 Des résultats similaires ont été observés lorsque dans la séquence SEQ ID NO
:8, Xl,
X2, X3 et X4 sont indépendamment choisis parmi la lysine, l'omithine, le
diaminobutyrate ou le diaminopropionate, et au moins un parmi Xl, X2, X3 et X4
n'est
pas de la lysine.
10 Exemple 4
Un test avec deux fois 0.5mM de polypeptide de séquence SEQ ID NO : 19 et SEQ
ID
NO : 8, dans laquelle Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun une lysine, et 5 mM
de
composé test, a été réalisé selon le même protocole que celui décrit pour
l'exemple 1.
Le tampon utilisé était le TRIS-HC1 à 100mM.
15 Les résultats sont présentés dans le tableau 4.
Tableau 4
SEQ ID NO: 8 dans
% de fixation (moyenne) SEQ ID NO : 19 laquelle Xl, X2, X3 et X4
représentent chacun une
lysine
HQ 90% 100%
GA 33% 50%
Ben 90% n/a
PA 81% Fixation
Li 18% 0%
LA (contrôle négatif) 0% 0%
DPCP 100% n/a
LG 100% 62%
DMAPA 15% 6%
CA n/a 30%
Cal 46% 70%
Cbz (contrôle négatif) 0% 0%
Des résultats similaires ont été observés lorsque dans la séquence SEQ ID NO
:8, Xl,
20 X2, X3 et X4 sont indépendamment choisis parmi la lysine, l'omithine, le
diaminobutyrate ou le diaminopropionate, et au moins un parmi Xl, X2, X3 et X4
n'est
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21
pas de la lysine.
Exemple 5
Un test avec deux fois 0.5mM de polypeptides de séquences SEQ ID NO : 19, SEQ
ID
NO :1, dans laquelle Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun une lysine, et
présentant un
groupement NH2 à son extrémité C-Terminale et SEQ ID NO : 8 dans laquelle Xl,
X2,
X3 et X4 représentent chacun une lysine, et 5 mM de composé test, a été
réalisé selon
le même protocole que celui décrit pour l'exemple 1.
Le tampon utilisé était le TRIS-HC1 à 100mM.
Les résultats sont présentés dans le tableau 4.
Tableau 5
SEQ ID NO: 1,
dans laquelle Xl,
X2, X3 et X4
SEQ ID NO : 8
représentent
dans laquelle Xl,
de fixation SEQ ID NO : 19 X2, X3 et X4 chacun une lysine,
et présentant un
représentent
groupement NH2 à
chacun une lysine
son extrémité C-
Terminale.
HQ 90% 100% 82.5%
GA 33% 50% 83%
Ben 90% n/a n/a
PA 81% Fixation 54%
Li 18% 0% 12%
LA (contrôle 0% 0%
1%
négatif)
DPCP 100% n/a 83.5%
LG 100% 62% 41.5%
DMAPA 15% 6% 3%
CA n/a 30% n/a
Cal 46% 70% 64%
Cbz (contrôle 0% 0%
7.5%
négatif)
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22
Des résultats similaires ont été observés lorsque dans la séquence SEQ ID NO
:1 ou
dans la séquence SEQ ID NO :8, Xl, X2, X3 et X4 sont indépendamment choisis
parmi
la lysine, l'ornithine, le diaminobutyrate ou le diaminopropionate, et au
moins un parmi
Xl, X2, X3 et X4 n'est pas de la lysine.
A noter dans le cas des tests de SEQ ID NO : 1, le signal a été perturbé,
empêchant des
mesures supérieures à 82-83% de fixation. Ces valeurs représentent par
conséquent un
minima.
Lors d'une série de mesure réalisée avec la séquence SEQ ID NO : 1, le lauryl
gallate et
le phénylacetaldéhyde ont très fortement précipités, expliquant ainsi les
résultats
moyens obtenus.
Une coélution du polypeptide avec les allergènes Cinnamic aldehyde et 1,2-
Benzisothiazolin-3-one a été observée.
Les résultats montrent que le polypeptide de séquence SEQ ID NO : 1 permet
d'obtenir
des résultats similaires à l'emploi des 2 polypeptides de séquence SEQ ID NO :
19 et
SEQ ID NO : 8, tout en présentant les avantages suivants :
- peptide court, 11 résidus, synthèse et purification sans difficultés
- faible dimérisation
- excellente solubilité, aisé à manipuler (peu électrostatique)
- test et conditions uniques
- permet de détecter à la fois les allergènes fixés par la cystéine et ceux
fixés par la
lysine.
