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CA 02766762 2011-12-23
WO 2011/001052
PCT/FR2010/050986
1
NOUVEAUX CONJUGUES, LEUR PREPARATION ET LEUR APPLICATION EN
THERAPEUTIQUE
La présente invention se rapporte à des conjugués de cryptophycines, les
compositions les
contenant et leur application thérapeutique, notamment comme anticancéreux.
L'invention se
rapporte aussi au procédé de préparation de ces composés ainsi qu'aux dérivés
de
cryptophycines eux-mêmes.
[Domaine technique]
Les cryptophycines sont des métabolites secondaires appartenant à la classe
des macrocycles
depsipeptidiques produits par les cyanobactéries du genre Nostoc. Leur nom se
réfère au fait
qu'elles sont hautement cytotoxiques vis-à-vis des levures du genre
cryptococcus. Le premier
représentant de cette classe de molécules, la cryptophycine-1 (C-1), a été
isolé en 1990 de
cyanobacterium Nostoc sp (ATCC 53789) (voir EifIler S., et al., Synthesis
2006, 22, 3747-3789).
La structure, la formule générale ainsi que la numérotation des atomes de
carbone de ces
composés, telle que décrite dans WO 98/08505, sont rappelées ci-dessous :
R1 R3 R5
R4 0
Ar,---17 16 -'114 lyR14
R6
3 R50 R3
R9
Rio
R7 R8 H
Les cryptophycines C-1 et C-52, qui se caractérisent par une fonction époxyde
représentée ci-
dessous, ont des propriétés anticancéreuses. Des essais cliniques de phase Il
dans le cancer du
poumon ont été conduits avec C-52 (LY 355073) : voir Edelman M.J., et al.,
Lung Cancer 2003,
39, 197-199; Sessa C., et al., Eur.J.Cancer 2002, 38, 2388-96. La
cryptophycine C-55,
prodrogue de C-52, se caractérise quant à elle par une fonction chlorhydrine
en lieu et place de
la fonction époxyde (Bionpally R.R., et al., Cancer Chemother Pharmacol 2003,
52, 25-33). C-55
s'est avérée très active mais n'est pas stable en solution. Des dérivés de
type glycinate de
chlorhydrine tel que le composé C-55 Gly ont également été décrits pour gagner
en stabilité
(Liang J., et al., Investigational New Drugs 2005, 23, 213-224).
=
õo
o 0 HN ,C1 O HN CI
0 0 -
N 0 OMe OMe
H H
Cl C52
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WO 2011/001052 PCT/FR2010/050986
2
,o
le OH O HN xy, Cl OGIY 0 HN Cl
0-v 0 0
I\10 >f
'OMe OMe
H H
C55 C55-gly
[Problème technique]
La chimie des conjugués est connue depuis de nombreuses années et a été
appliquée à
plusieurs familles de cytotoxiques comme par exemple les maytansindides (WO
04103272), les
taxanes (WO 06061258), les tomaymycines (WO 09016516), les leptomycines (WO
07144709),
le CC-1065 et ses analogues (WO 2007102069); voir aussi à propos des
conjugués, Monneret
C., et al., Bulletin du Cancer. 2000, 87(11), 829-38; Ricart A.D., et al.,
Nature Clinical Practice
Oncology 2007, 4, 245-255. Cependant, elle n'a pas été appliquée aux dérivés
de cryptophycine
conjugués à des anticorps ou à d'autres agents de ciblage.
Le problème technique qu'entend résoudre la présente invention est de proposer
de nouveaux
conjugués à base de dérivés de cryptophycine, ainsi que de nouveaux dérivés de
cryptophycine
aptes à être conjugués.
[Art antérieur]
EP 0830136 et WO 98/08505 décrivent des dérivés de cryptophycines mais ne
décrivent pas de
conjugués de cryptophycines. WO 98/08505 décrit des dérivés de cryptophycines
de formule
R1 R3 R5
Ar 19 õ 17 I 16 114
R14
R6
3R0 R11 R30
yO
R9
Ri 7 a H
(A) : R R
(A) dans laquelle Ar peut représenter un groupe Ar' de
R"
formule : R54 R55 dans laquelle R64 représente H, un groupe (C1-C6)alkyle,
(Cr
C6)a
" , aryle, phényle, hétérocycloalkyle, un atome d'halogène, C00R57, PO3H,
S031-1, S02R58, NR59R60, NHOR61, NI-10R61', CN, NO2, OR62, CH
(Ci-
/ \
NX- N-R111
\ /
C6)alkYle0R100,
______________________________________________________________ , SR63 ; R66 et
R66 représentent H, un groupe (C1-C6)alkyle,
e571:.1D, aryle, phényle, hétérocycloalkyle, un atome d'halogène, C00R57,
PO3H, SO3H,
S02R58, NR59R60, NHOR61, NI-ICHR61', CN, NO2, OR62, 1\112,
Ci-C6 alk le0Rioo Ci-C6 alk leNR59R6o. WO 98/08505 décrit notamment les
composés
suivants :
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3
* o
el' ? ''''';,µ 1
H
pel0 re:CL0Ime
/ \ H
(ex.34)
cl
o
0 OH O HN a
0 /
0,7 0
NHBoc
01,.NO OMe
H
(composé 24, schéma 4)
=
,...- 0
(composé 33, schéma 5) 1N1 * .
ci
c, ----g-
..õ.0)1.)C[siir0 OMe
io .. 0
1
o N'''''Irc 1111 o 8 , HMy. dl a
H
o
..,....0)1.7C[Ii.0 niell OMe
(ex.42)
V
..--- 0
L 1
0 NI(C) 11101 HOA,
0
H
0
......0)...?CNI*0 OMe
H
(ex.43)
...,_ ,...
>01rN
0
1-1,)iro 1101 o 3 HN,y Cl
,,..
0
0 0
.........0)..--,C il ..0 el OMe
(ex.47)
V
¨ =
>r Y11,)(1r.= *Hoc
0 H N y. CI
0 0
OMe
H
(ex.48)
>LoXN--- r&I =
... 0
I
LN W 0 ô HN,I, Cl
,.,.,0''I)CN-.-.0 = OMe
H
(ex.74)
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WO 2011/001052
PCT/FR2010/050986
4
=
,...-= 0
à
L IN M I. 0y3 HN
1,..= CI
0 H
X C)...12CNO 11111
H OMe
(ex.77)
qui se caractérisent pas le groupe terminal ¨NHC(=0)0t-Bu. WO 98/08505 ne
précise pas que
ces composés sont aptes ou destinés à être conjugués.
-- US 2007/0213511 décrit des immunoconjugués de calichéamicine. Parmi ceux-
ci, mention est
faite du MYLOTARG (ou CMA-676) qui est un immunoconjugué de calichéamicine
utilisé dans
le traitement de l'AML (anti-CD33-calichéamicine). Voir aussi à propos des
conjugués : WO
2006/042240.
-- Al-awar R.S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46(14), 2985-3007 et Al-awar R.S.,
et al., Mol.Cancer
Ther. 2004, 3(9), 1061-1067 décrivent des dérivés de cryptophycine, ainsi que
leurs évaluations
in vivo.
WO 08010101 décrit un anticorps monoclonal anti-EphA2 ainsi que les conjugués
-- correspondants comprenant une ou plusieurs molécules d'un composé
cytotoxique attachée(s) à
l'anticorps monoclonal. WO 08047242 décrit un anticorps monoclonal anti-CD38
ainsi que les
conjugués correspondants comprenant une ou plusieurs molécules d'un composé
cytotoxique
attachée(s) à l'anticorps monoclonal. Le composé cytotoxique peut être choisi
parmi les
maytansinoïdes, les taxanes, les tomaymycines, les leptomycines, le CC-1065 et
ses analogues.
WO 2009/126934 décrit des anticorps anti-CD70 et leurs conjugués avec des
composés
cytotoxiques ; la cryptophycine est citée parmi les cytotoxiques. WO
2009/134976 décrit des
conjugués avec un taux de subsitution optimisé pour délivrer la quantité
nécessaire de
cytotoxique dans la cellule ; la cryptophycine est citée parmi les
cytotoxiques.
WO 2005/116255 décrit des conjugués d'aptamères et d'un cytotoxique pouvant
être une
cryptophycine (voir [0037] et Tableau 2), le linker pouvant comprendre une
chaîne PEG ([0038]).
Plus particulièrement, la cryptophycine Cryp-N H2 est décrite :
. .,.
-----
..----
1 0H 1
0 0,-õ,......, .
.,,...Y.......r d
0 01.'',..0 i.... m."'N, OCH3
He Cli
FIC%
-- ainsi que ses conjugués d'aptamères avec les linkers suivants : NHS-PEG-
erythritol, pNP-PEG-
erythritol, NHS-PEG-octaPEG, pNP-PEG-octaPEG et PEG-comb (Tableaux 3 et 4). La
nature de
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l'enchaînement sur le cycle phényle (-CH2O-C(=0)-CMe2-CH2NH-...) est différent
de ce qui est
envisagé dans la présente invention. WO 2006/096754 décrit également des
conjugués
d'aptamères et d'un cytotoxique qui peut être aussi une cryptophycine.
5 WO 2009/002993 décrit des conjugués de cytotoxique de formule B-L-A
comprenant des linkers
hydrophiles, par exemple le linker de formule :
H H
S*
0 CO2H
Le cytotoxique peut être une cryptophycine (page 46) mais sans préciser le
point d'attachement
du linker. Un exemple de conjugué est le ECO262 :
0
CO,H 00,H 0 0 0 e
Y C. "C50 HNI,h 46 Cl
ç.02H H ri? ery JI( P.._
0
-N 0)5ÇM 0
Ohlç4
41) 0 e ca 0 i.1108.0M
H-N N N .00H 'OH. "10H
OH OH OH
dont le linker et le point d'ancrage sont différents de ce qui est envisagé
dans la présente
invention.
[Sommaire]
L'invention est relative à un agent de ciblage auquel est attaché au moins un
dérivé de
cryptophycine de formule (I) :
R, R3 R5
R2 R4
0
(30 0 HN
R11 R9 R15
R, R6
(I)
dans laquelle :
= R1 représente un atome d'halogène et R2 représente un groupe ¨OH, un
groupe acyle
dérivé d'un acide aminé AA ou un groupe (C1-C4)alcanoyloxy ;
ou bien R1 et R2 forment ensemble un motif époxyde ;
= AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel ;
= R3 représente un groupe (C1-C6)alkyle ;
= R4 et R5 représentent tous deux H ou forment ensemble une double liaison
CH=CH entre
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5a
C13 et C14 ;
= R6 et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (Ci-
C6)alkyle ;
" R8 et R6 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (Ci-
C6)alkyle ;
= Rio représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi : H,
un groupe -OH,
(C1-C4)alcoxy, un atome d'halogène ou bien un groupe -NH2, -NH(Ci-C6)alkyle ou
-N(C1-
C6)alkyle2 ;
= R11 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou
un groupe (Ci-
C4)alkyle ;
l'agent de ciblage et le dérivé de cryptophycine étant attachés de façon
covalente, l'attachement
se situant en position ortho (o), méta (m) ou para (p) du noyau phényle
porteur du motif CRi.
L'invention concerne plus particulièrement un dérivé de cryptophycine de
formule (Il):
R,
R2 R,
0
L ________________________
oo 0 HN
R1, Rõ
R, H
R, R, (Il)
dans laquelle :
= R1 et R2 forment ensemble un motif époxyde ;
= R3 représente un groupe (C1-C6)alkyle ;
= R4 et R5 représentent tous deux H ou forment ensemble une double liaison
CH=CH
entre C13 et C14;
= R6 et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (Cl-
C6)alkyle ;
= R9 et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C-i-
C6)alkyle ;
= R10 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi : H,
-OH,
(Cl-C4)alcoxy, un atome d'halogène, ¨NH2, -NH(Ci-C6)alkyle ou -N(Ci-C6)alkyle2
;
= R11 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou
un groupe
(C1-C4)alkyle ;
= L représente un linker en position ortho (o), méta (m) ou para (p) du
noyau phényle
choisi parmi :
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,
5b
0 R
1312
zase...)L.1\11 R ZaSy'N'
ZaSk.,.1.11..b,...jr. . ZaSY'=--"yN,õJ
Lr\i"- = zaS--i'-' = ZaS 2 t41')e . /=,....N.,3( . 0 =
,
1312
v r-- ZaS, 1312
N---N,I,
R.,
ZaS N-N.....4.-
¨,...-N..._õ,1
= I =
E R11---,0'" =.`0''.1-
0 ZaS.4- ZaS, RbZb y,
N e"....1 RbZby..--....,-.N.-....1
ZaS
= .
I \ = 0 1,...,N..õ,-
. 0
,
0 0F.12
1312
RbZb y-,11-1\11 RbZbN,1
..4-
O 1-..._õNõ..i- . 0 =
0 =
1 y
0
1--N--N i R12
O 1312 Rbzby.-
..,zo,..,-Ø--,o,-.N.-..) Rb0-1L-"Sri'N"-..) RbZby^s,\
N..
Rb
N) 0 1.,.....N..Je= .
1...,N ....,..- . 0 =
5 =
,
,
0
v I F.12 0
RbZb.,SrN..--)
0 =
RbZb S
RbZb)(----S,A, .
A = Lõ,,N,t .
' 0
0 0 0
/312 RbZb
RbZb.y
) .s....V,, NrY"..\--N"ir
H t.....õ. N Se .
0 =
RbZb 0
.õ.......,
0"-- \,...0 RbZb
0
,....., 0 0-\_0
RbZb-4\___\,_
NrN R12 ,---
,
11õ... 1õ,.."A.4.. . N"
1312 0
1312 0 H
RbZb)(--SSY...."'N'lf Jr-
O 0 0
= 0 =
5
O 0 '
0 H
RbZ19)0 '-'0----- --r ,---1- RbZID)10---
CIOC)(N4-
0 0 0 =
,
0 0 0
RbZ19)1-0--'-' `-"--'0"'"'" ''''N'e-
0
0 = R12RbZb
. .
=
s 1
0
I
0 0 'firui 0,)L elle
RbZb). N
N : N Wi
H
O LN5)LNH2
= H
= ou
1
0
an 0 N.je-
MF.
O H0 U H
LNANH2
H .
.
5
= R12 représentant H ou un groupe (Ci-C6)alkyle;
= Za représentant H ou le groupe -SRa, Ra représentant un groupe (Ci-
C6)alkyle ;
= Zb représentant -0- ; et
7----
= Rb représentant -(Ci-C6)alkyle, -CH2CH=CH2 ou ¨N\_____.
Y0
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5c
Selon un aspect optionnel, dans la formule (II), L représente un linker en
position para du noyau
phényle.
Selon un autre aspect optionnel, dans la formule (II), Rio représente au moins
un substituant du
noyau phényle choisi parmi : H, un groupe OH, (Ci-C4)alcoxy, ou un atome
d'halogène.
Selon un autre aspect optionnel, dans la formule (II), R12 représente H. Selon
un autre aspect
optionnel, dans la formule (II), R12 représente (Ci-C6)alkyle. Plus
particulièrement, R12 peut
représenter le groupe méthyle.
Selon un autre aspect optionnel, dans la formule (II), Za représente H ou¨SMe.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un dérivé de cryptophycine ayant
l'une quelconque
des formules suivantes:
= =
o o
,.
L I L 1 -
HN.,.., CI ,.., 0,0 HN,,, Cl
----- se"(jY*NO la ,-- N 0 OMe H
OMe
0 .. v-,
== -
L s L I
o.,c5 0 HiµJ.õ,, el Cl 0,.A 0 HN,, õ, Cl
7C0j5CprO OMe 0.----,.o..1õ-----,
N 0 OMe
H
Cl CI
\ \
Li HO L __
Oyti 0 HN .. Cl7-- OyU 0 HM Cl
0)
Hi OMe .....0 N 0
H OMe
ci ci
0 0
L 1 L I
,..,. 0(.5 CI -. 0-(5 0 HN,,, go Cl
Gly-O Gly-O
...--\
0 .
,-- N 0 OMe 0 N 0 OMe
H
Gly=glycinate ou
Gly=glycinate
où L est tel que défini précédemment.
Selon un autre aspect optionnel, le dérivé de cryptophycine de formule (II)
peut être choisi parmi
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= ..
5d
les composés suivants :
=
o ZaS yj,
L.,2\I 11111 0 6 HNah ci
L,,N 0 0 HN.y.= dl Cl
Vil
=
= ,-- 0
... 0
r', gb 0 é,o
P *O :
o ô "NI-- e CI
zas) HN,I.::, * Cl
ZaS
--4-
' 017.--'N".-0 ? C))CF1 5'
.
ZaS.y.----,,N,-,1 * / 0
0 O .4,.. CI = .., 0
oyo 0 HN ..,.= CI
1. i. ZaSIL-r-'0 ''''''0"''')1 1 = ,
? ej)111 I
0
.--"" 0
\
i 1 '
Elt,,,,,.Ø,,,,,õ0,----,0,,,,,,_,N" 00 HN 0 CI
ZaS --...,... =0 X'012ÇiE\r0
=
?
= =
0 RbZby^,N,--.1 eh -,0
HN
ZaS 5 0,0...2c..11.0 * Ci: 0 L.-N *II 0y0 HN
y i Cl
0
C))C111 ?
=
.--' 0
RbZby.õ0,---,0,-,,O,..---.0,,,..õNH * 0 O HN,rõ, *ie Cl
0
I
=
I 5 ..." 0
0 iii CI
O 11'40 "I y
=
N,-,1 ob . --- 0
O L.,..,,N 0y0 0 HNy, i CI
(C:')C11() ?
O 0
=
,v 0
H 51 0y0 o HNCl
?
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. ,
5e
..0
.-- 0
H
* 0 00iyiNxn * CI
0 0
?
0
=
RbZb / 0
N----,-.m
\ N..õ,..-----õ,,,,,----' 0 0 0 HN ,, dl, CI
õ,....,
% H
I
RbZb ,
0 \----\
CY"-\---0
\----\
=
N--,N 1 '--. / 0
0y0 ill Cl
e".0-57'''0 0
', H
I
0
=
---- 0
0 0 HN,,, dli Cl
____O--117ftir0 lel ?
0
-,-. -
H 1
RbZb
)11 N *0y0 HN ,, Cl
0 0
H H
0 õ..-- L'0[,11I 0
ilb
I
=--.N1NH2
H
=
..- 0
H
jt.....,,,..), X( ut, dl 0 * :3; 0 0 HNI, = Cl
RbZb N : N 0
H H
i
- riot
-i.õ
.2
,
OU
: -- o
HN
0
Za, Zb et Rb étant tels que définis ci-dessus.
L'invention concerne également un dérivé de cryptophycine de formule (III) :
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5f
Ri R2 R, R,
R,
0
G ____________________________
00 0 HN
Rõ
Rõ
Re R7 Re N
(III)
dans laquelle les groupes R1 à R11 ont les mêmes significations qu'indiqués ci-
dessus pour la
formule (II) et G représente un groupe -(CH2),-,Y, se situant en position
ortho (o), méta (m) ou
para (p) du noyau phényle porteur du motif CRI, n étant un entier allant de 1
à 6 et Y désignant
-N3; -NR12-CH2-CECH dans lequel R12 représente H ou un groupe (Ci-C6)alkyle ; -
0Ms ;
0 R13
-0C(=0)-0-(4-nitrophényle), ¨N\ ou --\-\
ou I , R13 représentant H ou (Ci-C6)alkyle.
/T
0 0
Selon un aspect optionnel, dans la formule (III), G est en position para du
noyau phényle
porteur du motif CRi.
Selon un autre aspect optionnel, dans la formule (III), R13 représente H ou le
groupe méthyle.
Selon un autre aspect optionnel, dans la formule (III), Y représente -Na; -
NR12-CH2-CECH dans
lequel R12 représente H ou un groupe (Cl-C6)alkyle ; -0Ms ou -0C(=0)-0-(4-
nitrophényle).
L'invention concerne également un dérivé de cryptophycine tel que défini ci-
dessus destiné à
être conjugué à un agent de ciblage.
L'invention concerne de plus, un dérivé de cryptophycine de formule (III) tel
que défini ci-dessus
Ris
(
avec G= -(CH2),Y avec Y= -N3, maléimido, ou
ou I, R13 étant tel que défini ci-
0
dessus, destiné à être conjugué à un agent de ciblage.
Selon un aspect optionnel, l'agent de ciblage est un ligand, une protéine, un
anticorps, un
fragment de protéine ou d'anticorps, un peptide, un oligonucléotide ou un
oligosaccharide.
Selon un aspect particulier, l'anticorps peut être un anticorps monoclonal.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'un agent de ciblage
auquel est
attaché au moins un dérivé de cryptophycine, dénoté conjugué, consistant à:
(i) mettre en contact et laisser réagir une solution aqueuse d'un agent de
ciblage éventuellement
tamponnée et une solution d'un dérivé de cryptophycine tel que défini ci-
dessus;
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5g
(ii) puis à éventuellement séparer le conjugué formé à l'étape (i) du dérivé
de cryptophycine
et/ou de l'agent de ciblage n'ayant pas réagi et/ou des agrégats qui se
seraient formés.
L'invention concerne également un conjugué obtenu par le procédé tel que
défini
précédemment.
Selon un aspect optionnel, le conjugué est caractérisé par un DAR déterminé à
partir de la
déconvolution du spectre HRMS supérieur à 1, particulièrement compris entre 2
et 10 et plus
particulièrement compris entre 2 et 7.
Selon un autre aspect optionnel, le conjugué est caractérisé par un DAR
déterminé à l'aide d'un
spectrophotomètre UV supérieur à 0,5, de préférence supérieur à 1,
particulièrement compris
entre 1 et 10 et plus particulièmenet entre 2 et 7, le DAR étant calculé par
l'équation :
DAR = CD/ CA
dans laquelle :
CD = REA X1 X A22) (EA X2 X AM)] / RED 22 X CA 1) (EA 22 X CD 2.1)]
CA = [Ax1 - (CD X CD X1)] !EA1
et
Am et Ax2 désignant respectivement les absorbances de la solution de conjugué
respectivement aux longueurs d'onde X1 et X2 ;
CD xi et CD x2 désignant respectivement les coefficients d'absorption molaires
du dérivé de
cryptophycine avant conjugaison à deux longueurs d'onde X1 et X2, coefficients
mesurés sur les composés de formule (Il) de type -SZa avec Za = -SMe ou de
type -
C(=0)-ZbRb avec ZbRb = -0Me ou -0CFi2-CH=C1-12 ;
CA X1 et CA X2 désignant respectivement les coefficients d'absorption molaires
de l'anticorps
nu avant conjugaison aux deux longueurs d'onde 11 et 12.
Selon un aspect optionnel, X1= 280 nm et X2 est choisie dans la gamme de
longueurs d'onde
spécifiques 246 nm - 252 nm.
L'invention concerne également l'utilisation d'un dérivé de cryptophycine tel
que défini
précédemment pour la préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au
moins un dudit
dérivé de cryptophycine.
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=
5h
L'invention concerne également l'utilisation d'un dérivé de cryptophycine de
formule (III) :
R R
1 R, 3 R4 5 0
G ____________________________
0 HN
Rõ R9 J] le Rie
N 0
Ri, R7 R6 H
(III)
dans laquelle :
G représente un groupe -CH=CH2 ou -(CH2)nY, se situant en position ortho (o),
méta (m)
ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CRi;
Y représente ¨OH; -Cl; -N3; -NH2 ; -SH ; -COOH ; -NR12-CH2-CF-CH dans lequel
R12
représente H ou un groupe (C1-C6)alkyle; -OGP dans lequel GP désigne un groupe
partant ; -0C(=0)-0-(4-nitrophényle) ; ou -maléimido ;
les groupes Ri à R11 ayant les mêmes significations que pour la formule (II)
mentionnées ci-dessus et n étant un entier allant de 1 à 6;
pour la préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dudit
dérivé de
cryptophycine.
L'invention concerne également l'utilisation d'un dérivé de cryptophycine de
formule :
0
R4 R36 = R, R4R5
11111 0
Rõ dît.
NH an (ci-)n-ss(cH2 n R9 RI.
al
0 NULCI-R9 " ,, 0 N 0
H R, R, o Io R7 Rs H
les groupes R3 à R5 et R7 à R11 ayant les mêmes significations que pour la
formule (II)
mentionnées ci-dessus et n étant un entier allant de 1 à 6,
pour la préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dudit
dérivé de
cryptophycine.
L'invention concerne également l'utilisation d'un dérivé de cryptophycine
choisi parmi l'un
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. .
5'
quelconque des composés suivants :
=
-- 0 I -- 0 ' -- 0
HO * 0 O HN,r, di CI CI * 0 O0 HN,r, dm CI ZaS * 0 O0 HN),,, il CI
ON-..0 le' 9 .0-jiy-S-0 111fre 0 ON.-0 'Ille 9
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= = =
..-= 0 -- 0 ----
0
N, * .,?Oo.V%.1,,,c) . CI H2N 5 0 00 HN),,, CI ZaS * 0 O HN,r, iii
Cl
Ille y
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0
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* CI ZaS
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0 0
==
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-- 0 ZaSy----N.--)
ZaS
ZaS-'Ni * 0 O HN,r, di CI /\ 1-,..,N = 0 O
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0 O HN ,., CI 0 V I =
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H 0 ,-= H
9 0
LN5.3NH2 = H
- H
I
H
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. .
5j
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Rboy-s.-.) el. , 0 7 0
H
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H
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0 * 0 6 HN1µ......c.r CI
Rbolr,,o,......-Ø,,..0,....--, H N * 0 0 0 FfNsryµr.. Cl
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CCir'N-'0 11'.11.. 0
H
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70 70
0
-, * ,,, 0 HN1 * Cl* 0 iii,
CI
Rb0 0 0 Rb00 "*"....0 '
, -,,..6o FINI
0)1Y. =N ? ou o'lL/rIi o Ile o
' H I
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5k
Za et Rb étant tels que définis pour la formule (Il) ci-dessus, pour la
préparation d'un agent de
ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine.
L'invention concerne également un dérivé de cryptophycine de formule :
0
n pp R,
¨ 0
NH 9 oyoR
(CH 2)n-SS(CH2 n R 9 *1
0 0 Rio HN
g
0 N---)('-'0 g 0"' X.--S 0
H R0 R, ¨10 ..10 R, R, H
les groupes R3 à R5 et R7 à Ru ayant les mêmes significations que pour la
formule (Il)
mentionnées ci-dessus et n étant un entier allant de 1 à 6.
L'invention concerne également un dérivé de cryptophycine tel que défini ci-
dessus pour
utilisation en tant qu'anticancéreux.
L'invention concerne également un conjugué tel que défini ci-dessus pour
utilisation en tant
qu'anticancéreux.
L'invention concerne également l'utilisation d'un dérivé de cryptophycine tel
que défini ci-dessus
pour la préparation d'un médicament anticancéreux.
L'invention concerne également l'utilisation d'un conjugué tel que défini ci-
dessus pour la
préparation d'un médicament anticancéreux.
[Définitions]
On entend par:
= conjugué : un agent de ciblage cellulaire auquel est attaché de façon
covalente au moins
une molécule d'un composé cytotoxique ;
= agent de ciblage cellulaire (ou cell binding agent en anglais) : une
molécule ayant une
affinité pour une cible biologique : il peut s'agir par exemple d'un ligand,
d'une protéine, d'un
anticorps, plus particulièrement monoclonal, d'un fragment de protéine ou
d'anticorps, d'un
peptide, d'un oligonucléotide, d'un oligosaccharide. L'agent de ciblage a pour
fonction de
diriger le composé biologiquement actif comme un cytotoxique vers la cible
biologique. De
préférence, l'agent de ciblage n'est pas un aptamère ;
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. ,
51
= cible biologique : un antigène (ou groupe d'antigènes) localisé
préférentiellement à la
surface des cellules cancéreuses ou cellules stromales associées à cette
tumeur; ces
antigènes pouvant être par exemple, un récepteur de facteur de croissance, un
produit
d'oncogène ou de gène suppresseur de tumeur muté, une molécule liée à
l'angiogénèse,
une molécule d'adhésion ;
= linker : un ensemble d'atomes permettant d'attacher de façon covalente un
composé
cytotoxique à l'agent de ciblage ;
= groupe alkyle : un groupe hydrocarboné aliphatique saturé obtenu en
enlevant un atome
d'hydrogène d'un alcane. Le groupe alkyle peut être linéaire ou ramifié. A
titre d'exemples, on
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6
peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, iso-
butyle, tertio-butyle,
pentyle, 2,2-diméthylpropyle, hexyle ;
= groupe cycloalkyle : un groupe alkyle cyclique comprenant entre 3 et 8
atomes de carbone
engagés dans la structure cyclique. A titre d'exemples, on peut citer les
groupes cyclopropyle,
cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle ;
= groupe hétérocycloalkyle : un groupe cycloalkyle comprenant au moins un
hétéroatome (0, S,
N) engagé dans le cycle et relié aux atomes de carbone formant le cycle ;
= groupe alcoxy : un groupe -0-alkyle, où le groupe alkyle est tel que
défini ci-dessus ;
= groupe alcanoyloxy : un groupe ¨0-CO-alkyle, où le groupe alkyle est tel
que défini ci-
dessus ;
= groupe alkylène : un groupe divalent saturé de formule brute -CnH2n-,
obtenu en enlevant
deux atomes d'hydrogène d'un alcane. A titre d'exemples, on peut citer les
groupes méthylène
(-CH2-), éthylène (-CH2CH2-), propylène (-CH2CH2CH2-), butylène (-CH2CH2CH2CH2-
),
hexylène (-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-) ou les groupes ramifiés suivants
= de préférence, le groupe alkylène est de formule ¨(CH2)n-, n représentant un
nombre entier ;
= dans les plages de valeurs, les bornes sont incluses (par ex. une plage
du type n allant de
1 à 6 ou bien compris entre 1 et 6 inclut les bornes 1 et 6).
Abréviations utilisées
AcOEt : acétate d'éthyle ; ALK : groupe (C1-C12)alkylène, plus
particulièrement (C1-C6)alkylène,
plus particulièrement de la forme ¨(CH2)n- n étant un entier de 1 à 12, de
préférence de 1 à 6 ;
aq. : aqueuse ; CCM : chromatographie sur couche mince (TLC en Anglais) ; CMS
: chlorure de
R, R,
0 R, 0
,
m le RI.
R,
méthanesulfonyle ; crypto désigne le motif de formule R;"R. H
, crypto
désigne notamment l'un des dérivés de cryptophycine D1-D8 décrits plus loin ou
un dérivé de
cryptophycine d'un exemple ; Rf : facteur de rétention ; DAR: taux de
substitution (drug-antibody
ratio) ; DBU : 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ène ; DCC : N,N'-
dicyclohexylcarbodiimide ; DCM :
dichlorométhane ; DEAD : diéthylazodicarboxylate ; DIC : N,N'-
diisopropylcarbodiimide ; DIPEA :
N,N-diisopropyléthylamine ; DMA : diméthylacétamide ; DMAP : 4-
diméthylaminopyridine ; DME :
diméthoxyéthane ; DMF : diméthylformamide ; DMSO : diméthylsulfoxyde ; EEDQ :
2-éthoxy-1-
éthoxycarbony1-1,2-dihydroquinoline ; EDCI : N-(3-diméthylaminopropyI)-N'-
éthylcarbodiimide ;
EDTA : acide éthylène-diamine-tétraacétique ; éq. :
équivalent ; Fmoc :
fluorénylméthoxycarbonyl ; HOBt : 1-hydroxybenzotriazole ; HEPES : acide 4-(2-
hydroxyéthyl)-1-
pipérazineéthanesulfonique ; mCPBA : acide m-
chloroperbenzoïque ; NHS : N-
hydroxysuccinimide ; NMP : N-méthylpyrrolidinone ; FA: pression atmosphérique
; PABAC :
para-aminobenzylic alcohol carbonate ; PR: pression réduite ; SEC:
chromatographie
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7
d'exclusion stérique ; SPE : extraction sur phase solide ; TA: température
ambiante ; TBDMS :
tert-butyldiméthylsilyl ; TCEP : chlorhydrate de tris-(2-carboxyéthyl)-
phosphine ; TEA
triéthylamine ; TFA : acide trifluoroacétique ; TIFS : thisopropylsily1 ; THF
: tétrahydrofurane ; tR
temps de rétention.
[Brève description des figures]
Les Figures 1 et 2 illustrent la modification d'un groupe amino d'un agent de
ciblage par le N-
+
NH2 Cl
succinimidyl pyridyldithiopropionate (SPDP) ou bien par l'iminothiolane .
[Description détaillée de l'invention]
L'invention est relative à un agent de ciblage auquel est attaché au moins un
dérivé de
cryptophycine de formule (1) :
R R3 R,
1 R2 R4
0
o
HN =
R1,
R9';
õ R
ONC)
R8 H
R, R,
(I)
dans laquelle :
= Ri représente un atome d'halogène et R2 représente un groupe ¨OH, un
groupe acyle
dérivé d'un acide aminé AA ou un groupe (C1-C4)alcanoyloxy ;
ou bien R1 et R2 forment ensemble un motif époxyde ;
= AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel ;
= R3 représente un groupe (C1-C6)alkyle ;
- R4 et R5 représentent tous deux H ou forment ensemble une double liaison
CH=CH entre
013 et C14 ;
= R6 et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (01-
06)alkyle ;
= R8 et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-
06)alkyle;
= R10 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi : H,
un groupe -OH,
(01-C4)alcoxy, un atome d'halogène ou bien un groupe -NH2, -NH(01-C6)alkyle ou
-N(C1-
06)alkyle2 ;
= R11 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou
un groupe (Ci-
04)alkyle ;
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,
7a
l'agent de ciblage et le dérivé de cryptophycine étant attachés de façon
covalente,
l'attachement se situant en position ortho (o), méta (m) ou para (p) du noyau
phényle porteur du
motif CRi.
positions ortho (o), méta (m) ou para( p):
R, R, R,
o R, R,
0
M
P
o OO0
HN
R11 R9R 0 0 1/10 R 1 0
R, R,
R1 représente un atome d'halogène, plus particulièrement Cl. R3 représente un
groupe (Ci-
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C6)alkyle, plus particulièrement Me. R6 et R7 représentent indépendamment l'un
de l'autre H ou
un groupe (C1-C6)alkyle ; plus particulièrement ils représentent
indépendamment l'un de l'autre H
ou un groupe Me. R8 et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un
groupe (C1-
C6)alkyle ; plus particulièrement R8 représente H et R9 représente isobutyle.
R10 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H, un
groupe OH, (C1-
C4)alcoxy, un atome d'halogène. Il peut s'agir aussi d'un groupe -NH2, -NH(C1-
C6)alkyle ou -
N(C1-C6)alkyle2 tel que par exemple ¨NH2 ou ¨NMe2, de préférence en position 3
ou 4 sur le
noyau phényle. Plus particulièrement, le noyau phényle comprend deux
substituants en position
3 et 4 sur le noyau phényle. De préférence, il s'agit de 3-C1 et 4-méthoxy.
R11 représente au
moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou un groupe (C1-
C4)alkyle ; plus
particulièrement H.
Plus particulièrement, on pourra choisir l'un des substituants R1 à R11 parmi
ceux décrits dans les
exemples. Chaque substituant R1 à R11 pourra aussi adopter une des
configurations spatiales
(par ex. R ou S ou bien Z ou E) telle que décrite dans les exemples.
AA représente un acide aminé naturel ou non naturel. Il peut s'agir d'un acide
aminé la, p ou y.
On peut citer notamment les acides aminés suivants : alanine (Ala), 13-
alanine, acide 2-amino-2-
cyclohexylacétique, acide 2-amino-2-phénylacétique, arginine (Arg), acide
aspartique (Asp),
cystéine (Cys), glutamine (Gln), acide glutamique (Glu), glycine (Gly),
histidine (His), isoleucine
(11e), leucine (Leu), lysine (Lys), méthionine (Met), phénylalanine (Phe),
proline (Pro), sérine
(Ser), thréonine (Thr), tryptophane (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val), acide
raminobutyrique,
acide oc,a-diméthyl raminobutyrique, acide 13,13-diméthyl raminobutyrique,
ornithine (Orn),
citrulline (Cit) ainsi que les formes protégées desdits acides aminés (par ex.
par acétyl, formyl,
tosyl, nitro). De préférence, il s'agit d'un acide aminé naturel. Plus
particulièrement, il s'agit de la
glycine.
R1 et R2 peuvent aussi former ensemble un motif époxyde.
L'attachement entre le dérivé de cryptophycine et l'agent de ciblage est
réalisé par l'intermédiaire
d'un linker L positionné en position ortho (o), méta (m) ou para (p) du noyau
phényle porteur du
motif CRi; ainsi, le dérivé de cryptophycine apte à la conjugaison a pour
formule (11) :
R, R,
R2 R4
0
L I
0 0
0 HN
R11
R90 N 0
R7 R6
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L'attachement au niveau de l'agent de ciblage se situe à l'autre extrémité du
linker L au niveau
d'un groupe réactif présent sur l'agent de ciblage. Ainsi, L comprend au moins
un groupe
chimique réactif (GCR1) vis-à-vis d'un groupe chimique réactif (GCR2) présent
sur l'agent de
ciblage. La réaction entre GCR1 et GCR2 assure l'attachement du composé de
formule (II) sur
l'agent de ciblage par formation d'une liaison covalente. Ainsi, le dérivé de
cryptophycine de
formule (II) est apte à être conjugué à un agent de ciblage.
Les dérivés de cryptophycine de la présente invention, y compris ceux
exemplifiés, peuvent
exister à l'état de bases ou de sels d'addition à des acides, notamment des
acides
pharmaceutiquement acceptables.
A titre d'exemples de GCR1, on peut citer :
(i) le groupe réactif ¨SZa pour lequel Za représente H ou le groupe -SR. et Ra
représentant un
groupe (C1-C6)alkyle, (C3-C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-
C7)hétérocycloalkyle ;
(ii) le groupe réactif -C(=0)-ZbRb pour lequel Zb représente une liaison
simple, -0- ou -N H-, plus
particulièrement -0-, et Rb représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, (C3-
C7)cycloalkyle, aryle,
hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle ;
0
_______________________________________________________________________ N
(iii) l'un des groupes réactifs suivants : -Cl, -N3, -OH, -N H2, le groupe
réactif maléimido ou
R12
-\r'LeBr ou I
haloacétamido. 0
avec R12 représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus
particulièrement Me dans le cas des composés de formule (III) :
R1 R2 R3 R5
R4
G __________________________
0 0 HN
R11 R10
,970 N 0
R.7 R6 H (III)
0
__________________________________________________________ N R112
'InBr ou I
comprenant le groupe G= -(CH2).Y. avec Y= -Cl, -N3, -OH, -NI-12, ou.
0 avec
R12 représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement Me;
0
______________________________ N RI12
"Ir-Br ou I
(iv) le groupe réactif maléimido
ou haloacétamido. avec R12 représentant H
ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement Me.
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Plus particulièrement, -SZa peut représenter ¨SH ou ¨SS(C1-C6)alkyle,
notamment ¨SSMe, ou ¨
SS-hétéroaryle, notamment S N OU
(X1 et X2 étant définis plus bas). Plus
particulièrement, -ZbRb peut représenter -OH, -OCH3,
-OCH2CH=C1-12,
0 0
O-NN_N
¨0-N ¨0-N GI
s>õ_- M=H ou cation
¨0 411
OU OU e ou le groupe
dans lequel GI représente
5 au moins un groupe électroinductif tel que -NO2 ou -Hal, notamment -F. Il
peut s'agir par exemple
F F
¨0¨(
¨0 4.1 NO2 2
des groupes suivants, OU F F
Un autre type de groupe ¨C(=0)ZbRb est
0
0 ¨0-N
le suivant : `-'N. Les groupes réactifs ¨SH et
présentent une bonne réactivité.
Plus particulièrement, GCR1 pourra être choisi parmi l'un de ceux décrits dans
les exemples.
10 A titre d'exemple de GCR2, on peut citer les groupes e-amino des lysines
portés par les chaînes
latérales des résidus lysine qui sont présents à la surface d'un anticorps,
les groupes saccharides
de la région charnière ou les thiols de cystéines par réduction de liaisons
disulfures intra-chaînes
(Garnett M.C., et al., Advanced Drug Delivery Reviews 2001, 53, 171-216). Plus
récemment
d'autres approches ont été considérées comme l'introduction de cystéines par
mutation (Junutula
J.R., et al., Nature Biotechnology 2008, 26, 925-932; WO 09026274) ou
l'introduction d'acides
aminés non-naturels permettant d'autres types de chimie (de Graaf A.J., et
al., Bioconjugate
Chem. 2009, Publication Date (Web): February 3, 2009 (Review); D01:
10.1021/bc800294a ; WO
2006/069246 et selon Chin J.W., et al., JACS 2002, 124, 9026-9027 (technologie
ReCode )).
Ces modes d'attachement utilisés avec les anticorps sont applicables à
l'ensemble des agents de
ciblage connus en fonction de leur structure.
Il est également possible de modifier chimiquement l'agent de ciblage de façon
à introduire de
nouveaux groupes chimiques réactifs GCR2. Ainsi, il est bien connu de l'homme
du métier
comment modifier un anticorps à l'aide d'un agent de modification (voir
notamment WO
2005/077090 page 14). La modification permet d'améliorer la réaction de
conjugaison et d'utiliser
une plus grande variété de groupes GCR1.
Agents de modification permettant d'introduire des groupes disulfures
0
0
0
L'agent de modification peut être un ester activé NHS de formule
dans
laquelle R représente un groupe (C1-C6)alkyle, aryle, hétéroaryle, (C3-
C7)cycloalkyle, (C3-
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C7)hétérocycloalkyle et ALK représente un groupe (C1-C8)alkylène ; par
exemple, on peut utiliser
le N-succinimidyl pyridyldithiopropionate (SPDP) ou le N-succinimidyl
pyridyldithiobutyrate (SPDB
ou ester N-hydroxy-succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butandique) de
façon à introduire
des groupes réactifs GCR2 dithiopyridyl (voir Bourdon M.A., et al., Biochem.
J. 1978, 173, 723-
737; US 5208020) lesquels peuvent ensuite réagir avec un groupe chimique
réactif GCR1 de
type ¨SH présent sur le linker du dérivé de cryptophycine afin de former une
nouvelle liaison ¨S-
S- (voir ex.9 pour un conjugué présentant une liaison disulfure). Le groupe N-
hydroxysuccinimide
réagit préférentiellement sur les groupes amino présents sur l'anticorps de
façon à former des
liaisons amides. Un autre exemple d'agent de modification est décrit dans WO
2004/016801 de
o
x,
NO
0 Xe X a X3
, X,
formule
ou un analogue pegylé de formule
o-JNN7Lo
o
o S N
décrit dans WO 2009/134976 ou un analogue sulfonique
x,
oo
SO3H
0 S
= S N
de formule décrit dans WO 2009/134977 dans lesquelles :
¨ X3, X4, X5, X6 représentent H ou un groupe (C1-C6)alkyle,
- X1 et X2 représentent -H, -CONX8X9, -NO2, X8 et X9 représentant H ou un
groupe (C1-C8)alkyle,
- X7 représente -S03-M+ ou H ou bien un groupe ammonium quaternaire
- a désigne un entier allant de 0 à 4 et b désigne un entier allant de 0 à
2000, de préférence entre
1 et 200; a et b peuvent prendre toutes les valeurs entre respectivement 0 et
4 ou entre 0 et
2000.
Agents de modification permettant d'introduire des groupes maléimido
Un autre exemple d'agent de modification est le succinimidy1-4-(N-
maléimidométhyl)cyclohexane-
1-carboxylate (SMCC), un composé similaire décrit dans EP 0306943 ou un sulfo-
SMCC
(sulfosuccinimidyl 4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate). On peut
citer comme
0 0
ALK
O Y
autres exemples : 0 comme le 3-maléimido-propanoate de N-
succinimidyle ;
0 0 0
H 0
0
comme le 6-(3-maléimidopropionamido)hexanoate de N-succinimidyle ;
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0
b étant un nombre entier compris entre 0 et 2000, de préférence
entre 1 et 200 (b peut prendre toutes les valeurs entre 0 et 2000), comme le
3424243-
maléimido-propionylamino]-éthoxyl-éthoxy)-propanoate de N-succinimidyle ou
SM(PEG)2;
0 0
0õALK-T- 'N
g0
0 comme le succinate de maléimidoéthyle et de N-succinimidyle ;
0
-0,
-ALKr
.1r 0
0 comme le 4-(4-maléimidophényl)butanoate de N-succinimidyle ou
0
0 0,
1111 0 N
0
0 comme le 3-maléimidobenzoate de N-succinimidyle.
Agents de modification permettant d'introduire des groupes thiols
Un autre exemple d'agent de modification décrit dans WO 90/06774 est de
formule
X10
¨s
xõ
NH2* Hal-
x, dans laquelle :
- Hal représente un atome d'halogène ;
- X10 représente un atome d'halogène ou le groupe C00X14, nitro, (C1-
C8)alkyle non substitué ou
halogéné, (C1-C8)alkoxy non substitué ou halogéné, (C2-C8)alkényle non
substitué ou halogéné,
(C2-C8) alkynyle non substitué ou halogéné, (C3-C8)cycloalkyle non substitué,
aryle non substitué
ou substitué par un à trois substituants sélectionnés parmi amino, atome
d'halogène, groupe (C1-
C8)alkyle non substitué ou halogéné, (C1-C8)alkoxy non substitué ou halogéné ;
- chacun des X11, X12, X13 représente indépendamment un atome d'hydrogène
ou bien peut
représenter X3;
OU X10 et X11 forment ensemble un cycle (C2-05)alkylène, non substitué ou
substitué par un à
cinq groupe(s) (Ci-C4)alkyle ;
ou X10 ou X11 forment ensemble avec X12 un cycle (C1-05)alkylène, non
substitué ou substitué
par un à cinq groupes (C1-C4) alkyle
et X14 est -H ou un groupe (C1-C8)alkyle.
De préférence, Hal représente un atome de chlore ou de brome. On trouvera dans
le tableau ci-
dessous des possibilités pour X10-X13
X10 X11 X12 X13 Hal
Me H H H CI
Ph H H H CI
t-Bu H H H CI
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Me Me H H CI
(-CH2(CH2)3CH2-) H H CI
H (-CH2(CH2)3CH2-) H CI
Et H H H Br
Et Me H H CI
-CH-CH2-CH H H H CI
Me H Me H CI
H H Me Me CI
Ph Me H H CI
4-CIPh H H H CI
3-furanyl H H H CI
i-Pr H H H CI
Me Me Me Me CI
C61-111 H H H CI
CH2Br H H H CI
CF3 H H H CI
CH=CH2 H H H CI
2-NH2Ph H H H CI
+ _
NH2 CI
S
Un exemple d'iminothiolane préféré est le suivant : /
Agents de modification permettant d'introduire des groupes haloacétamido
Un autre exemple d'agent de modification est le succinimidy1-4-(N-iodoacéty1)-
aminobenzoate
0 lab 0
0 I
N ' N
H
0
(SIAB) 0 , ou
des composés similaires parmi lesquels le succinimidyl-N-
0
0
N , I
0
iodoacétate (SIA) 0
, le succinimidyl-N-bromoacétate (SBA), ou le succinimidy1-3-(N-
bromoacétamido)propionate (SBAP) ou un composé pegylé similaire décrit dans WO
0
0
H
0 0 b I
2009/134976 0
, b étant tel que décrit précédemment. Les figures 1 et 2
illustrent la modification d'un groupe amino d'un agent de ciblage par le SPDP
ou bien par
l'iminothiolane préféré ci-dessus.
Ainsi, on peut introduire sur l'agent de ciblage des groupes GCR2 disulfures
(¨SSR), notamment
I T
de type pyridyldisulfures Si\i OU S N
, dans le cas où GCR1 représente ¨SH.
De même, on peut introduire sur l'agent de ciblage des groupes GCR2 thiol (-
SH), par ex. avec
un iminothiolane, dans le cas où GCR1 représente disulfure (c'est-à-dire GCR1=
¨SZa avec
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Za#1-1, par exemple Za= ¨s-N ). Dans les deux cas, la liaison covalente qui se
forme par
réaction entre GCR1 et GCR2 est une liaison disulfure clivable.
Il est également possible, dans le cas où GCR1 représente -SH, d'introduire à
la surface de
0
N
l'agent de ciblage des groupes GCR2 de type maléimido ( ) ou haloacétamido
(par ex.
H
--)\N'eBr ou I
bromo- ou iodoacétamido 0
). Réciproquement, on peut introduire sur l'agent de ciblage
des groupes GCR2 thiol (-SH), par ex. avec un iminothiolane, dans le cas où
GCR1 représente
0
N H
--)\N'eBr ou I
ou . Dans
ce cas, la liaison covalente qui se forme par réaction entre GCR1 et
GCR2 est une liaison sulfure non-clivable.
Tableau I : exemples de modifications d'agent de ciblage lorsque GCR1=-SZ.
0
I.)
o
agent de modification GCR2 à la surface de l'agent de exemple après
réaction sur un groupe conjugué --,
--,
ciblage amino, notamment
lysine, d'un anticorps e:"3
noté MAb
ID
--,
ID
D o*'
un
o
o o I.)
Rõ,s,S¨ALKILO,N R ,S ALKILrr R.,s S¨ALKIL
Crypto¨I2 S¨ALK1L
S NH-
MAb S' NH-MAb
0 9
d
0
--'-'- 0 '
--N., ---,.s-S¨CH2CH2 1,,_,3,N 0 0
0
.,
,S¨CH2CH2 IL. Crypto SS CH2CH2 L
,s-CH2CH N S N H-M Ab 'L* NH-MAb
SPDP= 0 N S
_ 9 _ d
Q
o
o \
--'-- o
o o
I.)
ts,/,.., s,S¨C1-12CH2C ,N-,.:^-
,s,S¨C112CH2C1-1--.
N H-MAb Crypto SS CH2CH2CH2
'L*
L NH-MAb -.1
0)
SPDB= o
c5,
_ 9 d
--,
0)
N
0
//o 0
N
0
I g. =.-N
H
H
0
I
0 // 0
H
SM CC= C) \ /5)
0 N
N¨C =
'( 0
//
\
0 I
N
sulfo-SMCC= ¨ H' N _c
N_. ii>
. h¨
2 NH-M Ab / H NH MAb
SO,M
Crypto, ,/ % 2
0 0 0 _9
L* -S 0 d
G
N¨C = o,N
H' 0
0
/ o 0 X1 , X2
1Xi ,,-õ_.,õ,---,,,X2
Xi ,,,,_.õ--,.. ,,,,z,X2
eld
n
X7 0 0
0
S
2,0 Iy-S, `,,,i
! 1
x, X3 Sõ. ,.-.
,õ. S
S, .--- / L* Crypto
; x
,q
0 S N MAb-N H S N
MAb-NH'S'
X6 ; X, X6 )(6 X, X, X3
X6; X4 ;
¨g
d
0
O
0
OC
Cl
CD
X,
X,,,, ,,__---õ(X,Xi .-..õ,,,..,-, --õ,,_,..-X2
N
MAb- H 0
l ID
l..------õ--S-.. ------k,- ,---
011,-..õ0, 0
S N b
-D-eD
0 -
0 - CD
o
- 9 d
CD
1,..)
X,
0),, .----0 S031-1 )(1' "--f---; '-r-X2 S031-1 Xi
,..... ...X,
SO,H
N
MAb-NH?--...õ.S,, _---,-, j MAb-NH ,r,j,_,. S, ,./ L*-C rypio
I S0211
a g N
a g
I
0Sõ------S,,N.,-% 0
0
_g
0
d
0
X10
Xi., XloXii Xl,
___--S XII x,0
X11 MAb-NH
MAb-N H (-)
NH2. Hal- SHI
SH
SS-L*-Crypto
X12
'NH2 Xi3X-12
-, NI-12 X2e12
*NH, Xj12 0
XI, Hal- - Hal -
9 - Hal- d IV
-
--I
cY)
cY)
0 0
-4
0
.
cY
)
N"--
P MAb-NHMAb-N H
el ,i-L,,,,,S-C-Crypto Cl IV
0 N Ni
N I.)
1-1 H
H
SIAB= o o o
o o
_g
_ d H
H
o l
o H
IV
0 0
0 1
1>C0 ,i1 MAb-NH
11-, I MAb-NH 11-,,S-1..*-Crypto IV
us)
SIA= o _g
_ d
0 0 0
0
0 H
H
N,0)01:),N,Ir-.1
0 0 0
0
0 _g
_ d
g : nombre de fonctions GCR2 sur un agent de ciblage modifié ; d: nombre de
dérivé(s) de cryptophycine sur l'agent de ciblage MAb
n
L* = fragment d'un linker L comprenant GCR1=-SZa et tel que L= -L*SZa
-a;
un
o
o
ce
o
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Plus particulièrement dans le cas où GCR1 est du type (iii) ci-dessus, il est
possible de modifier
chimiquement l'agent de ciblage à l'aide d'un agent de modification adéquat ou
d'introduire
un/des acide(s) aminé(s) non-naturel(s) afin d'introduire les fonctions GCR2
adéquates. Par
exemple,
- avec une fonction -N3: GCR2 peut être un groupe -CCI-1 ;
- avec une fonction -OH ou -NH2 : GCR2 peut être une fonction acide
carboxylique ;
- avec une fonction -Cl : GCR2 peut être un groupe -SH.
0
\---
___________________________________________________________ N
/-----
Dans le cas où GCR1 représente un groupe réactif maléimido ou
haloacétamido
R a
11
--NLIC-Br ou I
0 avec R12 représentant H ou (C1-C6)alkyle, plus particulièrement Me, le
dérivé de
cryptophycine peut être représenté par la formule (11a) ou (lib) ci-dessous :
0 R, R, R5 Br ou I 0
0 0
õ.-- 0,,C3
HN
R R
õ ,,, t ¨---1210
R
._7,,0 R11 ll'
j'è10 ge -
N ' 0
Ra H Rs
R, Ra (11a) R, R, H
(11b)
(L* représente un fragment d'un linker L tel que L= -L*-maléimido ou bien L= -
L*-haloacétamido)
Le dérivé de cryptophycine pourra être, en série C-52 et C-1, l'un des
suivants D1-D8:
. .
,o
* 1 o * gel
õ---- oo 0 HN, --õ_. -CI C) HN
=-= CI
0 ---
0 1-?,õ-------, .,---`-' .---'--
N 0 OMe 0 N 0
OMe
H
Di D2
,Q Io
,o ' - o
,-- -,-'
____________ f* 1
f.f.-- ) o 0 HN ,--õ,---, Cl __ * 0,.0 0 HN
CI
----- 0
.....------, .--------,- , ---
.....------, ,---1--õ(------.. .--------,-
0 N 0 OMe 0 N 0
OMe
H
Ci Ci
õ __________
,-, Cl * 111 HO
00 HN
0......_,,,,0 HN lb Cl
- OMe
--, 0
.....------, ,--[1-7------, ,----- ,---,
0 N 0 0--LIIr-N '-
'0 OMe
H
------- 135 D6
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õ ______________________________________ õ __
0 HN CI
,CI ,0 go
Gly-O '-'-- 0 ---, ....- y
1
..-----, õ--LI---õ..------, ..----- ,. ....----, ..--11-4.------, ,.----
0 . N 0 OMe 0 N 0 OMe
H
------ ------
D7 Gly=glycinate D, Gly=glycinate
ou un motif équivalent décrit dans l'un des exemples.
Plus particulièrement, L est en position para du motif CRi.
Procédé de préparation des dérivés de cryptophycine
Les composés de formule (II) sont préparés selon le Schéma 1 à partir d'un
dérivé de
cryptophycine de formule (III) et d'un précurseur de linker (PL) :
Ri R2 R, R, R,
0
=
PL+ D 1 i ____________________ - (II)
0,0 HN
'----- 0
1411 R9-7,,,c) , ,<õ.,,,, le R1,
N 0
; R7 R6 H
(III)
Schéma 1
G représente le groupe -CH=CH2, -(CH2)nY ou bien -(C1-C6)alkylène-Y avec n
étant un entier
allant de 1 à 6 et Y représentant ¨OH, -SH, -Cl, -OGP dans lequel GP désigne
un groupe partant
tel que par exemple le groupe mésylate (0Ms) ou tosylate, ou bien Y
représentant -N3, -NH2, -
COOH, -NR12-CH2-CECH dans lequel R12 représente H ou un groupe (C1-C6)alkyle,
plus
particulièrement le groupe méthyle. Le précurseur de linker PL a pour fonction
d'introduire le
linker L au niveau du dérivé de cryptophycine après réaction entre le groupe G
et une fonction
chimique présente sur PL.
HS-40(CH2)n--
G peut aussi représenter le groupe
(c'est-à-dire que Y représente le groupe
HS 411,
) choisi parmi l'un des 9 groupes suivants (R12 et R'12 représentent H ou un
groupe
(C1-C6)alkyle) :
o
52
HS-ALKN , .,---.1
HS-ALK)S'-'-i l',12 HS-ALK-11"---"-)
L-
N _________ N ,N(Ch12)n . HS-ALK "(cF12)n __ r\i'(Ch12)n
.
.
5
I12 R',2 I12 l'12
I12
' ,---...,..--N__.
HS-ALK-CH(I\0---N" i II(CH2) HS-ALK N µ-' N-'-- (CH)
HS-(CH2CH20)i-CH2CH2 (CH2)11
. HS-ALK--
0 =
ou -(CH2)n-SH
Sur le Schéma 1, plusieurs étapes et/ou réactions peuvent être nécessaires
pour aboutir au
dérivé de cryptophycine (II) à partir du dérivé de cryptophycine (III). Ainsi,
par exemple, dans le
cas où Za=H, on préfère introduire un linker L pour lequel Za=-S(C1-C6)alkyle
utilisant le
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précurseur de linker correspondant, puis à réduire la fonction disulfure
¨SS(C1-C6)alkyle en
fonction thiol ¨SH. On peut utiliser pour cela par exemple le TCEP : voir à ce
propos Burns J.A.,
et al., J.Org.Chem. 1991, 56(8), 2648-2650. Cette transformation ¨SS(C1-
C6)alkyle -SH peut
s'appliquer par exemple aux linkers L1-4 et L21-23 du Tableau II.
¨0¨N
De même, dans le cas où ZbRb= 0 , on peut introduire un
linker L pour lequel ZbRb-0-
allyle utilisant le précurseur de linker correspondant, puis déprotéger la
fonction ¨COOH et
0
¨0¨N
introduire
0 . La déprotection peut être réalisée par un traitement avec un catalyseur
au
palladium, par exemple Pd(PPh3)4 en présence d'une amine scavenger , par
exemple la
morpholine ; l'activation peut être réalisée avec le carbonate de N-N'-
disuccinimidyle en présence
d'une base, par exemple la DIPEA ou avec le NHS en présence d'un agent de
couplage, par
exemple le DCC. Cette transformation d'un groupe ZbRb à un autre groupe ZbRb
(par ex. -0-allyle
0
¨0¨N
) peut s'appliquer pour obtenir d'autres groupes ZbRb, notamment ceux décrits
plus
haut.
Dans le cas où R1 représente un atome d'halogène et R2 un groupe acyle, on
préfère préparer
d'abord un composé de formule (II) pour lequel R2 représente un groupe -OH
(une fois le linker
introduit), et introduire ensuite le groupe acyle à l'aide du composé acylant
correspondant.
Les Schémas 1' et 1" illustrent de même la préparation d'un dérivé de
cryptophycine
comprenant un linker comprenant respectivement un groupe maléimido ou
haloacétamido (L*
représente un fragment d'un linker L tel que L= -L*-maléimido ou bien L= -L*-
haloacétamido).
rnr 00
rir C)\\
O-N "
H2N\ N /HS
0 \L* ___ Crypto 0
L'¨Crypto _____________________________________________________ 1J¨Crypto
(11a)
Schéma 1'
Brou I 0
Br ou I /5)
NI21
y 0 0
Brou I 0
O¨N NR12
0
\ /
H2 N HS\
0 Br ou I
L'¨Crypto L*¨Crypto 12¨Crypto
(11b)
Schéma 1"
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Ces dérivés sont obtenus par réaction entre un dérivé de cryptophycine
comprenant un linker L'
comprenant un groupe amino ou thiol et un agent de modification permettant
d'introduire
respectivement un groupe maléimido ou haloacétamido.
5
Exemples de réactions entre le groupe G et une fonction chimique présente sur
PL
= substitution nucléophile entre un précurseur de linker PL porteur d'une
fonction amine ¨NH-
(un sel d'amine peut également convenir) et G=-(CH2)nCI ou -(CH2)n0Ms (voir
par ex. Tableau
Il, PL14, PL7a, PL840, PL21_23) : cette réaction peut être conduite dans un
solvant polaire
10 aprotique en présence d'une base, comme par exemple la TEA ou la DIPEA.
Voir ex.1,
composé 7 ou ex.15, composé 48;
= acylation entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction
halogénure de carbamoyle
et G=-(CH2)n0H (voir par ex. Tableau Il, PL5) : cette réaction peut être
conduite dans un
solvant polaire aprotique en présence d'une base amine comme, par exemple la
TEA.
Selon une variante, on peut également faire réagir un précurseur de linker PL
porteur d'une
fonction amine ¨NH- et G=-(CH2)nO-C(=0)-0-(4-nitrophényle) obtenu à partir de
G=-(CH2)n0H
et de p-nitrophénylchloroformate (activation de l'alcool sous forme de
carbonate) selon le
schéma ci-dessous (R12= H ou (C1-C6)alkyle) :
-N H R12 crypto-(CH2)nO-C(=0)-0-(4-nitrophényle) crypto-(CH2)nO-C(=0)-N R12-
= l'activation d'un alcool sous forme de carbonate peut aussi être utilisée
pour faire réagir un
précurseur de linker porteur d'une fonction ¨OH et G=-(CH2)nNH2 ou ¨(CH2)n0H
pour obtenir
respectivement une fonction carbamate (-0-C(=0)-NH-) ou carbonate (-0-C(=0)-0-
) selon les
schémas respectifs suivants :
-0-C(=0)-0-(4-nitrophényle) + crypto-(CH2)nN H2 crypto-(CH2)nNH-C(=0)-0-
-OH + crypto-(CH2)nO-C(=0)-0-(4-nitrophényle) crypto-(CH2)nO-C(=0)-0-.
(voir par ex. Tableau Il, PL6a-6b, PI-24-25)
= estérification entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction
acide ¨COOH et G=-
(CH2)n0H (voir par ex. Tableau Il, PL14b) : cette réaction peut être conduite
dans un solvant
polaire aprotique en présence d'une base amine comme, par exemple la DMAP et
d'un agent
de couplage, par exemple le DCC ;
= amidification entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction
acide ¨COOH et G=-
(CH2)nNH2 (voir par ex. Tableau Il, PL14a) : cette réaction peut être conduite
dans un solvant
polaire aprotique en présence d'un agent de couplage, par exemple l'EDCI ou le
HOBt ;
= amidification entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction
¨NH2 et G=-
(CH2)nCOOH (voir par ex. Tableau Il, PL7c) : cette réaction peut être conduite
dans un solvant
polaire aprotique en présence d'un agent de couplage, par exemple l'EDCI ou le
HOBt ;
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21
= cycloaddition 1,3-dipolaire (appelée aussi chimie click ) entre un
précurseur de linker PL
porteur d'une fonction alcyne terminale et G=-(CH2)nN3 ou bien entre un
précurseur de linker
PL porteur d'une fonction azide et G=-(CH2)nNR12-CH2CCH (voir par ex. Tableau
Il, PI-15-18)
cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire en présence de Cu(I)
comme
catalyseur (voir à ce propos, sur la cycloaddition de Huisgen : Rostovtsev
V.V., et al., Ange w.
Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599 ; Tornoe C.W., et al., J. Org. Chem. 2002,
67, 3057-
3064) ;
= métathèse entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction
éthylénique terminale et
G=-CH=CH2 (voir Tableau Il, PL19, PL20) : cette réaction peut être conduite
dans un solvant
polaire aprotique en présence du catalyseur de Grubbs de 2ème génération (CAS
N 246047-72-
3, voir à ce propos, Poeylaut-Palena A.A., et al., J. Org. Chem. 2008, 73,
2024-2027.
A propos du linker L
Le linker L pourra être choisi parmi l'un des suivants :
-G' X (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)n Q GCRi ,
-G' X (CRi3R14)t(OCH2CH2)y-Y'-(CR15R16)n Q GCRi ;
-G' X (CRi3R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCI-12CH2)y Q GCRi ,
-G' X (CRi3R14)t(OCH2CH2)y(CR17=CR18)(CR15R16)n Q GCRi ,
-G' X (CR13R14)1-phényl-(CR15R16)n Y' Q GCRi ; -G' X (CRi3R14)1-fury1-
(CR15R16)n Y' Q GCRi ;
-G' X (CR13R14)1-oxazoly1-(CR15R16)n Y' Q GCRi ; -G' X (CR13R14)1-thiazoly1-
(CR15R16)n Y' Q GCRi
; -G' X (CR13R14)1-thiényl-(CR15R16)n Y' Q GCRi; -G' X (CR13R14)1-imidazoly1-
(CR15R16)n Y' Q
GCRi ; -G' X (CR13R14)1-pipérazinyl-CO(CR15R16)n Y' Q GCRi ; -G' X (CRi3R14)t-
pipéridinyl-
méthyl-NR12-CO(CRi5R16)n Y' Q GCRi ; -G' X (CR13R14)1-pipéridinyl-(CR15R16)n
Y' Q GCRi , -G' X
(CRi3R14)t-pipéridinyl-NR12-(CRi5R16)n Y' Q GCRi X (CR13R14)1-triazoly1-
(CR15R16)n Y' Q
GCRi, -G' X (CR13R14)1-triazoly1-(CR15R16)n Y' Q GCRi,
-G' X (CR13R14)1-phényl-(CR15R16)n Q GCRi ; -G' X (CR13R14)1-furyl--(CR15R16)n
Q GCRi, -G' X
(CR13R14)1-oxazoly1-(CR15R16)u Q GCRi ; -G' X (CR13R14)1-thiazoly1-(CR15R16)n
Q GCRi; -G' X
(CR13R14)1-thiényl-(CR15R16)n Q GCRi ; -G' X (CR13R14)1-imidazoly1-(CR15R16)n
Q GCRi ; -G' X
(CR13R14)1-pipérazinyl-(CR15R16)n Q GCRi ; -G' X (CR13R14)1-pipéridinyl-
(CR15R16)n Q GCRi ; -G'
X (CRi3R14)t-Pipéridinyl-méthyl-NR12-(CRi5R16)n Q GCRi ; -G' X (CRi3R14)t-
pipéridinyl-NR12-
(CRi5R16)n Q GCRi , -G' X (CR13R14)1-triazoly1-(CR15R16)n Q GCRi ;
ou
-G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)n Q GCRi ,
-G" Y (CRi3R14)t(OCH2CH2)y-Y'-(CR15R16)n Q GCRi ;
-G" Y (CRi3R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCI-12CH2)y Q GCRi ,
-G" Y (CRi3R14)t(OCH2CF-12)y(CR17=CR18)(CR15R16)n Q GCRi ,
-G" Y (CR13R14)1-phényl-(CR15R16)n Y' Q GCRi ; -G" Y (CR13R14)1-fury1-
(CR15R16)n Y' Q GCRi ; -G"
Y (CR13R14)1-oxazoly1-(CR15R16)n Y' Q GCRi ; -G" Y (CR13R14)1-thiazoly1-
(CR15R16)n Y' Q GCRi ; -
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G" Y (CR13R14)1-thiényl-(CR15R16)u
Q GCRi; -G" Y (CR13R14)1-imidazoly1-(CR15R16)u Q GCRi
; -G" Y (CR13R14)1-pipérazinyl-CO(CR15R16)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3R14)t-
pipéridinyl-méthyl-
NR12-CO(CRi5R16)u Q GCRi ; -G" Y (CR13R14)1-pipéridinyl-(CR15R16)u Q GCRi ; -
G" Y
(CRi3R14)t-pipéridinyl-NR12-(CRi5R16)u Q
GCRi ; -G" Y (CR13R14)1--triazoly1-(CR15R16)u Y' Q
GCRi
-G" Y (CR13R14)1-phényl-(CR15R16)u Q GCRi ; -G" Y (CR13R14)1-furyl--(CR15R16)u
Q GCRi, -G" Y
(CR13R14)1-oxazolyl-(CR15R16)u Q GCRi ; -G" Y (CR13R14)1-thiazoly1-(CR15R16)u
Q GCRi; -G" Y
(CR13R14)1-thiényl-(CR15R16)u Q GCRi ; -G" Y (CR13R14)1-imidazoly1-(CR15R16)u
Q GCRi ; -G" Y
(CR13R14)1-pipérazinyl-(CR15R16)u Q GCRi ; -G" Y (CR13R14)1-pipérazinyl-
(CR15R16)u Q CCRi ; G"
Y (CR13R1.4)1-pipéridinyl-(CR15R16)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ria)t-pipéridinyl-
méthyl-NR12-(CRi5R16)u
Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ria)t-pipéridinyl-NR12-(CRi5R16)u Q GCRi ; -G" Y
(CR13R14)1-triazoly1-
(CR15R16)u Q GCRt;
G' représente un groupe -CH=CH- ou -(CH2)n- ;
G" représente un groupe -(CH2)n- ;
n représente un entier allant de 1 à 6 ;
X représente une liaison simple ou un groupe -CO-, -000-, ou -CONR12-, le
groupe CO étant
attaché à G';
Y représente un groupe -0-, -000-, -0000-, -000NR12-, -NR12CONR'12-
, -
NR12C00- ou -S(0)q-, l'atome 0 ou le groupe NR12 étant attachés à G";
Y' représente un groupe -0-, -000-, -0000-, -000NR12-, -NR12CONR'12-
, -
NR12C00-, -S(0)q-, -CO-, -000-, ou -CONR12- ;
R12, R'12, R13, R14, R15 et R16, R17 et R18 représentent indépendamment l'un
de l'autre H ou un
groupe (C1-C6)alkyle ;
t, u et y représentent des nombres entiers pouvant aller de 0 (cas du groupe
absent) à 20 et tels
que t+u+y soit supérieur ou égal à 1 ;
q représente un entier pouvant valoir 0, 1 ou 2;
Q représente une liaison simple, un groupe (C1-C10)alkylène ou un groupe
(OCH2CH2),, i étant un
entier allant de 1 à 20, plus particulièrement de 1 à 10, plus
particulièrement encore de 1 à 8, ou
de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5. i peut prendre chacune des
valeurs de ces
plages, notamment valoir 2, 3, 4 ou 5.
Dans le cas du linker de formule -G" Y (CR13R14)1(OCH2CH2)y-Y'-(CR15R16)u Q
GCRi, si y vaut 0
(pas de groupe PEG) et que Q représente une liaison simple, alors u ne peut
valoir 0. Plus
particulièrement, on exclut les linkers comprenant le motif terminal ¨NR12-
C(=0)-0- (Y'=NR12 ;
u=0 ; Q=liaison simple et GCR1=-C(=0)ZbRb).
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y représente un entier allant de 0 à 20, plus particulièrement de 1 à 20, plus
particulièrement
encore de 1 à 10, de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à
5. y peut prendre
chacune des valeurs de ces plages, notamment valoir 2, 3, 4 ou 5.
Certains de ces linkers ont été décrits dans les demandes WO 07085930 et WO
09016516.
Le linker L pourra être choisi parmi l'un de ceux de formule (IV) :
o
D ¨(CH2)n ____________________________
RbZb-CO-ALK (AA)w
(IV)
dans laquelle :
= (AA)w représente un enchaînement de w acides aminés AA reliées entre eux par
des
liaisons peptidiques ;
= w représente un entier allant de 1 à 12, de préférence de 1 à 6;
= n représente un entier allant de 1 à 6;
= D représente l'un des motifs suivants :
V=V
2 4
¨NR12 I ¨NR12
R20 R21 0 (D1) R20 R21 0 (D2)
VF V4
¨NR12
R20 R21 0 (D3)
pour lesquels :
R12 représente H ou un groupe (C1-C6)alkyle ;
R10, R20, R21, R22 représentent indépendamment l'un de l'autre H, un atome
d'halogène, -OH, -CN ou un groupe (C1-C4)alkyle ;
T rattaché à (CH2)n représente NR12 ou 0 ;
V1 représente 0, S, NR12 ;
V2 représente CR22 ou N;
V3, V4, V5 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi CR22 ou N.
Un exemple de D2 est le suivant :
H
¨N
o
1.1
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AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel, plus particulièrement choisi
parmi : alanine
(Ala), 6-alanine, acide 2-amino-2-cyclohexylacétique, acide 2-amino-2-
phénylacétique, arginine
(Arg), acide aspartique (Asp), cystéine (Cys), glutamine (Gln), acide
glutamique (Glu), glycine
(Gly), histidine (His), isoleucine (11e), leucine (Leu), lysine (Lys),
méthionine (Met), phénylalanine
(Phe), proline (Pro), sérine (Ser), thréonine (Thr), tryptophane (Trp),
tyrosine (Tyr), valine (Val),
acide raminobutyrique, acide oc,a-diméthyl raminobutyrique, acide 3,13-
diméthyl
aminobutyrique, ornithine (Orn), citrulline (Cit).
L'enchaînement (AA), a pour formule :
0
H
NALK
_w *
R23
dans laquelle R23 représente un résidu d'un des acides aminés décrits ci-
dessus. Des exemples d'enchaînements sont les suivants : Gly-Gly, Phe-Lys, Val-
Lys, Val-Cit,
Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lsy, Ala-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit,
Ile-Cit, Trp-Cit,
Phe-Ala, Ala-Phe, Gly-Gly-Gly, Gly-Ala-Phe, Gly-Val-Cit, Gly-Phe-Leu-Cit, Gly-
Phe-Leu-Gly, Ala-
Leu-Ala-Leu.
Les précurseurs de linkers sont ceux comprenant les motifs ¨OH correspondants
:
V2 R19 V=V4 V=V
2 / 2
-NR12 -NR12 ÇOH NR12 /V5
OH
R20 R21 R20 R21 R20 R21
WO 2005/082023 (voir notamment pages 61-64) décrit comment obtenir certains
précurseurs de
linkers. Les préparations des précurseurs de linkers PL25 et PL26 décrites ci-
après peuvent
également être utilisées pour obtenir d'autres précurseurs de linkers
similaires comprenant un
autre enchaînement (AA)õ.
Le linker L pourra être choisi également parmi l'un de ceux décrits dans le
Tableau II ou parmi
les composés exemplifiés. Dans toutes les formules de linkers, NR12 ou NR'12
représente plus
particulièrement NH ou NMe.
Préparation des composés de formule (III)
cas où G=-(CF1a),,OH ou -CH=CFla
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. R, R,R, 0 ?H R- R,'" 0 R R
3 IR, 5 0
0 ,
* 0 0 HN , HC104, 2M *HO c) 0 Nan
R, y,,, I to IR,,, (1) ' R 1 õ., ,,,L. IF R,,,
H201THF p,3h10 " R"
Rs 0 R;Xp HN 0
R. R, FO (i1)
M. R, ; H
P, P,
1100EI ¨*-étapes --...- TIPSO PPh'+' Br- PPh,+, Br- ov)
s
Rõ 4 Rõ
R Tf ou (iii) avec ,,,,õCr' PPh, -+ ' Br-
BuLi, THF TBDMSOBuLi, THF (iii) puis mCPBA, DCM IR i
(III)
R3 P,R 0 R3 P,R, 0 0 R3 1:24 0
111
TIPSO gr, R R 0 0 HN , TBDMSO ,, 1111 0,,0
(., HN,.,, \ 41 0 0 FIN .,, I, ,,9: liC,N1 * R,0
Ri, le R,), &., ,L Io
Rõ 4:_ 1 1_ * R,,
Re R, Ro H Re R7 R6 r11 ; R,) \-
R Ji
P5 P,=
composé de fomule (III) avec
(y)1TBAF mi TBAF G=-CH=CH,
THF THF
R, R? '0 P,R, 0
ei
HO 'gr 0 0 HN ,, * 000 HNõ,,,
Rõ RI Cilt 1 _ * R,0 HO
Ri, R97L03,N,LO * R,,
RI '0- X IV 0 R
8 R, IR, H R, ; H
1.7 = composé de fomule (III) avec P,= composé de fomule (III)
avec
G=-CH2OH G.-CH,CH,OH
Schéma 2
5 Pi est préparé selon l'enseignement des demandes WO 98/08505, WO 00/23429
ou WO
00/34252 ainsi que des publications suivantes Rej R., et al., J. Org. Chem.
1996, 61, 6289-
6295 ; Salamonczyk G.M., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6893-6900 ou J. Med.
Chem.1999, 42
(14), 2588-2603. Dans les pages 158-159 de The isolation, characterization
and development
of a novel class of potent antimitotic macrocyclic depsipeptides : the
cryptophycins , Chap.9, in
10 Anticancer agents from naturel products , Taylor&Francis, CRC press
book, isbn=0-8493-
1863-7 sont donnés les schémas de synthèse permettant de préparer les
différents fragments (A,
B, C et D) de cryptophycine et d'aboutir à Pi. Rej R., et al., J. Org. Chem.
1996, 61, 6289-6295
décrit sur les schémas 1-6 la voie d'accès à l'un des dérivés de cryptophycine
de la Figure 1 mais
ces schémas peuvent s'appliquer à la préparation de P1 en utilisant les
réactifs de départ idoines.
Pi permet de préparer d'autres dérivés de cryptophycine à l'aide des étapes
détaillées ci-après :
Etape (j) : ouverture du cycle époxyde de P1 en milieu acide permettant
d'obtenir la fonction diol.
On peut utiliser par exemple l'acide perchlorique concentré ;
Etape (ii) : coupure oxydante du diol à l'aide par exemple du periodate de
sodium ;
Etape (iii) : réaction de Wittig utilisant un halogénure de phosphonium
adéquat, par exemple un
bromure, et une base forte telle que par exemple BuLi ;
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25a
Etape (iv) : réaction d'époxydation de Corey-Chaykovsky faisant intervenir un
sel de sulfonium
chiral, par exemple un triflate, en présence d'une base telle que par exemple
KOH.
Etape (v): déprotection de l'éther silylé en utilisant par exemple une
solution de fluorure de
tétrabutylammonium.
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26
Le bromure de 4-(triisopropylsiloxyméthyl)benzyltriphénylphosphonium est
obtenu partir du 1-
(bromométhyl)-4-(triisopropylsiloxyméthyl)-benzène (CAS N 934667-38-6) dont
la préparation à
partir de 1,4-benzènediméthanol (CAS N 589-29-7, produit commercial) est
décrite par Potter
R.G., et al., Organic Letters 2007, 9(7), 1187-1190. Les composés pour
lesquels R11 représente
un groupe (C1-04)alkyle sont obtenus de façon semblable à partir du diol
correspondant qui est
soit un produit commercial soit est obtenu par C-alkylation Friedel-Crafts à
partir du 1,4-
benzèned iméthanol.
A partir du 1-(bromométhyl)-4-(triisopropylsiloxyméthyl)-benzène (CAS N 135408-
73-0), dont la
préparation est décrite sur le schéma 4a de EP 0496548 ou en page 83 de
l'article de Nevill C.R.
Jr., et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1991, /(1), 83-86, on peut obtenir
le bromure de
phosphonium correspondant. Les composés pour lesquels R11 représente un groupe
(C1-
C4)alkyle sont obtenus de façon semblable à partir d'un composé équivalent au
composé 1 décrit
en page 83 de l'article de Nevill C.R. Jr., et al., Bioorganic & Med. Chem.
Lett. 1991, /(1), 83-86
qui est soit un produit commercial, soit est obtenu par C-alkylation Friedel-
Crafts à partir de
l'acide p-tolylacétique.
Le trifluorométhanesulfonate de (1R,4R,5R,6R)-4,7,7-triméthy1-6-(4-vinyl-
benzy1)-6-thionia-
bicyclo[3.2.1]octane utilisé à l'étape (iv) est obtenu à partir du (1R,4R,5R)-
isothiocineole (voir
Aggarwal V. et al., JACS 2010, 132, 1828-1830) dont la préparation à partir du
(R)-limonène
(CAS N 95327-98-3, produit commercial) est décrite dans cette même référence.
Le bromure de triphényl(p-vinylbenzyl)phosphonium (CAS N 118766-51-1) est
obtenu à partir du
dérivé bromé correspondant (voir Drefahl G., et al., Chem.Ber. 1961, 94(8),
2002-2010) dont la
préparation à partir de l'alcool 4-vinylbenzylique (CAS N 1074-61-9, produit
commercial) est
décrite dans l'article de Shimomura O., et al., Tetrahedron 2005, 61, 12160-
12167.
A partir de P7 ou de Pg qui sont des composés de formule (III) pour lesquels
G=-(CH2)n0H, on
peut obtenir d'autres composés de formule (III) ayant d'autres groupes G.
cas où G=-(CF1a),,C1 ou ¨(CF1a),,N3
R R,R' R,R,
R4 0
N,, 0 0 HNõT _.(Ph0)2P(=0)N, HO SI 0,0 0 HN1. MsCI TEA
118111:00 0 HNNio
R11 R10
DBU R THF " Rp7L0jÇ'-'N 0 inee
R " DCM
5 R0
R, R. H R, R6 H R, R. H
P,
mCPBA DCM
R,
I% R4R. 0 R, R,
0 R4 0 0 0 R4 0
N, 0 0 0 HNõ,.. 4k. (Ph0)2P(=0)N, HO = 0 0 HN,
MsCI TEA CI O HN,
Rõ RI DBU THF R11 Dom R11
P12 R8 R, H P" , RH p, R8 R
Reirl
Schéma 3
A partir du groupe G=-CH2OH, on peut obtenir les groupes G=-CH2CI ou -CH2N3 :
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- l'introduction de -Cl peut être réalisée en présence de CMS : voir ex.1-
composé 2;
- l'azidation peut être réalisée en présence du diphénylphosphorazide
(Ph0)2P(=0)N3 et d'une
base, par exemple le DBU. Le Schéma 3 décrit ces réactions pour le cas n=1
mais il peut
s'appliquer également pour n>1.
cas où G=-(CHg)õCOOH
0 R4R. 0
Deysr cs-DMartmm H NaCIO, NaH,P0, 6
p HN
HO el '0 H
0
2Me-2-b HO utene R11
R, H
Re R, THF/H,0 Re 0 R-XR.
rd 0
P, Põ
mCPBA DCM
0 's R41% 0 -3 R4R3 0 R4R3
Ho el 0y0 H ___ Dess-Marti Ho rell 0 0 H NaCIO,
NaH,PO4 HO (3
411 0 0 H
R Pyr DCM
* , R 2Me 2 butene
O
e,0%;IN1 ss - -
R11 iq:0)Ç:IN1 01 Io
THF/H,0
R, H R, H R, H
Põ
Schéma 4
A partir du groupe G=-(CH2)20H, on peut obtenir le groupe G=-CH2COOH par une
oxydation. Le
Schéma 4 décrit une double oxydation : 1ère oxydation à l'aide du réactif de
Dess-Martin (voir
"Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis"; Paquette L. A., Ed.; Wiley:
Chichester, UK,
1995, Vol. 7, 4982-4987 ou Boeckman R.K. Jr., et al., J.J. "The Dess-Martin
Periodinane" Org.
Synth. 2004, 10, 696-702) suivie d'une 2ème oxydation de type Pinnick en
présence de 2-méthyl-
2-butène (Pinnick H.W., Tetrahedron 1981, 37, 2091-2096). Le Schéma 4 décrit
ces réactions
pour le cas d'un composé de départ pour lequel n=2 mais il peut s'appliquer
également pour n>2.
Cas où G=-
0 R3 R4R5 0R
0 R4 R5
N, O O0 HNõõ, =TCEP lb 0,0 HN
R11 IR,4.0 Me0H/F1,0 R11 R97L, iF
R R6 H R R N
Pl: Pl:
Schéma 5
A partir du groupe G=-CH2N3dont la préparation est décrite dans le Schéma 3,
on peut obtenir le
groupe G =-CH2NH2 à l'aide d'une réaction de réduction utilisant une phosphine
comme le TCEP.
A ce propos, voir : Faucher A.-M. et al., Synthetic Comm 2003, 33, 3503-3511:
C*R
H0,1 Oy 0 1 N '0 0 . H R
DEAD Ph
N.õ
. H
gr P 2
R11 Rõ<,..L..0 Rlo Et0H - R11 %
ReR R, H THF e R R, H R RHi
P, P20 Põ
0 Rs R4R3
0 0 HN
R11 RO:oiç ,N10 110
Plo R, R, H
Schéma 5'
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28
Selon une variante, à partir du groupe G=-CH2OH, on peut obtenir le groupe G=-
CH2NH2 à l'aide
d'une réaction de Mitsunobu utilisant la triphénylphosphine et le DEAD. A ce
propos, voir :
Mitsunobu O., Synthesis 1981, 1-28; Hughes D.L., Org. Reactions 1992, 42, 335-
656 ; Hughes
D.L., Org. Prep. 1996, 28, 127-164. Les Schémas 5 et 5' décrivent le cas n=1
mais ils peuvent
s'appliquer également pour n>1.
Cas où G=-(CH2)-NR12-CH2CECH
A partir du groupe G=-(CH2)nCI, on peut obtenir le groupe G=-(CH2)n-NR12-CH2-
CECH à l'aide
d'une substitution nucléophile utilisant le composé de formule NHR12-CH2-CECH
(R12=H :
propargylamine ; R12=(C1-C6)alkyle : préparé selon Mock W.L., et al., J.Org.
Chem. 1989, 54 (22),
5302-8).
Cas où G=-(CHg)n-SH
R R R R
lyt0 lyt0
CI 0 00 HN (Me3S02S, TBAF A 0 0 0 HN
R11 Roioxõ,N1.0 Or Rie ____________________ THF/water R11 ROE,J1.oxõ,N1.0
Or Rie
Ro R, Re H RB R, Re H
P13 P22
Schéma 6
A partir du groupe G=-(CH2)nCI, on peut obtenir le groupe G=-(CH2)nSH par une
fonctionnalisation directe à l'aide de triméthylsilylthiolate de
tétrabutylammonium préparé in situ à
partir de fluorure de tetrabutylammonium et d'hexaméthyldisilathiane selon Hu
J. et al., J. Org.
Chem. 1999, 64, 4959-4961 (voir ex.8). Le Schéma 6 décrit cette réaction pour
le cas n=1 mais il
peut s'appliquer également pour n>1. Au cours de cette réaction, il peut se
former le dimère
intermédiaire de formule :
R5R R30R
0 R4 R5 0
0, 4
NH 00 1.1 * 0 0 HN
R11 (CH2)n-SSPH, n R11 R
Or' R,C) dimère Ru
Cas où G=-ALK-SH
0, er0 0
Etp,, RØ00 0 HNI D_RI. 24...C. 1-0,,0 0 4 HN, Re= 0A0I-K B:
512
RALK y o
HN-1
Br õ4.
R, Re R, Re' r-s1 R;ta)õ0, õRaIr.L.0
R, Id
p2r
Ps P23
("0 mCPBA, DCM
0 Ra R4R, 0 Ra R R
4H. 0 Ra Rr
(y) 0 (') R
0 4 0
a r_ALK * R0.005(>,,FINNI0 dite ,MsCI, TEA ,õ rAL
K 0 0 H TBAF
--ALK 0 0 0
HN,
R, DCM R11 eoxN NI0R, THF
R,R0
R0
RI.
Põ Re R, Rs H Re R, Ra H RRõ Re H
P25
(vo (Me,S02S, TBAF
avec R12, Rss, R14 = Me, 1Pr, ,Bu par exemple
THF/water
o1 R41% 0
HS-ALK OY HN
R" R R7L0-NIO
28 R, Re H
Schéma 7
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P3 permet de préparer d'autres dérivés de cryptophycine selon le Schéma 7:
Etape (i) : réaction de Wittig utilisant un halogénure de phosphonium adéquat,
par exemple un
bromure, et une base forte telle que par exemple BuLi ;
Etape (ii) : couplage de Kumada utilisant un réactif de Grignard adéquat, par
exemple un
bromure d'alcoxymagnésium protégés sous forme d'éther silylé, en présence d'un
catalyseur au
palladium ou au nickel (voir par exemple Organic Letters 2009, 11, 5686-5689
ou Synthesis
2009, 141, 2408-2412).
Les étapes (iii) à (y) sont décrites sur le Schéma 2 et l'étape (vi) sur le
Schéma 6.
Le bromure de (4-bromobenzyl)triphénylphosphonium est un produit commercial
(CAS N 51044-
13-4). Les bromures d'alcoxymagnésium protégés sous forme d'éther silylé
peuvent être
préparés à partir des bromoalcools correspondants par protection de la
fonction alcool avec le
chlorosilane adéquat puis par formation de l'organomagnésien en présence de
magnésium dans
un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF (voir par exemple Organic
Letters 2005, 7,
183-186). Les bromoalcools, linéaires ou ramifiés comportant 1 à 6 atomes de
carbone, sont
commercialement disponibles, comme le 3-bromo-1-propanol (CAS N 627-18-9) ou
le 1-bromo-
2-propanol (CAS N 19686-73-8) ou peuvent être préparés à partir des
bromoesters ou
bromocétones correspondantes selon des méthodes décrites dans la littérature.
Le chlorosilane
peut, par exemple, être le tert-butyldiméthylchlorosilane (CAS N 18162-48-6)
ou le triisopropyl-
chlorosilane (CAS N 13154-24-0).
Cas où G=-(CF12)n-maléimido
H
0
-=( 0 0 HN, DEAD PPh,0,, 0 HN
0 e
irt):0)ç_,NL R __ -
THF R9):05)NI = R10
R, R, H p. R, R, H
mCPBA DCM
H
0 R3 R4R. 0 0 N 0
0 R, R4R. 0
0
HO le 0 0 HN DEAD PPh, * 0, 0 HN
R11 4:0 ' ____ * R,,
THF 0 R11 R9):05)N10 Rio
PH R8 R R, H p. Re R R, H
Schéma 8
En complément du schéma 1' qui décrit une méthode de préparation de dérivés de
cryptophycine
comprenant un motif maléimido, à partir du groupe G=-CH2OH, on peut obtenir le
groupe
0
G=
0 par une réaction de Mitsunobu en présence de triphéhylphosphine et de DEAD
selon
Matuszak N. et al., J. Med. Chem. 2009, 52, 7410-7420. Le Schéma 8 décrit
cette réaction pour
le cas n=1 mais il peut s'appliquer également pour n>1.
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Les Schémas 1-8 ci-dessus sont données pour un linker en position para mais
pourraient
s'appliquer identiquement pour les positions ortho ou méta. De même, ils sont
donnés pour un
dérivé de cryptophycine mais pourraient s'appliquer à la préparation d'autres
dérivés de formule
(Il), notamment D1-D8.
5
Plus particulièrement, dans le cas de la C-52, on pourra utiliser les composés
suivants dont les
préparations sont décrites dans Al-awar R.S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46,
2985-3007 ou dans
WO 9808505:
G=-CH2OH : composé 31b du schéma 5
GOO FIN1 Cl G=-CH2CH2OH : composé 49 du schéma
9OMe .,
G=-CH2COOH : composé 51 du schéma 9
I. H ou ex.81 de WO 9808505
G=-C(=0)H : ex.80 de WO 9808505
D'autre part, à partir du composé 31b pour lequel G=-CH2OH, il est possible
d'obtenir les
10 composés pour lesquels G=-CH2CI ou -CH2N3 :
= G=-CH2CI : voir exemple 1, composé 2;
= G=-CH2N3 : la conversion de -CH2OH en -CH2N3 peut être réalisée dans un
solvant polaire
aprotique en présence de diphénylphosphorazide et d'une base comme le DBU,
voir exemple
19, composé 60.
15 = G=-CH2maléimido : la conversion de -CH2OH en -CH2maléimido peut être
réalisée dans un
solvant polaire aprotique en présence de maléimide, de triphénylphosphine et
de DEAD.
L'enseignement de J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007 pourrait s'appliquer à
d'autres dérivés de
cryptophycine comprenant d'autres substituants R6-R9.
20 Préparation des précurseurs de linker PL
PL pourra être l'un des suivants :
)0L
Za-S-ALK
"
prepare selon le schéma ci-dessous :
HN
1 0 1--,õNõboc 0 1)
HO A LK-SZa
N, jp-L. ZaS-ALK ZaS-ALK
0 ALK-SZa L,NH Cl
0
Etape (i) : activation de l'acide à l'aide de NHS ; l'activation est réalisée
à TA en présence d'un
25 agent de couplage comme par exemple le chlorhydrate de 1-(3-
diméthylaminopropyI)-3-
éthylcarbodiimide en solution dans un solvant aprotique anhydre comme le DCM.
On pourra
s'inspirer des conditions de l'exemple 1, composé 4.
Etape (ii) : amidification avec la pipéridine N-Boc ; le couplage peptidique
est réalisé dans un
solvant polaire aprotique à TA en présence d'une base, qui peut être une amine
tertiaire comme
30 la TEA ou la DIPEA. Le solvant peut être le DMF. On pourra s'inspirer
des conditions de
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l'exemple 1, composé 5.
Etape (iii) : déprotection de l'amine à l'aide d'une solution d'acide, par
exemple acide
chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des
conditions de
l'exemple 1, composé 6.
L'acide de départ, par exemple l'acide 4-méthy1-4-(méthyldithio)-pentanoïque,
peut être
commercial ou préparé à partir d'un acide carboxylique halogéné par
traitements successifs avec
le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate. Voir
aussi US 2719170.
L.,NH -
préparé selon le schéma ci-dessous :
0
HN- H j-LALK-SZa
Etape (i) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à
TA dans un solvant
polaire aprotique anhydre comme le THF en deux étapes : formation d'un
complexe intermédiaire
en présence d'isopropoxyde de titane puis réduction in situ avec un agent
réducteur comme par
exemple le cyanoborohydrure de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de
l'exemple 5,
composé 17.
Etape (ii) : déprotection de l'amine à l'aide d'une solution d'acide, par
exemple acide
chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des
conditions de
l'exemple 5, composé 18.
L'aldéhyde de départ, par exemple le 2-méthy1-2-(méthyldithio)-propanal, peut
être commercial
ou préparé par oxydation d'un alcool porteur d'un motif disulfure obtenu à
partir d'un alcool
halogéné convenablement protégé (par exemple sous forme d'éther silylé) par
traitements
successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type
méthanethiosulfonate.
pL3 ZaS-ALK¨NHR12 préparé selon les schémas ci-dessous :
cas où Ri2=1-1
0 NH2
LLO (i)
ZaS-ALK H + H2N ZaS-ALK¨II 01)
ZaS-ALK-j
CIH
Etape (i) : formation d'une oxime ; l'aldéhyde précédemment décrit est mis en
solution dans un
solvant polaire protique comme l'éthanol puis traité par le chlorhydrate de 0-
méthylhydroxylamine au reflux en présence d'une base comme l'hydroxyde de
sodium. On
pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 3, composé 11.
Etape (ii) : réduction de l'oxime ; l'oxime est réduite par un traitement au
reflux avec une solution
de borane diméthylsulfure dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le
THF. On pourra
s'inspirer des conditions de l'exemple 3, composé 12.
cas où Ri21-1
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0
ZaS-ALK + H2N-R (') - ZaS-ALK-j
Etape (i) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à
TA dans un solvant
polaire aprotique anhydre comme le THF en présence d'un agent réducteur comme
par exemple
le triacétoxyborohydrure de sodium.
R12
ZaS-ALK
PL4 NH
préparé selon le schéma ci-dessous :
j:t R2
R2 R,,
1
HTi
H ALK-SZa ZaS-ALK-) ZaS-ALK
NH
N'boc CIH
Ce linker est préparé de façon semblable à ce qui est présenté pour PL2.
Etape (i) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à
TA dans un solvant
polaire aprotique anhydre comme le THF en deux étapes : formation d'un
complexe intermédiaire
en présence d'isopropoxyde de titane puis réduction in situ avec un agent
réducteur comme le
cyanoborohydrure de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple
5, composé 17.
Etape (ii) : déprotection de l'amine à l'aide d'une solution d'acide, par
exemple acide
chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des
conditions de
l'exemple 5, composé 18.
p L5 RbZb-CO-ALK-SS-ALK¨NR c I préparé selon le schéma ci-dessous :
Br-ALK (iii)-N(Boc)R12 Me-COS-ALK-N(Boc)R12
(iDîcNiSSALK-5ZbRb (iv)
(viii)
HO-ALK-NHR12 ____ HO-ALK-N(Boc)Ri2 RbZb0C-ALK-SS-ALK-N(Boc)R12 RbZb0C-
ALK-SS-ALK-NHR12
(v)
SSALK-5ZbRb (vii)
(ix) HCI
(vi)
Ms0-ALK-N(Boc)R12 _________________ > HS-ALK-N(Boc)R12
RbZb0C-ALK-SS-ALK NR12-COCI
Etape (i) : protection de l'amine ; la réaction est réalisée à TA dans un
solvant polaire aprotique
comme le DCM par traitement de l'amine avec le dicarbonate de di-tert-butyle
en présence d'une
base comme par exemple la TEA.
Etape (ii) : transformation de l'alcool en bromure ; la réaction est réalisée
à TA dans un solvant
polaire aprotique comme le THF par traitement de la fonction alcool avec CBr4
en présence d'une
phosphine par exemple la triphénylphosphine ; voir à ce propos Appel R. Ange
w. Chem. Int. Ed.
Engl. 1975, 14, 801-811 ou Desmaris N., et al., Tetrahedron Letters 2003,
44(41), 7589-7591.
Etape (iii) : substitution du bromure par le thioacétate ; la réaction est
réalisée à TA dans un
solvant polaire aprotique anhydre comme le DMF en utilisant comme nucléophile
le thioacétate
de potassium.
Etape (iv) : formation de la liaison disulfure ; la réaction est réalisée dans
un solvant polaire
protique anhydre comme le méthanol en présence d'une base comme par exemple le
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méthanolate de sodium et d'un réactif comportant un motif pyridyl-disulfure.
Selon une variante :
Etape (y) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est
réalisée dans un solvant
polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de
mésyle en présence
d'une base comme par exemple la TEA.
Etape (vi) : formation du thiol libre ; la réaction est réalisée au reflux
d'un solvant polaire protique
comme un mélange éthanol/eau en deux étapes successives : déplacement du
mésylate par la
thiourée puis hydrolyse in situ du sel d'isothiouronium par ajout d'une base
comme NaOH.
Etape (vii) : activation du thiol sous forme de pyridyl-disulfure; la réaction
est réalisée à TA dans
un solvant polaire protique comme l'éthanol par traitement avec un réactif
comportant un motif
pyridyl-disulfure en présence d'un acide comme l'acide acétique.
Etape (viii) : déprotection de l'amine à l'aide d'une solution d'acide, par
exemple acide
chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane).
Etape (ix) : activation de l'amine sous forme de chlorure de carbamoyle ; la
réaction est réalisée
dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le
diphosgène en
présence d'une base comme la TEA.
p L6 RbZb-OC-ALK- (OCH2CH2)
¨ H préparé selon le schéma ci-dessous :
cas où ALK=CH2C1-12
voie A:
(i) OH (ii)
HO ___________________ - HO ___________ - HO
0 0 0
voie B:
H (HO (3)U+0,,_HT_c ,
Etape (i) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par
ex. solution dans le
dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.
Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ;
la réaction est réalisée
à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DMF en présence de bromure
allylique et d'une
base comme le carbonate de potassium.
Etape (iii) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous
forme d'ester
avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.
cas où ALKCH2CH2
o
TO1ALK Hal. H 0 HP(iv) 0,-,__,THP (I)
ALK- O FIC)-jo-l'ALK-0---------,OH OH
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Etape (iv) : élongation de la chaine PEG; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné
avec l'alcoolate
d'un diol PEG monoprotégé sous forme d'éther de tétrahydropyrane (THP). La
préparation de ce
type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par
ex. Richard A. et al.
Chem. Eur. J. 2005, 11,7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003,
59, 9083-9090.
Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester tert-
butylique sont
commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de
tert-butyle) ou
préparés à partir de l'acrylate de tert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG
de départ sont
commercialement disponibles pour i=3 à 12.
pL7 RbZb0C-ALK- (OCH2CH2),--NHRi2 préparé selon les schémas ci-dessous :
cas où ALK=CH2C1-12
cas où R12=1-1
H H
cas où Ri21-1
cas où ALKCH2CH2
cas où R12=1-1
'01ALK¨Hal
N (y)
Hal= Br ou I le le OW
s O.
cas où Ri21-1
(iv) (v)
OIALK Hal
Hal= Br ou I
I 10
1
0
H, HO ____________________________________________________ A LK
(vi) *
0 0 0
R12
Etape (i) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ;
la réaction est réalisée
à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'alcool
allylique, d'un agent
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de couplage comme l'EDCI et d'une base comme la DMAP. On pourra s'inspirer des
conditions
de l'exemple 14, composé 42.
Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par
ex. solution dans le
dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de
l'exemple 14,
5 composé 43.
Etape (iii) : alkylation de l'atome d'azote ; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme NaH en
présence d'un
réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle. On
pourra s'inspirer
des conditions de l'exemple 15, composé 46.
10 Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans
un solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné
avec l'alcoolate
d'un benzophénone-imine-PEG-alcool généré par l'action de NaH ou du
naphtalénure de
potassium comme décrit dans WO 2007/127440 ;
Etape (y) : saponification de l'ester ; la réaction est réalisée par réaction
de l'ester avec de la
15 lithine en présence d'eau.
Etape (vi) : protection de l'amine ; la réaction est réalisée à TA dans un
solvant polaire aprotique
comme le DCM par traitement de l'amine avec le dicarbonate de di-tert-butyle
en présence d'une
base comme par exemple la TEA.
Les amino-PEG-acides sont commercialement disponibles pour i=3,5,6,10 ou
peuvent être
20 préparés à partir de l'acrylate de tert-butyle et de l'amino-PEG-alcool
correspondant.
Les amino-PEG-alcools sont commercialement disponibles pour par exemple i=3,
4, 7, 8 ou
peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour
i=3 à 12, selon
la procédure décrite dans US 7230101. La protection de la fonction amine par
la benzophénone
peut être réalisée par déshydratation azéotropique en présence d'un acide de
Lewis comme
25 l'éthérate de BF3.
RbZb0C-ALK-(OCH2CH2LN
õ
PL8 NH préparé selon les schémas ci-dessous :
cas où ALK=CH2C1-12
0 Ho+,01_,---OH 00 Ho+ OH)
0
HN
Ov)
0 0
CIH
30 Etape (i) : déprotection du composé de départ à l'aide d'une solution
d'acide chlorhydrique (par
ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra
s'inspirer des conditions de
l'exemple 16, composé 50.
Etape (ii) : protection de la fonction acide carboxylique sous forme d'ester
allylique ; la réaction
est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DMF en présence
de bromure
35 allylique et d'une base comme le carbonate de potassium. On pourra
s'inspirer des conditions de
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l'exemple 16, composé 51.
Etape (iii) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est
réalisée dans un solvant
polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de
mésyle en présence
d'une base comme la TEA.
Etape (iv) : réaction entre la fonction mésylate et la fonction amine du
composé
Boc-N
\-----/"(alkylation) ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire
aprotique anhydre
comme le DCM en présence d'une base comme la TEA. On pourra s'inspirer des
conditions de
l'exemple 16, composé 52.
cas où ALI.< CH2C1-12
1A 0) 1 CkA
---*01ALK¨Hal + H ------ OTHP 0 1-1<4_00THP
Ho ALK (:),Ar0 1-1(1-0-1f E1
Hal = Br, I
100
(1)(iv)ciF1 ALK
OI
1,1/ ALK
-1-0--jr 1µAs
Etape (y) : élongation de la chaine PEG; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné
avec l'alcoolate
d'un diol PEG monoprotégé sous forme d'éther de tétrahydropyrane (THP). La
préparation de ce
type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par
ex. Richard A. et al.
Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron
2003, 59, 9083-9090.
Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester tert-
butylique sont
commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de
tert-butyle) ou
préparés à partir de l'acrylate de tert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG
de départ sont
commercialement disponibles pour i= 3 à 12.
ZbRb-CO-ALKs----)
PL9 NH préparé selon le schéma ci-dessous :
boc boc H CIH
H ALKO ALK
yO
Etape (i) : alkylation de l'amine ; la réaction est réalisée dans un solvant
polaire aprotique
anhydre comme l'acétonitrile avec un halogénoalkylcarboxylate d'allyle comme
le bromoacétate
d'allyle en présence d'une base comme par exemple la TEA. On pourra s'inspirer
des conditions
de l'exemple 13, composé 38.
Etape (ii) : déprotection de l'amine à l'aide d'une solution d'acide, par
exemple acide
chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des
conditions de
l'exemple 13, composé 39.
L'halogénoalkylcarboxylate d'allyle peut être obtenu à partir de l'alcool
allylique et de l'halogénure
d'halogénoacyle correspondant et commercialement disponible pour ALK=-(C1-
12)1_6- (comme le
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bromure de bromoacétyle ou le chlorure de 4-butanoyle).
ZbRb-CO-ALK
PL10 NH préparé selon les schémas ci-dessous :
cas où ALK=CH2C1-12
0
c
+ HO
rsj) CIH
N - D rs1)
0
0 0
cas où ALI.< CH2C1-12
oo
, N 0
(iv) (:)\--ALK (ii)
-'01ALJOH HO
0 0 0
NH
0
ALK HCI
0
Etape (i) : ouverture de l'anhydride cyclique ; la réaction est réalisée à TA
dans un solvant polaire
aprotique anhydride comme le DCM en présence d'une base comme la TEA.
Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ;
la réaction est réalisée
à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'alcool
allylique, d'un agent
de couplage comme l'EDCI et d'une base comme la DMAP.
Etape (iii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par
ex. solution dans le
dioxane).
Etape (iv) : couplage peptique ; la réaction entre l'acide carboxylique et
l'amine est réalisée à TA
dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'un agent de
couplage comme le
système DIC / HOBt.
Etape (y) : saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée à
TA dans un mélange de
solvants polaires comme un mélange THF/eau en présence de lithine.
Les diacides monoprotégés sous forme d'ester méthylique sont commercialement
disponibles
pour ALK=-(CH2)1-6- (comme l'ester monométhylique de l'acide 1,6-
hexanedidique).
112
Z= Br ou I
1\1
RbZb0C-ALK-(OCH2CH2), z
PI-11 0 préparé selon les schémas ci-dessous :
cas où ALK=CH2C1-12
cas où R12=1-1
0
0 0 0
(i)
.
NH2
Z= Br ou I
Etape (i) : formation de l'amide et activation de l'acide ; les deux étapes
sont réalisées
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successivement dans un solvant polaire aprotique comme le DCM : réaction entre
la fonction
amine et l'halogénoacétate de N-hydroxysuccinimidyle puis addition in situ
d'un agent de
couplage comme le DIC. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 17,
composé 56.
cas où Ri21-1
0 0 0
cioF HO
HO " 1-12 N
H F F
0 (1)
0 0 Z= Br ou
I
0
Etape (ii) : protections de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique
et de l'amine sous
forme de trifluoroacétamide ; la réaction est réalisée en deux étapes
successives dans un solvant
polaire aprotique comme le DCM : protection de l'acide par traitement avec le
triméthylsilyldiazométhane en présence de méthanol puis protection de l'amine
par addition
d'anhydride trifluoroacétique et d'une base comme la TEA.
Etape (iii) : alkylation de l'amine et saponification de l'ester ; la réaction
est réalisée en deux
étapes successives dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF :
alkylation de
l'amine par traitement avec une base comme NaH en présence d'un réactif
porteur d'un
groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle RuHal puis addition de
lithine et d'eau.
Etape (i) : suite à l'étape (iii), on reprend les réactions de l'étape (i)
pour le cas R12=H.
cas où ALKCH2CH2
cas où Ri2=1-1
ALK-Hal HOIALK-0-b--" 2
Hal= Br ou I I
0 (1)
r_e
H
0
Z=Br ou I
cas où Ri21-1
'01ALK-Hal
Hal= Br ou I IO I. IO 40
(vo
o
00
ALK-0"-H--C CF3
'`=( H
0 R12
Z=Br ou I
Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné
avec l'alcoolate
d'un benzophénone-imine-PEG-alcool généré par l'action de NaH ou du
naphtalénure de
potassium (cf. WO 2007/127440) ;
Etape (y) : clivage sélectif de l'imine par hydrogénation en présence de
palladium sur charbon (cf.
Wessjohann, L. et al., Synthesis 1989, 5, 359-63) ;
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Etape (vi) : protection de l'amine par addition d'anhydride trifluoroacétique
et d'une base comme
la TEA.
Les amino-PEG-acides sont commercialement disponibles pour i=3, 5, 6, 10 ou
peuvent être
préparés à partir de l'acrylate de tert-butyle et de l'amino-PEG-alcool
correspondant.
Les amino-PEG-alcools sont commercialement disponibles pour par exemple i=3,
4, 7, 8 ou
peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour
i=3 à 12, selon
la procédure décrite dans US 7230101. La protection de la fonction amine par
la benzophénone
peut être réalisée par déshydratation azéotropique en présence d'un acide de
Lewis comme
l'éthérate de BF3.
RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)L'z
pL12 Z= Br ou I préparé selon les schémas ci-dessous :
cas où ALK=CH2C1-12
Voie A:
(I) MsOz_,,,,,,i)
C)
Z= Br ou I (iv)
0
ZC)J1-1r -rj_
0 0
Voie B :
0 1
0 Z=Broul
40L HO-H-0-tH
0 0
0
cas où ALI.< CH2C1-12
Z- Br ou I
HOTHPOALKO0H
OALK4OOMS(u) 401)ALK40-----H,[z
Hal = Br, I r_e0
0
HOjALKq-Oz
0
Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est
réalisée dans un solvant
polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de
mésyle en présence
d'une base comme la TEA.
Etape (ii) : échange mésylate / halogène ; la réaction est réalisée au reflux
d'un solvant polaire
aprotique comme l'acétone avec un halogénure de sodium comme l'iodure de
sodium.
Etape (iii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par
ex. solution dans le
dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.
Etape (iv) : activation de l'acide ; la réaction est réalisée à TA dans un
solvant polaire aprotique
comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage
comme le DCC.
Etape (y) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous
forme d'ester
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avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.
Etape (vi) : élongation de la chaîne PEG; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné
avec l'alcoolate
du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de
ce type de diol
5 PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple
Richard A. et al. Chem.
Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59,
9083-9090.
L'intermédiare formé est hydrolysé sélectivement à pH 5 en hydroxy ester.
Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester tert-
butylique sont
commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de
tert-butyle) ou
10 préparés à partir de l'acrylate de tert-butyle et d'un diol PEG. Les
diols PEG de départ sont
commercialement disponibles pour i=3 à 12.
pL1
3 RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i¨SH préparé selon les schémas ci-dessous :
cas où ALK=CH2C1-12
15 Voie A :
HO HO OH Ho -11-ye:' Ms04- 1-1(0
0 8 0
0 (iv)
HS+"--"MV'IrOH
0
Voie B:
0 0 0
(\""
0
0
1 (ii)
0 0 0
SH )
cas où ALKCH2CH2
4
OTHP 01ALK-Hal+ H (-) 40-1-ALK_0õ-- 'OjtALK40----
-Hi H
0
Hal = Br, I
i(III)
20 HO-i -LALK40
'OjtALK
Etape (i) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par
ex. solution dans le
dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Dans ce dernier cas, du
trifluoroacétate de la fonction
hydroxy peut se former. Il est clivé lors de l'étape suivante (ii).
Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique
; la réaction est
25 réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le méthanol par
traitement avec le
triméthylsilyldiazométhane.
Etape (iii) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est
réalisée dans un solvant
polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de
mésyle en présence
d'une base comme la TEA.
30 Etape (iv) : formation du thiol libre et saponification de l'ester
méthylique ; la réaction est réalisée
au reflux d'un solvant polaire protique comme un mélange éthanol/eau en deux
étapes
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successives : déplacement du mésylate par la thiourée puis hydrolyse in situ
du sel
d'isothiouronium par ajout d'une base comme l'hydroxyde de sodium.
Etape (y) : élongation de la chaîne PEG; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous
forme d'ester
avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.
Etape (vi) : élongation de la chaîne PEG; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné
avec l'alcoolate
du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de
ce type de diol
PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard
A. et al. Chem.
Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59,
9083-9090.
Le linker avec n = 8 (l'acide 3[2-mercaptoéthoxy-hepta-
(éthylèneoxy)]propionique) est disponible
commercialement. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous
forme d'ester
tert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-
trioxadodécanoate de tert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de tert-
butyle et d'un diol
PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12.
0
j-
RbZb0C-ALK-(OCH2CH2) OH , préparé selon le
schéma ci-dessous :
cas où ALK=CH2C1-12
0
o:))U HO H (i) (ii)
¨H __________________________________________________
F F
0 (iii)
0 0 0
8 0 (i)
1(y)
0 0
OH
0 0 0
0 8
cas où ALKCH2CH2
0
4
(vi)
0)l'ALK 0 iOTHP (ii) - H01)
ALK
7 igF
Hal = Br, I 0
0
HO1ALK
0 (i)
(v)
o Y
OH
OALK-0 OIALK ¨0
Etape (i) : élongation de la chaîne PEG; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous
forme d'ester
avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.
Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par
ex. solution dans le
dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Dans ce dernier cas, du
trifluoroacétate de la fonction
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alcool éventuellement présente sur la structure peut se former. Ce
trifluoroacétate est clivé lors
de l'étape suivante (iii).
Etape (iii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique
; la réaction est
réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le méthanol par
traitement avec le
triméthylsilyldiazométhane.
Etape (iv) : saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée à
TA dans un mélange
de solvants polaires comme un mélange THF/eau en présence de lithine.
Etape (y) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ;
la réaction est réalisée
à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'alcool
allylique, d'un agent
de couplage comme l'EDCI et d'une base comme la DMAP.
Etape (vi) : élongation de la chaîne PEG; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné
avec l'alcoolate
du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de
ce type de diol
PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard
A. et al. Chem.
Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59,
9083-9090.
Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12.
pLi5 RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i0i<2.
préparé selon les schémas ci-dessous :
cas où ALK=CH2C1-12
Voie A :
0
0 0 0
(i) (ii)
1,2 1,2
1,2
0
Voie B:
0 0 0
+HO
(iv)
õ (i)
C)¨ihi ___________________________________________ -
0
0 0
N,0 HO
0
cas où ALKCH2CH2
0 0 0
OTHP (y) - OH
0 ALK¨Hal \ 0
Hal = Br, I
0
0 0
(iii)
0
Etape (i) : substitution nucléophile ; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire aprotique
anhydre comme le THF en présence d'une base comme NaH et d'un halogénure
d'alkynyle
comme le bromure de propargyle ou le 4-bromo-1-butyne. On pourra s'inspirer
des conditions de
l'exemple 20, composé 63.
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Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par
ex. solution dans le
dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de
l'exemple 20,
composé 65.
Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS; la
réaction est réalisée à
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS
en présence
d'un agent de couplage comme le DCC supporté.
Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous
forme d'ester
avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique. On
pourra s'inspirer des
conditions de l'exemple 20, composé 64.
Etape (y) : élongation de la chaîne PEG; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné
avec l'alcoolate
du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de
ce type de diol
PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard
A. et al. Chem.
Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59,
9083-9090.
Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester tert-
butylique sont
commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de
tert-butyle) ou
préparés à partir de l'acrylate de tert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG
de départ sont
commercialement disponibles pour i=3 à 12.
PLis RbZb0C-ALK-(OCH2CH2V1\13préparé selon les schémas ci-dessous
cas où ALK=CH2C1-12
1 0 1 0 0 0
H--1-01("3 1-100----"HiN3
0
0
cas où ALKCH2CH2
0
OALK-
Hal H ------ (Iv)OALKO HOIALK çe
0 , NI' 0 ALK
N3
Hal = Br, I 0
Etape (i) : élongation de la chaîne PEG; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous
forme d'ester
avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.
Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par
ex. solution dans le
dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.
Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS; la
réaction est réalisée à
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS
en présence
d'un agent de couplage comme le DCC supporté.
Etape (iv) : élongation de la chaîne hydroxy azido PEG; la réaction est
réalisée dans un solvant
polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester
halogéné avec
l'alcoolate de l'hydroxy azido PEG.
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Les alcools azido PEG sont commercialement disponibles ou peuvent être
préparés à partir des
diols PEG correspondants commercialement disponibles pour i=3 à 12.
pL17 RbZb-CO-ALK préparé selon le schéma ci-dessous :
o
HO ALK çrt:2J-A L K
0
Etape (i) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS; la
réaction est réalisée à
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS
en présence
d'un agent de couplage comme le DCC supporté.
Les acides porteurs d'un groupement acétylénique sont commercialement
disponibles pour
ALK=-(CH2)m- avec m=1 à 10 (comme l'acide 3-butyndique).
pL18 RbZb-CO-ALK,N, préparé selon le schéma ci-dessous :
0
():t A Li< Hal ) Li< N3 0
HO ALK¨N3 O ALK¨N3
0
Hal = CI, Br, I
Etape (i) : substitution nucléophile de l'halogénure par l'azoture ; la
réaction est réalisée dans un
solvant polaire aprotique comme l'acétone en présence d'azoture de sodium.
Etape (ii) : saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée à
TA dans un mélange de
solvants polaires comme un mélange THF/eau en présence de lithine.
Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS; la
réaction est réalisée à
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS
en présence
d'un agent de couplage comme le DCC supporté.
Les esters méthyliques porteurs d'un motif halogénoalkyle sont commercialement
disponibles
pour ALK = -(CH2)m- avec m=1 à 6 (comme le bromoacétate de méthyle).
RbZb-CO-ALK-(0C1-12C1-12)i0,,
.1,2- préparé selon les schémas ci-dessous :
cas où ALK=CH2C1-12
voie A:
0
0 0 0
HO N.
0 0
0
voie B:
0 (iv) 0 0 (õ) 0
OH
0
(III)
0
0
0
cas où ALKCH2CH2
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H OTHP OH ¨
(1)¨
ALK-Hal
Hal = Br, I
0
OH) 5)
HO ALK-0------1 -
0
Etape (i) : substitution nucléophile ; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire aprotique
anhydre comme le THF en présence d'une base comme NaH et d'un halogénure
d'alkényle
comme le bromure d'allyle ou le 4-bromo-1-butène.
5 Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique
(par ex. solution dans le
dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.
Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS; la
réaction est réalisée à
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS
en présence
d'un agent de couplage comme le DCC supporté.
10 Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG; la réaction est réalisée dans
un solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous
forme d'ester
avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.
Etape (y) : élongation de la chaîne PEG; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné
avec l'alcoolate
15 du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La
préparation de ce type de diol
PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard
A. et al. Chem.
Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59,
9083-9090.
Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester tert-
butylique sont
commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de
tert-butyle) ou
20 préparés à partir de l'acrylate de tert-butyle et d'un diol PEG. Les
diols PEG de départ sont
commercialement disponibles pour i=3 à 12.
pL20
préparé selon le schéma ci-dessous :
o
HO ALK
0
25 Etape (i) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS;
la réaction est réalisée à
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS
en présence
d'un agent de couplage comme le DCC supporté.
Les acides porteurs d'un groupement éthylénique sont commercialement
disponibles pour ALK=-
(CH2)m- avec m= 1 à 10 (comme l'acide 3-butènoïque).
PI-ALK-CH2-NR12-(CH2CH20),-CH2CH2-NHR'12
PI-21 préparé selon les schémas ci-dessous :
cas où R12 et Ki2=1-1
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H Boo N,---N1H Boo H2NNHBoc
H Boc
0"6 0
(iv)
H ALK-SZa
Y
ZaS-ALKN11N1HBoc
ZaS-ALK.,,P1"0,,_IN1HHC21
cas où Ri21-1 et Ki2=1-1
CH2P h CH Ph CH2P h
HoNHBOC H 1-0-------NBoc oc
Bi oc (\õH2NNHBOC
d"b
(iv)
H ALK-SZa
ZaS-ALK Boc (viii)
ZaS-ALK ,N H Boc
HCI
ZaS-ALK-,,,N0.-^H-iN Hi 2 -
cas où Ri2=H et R'i21-1
41111
Boo AN3NHBoc (viii)--
6"6
0 (iii)
H HCI H
ZaS-ALK N NHR' (y) ZaS-ALK.,,N NR' Boc H ALK-SZa
H2N.,/NRBoc
cas où R12 et R'i21-1
Hto------HfNHBoc A,_ 1111 0 NHBoc
0
0 0
ZaS-ALK AIR
(viii) H JNRBOC ,HALK-SZa
(iy)
(y)
HCI
ZaS-ALKNRNHR
Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de tosylate ; la réaction est
réalisée dans un solvant
polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le chlorure de tosyle en
présence d'oxyde
d'argent et d'iodure de potassium. On pourra s'inspirer des conditions de
l'exemple 6, composé
23.
Etape (ii) : substitution nucléophile du tosylate ; la réaction est réalisée
dans un solvant polaire
aprotique comme l'acétonitrile par traitement avec l'azoture de sodium. On
pourra s'inspirer des
conditions de l'exemple 6, composé 24.
Etape (iii) : réduction de l'azoture ; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire comme un
mélange THF/eau en présence de triphénylphosphine. On pourra s'inspirer des
conditions de
l'exemple 6, composé 26.
Etape (iv) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée
à TA dans un solvant
polaire aprotique anhydre comme le DCM en présence d'un agent réducteur comme
le
triacétoxyborohydrure de sodium et si nécessaire d'acide acétique comme
catalyseur. On pourra
s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 27.
Etape (y) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par
ex. solution dans le
CA 02766762 2011-12-23
WO 2011/001052 PCT/FR2010/050986
47
dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de
l'exemple 6,
composé 29.
Etape (vi) : protection de la fonction NHBoc ; la réaction est réalisée dans
un solvant polaire
aprotique comme le THF ou la DMF par traitement avec 1 équivalent de base
comme l'hydrure
de sodium suivi d'un halogénure de benzyle comme le chlorure de benzyle.
Etape (vii) : clivage du groupement benzyle et réduction de la fonction azido
; la réaction est
réalisée dans un solvant protique comme le méthanol par l'hydrogène en
présence d'un
catalyseur comme l'hydroxyde de palladium.
Etape (viii) : alkylation de l'amine ; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire aprotique
anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en
présence
d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle.
On pourra
s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 25.
Les amino-PEG-alcools protégés ou non par un groupement Boc sur la fonction
amine sont
commercialement disponibles (comme le N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthanol ou le 1-
amino-
3,6,9-trioxaundecany1-11-ol) ou peuvent être préparés à partir des diols PEG,
commercialement
disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101.
L'aldéhyde ZaSS-ALK-
CHO, par exemple le 2-méthy1-2-(méthyldithio)-propanal, est commercial ou peut
être préparé
par oxydation d'un alcool porteur d'un motif disulfure obtenu à partir d'un
alcool halogéné
convenablement protégé (par exemple sous forme d'éther silylé) par traitements
successifs avec
le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate.
o
ZaS-ALK NR12-(CH2CH20)-CH2CH2-NHR'12
pL22 préparé selon les schémas ci-dessous :
cas où R12 et Ki2=1-1
Hf NHBoc SO0JNHBoc
N3NHBOC i)
0 0
(iv)
HO ALK-SZa
H HCI H
(V) HBoc
cas où Ri21-1 et Ki2=1-1
CH2Ph CH Ph CH2Ph
2NB 0)
H H oc NB2oc N,"0,,
1\11Boc ( H2N Boo
S
6"6
(vin)
ZaS-ALKNR0v) Y
HCI
ZaS-ALK. ,NR NHBoc
H 2 R12H N
H Boc
0
0 0
H OALK-SZa
cas où Ri2=H et R'i21-1
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WO 2011/001052
PCT/FR2010/050986
48
NR'1,
HB oc (.1>.
0
d `b
(Hi)
Y NR'12
H HCI NR12
(iv) 0
ZaS-ALKIr
0
NBoc
0
HOALK-SZa
cas où R12 et R'i21-1
N R12
Htcy"-----1INHBoc ,o NHBoc
HB oc
(iii)
R12NR'12
NR'12 NR'12
(iv) (viii) H N NB
ZaS-ALK N NBoc 2
R 0 OC
0
(v) HOALK-SZa
R12
HCI
ZaS-ALKõy,
Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de tosylate ; la réaction est
réalisée dans un solvant
polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le chlorure de tosyle en
présence d'oxyde
d'argent et d'iodure de potassium. On pourra s'inspirer des conditions de
l'exemple 6, composé
23.
Etape (ii) : substitution nucléophile du tosylate ; la réaction est réalisée
dans un solvant polaire
aprotique comme l'acétonitrile par traitement avec l'azoture de sodium. On
pourra s'inspirer des
conditions de l'exemple 6, composé 24.
Etape (iii) : réduction de l'azoture ; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire comme un
mélange THF/eau en présence de triphénylphosphine. On pourra s'inspirer des
conditions de
l'exemple 6, composé 26.
Etape (iv) : couplage peptidique ; la réaction est réalisée dans un solvant
polaire aprotique
comme le diméthylformamide en présence d'agents de couplage comme le système
N,N'-
diisopropylcarbodiimide/1-hydroxybenzotriazole et d'une base comme la TEA.
Etape (y) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par
ex. solution dans le
dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de
l'exemple 7,
composé 32.
Etape (vi) : protection de la fonction NHBoc ; la réaction est réalisée dans
un solvant polaire
aprotique comme le THF ou la DMF par traitement avec 1 équivalent de base
comme l'hydrure
de sodium suivi d'un halogénure de benzyle comme le chlorure de benzyle.
Etape (vii) : clivage du groupement benzyle et réduction de la fonction azido
; la réaction est
réalisée dans un solvant protique comme le méthanol par l'hydrogène en
présence d'un
catalyseur comme l'hydroxyde de palladium.
Etape (viii) : alkylation de l'amine par amination réductrice avec un aldéhyde
; la réaction est
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49
réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM en
présence d'un agent
réducteur comme le triacétoxyborohydrure de sodium et si nécessaire d'acide
acétique comme
catalyseur.
Etape (ix) : alkylation du groupe NHBoc ; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire
aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de
sodium en
présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure
d'alkyle. On
pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 25.
Les amino-PEG-alcools protégés ou non par un groupement Boc sur la fonction
amine sont
commercialement disponibles (comme le N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthanol ou le 1-
amino-
3,6,9-trioxaundecany1-11-ol) ou peuvent être préparés à partir des diols PEG,
commercialement
disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. L'acide
carboxylique
ZaS-ALK-CO2H, par exemple l'acide 4-méthy1-4-(méthyldithio)-pentandique, peut
être
commercial ou préparé à partir d'un acide carboxylique halogéné par
traitements successifs avec
le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate.
pL23 ZaS-(CH2CH20),-CH2CH2-NHR12préparé selon les schémas ci-dessous
cas où R12=1-1
(i)
(iv)
HCI
cas où Ri21-1
(i) (H) (iii)
(y)
(iv)
HCI
Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est
réalisée dans un solvant
polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de
mésyle en présence
d'une base comme la TEA.
Etape (ii) : formation du thiol libre ; la réaction est réalisée au reflux
d'un solvant polaire protique
comme un mélange éthanol/eau en deux étapes successives : déplacement du
mésylate par la
thiourée puis hydrolyse in situ du sel d'isothiouronium par ajout d'une base
comme l'hydroxyde
de sodium.
Etape (iii) : protection du thiol ; la réaction est réalisée dans un mélange
de solvants polaires
comme un mélange éthanol/eau avec un réactif comportant une fonction
méthanethiosulfonate
comme le méthyl-méthanethiosulfonate en présence d'une base comme le carbonate
de sodium.
Etape (iv) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par
ex. solution dans le
dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.
Etape (y) : alkylation de l'amine ; la réaction est réalisée dans un solvant
polaire aprotique
anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en
présence
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d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle.
Les amino-PEG-alcools protégés ou non par un groupement Boc sur la fonction
amine sont
commercialement disponibles (comme le N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthanol ou le 1-
amino-
3,6,9-trioxaundecany1-11-ol) ou peuvent être préparés à partir des diols PEG,
commercialement
5 disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101.
0 y 0
RbZb0C-ALKfr le OH
'IS
H2N,NH
11
p1-24 0 préparé
selon le schéma ci-dessous :
(i)OE 0 0 0 OH
FmocHNOH Pl-LOH (iii)
FmocHN SFmocHN N N
0 FmocH
H
0 0 0 0
0
(L-citrulline)
"2"-y-NH
1-y\LI NH H2NNH (iv)
oJLALKJ0 0 frH f= r'OH H33 OH
H2 -NITrN N Selle
(vo z H
0 0 __
0 0
cr)ALKIL
0
(y) I0 0 o
Etape (i) : activation de la Fmoc-L-valine sous forme d'ester NHS; la réaction
est réalisée dans
un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec le NHS
en présence
10 d'un agent de couplage comme le DCC.
Etape (ii) : couplage peptidique entre la Fmoc-L-valine-NHS et la L-citrulline
; la réaction est
réalisée dans un solvant polaire comme un mélange diméthoxyéthane/THF/eau en
présence
d'une base comme le bicarbonate de sodium.
Etape (iii) : couplage peptidique avec l'alcool 4-aminobenzylique ; la
réaction est réalisée dans un
15 solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'un agent de
couplage comme
l'EEDQ.
Etape (iv) : déprotection de l'amine Fmoc ; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire comme
un mélange DCM/méthanol en présence d'une base comme la diéthylamine.
Etape (y) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS; la
réaction est réalisée
20 dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le
NHS en présence d'un
agent de couplage comme le chlorhydrate d'EDCI.
Etape (vi) : couplage peptidique entre le dipeptide et l'ester NHS; la
réaction est réalisée à TA
dans un solvant polaire aprotique comme un mélange DCM/acétonitrile.
Les diacides monoprotégés sous forme d'ester allylique sont commercialement
disponibles pour
25 n=2 (succinate de monoallyle) ou peuvent être préparés par
transestérification des monoesters
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51
méthyliques ou tert-butyliques qui sont commercialement disponibles pour n = 2
à 6.
o 0
H
RbZb0C-ALK-(OCH2CH2)i)Ç N
N 10 OH
H (: H
ç
H2NNH
PI-25 0 préparé selon le schéma ci-
dessous :
(0
'Ir- OH N 0 (H)
FmocHN , _
0
FmocHNX*--1 I'OH (III) FmocH N'ICir irl Ut N el OH
FmocH 'II( a'r;1
d 0 H2N,LL,0H 0 - 0 H
0
\ (
1-121NH H2N_Ior NH H2NIN H (iv)
o
0 OH OH
\ -ÇLK--'-'"O'-''<lj'n N'Ir Erl j. N el
- (vi)
H21\firl'-'1N ille
0
0 \
i
H2N: o
H (y)
0 0 H2N.,lrNH
Etape (i) : activation de la Fmoc-L-valine sous forme d'ester NHS; la réaction
est réalisée dans
un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec le NHS
en présence
d'un agent de couplage comme le DCC.
Etape (ii) : couplage peptidique entre la Fmoc-L-valine-NHS et la L-citrulline
; la réaction est
réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DME/THF/eau en présence
d'une base
comme le bicarbonate de sodium.
Etape (iii) : couplage peptidique avec l'alcool 4-aminobenzylique ; la
réaction est réalisée dans un
solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'un agent de
couplage comme
l'EEDQ.
Etape (iv) : déprotection de l'amine Fmoc ; la réaction est réalisée dans un
solvant polaire comme
un mélange DCM/méthanol en présence d'une base comme la diéthylamine.
Etape (y) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS; la
réaction est réalisée à
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS
en présence
d'un agent de couplage comme le DCC supporté.
Etape (vi) : couplage peptidique entre le dipeptide et l'ester NHS; la
réaction est réalisée à TA
dans un solvant polaire aprotique comme un mélange DCM/acétonitrile.
Les diacides PEG monoprotégés sous forme allyle sont préparés selon la
description de
préparation du linker L14.
RbZb
z
0
p1-26 Z= Br ou I =
Le bromoacétate et l'iodoacétate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle sont des
produits commerciaux
dont les numéros CAS sont respectivement 42014-51-7 et 39028-27-8.
Tableau II
Précurseurs de linkers Dérivés de cryptophycine de formule
(11)2 5
CD
1=.)
0
0 --,
--,
,,---
0
e:--,
G Réaction(s)1
(010 0,,,0 0 HN , ,, CI
--,
Famille de linker dérivée du
L IX ID
PL exemples de PL L
u,
précurseur PL
X-0,'--pli `o OMe 1.)
avec L =
o
0
0
PLi S'S N"----) -(CH2)nCI I-1 ZaS-
ALK)'N'-'1 HS
N--
NH N
ex.i N,
ZaS-ALK,Nõ---,1 HS 0
N----'1
PI-2 -(CH2)nCI substitution L2
nucléophile
NH
1\1'(Ch12)n
ex.5
I\)
[pour Za=H, étape
-4
supplément. de R,2
I12 C51
C51
_IIHS N -4
PI-3 S,s NHRõ
-(CH2)nCI réduction] L3 ZaS-ALK '-
(cF12)n uh 0)
R12=H ou Rõ=Me R,=H :
ex.3 ou R,=Me : ex.4
I.)
ir,12 Ri2
0
ZaS-ALK-11'''-''-I HSri.r---1 H
H
PI-4 -(CH2)nCi L4
i
NH
H
r\l'(Chl2)n-
L,õN- n)
i
R12=H ou R12=Me
n)
0
I12
/0 o Lo
0
PL5 N,0 S,s>,r,Ira -(CH2)n0H acylation L5 RbZb-CO-ALK-SS-
ALK'N'Tr '(CH2)n
1 0
s y
O o 0
o o
activation, couplage,
o
-(CH2)n0H [évent. transformation 1
.-6a
0 2 y
d'un ZbRb en un autre 0
\ o o o
ZbRb, par ex. pour
o md
n
-c)-N
R12 0 H (
0 0
-
P 1-6 (C
-- --,,,..,,---,_00,---õUDH
F12)nN F12 ZbRb= L6b RbZb-00-ALK-
(00H20H2)r Ir(CH2)n
0 0
0
0
déprotection,
activation par NHS]
cD
estérification, o
/0
un
o
-(CH2)n [évent. transformation L6c RbZb-CO-
ALK-(OCH2CH2)L0.*(0H2)
CO2H d'un ZbRb en un autre
0
0
ZbRb, par ex. pour
o
¨O
-N
o
ZbRb= 0
1J
déprotection,
ID
--,
activation par NHS]
--,
'a
substitution
ID
i-,
nucléophile, [évent.
ID
un
transformation d'un
1J
ZbRb en un autre
o I12
à,,j-02.1c,,,_,,Ø.,,--,0..---3.,N.,,,
ZbRb, par ex. pour R12
-(CH2)n ¨O¨N
CI o
I-7a RbZb-CO-ALK-
(OCH2CH2)i '(CH2) 0
O
R12 =H : ex.14 ou R12=Me : ex.15
ZbRb= o
déprotection,
activation par NHS]
activation,
n
couplage, [évent.
o
transformation d'un
n)
O
ZbRb en un autre 12
I2 --1 o I
NHR R
61
PL, (Dj)--'4 12 -(CH2)11 ZbRb, par ex. pour
I-7b N 0
(CH2)
RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2r ----H-
0
0 uy, (5)
-1(5)
R12 = H ou Me OH o
0
0 Ri2 =H : ex.18 ou R12=Me té.) n)
¨0¨N
N
0
ZbRb= o
H
déprotection,
H
I
H
activation par NHS]
n)
i
amidification, [évent.
n)
(....)
transformation d'un
ZbRb en un autre
o
ZbRb, par ex. pour o
o 0
-(CH2)n o RbZb-CO-ALK-
(OCH2CH2)i-,
N-k(CH,),,
0 3
I-7c 1
R
ID
1412
CO2H ¨O¨N 12
R12 =H ou Me
ZbRb= o
déprotection,
activation par NHS]
n
/0 o
substitution
RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)LN,,,
;-+-
PI-8
-(CH2)nCI nucléophile, [évent. 1
1-8 ril
transformation d'un
(Ch12),,- o
O !,NH
N ex 16
ZbRb en un autre
--,
ID
ZbRb, par ex. pour
RbZb-CO-ALK,N.,-----,1
0 '
a
ui
,OEIrs,,,,i
-(CH2)N
nCI 1-9
0
PI-9 0 1.NH
l\i'(Ch12),,+
\ 0 ex.13 e
o
0
0 0
0 r"-NH ¨O-N
PI-10 ''''>-------01-(N'-) -(CH2)nCI , ,
Lbrcb= 0 I-10 RbZb-CO-ALK-J-LN---
1
__r%,(1-r-)
0
N.----1
0
0 déprotection, IN-(CI-
12)n
0
activation par NHS]
--,
--,
,o
'a
0 0
.
;ri HS
(C11,0- substitution RbZb-CO-ALK-(OCH,CH2)iN S¨(131-,,
Un
I.)
'0 0
I-11
0 00.-------õ_,.0,---,N)-LõBr nucléophile I12
PI-11
3
H
ex.17
0
0 0
0 HS-(9'(C1-120- substitution s.
PL12 N,0 ..11.._.---,0,----,, 0,---, Br L12 RbZb-CO-ALK-
(OCH2CH2)1" (Ch12)n N---)
nucléophile
0
0
0
0
c)
N,0 1
nucléophile L13 RbZb-CO-ALK-
(OCH2CH2)substitution s
¨
> o------,:, -------st >e
PL13 H C)j-)SH -(CH2)nCI
1
'(CH2),,
0
O
K.)
--1
'o o cn
amidification,
112O CY)
-
RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i,,, ,N, H --I
déprotection, Liaa
0 (CH2)nNH2 = =
4à. I.)
activation 0
o o
PLia ----..k.,,,,o--11õ,¨. ,-õo
o 3 '------If. F1
' 0 o N
0
o estérification,
RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i3O, H
-(CH2)n0H déprotection, Liab
If (cH2)n¨ H
I
0
H
activation
o
i
I.)
(....)
0
N=N
0
0
0
0
N,
Nr--N
0
0
PI-15 0 -(CH2)nN3 cycloaddition L15 RbZb-CO-ALK-
(0CH2CH2)i(CH2)n
0\----,
0 (3
0¨\_..0 n
\--\
(:).¨\___
0
Ex20 O NI,N
\--ri
'a
u,
ce
c7,
0
0
,l2 N-0
0 - RbZb-CO-ALK-
(OCH2CH2)i-N V ¨ \___,,_,,, \___,3
pLi6 r:J.0 o,-,20,-,,Nj (CH2)nNR12- cycloaddition
L16 (CE12),, 0 0
CD
0
----\
' CH2CCH
oZ N,N
-\---N' I ID
I-,
-,-D.--
0
0
- 0
/ N=N
/
Un
PI-17 N,0 -(CH2)nN3 cycloaddition L17 RbZb-CO-ALK
'(CH2)
0
0
ex.19
ou acide 5-hexynoïque
o o
\ N.0 , - N=N R,
'' 0 N=N R12
pL18 N3 (CH2)nN R12- cycloaddition L18 RbZb-
CO-ALK-N '(CF12).-- N.c)NN,,Sr
0 CH2CCH
0
0
R12=Me : ex.21
(:) o
0
pL19 N,0)---0,_j5) -cH=cH2 métathèse L10., 0,
RbZb-CO-ALK-(OCH2CH21 ) l-
)1,2
0
o 0
Q
(:) o
o
o 0
pl-20 -I
CH=CH2 métathèse L20 RbZb-
CO-ALK
N,0
0
(Y)
0
(Y)
-4
Un
(Y)
12
MeSS NM e NHR 52 R',2
Cil N
--'0----1-,---12
N
-(CH2)a n L21
ZaS-ALK-CH(N0"--\--",li'(CH2)
PL21
0
H
i=3
R'12=H ou R'12=Me : ex.6 H
I
R'12= H OU Me substitution
H
H nucléophile
H 12 K)
i
N,---- o,,---õ,_ NHR'12 R12
R'12
MeSS I i [pour Za=H, étape
HS
1
3 CA
p1-22 0 -(CH2)na supplément. de L22
ZaS-ALKy rl ------"0="-`-, il'(CH2)n 0
i=3 0
réduction]
R12=H ou R'12=Me : ex.7
R'12= H OU Me
R12
52
p1-(CH2CH20),-CH2CH2-NHR,2 IV
FIS..õ---- .,-----õ,_ N..õ--
0
p1-23 -(CH2)na L23 ZaS-(CH2CH20)i-CH2CH( -(C112), 3
R12= H OU Me
R12=H ou Me
(:) H
OH
2 0
H H
n
çfo (cH2)n < 0 cl
0
frii i = 0
0 'j75
,--+--
_O 1 il activation, o
çri_o
NX N----' -N
H
_ H
N 0 0 r.....
\\_¨H
0 _ couplage,
C O N ,
p1-24 ( \ ,, j (CH2)nNH2 déprotection,
L24 0
2
NH activation RbZb-CO-ALK H NH HN
NH
fil
H2N-
il,
0
=F 0 0
H2N- ce
0 Cl
H
H
OyN
,2
(Ch12).- 0N...,,_%
1
0 çs-OH
0o
el
0
n.)
o
¨S411Hactivation,
>.\
ô
N 0 (__ \ L25 0--NH
0,
PL25 0- - couplage,
,NH 0
H (CH2)nN H2 déprotection,
i¨,
NH
1-12N¨
activation
of--ce
0 0
EN1 0 H 1=.)
(D--/ 0 NH
0
N
0, NH
H2N0
H2N (2)
0 i
0
-\¨ RbZb-CO-
ALK-(OCH2CH2)1
çrl,c,
0--------P-----
0
Ici o0
0
0
Hs-C),
0- substitution
P 1-26 N_o J--z (C11, L26 RbZb (C1-
12)
N"----)
/ nucléophile
o
0
N n
z = I, Br
>
1 pour plus de détails, voir aussi la partie exemples de réactions ci-
dessus. o
2
I.)
les exemples sont donnés pour un dérivé de cryptophycine particulier, mais
peuvent s'appliquer à tout dérivé de cryptophycine de formule ( I I ) ,
notamment Di-D8. -.]
i:5)
+s .
cõ
,
3 (01-12)n¨
(J4 i:5)
correspond à une structure de linker clivable disulfure choisie parmi les
linkers L1 à L.4 ouL21 à L23. C: IV
4
R12 et R
N
'12 : H ou groupe (Ci-C6)alkyle, par ex. méthyle ; n : entier allant de 1 à 6
; i : entier allant de 1 à 20, plus particulièrement de 1 à 10, plus
particulièrement de 1 à 8, ou o
de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5. i peut prendre chacune des
valeurs de ces plages, notamment valoir 2, 3, 4 ou 5. H
H
dans le Tableau Il, L est ici donné en para mais il est possible d'obtenir des
composés avec L en ortho ou en méta de façon similaire. IH
IV
I
IV
(...i
eld
n
.3
--,
o
--O3
un
o
o
oe
o
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Procédé de préparation du conjugué
Le conjugué est obtenu par le procédé consistant à:
(i) mettre en contact et laisser réagir une solution aqueuse de l'agent de
ciblage éventuellement
tamponnée et une solution du dérivé de cryptophycine de formule (II) ;
(ii) puis à éventuellement séparer le conjugué formé à l'étape (i) du dérivé
de cryptophycine et/ou
de l'agent de ciblage n'ayant pas réagi et/ou des agrégats qui se seraient
formés.
Plus particulièrement, on ne sépare à l'étape (ii) le conjugué de l'étape (i)
que du dérivé de
cryptophycine n'ayant pas réagi et des agrégats qui se seraient formés et on
laisse dans la
solution l'agent de ciblage qui n'aurait éventuellement pas réagi.
La mise en contact a pour fonction de laisser réagir les groupes chimiques
GCR1 et GCR2 afin
d'assurer l'attachement du dérivé de cryptophycine sur l'agent de ciblage par
formation d'une
liaison covalente ; de préférence,
= lorsque GCR1 représente ¨SZ, : on modifie l'agent de ciblage à l'aide d'un
agent de
modification de façon à introduire sur l'agent de ciblage des groupes GCR2
adaptés,
notamment ceux décrits dans la 2ème colonne du Tableau I :
o des groupes chimiques disulfures dans le cas où GCR1 représente ¨SH ;
o des groupes chimiques thiol dans le cas où GCR1 représente -SZ, avec Za#1-
1;
0 des groupes chimiques maléimido ou iodoacétamido dans le cas où GCR1
représente ¨SH ;
Dans le cas d'un anticorps (MAb), on trouve les formules des conjugués dans la
4ème
colonne du Tableau I ;
= lorsque GCR1 représente ¨C(=0)-ZbRb : la réaction a lieu
préférentiellement sur les
fonctions amino de l'agent de ciblage, notamment les groupes e-amino portés
par les
chaînes latérales des résidues lysine (Lys) d'un anticorps. Dans le cas d'un
anticorps
(MAb), on obtient dans ce cas un conjugué de formule : MAb4NH-C(=0)-L*-Cryptok
avec
L* = fragment d'un linker L comprenant GCR1=-C(=0)-ZbRb et tel que L= -L*C(=0)-
ZbRb ;
= en présence d'un dérivé de cryptophycine de formule (III) avec G= -
(CH2)nY, l'agent de
ciblage comprend des groupes ¨SH lorsque Y= -Cl, des groupes -CCI-1 lorsque Y=
-N3
ou des groupes acide carboxylique lorsque Y= -OH ou -NH2 ;
= en présence d'un dérivé de cryptophycine comprenant un groupe chimique
réactif GCR1
de type maléimido ou haloacétamido, l'agent de ciblage comprend des groupes
chimiques thiols.
On entend par agrégats les associations qui peuvent se former entre deux
agents de ciblage
ou plus, les agents de ciblage ayant été modifiés ou non par conjugaison. Les
agrégats sont
susceptibles de se former sous l'influence d'un grand nombre de paramètres
tels qu'une
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concentration élevée en agent de ciblage dans la solution, le pH de la
solution, des forces de
cisaillement élevées, le nombre de dimères greffés et leur caractère
hydrophobe, la température
(voir les références citées dans l'introduction de J. Membrane Sci. 2008, 318,
311-316),
l'influence de certains d'entre eux n'étant parfois pas éclaircie avec
précision. Dans le cas des
protéines ou des anticorps, on pourra se reporter à AAPS Journal, Protein
Aggregation and
Bioprocessing 2006, 8(3), E572-E579. La teneur en agrégats peut être
déterminée à l'aide de
techniques connues telles que la SEC (voir à ce propos, Analytical
Biochemistry 1993, 212 (2),
469-480).
La solution aqueuse de l'agent de ciblage peut être tamponnée à l'aide par
exemple de tampons
tels que par exemple le phosphate de potassium ou l'acide N-2-
hydroxyéthylpipérazine-N'-2-
éthanesulfonique (tampon HEPES) ou un mélange de tampons tel que le tampon A
décrit plus
loin. Le tampon dépend de la nature de l'agent de ciblage. Le dérivé de
cryptophycine est mis en
solution dans un solvant organique polaire, par exemple le DMSO ou la DMA.
La réaction a lieu à une température comprise généralement entre 20 et 40 C.
La durée de la
réaction peut varier entre 1 à 24 h. La réaction entre l'anticorps et le
dérivé de cryptophycine peut
être suivie par SEC avec un détecteur réfractométrique et/ou ultraviolet afin
d'en déterminer l'état
d'avancement. Si le taux de substitution est insuffisant, on peut laisser
réagir plus longtemps
et/ou ajouter du dérivé de cryptophycine. On pourra se reporter à la méthode
générale donnée
dans la partie exemples pour plus de détails sur des conditions particulières.
Des modes
particuliers sont décrits dans les exemples 9, 10, 11, 25, 26 ou 27.
L'homme du métier dispose de différentes techniques chromatographiques pour la
séparation de
l'étape (ii) : le conjugué peut être purifié par exemple par chromatographie
d'exclusion stérique
(SEC), par chromatographie d'adsorption (comme l'échangeuse d'ions, IEC), par
chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC), par chromatographie
d'affinité, par
chromatographie sur des supports mixtes comme l'hydroxyapatite céramique ou
par HPLC. La
purification par dialyse ou diafiltration peut également être utilisée.
Après l'étape (i) ou (ii), la solution du conjugué peut subir une étape (iii)
d'ultrafiltration et/ou de
diafiltration. On obtient donc à l'issue de ces étapes le conjugué en solution
aqueuse.
Anticorps
L'anticorps (voir à ce propos, Janeway et al. Immunobiology , 5ème édition,
2001, Garland
Publishing, New York) pourra être choisi parmi ceux décrits notamment dans WO
04043344, WO
08010101, WO 08047242, WO 05009369 (anti CA6) ou WO 2010014812. L'anticorps
peut être
éventuellement modifié à l'aide d'un agent de modification afin de favoriser
l'attachement du
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dérivé de cryptophycine (voir ci-dessus). L'anticorps peut être notamment
monoclonal, polyclonal
ou multispécifique. Il peut s'agir aussi d'un fragment d'anticorps. Il peut
s'agir aussi d'un anticorps
murin, humain, humanisé ou chimérique.
Conjugué
Un conjugué comprend généralement de l'ordre de l'ordre de 1 à 10 dérivés de
cryptophycine
attachés de façon covalente à l'agent de ciblage (il s'agit du taux de
greffage ou "drug-to-
antibody ratio" ou "DAR" en Anglais). Ce nombre varie en fonction de la nature
de l'agent de
ciblage et du dérivé de cryptophycine ainsi que des conditions opératoires
utilisées dans le
procédé de conjugaison (par exemple nombre d'équivalents de dérivé de
cryptophycine par
rapport à l'agent de ciblage, temps de réaction, nature du solvant et de
l'éventuel cosolvant). La
mise en contact de l'agent de ciblage et du dérivé de cryptophycine conduit à
un mélange
comprenant plusieurs conjugués se distinguant individuellement les uns des
autres par des DAR
différents ; éventuellement l'agent de ciblage n'ayant pas réagi ;
éventuellement des agrégats. Le
DAR qui est déterminé sur la solution finale correspond donc à un DAR moyen.
Dans le cas où l'agent de ciblage est un anticorps, la spectroscopie UV peut
être une méthode
utilisée pour déterminer le DAR. Cette méthode s'inspire de celle présentée
dans Antony S.
Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols , vol. 525,
445, Springer
Science. Elle consiste à mesurer l'absorbance d'une solution de conjugué après
l'étape de
séparation (ii) à deux longueurs d'onde notées X1 et X2. On utilise les
coefficients d'extinction
molaires suivants de l'anticorps nu et du dérivé de cryptophycine mesurés
préalablement à la
conjugaison.
Les absorbances de la solution de conjugué à X1 et X2 (Am) et (Au) sont
mesurées soit sur le pic
correspondant du spectre SEC (ceci permet de calculer un "DAR(SEC)") ou en
utilisant un
spectrophotomètre UV classique (ceci permet de calculer un "DAR(UV)"). Les
absorbances
peuvent être exprimées sous la forme :
= (cD x ED ?A) + (CA X EA ?A)
= (CD X ED A2) + (CA X EA72)
équations pour lesquelles :
= cD et cA désignent respectivement les concentrations dans la solution de
la partie du
conjugué relative au dérivé de cryptophycine et la partie du conjugué relative
à
l'anticorps ;
= ED ?A et ED u désignent respectivement les coefficients d'absorption
molaires du dérivé de
cryptophycine avant conjugaison aux deux longueurs d'onde X1 et X2,
coefficients
mesurés sur les composés de formule (Il) de type SZ, avec Za=-SMe ou de type -
C(=0)-
ZbRb avec ZbRb= OMe ou OCH2-CH=CH2 ;
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,
= EA Met EA 22 désignent respectivement les coefficients d'absorption
molaires de
l'anticorps nu aux deux longueurs d'onde X1 et X2.
On entend par anticorps nu, l'anticorps auquel n'est attaché aucun dérivé de
cryptophycine,
5 c'est-à-dire l'anticorps avant l'étape de conjugaison.
La résolution de ces deux équations conduit à:
CD = [(CA X1 X Al2) (CA X2 X A1)] / [(CD X2 X CA X1) (CA 12 X CD X1)}
CA = [Am ¨ (CD X CD X1)] / CA X1
Le DAR moyen correspond alors à cc, / C. Dans le cas des dérivés de
cryptophycine, on peut
considérer la longueur d'onde X1= 280 nm et selon la nature du dérivé de
cryptophycine, X.2 est
choisie dans la gamme de longueurs d'onde spécifiques 246 nm - 252 nm. Le
DAR(UV) est de
préférence supérieur à 0,5, plus particulièrement compris entre 1 et 10,
encore plus
particulièrement entre 2 et 7.
Le conjugué peut être utilisé en tant qu'anticancéreux. De par la présence de
l'agent de ciblage,
le conjugué est rendu très sélectif vis-à-vis des cellules tumorales plutôt
que des cellules
saines. Ceci permet de diriger le dérivé de cryptophycine dans un
environnement proche de
celles-ci ou directement à l'intérieur de celles-ci (à ce propos, voir les
publications suivantes qui
décrivent l'utilisation de conjugués d'anticorps monoclonaux dans le
traitement de cancers :
Antibody-drug conjugates for cancer therapy Carter P.J., et al., Cancer J.
2008, 14, 154-
169; Targeted cancer therapy: conferring specificity to cytotoxic drugs
Chari R., Acc. Chem.
Res. 2008, 41, 98-107). Il est possible de traiter des cancers solides ou
liquides. Le conjugué
peut être utilisé seul ou en combinaison avec au moins un autre anticancéreux.
Le conjugué est formulé sous forme d'une solution aqueuse tamponnée à une
concentration
généralement comprise entre 1 et 10 mg/ml. Cette solution peut être injectée
sous forme de
perfusion telle qu'elle ou bien être rediluée pour former une solution de
perfusion.
[Exemples]
Méthodes analytiques utilisées
Chromatographie liquide haute pression ¨ Spectrométrie de masse (LCMS)
Méthode Al
L'analyse est réalisée sur un appareil Waters ZQ et une colonne XBridgemc C18
2,5 pm
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(3x50 mm) à 70 C avec un débit de 0,9 ml/min, un gradient d'élution (7 min) de
(A)
eau/0,1 /0 acide formique et de (B) acétonitrile/0,1% acide formique (gradient
: de 5% à
100% B en 5,3 min ; 5,5 min : 100% B; 6,3 min : 5% B) et une ionisation
électrospray en
mode positif et/ou négatif.
Méthode A2
L'analyse est réalisée sur un appareil Waters UPLC-SQD et une colonne
Acquitymc BEH C18
1,7 pm (2,1x50 mm) à 50 C avec un débit de 1 ml/min, un gradient d'élution (2
min) de (A)
eau/0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile/0,1% acide formique (gradient
: de 5% à 50%
B en 0,8 min ; 1,2 min : 100% B; 1,85 min : 100 /0 B; 1,95 min : 5% B) et une
ionisation
électrospray en mode positif et/ou négatif.
Méthode A3
L'analyse est réalisée sur un appareil Waters UPLC-SQD et une colonne
Acquitymc BEH C18
1,7 pm (2,1x50 mm) à 70 C avec un débit de 1 ml/min, un gradient d'élution (2
min) de (A)
eau / 0,1 A acide formique et de (B) acétonitrile / 0,1% acide formique
(gradient : de 5% à
50% B en 1 min ; 1,3 min : 100% B; 1,45 min : 100% B; 1,75 min : 5% B) et une
ionisation
électrospray en mode positif et/ou négatif.
Méthode A4
L'analyse est réalisée sur un appareil Waters ZQ et une colonne Phenomenex
Kinetexmc
C18 100A 2,6 pm (3x50 mm) à 45 C avec un débit de 1 ml/min, un gradient
d'élution (6 min)
de (A) eau/0,1% acide formique et de (B) acétonitrile/0,1% acide formique
(gradient : 6% B:
0,8 min ; de 6% à 100% B en 4,1 min ; 4,8 min : 100% B; 5,0-6,0 min : 6% B) et
une
ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif.
Méthode A5
L'analyse est réalisée sur un appareil Waters ZQ et une colonne Phenomenex
Kinetexmc C18
2,6 pm (3x1000 mm) à 50 C avec un débit de 0,8 ml/min, un gradient d'élution
(8 min) de (A)
eau/0,1% acide formique et de (B) acétonitrile/0,1% acide formique (gradient :
4% B: 0,15
min ; de 4% à 100% B en 6,85 min ; 7,1 min : 100% B; 7,4-8,2 min : 4% B) et
une ionisation
électrospray en mode positif et/ou négatif.
Spectrométrie de masse (MS)
Les spectres ont été réalisés par introduction directe sur un appareil WATERS
GCTof
(introduction directe sans LC).
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,
62
Chromatographie d'exclusion stérique ¨ Spectrométrie de masse haute résolution
(SEC-
HRMS)
L'analyse peut nécessiter une étape préalable de déglycosylation du conjugué.
Celle-ci est
réalisée en ajoutant à la solution de conjugué 2% en volume d'une solution
d'enzyme
PNGase F (préparée en complétant à 100 ml un flacon de 100 unités de
lyophilisat
d'enzyme N-glycanase avec de l'eau milliQ). La solution est homogénéisée à
l'aide du vortex
et incubée à 37 C pendant 19 h. L'échantillon déglycosylé est prêt à être
analysé par SEC-
HRMS. L'analyse chromatographique est réalisée sur un appareil Agilent HP1100
et une
colonne Waters Biosuite 250 HR SEC 4 pm (4,6x300 mm) à 30 C avec un débit de
0,4
ml/min et une élution isocratique de (A) formiate d'ammonium 25 mM pH=7 1(B)
acétonitrile
70/30 de 15 min. La spectrométrie de masse est réalisée sur un appareil Waters
QTOF II
avec une ionisation électrospray en mode positif. Les spectres de masse sont
déconvolués
avec le logiciel Waters MaxEnt1.
Chromatographie d'exclusion stérique (SEC HPLC)
L'analyse est réalisée sur un appareil Merck Lachrom Elite HPLC avec un
détecteur
spectrophotométrique L2455 DAD et une colonne Tosoh Bioscience TSKgelmc G3000
SWXL
5pm (7,8x300 mm) avec un débit de 0,5 ml/min et une élution isocratique de 30
min avec un
tampon pH=7 contenant 0,2 M de KCI, 0,052 M de KH2PO4, 0,107 M de K2HPO4 et
20% en
volume d'isopropanol.
Résonance magnétique nucléaire 1H (RMN)
Les spectres RMN 1H ont été réalisés sur un spectromètre Bruker Avancemc soit
DRX-300,
DRX-400, DRX-500 ou DMX-600. Les déplacements chimiques sont donnés en ppm.
Méthode générale utilisée pour préparer les conjugués dans le cas des dérivés
de
cryptophvcine comprenant un linker L terminé par -SZa
Méthode en deux étapes successives
lè" étape
L'anticorps est tout d'abord modifié par un ester activé NHS, afin
d'introduire à sa surface
des groupements pyridyldisulfures. Une solution d'anticorps hu2H11 dans un
tampon
aqueux pH=6,5 contenant 0,05 M de phosphate de potassium et 0,05 M de NaCI
(désigné
par tampon A) est traitée par 5 à 10 éq. de l'ester activé NHS en solution
dans la DMA de
telle sorte que la concentration finale en anticorps soit comprise entre 5 et
10 mg/m1 et le
pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 5%. La réaction est poursuivie
pendant 2 h
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à TA. Le mélange est déposé sur une colonne de filtration sur gel (matrice
Sephadexmc G25,
GE Healthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=8 contenant
0,05 M de
HEPES, 0,05 M de NaCI et 2 mM d'EDTA. L'anticorps modifié est élue avec le
tampon
HEPES pH=8, collecté puis dosé par spectrométrie UV afin de déterminer la
concentration
en anticorps de l'échantillon ainsi que le nombre de groupements
pyridyldisulfures. Un
prélèvement de l'anticorps modifié est traité avec le dithiothréitol afin de
réduire la liaison
disulfure, la pyridine-2-thione libérée est dosée par spectrométrie
(coefficients d'extinction :
8343 nm : 8080 M-1cm-1, E-280 nm 5100 M-1cm-1 pour la pyridine-2-thione, et
E280 nm 208380
M-1cm-1 pour l'anticorps). En moyenne, de 3 à 6 groupements pyridyldisulfures
sont greffés
par molécule d'anticorps.
2ème étape
La solution d'anticorps modifié de la 1&e étape est diluée dans le tampon
aqueux pH=8 décrit
ci-dessus puis traitée par une solution du dérivé de cryptophycine (5 éq.) de
telle sorte que
la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/m1 et le pourcentage de DMA
dans le
tampon aqueux de 20%; le nombre d'équivalents de dérivé de cryptophycine est
exprimé
par rapport au nombre de molécules de pyridyldisulfures introduites lors de la
première
étape. La réaction est poursuivie pendant la nuit à 30 C ou sous une agitation
d'environ
2000 rpm. Le mélange est analysé par SEC HPLC afin de déterminer le taux de
greffage du
dérivé de cryptophycine sur l'anticorps. Si le taux de substitution est
insuffisant, le mélange
est traité avec 1 à 5 éq. supplémentaire(s) de dérivé de cryptophycine dans la
DMA pendant
3 h à 30 C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est filtré sur
filtre Millex0-
SV 5 pm (membrane PVDF, Duraporemc, Milliporemc) puis purifié par filtration
sur gel en
utilisant une matrice Superdexmc 200 pg (colonne HiLoad 16/60 desalting,
GEHealthcare) au
préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de
phosphate,
0,14 M de NaCI et 10% à 20% de NMP. Les fractions contenant l'anticorps
conjugué sous
forme monomérique sont collectées, rassemblées et concentrées sur Amiconmc
Ultra-15
(membrane Ultracelmc 10k ou 50k, Milliporemc) jusqu'à une concentration
comprise entre 2 et
5 mg/ml. Un changement de tampon est finalement réalisé afin d'éliminer le
solvant
organique du tampon de conservation du conjugué. Le conjugué est déposé sur
une colonne
de filtration sur gel composée d'une matrice Sephadexmc G25 (colonnes Nap-5, -
10, PD-10,
Hiprep 26/10 desalting, GE Healthcare) au préalable équilibrée avec un tampon
aqueux de
composition et pH adaptés à chaque conjugué. Le conjugué final est dosé par
spectrométrie
UV en utilisant les coefficients d'extinction déterminés pour l'anticorps et
le dérivé de
cryptophycine correspondant afin de mesurer la concentration en anticorps et
le nombre
moyen de cytotoxique par anticorps. Le taux de substitution peut également
être calculé à
partir de la déconvolution du spectre SEC-HRMS du conjugué.
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,
64
Méthode en deux étapes one-pot
L'anticorps est tout d'abord modifié par un ester activé NHS, afin
d'introduire à sa surface
des groupements pyridyldisulfures. Une solution d'anticorps hu2H11 dans un
tampon
aqueux pH=6,5 contenant 0,05 M de phosphate de potassium et 0,05 M de NaCI est
diluée
avec le tampon phosphate pH=6,5 et une solution aq. d'HEPES 1N de telle sorte
que la
proportion finale de tampon phosphate initial pH=6,5 et d'HEPES soit de 96/4
afin d'obtenir
un Cette solution d'anticorps est traitée par 5 à 10 éq. de
l'ester activé NHS en
solution dans la DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps
soit comprise
entre 5 et 10 mg/mi et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 5%. La
réaction
est poursuivie pendant 2 h à TA. La solution d'anticorps ainsi modifié est
directement diluée
avec un mélange 96/4 de tampon phosphate pH=6,5 et d'HEPES puis traitée par
une
solution du dérivé de cryptophycine (4 éq.) dans la DMA de telle sorte que la
concentration
finale en anticorps soit de 3 mg/mi et le pourcentage de DMA dans le tampon
aqueux de
20%; le nombre d'équivalents de dérivé de cryptophycine est exprimé par
rapport au
nombre d'équivalents d'ester activé NHS introduits lors de la première étape.
La réaction est
poursuivie pendant la nuit à 30 C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le
mélange est
analysé par SEC HPLC afin de déterminer le taux de greffage du dérivé de
cryptophycine
sur l'anticorps. Si le taux de substitution est insuffisant, le mélange est
traité avec 1 à 5 éq.
supplémentaire(s) de dérivé de cryptophycine dans la DMA pendant 3 h à 30 C ou
sous une
agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est filtré sur filtre Millex -SV 5 pm
(membrane
PVDF, Duraporemc, Milliporemc) puis purifié par filtration sur gel en
utilisant une matrice
Superdexmc 200 pg (colonne HiLoad 16/60 desalting, GEHealthcare) au préalable
équilibrée
dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCI et
10% à
20% de NMP. Les fractions contenant l'anticorps conjugué sous forme
monomérique sont
collectées, rassemblées et concentrées sur Amiconmc Ultra-15 (membrane
Ultracelmc 10k ou
50k, Milliporemc) jusqu'à une concentration comprise entre 2 et 5 mg/ml. Un
changement de
tampon est finalement réalisé afin d'éliminer le solvant organique du tampon
de conservation
du conjugué. Le conjugué est déposé sur une colonne de filtration sur gel
composée d'une
matrice Sephadexmc G25 (colonnes Nap-5, -10, PD-10, Hiprep 26/10 desalting, GE
Healthcare) au préalable équilibrée avec un tampon aqueux de composition et pH
adaptés à
chaque conjugué. Le conjugué final est dosé par spectrométrie UV en utilisant
les
coefficients d'extinction déterminés pour l'anticorps et le dérivé de
cryptophycine
correspondant afin de mesurer la concentration en anticorps et le nombre moyen
de
cytotoxique par anticorps. Le taux de substitution peut également être calculé
à partir de la
déconvolution du spectre SEC-HRMS du conjugué.
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. ,
Méthode générale utilisée pour préparer les coniuqués dans le cas de dérivés
de
c = to = h cine com = renant un linker terminé = ar ¨C =0 ZbRb
Une solution d'anticorps hu2H11 dans un tampon aqueux pH=8 contenant 0,05 M de
5 HEPES, 0,05 M de NaCI et 2 mM d'EDTA ou étant composé d'un mélange 96/4
d'un tampon
aqueux pH=6,5 contenant 0,05 M de phosphate de potassium et 0,05 M de NaCl /
HEPES
1N est traitée avec un excès d'une solution dans le DMA du dérivé de
cryptophycine de telle
sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/mi et le
pourcentage de DMA
dans le tampon aqueux de 20%. La réaction est poursuivie pendant 3 h à 30 C ou
sous une
10 agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est analysé par SEC HPLC afin
de déterminer le
taux de greffage de cytotoxique sur la population d'anticorps monomériques. Si
le taux de
substitution est insuffisant, le mélange est traité avec 1 à 5 éq.
supplémentaire(s) de dérivé
de cryptophycine dans la DMA pendant 3 h à 30 C ou sous une agitation
d'environ 2000
rpm. Le mélange est filtré sur filtre Millex -SV 5 pm (membrane PVDF,
Duraporemc,
15 Milliporen puis purifié par filtration sur gel en utilisant une matrice
Superdexmc 200 pg
(colonne HiLoad 16/60 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée dans un
tampon
aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 10% à 20% de
NMP.
Les fractions contenant l'anticorps conjugué sous forme monomérique sont
collectées,
rassemblées et concentrées sur Amiconmc Ultra-15 (membrane Ultracelmc 10k ou
50k,
20 Milliporemc) jusqu'à une concentration comprise entre 2 et 5 mg/ml. Un
changement de
tampon est finalement réalisé afin d'éliminer le solvant organique du tampon
de conservation
du conjugué. Le conjugué est déposé sur une colonne de filtration sur gel
composée d'une
matrice Sephadexmc G25 (colonnes Nap-5, -10, PD-10 ou colonne Hiprep 26/10
desalting,
GEHealthcare) au préalable équilibrée avec un tampon aqueux de composition et
pH
25 adaptés à chaque conjugué. Le conjugué final est dosé par spectrométrie
UV en utilisant les
coefficients d'extinction déterminés pour l'anticorps et le dérivé de
cryptophycine
correspondant afin de mesurer la concentration en anticorps et le taux de
greffage. Le taux
de substitution peut également être calculé à partir de la déconvolution du
spectre SEC-
HRMS du conjugué.
Les méthodes décrites pour le cas de l'anticorps hu2H11 pourraient s'appliquer
aussi de
façon semblable à d'autres anticorps, ainsi qu'à d'autres agents de ciblage.
Exemple 1: (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-16-[(S)-
1-
((2R,3R)-3-{4-(4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoy1)-pipérazin-1-ylméthylFphény1}-
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65a
oxirany1)-éthy1]-6,6-diméthy1-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-
2,5,9,12-
tétraone
0
=
N el 0 0 HN..1 ,,, =;'
Composé 2 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-16-{(S)-1-[(R)-3-
(4-chloro-
méthyl-phény1)-oxirany1]-éthyl}-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-
cyclohexadec-
13-ène-2,5,9,12-tétraone
=
e 0 S ..-- 0
HO * 0 0 HN ,, Cl
CI OO0 " CI
0
1 2
Le composé 1 (30 mg; 42,9 mol, préparé selon Al-awar R.S., et al.,
J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007)
est placé en solution dans le DMF anhydre (2 ml) et le mélange est refroidi à
0 C avant ajout de la TEA
(107 mol) puis du CMS (64,6 mol). Après 15 min, le bain est retiré et
l'agitation est poursuivie 12 h à
TA. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt (2 ml) et la phase organique est
lavée par de l'eau (2x1 ml),
par une solution aq. saturée de NaHCO3 (1 ml) et par une solution aq. saturée
de NaC1 (1 ml). La phase
organique est séchée sur MgSO4 et, après filtration et évaporation des
solvants sous PR, le produit 2 est
obtenu sous forme d'une huile incolore qui cristallise (25 mg; 81%). RMN 1H
(500 MHz, DMSO-d6): 0,77
¨0,83 (m, 6 H) ; 1,02 (s, 3 H) ; 1,04 ¨ 1,07 (m, 3 H) ; 1,14 (s, 3 H) ; 1,29 ¨
1,36 (m, 1 H) ; 1,54 ¨ 1,63 (m, 2
H) ; 1,80 ¨ 1,87 (m, 1 H) ; 2,24 ¨2,33 (m, 1 H) ; 2,63 ¨2,73 (m, 2 H) ; 2,96
¨3,06 (m, 3 H) ; 3,28 ¨3,32 (m,
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1 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,93 (d, J=1,6 Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=11,3, 8,0, 3,6
Hz, 1 H) ; 4,78 (s, 2 H) ;
4,93 (dd, J=9,6, 3,6 Hz, 1 H) ; 5,13 (dd, J=10,8, 5,1 Hz, 1 H) ; 5,81 (d,
J=14,8 Hz, 1 H) ; 6,49
(ddd, J=15,0, 11,2, 3,7 Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=8.5,
1,9 Hz, 1 H) ; 7.23 (d,
J=9,6 Hz, 1 H) ; 7,29 (d, J=1,9 Hz, 1 H) ; 7,34 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 7,47 (d,
J=8,2 Hz, 2 H) ; 8,35
(d, J=8,2 Hz, 1 H). LCMS (AI): ES m/z = 713 [M + ; m/z = 715 [M - ; tR =
5,17 min.
Composé 4 : 4-Méthy1-4-méthyldisulfanyl-pentanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-
yle
0
0 0
HO s _____ - N
-0
0
3 4
A une solution, purgée à l'argon, du composé 3 (3,05 g, 15,7 mmol, préparé
selon WO
2007085930) dans le DCM (30 ml) sont successivement ajoutés le NHS (17,3 mmol)
et le
chlorure d'EDC1 (17,3 mmol). Le mélange est agité 3 h à TA avant d'être lavé
avec un tampon
phosphate pH=6 (2x30 ml) puis avec une solution saturée de NaC1 (30 ml), séché
sur Mg504 et
concentré à sec. L'huile ambrée obtenue qui cristallise est lavée par un
mélange heptane/AcOEt
75/25 et filtrée sur un verre fritté pour donner le composé 4 sous la forme
d'un solide blanc (2,08
g, 45%). Le filtrat est concentré à sec et le brut obtenu est purifié par
chromatographie sur gel de
silice, en éluant avec un mélange heptane/AcOEt 50/50 à 0/100. Les fractions
contenant le
produit attendu sont concentrées à sec et reprises dans de l'éther
isopropylique (5 ml) ; le
précipité est filtré sur verre fritté pour donner le composé 4 attendu (1 g,
22%). RMN 1H (400
MHz, DMSO-d6): 1,29 (s, 6 H) ; 1,92 à 1,98 (m, 2 H) ; 2,41 (s, 3 H) ; 2,72 à
2,78 (m, 2 H) ; 2,81
(s, 4 H). LCMS (A4) : El, m/z = 291 [M + H].
Composé 5 : 4-(4-Méthy1-4-méthyldisulfanyl-pentanoy1)-piperazine-1-carboxylate
de tert-butyle
o N
N,0 0
0
0
4 5
Dans un tube Wheatton sont chargés le composé 4 (200 mg, 686 pmol), la 1-Boc-
pipérazine (686
pmol), la TEA (755 pmol) et le DMF (1,6 ml). Le mélange est agité à TA pendant
la nuit puis dilué
avec de l'AcOEt (5 ml), lavé avec de l'eau (2x5 ml), séché sur Mg504 et
concentré à sec. Le brut
est repris dans de l'éther isopropylique (3 ml) ; le précipité est filtré sur
verre fritté pour donner le
composé 5(213 g, 86%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,27 (s, 6 H) ; 1,41 (s, 9
H) ; 1,73 à 1,87
(m, 2 H) ; 2,34 à 2,41 (m, 2 H) ; 2,40 (s, 3 H) ; 3,23 à 3,36 (m partiellement
masqué, 4 H) ; 3,39 à
3,45(m, 4H). LCMS (A2) : ES m/z = 363[M + ; m/z = 307 [M+ H - C41-18]- ; tR
= 1,08 min.
Composé 6: Chlorhydrate de la 4-méthy1-4-méthyldisulfany1-1-pipérazin-1-yl-
pentan-1-one
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67
s(I) o
iiuuS-
N-
_ S'S
il [, NH
0
6 Cl
A une solution du composé 5 (213 mg, 588 pmol) dans le dioxane (4,4 ml) est
ajoutée une
solution HCI 4M dans le dioxane (4,4 ml). L'agitation est poursuivie 4 h à TA.
Le mélange est filtré
sur verre fritté, le solide obtenu est rincé avec du dioxane (2 ml) puis de
l'éther isopropylique (2
5 ml) pour donner le composé 6 (132 mg, 75%) sous la forme d'un solide
crème. RMN 1H (500
MHz, DMSO-d6): 1,27 (s, 6 H) ; 1,73 à 1,85 (m, 2 H) ; 2,37 à 2,45 (m, 2 H) ;
2,40 (s, 3H) ; 2,98 à
3,15 (m, 4 H) ; 3,62 à 3,73 (m, 4H) ; 9,39 (m étalé, 2 H). LCMS (AI): ES m/z =
263 [M + H] ; tR =
2,40 min.
Composé 7: (E)-(35,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-6,6-
diméthyl-16-[(S)-1-
((2R,3R)-3-{444-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoy1)-pipérazin-1-ylméthyl]-
phényll-oxirany1)-
éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
S"--- 0
= i ii =
, 0-- S 0
N----) 1
HN '--
--
H0,),,,,r7- 0 0 0 .,1
1, CI t-õ,õN ' , 0 0 0 HN Cl
'
7 INil
O
Le composé 1 (20,3 mg ; 29,0 pmol) est placé en solution dans le DMF anhydre
(0,77 ml) et la
TEA (72,6 pmol) puis le CMS (43,6 pmol) sont ajoutés. Après 12 h à TA, le
produit 2 formé n'est
pas isolé et la TEA (58,0 pmol) puis le chlorhydrate de la 4-méthy1-4-
méthyldisulfany1-1-pipérazin-
1-yl-pentan-1-one 6 (34,8 pmol) sont ajoutés. Le mélange est agité 72 h
supplémentaires à TA
avant d'être dilué par de l'AcOEt (10 ml). La phase organique est lavée par de
l'eau (2x2 ml), par
une solution aq. saturée de NaHCO3 (2 ml) et par une solution aq. saturée de
NaCI (2 ml). Après
séchage sur Mg504 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut
de la réaction est
purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange
DCM/méthanol 99/1 à
98/2. Un solide blanc, 7, est obtenu (5,7 mg ; 21%). CCM (DCM 90/Me0H 10):
Rf=0,6 ; RMN 1H
(400 MHz, DMSO-d6): 0,75- 0,81 (m, 6 H) ; 1,01 (s, 3 H) ; 1,05 (d, J=6,8 Hz, 3
H) ; 1,12 (s, 3 H) ;
1,26 (s, 6 H) ; 1,28 - 1,33 (m, 1 H) ; 1,52 - 1,61 (m, 2 H) ; 1,76 - 1,83 (m,
2 H) ; 2,27 - 2,38 (m, 4
H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,64 - 2,74 (m, 2 H) ; 2,95 - 3,05 (m, 2 H) ; 3,24 - 3,34
(m, 6 H) ; 3,44 (br. s.,
4 H) ; 3,49 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1,7 Hz, 1 H) ; 4,22 - 4,29
(m, 1 H) ; 4,92 (dd, J=9,9,
3,5 Hz, 1 H) ; 5,08 - 5,15 (m, 1 H) ; 5,81 (d, J=14,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd,
J=15,2, 11,3, 3,5 Hz, 1
H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=8,4, 2,3 Hz, 1 H) ; 7,22 (d, J=9,3
Hz, 1 H) ; 7,25 - 7,34
(m, 5 H) ; 8,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H) ; LCMS (AI): ES m/z = 943 [M + H] ; m/z =
941 [M - HF ; tR =
4,03 min.
Exemple 1 : (E)-(35,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-6,6-
diméthyl-16-[(S)-1-
((2R,3R)-3-{444-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoy1)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényll-
oxirany1)-éthylF
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1,4-d ioxa-8, 11-d iaza-cyclohexad ec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone
1$10
0 0 HN1,1 1-1N1'
N 0
0 0 HN1,1
0
7 :01r-Nr'0 0
Exl die 0-
-1-1y-I10 nie
Le produit 7 (9,6 mg; 10,2 pmol) est placé en solution dans un mélange éthanol
(1,2 ml)! eau
(1 ml) et le mélange se trouble. Le TCEP (25,4 pmol) est ensuite additionné et
le mélange est
agité 5 h à TA. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt et la phase organique
est lavée par un
mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4CI (1 ml). Après séchage
de la phase
organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le
produit final, Exl , est
obtenu sous forme d'un solide blanc (6,5 mg ; 71%). CCM (DCM 90 / Me0H 10) :
Rf = 0,56 ;
RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,76 - 0,81 (m, 6 H) ; 1,01 (s, 3 H) ; 1,06 (d,
J=6,8 Hz, 3 H) ; 1,13
(s, 3 H) ; 1,24 (s, 6 H) ; 1,27 - 1,31 (m, 1 H) ; 1,56 - 1,64 (m, 2 H) ; 1,73 -
1,85 (m, 3 H) ; 2,26 -
2,33 (m, 3 H) ; 2,36 - 2,45 (m, 4 H) ; 2,63 - 2,75 (m, 2 H) ; 2,95 - 3,06 (m,
3 H) ; 3,34 - 3,36 (m,
1 H) ; 3,42 - 3,51 (m, 6 H) ; 3,82 (s, 3 H) ; 3,89 (s, 1 H) ; 4,22 - 4,29 (m,
1 H) ; 4,92 (dd, J=9,8,
3,4 Hz, 1 H) ; 5,12 (dd, J=10,8, 4,9 Hz, 1 H) ; 5,81 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ;
6,48 (ddd, J=15,0, 11,4,
3,4 Hz, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=8,3, 1,5 Hz, 1 H) ; 7,24
(d, J=9,8 Hz, 1 H) ;
7,26 - 7,36 (m, 5 H) ; 8,37 (d, J=7,8 Hz, 1 H) ; LCMS (A2) : ES m/z = 897 [M +
; m/z = 895 [M
- ; tR = 0,97 min.
Exemple 2: (E)-(38,6R,10R,168)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobutyl-16-
[(S)-1-
((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoy1)-pipérazin-1-ylméthyl]-phény1}-
oxirany1)-
éthyI]-6-méthyl-1,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
0
HS
o 0 HNH
H 1
Composé 9 : (E)-(35,6R,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-16-{(S)-1-[(R)-
3-(4-chloro-
méthyl-phény1)-oxiranylFéthyll-3-isobutyl-6-méthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-
cyclohexadec-13-ène-
2,5,9,12-tétraone
--- 0 e 0
0 0 0 HN,1 ai Cl Cl- 00 0 1-INI CI
111.- 0
8 9
Le composé 8(49 mg; 71,4 pmol, qui peut être préparé selon Al-awar R.S., et
al., J.Med.Chem.
2003, 46, 2985-3007) est placé en solution dans le DCM anhydre (5 ml) et le
mélange est refroidi
à 0 C avant ajout de la DIPEA (428 pmol) puis du CMS (214 pmol). Le mélange
est laissé revenir
à TA et l'agitation est poursuivie 40 h à TA. Le mélange est hydrolysé avec 5
ml d'eau, la phase
aq. extraite par du DCM (3x5 ml). Les phases organiques sont rassemblées,
lavées par une
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solution aq. saturée de NaHCO3 (10 ml) et par une solution aq. saturée de NaCI
(10 ml) et
séchées sur MgSO4. Après filtration et évaporation des solvants sous PR, le
brut est purifié par
chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/Me0H 100/0 à
90/10. Le
composé 9 est obtenu sous forme d'un solide blanc (37 mg; 79%). RMN 1H (500
MHz, DMS0-
de): 0,78 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,80 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1,01 (d, J=6,9 Hz, 3
H) ; 1,05 (d, J=6,9 Hz,
3 H) ; 1,30 (m, 1 H) ; 1,54 (m, 1 H) ; 1,60 (m, 1 H) ; 1,82 (m, 1 H) ; 2,27
(m, 1 H) ; 2,60 à 2,78 (m,
3 H) ; 2,97 à 3,05 (m, 2 H) ; 3,15 (m, 1 H) ; 3,41 (m, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ;
3,92 (d, J=1,6 Hz, 1 H) ;
4,26 (ddd, J=3,8 et 8,2 et 11,5 Hz, 1 H) ; 4,77 (s, 2 H) ; 4,88 (dd, J=3,8 et
9,6 Hz, 1 H) ; 5,12
(ddd, J=1,5 et 5,3 et 11,2 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1,5 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47
(ddd, J=3,7 et 11,2 et
15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ;
7,23 (dd, J=2,7 et 9,1 Hz,
1 H) ; 7,29 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,32 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 7,45 (d, J=8,2 Hz,
2 H) ; 8,34 (d, J=8,2
Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 703 [M + miz = 701 [M - ; m/z =
747 [M - H + HCO21-1]
pic de base ; tR = 1,17 min.
Composé 10 : (E)-(35,6R,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-6-
méthyl-16-[(S)-
14(2R,3R)-3-{444-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoy1)-pipérazin-1-ylméthyl]-
phényll-
oxiranyI)-éthy1]-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
0 =
, 0
0 H%. 0 0 HN-
CI
2 O'llICS 0 - '0 I
H H
Le composé 9 (36,6 mg ; 52 pmol) est placé en solution dans l'acétonitrile
anhydre (3 ml) puis
sont successivement ajoutés la DIPEA (260 pmol) et le composé 6 (156 pmol). Le
milieu
réactionnel est agité 20 h à TA puis hydrolysé par addition de 4 ml d'eau. La
phase aq. est
extraite avec de l'AcOEt (3x4 ml), les phases organiques sont rassemblées,
lavées par une
solution aq. saturée de NaHCO3 (5 ml) et par une solution aq. saturée de NaCI
(5 ml). Après
séchage sur Mg504 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut
de la réaction est
purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange
DCM/méthanol 100/0 à
95/5. Le composé 10 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (39 mg; 80%).
RMN 1H (500
MHz, DMSO-de): 0,78 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,80 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1,01 (d,
J=6,9 Hz, 3 H) ; 1,05
(d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1,26 (s, 6 H) ; 1,30 (m, 1 H) ; 1,53 (m, 1 H) ; 1,60 (m,
1 H) ; 1,75 à 1,84 (m, 3
H) ; 2,26 à 2,37 (m, 7 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,61 à 2,77 (m, 3 H) ; 2,96 à 3,05
(m, 2 H) ; 3,15 (m, 1
H) ; 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,44 (m, 4 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,81
(s, 3 H) ; 3,88 (d,
J=1,6 Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=4,0 et 8,1 et 11,5 Hz, 1 H) ; 4,88 (dd, J=3,8 et
9,6 Hz, 1 H) ; 5,12
(ddd, J=1,6 et 5,3 et 11,5 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1,6 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,47
(ddd, J=3,6 et 11,5 et
15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ;
7,23 (dd, J=2,6 et 9,2 Hz,
1 H) ; 7,27 (d, J=8,4 Hz, 2 H) ; 7,29 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,32 (d, J=8,4 Hz,
2 H) ; 8,35 (d, J=8,1
Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 929 [M + ; m/z = 927 [M - ; m/z = 973 [M -
H + HCO2HF
pic de base ; tR = 0,99 min.
CA 02766762 2011-12-23
WO 2011/001052
PCT/FR2010/050986
Exemple 2 : (E)-(3S,6R,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-6-
méthyl-16-[(S)-1-
((2R,3R)-3-{444-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoy1)-pipérazin-1-ylméthy1]-phényll-
oxirany1)-éthylF
1 ,4-d ioxa-8, 11-d iaza-cyclohexad ec-13-ene-2, 5,9,12-tétraone
0 0
e 0 i& HS 0
=
N gr 0 0 lirsH CI 0 0
Hrsl..,1 CI
10 (W 0 Ex2
419 -- 0
H H
5
Le produit 10 (34 mg; 36,6 pmol) est placé en solution dans un mélange éthanol
(4,3 ml) / eau
(3,6 ml) et le mélange se trouble. Le TCEP (146 pmol) est ensuite additionné,
le mélange devient
incolore et est agité 2 h à TA. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt (20 ml)
et la phase
organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de
NH4C1 (20 ml). La
10 phase aq. est extraite par 2x20 ml d'AcOEt, les phases organiques
sont rassemblées et lavées
avec une solution saturée de NaC1 (20 ml). Après séchage sur MgSO4, filtration
et évaporation
des solvants sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de
silice en éluant avec un
mélange DCM/Me0H 98/2 à 90/10. Le composé Ex2 est obtenu sous forme d'un
solide blanc
(28,2 mg ; 87%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,77 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,79 (d,
J=6,6 Hz, 3 H)
15 ; 1,01 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1,04 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1,27 (m, 1 H)
; 1,31 (s, 6 H) ; 1,53 (m, 1 H) ;
1,59 (m, 1 H) ; 1,77 (m, 2 H) ; 1,82 (m, 1 H) ; 2,24 à 2,32 (m, 3 H) ; 2,34 à
2,44 (m, 4 H) ; 2,62 à
2,76 (m, 4 H) ; 2,98 à 3,04 (m, 2 H) ; 3,15 (m, 1 H) ; 3,41 (m, 1 H) ; 3,46
(m, 4 H) ; 3,48 (s, 2 H) ;
3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,26 (ddd, J=3,4 et 8,3 et 11,5 Hz,
1 H) ; 4,88 (dd, J=3,7
et 10,0 Hz, 1 H) ; 5,12 (ddd, J=2,0 et 5,3 et 11,1 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=2,0
et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47
20 (ddd, J=3,7 et 11,1 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ;
7,17 (dd, J=2,0 et 8,3 Hz, 1 H) ;
7,23 (dd, J=2,9 et 9,3 Hz, 1 H) ; 7,27 (d, J=8,5 Hz, 2 H) ; 7,29 (d, J=2,0 Hz,
1 H) ; 7,32 (d, J=8,5
Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 883 [M + ; m/z =
881 [M - H] ; tR =
0,92 min.
25
Exemple 3 : (E)-(38,10R,168)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobutyl-16-
[(S)-1-((2R,3R)-
3-{4-[(2-mercapto-2-méthyl-propylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyll-6,6-
diméthyl-1,4-
dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
0
0
HSN 0-,70 0 HN, g, Cl
Composé 11: 2-Méthy1-2-méthyldisulfanyl-propionaldéhyde 0-méthyl-oxime
0
30 H2N
11
CIH
5 g (33,3 mmol) de 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde sont mis en solution dans
50 ml d'éthanol,
sous atmosphère inerte. Sont successivement ajoutés une suspension de 5,56 g
(66,54 mmol)
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de chlorure d'O-méthylhydroxylamine dans 50 ml d'éthanol puis 6,65 ml (66,54
mmol) de NaOH.
Le mélange, blanc trouble, est chauffé au reflux pendant la nuit. Après retour
à TA, le mélange
est versé dans 500 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec l'AcOEt (3x175
ml), les phases
organiques rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCI (200 ml) et
séchées sur
MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le composé 11 est obtenu
sous la forme d'une
huile incolore (5,89 g, 32,9 mmol).
Composé 12 : 2-Méthy1-2-méthyldisulfanyl-propylamine
N,C)
NH
+ 2
BH3
THF
11 s S
12
Dans un ballon purgé à l'argon, sont successivement introduits, à TA, 1,78 g
(9,9 mmol) d'éther
d'oxime 11, 19 ml de THF anhydre et 99,5 ml d'une solution 2M de borane
méthylsulfure dans le
THF. Le mélange est chauffé 16 h au reflux. La réaction est ensuite arrêtée,
le mélange laissé
revenir à TA avant que 100 ml de Me0H soient ajoutés goutte à goutte
prudemment, à 0 C tant
que la mousse se forme puis à TA. Le mélange est évaporé sous PR pour donner
environ 2,8 g
d'une huile jaune qui est reprise dans 30 ml d'une solution HCI 5 à 6N dans
l'isopropanol. Le
mélange est porté au reflux 1 h puis laissé à TA pendant la nuit. Après
évaporation sous PR, le
résidu obtenu est repris avec 80 ml de HCI 1N puis extrait avec le diéthyle
éther (3x20 ml). La
phase aq. est traitée avec de l'ammoniaque aqueux à 30% jusqu'à obtention d'un
pH de 12,5-13,
le 12 ml (phase aq. violet pâle) puis à nouveau extraite avec 3x20 ml d'éther.
Les phases
organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4, filtrées et évaporées à sec
sous PR pour
donner 760 mg de brut. Ce résidu est finalement purifié par chromatographie
sur gel de silice en
éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 12 est obtenu
sous la forme
d'une huile jaune pâle (301 mg, 20%). LCMS (A2) : ES m/z = 152 [M + ; tR =
0,27 min.
Composé 13: (E)-(35,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-16-[(S)-
14(2R, 3 R)-
3-{4-[(2-méthy1-2-méthyldisu Ifanyl-propylamino)-méthy1]-phenyll-oxirany1)-
éthyl]-6,6-diméthyl-1,4-
dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5, 9,12-tétraone
= =
0 0
CI- OO HN Cl 0 0 0 HN Ci
0
2 X0)-L7pli"0 Ci) 13 igee
A une solution, purgée à l'argon, de 25 mg (35 pmol) du composé 2 dans 3,1 ml
de DMF anhydre
sont successivement ajoutés, à TA, 9,8 pl (70 pmol) de TEA et 6,3 mg (42 pmol)
du composé 12.
L'agitation est poursuivie sous agitation à 40 C. Après 72 h de réaction, il
reste du composé 2 de
départ, sont alors ajoutés 9,8 pl (70 pmol) de TEA et 6,3 mg (42 pmol) de
l'amine 12. Après 72h
supplémentaires à 40 C, il reste encore du composé 2 : 6,3 mg (42 pmol) de
l'amine 12 sont
ajoutés et l'agitation poursuivie à 40 C. Un jour plus tard, la réaction est
complète. Le mélange
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est dilué dans 10 ml d'AcOEt, lavé avec 2x10 ml d'eau, 10 ml d'une solution
saturée de NaHCO3
et 10 ml d'une solution saturée de NaCI. Après séchage de la phase organique
sur MgSO4, celle-
ci est filtrée puis évaporée sous PR pour donner 30 mg de brut. Ce résidu est
purifié par
chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2
à 93/7. Le
composé 13 est obtenu sous la forme d'une poudre blanche (23,3 mg, 81%). CCM
(DCM 90/
Me0H 10) : Rf=0,55 ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,76 à 0,81 (m, 6 H) ; 1,02
(s, 3 H) ; 1,07
(d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1,13 (s, 3 H) ; 1,27 à 1,33 (m, 7 H) ; 1,52 à 1,63 (m, 2
H) ; 1,82 (sxt, J=6,8 Hz,
1 H) ; 2,06 (s large, 1 H) ; 2,25 à 2,34 (m, 1 H) ; 2,37 (s, 3 H) ; 2,57 (s, 2
H) ; 2,66 à 2,76 (m, 2 H)
; 2,97 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,33 à 3,38 (m, 1 H) ; 3,75 (s, 2 H) ; 3,83 (s, 3 H)
; 3,88 (d, J=1,6 Hz, 1 H)
; 4,27 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 11,4 Hz, 1 H) ; 4,93 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ;
5,12 (dd, J=5,8 et 11,3
Hz, 1 H) ; 5,82 (dd, J=1,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd, J=3,8 et 11,3 et 15,2
Hz, 1 H) ; 7,07 (d,
J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=1,9 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,6 et 9,5 Hz,
1 H) ; 7,26 (d, J=8,2
Hz, 2 H) ; 7,30 (d, J=1,9 Hz, 1 H) ; 7,35 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,0
Hz, 1 H). LCMS (A2) :
ES m/z = 832 [M + miz = 830 [M ; tR = 0,96 min.
Exemple 3 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-16-[(S)-
14(2R,3R)-3-
{4-[(2-mercapto-2-méthyl-propylamino)-méthyl]-phényll-oxiranyl)-éthyl]-6,6-
diméthyl-1,4-dioxa-
8,11-d iaza-cyclohexad ec-13-ène-2,5, 9,12-tétraone
=
=
0 0
0 HN Cl Hs,..õ,)11õ,, 0 0 0
HN, CI
rOÅ),) 0 ? Ex3 ()År1,11-0
Le produit 13 (10,6 mg; 12,8 pmol) est placé en solution dans un mélange
éthanol (1,5 ml) / eau
(1,26 ml). Le TCEP (9,1 mg, 31,9 pmol) est ensuite additionné et le mélange
est agité 2 h 30 à
TA. Le mélange est dilué dans 15 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée
par un mélange
1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4CI (5 ml). Après séchage de la
phase organique
sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut obtenu est
finalement purifié
par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol
98/2 à 92/8. Le
composé Ex3 est obtenu sous forme d'un solide blanc (6,4 mg ; 63%). CCM (DCM
90/Me0H
10) : Rf=0,47 ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,80 à 0,86 (m, 6 H) ; 1,06 (s, 3
H) ; 1,11 (d, J=6,9
Hz, 3 H) ; 1,18 (s, 3 H) ; 1,31 à 1,38 (m, 7 H) ; 1,57 à 1,67 (m, 2 H) ; 1,87
(sxt, J=6,8 Hz, 1 H) ;
2,29 à 2,38 (m, 1 H) ; 2,56 (s, 2 H) ; 2,70 à 2,80 (m, 2 H) ; 3,00 à 3,11 (m,
3 H) ; 3,39 à 3,43 (m, 1
H) ; 3,82 (s, 2 H) ; 3,87 (s, 3 H) ; 3,92 (d, J=1,9 Hz, 1 H) ; 4,31 (ddd,
J=3,6 et 8,0 et 11,5 Hz, 1 H)
; 4,97 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,17 (dd, J=5,8 et 11,3 Hz, 1 H) ; 5,86
(dd, J=1,4 et 15,1 Hz, 1
H) ; 6,54 (ddd, J=3,8 et 11,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,11 (d, J=8,7 Hz, 1 H) ;
7,23 (dd, J=1,9 et 8,7 Hz,
1 H) ; 7,27 (dd, J=2,7 et 9,6 Hz, 1 H) ; 7,31 (d, J=8,0 Hz, 2 H) ; 7,34 (d,
J=1,9 Hz, 1 H) ; 7,42 (d,
J=8,0 Hz, 2 H) ; 8,40 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 786 [M + ;
m/z = 784 [M -
; tR = 0,92 min.
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Exemple 4 : (E)-(36,10R,166)-10-(3-C h loro-4-m éth oxy-benzyI)-3-iso buty1-16-
[(S)-1- 2 R,3R)-
3-{4-[({2-mercapto-2-méthyl-propyI}-méthyl-am ino)-méthyll-phény1}-oxirany1)-
éthy11-6,6-
diméthy1-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
0
- 0
0 HN, g, Cl
0
Composé 14: Méthy1[2-méthy1-2-méthyldisulfanyl-prop-(E)-ylidèneamine
0
+ NH2s,S
14
1 g (6,66 mmol) de 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde sont mis en solution dans
10 ml de THF
anhydre, sous atmosphère inerte. La solution de méthylamine 2M dans le THF
(33,3 ml,
66,6 mmol) est ajoutée puis le mélange est agité 5 h à TA. Il est dilué dans
50 ml d'AcOEt, lavé
avec de l'eau (30 ml), une solution saturée de NaCI (30 ml) et séché sur
MgSO4. Après filtration
et concentration sous PR, le composé 14 est obtenu sous la forme d'une huile
jaune pâle (1,01 g,
93%). RMN 1H (400 MHz, chloroforme-d): 1,46 (s, 6 H) ; 2,36 (s, 3 H) ; 3,32
(s, 3 H) ; 7,52 (s, 1
H).
Composé 15 : 2-Méthy1-2-méthyldisulfanyl-propylamine
o
* 0 0 HN
Na
+ 0-B THF
0
14 0
Une solution du composé 14 (1,01 g, 6,185 mmol) dans 30 ml de THF est purgée à
l'argon et
refroidie à 0 C avant que soit ajouté, à 0 C, 1,44 g (6,80 mmol) de
triacétoxyborohydrure de
sodium. L'agitation est poursuivie 15h à TA: il reste de l'imine de départ ;
1,44 g (6,80 mmol) de
triacétoxyborohydrure de sodium et 354 pl (6,185 mmol) d'acide acétique sont
ajoutés à 0 C puis
l'agitation poursuivie à TA pendant 3 h. Le mélange est dilué dans 50 ml
d'AcOEt et lavé avec de
l'eau (50 ml). Le pH de la phase aq. est ajusté à 12 environ par ajout de 14
ml d'une solution aq.
de soude 1N puis elle est extraite avec de l'éther diéthylique (3x50 ml). Les
phases organiques
sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCI (50 ml), séchées
sur MgSO4. Après
filtration et concentration sous PR, le composé 15 est obtenu sous la forme
d'une huile incolore
(695 mg, 68%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,25 (s, 6 H) ; 1,47 (m étalé, 1 H)
; 2,31 (s, 3 H) ;
2,38 (s, 3 H) ; 2,53 (m, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 166 [M + ; tR = 0,28
min.
Composé 16: (E)-(35,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-16-{(S)-
1-[(2R,3R)-
3-(4-{[(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-méthyl-amino]-méthyll-phény1)-
oxiranyl)-éthyl]-6,6-
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diméthy1-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
QI
=
.----
I
0
- 0 0 HN
0
CI
H
0
16ONO H 0
Le composé 16 peut être obtenu par substitution nucléophile du groupement
chloro du dérivé 2
par l'amine 15 en appliquant la méthode décrite pour la préparation du composé
30.
Exemple 4: (E)-(3S,10 R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-16-{(S)-
1-[(2 R,3R)-3-
(4-{[(2-mercapto-2-méthyl-propyI)-méthyl-am ino]-méthyll-phény1)-oxirany1)-
éthyl]-6,6-d iméthyl-
1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
=
--- 0 --- 0
0 HN,, Cl ____ HS" OO0 HN.,CI
16 rO)Li'-'prO Ex4 X`O)FNI 0 0
L'exemple 4 peut être obtenu en appliquant la méthode décrite pour la
préparation de l'exemple 6
au composé 16.
Exemple 5: (E)-(36,10R,166)-10-(3-Ch loro-4-méthoxy-benzyI)-3-isobutyl-16-[(S)-
1-((2R,3R)-
3-{444-(2-mercapto-2-méthyl-propy1)-pipérazin-1-ylméthyll-phény1}-oxirany1)-
éthy11-6,6-
diméthy1-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
HS ---- 0
0 0 0 HN,I. di CI
"le
Composé 17 : 4-(2-Méthy1-2-méthyldisulfanyl-propy1)-pipérazine-1-carboxylate
de tert-butyle
o
17
0
A une solution, purgée à l'argon, de 1-Boc-pipérazine (1,0 g, 5,37 mmol) dans
le THF anhydre
(20 ml) sont ajoutés le 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde (5,37 mmol) et
l'isopropoxyde de titane
(IV) (6,71 mmol). Le mélange est agité 20 min à TA puis un nouvel ajout de 2-
(méthyldithio)-
isobutyraldéhyde (5,37 mmol) et l'isopropoxyde de titane (IV) (6,71 mmol) est
réalisé. L'agitation
est poursuivie 2 h puis 12 ml d'éthanol sont ajoutés et l'agitation poursuivie
5 min. Sont ajoutés
du cyanoborohydrure de sodium (5,37 mmol), le mélange est agité 1 h avant que
soient ajoutées
5,37 mmoles supplémentaires de cyanoborohydrure de sodium. L'agitation est
poursuivie 1 h. Le
mélange est concentré à sec puis repris dans l'AcOEt. De l'eau est ajoutée
entraînant la
formation d'un précipité qui est filtré sur verre fritté, rincé avec de
l'AcOEt et de l'eau. Le solide
obtenu est solubilisé dans une solution aq. HCI 1N (50 ml), le milieu est
neutralisé avec une
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solution aq. NaOH 5N puis extrait au DCM. Les phases organiques sont
rassemblées, lavées
avec une solution saturée de NaCI, séchées sur MgSO4, filtrées et concentrées
sous PR. Le brut
est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec DCM/méthanol
100/0 à 97/3. Le
composé 17 est obtenu sous forme d'une huile jaune pâle (650 mg; 40%). RMN 1H
(400 MHz,
5 DMSO-d6): 1,26 (s, 6 H) ; 1,39 (s, 9 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,42 (s, 2H) ;
2,44 à 2,48 (m, 4 H) ; 3,27
(m partiellement masqué, 4 H). LCMS (AI): ES m/z = 321 [M +
; m/z = 265 pic de base ; tR =
3,02 min.
Composé 18: Chlorhydrate de 1-(2-méthy1-2-méthyldisulfanyl-propy1)-pipérazine
"
E _ s 01H
NH
18
10 0
A une solution du composé 17 (322 mg, 1,01 mmol) dans le dioxane (13 ml) est
ajoutée une
solution HCI 4M dans le dioxane (5 ml). L'agitation est poursuivie 16 h à TA.
Le mélange est filtré
sur verre fritté, le solide obtenu est rincé avec du dioxane pour donner le
composé 18 (231 mg,
90%) sous la forme d'une poudre blanche. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,31 (s
large, 6 H) ;
15 2,42 (s, 3 H) ; 2,59 à 3,38 (m très étalé, 10 H) ; 8,78 (m étalé, 2 H).
LCMS (A2) : ES m/z = 221 [M
+ ; tR = 0,46 min.
Composé 19 : (E)-(35,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-6,6-
diméthyl-16-[(S)-
14(2R,3R)-3-{444-(2-méthy1-2-méthyldisulfanyl-propy1)-pipérazin-1-
ylméthylFphényll-oxiranyl)-
20 éthyI]-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
= =
,s ---
- r s 1 ,
CI goi 0 0 HN ClLõN 111)11 0 0 HN C
0 I
2
nX H 'ON0 0
A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (15,02 mg, 20,93 pmol) dans le
DMF anhydre
(0,9 ml) est ajoutée une solution du composé 18 (25,12 pmol) et de TEA (52,3
pmol) dans le
DMF (1 ml). Le mélange est agité à 40 C sous argon. Après 24 h, 25,12 pmol du
composé 18 et
25 31,4 pmol de TEA sont ajoutés. Après 24 h supplémentaires à 40 C, la
réaction est terminée. Le
mélange est dilué avec de l'AcOEt (6 ml) et lavée avec de l'eau (2x6 ml), une
solution saturée de
NaHCO3 (6 ml) et une solution saturée de NaCI (6 ml). Après séchage de la
phase organique sur
Mg504, celle-ci est filtrée puis évaporée sous PR pour donner 46 mg de brut.
Le résidu est
purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange
DCM/méthanol 100/0 à
30 95/5. Le composé 19 est obtenu sous la forme d'une poudre blanche (5,2
mg, 28%). RMN 1H
(500 MHz, DMSO-d6): 0,76 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 1,01
(s, 3 H) ; 1,06 (d,
J=6,8 Hz, 3 H) ; 1,13 (s, 3 H) ; 1,25 (s, 6 H) ; 1,27 à 1,33 (m, 1 H) ; 1,51 à
1,63 (m, 2 H) ; 1,76 à
1,85 (m, 1 H) ; 2,23 à 2,32 (m, 1 H) ; 2,37 (m, 4 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,41
(s, 2 H) ; 2,53 à 2,56 (m,
4 H) ; 2,63 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 (m partiellement
masqué, 1 H) ; 3,40 à
CA 02766762 2011-12-23
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PCT/FR2010/050986
76
3,48 (m, 2 H) ; 3,82 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,26 (ddd, J=3,8 et
7,8 et 11,3 Hz, 1 H) ;
4,92 (dd, J=3,8 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,07 à 5,14 (m, 1 H) ; 5,81 (d, J=15,2 Hz, 1
H) ; 6,48 (ddd, J=3,8
et 11,3 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=2,2 et 8,5
Hz, 1 H) ; 7,21 à 7,32 (m,
6 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (AI): ES m/z = 901 [M +
; m/z = 451 pic de base ; tR =
4,33 min.
Exemple 5: (E)-(35,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-16-[(S)-
14(2R,3R)-3-
{444-(2-mercapto-2-méthyl-propy1)-pipérazin-1-ylméthylFphényll-oxiranyl)-
éthyl]-6,6-diméthyl-1,4-
d ioxa-8,11-d iaza-cyclohexad ec-13-ène-2,5, 9,12-tétraone
= =
0 HS
0
00 0 HN, el Cl 00 0 HN,
Cl
ne 0
19 Cy'lly-"NO Ex5 0
H H
Le produit 19 (5,7 mg; 6,3 pmol) est placé en solution dans un mélange éthanol
(0,8 ml) / eau
(0,5 ml). Le TCEP (4,54 mg, 15,83 pmol) est ensuite additionné et le mélange
est agité 1 h à TA.
Le mélange est dilué dans 7 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par un
mélange 1/1
d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4C1 (7 ml). Après séchage de la phase
organique sur
Mg504, filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut obtenu est
purifié par
chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1
à 95/5. Le
composé Ex5 est obtenu sous forme d'un solide blanc (2,95 mg; 55%). RMN 1H
(500 MHz,
DMSO-d6): 0,77 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 1,02 (s, 3 H) ;
1,06 (d, J=6,9 Hz, 3
H) ; 1,13 (s, 3 H) ; 1,27 (s, 6 H) ; 1,29 à 1,34 (m, 1 H) ; 1,52 à 1,63 (m, 2
H) ; 1,82 (m, 1 H) ; 2,29
(m, 1 H) ; 2,37 (s, 2 H) ; 2,39 à 2,41 (m, 4 H) ; 2,57 à 2,62 (m, 4 H) ; 2,65
à 2,76 (m, 2 H) ; 2,96 à
3,06 (m, 3 H) ; 3,34 (m, partiellement masqué, 1 H) ; 3,46 (s, 2 H) ; 3,83 (s,
3 H) ; 3,88 (d, J=2,2
Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 11,5 Hz, 1 H) ; 4,93 (dd, J=3,7 et 9,7
Hz, 1 H) ; 5,12 (m, 1 H)
; 5,82 (d, J=15,2 Hz, 1 H); 6,49 (ddd, J=3,7 et 11,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,07
(d, J=8,5 Hz, 1 H) ;
7,18 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,21 à 7,33 (m, 6 H) ; 8,36 (d, J=8,0 Hz, 1
H). LCMS (A1) : ES
m/z = 855 [M + ; m/z = 428 [M + 21-1]2+ pic de base ; t = 4,13 min.
Exemple 6 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobutyl-16-[(S)-
1-((2R,3R)-
3-{444-({242-(2-{2-méthy142-mercapto-2-méthyl-propyllamino-éthoxy}-éthoxy)-
éthoxyl-
éthyl}méthylamino)-méthyll-phény1}-oxirany1)-éthyll-6,6-diméthyl-1,4-dioxa-
8,11-diaza-
cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
=
,eo
o.,õo 0 HN Cl
HS 0
o
X0j[Y(''0
Composé 20 : Toluène-4-sulfonate de 2-{242-(2-hydroxy-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-
éthyle
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,
77
O 0
H
A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0 C, de 5 g (25,74 mmol) de
tetraéthylèneglycol dans 68,7 ml de DCM sont successivement ajoutés, par
portion afin de
maintenir une agitation convenable, 8,95 g (38,61 mmol) d'oxyde d'argent et
5,40 g (28,31
5 mmol) de chlorure de tosyle. 855 mg (5,15 mmol) de KI sont ajoutés par
petites portions afin
de maintenir la température du mélange inférieure à 5 C. L'agitation est
poursuivie 1 h en
maintenant la température inférieure à 5 C. Après retour à TA, le mélange est
filtré sur
Clarcelmc, le résidu est rincé au DCM puis le filtrat concentré à sec sous PR.
Le brut est
purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un
mélange
10 DCM/méthanol 99/1 à 95/5. Le composé 20 est obtenu sous forme d'une
huile incolore (5,4
g, 60%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 2,43 (s, 3 H) ; 3,40 (m, 2 H) ; 3,44 à
3,52 (m, 10 H) ;
3,58 (m, 2 H) ; 4,11 (m, 2 H) ; 4,53 (t, J=5,4 Hz, 1 H) ; 7,48 (d, J=8,3 Hz, 2
H) ; 7,78 (d, J=8,3
Hz, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 349 [M + ; m/z = 371 [M + Na] ; tR = 0,69
min.
15 Composé 21: 1-Azido-3,6-9-trioxaundecane-11-01
O H
21
A une solution de 5,4 g (15,51 mmol) du composé 20 dans 40,6 ml d'acétonitrile
anhydre
sont ajoutés 1,34 g (20,63 mmol) deNaN3 puis le mélange est chauffé 6 h 30 au
reflux. Après
retour à TA, le mélange est filtré sur Clarcelmc et concentré sous PR. Il
reste du composé 20
20 de départ : le brut est repris dans 25 ml d'acétonitrile anhydre et 230
mg (3,5 mmol) de NaN3
sont ajoutés. Le mélange est chauffé au reflux pendant 5 h. Après retour à TA,
il est filtré sur
Clarcelmc et concentré à sec sous PR pour donner le composé 21 sous la forme
d'une huile
jaune pâle (3,37 g, 99%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 3,37 à 3,43 (m, 4 H) ;
3,45 à 3,58
(m, 10 H) ; 3,60 (m, 2 H) ; 4,54 (t, J=5,1 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 220
[M + ; m/z =
242 [M + Na] pic de base ; tR = 0,39 min.
Composé 22: N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthoxy-éthanol
H
21 0 22
A une solution, inertée à l'argon, de 320 mg de palladium sur charbon 10% dans
5 ml d'AcOEt
est ajoutée une solution de 3,25 g (14,8 mmol) du composé 21, 6,46 g (29,6
mmol)
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. ,
77a
de dicarbonate de tert-butyle et 4,13 ml (29,6 mmol) de TEA dans 45 ml
d'AcOEt. La réaction est
réalisée 17 h à 30 C sous une pression d'hydrogène de 2 bars. Après retour à
TA et PA, le
mélange est filtré sur Clarcelmc et concentré sous PR. Le brut est purifié par
chromatographie sur
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gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10.
Le composé 22
est obtenu sous forme d'une huile incolore (2,92 g, 67%). RMN 1H (400 MHz,
DMSO-d6): 1,37 (s,
9 H) ; 3,06 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,37 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,42 (m, 2 H) ;
3,46 à 3,53 (m, 10 H) ; 4,54
(t large, J=5,1 Hz, 1 H) ; 6,71 (t large, J=6,1 Hz, 1 H). LCMS (AI): ES m/z =
316 [M + Na] ; m/z
= 194 pic de base ; tR = 2,81 min.
Composé 23 : Toluène-4-sulfonate de 2-{242-(2-tert-butoxycarbonylamino-éthoxy)-
éthoxe
éthoxyl-éthyle
H H 0
0
N
22 8 23
Si
A une solution, purgée à l'argon, de 3,06 g (10,42 mmol) du composé 22 dans 20
ml de DCM
sont ajoutés 2,53 ml (31,26 mmol) de pyridine. Le mélange est refroidi à 0 C
puis une solution de
2,98 g (15,63 mmol) de chlorure de tosyle dans 10 ml de DCM est ajoutée goutte
à goutte.
L'agitation est poursuivie 15 h à TA. Le mélange est dilué dans 20 ml de DCM,
lavé avec une
solution saturée de NaHCO3 (30 ml), de l'eau (2x30 ml), une solution saturée
de NaCI (30 ml) et
séché sur Mg504. Après filtration et concentration sous PR, le brut est
purifié par
chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange
DCM/méthanol 100/0 à
90/10. Le composé 23 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle (4,38 g,
94%). RMN 1H
(400 MHz, DMSO-d6): 1,37 (s, 9 H) ; 2,42 (s, 3 H) ; 3,05 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ;
3,36 (t, J=6,1 Hz, 2
H) ; 3,46 (m, 8 H) ; 3,58 (m, 2 H) ; 4,10 (m, 2 H) ; 6,71 (t large, J=6,1 Hz,
1 H) ; 7,48 (d, J=7,8 Hz,
2 H) ; 7,78 (d, J=7,8 Hz, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 448 [M + ; m/z = 470
[M + Na] ; m/z =
348 pic de base ; m/z = 492 [M - H + HCO2HF ; tR = 1,00 min.
Composé 24: (2-{242-(2-Azido-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthyl)-carbamate de tert-
butyle
H H
y o y
8 23
8 24
A une solution de 4,38 g (9,79 mmol) du composé 23 dans 25 ml d'acétonitrile
sont ajoutés
846 mg (13,02 mmol) d'azoture de sodium puis le mélange est chauffé 6 h au
reflux. Il reste du
composé de départ en proportion importante : après retour à TA, 1,7 g (26,13
mmol) sont ajoutés
au mélange. L'agitation est maintenue 24 h au reflux. Après retour à TA, le
mélange est filtré sur
Clarcel et concentré sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel
de silice en utilisant
comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 24 est obtenu
sous forme
d'une huile jaune pâle (2,16 g, 69%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,37 (s, 9 H)
; 3,06 (q, J=6,1
Hz, 2 H) ; 3,34 à 3,43 (m, 4 H) ; 3,46 à 3,58 (m, 8 H) ; 3,60 (m, 2 H) ; 6,70
(t large, J=6,1 Hz, 1
H). LCMS (A2) : ES m/z = 341 [M + Na] ; tR = 0,81 min.
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Composé 25: (2-{242-(2-Azido-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthyl)-méthyl-carbamate de
tert-butyle
H
6 24 8 25
A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0 C, de 2,06 g (6,47 mmol) du
composé 24 dans
25 ml de THF anhydre sont successivement ajoutés, à 0 C, 854 mg (21,35 mmol)
de NaH 60%
en dispersion dans une huile minérale (par portion) et 886 pl (14,23 mmol)
d'iodure de méthyle.
L'agitation est poursuivie 1 h à 0 C puis 16 h à TA. Le mélange est filtré sur
Clarcel, lavé avec du
THF et concentré sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de
silice en utilisant
comme éluant un mélange de DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Le composé 25 est obtenu
sous la
forme d'une huile incolore (1,67 g, 78%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,39 (s,
9 H) ; 2,80 (s
large, 3 H) ; 3,29 (t partiellement masqué,J=5,6 Hz, 2 H) ; 3,38 (m, 2 H) ;
3,46 à 3,56 (m, 10 H) ;
3,60 (t, J=5,4 Hz, 2 H).
Composé 26: (2-{242-(2-Amino-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthyl)-méthyl-carbamate de
tert-butyle
o26
A une solution, purgée à l'argon, de 1,66 g (4,99 mmol) du composé 25 dans 20
ml de THF sont
successivement ajoutés 1,31 g (4,994 mmol) de triphénylphosphine et 108 pl
(5,99 mmol) d'eau.
L'agitation est poursuivie 25h30 puis le mélange est concentré à sec et
purifié par filtration SPE
sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis
éluée avec une
solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 26 est obtenu sous la
forme d'une
huile incolore (1,23 g, 80%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,39 (s, 9 H) ; 2,65
(t, J=5,9 Hz, 2 H)
; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,29 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,36 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ;
3,45 à 3,56 (m, 10 H).
LCMS (A2) : ES m/z = 307 [M + ;t = 0,49 min.
Composé 27: Méthy142-(2-{242-(2-méthy1-2-méthyld isu 'fa nyl-propyla
mi no)-éthoxyFéthoxyl-
éthoxy)-éthyn-carbamate de tert-butyle
H2
0 0
8 26 8 27
A une solution, purgée à l'argon, de 131 mg (426 pmol) du composé 26 dans 3 ml
de DCM sont
successivement ajoutés 64 mg (426 pmol) de 2-méthyldithio-isobutyraldéhyde,
126 mg
(596 pmol) de triacétoxyborohydrure de sodium et 24,4 pl (426 pmol) d'acide
acétique. L'agitation
est poursuivie 6 h à TA sous Ar, la réaction est quenchée par addition de 1 ml
d'une solution aq.
de soude 1N puis le mélange est extrait avec 10 ml d'éther diéthylique. Après
concentration sous
PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant
comme éluant un mélange
DCM/isopropanol 90/10 qui ne permet pas de séparer l'attendu de l'amine
résiduelle de départ.
Le produit obtenu est à nouveau purifié par chromatographie sur phase inverse
RP18 en utilisant
comme éluant un mélange eau/acétonitrile 95/5 à 5/95. le composé 27 est obtenu
sous la forme
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d'une huile incolore (67 mg, 36%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,25 (s, 6 H) ;
1,39 (s, 9 H) ;
1,58 (m étalé, 1 H) ; 2,38 (s, 3 H) ; 2,59 (s, 2 H) ; 2,68 (t, J=5,6 Hz, 2 H)
; 2,80 (s large, 3 H) ;
3,46 (t, J=5,6 Hz, 2 H) ; 3,48 à 3,54 (m, 12 H). LCMS (AI): ES m/z = 441 [M +
; tR = 3,29 min.
5 Composé 28: Méthyl-{242-(2-{2-[méthyl-(2-méhy1-2-méthyldisulfanyl-propy1)-
amino]-éthoxyl-
éthoxy)-éthoxeéthyll-carbamate de tert-butyle
o
27 28
A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0 C, de 65 mg (148 pmol) du
composé 27 dans
1 ml de DCM sont successivement ajoutés 19,5 mg (487 pmol) de NaH 60% en
dispersion dans
10 une huile minérale et 20 pl (325 pmol) d'iodure de méthyle. L'agitation
est poursuivie 45 min à
0 C puis 72 h à TA. Le mélange est filtré sur Clarcel puis concentré sous PR.
Le brut est purifié
par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluent un mélange
DCM/méthanol 99/1
à 90/10. Le composé 28 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (43 mg,
64%). RMN 1H
(400 MHz, DMSO-d6): 1,25 (s, 6 H) ; 1,39 (s, 9 H) ; 2,32 (s, 3 H) ; 2,39 (s, 3
H) ; 2,54 (m, 2 H) ;
15 2,61 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,42 à 3,54 (m, 14 H).
LCMS (A2) : ES m/z = 455 [M
+ ; tR = 0,77 min.
Composé 29: Méthyl-(2-{242-(2-méthylamino-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthyl)-(2-
méthyl-2-méthyl-
disulfanyl-propy1)-amine
s __________________________________________
s,
20 28 29
Aune solution de 43 mg (95 pmol) du composé 28 dans 1,5 ml de DCM sont ajoutés
351 pl de
TFA. L'agitation est poursuivie 5 h à TA puis le mélange est concentré à sec.
Le brut est purifié
par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec
du méthanol puis
éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 29 est
obtenu sous
25 la forme d'une huile incolore (25 mg, 75%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6):
1,25 (s, 6 H) ; 1,75 (m
étalé, 1 H) ; 2,27 (s, 3 H) ; 2,32 (s, 3 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,53 (m, 2 H) ;
2,57 à 2,64 (m, 4 H) ; 3,44
(t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,46 à 3,55 (m, 10 H). LCMS (A2) : ES m/z = 355 [M + ;
tR = 0,30 min.
Composé 30 : (E)-(35,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-16-
[(S)-14(2R,3R)-3-
30 {444-({242-(2-{2-méthy142-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl]amino-éthoxy}-
éthoxy)-éthoxy]-
éthyllméthylamino)-méthyl]-phényll-oxirany1)-éthyl]-6,6-diméthyl-1,4-dioxa-
8,11-diaza-
cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
=
0
CI el 0 0 0 HN Cl ,S, .--71O O0 HN,i
CI
S
2 0 0 H
A une solution, purgée à l'argon, de 15,3 mg (21,3 pmol) de composé 2 dans 1
ml d'acétonitrile
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anhydre sont successivement ajoutés 18,6 pl (106,6 pmol) de DIPEA et une
solution de 22,7 mg
(64 pmol) du composé 29 dans 1 ml d'acétonitrile anhydre. L'agitation est
poursuivie 24 h sous
Ar à 40 C. Après retour à TA, le mélange est dilué avec 7 ml d'AcOEt, lavé
avec de l'eau (2 X 3
ml), une solution saturée de NaHCO3 (3 ml), une solution saturée de NaCI (3
ml) et séché sur
MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par
chromatographie sur gel
de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 90/10. Le composé
30 est obtenu
sous la forme d'un solide incolore (14,6 mg, 66%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6):
0,76 (d, J=6,1
Hz, 3 H) ; 0,76 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 1,00 (s, 3 H) ; 1,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ;
1,12 (s, 3 H) ; 1,24 (s, 6
H) ; 1,29 (m, 1 H) ; 1,50 à 1,62 (m, 2 H) ; 1,81 (m, 1 H) ; 2,15 (s, 3 H) ;
2,27 (m, 1 H) ; 2,31 (s, 3
H) ; 2,38 (s, 3 H) ; 2,45 à 2,54 (m partiellement masqué, 4 H) ; 2,60 (t,
J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,63 à
2,75 (m, 2 H) ; 2,92 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,35 (m partiellement masqué, 1
H) ; 3,44 à 3,54 (m,
14 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,9 et 8,3 et
11,7 Hz, 1 H) ; 4,91 (dd,
J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1,5 et 5,7 et 11,5 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd,
J=1,5 et 15,5 Hz, 1 H) ;
6,47 (ddd, J=3,5 et 11,5 et 15,5 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,17
(dd, J=2,0 et 8,8 Hz, 1 H)
; 7,20 à 7,26 (m, 3 H) ; 7,27 à 7,33 (m, 3 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS
(A2) : ES m/z = 1035
[M +H] miz = 518 [M + 2I-1]2+ pic de base ; tR = 0,86 min.
Exemple 6 : (E)-(35,10 R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-16-
[(S)-14(2R,3R)-3-
{444-({242-(2-{2-méthy142-mercapto-2-méthyl-propyl]amino-éthoxy}-éthoxy)-
éthoxe
éthyllméthylamino)-méthyn-phényll-oxirany1)-éthyl]-6,6-diméthyl-1,4-dioxa-8,11-
diaza-
cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
= 0
110 0 0 0
NN,1 CI
0 0 HN 0
Ext3
ne' 0
A une solution de 10,9 mg (10,5 pmol) du composé 30 dans 1,24 ml d'éthanol est
ajoutée une
solution de 12,06 mg (42,1 pmol) de TCEP dans 1,04 ml d'eau. L'agitation est
poursuivie 4 h à
TA. Le mélange est dilué avec 6 ml d'AcOEt, lavé avec un mélange 1/1
eau/NH4CIõ1 (6 ml), une
solution saturée de NaCI (6 ml) et séché sur Mg504. Après filtration et
concentration sous PR, le
brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utlisant un mélange
DCM/méthanol 99/1
à 90/10. Le composé Ex6 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (7,36 mg,
71%). RMN 1H
(500 MHz, DMSO-d6): 0,76 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 1,00
(s, 3 H) ; 1,04 (d,
J=6,8 Hz, 3 H) ; 1,12 (s, 3 H) ; 1,25 (s, 6 H) ; 1,28 (m, 1 H) ; 1,51 à 1,62
(m, 2 H) ; 1,80 (m, 1 H) ;
2,15 (s, 3 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,34 (s, 3 H) ; 2,44 (s, 2 H) ; 2,51 (t, J=6,4
Hz, 2 H) ; 2,60 (s, 1 H) ;
2,63 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,66 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,93 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,25 à
3,37 (m partiellement
masqué, 1 H) ; 3,45 à 3,55 (m, 14 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1,5 Hz, 1 H)
; 4,25 (ddd, J=3,7 et
8,0 et 11,5 Hz, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1,5 et
5,6 et 11,5 Hz, 1 H) ;
5,80 (dd, J=1,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,9 et 11,5 et 15,2 Hz, 1 H) ;
7,05 (d, J=8,8 Hz, 1
H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,8 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,26 (m, 3 H) ; 7,27 à 7,32 (m,
3 H) ; 8,35 (d, J=8,0
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Hz, 1 H). LCMS (AI): ES m/z = 989 [M + ; m/z = 495 [M + 21-1]2+ pic de base
; tR = 3,24 min.
Exemple 7: (E)-(36,10R,166)-10-(3-Ch loro-4-m éthoxy-benzyI)-3-isobutyl-16-
[(S)-1-((2R,3R)-
344444{2424244-m éthy1-4-méthyld is u Ifa nyl-pentan oyla m I n o-éth oxy}-
éthoxy)-éthoxyl-
éthyl}méthylamino)-méthyll-phény1}-oxirany1)-éthy11-6,6-diméthy1-1,4-dioxa-
8,11-diaza-
cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
H I
70 0 HN, ,C1
HS
0
Composé 31: Méthy142-(2-{242-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoylamino)-
éthoxyFéthoxyl-
éthoxy)-éthylFcarbamate de tert-butyle
0
0 H
N, ss
+ C) ,S
S
0
4 26 31 0
270 mg (649 pmol) du composé 4, 199 mg (649 pmol) du composé 26 sont dissous
dans 1,5 ml
de DMF puis 100 pl (714 pmol) de TEA sont ajoutés au mélange. L'agitation est
poursuivie 16 h à
TA. Le mélange est dilué avec 10 ml d'AcOEt, lavé avec de l'eau (2x5 ml), une
solution saturée
de NaCI (5 ml) et séché sur Mg504. Après filtration et concentration sous PR,
le brut est purifié
par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange
DCM/méthanol 98/2
à 90/10. Le composé 31 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (251 mg,
80%). RMN 1H
(400 MHz, DMSO-d6): 1,24 (s, 6 H) ; 1,39 (s, 9 H) ; 1,79 (m, 2 H) ; 2,16 (m, 2
H) ; 2,40 (s, 3 H) ;
2,80 (s large, 3 H) ; 3,18 (q, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,39 (1, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,45
à 3,54 (m, 12 H) ; 7,88
(t large, J=5,9 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 483 [M + ; m/z = 505 [M +
Na] ; m/z = 527 [M
- H + HCO2HF ; tR = 1,04 min.
Composé 32 : N-(2-{242-(2-Méthylamino-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-
éthyl)-4-méthyl-4-méthyl-
disulfanyl-pentamide
H H
HN,^. .
S
31 0 32
A une solution de 251 mg (520 pmol) du composé 31 dans 8 ml de DCM sont
ajoutés 1,93 ml
(26 mmol) de TFA. L'agitation est poursuivie 3 h à TA puis le mélange est
concentré à sec. Le
brut est dissout dans le minimum de DCM puis plusieurs entraînements au
toluène sont réalisés.
Le brut est purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian)
conditionnée et lavée avec
du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol.
Le composé
32 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (159 mg, 80%). RMN 1H (400
MHz, DMSO-d6):
1,24 (s, 6 H) ; 1,79 (m, 2 H) ; 2,15 (m, 2 H) ; 2,27 (s, 3 H) ; 2,40 (s, 3 H)
; 2,58 (1, J=5,7 Hz, 2 H) ;
3,18 (q, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,39 (1, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,44 (1, J=5,7 Hz, 2 H) ;
3,47 à 3,54 (m, 8 H) ;
7,89 (t large, J=5,7 Hz, 1 H). LCMS (AI): ES m/z = 383 [M + ; tR = 2,68
min.
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Exemple 7: (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-16-[(S)-
14(2R,3R)-3-
{444-({242-(2-{4-méthy1-4-méthyldisu 'fa nyl-pentanoylam ino-éthoxy}-éthoxy)-
éthoxy]-
éthyllméthylamino)-méthyn-phényll-oxirany1)-éthyl]-6,6-diméthyl-1,4-dioxa-8,11-
diaza-
cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
dieh = 0
ci IF 0 0 HN = Cl H
I.
o
:c>1 HS
91Ie ci)
0
H Ex7
L'exemple 7 peut être obtenu par substitution nucléophile du groupement chloro
du dérivé 2 par
l'amine 32 en appliquant la méthode décrite pour la préparation du composé 30
puis par
réduction du disulfure en appliquant la méthode décrite pour la préparation de
l'exemple 6.
Exemple 8: (E)-(38,10R,168)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobutyl-16-{(S)-
1-[(2R,3R)-
3-(4-mercaptométhyl-phényl)-oxiranyll-éthyl}-6,6-diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-
cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone
=
o
HS 1 0 0 0 HN Cl
g&
X0j*I%r0 ci)
Composé 33 : dimère de l'exemple 8
o eib = ---
o
=
a o o i& Cly ys,(NH,,))30,r0 S-S 0 0 HN a
0
"Ir 0 -
Le composé 2 (24,5 mg ; 34,1 pmol) est placé en solution dans le THF anhydre
(2,5 ml) et le
mélange est refroidi à -10 C avant ajout d'hexaméthyldisilathiane (44,3 pmol)
puis d'une solution
de fluorure de tétrabutylammonium 1M dans le THF (40,9 pmol). Le mélange est
ramené à TA et
l'agitation est poursuivie 1h30. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt (5 ml)
et la phase
organique est lavée par une solution aq. saturée de NH4C1 (5 ml). La phase aq.
est extraite par
de l'AcOEt (2x5 ml). Les phases organiques sont réunies, lavées par une
solution aq. saturée de
NaC1 (5 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés
sous PR. Le brut
de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant
avec un mélange
DCM/méthanol 100/0 à 97/3. Un solide blanc, le composé 33, est obtenu (19 mg ;
78%). RMN 1H
(400 MHz, DMSO-d6): 0,78 (m, 12 H) ; 1,00 (s, 6 H) ; 1,04 (d, J=6,8 Hz, 6 H) ;
1,11 (s, 6 H) ; 1,30
(m,2 H) ; 1,49- 1,63(m, 4 H) ; 1,82 (m, 2 H) ; 2,26 (m, 2 H) ; 2,63 - 2,72 (m,
4 H) ; 2,93 - 3,05
(m, 6 H) ; 3,25 - 3,37 (m partiellement masqué, 2 H) ; 3,81 (s, 6 H) ; 3,82
(s, 4 H) ; 3,89 (d, J=2,0
Hz, 2 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7, 8,0 et 11,5 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,7, 9,6 Hz, 2
H) ; 5,10 (ddd, J=1,3,
5,3 et 10,8 Hz, 2 H) ; 5,79 (dd, J=1,3, 15,3 Hz, 2 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7, 10,8
et 15,3 Hz, 2 H) ;
7,05 (d, J=8,6 Hz, 2 H) ; 7,17 (dd, J=2,0, 8,6 Hz, 2 H) ; 7,22 (dd, J=2,5, 9,3
Hz, 2 H) ; 7,26 - 7,32
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(m, 10 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 2H). LCMS (A2) : ES m/z = 1427 [M + ; tR =
1,31 min.
Exemple 8 : (E)-(3S,10 R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-16-
{(S)-1-[(2 R,3R)-3-
(4-mercaptométhyl-phény1)-oxi ranyn-éthyll-6,6-d méthyl-1,4-d ioxa-8, 11-d
iaza-cyclohexad ec-13-
ène-2,5,9,12-tétraone
00 0
CI NH 0 0 41111 S-S 1101 0 0 HN CI HS grO 0 HN
CI
gh CI
),1
0 0 [1 0 33 y 0
Ex8
ne 01
Le composé 33 (11 mg ; 7,7 pmol) est placé en solution dans le méthanol (8,8
ml). Le TCEP
(76,7 pmol) en solution dans 2,2 ml d'eau est ensuite additionné et le mélange
est agité 2 h à TA.
Le mélange est dilué dans 20 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par un
mélange 1/1
d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4C1 (20 ml). La phase aq. est
extraite par de l'AcOEt
(2x15 ml). Les phases organiques sont réunies, lavées par une solution aq.
saturée de NaC1 (15
ml). Après séchage sur Mg504 et filtration, les solvants sont évaporés sous
PR. Le brut de la
réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un
mélange
DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Un solide blanc, Ex8, est obtenu (4,7 mg ; 31%).
RMN 1H (400
MHz, DMSO-d6): 0,79 (d, J=6,4 Hz, 6 H) ; 1,00 (s, 3 H) ; 1,05 (d, J=6,9 Hz, 3
H) ; 1,12 (s, 3 H) ;
1,30 (m, 1 H) ; 1,50 - 1,63 (m, 2 H) ; 1,80 (m, 1 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,62 -
2,75 (m, 2 H) ; 2,84 (t
large, J=6,5 Hz, 1 H) ; 2,93 - 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1
H) ; 3,73 (d large,
J=6,5 Hz, 2 H) ; 3,81 (s., 3 H) ; 3,87 (d, J=1,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7,
8,0 et 11,4 Hz, 1 H) ;
4,91 (dd, J=3,6, 9,6 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1,3, 5,3 et 11,4 Hz, 1 H) ; 5,79
(dd, J=1,3, 15,2 Hz, 1
H) ; 6,47 (ddd, J=3,4, 11,3 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17
(dd, J=1,9, 8,5 Hz, 1
H) ; 7,22 (dd, J=2,3, 9,5 Hz, 1 H) ; 7,25 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=1,9
Hz, 2 H) ; 7,35 (d,
J=8,3 Hz, 2 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 715 [M
; m/z = 713 [M - 1-1]-;
tR = 1,18 min.
Exemple 9: hu2H11-SPDB-Ex1
0 0 =
___________________________ Lys , 0
S
hu2H11 N 010 0 0 HN CI
Ex9
d
Selon la méthode générale en deux étapes, 10,4 mg (0,071 pmol, 1,174 ml)
d'anticorps nu
hu2H11 à une concentration initiale de 8,86 mg/mi sont traités par 7 éq. de
l'ester N-hydroxy-
succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butandique (0,16 mg, 0,496 pmol)
en solution dans
34,2 pl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de
8 mg/mi dans le
mélange. Après purification, on obtient 2,2 ml d'anticorps hu2H11 modifiés à
une concentration
de 4,28 mg/mi (9,42 mg, 91%) avec en moyenne 4,68 molécules de
pyridyldisulfures par
anticorps. 1,68 ml (7,2 mg, 0,049 pmol) d'anticorps hu2H11 modifié sont
traités avec 1,03 mg de
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(E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-16-[(S)-14(2R,3R)-3-
{444-(4-
mercapto-4-méthyl-pentanoy1)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényll-oxirany1)-éthyl]-
6,6-diméthyl-1,4-
dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone (composé Exl, 1,148
pmol) en solution
dans 101,2 pl de DMA. Après purification sur Superdex en présence de 10% de
NMP et
5 concentration sur Amicon Ultra-15, le changement de tampon final est
réalisé dans un tampon
aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate et 0,14 M de NaCI. On obtient
alors 1,5 ml de
conjugué Ex9 à une concentration de 1,1 mg/mi avec en moyenne 3 dérivés de
cryptophycine
par anticorps (HRMS) et une pureté monomérique de 99,9%.
10 Exemple 10: hu2H11-SPDB-Ex2
0 0
_______________________ Lys 0
L,N,õ) 0, 00 HN.õ1 dle
CI
hu2H11
Ex10 ONO
H I d
Selon la méthode générale en une étape, 13,5 mg (0,092 pmol, 1,318 ml)
d'anticorps nu hu2H11
à une concentration initiale de 10,24 mg/mi sont traités par 6 éq. de l'ester
N-hydroxy-
succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butandique (0,18 mg, 0,551 pmol)
en solution dans
15 38,4 pl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps
soit de 9 mg/mi dans le
mélange. Après 2 h d'agitation à environ 2000 rpm à TA, sont successivement
ajoutés à 1,333 ml
(12,0 mg, 0,081 pmol) du mélange d'anticorps hu2H11 modifié 1,760 ml de tampon
pH,7,5-8,
543 pl de DMA puis 1,73 mg de (E)-(35,6R,10R,165)-10-(3-chloro-4-méthoxy-
benzy1)-3-isobuty1-
16-[(S)-14(2R,3R)-3-{444-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoy1)-pipérazin-1-ylméthyl]-
phényll-
20 oxirany1)-éthy1]-6-méthy1-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-
tétraone (composé
Ex2, 1,958 pmol) en solution dans 182 pl de DMA. Après purification sur
Superdex en présence
de 20% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15, le changement de tampon
final est réalisé
dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M d'histidine, 10% de sucrose
(w/v) et 5% de
NMP (v/v). On obtient alors 1,5 ml de conjugué Ex10 à une concentration de
2,83 mg/mi avec en
25 moyenne 3,7 dérivés de cryptophycine par anticorps et une pureté
monomérique de 98,8%.
Exemple 11: hu2H11-SPDB-Ex5
0 = 1
________________________ Lys
S-SCN 0, '11'rf CI
hu2H11
oJCNo
1. 0
Exil H d
Selon la méthode générale en une étape, 9,45 mg (0,064 pmol, 0,923 ml)
d'anticorps nu hu2H11
30 à une concentration initiale de 10,24 mg/mi sont traités par 6 éq. de
l'ester N-hydroxy-
succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butandique (0,13 mg, 0,398 pmol)
en solution dans
26,88 pl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit
de 9 mg/mi dans le
mélange. Après 2h d'agitation à environ 2000 rpm à TA, sont successivement
ajoutés à 1,0 ml
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(9,0 mg, 0,061 pmol) du milieu réactionnel d'anticorps hu2H11 modifié 1,45 ml
de tampon pH,
7,5-8, 265 pl de DMA puis 1,26 mg de (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-
benzy1)-3-
isobuty1-16-[(S)-14(2R,3R)-3-{444-(2-mercapto-2-méthyl-propy1)-pipérazin-1-
ylméthylFphényll-
oxirany1)-éthy1]-6,6-diméthy1-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-
2,5,9,12-tetraone
(composé Ex5, 1,472 pmol) en solution dans 285 pl de DMA. Après purification
sur Superdex en
présence de 20% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15, le changement de
tampon final
est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M d'histidine, 10% de
sucrose (w/v) et
5% de NMP (v/v). On obtient alors 2,5 ml de conjugué Ex12 à une concentration
de 1,70 mg/mi
avec en moyenne 3,7 / 3,1 dérivés de cryptophycine (UV / HRMS) par anticorps
et une pureté
monomérique de 98,0%.
Exemple 12: hu2H11-SPDB-Ex6
0
0
___________________ Lys S 0 rû o, o HN Cl
hu2H11 I-0?-N10 le
0
H
Ex12 d
Selon la méthode générale en une étape, 10,31 mg (0,070 pmol, 1,006 ml)
d'anticorps nu
hu2H11 à une concentration initiale de 10,24 mg/mi sont traités par 6 éq. de
l'ester N-hydroxy-
succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butandique (0,14 mg, 0,429 pmol)
en solution dans
29,32 pl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit
de 9 mg/mi dans le
mélange. Après 2 h d'agitation à environ 2000 rpm à TA, sont successivement
ajoutés à 1,1 ml
(9,9 mg, 0,067 pmol) du mélange d'anticorps hu2H11 modifié 1,595 ml de tampon
pH , 7,5-8,
291 pl de DMA puis 1,60 mg de (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-
3-isobuty1-16-
[(S)-1-((2R,3R)-3-{444-({242-(2-{2-méthy142-mercapto-2-méthyl-propyl]amino-
éthoxy} -éthoxy)-
éthoxyFéthyllméthylamino)-méthyl]-phényll-oxirany1)-éthyl]-6,6-diméthyl-1,4-
dioxa-8,11-diaza-
cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tetraone (composé Ex6, 1,617 pmol) en solution
dans 314 pl de
DMA. Après purification sur Superdex en présence de 20% de NMP et
concentration sur Amicon
Ultra-15, le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux
pH=6,5 contenant
0,01 M d'histidine, 10% de sucrose (w/v) et 5% de NMP (v/v). On obtient alors
3 ml de conjugué
Ex12 à une concentration de 1,97 mg/mi avec en moyenne 3,4 dérivés de
cryptophycine par
anticorps (HRMS) et une pureté monomérique de 99,8%.
Exemple 13 : (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-1043-Chloro-4-méthoxy-
benzy11-3-
isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tétraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-
en-16-y1}-
éthyl)-oxiranyll-benzy1}-pipérazin-1-y1)-acétate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
0
0 1,õ_õN = 0 0 HN.,1 ah CI
0
0 Y-L/11 gille
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Composé 34 : 4-Méthoxycarbonylméthyl-pipérazine-1-carboxylate de tert-butyle
\ \
rfV-LO")
HN
200 mg (1,07 mmol) de pipérazine-1-carboxylate de tert-butyle sont placés en
solution dans
l'acétonitrile anhydre (10 ml). La TEA (1,07 mmol) puis le bromoacétate de
méthyle (1,61 mmol)
sont ensuite ajoutés. La suspension blanche est agitée 48 h à TA avant ajout
d'une solution aq.
saturée de NaHCO3 (10 ml). La phase aq. est extraite par du DCM (3x10 ml), les
phases
organiques sont réunies, lavées par une solution aq. saturée de NaCI et
séchées sur MgSO4.
Après filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit brut est
obtenu. Ce brut est purifié
par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol
98/2. Le produit
attendu 34, une huile incolore est alors obtenu (174,8 mg ; 63%). CCM (DCM 90!
Me0H 10) : Rf
= 0,66; RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6): 1,39 (s, 9 H) ; 2,40 à 2,48 (m, 4 H) ; 3,25
(s, 2 H) ; 3,28 à
3,33 (m partiellement masqué, 4 H) ; 3,61 (s, 3 H).
Composé 35: Chlorhydrate du pipérazin-1-yl-acétate de méthyle
0 CIH
34 3
0
5
Le composé 34(174 mg ; 0,67 mmol) est placé en solution dans le dioxane
anhydre (5 ml) et une
solution HCI 4 M dans le dioxane (0,02 mmol) est ajoutée. Le mélange est agité
5 h à TA puis la
suspension est filtrée sur verre fritté. Le solide ainsi obtenu est lavé par
du dioxane (2 ml) puis
par de l'éther isopropylique (2 ml) avant d'être séché sous vide. Un solide
beige, 35, est obtenu
(131 mg; 100%). RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6): 2,88 à 2,97 (m, 4 H) ; 3,09 à 3,19
(m, 4 H) ;
3,53 à 3,59 (m, 2 H) ; 3,65 (s, 3 H) ; 8,65 à 9,22 (m étalé, 2 H).
Composé 36: (4-{4-[(2 R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-1043-Chloro-4-méthoxy-
benzy1]-3-
isobuty1-6,6-diméthy1-2,5,9,12-tetraoxo-1 ,4-d ioxa-8, 11-d iaza-cyclohexadec-
13-èn-16-yll-éthyI)-
oxiranyn-benzyll-pipérazin-1-y1)-acétate de méthyle
= =
HO le 0 0 HN 0 0 CI 41/
00 HN.õ CI
1-
0'17'-'HN 0 0 36
0 -
1:1)
Le dérivé 1 (20 mg ; 28,6 pmol) est placé en solution dans le DCM anhydre (1
ml) et la TEA (71,5
pmol) puis le CMS (45,8 pmol) sont ajoutés. Après 12 h à TA, le produit 2
formé n'est pas isolé.
La TEA (85,7 pmol) puis le chlorhydrate du pipérazin-1-yl-acétate de méthyle
35 (42.8 pmol) sont
ajoutés. Le mélange est agité 72 h supplémentaires à TA avant que du DMF
anhydre (1 ml) et
Nal (30 pmol) ne soient ajoutés. Le mélange est agité 48 h à 45 C avant d'être
dilué par de
l'AcOEt (5 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (2x2 ml), par une
solution aq. saturée
de NaHCO3 (2 ml) et par une solution aq. saturée de NaCI (2 ml). Après séchage
sur MgSO4 et
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filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est
purifié par
chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol
100/0 à 98/2. Le
composé 36 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (8,2 mg; 34%). CCM (DCM
90 / Me0H
10) : Rf = 0,45; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 0,77 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 0,78 (d,
J=6,1 Hz, 3 H) ;
1,00 (s, 3 H) ; 1,05 (d, J=7,1 Hz, 3 H) ; 1,12 (s, 3 H) ; 1,27 à 1,32 (m, 1 H)
; 1,50 à 1,60 (m, 2 H) ;
1,74 à 1,84 (m, 1 H) ; 2,21 à 2,30 (m, 1 H) ; 2,37 (s large, 4 H) ; 2,64 à
2,74 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,06
(m, 3 H) ; 3,18 à 3,52 (m, partiellement masqué, 9 H) ; 3,60 (s, 3 H) ; 3,81
(s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0
Hz, 1 H) ; 4,20 à 4,31 (m, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,8 et 9,9 Hz, 1 H) ; 5,11 (m, 1
H) ; 5,80 (d, J=15,2
Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 11,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H)
; 7,17 (dd, J=2,2 et
8,3 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,33 (m, 6 H) ; 8,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H). LCMS (AI): ES
m/z = 839 [M + ;
m/z = 420 [M + 21-1]2+ (pic de base) ; m/z = 837 [M -
; m/z = 883 [M + HCO2H - HF (pic de
base) ; tR = 3,57 min.
Composé 37: Bromoacétate d'allyle
0 0
37
Br _________________________________________ Br
Br 0
288 mg (4,95 mmol) d'alcool allylique sont mis en solution dans 25 ml de DCM.
La solution est
refroidie à 0 C puis 760 pl (5,45 mmol) de TEA et 3,03 mg (24,8 pmol) de DMAP
sont ajoutés. Le
mélange est agité à 0 C puis 1,0 g (4,95 mmol) de bromure de bromoacétyle sont
ajoutés. La
réaction est poursuivie pendant la nuit à TA. On ajoute de l'eau au mélange ;
la phase aq. est
lavée avec du DCM. Les fractions organiques sont rassemblées, lavées avec de
l'eau et une
solution saturée de NaCI et séchées sur Mg504. Après filtration et évaporation
des solvants sous
PR, le produit 37 est obtenu (747 mg, 84%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 4,18
(s, 2 H) ; 4,64
(td, J=1,5 et 5,4 Hz, 2 H) ; 5,25 (qd, J=1,5 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,35 (qd,
J=1,5 et 17,2 Hz, 1 H) ;
5,92 (tdd, J=5,4 et 10,5 et 17,2 Hz, 1 H).
Composé 38 : 4-Allyloxycarbonylméthyl-pipérazine-1-carboxylate de tert-butyle
o 38 0
NO
H
A une solution de 200 mg (1,07 mmol) de 1-Boc-pipérazine dans 8 ml
d'acétonitrile sont ajoutés
150 pl (1,07 mmol) de TEA et 250 mg (1,40 mmol) de bromoacétate d'allyle 37.
Le mélange est
agité à TA pendant la nuit. La réaction est arrêtée par ajout d'une solution
saturée de NaHCO3.
Le mélange est extrait avec l'AcOEt (3 fois) ; les phases organiques sont
rassemblées, lavées
avec une solution saturée de NaCI et séchées sur Mg504. Après filtration et
évaporation du
solvant sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice, en
éluant avec un
mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le produit attendu 38 est obtenu sous la
forme d'une huile
jaune (314 mg; 100%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,39 (s, 9 H) ; 2,45 à 2,48
(m, 4 H) ; 3,25
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à 3,34 (m partiellement masqué, 6 H) ; 4,57 (td, J=1,5 et 5,6 Hz, 2 H) ; 5,22
(qd, J=1,5 et 10,3 Hz,
1 H) ; 5,30 (qd, J=1,5 et 17,1 Hz, 1 H) ; 5,83 à 5,98 (m, 1 H). LCMS (A2):ES
m/z = 285 [M + ;
m/z = 229 pic de base ; tR = 0,51 min.
Composé 39: Chlorhydrate du pipérazin-1-yl-acétate d'allyle
O No O NH Ho,
38 39
314 mg (1,10 mmol) du composé 38 sont dissous dans 12,6 ml de dioxane puis 5,5
ml
(22,0 mmol) d'une solution HCI 4M dans le dioxane sont ajoutés. L'agitation
est poursuivie
pendant la nuit à TA. Le mélange est concentré à sec pour donner le composé
attendu 39 sous
la forme d'une huile jaune (260 mg; 100%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 2,79 à
2,88 (m, 4 H)
; 3,07 à 3,15 (m, 4 H) ; 3,48 à 3,51 (m, 2 H) ; 4,60 (td, J=1,5 et 5,6 Hz, 2
H) ; 5,23 (qd, J=1,5 et
10,3 Hz, 1 H) ; 5,32 (qd, J=1,5 et 7,4 Hz, 1 H) ; 5,86 à 5,98 (m, 1 H) ; 8,74
(s large, 2 H). LCMS
(A2): ES m/z = 185 [M + ; tR = 0,19 min.
Composé 40 : (4-{4-[(2R,3R)-34(S)-1-{(E)-(35,10 R,16S)-1043-Chloro-4-méthoxy-
benzy1]-3-
isobuty1-6,6-d méthy1-2,5,9,12-tétraoxo-1 ,4-d ioxa-8, 11-d iaza-cyclohexadec-
13-en-16-yll-éthyI)-
oxiranyn-benzyll-pipérazin-1-y1)-acétate d'allyle
0 0
CI
0 0 0 HN.,1 ai a 0 0 0 0 HN, CI
"1--- 0
H
2
A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (28,3 mg, 39,5 pmol) dans
l'acétonitrile anhydre
20 (2,5 ml) est ajoutée une solution du composé 39 (118,5 pmol) et de TEA
(198 pmol) dans
l'acétonitrile anhydre (1 ml). L'agitation est poursuivie 24 h à 40 C. Le
mélange est dilué dans de
l'AcOEt (10 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (10 ml), par une
solution aq. saturée
de NaHCO3 (10 ml) et par une solution aq. saturée de NaCI (10 ml). Après
séchage sur Mg504 et
filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est
purifié par
25 chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange
DCM/méthanol 98/2. Le composé
40 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (19,2 mg; 56%). RMN 1H (500 MHz,
DMSO-d6):
0,75 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,77 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 1,00 (s, 3 H) ; 1,05 (d,
J=6,9 Hz, 3 H) ; 1,12 (s,
3 H) ; 1,25 à 1,33 (m, 1 H) ; 1,50 à 1,61 (m, 2 H) ; 1,74 à 1,84 (m, 1 H) ;
2,27 (dt, J=11,3 et 14,2
Hz, 1 H) ; 2,32 à 2,42 (m, 4 H) ; 2,52 (m partiellement masqué, 4 H) ; 2,64 à
2,74 (m, 2 H) ; 2,94
30 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,25 (s, 2 H) ; 3,32 à 3,35 (m partiellement masqué, 1
H) ; 3,40 à 3,48 (m, 2 H) ;
3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 11,6 Hz,
1 H) ; 4,56 (td, J=1,5 et
5,5 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,11 (m, 1 H) ; 5,21 (qd,
J=1,5 et 10,5 Hz, 1 H) ;
5,30 (qd, J=1,5 et 17,3 Hz, 1 H) ; 5,80 (d, J=16,2 Hz, 1 H) ; 5,86 à 5,95 (m,
1 H) ; 6,47 (ddd,
J=3,8 et 11,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et
8,5 Hz, 1 H) ; 7,19 à
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7,32 (m, 6 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES rniz = 865 [M +
; rniz = 433,5 [M +
21-1]2+ (pic de base) ; rniz = 863 [M - ; rniz = 909 [M +
HCO2H - ; tR = 0,92 min.
Composé 41: Acide (4-{4-[(2R,3R)-34(S)-1-{(E)-(35,10R,16S)-1043-chloro-4-
méthoxy-benzy1]-3-
5 isobuty1-6,6-d i méthy1-2,5,9,12-tétraoxo-1 ,4-d ioxa-8, 11-d iaza-
cyclohexadec-13-en-16-yll-éthyI)-
oxiranyn-benzyll-pipérazin-1-y1)-acétiq ue
diet. 0 H0,-, , 0
0 LN0 HN.õ1. 0 CI NL) 1 I
C10
0 0 HN,1
1 41
H
A une solution sous argon du composé 40 (12,8 mg, 14,8 pmol) dans le THF
anhydre sont
ajoutés le tétrakis(triphénylphospine)palladium (1,48 pmol) et la morpholine
(148 pmol). Après 3
10 h de réaction, le mélange est concentré à sec et repris dans 5 ml de
DCM. La phase organique
est lavée par une solution de 1 ml HCI 0,1N dans 3 ml d'eau (pH--5), séchée
sur Mg504, filtrée et
évaporée pour donner le composé 41(6,7 mg, 55%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6):
0,76 (d,
J=6,0 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ; 1,00 (s, 3 H) ; 1,05 (d, J=6,9 Hz,
3 H) ; 1,12 (s, 3 H) ;
1,28 (m, 1 H) ; 1,52 à 1,59 (m, 2 H) ; 1,76 à 1,84 (m, 1 H) ; 2,21 à 2,32 (m,
1 H) ; 2,42 (d, J=6,6
15 Hz, 4 H) ; 2,58 à 2,76 (m, 6 H) ; 2,97 à 3,09 (m, 3 H) ; 3,14 (s large,
2 H) ; 3,33 (m masqué, 1 H) ;
3,46 (s large, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1,8 Hz, 1 H) ; 4,20 à 4,29
(m, 1 H) ; 4,89 à 4,93 (m,
1 H) ; 5,06 à 5,14 (m, 1 H) ; 5,80 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,43 à 6,50 (m, 1 H)
; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1
H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,32 (m, 6 H) ; 8,34 (d, J=8,0
Hz, 1 H). LCMS (A2) :
ES rniz = 825 [M + ; rniz = 413 [M + 21-1]2+ (pic de base) ; rniz = 823 [M -
; tR = 0,86 min.
Exemple 13:
(4-{4-[(2R,3R)-34(S)-1-{(E)-(35,10 R,16S)-1043-Chloro-4-méthoxy-benzy1]-3-
isobuty1-6,6-d méthy1-2,5,9,12-tétraoxo-1 ,4-d ioxa-8, 11-d iaza-cyclohexadec-
13-en-16-yll-éthyI)-
oxiranyn-benzyll-pipérazin-1-y1)-acétate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
o
HO
0
0 I--õ_õN 0 0 HNLI di CI 0 [-N 0 0
HN.õi Cl
0 0
41 gielle 0
"111--. 0
H Ex13 H
L'exemple 13 peut être obtenu en activant l'acide 41 selon la méthode décrite
pour l'exemple 18.
Exemple 14 : (2-{242-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(38,10R,168)-1043-Chloro-4-
méthoxy-
benzy11-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-
cyclohexadec-13-èn-
16-y1}-éthyl)-oxiranyll-benzylamino}-éthoxy)-éthoxyl-éthoxy}-éthoxy)-
propanoate de 2,5-
dioxo-pyrrolidin-1-yle
00
IlO 0 HN CI
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Composé 42 : 3-(2-{242-(2-tert-Butoxycarbonylamino-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-
éthoxy)-
propanoate d'allyle
H H
HO 0,
0 (1)-L 0 (1)_L
42
A une solution d'acide Boc-15-amino-4,7,10,13-tétraoxapentadecandique (50 mg,
137 pmol)
dans 1,25 ml de DCM sont successivement ajoutés le chlorhydrate d'EDC1 (164,2
pmol), la
DMAP (13,7 pmol) et l'alcool allylique (164,2 pmol). Le mélange est agité à TA
pendant 16 h puis
évaporé à sec. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice, en
éluant avec un
mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 42 est obtenu sous la forme
d'une huile
incolore (37,5 mg; 67%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,37 (s, 9 H) ; 2,57 (t,
J=6,1 Hz, 2 H) ;
3,06 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,37 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,44 à 3,53 (m, 12 H) ;
3,64 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ;
4,55 (td, J=1,6 et 5,4 Hz, 2 H) ; 5,20 (qd, J=1,6 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd,
J=1,6 et 17,3 Hz, 1 H)
; 5,90 (tdd, J=5,4 et 10,5 et 17,3 Hz, 1 H) ; 6,70 (t large, J=6,1 Hz, 1 H).
LCMS (A2) ES m/z = 406
[M + ; m/z = 428 [M + Na] ; m/z = 306 pic de base ; tR = 0,91 min.
Composé 43 : Chlorhydrate du 3-(2-{242-(2-amino-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-
propanoate
d'allyle
O H
NH2
HCI
0
42 43
A une solution du composé 42 (37,5 mg, 92,5 pmol) dans 2 ml de dioxane sont
ajoutés 460 pl
(1,85 mmol) d'une solution d'acide chlorhydrique 4M dans le dioxane.
L'agitation est poursuivie à
TA pendant la nuit puis le milieu réactionnel est évaporé à sec pour donner le
composé 43 sous
la forme d'une huile incolore (31 mg, quantitatif). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6):
2,58 (t, J=6,1
Hz, 2 H) ; 2,96 (t, J=5,4 Hz, 2 H) ; 3,48 à 3,53 (m, 8 H) ; 3,55 à 3,58 (m, 4
H) ; 3,60 (t, J=5,4 Hz, 2
H) ; 3,65 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 4,56 (td, J=1,6 et 5,4 Hz, 2 H) ; 5,21 (qd,
J=1,6 et 10,5 Hz, 1 H) ;
5,30 (qd, J=1,6 et 17,3 Hz, 1 H) ; 5,91 (tdd, J=5,4 et 10,5 et 17,3 Hz, 1 H) ;
7,91 (m étalé, 3 H).
LCMS (A2) : ES m/z = 306 [M + ; tR = 0,42 min.
Composé 44: (2-{242-(2-{4-[(2R,3R)-34(S)-1-{(E)-(35,10R,16S)-1043-Chloro-4-
méthoxy-benzyl]
-3-isobuty1-6,6-diméthy1-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-
13-èn-16-yll-éthyl)-
oxiranylFbenzylaminol-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-propanoate d'allyle
a =te
dei
0 0 HN,1 0,v-iNi
ci
2 dIN":' 0 44
H 0 0
?
A une solution, purgée à l'argon, du composé 2(12,7 mg, 17,7 pmol) dans 1,48
ml d'acétonitrile
anhydre sont successivement ajoutés 22,2 pl de TEA (159 pmol) et 30,2 mg du
composé 43
(88,4 pmol). L'agitation est poursuivie à 40 C pendant 24 h: il reste du
composé 2 de départ ;
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22,2 pl de TEA (159 pmol) et 30,2 mg du composé 43 (88,4 pmol) sont à nouveau
ajoutés au
mélange et l'agitation poursuivie à 40 C pendant 48 h supplémentaires. 2 ml
d'eau sont ajoutés
au mélange qui est ensuite extrait avec 2x2 ml d'AcOEt. Les phases organiques
sont
rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaHCO3 (2 ml), une solution
saturée de
chlorure de sodium (2 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et
concentration sous PR, le
brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en
éluant avec un mélange
DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 44 est obtenu sous la forme d'un solide
blanc (4,8 mg;
27%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,77 (m, 6 H) ; 1,00 (s, 3 H) ; 1,05 (d,
J=6,9 Hz, 3 H) ; 1,12
(s, 3 H) ; 1,29 (m, 1 H) ; 1,49 à 1,60 (m, 2 H) ; 1,81 (m, 1 H) ; 2,26 (m, 1
H) ; 2,56 (t, J=6,1 Hz, 2
H) ; 2,61 à 2,73 (m, 4 H) ; 2,93 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,28 à 3,38 (m
partiellement masqué, 1 H) ; 3,45
à 3,53 (m, 14 H) ; 3,63 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ;3,72 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ;
3,86 (s large, 1 H) ; 4,25
(ddd, J=3,4 et 8,2 et 11,4 Hz, 1 H) ; 4,55 (dm, J=5,4 Hz, 2 H) ; 4,90 (dd,
J=3,9 et 9,8 Hz, 1 H) ;
5,11 (ddd, J=1,4 et 5,4 et 11,2 Hz, 1 H) ; 5,19 (dm, J=10,8 Hz, 1 H) ; 5,29
(dm, J=17,2 Hz, 1 H) ;
5,79 (dd, J=1,4 et 15,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,9 et 11,2 et
15,2 Hz, 1 H) ; 7,05
(d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,8 Hz, 1 H) ; 7,21 (m, 1 H) ; 7,24
(d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,28
(d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 7,33 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,2 Hz, 1 H). LCMS
(A2) : ES m/z = 986
[M + H] ; m/z = 493,5 [M + 21-1]2+ pic de base ; m/z = 984 [M - 1-1]- ; m/z =
1030 [M - H + 1-1CO21-1]-
pic de base ; tR = 0,95 min.
Exemple 14: (2-{242-(2-{4-[(2R,3R)-34(S)-1-{(E)-(35,10R,16S)-1043-Chloro-4-
méthoxy-benzyn-
3-isobuty1-6,6-d i méthy1-2,5,9,12-tetraoxo-1 ,4-d ioxa-8, 11-d iaza-
cyclohexad ec-13-èn-16-yll-éthyI)-
oxiranyn-benzylaminol-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-
pyrrolidin-1-yle
de. = - 0 - 0
0
c, , HN1
0)1r11 0 e 0 ___________________________________________ 0:000
e ?0O i0l ylHNgi,T 0 Si 0c
i
I
L'exemple 14 peut être obtenu en déprotégeant le composé 44 selon la méthode
décrite pour le
composé 41 et en activant l'acide obtenu selon la méthode décrite pour
l'exemple 18.
Exemple 15 : (2-{242-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(38,10R,168)-1043-Chloro-4-
méthoxy-
benzy11-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11 -diaza-
cyclohexadec-13-èn-
16-y1}-éthyl)-oxiranyll-benzyl-méthyl-amino}-éthoxy)-éthoxyl-éthoxy}-éthoxy)-
propanoate
de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
.
0 0 , 0
i i I -
, 0 0 0 HN... iiii CI
0'11'i') 0 "IIII-- Ci)
Composé 45 : Acide 342-(2-{242-(tert-butoxycarbonyl-méthyl-amino)-
éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-
éthoxepropandique
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H
HO HO
0
520 mg (1,423 mmol) d'acide Boc-15-amino-4,7,10,13-tétraoxapentadecanoïque
sont mis en
solution dans 14 ml de THF anhydre puis le mélange est refroidi à 0 C avant
que soient ajoutés,
par spatulées, 85,4 mg (2,135 mmol) d'hydrure de sodium. L'agitation est
poursuivie pendant
5 10 min à 0 C puis 150,6 pl (2,419 mmol) d'iodure de méthyle sont ajoutés
à 0 C. La température
est laissée revenir à TA et l'agitation poursuivie 2 h. 8 ml d'eau sont
ajoutés au mélange dont le
pH est ensuite acidifié par addition d'acide acétique pour obtenir pH,-4. Il
est extrait par 3x10 ml
d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec 10 ml d'une
solution saturée de
NaCI et séchées sur MgSO4. Après filration et concentration à sec sous PR, le
composé 45 est
10 obtenu sous la forme d'une huile incolore (414 mg, 77%). RMN 1H (400
MHz, DMSO-d6): 1,38 (s,
9 H) ; 2,43 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,29 (1, J=5,9 Hz, 2 H)
; 3,45 à 3,52 (m, 14 H) ;
3,60 (1, J=6,4 Hz, 2 H) ; 12,01 (m étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 402 [M +
Na] ; m/z = 378 [M
- 1-1]- ; m/z = 280 pic de base ; tR = 0,95 min.
15 Composé 46 : 342-(2-{242-(tert-Butoxycarbonyl-méthyl-amino)-
éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-éthoxy]-
propanoate d'allyle
0 0
HO 0 y
0 0 0
45 46
A une solution de 540 mg (1,423 mmol) du composé 45 dans 15 ml de DCM anhydre
sont
successivement ajoutés 327 mg (1,71 mmol) d'EDCI, 17,4 mg (142 pmol) de DMAP
et 116 pl
20 (1,71 mmol) d'alcool allylique. L'agitation est poursuivie 15h à TA puis
le mélange est concentré
à sec. Le brut obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice, en
éluant avec un
mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 46 est obtenu sous la forme
d'une huile
incolore (337 mg ; 56%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,38 (s, 9 H) ; 2,57 (t,
J=6,1 Hz, 2 H) ;
2,80 (s large, 3 H) ; 3,22 à 3,33 (m partiellement masqué, 2 H) ; 3,44 à 3,54
(m, 14 H) ; 3,64 (t,
25 J=6,1 Hz, 2 H) ; 4,55 (d large, J=4,9 Hz, 2 H) ; 5,20 (d large, J=10,3
Hz, 1 H) ; 5,30 (d large,
J=17,1 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 442 [M + Na] ; m/z = 320
pic de base ; tR
= 0,98 min.
Composé 47: 3-(2-{242-(2-Méthylamino-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-propanoate
d'allyle
0
0 0
46 47
A une solution de 337 mg (0,802 mmol) du composé 46 dans 20 ml de DCM sont
ajoutés 1,19 ml
(16,04 mmol) de TFA. L'agitation est poursuivie pendant 3 h à TA puis le
mélange est concentré
à sec sous PR. Le brut est purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX
(Varian) conditionnée
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et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans
le méthanol.
Le composé 47 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (208 mg, 81%). RMN
1H (400 MHz,
DMSO-d6): 2,27 (s, 3 H) ; 2,54 à 2,61 (m, 4 H) ; 3,44 (t, J=5,6 Hz, 2 H) ;
3,47 à 3,52 (m, 12 H) ;
3,65 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,56 (d large, J=5,4 Hz, 2 H) ; 5,20 (d large,
J=10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (d
large, J=17,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 320 [M + ; tR
= 0,42 min.
Composé 48: (2-{242-(2-{4-[(2R,3R)-34(S)-1-{(E)-(35,10R,16S)-
1043-Chloro-4-méthoxy-
benzy1]-3-isobuty1-6,6-diméthy1-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-
cyclohexadec-13-èn-16-
yll-éthyl)-oxiranylFbenzylaminol-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-propanoate
d'allyle
0 -- 0
ci =0 0 HN.1 Cl j le 0 0 HN
y
H
1 0
A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (40 mg, 55,7 pmol) dans 5 ml
d'acétonitrile
anhydre sont successivement ajoutés 48,5 pl de DIPEA (279 pmol) et 53 mg du
composé 47
(167 pmol). L'agitation est poursuivie à 40 C pendant 15 h ; 5 ml d'eau sont
ajoutés au mélange
qui est ensuite extrait avec 4x5 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont
rassemblées, lavées
avec une solution saturée de NaHCO3 (5 ml), une solution saturée de NaCI (5
ml) et séchées sur
Mg504. Après filtration et concentration sous PR, le brut de la réaction est
purifié par
chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol
100/0 à 90/10. Le
composé 48 est obtenu sous la forme d'un solide incolore (45,3 mg ; 80%). RMN
1H (500 MHz,
DMSO-d6): 0,76 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 1,00 (s, 3 H) ;
1,04 (d, J=6,8 Hz, 3
H) ; 1,12 (s, 3 H) ; 1,29 (m, 1 H) ; 1,50 à 1,61 (m, 2 H) ; 1,80 (m, 1 H) ;
2,15 (s, 3 H) ; 2,28 (m, 1
H) ; 2,52 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,56 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,63 à 2,73 (m, 2 H)
; 2,94 à 3,06 (m, 3 H) ;
3,25 à 3,35 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,49 à 3,51 (m, 12
H) ; 3,52 (t, J=6,4
Hz, 2 H) ; 3,63 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1,5 Hz, 1 H) ;
4,25 (ddd, J=3,4 et 8,3
et 11,5 Hz, 1 H) ; 4,55 (d large, J=5,0 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,7 et 9,5 Hz,
1 H) ; 5,11 (ddd, J=1,5
et 5,7 et 11,5 Hz, 1 H) ; 5,19 (dm, J=10,3 Hz, 1 H) ; 5,29 (dm, J=17,6 Hz, 1
H) ; 5,80 (dd, J=1,5 et
15,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 11,5 et 15,2 Hz, 1 H) ;
7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ;
7,17 (dd, J=2,0 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,9 et 9,8 Hz, 1 H) ; 7,25 (d,
J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,28 (d,
J=2,0 Hz, 1 H) ; 7,30 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A2)
: ES m/z = 1000 [M
+ ; m/z = 500,5 [M + 21-1]2+ ; m/z = 1044 [M - H + HCO2HF ; tR = 1,01
min.
Composé 49: Acide (2-{242-(2-{4-[(2R,3R)-34(S)-1-{(E)-(35,10R,16S)-1043-chloro-
4-méthoxy-
benzy1]-3-isobuty1-6,6-diméthy1-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-
cyclohexadec-13-èn-16-
yll-éthyl)-oxiranylFbenzylaminol-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-propandique
=0 0
.,,.?00 0 FlriNlo . HOrõ0,_,--.0,,49 0 0 N
,?00 0 HraN10
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19 mg (18,9 pmol) du composé 48 sont mis en solution dans 3,8 ml de THF
anhydre et purgés à
l'argon. 6 pl (18,9 pmol) de diéthylamine sont ajoutés au mélange qui est
agité 15 min à TA avant
que soient ajoutés 4,45 mg (19,8 pmol) d'acétate de palladium (II) et 18,89 mg
de
triphénylphosphine supportée. L'agitation est poursuivie 6 jours à TA: il
reste du départ mais la
5 réaction n'évolue plus. Le mélange est filtré, concentré à sec, repris
dans 2 ml de THF anhydre et
traité avec 10 pl (31,5 pmol) de diéthylamine et 10 mg de tétrakis(triphényl-
phospine)palladium
pendant 1h. Le mélange est hydrolysé avec 2 ml d'une solution aq.
d'hydrogénosulfate de
sodium 2M et extrait avec 3 X 2 ml de DCM. Les phases organiques sont
rassemblées, lavées
avec une solution saturée de NaCI (2 ml) et séchées sur MgSO4. Après
filtration et concentration
10 sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice
greffée diol en éluant avec un
mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 49 est obtenu sous la forme d'un
solide
incolore (5,4 mg ; 30%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,76 (t, J=5,9 Hz, 3 H) ;
0,78 (t, J=5,9 Hz,
3 H) ; 1,00 (s, 3 H) ; 1,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1,12 (s, 3 H) ; 1,31 (m, 1 H)
; 1,51 à 1,62 (m, 2 H) ;
1,80 (m, 1 H) ; 2,15 (s, 3 H) ; 2,28 (m, 1 H) ; 2,42 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,52
(t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,64
15 à 2,73 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,44 (m partiellement
masqué, 3 H) ; 3,45 à 3,51
(m, 12 H) ; 3,53 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,59 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H)
; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H)
; 4,25 (ddd, J=4,2 et 7,8 et 11,5 Hz, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ;
5,11 (dd, J=5,4 et 11,2
Hz, 1 H) ; 5,80 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 11,2 et 15,2 Hz, 1
H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz,
1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,3 Hz, 1 H) ; 7,21 à 7,27 (m, 3 H) ; 7,28 à 7,32
(m, 3 H) ; 8,38 (d large,
20
J=7,8 Hz, 1 H) ; 11,22 (m très étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 960 [M + ;
m/z = 480,5 [M +
21-1]2+ pic de base ; m/z = 958 [M ; t = 0,90 min.
Exemple 15: Acide (2-{242-(2-{4-[(2R,3R)-34(S)-1-{Ã-(35,10R,16S)-1043-chloro-4-
méthoxy-
benzy1]-3-isobuty1-6,6-d méthy1-2,5,9,12-tetraoxo-1 ,4-d ioxa-8,11-d iaza-
cyclohexad ec-13-èn-16-
25 yll-éthyl)-oxiranylFbenzylaminol-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-propanoate
de 2,5-dioxo-
pyrrolidin-1-yle
H000) 00 = 0,_
0?,
0 e0 ? 0 Ex15
L'exemple 15 peut être préparé en activant l'acide 49 selon la méthode décrite
pour l'exemple 18.
30 Exemple 16: (2-{242-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(38,10R,168)-10-{3-chloro-
4-méthoxy-benzy1}-
3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-
èn-16-y1)-
éthyll-oxirany1}-benzyl-piperazin-1-y1)-éthoxyl-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de
2,5-dioxo-
pyrrolidin-1-yle
0
Ali = 0
0 00 HN a
0 :(3)t7,,Floo
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Composé 50 : Acide 3-{242-(2-hydroxy-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-propandique
H _________________________________________
A une solution de 300 mg (1,08 mmol) de 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de
tert-butyle
dans 6 ml de DCM sont ajoutés 1,6 ml (21,56 mmol) de TFA. L'agitation est
poursuivie à TA
5 pendant 3h. Le mélange est concentré à sec, repris dans le minimum de DCM
et plusieurs
entraînements au toluène sont effectués pour donner le composé 50 sous la
forme d'une huile
jaune pâle (240 mg, quantitatif).
Composé 51: 3-{242-(2-Hydroxy-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-propanoate d'allyle
10 50 51
A une solution de 240 mg (1,08 mmol) du composé 50 dans 3 ml de DCM sont
successivement
ajoutés 248 mg (1,29 mmol) d'EDCI, 13,2 mg (1,29 mmol) de DMAP et 88 pl (1,29
mmol) d'alcool
allylique. L'agitation est poursuivie à TA pendant 15 h puis le mélange est
concentré à sec sous
PR et le brut purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme
éluant un mélange
15 DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 51 est obtenu sous la forme d'une
huile incolore (144
mg, 51%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 2,57 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 3,41 (m, 2 H) ;
3,46 à 3,52 (m,
10 H) ; 3,65 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,52 (t, J=5,5 Hz, 1 H) ; 4,56 (m, 2 H) ;
5,20 (dm, J=10,5 Hz, 1 H)
; 5,50 (dm, J=17,4 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H).
20 Composé 52: 4-(2-{242-(2-Allyloxycarbonyl-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthyl)-
piperazine-1-
carboxylate de tert-butyle
51 52
A une solution, refroidie à 0 C, de 94 mg (357 pmol) du composé 51 dans 3,7 ml
de DCM sont
successivement ajoutés 125 pl (893 pmol) de TEA et 30,4 pl (393 pmol) de
chlorure de mésyle,
25 l'agitation est poursuivie à TA pendant 1 h. Le mélange est concentré à
sec sous PR puis repris
dans 5 ml d'acétonitrile. 249 pl (1,785 mmol) de TEA et 200 mg (1,071 mmol) de
Boc-pipérazine
sont ajoutés à la solution et le mélange est agité et chauffé 15 h à 40 C.
Après retour à TA, le
mélange est concentré à sec et purifié par chromatographie sur gel de silice
en utilisant comme
éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 52 est obtenu sous la
forme d'une
30 huile incolore (69 mg, 45%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,39 (s, 9 H) ;
2,33 (m, 4 H) ; 2,46 (t,
J=5,9 Hz, 2 H) ; 2,57 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 3,28 (m partiellement masqué, 4 H)
; 3,45 à 3,53 (m, 10
H) ; 3,64 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,55 (m, 2 H) ; 5,20 (dm, J=10,5 Hz, 1 H) ;
5,30 (dm, J=17,2 Hz, 1 H)
; 5,90 (m, 1 H).
35 Composé 53 : 3-{242-(2-Piperazin-1-yl-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-propanoate
d'allyle
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0
52
Icço 53 I,õNH
A une solution de 110 mg (256 pmol) du composé 52 dans 10 ml de DCM sont
ajoutés 380 pl
(5,11 mmol) de TFA. L'agitation est poursuivie 24 h à TA. Le mélange est
concentré à sec, repris
dans le minimum de DCM et plusieurs entraînements au toluène sont effectués.
Le brut est
purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et
lavée avec du méthanol
puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé
53 est obtenu
sous la forme d'une huile incolore (47 mg, 55%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6):
2,58 (t, J=6,2
Hz, 2 H) ; 3,10 à 3,36 (m large, 6 H) ; 3,45 à 3,78 (m partiellement masqué,
16 H) ; 4,56 (m, 2 H)
; 5,20 (dm, J=10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (dm, J=17,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H) ; 9,00
(m étalé, 1 H).
Composé 54: (2-{242-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-14(E)-(3S,10R,16S)-10-{3-Chloro-4-
méthoxy-benzy1}-3-
isobuty1-6,6-diméthy1-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-
èn-16-y1)-éthyl]-
oxiranyll-benzyl-piperazin-1-y1)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-propanoate d'allyle
= 00
CI 0 el c.
à 0 HN,
allie H CI l CI
riiN
0 0
H I
Le composé 54 peut être obtenu par substitution nucléophile du groupement
chloro du dérivé 2
par l'amine 53 en appliquant la méthode décrite pour la préparation du composé
30.
Composé 55: Acide (24242444(2 R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-chloro-4-
méthoxy-
benzy1}-3-isobutyl-6,6-d méthy1-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-d ioxa-8,11-d iaza-
cyclohexad ec-13-èn-16-
y1)-éthylFoxiranyll-benzyl-piperazin-1-y1)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-propandique
O dei
QuiO O HN ,7 Cl H el 0 0
HN Cl
`CCI
el 0
H
Le composé 55 peut être obtenu selon la méthode décrite pour le composé 41.
Exemple 16: (2-{242-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-14(E)-(3S,10 R,16S)-10-{3-Chloro-4-
méthoxy-benzy1}-3-
isobuty1-6,6-diméthy1-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-
èn-16-y1)-éthyl]-
oxiranyll-benzyl-piperazin-1-y1)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-propanoate de 2,5-
dioxo-pyrrolidin-1-yle
0
=
O
0 0 HNO
ci t_trOr,0,,,o0.....0 0 0
HN Cl
0
Ex16
L'exemple 16 peut être obtenu selon la méthode décrite pour l'exemple 18.
Exemple 17 : 3-(2-{2-[2-(2-{2-[4-(4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(10R,168)-10-(3-
Chloro-4-
méthoxy-benzyI)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-
cyclohexa-
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dec-13-èn-16-y1}-éthyl)-oxiranyll-benzyl}-pipérazin-1-y1)-1,1-dirnéthyl-4-oxo-
butylsulfanyll-
acétylamino}-éthoxy)-éthoxyl-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-
pyrrolidin-1-yle
o
0 H
NIL.,N 0y0 HNI i& CI
o
Composé 56: 3-(2-{242-(2-{2-Bromo-acétylamino}-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-
propanoate
de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
O 0
HO
0
0
56
A une solution d'acide 3-(2-{242-(2-amino-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-
propionique (671 mg,
2,53 mmol) dans le DCM (10 ml) est ajoutée une solution du bromoacétate de 2,5-
dioxo-
pyrrolidin-1-yle (2,53 mmol) dans 4,7 ml de DCM. L'agitation est poursuivie 15
min à TA puis le
DCC est ajouté au mélange. Après 4 h de réaction, le mélange est filtré sur
verre fritté puis le
filtrat est évaporé et purifié par chromatographie sur gel de silice, en
éluant avec un mélange
DCM/méthanol 99/1 à 94/6. L'huile obtenue (800 mg) est à nouveau purifiée par
chromatographie sur gel de silice greffée cyano, en éluant avec un mélange
DCM/méthanol 99/1.
On obtient le composé 56 sous la forme d'une huile incolore (611 mg, 50%). RMN
1H (500 MHz,
DMSO-d6): 2,81 (s, 4 H) ; 2,92 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,23 (q, J=5,9 Hz, 2 H) ;
3,43 (t, J=5,9 Hz, 2 H)
; 3,48 à 3,55 (m, 12 H) ; 3,72 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,85 (s, 2 H) ; 8,30 (t
large, J=5,9 Hz, 1 H).
LCMS (A2) : ES m/z = 483 [M + ; m/z = 481 [M - ; tR = 0,51 min.
Composé 7: (E)-(35,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-6,6-
diméthyl-16-[(S)-1-
((2R,3R)-3-{444-(4-méthy1-4-méthyldisulfanyl-pentanoy1)-pipérazin-1-ylméthyl]-
phényll-oxirany1)-
éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tétraone
S 0
à
0 - 0
CI el 0 0 HN..,1 CI el 0 0 HN Ci
0 I
"1111-- 0
H 7 O'Lly-)1 0
4111er ?
A une solution purgée à l'argon du composé 2 (19,8 mg, 27,6 pmol) dans
l'acétonitrile anhydre
(2,5 ml) sont successivement ajoutés la TEA (138 pmol) et le chlorhydrate de
la 4-méthy1-4-
méthyldisulfany1-1-pipérazin-1-yl-pentan-1-one 6 (83 pmol). L'agitation est
poursuivie à 40 C
pendant 24 h puis le mélange est dilué dans de l'AcOEt (10 ml). La phase
organique est lavée
par de l'eau (2x10 ml), par une solution aq. saturée de NaHCO3 (10 ml) et par
une solution aq.
saturée de NaC1 (10 ml). Après séchage sur Mg504 et filtration, les solvants
sont évaporés sous
PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice,
en éluant avec un
mélange DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Une poudre blanche, 7, est obtenue (19,4
mg; 75%).
CCM (DCM 90 / Me0H 10) : Rf = 0,6; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 0,75 - 0,81 (m,
6 H) ; 1,01
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(s, 3 H) ; 1,05 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1,12 (s, 3 H) ; 1,26 (s, 6 H) ; 1,28 -
1,33 (m, 1 H) ; 1,52 - 1,61
(m, 2 H) ; 1,76- 1,83(m, 2 H) ; 2,27 - 2,38 (m, 4 H) ; 2,39(s, 3 H) ; 2,64 -
2,74 (m, 2 H) ; 2,95 -
3,05 (m, 2 H) ; 3,24 - 3,34 (m, 6 H) ; 3,44 (br. s., 4 H) ; 3,49 (s, 2 H) ;
3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d,
J=1,7 Hz, 1 H) ; 4,22 - 4,29 (m, 1 H) ; 4,92 (dd, J=9,9, 3,5 Hz, 1 H) ; 5,08 -
5,15 (m, 1 H) ; 5,81
(d, J=14,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=15,2, 11,3, 3,5 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6
Hz, 1 H) ; 7,17 (dd,
J=8,4, 2,3 Hz, 1 H) ; 7,22 (d, J=9,3 Hz, 1 H) ; 7,25 - 7,34 (m, 5 H) ; 8,34
(d, J=8,1 Hz, 1 H).
LCMS (AI): ES m/z = 943 [M + ; m/z = 941 [M - ; tR = 4,03 min.
Nota : le composé 7 peut être préparé également à partir de G=0Ms (voir
exemple 1)
Composé Exl : (E)-(35,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-6,6-
diméthyl-16-
[(S)-1 -((2 R,3R)-3-{444-(4-m ercapto-4-méthyl-penta noyI)-pi pérazi n-1 -ylm
éthyn-phényll-oxi ranyI)-
éthyI]-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tétraone
0 0
ïIui
à .---- 0 HS =
.---- 0
III
=
ir 0 0 0 HN, CI N[ N 0 0 0 HN.õ1
7 21'0
Exl
Le composé 7 (17,9 mg ; 18,97 pmol) est placé en solution dans un mélange
éthanol (2,2 ml) /
eau (1,8 ml) et le mélange se trouble. Le TCEP (47,4 pmol) est ensuite
additionné et le mélange
est agité 3 h à TA, puis dilué par ajout d'AcOEt (20 ml) et la phase organique
est lavée par un
mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4CI (20 ml) puis par 20
ml d'une solution
saturée en NaCI. Après séchage de la phase organique sur Mg504, filtration et
évaporation des
solvants sous PR, le produit Exl est obtenu sous forme d'un solide blanc (15,6
mg ; 92%). CCM
(DCM 90 / Me0H 10) : Rf = 0,56; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,76 - 0,81 (m, 6
H) ; 1,01 (s, 3
H) ; 1,06 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1,13 (s, 3 H) ; 1,24 (s, 6 H) ; 1,27 - 1,31 (m,
1 H) ; 1,56 - 1,64 (m, 2
H) ; 1,73- 1,85 (m, 3 H) ; 2,26 - 2,33 (m, 3 H) ; 2,36 - 2,45 (m, 4 H) ; 2,63 -
2,75 (m, 2 H) ; 2,95
- 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 - 3,36 (m, 1 H) ; 3,42 - 3,51 (m, 6 H) ; 3,82 (s, 3 H)
; 3,89 (s, 1 H) ; 4,22 -
4,29 (m, 1 H) ; 4,92 (dd, J=9,8, 3,4 Hz, 1 H) ; 5,12 (dd, J=10,8, 4,9 Hz, 1 H)
; 5,81 (d, J=15,2 Hz,
1 H) ; 6,48 (ddd, J=15,0, 11,4, 3,4 Hz, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,18
(dd, J=8,3, 1,5 Hz, 1
H) ; 7,24 (d, J=9,8 Hz, 1 H) ; 7,26 - 7,36 (m, 5 H) ; 8,37 (d, J=7,8 Hz, 1 H).
LCMS (A2) : ES m/z =
897 [M + ; m/z = 895 [M - ; tR = 0,97 min.
Exemple 17: 3-(2-{242-(2-{244-(4-{4-[(2R,3R)-34(S)-1-{(E)-(10R,16S)-10-(3-
Chloro-4-méthoxy-
benzy1)-3-isobuty1-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-
cyclohexadec-13-èn-16-
yll-éthyl)-oxiranylFbenzyll-pipérazin-1-y1)-1,1-diméthyl-4-oxo-
butylsulfanylFacétylaminol-éthoxy)-
éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
0
=
el" 0 0
00 HrAiN.0 101 0
a t,õ1.1 HN
E1 Ex17 rio
x
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100
A une solution, purgée à l'argon, du composé Exl (15,6 mg, 17,8 pmol) dans
l'acétonitrile
anhydre (1,0 ml) sont successivement ajoutés la DIPEA (19,12 pmol) et le
composé 56
(19,12 pmol). L'agitation est poursuivie à TA pendant 4 h puis 29,5 pmol
supplémentaires de
DIPEA sont ajoutés et l'agitation poursuivie pendant 16 h. Le lendemain, sont
ajoutés 29,5 pmol
supplémentaires de composé 56 et de DIPEA et le mélange est chauffé à 50 C.
Après 24 h
supplémentaires de réaction, 22,6 pmol de composé 56 et 29,5 pmol de DIPEA
sont ajoutés et le
mélange chauffé à 60 C pendant 24 h supplémentaires. Le chauffage est alors
arrêté et
l'agitation poursuivie à TA pendant 64 h. Le mélange est dilué dans 10 ml
d'AcOEt et la phase
organique est lavée par 2x10 ml d'eau puis par 10 ml d'une solution saturée en
NaCI. Après
séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des
solvants sous PR, le brut
est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange
DCM/méthanol 99/1
à 90/10. Le produit Ex17 est obtenu sous forme d'un solide incolore (9,2 mg;
41%). RMN 1H
(500 MHz, DMSO-d6): 0,77 à 0,82 (m, 6 H) ; 1,02 (s, 3 H) ; 1,06 (d, J=6,9 Hz,
3 H) ; 1,13 (s, 3 H) ;
1,23 (s, 6 H) ; 1,26 à 1,35(m, 1 H) ; 1,52 à 1,64(m, 2 H) ; 1,68 à 1,77 (m, 2
H) ; 1,78à 1,86 (m, 1
H) ; 2,26 à 2,33 (m, 3 H) ; 2,35 à 2,41 (m, 4 H) ; 2,68 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,82
(s, 4 H) ; 2,93 (t,
J=6.0 Hz, 2 H) ; 2,96 à 3,07 (m, 4 H) ; 3,13 (s, 2 H) ; 3,20 (q, J=5,8 Hz, 2
H) ; 3,33 (m, 1 H) ; 3,38
à 3,57 (m, 18 H) ; 3,73 (t, J=5,8 Hz, 2 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,89 (s, 2 H) ;
4,27 (m, 1 H) ; 4,93 (dd,
J=3,8 et 10,0 Hz, 1 H) ; 5,13 (m, 1 H) ; 5,82 (d, J=15,4 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd,
J=3,8 et 11,1 et 15,4
Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,15 à 7,37 (m, 7 H) ; 8,01 (t, J=5,8 Hz,
1 H) ; 8,35 (d, J=8,0
Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1299 [M + ; m/z = 650 [M + 21-1]2+ ; m/z =
1297 [M - ; tR =
0,92 min.
Exemple 18: 3-(2-{242-(2-{4-[(28,38)-3-((S)-1-{(E)-(38,10R,168)-1043-Chloro-4-
méthoxy-
benzy11-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-
cyclohexa-dec-13-èn-
16-y1}-éthyl)-oxi ranyll-benzyloxycarbonylam I no}-éthoxy)-éthoxyl-éthoxy}-
éthoxy)-
propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle
ONO - 0
H I
0 0 HNCI
'1
0 Er1-0
Composé 58 : Carbonate de 44(2S,3S)-3-{(S)-1-[(E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-
méthoxy-
benzy1)-3-isobuty1-6,6-d méthy1-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-d ioxa-8,11-d iaza-
cyclohexad ec-13-èn-16-
yn-éthyll-oxirany1)-benzyle et de 4-nitrophényle
Q
-- 0
HO go 0 HN ci 0_0 upo 0 0 HN
Cl
E
0 [Ji 0 c m le
0 1 [Ji 0
Le dérivé 57 (20 mg ; 28,6 pmol, préparé selon Al-awar R.S., et al.,
J.Med.Chem. 2003, 46,
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2985-3007) est placé en solution dans le DCM anhydre (0,3 ml), la solution est
purgée à l'argon
avant que soient ajoutés la TEA (40 pmol) puis le chloroformate de 4-
nitrophényle (32,32 pmol).
Après 3h30 d'agitation à TA, le mélange est hydrolysé et dilué dans 7 ml
d'AcOEt. La phase
organique est lavée à l'eau puis avec une solution saturée de NaCI, séchée sur
MgSO4, filtrée et
évaporée à sec pour donner le composé 58 sous la forme d'un solide blanc (23
mg, 93%). LCMS
(A3) : ES m/z = 864 [M + ; m/z = 908 [M + HCO2H - ; tR = 1,43 min.
Composé 59 : Acide 3-(2-{242-(2-{4-[(25,35)-34(S)-1-{(E)-(35,10R,16S)-1043-
chloro-4-méthoxy-
benzy1]-3-isobuty1-6,6-d iméthy1-2,5,9,12-tetraoxo-1 ,4-d ioxa-8,11-d iaza-
cyclohexa-dec-13-èn-16-
yll-éthyl)-oxi ranyn-benzyloxycarbonyla mi no}-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-
propandiq ue
0,N.0
9 0 _
9,Toro 0 0 HN,1 " a go 0 0 0 HN,i ==
Cl
nele 0 "1111.-
H
A une solution, purgée à l'argon, du composé 58 (23 mg, 26,6 pmol) dans
l'acétonitrile anhydre
(1,6 ml) sont successivement ajoutés l'acide 3-(2-{242-(2-amino-éthoxy)-
éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-
propionique (39,9 pmol) et la TEA (53,2 pmol). Après 24 h d'agitation à TA, le
mélange est dilué
dans 10 ml d'AcOEt. La phase organique est lavée avec 10 ml d'eau contenant
250 pl d'HCI 0,1N
(pH,4). La phase aq. est extraite avec 10 ml d'AcOEt (2x) ; les phases
organiques sont
rassemblées, lavées avec 10 ml d'eau puis 10 ml d'une solution saturée de
NaCI, séchées sur
Mg504, filtrées et évaporées à sec pour donner le composé 59 sous la forme
d'un solide jaune
très pâle (18,5 mg, 70%). LCMS (A3) : ES m/z = 990 [M + ; m/z = 988
[M - ; tR = 1,32 min.
Exemple 18:
3-(2-{242-(2-{4-[(25,35)-34(S)-1-{(E)-(35,10R,16S)-1043-Chloro-4-méthoxy-
benzy1]-3-isobuty1-6,6-diméthy1-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-
cyclohexa-dec-13-èn-16-
yll-éthyl)-oxiranylFbenzyloxycarbonylaminol-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-
propanoate de 2,5-
dioxo-pyrrolidin-1-yle
9 0
=
r, o
1,10.11.:00 H
Cl
H
A une solution, purgée à l'argon, du composé 59(18,5 mg, 18,6 pmol) dans le
THF (1,5 ml) sont
successivement ajoutés la DIPEA (55,8 pmol) et le carbonate de N,N'-
disuccinimidyle (37,2
pmol). Après 19 h d'agitation à TA, le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt,
lavé avec 10 ml
d'eau (2 fois) puis 10 ml d'une solution saturée de NaCI, séché sur Mg504 et
évaporé à sec. Le
brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un
mélange heptane/AcOEt
100/0 à 0/100 contenant 10% d'isopropanol. Le produit Ex17 est obtenu sous
forme d'un solide
blanc (6,08 mg ; 30%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,83 à 0,88 (m, 6 H) ; 0,97
(d, J=7,1 Hz, 3
H) ; 1,02 (s, 3 H) ; 1,15 (s, 3 H) ; 1,47 à 1,56 (m, 1 H) ; 1,58à 1,68 (m, 2
H) ; 1,82 à 1,90 (m, 1 H)
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102
; 2,39 à 2,47 (m, 1 H) ; 2,60 à 2,66 (m, 1 H) ; 2,71 (dd, J=11,5 et 14,4 Hz, 1
H) ; 2,80 (s, 4 H) ;
2,91 (t, J=6,0 Hz, 2 H) ; 2,94 à 3,07 (m, 3 H) ; 3,14 (q, J=6,0 Hz, 2 H) ;
3,37 à 3,56 (m
partiellement masqué, 15 H) ; 3,71 (t, J=6,0 Hz, 2 H) ; 3,79 (m, 1 H) ; 3,81
(s, 3 H) ; 4,27 (ddd,
J=3,8 et 8,0 et 11,3 Hz, 1 H) ; 4,96 à 5,05(m, 3 H) ; 5,11 (m, 1 H) ; 5,88(d,
J=15,4 Hz, 1 H) ; 6,48
(ddd, J=3,8 et 11,3 et 15,4 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,14 à 7,39
(m, 8 H) ; 8,40 (d,
J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES rniz = 1087 [M + ; rniz = 1085 [M -
; tR = 1,09 min.
Exemple 19: (1-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(36,10R,166)-1043-Chloro-4-méthoxy-
benzy11-3-
isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tétraoxo-1,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-
en-16-yI}-
éthyl)-oxiranyll-benzy1}-1H-1,2,3-triazol-4-y1)-butanoate de 2,5-dioxo-
pyrrolidin-1-yle
o
0 YNN0
0 OO HN
0 di cl
o
Composé 60 : (E)-(35,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-Azidométhyl-phény1)-
oxiranylFéthyll-10-
(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-
cyclohexadec-13-ène-
2,5,9,12-tetraone
= =
0 0
,0 0 HN CI N37 00 0 HN,
CI
1V-
1
H 0
0 N 0 0
A une solution, purgée à l'argon, de 60 mg (85,8 pmol) de composé 1 dans 9 ml
de THF anhydre
sont ajoutés 25,9 pl (120 pmol) de diphénylphosphorazide. Le mélange est agité
à TA pendant
10 min puis refroidi à 0 C avant que soient ajoutés 18,0 pl (120 pmol) de DBU.
L'agitation est
poursuivie à TA pendant 15 h. La réaction n'est pas complète : sont ajoutés
25,9 pl (120 pmol) de
diphénylphosphorazide et 18,0 pl (120 pmol) de DBU puis l'agitation est
poursuivie pendant 24 h.
Il reste encore du composé 1 de départ : sont ajoutés 25,9 pl (120 pmol) de
diphénylphosphorazide et 18,0 pl (120 pmol) de DBU puis l'agitation est
poursuivie pendant 24 h.
Le milieu réactionnel est hydrolysé par addition de 6 ml d'eau puis extrait
avec du DCM (3x6 ml).
Les phase organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de
NaCI (8 ml) et
séchées sur Mg504. Après filtration et concentration sous PR, le brut est
purifié par
chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange
DCM/méthanol 100/0 à
90/10. Le composé 60 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (46 mg, 74%).
RMN 1H (500
MHz, DMSO-d6): 0,76 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ;1,00 (s, 3
H) ; 1,05 (d, J=6,9
Hz, 3 H) ; 1,12 (s, 3 H) ; 1,30 (m, 1 H) ; 1,49 à 1,63 (m, 2 H) ; 1,82 (m, 1
H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,63
à 2,74 (m, 2 H) ; 2,95 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,38 (m partiellement masqué,
1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ;
3,92 (d, J=1,9 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11,5 Hz, 1 H) ; 4,46 (s,
2 H) ; 4,92 (dd, J=3,6
et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1,5 et 5,7 et 11,3 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1,5
et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,48
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(ddd, J=3,8 et 11,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd,
J=2,2 et 8,6 Hz, 1 H) ;
7,22 (dd, J=2,6 et 9,5 Hz, 1 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,34 (d, J=8,3 Hz,
2 H) ; 7,38 (d, J=8,3
Hz, 2 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 724 [M +
; m/z = 722 [M - ; m/z
= 768 [M - H + 1-1CO21-1]- pic de base ; tR = 1,18 min.
Composé 61: Acide (1-{4-[(2R,3R)-34(S)-1-{(E)-(35,10R,16S)-1043-chloro-4-
méthoxy-benzy1]-3-
isobuty1-6,6-diméthy1-2,5,9,12-tétraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-
en-16-yll-éthyl)-
oxiranylFbenzyll-1H-1,2,3-triazol-4-y1)-butandique
o
0 Ho 0
N, =0 0 HN Cl N 0 0 HN
60 0 N 0 0
61 0
=0
H
10 A une suspension de 22 mg (30,4 pmol) du composé 60 dans 500 pl d'eau
est ajoutée une
solution de 6,8 mg (60,8 pmol) d'acide 5-hexynoïque dans 500 pl de THF. Sont
ensuite ajoutés
122 pl (12,2 pmol) d'une solution aq. 0,1M de sulfate de cuivre et 122 pl
(24,3 pmol) d'une
solution aq. 0,2M d'ascorbate de sodium. L'agitation est poursuivie pendant 2
h à TA. Le
mélange est hydrolysé par addition de 2 ml d'eau puis extrait avec de l'AcOEt
(3 X 2 ml). Les
phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaC1
(3 ml) et
séchées sur Mg504. Après filtration et concentration sous PR, le brut est
purifié par
chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange
DCM/méthanol 98/2 à
90/10. Le composé 61 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (19,4 mg,
76%). RMN 1H (500
MHz, DMSO-d6): 0,73 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,75 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ;1,00 (s, 3
H) ; 1,04 (d, J=6,9
Hz, 3 H) ; 1,11 (s, 3 H) ; 1,29 (m, 1 H) ; 1,50 à 1,59 (m, 2 H) ; 1,76 à 1,85
(m, 3 H) ; 2,20 à 2,30
(m, 3 H) ; 2,62 (t, J=7,7 Hz, 2 H) ; 2,65 à 2,72 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,04 (m, 3
H) ; 3,28 à 3,38 (m
partiellement masqué, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,89 (d, J=1,6 Hz, 1 H) ; 4,25
(ddd, J=3,6 et 8,0 et
11,5 Hz, 1 H) ; 4,90 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,10 (ddd, J=1,6 et 5,2 et
11,2 Hz, 1 H) ; 5,53 (s,
2 H) ; 5,78 (dd, J=1,6 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,46 (ddd, J=3,7 et 11,2 et 15,0 Hz,
1 H) ; 7,05 (d, J=8,5
Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=1,9 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,3 et 9,5 Hz, 1 H) ;
7,28 (d, J=1,9 Hz, 1
H) ; 7,31 (s, 4 H) ; 7,92 (s, 1 H) ; 8,37 (d large, J=8,0 Hz, 1 H) ; 12,03 (m
très étalé, 1 H). LCMS
(A2) : ES m/z = 836 [M +
; m/z = 418,5 [M + 21-1]2+ pic de base ; m/z = 834 [M - H] ; tR =
1,04 min.
Composé 62: (1-
{4-[(2 R,3R)-34(S)-1-{(E)-(35,10 R,16S)-1043-Chloro-4-méthoxy-benzy1]-3-
isobuty1-6,6-d iméthy1-2,5,9,12-tétraoxo-1,4-d ioxa-8, 11-d iaza-cyclohexadec-
13-en-16-yll-éthy1)-
oxiranyn-benzy11-1H-1,2,3-triazol-4-y1)-butanoate de méthyle
0 0
HO
N=N 4 0
4
\ I 0 0 HN,1 CI\ .--) 0 0 HN CI
H H
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A une solution de 5 mg (6 pmol) du composé 61 dans 500 pl de DCM et 200 pl de
méthanol sont
ajoutés 4,5 pl (9,0 pmol) d'une solution de triméthylsilyldiazométhane 2M dans
l'hexane.
L'agitation est poursuivie 30 min. Le mélange est concentré sous PR et purifié
par filtration sur
gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2. Le composé 62 est
obtenu sous la
forme d'un solide blanc (5 mg, 98%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,72 (d, J=6,4
Hz, 3 H) ;
0,75 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,99 (s, 3 H) ; 1,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1,11 (s, 3
H) ; 1,28 (m, 1 H) ; 1,50
à 1,59 (m, 2 H) ; 1,79 (m, 1 H) ; 1,83 (m, 2 H) ; 2,25 (m, 1 H) ; 2,35 (t,
J=7,6 Hz, 2 H) ; 2,62 (t,
J=7,6 Hz, 2 H) ; 2,65 à 2,72 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,38 (m
partiellement
masqué, 1 H) ; 3,57 (s, 3 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,89 (d, J=1,5 Hz, 1 H) ; 4,25
(ddd, J=3,7 et 8,3 et
11,4 Hz, 1 H) ; 4,89 (dd, J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,09 (ddd, J=1,5 et 5,4 et
11,4 Hz, 1 H) ; 5,53 (s,
2 H); 5,78 (dd, J=1,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,46 (ddd, J=3,4 et 11,4 et 15,2 Hz,
1 H) ; 7,05 (d, J=8,8
Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,8 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,5 et 9,8 Hz, 1 H) ;
7,28 (d, J=2,0 Hz, 1 H)
; 7,31 (s, 4 H) ; 7,92 (s, 1 H) ; 8,34 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z
= 850 [M + ; m/z =
425,5 [M + 21-1]2+ pic de base ; m/z = 848 [M -
; m/z = 894 [M - H + 1-1CO21-1]- pic de base ; tR =
1,11 min.
Exemple 19:
(1-{4-[(2R,3R)-34(S)-1-{(E)-(35,10 R,16S)-1043-Chloro-4-méthoxy-benzy1]-3-
isobuty1-6,6-d méthy1-2,5,9,12-tétraoxo-1 ,4-d ioxa-8, 11-d iaza-cyclohexadec-
13-en-16-yll-éthyI)-
oxiranyn-benzy11-1H-1,2,3-triazol-4-y1)-butanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-
yle
0 0
HO 0 0 sO 0
0
gr O0 HN,1 ah= 0 HN.1 dit
Cl
0
61 0 Ex19 0
H I H
A une solution, purgée à l'argon, de 13,4 mg (16 pmol) du composé 61 dans 1,2
ml de THF sont
successivement ajoutés 8,4 pl (48,1 pmol) de DIPEA et 8,21 mg (32,04 pmol) de
carbonate de
N,N'-disuccinimidyle. L'agitation est poursuivie à TA pendant 26 h. Le mélange
est hydrolysé par
addition de 2 ml d'eau puis extrait avec 2x2 ml d'AcOEt. Les phases organiques
sont
rassemblées et séchées sur Mg504. Après filtration et concentration sous PR,
le brut est purifié
par filtration sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2.
Le produit obtenu
contient 0,15 mol de NHS. Il est repris dans 2 ml de DCM et lavé avec de l'eau
(2x3 ml) puis
séché sur Mg504. Après filtration et concentration à sec, on obtient le
composé Ex19 sous la
forme d'un solide blanc (12,56 mg, 84%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,73 (d,
J=6,3 Hz, 3 H) ;
0,75 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1,00 (s, 3 H) ; 1,04 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1,11 (s, 3
H) ; 1,30 (m, 1 H) ; 1,49
à 1,60 (m, 2 H) ; 1,79 (m, 1 H) ; 1,95 (quin, J=7,5 Hz, 2 H) ; 2,26 (m, 1 H) ;
2,65 à 2,77 (m, 6 H) ;
2,81 (s large, 4 H) ; 2,92 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1
H) ; 3,81 (s, 3 H) ;
3,89 (d, J=1,9 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,1 et 11,5 Hz, 1 H) ; 4,90 (dd,
J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ;
5,09 (ddd, J=1,4 et 5,5 et 11,3 Hz, 1 H) ; 5,54 (s, 2 H) ; 5,79 (dd, J=1,4 et
15,1 Hz, 1 H) ; 6,46
(ddd, J=3,8 et 11,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd,
J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ;
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7,21 (dd, J=2,5 et 9,6 Hz, 1 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,31 (s, 4 H) ;
7,95 (s, 1 H) ; 8,33 (d,
J=8,1 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 933 [M +
; m/z = 467 [M + 21-1]2+ pic de base ; m/z =
977 [M - H +1-1CO21-1]- pic de base ; tR = 1,08 min.
Exemple 20: 3424242424141 -(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(10R,16S)-10-(3-Chloro-4-
méthoxy-
benzyI)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11 -diaza-
cyclohexadec-13-èn-
16-y1)-éthyll-oxirany1}-benzy1)-1 ,2,3-triazol-1 -yll-méthoxy}-éthoxy)-éthoxyl-
éthoxy}-éthoxy)-
propanoate de 2,5-dioxa-pyrrolidin-1-yle
0
=
N,N õ
HNr 01
?
Composé 63 : 2-{242-(2-Prop-2-ynyloxy-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthanol
HO
63
A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0 C, de 1 g (5,15 mmol) de
tetraethylèneglycol
dans 25 ml de THF anhydre sont ajoutés 144 mg (3,60 mmol) de NaH à 60% en
dispersion dans
une huile minérale. L'agitation est poursuivie 30 min à 0 C puis 194 pl (2,58
mmol) de bromure
de propargyle sont ajoutés. L'agitation est poursuivie à TA pendant 15 h. Le
mélange est
concentré sous PR puis le brut purifié par chromatographie sur gel de silice
en utilisant comme
éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 63 est obtenu sous la
forme d'une
huile incolore (789 mg, 65%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 3,40 (1, J=2,4 Hz, 1
H) ; 3,42 (t,
J=5,5 Hz, 2 H) ; 3,48 (q, J=5,5 Hz, 2 H) ; 3,51 à 3,58 (m, 12 H) ; 4,14 (d,
J=2,4 Hz, 2 H) ; 4,53 (t,
J=5,5 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 233 [M + ; tR= 0,38 min.
Composé 64: 3-(2-{242-(2-Prop-2-ynyloxy-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-
propanoate de tert-
butyle
0
63 64
A une solution, purgée à l'argon, de 790 mg (3,40 mmol) du composé 63 dans 8,8
ml de THF
anhydre sont ajoutés 4,4 mg (190 pmol) de sodium. Le mélange est chauffé à 40
C pendant 2 h
pour le solubiliser entièrement ; après retour à TA, 740 pl (5,09 mmol)
d'acrylate de tert-butyle
sont ajoutés au mélange. L'agitation est poursuivie pendant 15 h à TA puis le
mélange est
concentré sous PR et le brut purifié par chromatographie sur gel de silice en
utilisant comme
éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 64 est obtenu sous la
forme d'une
huile incolore (944 mg, 77%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1,44 (s, 9 H) ; 2,41
(1, J=6,2 Hz, 2
H) ; 3,38 (1, J=2,4 Hz, 1 H) ; 3,46 à 3,62 (m, 16 H) ; 3,59 (1, J=6,2 Hz, 2 H)
; 4,14 (d, J=2,4 Hz, 2
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H). LCMS (AI): ES m/z = 361 [M + ; m/z = 383 [M + Na] ; tR = 3,79 min.
Composé 65 : Acide 3-(2-{242-(2-prop-2-ynyloxy-éthoxy)-éthoxyFéthoxyl-éthoxy)-
propandique
64 65
A une solution de 944 mg (2,62 mmol) de composé 64 sont ajoutés 2 ml (52,4
mmol) de TFA. Le
mélange est agité 6 h à TA puis concentré à sec, repris dans le minimum de DCM
et plusieurs
entraînements au toluène sont effectués. Le composé 65 est obtenu sous la
forme d'une huile
incolore (722 mg, 91%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 2,44 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ;
3,39 (t, J=2,4 Hz,
1 H) ; 3,46 à 3,56 (m, 16 H) ; 3,60 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 4,14 (d, J=2,4 Hz, 2
H) ; 7,44 à 9,73 (m très
étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 305 [M + ; m/z = 303 [M tR = 0,48 min.
Exemple 20 : 3-(2-{242-(2-{141-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-14(E)-(10R,16S)-10-(3-Chloro-
4-méthoxy-
benzy1)-3-isobuty1-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-
cyclohexad ec-13-èn-16-
y1)-éthylFoxiranyll-benzy1)-1,2,3-triazol-1-y1Fméthoxyl-éthoxy)-éthoxeéthoxyl-
éthoxy)-
propanoate de 2,5-dioxa-pyrrolidin-1-yle
0
0 \---\
0 0
N3 IS 0 0 0 Cl
60 'Ir"- 0 o o
HN,1 ,r¨ya
Ex20
L'exemple 20 peut être obtenu à partir des composés 60 et 65 selon la méthode
décrite pour le
composé 61 puis en activant l'acide selon la méthode décrite pour l'exemple
19.
Exemple 21: (4-{1-[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(36,10R,166)-10-{3-Chloro-4-
méthoxy-benzy1}-3-
isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tétraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-
en-16-y1)-
éthyll-oxirany1}-benzy1)-méthylaminol-méthy1}-1,2,3-triazol-1-y1)-butanoate de
2,5-dioxo-
pyrrolidin-1-yle
0
N =
0
HNõ1 Cl
IW
Composé 66: (E)-(35,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-6,6-
diméthyl-16-[(S)-
14(2R,3R)-3-{4-[(méthyl-prop-2-ynyl-amino)-méthyl]-phényll-oxirany1)-éthyl]-1
,4-dioxa-8,11-
diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tetraone
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=
=
o o
OO I
HN .CI OO HW. di CI
u I
a X-0'17-11 0 ? 66 gel ?
A une solution, purgée à l'argon, de 40 mg (55,7 pmol) du composé 2 dans 5 ml
d'acétonitrile
anhydre sont successivement ajoutés 48,5 pl (279 pmol) de DIPEA et 13,9 pl
(167 pmol) de N-
méthylpropargylamine. Le mélange est chauffé à 40 C pendant 15 h. Il reste du
composé 2 de
départ : sont à nouveau ajoutés 48,5 pl (279 pmol) de DIPEA et 13,9 pl (167
pmol) de N-
méthylpropargylamine. Après 24 h d'agitation à 40 C, le mélange est dilué avec
5 ml d'AcOEt
puis lavé avec 5 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec 3x5 ml d'AcOEt, les
phases organiques
sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaHCO3 (10 ml), une
solution saturée de
NaCI (10 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR,
le brut est purifié
par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange
DCM/méthanol 98/2
à 90/10. Le composé 66 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (45 mg,
quant.). RMN 1H
(400 MHz, DMSO-d6): 0,78 (m, 6 H) ; 1,00 (s, 3 H) ; 1,05 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ;
1,12 (s, 3 H) ; 1,30
(m, 1 H) ; 1,49 à 1,61 (m, 2 H) ; 1,81 (m, 1 H) ; 2,20 (s, 3 H) ; 2,28(m, 1 H)
; 2,63 à 2,76 (m, 2H)
; 2,92 à 3,07 (m, 3 H) ; 3,17 (1, J=2,4 Hz, 1 H) ; 3,27 (d, J=2,4 Hz, 2 H) ;
3,33 (m partiellement
masqué, 1 H) ; 3,50 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1,7 Hz, 1 H) ; 4,25
(ddd, J=3,4 et 7,8 et
11,4 Hz, 1 H) ; 4,92 (dd, J=3,5 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1,5 et 5,5 et
11,2 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd,
J=1,5 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,9 et 11,2 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d,
J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,17
(dd, J=2,1 et 8,6 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,1 et 9,4 Hz, 1 H) ; 7,25 à 7,33 (m,
5 H) ; 8,33 (d, J=7,8
Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 750 [M +
; ES m/z = 375,5 [M + 21-1]2+ pic de base ; ES m/z =
748 [M - 1-1]- ; m/z = 794 [M - H + HCO2HF ; tR = 0,91 min.
Composé 67: 4-Azido-butyrate d'éthyle
Br _______________________________________
67
2,86 ml (20 mmol) de 4-bromo-butanoate d'éthyle et 2,6 g (40 mmol) de NaN3
sont mis en
solution dans 30 ml d'un mélange acétone/eau 2/1. Le mélange est chauffé 7 h
au reflux. Après
retour à TA et concentration sous PR, le résidu est repris dans 50 ml d'eau.
La phase aq. est
extraite avec 3x30 ml de DCM. Les phases organiques sont réunies, séchées sur
Mg504, filtrées
et concentrées sous PR pour donner le composé 67 sous la forme d'une huile
incolore (3 g,
95%). RMN 1H (400 MHz, chloroforme-d): 1,27 (1, J=7,2 Hz, 3 H) ; 1,92 (m, 2 H)
; 2,41 (1, J=7,2
Hz, 2 H) ; 3,36 (1, J=6,7 Hz, 2 H) ; 4,15 (q, J=7,2 Hz, 2 H).
Composé 68 : Acide 4-azido-butandique
- HO N,
67 68
A une solution de 3 g (19,9 mmol) du composé 67 dans 47 ml de méthanol et 37
ml d'eau sont
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ajoutés, par petites fractions, 5,58 g (99,5 mmol) de potasse. Le mélange est
agité à TA pendant
6 h puis concentré sous PR jusqu'à environ 28 ml. Le résidu est dilué avec 25
ml d'eau et extrait
avec 2x20 ml de DCM. La phase aq. est acidifiée à pH,---1 par addition d'HCI
concentré puis
extraite avec 3x25 ml d'éther diéthylique. Les phases organiques sont
rassemblées, lavées avec
une solution saturée de NaCI (25 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et
concentration à
sec sous PR, le composé 68 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (2,05
g, 80%). RMN
1H (400 MHz, chloroforme-d): 1,93 (m, 2 H) ; 2,49 (t, J=7,1 Hz, 2 H) ; 3,39
(t, J=6,7 Hz, 2 H) ;
11,24 (m étalé, 1 H).
Composé 69: Acide (4-{1-[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-chloro-4-
méthoxy-
benzy1}-3-isobuty1-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tétraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-
cyclohexadec-13-en-16-
y1)-éthylFoxiranyll-benzy1)-méthylamino]-méthyll-1,2,3-triazol-1-y1)-
butandique
0
0
0
j
0 0 0 HNLI y,CI j 0 00 HNlõ CI
oNo S0
66 69
A une solution de 24 mg (32 pmol) du composé 66 dans 545 pl de THF sont
successivement
ajoutés 8,3 mg (13 pmol) de composé 68, 545 pl d'eau, 128 pl d'une solution
aq. 0,1M de sulfate
de cuivre et 128 pl d'une solution aq. 0,2M d'ascorbate de sodium. Le mélange
est 45 min agité à
TA puis dilué avec 2 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec 3x2 ml d'AcOEt.
Les phases
organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCI (2 ml)
et filtrées sur
MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par
chromatographie sur gel
de silice greffée diol en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2
à 90/10. Le
composé 69 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (22,6 mg, 80%). RMN 1H
(500 MHz,
DMSO-d6): 0,76 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1,00 (s, 3 H) ;
1,05 (d, J=6,9 Hz, 3
H) ; 1,11 (s, 3 H) ; 1,30 (m, 1 H) ; 1,50 à 1,62 (m, 2 H) ; 1,81 (m, 1 H) ;
2,03 (m, 2 H) ; 2,10 (s, 3
H) ; 2,20 (t, J=7,0 Hz, 2 H) ; 2,30 (m, 1 H) ; 2,64 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,94 à
3,03 (m, 3 H) ; 3,35 (m
partiellement masqué, 1 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,61 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ;
3,87 (d, J=1,6 Hz, 1 H) ;
4,25 (ddd, J=3,7 et 7,7 et 11,5 Hz, 1 H) ; 4,37 (t, J=7,0 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd,
J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ;
5,11 (ddd, J=1,5 et 5,5 et 11,3 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1,5 et 15,1 Hz, 1 H) ;
6,47 (ddd, J=3,7 et
11,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1
H) ; 7,23 (dd, J=2,5 et
9,8 Hz, 1 H) ; 7,26 (d, J=8,5 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,34 (d,
J=8,5 Hz, 2 H) ; 8,02 (s, 1
H) ; 8,39 (d large, J=7,7 Hz, 1 H) ; 12,14 (m étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z
= 879 [M + ; m/z
= 877 [M ; tR = 0,86 min.
Composé 70 : (441 -[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-14(E)-(35,10 R,16S)-10-{3-Chloro-4-
méthoxy-benzy1}-3-
isobuty1-6,6-diméthy1-2,5,9,12-tétraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-
en-16-y1)-éthylF
oxiranyll-benzy1)-méthylamino]-méthyll-1,2,3-triazol-1-y1)-butanoate de
méthyle
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0
HO N,N 0 î 0
'pi 0 0 0 Hr%1 CI 0 0 0 HN,1ôCI
:())*111i'Ç
70 0
A une solution, purgée à l'argon, de 5,5 mg (6,2 pmol) du composé 69 dans 0,5
ml de DCM et
0,2 ml de méthanol sont ajoutés 4,7 pl (9,3 pmol) de
triméthylsilyldiazométhane. Le mélange est
agité 45 min à TA puis concentré à sec. Le brut est purifié par
chromatographie sur gel de silice
en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 95/5. Le composé 70
est obtenu
sous la forme d'un solide blanc (3,4 mg, 62%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,75
(d, J=6,6 Hz,
3 H) ; 0,77 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1,00 (s, 3 H) ; 1,05(d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1,11
(s, 3 H) ; 1,28(m, 1 H)
; 1,49 à 1,61 (m, 2 H) ; 1,80 (m, 1 H) ; 2,07 (m, 2 H) ; 2,10 (m, 3 H) ; 2,26
(m, 1 H) ; 2,31 (t, J=7,0
Hz, 2 H) ; 2,62 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,93 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,27 à 3,37 (m
partiellement masqué, 1 H)
; 3,48 (s, 2 H) ; 3,58 (s, 3 H) ; 3,61 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d,
J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd,
J=3,7 et 8,2 et 11,6 Hz, 1 H) ; 4,38 (t, J=7,0 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,9 et
9,8 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd,
J=1,5 et 5,3 et 11,2 Hz, 1 H) ; 5,79 (dd, J=1,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd,
J=3,9 et 11,2 et 15,2
Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,16 (dd, J=2,2 et 8,6 Hz, 1 H) ; 7,22
(dd, J=2,4 et 9,8 Hz, 1 H)
; 7,26 (d, J=8,6 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,33 (d, J=8,6 Hz, 2 H)
; 8,03 (s, 1 H) ; 8,34 (d,
J=8,2 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 893 [M + ; m/z = 447 [M + 21-1]2+ pic
de base; m/z = 891
[M - 1-1]- ; m/z = 937 [M -H + HCO2HF pic de base ; t = 0,90 min.
Exemple 21: (441 -[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-14(E)-(35,10 R,16S)-10-{3-chloro-4-
méthoxy-benzy1}-3-
isobuty1-6,6-diméthy1-2,5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-
en-16-y1)-éthyn-
oxiranyll-benzy1)-méthylamino]-méthyll-1,2,3-triazol-1-y1)-butanoate de 2,5-
dioxo-pyrrolidin-1-yle
o
0 N0
=
-- 0
101
0
0 0 0 HN,1 CI 0 s0--/Ç__ N =
NU,N 0 0 0 HNõI Cl
69 OINO le 01 Ex21
?
L'exemple 21 peut être obtenu par activation de l'acide 69 selon la méthode
décrite pour
l'exemple 19.
Exemple 22
.0
o
0 H j
YN1,0 0 0
l\rVÇ
H E H oIJ N 0 0 HN
0 Cl
0 0 0 X ?
N NH2
H
Composé 71: (E)-(35,10R,16S)-16-{(S)-1-[(25,35)-3-(4-Azidométhyl-phény1)-
oxiranylFéthyll-10-
(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-
cyclohexadec-13-ène-
2,5,9,12-tétraone
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PCT/FR2010/050986
110
0
_
zO õ?
HO go 0 0 0 HN...1µ,, el cl N, 0 0 o
HN 1, CI
57 0 71
I H
L'alcool 57 (36 mg ; 51,48 pmol, préparé selon Al-awar R.S., et al.,
J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-
3007) est placé en solution dans le THF anhydre (2 ml). La solution est purgée
à l'argon et
refroidie avec un bain d'eau glacée avant d'additionner le DPPA (74 pmol) puis
le DBU (80 pmol).
Le mélange est laissé revenir à TA et l'agitation est poursuivie toute la
nuit. Le lendemain, la
solution est de nouveau refroidie avec un bain d'eau glacée puis sont ajoutés
74 pmol de DPPA
et 80 pmol de DBU supplémentaires. Après 2 h de réaction à 0 C et 2 h à TA, le
mélange est
hydrolysé avec 5 ml d'eau puis est extrait 3 fois au DCM. Les phases
organiques réunies sont
séchées sur Na2SO4, filtrées et évaporées sous PR. Le brut est alors purifié
par chromatographie
sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le
composé 57 est
obtenu sous forme d'un solide incolore (24 mg ; 64%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-
d6) (ppm) :
0,84 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,86 (d, J=6,3 Hz, 3H) ;0,98 (d, J=7,1 Hz, 3 H) ;
1,03 (s, 3 H) ; 1,15 (s, 3
H) ; 1,48 à 1,67 (m, 3 H) ; 1,88 (m, 1 H) ; 2,45 (m, 1 H) ;2,63 (m, 1 H) ;
2,71 (dd, J=11,5 et 14,0
Hz, 1 H) ; 2,97 à 3,08 (m, 3 H) ; 3,36 (m partiellement masqué, 1 H); 3,82 (s
large, 4 H) ; 4,28
(ddd, J=3,6 et 8,0 et 11,5 Hz, 1 H) ; 4,44 (s, 2 H) ; 4,99 (dd, J=3,7 et 9,5
Hz, 1H) ; 5,12 (ddd,
J=1,4 et 5,7 et 11,4 Hz, 1 H) ; 5,88 (dd, J=1,4 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd,
J=3,8 et 11,4 et15,2
Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,26 à
7,32 (m, 4 H) ; 7,36
(d,J=8,5 Hz, 2 H) ; 8,40 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 722 [M - 1-
1]- ; m/z = 724 [M +
; m/z = 768 [M + HCO2H - ; tR = 1,19 min.
Composé 72 : (E)-(35,10R,16S)-16-{(S)-1-[(25,35)-3-(4-Am inométhyl-phény1)-
oxirany1]-éthyll-10-
(3-chloro-4-m éthoxy-benzy1)-3-isobuty1-6,6-d im éthyl-1,4-d ioxa-8, 11-d iaza-
cyclohexad ec-13-ène-
2,5,9,12-tétraone
0
z
0 0
N, 11110 0 0 0 HNy. Cl H 0 2N 0 0
thi CI
71
72
Le composé 71(22 mg, 30,38 pmol) est mis en solution dans un mélange méthanol
(1 ml) / eau
(0,2 ml) avant addition de TCEP (34,89 pmol). La solution obtenue est laissée
sous agitation
toute la nuit à TA puis est concentrée sous PR. Le résidu est ensuite repris
avec une solution aq.
saturée en NaHCO3 et extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont
séchées sur
Na2504, filtrées et concentrées sous PR. L'intermédiaire 72 est ainsi obtenu
sous la forme d'un
solide incolore (21 mg, 99%) qui est utilisé brut dans l'étape suivante. LCMS
(A5) : ES m/z = 696
[M ; m/z = 698 [M + ; m/z = 742 [M + HCO2H - ; tR = 3,19 min.
Composé 74: FmocVal-Cit-PABAC-u-amino-cryptophycine 72
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WO 2011/001052
PCT/FR2010/050986
111
0
*1111 OIN')çr LN 0 Hel, A 9 0 OyH * 0 0 FIN) 0
HN IL oiNXTrit'::131'S * : ?
H H
* CN1NH * H (IHNii 74
H 2 n 72
H 2
Le composé 72 (21 mg, 30,08 pmol) est mis en solution dans un mélange
acétonitrile (2 ml) /
DMF anhydre (0,5 ml) avant l'addition d'une solution du composé 73 (23 mg,
30,1 pmol; préparé
selon WO 2006/110476) dans l'acétonitrile (2 ml). Le mélange est laissé 22 h
sous agitation à TA
puis est concentré sous PR. Le résidu est repris dans le DCM et lavé avec une
solution aq.
saturée en NaHCO3 puis séché sur Na2SO4, fitré et concentré sous PR. Le brut
est alors purifié
par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol
100/0 à 90/10.
Le composé 74 est obtenu sous forme d'un solide blanc (22 mg) qui est utilisé
brut dans l'étape
suivante. LCMS (AS): ES m/z = 1325 [M + ; m/z = 1369 [M + HCO2H - ;
tR = 4,30 min.
Composé 75 : Val-Cit-PABAC-u-amino-cryptophycine 72
o
=
oiNXirm JN 0 mi, itit Xirm de of o 0
H,N
1111aK H 0 0 H O'lly) 0 ? 0 0 H
0-ILy") 0 "=-7L?
11% LNNI-12 75
NH, H
Le composé 74 (22 mg, 16,59 pmol) est mis en solution dans le DMF (3 ml) avant
addition de
pipéridine (150 pl, 1,51 mmol) et agitation 30 min à TA. Le mélange est
concentré sous PR; le
résidu est mis en solution dans le minimum de méthanol et précipité avec de
l'éther. Le composé
75 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide blanc (15 mg, 82%). LCMS (AS):
ES m/z = 1103 [M
+ ; m/z = 1101 [M - 1-1]- ; m/z = 1148 [M + HCO2H - ; tR = 3,38 min.
Composé 76 : Acide glutarique-Val-Cit-PABAC-u-amino-cryptophycine 72
o
H 0
_
H2NfIrN 0,torN= C)0 0 H%.= di CI 0 0 =
Cl
NY-LM-12
=
H H
Une solution d'anhydride glutarique (8 mg, 70 pmol) dans le DMF anhydre (200
pl) est
additionnée au composé 75(15 mg, 13,59 pmol) conditionné sous argon. La
solution obtenue est
agitée toute la nuit à TA avant addition d'une solution aq. saturée en NH4C1
et extraction 3 fois au
DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2504, filtrées et
concentrées sous PR.
Le résidu obtenu est repris dans le DCM et précipité à l'éther. Après
filtration sur fritté et lavage à
l'éther, le composé 76 est obtenu sous la forme d'un solide beige (8 mg, 48%).
RMN 1H (500
MHz, DMSO-d6) (ppm) :0,80 à 0,92 (m, 12 H) ; 0,96 (d, J=7,1 Hz, 3H) ;1,02 (s,
3 H) ; 1,15 (s, 3
H) ; 1,30 à 1,72 (m, 9 H) ; 1,86(m, 1 H) ; 2,00 (m, 1 H) ; 2,11 à 2,26 (m, 4
H) ;2,42 (m, 1 H) ; 2,60
à 2,74 (m, 2 H) ; 2,91 à 3,11 (m, 5 H) ; 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ;
3,76 (d,J=1,8 Hz, 1
H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 4,17 (m, 3 H) ; 4,27 (m, 1 H) ; 4,37 (m, 1 H) ; 4,90 à
5,04 (m, 3 H) ; 5,11(m, 1
H) ; 5,50 (m large, 2 H) ; 5,88 (d large, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,20 (m étalé, 1
H) ; 6,48 (m, 1 H) ; 7,06
CA 02766762 2011-12-23
WO 2011/001052 PCT/FR2010/050986
112
(d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,11 à 7,32 (m, 9 H) ; 7,60 (m, 2 H) ; 7,75 (m, 1 H) ;
7,89 (m, 1 H) ; 8,28 (m
étalé, 1 H) ; 8,41 (d, J=7,8 Hz, 1 H) ; 9,92 (s large, 1 H); 12,06 (m étalé, 1
H). LCMS (A2) : ES
m/z = 1217 [M + ; m/z = 1215 [M ; tR = 1,05 min.
Exemple 22
9 o
" - o " 0
Ho 9 9 Xbril 9 de %II 00 HN, =y,C1_ rr de
y IP' 0.1.0 EIN:L. 01
r - ?
cx , Ex22
11 NH2 N NH2
H
Le composé 76 (6 mg, 4,93 pmol) est mis en solution dans un mélange de DCM
(0,5 ml) et de
DMF (0,1 ml) puis sont successivement ajoutés le carbonate de N,N'-
disuccinimidyle (6 mg,
23,42 pmol) et la DIPEA (4 pl, 22,96 pmol). Après 3 h de réaction à TA, une
solution aq. saturée
en NH4CI est additionnée et le mélange est extrait 3 fois au DCM. Les phases
organiques reunies
sont séchées sur Na2504, filtrées et concentrées sous PR. Le brut est purifié
par
chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0
à 90/10. Le
composé Ex22 est obtenu sous forme d'un solide blanc (4 mg ; 61%). RMN 1H (500
MHz,
DMSO-d6) (ppm) : 0,80 à 0,90 (m, 12 H) ; 0,96 (d, J=7,3 Hz, 3 H) ; 1,03 (s, 3
H) ; 1,15 (s, 3 H) ;
1,32 à 1,76 (m, 7 H) ; 1,80 à 1,89 (m, 3 H) ; 1,97 (m, 1 H) ; 2,29 (m, 2 H) ;
2,44 (m, 1 H) ; 2,60 à
2,75 (m, 4 H) ; 2,81 (s, 4 H) ; 2,89 à 3,08 (m, 5 H) ; 3,41 (m partiellement
masqué, 1 H) ; 3,77 (d,
J=2,0 Hz, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 4,14 à 4,24 (m, 3 H) ; 4,27 (ddd, J=3,9 et
8,3 et 11,5 Hz, 1 H) ;
4,38 (m, 1 H) ; 4,93 à 5,03 (m, 3 H) ; 5,11 (m, 1 H) ; 5,39 (s large, 2 H) ;
5,88 (d large, J=15,2 Hz,
1 H) ; 5,96 (t, J=5,9 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,7 et 11,1 et 15,2 Hz, 1 H) ;
7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ;
7,16 à 7,36 (m, 9 H) ; 7,59 (d, J=7,8 Hz, 2 H) ; 7,76 (t, J=6,1 Hz, 1 H) ;
7,88 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ;
8,10 (d, J=7,3 Hz, 1 H) ; 8,41 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 9,97 (s large, 1 H). LCMS
(A2) : ES m/z = 1314
[M + ; m/z = 1358 [M + HCO2H - ; tR = 1,06 min.
Exemple 23
--
0,[orki FHNX
is CI
N,0 fr.N
0
,
H NH
Composé77: (E)-(35,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-Aminométhyl-phény1)-
oxiranylFéthyll-10-
(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-
cyclohexadec-13-ène-
2,5,9,12-tétraone
-- 0 0
N, lel 0 0 - HNõ1 "ci I-12N 110 0 0
HN.õ1. "ci
0
o
0O "I- 0
CA 02766762 2011-12-23
WO 2011/001052 PCT/FR2010/050986
113
Le composé 60 (23 mg, 31,76 pmol) est mis en solution dans un mélange de
méthanol (1 ml) et
d'eau (0,2 ml) avant addition de TCEP (34,90 pmol) et de DCM (la quantité
suffisante pour
solubiliser). La solution obtenue est laissée sous agitation toute la nuit à
TA puis est concentrée
sous PR. Le résidu est ensuite repris avec une solution aq. saturée en NaHCO3
et extrait 3 fois
au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2SO4, filtrées et
concentrées sous
pression réduite. Le brut est enfin purifié par chromatographie sur gel de
silice en éluant avec un
mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 77 est ainsi obtenu sous la
forme d'un
solide blanc (12 mg, 59%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) (ppm) : 0,78 (d, J=6,4
Hz, 6 H) ; 1,00
(s, 3 H) ; 1,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1,12 (s, 3 H) ; 1,30 (m, 1 H) ; 1,47 à
1,62 (m, 2 H) ; 1,79 (m, 1
H) ; 2,22 à 2,32 (m, 3 H) ; 2,63 à 2,73 (m, 2 H) ; 2,92 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,35
(m partiellement
maqué, 1 H) ; 3,71 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,86 (d, J=1,6 Hz, 1 H) ; 4,25
(ddd, J=3,6 et 8,0 et
11,3 Hz, 1 H) ; 4,90 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1,5 et 5,2 et
11,3 Hz, 1 H) ; 5,79 (dd,
J=1,5 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,6 et 11,3 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d,
J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17
(dd, J=1,9 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,19 à 7,26 (m, 3 H) ; 7,28 (d, J=1,9 Hz, 1 H) ;
7,34 (d, J=8,0 Hz, 2H)
; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 698 [M + ; m/z = 696 [M - 1-
1]- ; m/z = 742 [M +
HCO2H - ; tR = 0,87 min.
Composé 78: FmocVal-Cit-PABAC-a-amino-cryptophycine 77
0
NNAy.
* M * ,N = 0
[11 10)
*
al H elo HNõ Cl l'IL OILNI:KIO'N Ill o H
1111 H â H 78
H
H 2
Le composé 77 (10 mg, 14,32 pmol) est mis en solution dans le DMF anhydre (0,1
ml) avant
l'addition d'une solution de l'intermédiaire 73 (11 mg, 14,35 pmol ; préparé
selon WO
2006/110476) dans un mélange d'acétonitrile (1 ml) et de DMF (0,1 ml). Le
mélange est laissé
sous agitation 3 h à TA puis est concentré sous PR. Le résidu est alors
purifié par
chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0
à 90/10. Le
composé 78 est obtenu sous forme d'un solide blanc (18 mg, 95%). LCMS (AS): ES
m/z = 1325
[M + ; m/z = 1369 [M + HCO2H - ; tR = 4,32 min.
Composé 79 : Val-Cit-PABAC-a-amino-cryptophycine 77
= 0 0
oiNfiroLN_c -0,TorM gr- 0 aie. Xirm . o.
HN Cl
H cielly-õriro H2N 0 ------N ?
N NH2 N NH2
H H
=
Le composé 78 (42 mg, 31,68 pmol) est mis en solution dans le DMF (5 ml) avant
addition de
pipéridine (150 pl, 1,51 mmol) et agitation 30 min à TA. Le mélange est
concentré sous PR et le
résidu est mis en solution dans le minimum de méthanol et est précipité avec
de l'éther. Le
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114
composé 79 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide blanc (21 mg, 60%). LCMS
(A4) : ES m/z
= 1103 [M + miz= [m _Hf; m/z= 1147 [M +1-1CO21-1-1-1]-; tR = 3,67
min.
Composé 80 : Acide glutarique-Val-Cit-PABAC-a-amino-cryptophycine 77
me" 0 0
ItNIrrUN die ip, 0 HO 0..,rorNH =
0 0 HN.µ dl" Cl
0 H 0õ11,7,-T4,0
H = 0 H
Cielly-11 0 0
1:)L
N NH2
H N NH2
H
Le composé 79 (20 mg, 18,12 pmol) est mis en solution dans un mélange de DMF
(100 pl) et de
DCM anhydre (500 pl) avant addition d'anhydride glutarique (4 mg, 35,06 pmol).
La solution
obtenue est agitée toute la nuit à TA puis est concentrée sous PR. Le résidu
est repris dans un
minimum de DCM et de méthanol, précipité avec un mélange d'éther et de pentane
et est filtré
sur fritté. Le composé 80 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide blanc (23
mg, 104% brut) qui
est utilisé brut dans l'étape suivante. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,78 (d,
J=6,3 Hz, 6 H) ;
0,84 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,86 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1,00 (s, 3 H) ; 1,04 (d,
J=6,9 Hz, 3 H) ; 1,12 (s,
3 H) ; 1,22 à 1,47 (m, 3 H) ; 1,51 à 1,64 (m, 3 H) ; 1,72 (m, 3 H) ; 1,80 (m,
1 H) ; 1,99 (m, 1 H) ;
2,20 (m, 4 H) ; 2,28 (m, 1 H) ; 2,59 à 2,73 (m, 2 H) ; 2,90 à 3,07 (m, 5 H) ;
3,32 (m partiellement
masqué, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (s large, 1 H) ; 4,19 (m, 3 H) ; 4,24 (m,
1 H) ; 4,38 (m, 1 H) ;
4,91 (dd, J=3,3 et 9,6 Hz, 1 H) ; 4,97 (s large, 2 H) ; 5,10 (dd, J=4,4 et
10,7 Hz, 1 H) ; 5,40 (s
large, 2 H) ; 5,79 (d large, J=15,1 Hz, 1 H) ; 5,99 (m large, 1 H) ; 6,47
(ddd, J=3,6 et 11,3 et 15,1
Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (d large, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,20 à
7,34 (m, 8 H) ; 7,60 (d
large, J=8,2 Hz, 2 H) ; 7,76 (t large, J=5,4 Hz, 1 H) ; 7,83 (d, J=8,5 Hz, 1
H) ; 8,09 (d large, J=7,1
Hz, 1 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H) ; 9,95 (s large, 1 H) ; 11,98 (m étalé, 1
H). LCMS (A2) : ES m/z
= 1217 [M + ; m/z = 1215 [M ; tR = 1,03 min.
Exemple 23
= 0
HONÇNH 0 0 0111 * 4 "
0,13,N 0 HN,c, CL.;105,1 ifirm Ji% 41
H 0 H 0 ril0 ? H 0 H
H
c' Ex23
N N11 y 2
=
H H
L'exemple 23 peut être obtenu en activant l'acide 80 selon la méthode décrite
pour l'exemple 22.
Exemple 24 : [2-Méthy1-2-(pyridin-2-yldisulfany1)-propyl]-méthyl-carbamate de
4-((2S,3S)-3-
{(S)-1-[(E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobutyl-6,6-
diméthyl-2,5,9,12-
tétraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn-16-y11-éthy1}-oxiranyl)-
benzyle
0
_
0
N 0 gr 0 0 0 HN,õi µµ die CI
S
,.,,,,O)ly1110 ne ci)
Composé 81: Méthy1[2-méthy1-2-(pyridin-2-yldisulfany1)-propylFamine
CA 02766762 2011-12-23
WO 2011/001052
PCT/FR2010/050986
115
zs_sy,õ S,s,H
NH
15 81
A une solution de l'amine 15 (478 mg, 2,90 mmol) dans le Me0H (35 ml) est
additionné le TCEP
(831 mg, 2,9 mmol). Après 2 h de réaction à TA la solution obtenue est
additionnée goutte à
goutte, sous atmosphère d'argon, à une solution de 2,2'-dipyridyldisulfide
(960 mg, 4,36 mmol)
dans l'éthanol (70 ml). Après encore 2 h de réaction à TA le mélange est
concentré sous PR. Le
résidu est repris dans le DCM et est lavé avec une solution aq. saturée en
NaHCO3. La phase
organique est séparée puis la phase aq. extraite encore 2 fois au DCM. Les
phases organiques
réunies sont séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées sous PR. Le brut est
purifié par
chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2
à 85/15. Le
composé 81 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle (587 mg, 89%). RMN
1H (500 MHz,
DMSO-d6): 1,25 (s, 6 H) ; 1,80 (m étalé, 1 H) ; 2,19 (s, 3 H) ; 2,45 (s, 2 H)
; 7,22 (ddd, J=1,5 et
5,0 et 7,0 Hz, 1 H) ; 7,74 à 7,85 (m, 2 H) ; 8,42 (ddd, J=1,1 et 1,5 et 5,0
Hz,1 H).
Exemple 24: [2-Méthy1-2-(pyridin-2-yldisulfany1)-propyl]-méthyl-carbamate de 4-
((2S, 3S)-3-{(S)-
1-[(E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzy1)-3-isobuty1-6,6-diméthyl-
2,5,9,12-tétraoxo-
1,4-dioxa-8, 11-diaza-cyclohexad ec-13-èn-16-yI]-éthyll-oxirany1)-benzyle
_,c;)
0 0 HN a N 0 0
a
oloro
:cp5)--No o
4111111 o
H
Ex24
A une solution de l'intermédiaire 58 (21 mg, 24,3 pmol) dans le DCM anhydre
sont
successivement ajoutés l'amine 81(10 mg, 43,79 pmol) et la DIPEA (8 pl, 45,43
pmol). Après
24 h à TA une solution aq. saturée en NaHCO3 est additionnée et le mélange est
extrait 3 fois au
DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2SO4, filtrées et
concentrées sous PR.
Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un
mélange
DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé Ex24 est ainsi obtenu sous la forme d'un
solide
incolore (7 mg, 30%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,82 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ;
0,84 (d, J=6,0 Hz,
3 H) ; 0,97 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1,03 (s, 3 H) ; 1,14 (s, 3 H) ; 1,25 (s
large, 6 H) ; 1,45 à 1,68 (m, 3
H) ; 1,88 (m, 1 H) ; 2,42 (m partiellement masqué, 1 H) ; 2,58 à 2,75 (m, 2 H)
; 2,83 à 3,09 (m, 6
H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,46 (s large, 2 H) ; 3,81 (s large,
4 H) ; 4,28 (m, 1 H) ;
4,91 à 5,17 (m, 4 H) ; 5,88 (d large, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,49 (m, 1 H) ; 7,05
(d, J=8,6 Hz, 1 H) ;
7,15 à 7,38 (m, 8 H) ; 7,80 (m large, 2 H) ; 8,39 (d, J=7,8 Hz, 1 H) ; 8,43 (d
large, J=4,6 Hz, 1 H).
LCMS (A2) : ES m/z = 953 [M + ; m/z = 477 [M + 21-1]2+ ; m/z = 997 [M +
HCO2H - H] ; tR =
1,23 min.
Exemple 25: hu2H11-Ex17
CA 02766762 2016-07-29
. ,
116
igh
H H o ô FINI..., CI
hu2H11 0
?
H
Ex25
_d
Selon la méthode générale, 8,31 mg (0,057 pmol, 1,468 ml) d'anticorps nu
hu2H11 à une
concentration de 5,66 mg/m1 sont traités par 5 éq. du composé Ex17 (0,442 mg,
0,340 pmol)
en solution dans 37,3 pl de DMA de telle sorte que la concentration finale en
anticorps soit
de 3 mg/m1 dans le mélange. Après purification sur Superdexmc 200 pg et
concentration sur
Amiconmc Ultra-15 (membrane Ultracelmc 50k, Milliporemc), on obtient 2,15 ml
de conjugué à
une concentration de 2,48 mg/mi avec en moyenne 2,2 cytotoxiques par anticorps
et une
pureté monomérique de 99,7% dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de
phosphate, 0,14 M de NaCI et 20% en volume de NMP. Le changement de tampon
final est
réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate et 0,14 M
de NaCI
sur 1 ml de conjugué. On obtient alors 1,5 ml d'une solution de conjugué Ex25
à une
concentration de 1,06 mg/mi avec en moyenne 2,8 dérivés de cryptophycine
(déterminé par
UV) par anticorps et une pureté monomérique de 99,7%.
Exemple 26: hu2H11-Ex18
0
________________________ H H
* 0 0 FINI
di CI
hu2H11 0 0
05y-N 0 ?
H
_d
Ex26
Selon la méthode générale, 7,8 mg (0,053 pmol, 1,458 ml) d'anticorps nus
hu2H11 à une
concentration de 5,35 mg/mi sont traités par 6 éq. du composé Ex18 (0,578 mg,
0,531 pmol,
pureté 60%) en solution dans 272 pl de DMA de telle sorte que la concentration
finale en
anticorps soit de 3 mg/m1 dans le mélange. Après purification sur Superdexmc
200 pg et
concentration sur Amiconmc Ultra-15 (membrane Ultracelmc 50k, Milliporemc), on
obtient
2,35 ml de conjugués à une concentration de 2,49 mg/mi avec en moyenne 2,5
dérivés de
cryptophycine par anticorps et une pureté monomérique de 100% dans un tampon
aqueux
pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCI et 20% en volume de NMP.
Le
changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant
0,01 M
de phosphate et 0,14 M de chlorure de sodium suri ml de conjugué. On obtient
alors 1,5 ml
de d'une solution de conjugué Ex26 à une concentration de 0,84 mg/mi avec en
moyenne
2,22 dérivés de cryptophycine (déterminé par UV) par anticorps et une pureté
monomérique
de 99,9%.
CA 02766762 2016-07-29
117
Exemple 27: hu2H11-Ex19
0
= 0
H
hu2H11 N 1101 0 0 HNIõ,
r& CI
,OjrN.'0 ne 0
I
Ex27 _d
Selon la méthode générale, 12 mg (81,7 pmol, 1,172 ml) d'anticorps nu hu2H11 à
une
concentration de 10,24 mg/mi sont traités par 2 x 5 éq. du composé Ex19 (0,382
mg,
0,41 pmol) en solution dans 44,3 pl de DMA de telle sorte que la concentration
finale en
anticorps soit de 3 mg/mi dans le milieu réactionnel. Après purification sur
Superdexmc
200 pg en présence de 20% de NMP et concentration sur Amiconmc Ultra-15
(membrane
Ultracelmc 50k, Milliporemc), on obtient 1,04 ml de conjugués dans un tampon
aqueux
pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 20% en volume de NMP.
Le
changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH = 6,5
contenant 0,01 M
d'histidine, 10% de sucrose (w/v) et 5% de NMP (v/v). On obtient alors 1,5 ml
d'une solution
de conjugué Ex27 à une concentration de 2,66 mg/mi avec en moyenne 1,4 dérivés
de
cryptophycine (HRMS) par anticorps et une pureté monomérique de 99,8%.
Les exemples donnés ci-dessus ont été réalisés par un dérivé de cryptophycine
particulier
(souvent le dérivé Di) mais pourraient s'appliquer à un autre dérivé du groupe
D1-D8 ou au
dérivé de cryptophycine de formule générale (II). De même, les exemples de
conjugués des
exemples 10, 11, 12, 25, 26 et 27 pourraient s'appliquer à d'autres anticorps
que hu2H11.
note : dans lesdits exemples, -Lys- signifie que l'attachement se fait sur les
groupes e-amino des lysines de
l'anticorps.
Exemple 28: évaluation de l'inhibition de la prolifération des lignées
cellulaires MDA-
MB-231, MDA-A1 et HCT116 par les cytotoxiques, étude réalisée sur les composés
de
formule (II) de type SZa avec Za = SMe ou de type -C(=0)-ZbRb avec ZbRb = OMe
ou OCH2-
CH=CH2
Les cellules MDA-MB-231, MDA-A1 ou HCT116 dans leur phase de croissance
exponentielle sont trypsinées et remises en suspension dans leur milieu de
culture respectif
(DMEM/F12 Gibco #21331, 10% SVF Gibco #10500-056, 2 nM Glutamine Gibco #25030
pour les cellules MDA ; DMEM Gibco #11960, 10% SVF Gibco #10500-056, 2 mM
Glutamine Gibco #25030 pour les cellules HCT116). La suspension cellulaire est
ensemencée dans des plaques de culture 96 puits Cytostar (GE Healthcare
Europe,
CA 02766762 2016-07-29
. ,
117a
#RPNQ0163) dans le milieu de culture complet contenant du sérum à une densité
de 5000
cellules/puits (MDA-MB-231, MDA-A1, HCT116). Après 4 h d'incubation, des
dilutions
successives des dérivés de cryptophycine sont ajoutées dans les puits à des
concentrations
décroissantes de 10-7 à 10-12 M (en triplicate pour chaque concentration). Les
cellules sont
cultivées 3 jours à 37 C dans une atmosphère à 5% de CO2 en présence des
cytotoxiques.
Le 4e jour, 10 pl d'une solution de thymidine 14C (0,1 pCi/puits, Perkin Elmer
#NEC56825000)
sont ajoutés dans chaque puits. L'incorporation de thymidine 14C est mesurée
CA 02766762 2011-12-23
WO 2011/001052
PCT/FR2010/050986
118
96 heures après le début de l'expérience avec un compteur radioactif microbétâ
(Perkin Elmer).
Les données sont exprimées sous la forme d'un pourcentage de survie en faisant
le ratio entre le
décompte obtenu avec les cellules traitées par le cytotoxique et celui obtenu
avec les cellules
des puits contrôlés (traitées par le milieu de culture seul).
IC50 (nM)
Tableau III
HCT116 MDA-MB-231 MDA-A1
Composé 1 0,032 0,041 1,07
Composé 7 0,315 0,303 7,946
Composé 8 0,052 0,104 0,828
Composé 13 0,336 0,529 9,763
Composé 19 0,152 0,149 2,705
Composé 30 0,031 0,03 11,95
Composé 40 0,12 0,293 1,579
Composé 44 0,135 0,156 15,552
Composé 57 1,131 1,185 29,01
Composé 62 0,035 0,095 10,88
Composé 77 0,105 0,170 15,06
Exemple 29: évaluation de l'inhibition de la prolifération des lignées
cellulaires MDA-MB-
231, MDA-A1 et HCT116 par les conjugués anticorps-cytotoxique
Les cellules MDA-MB-231, MDA-A1 ou HCT116 dans leur phase de croissance
exponentielle
sont trypsinées et remises en suspension dans leur milieu de culture respectif
(DMEM/F12 Gibco
#21331, 10% SVF Gibco #10500-056, 2 nM Glutamine Gibco #25030 pour les
cellules MDA ;
DMEM Gibco #11960, 10% SVF Gibco #10500-056, 2 mM Glutamine Gibco #25030 pour
les
cellules HCT116). La suspension cellulaire est ensemencée dans des plaques de
culture 96 puits
Cytostar (GE Healthcare Europe, #RPNQ0163) dans le milieu de culture complet
contenant du
sérum à une densité de 5000 cellules/puits (MDA-MB-231, MDA-A1, HCT116). Après
4 h
d'incubation, des dilutions successives des dérivés de cryptophycine sont
ajoutées dans les puits
à des concentrations décroissantes de 10-7 à 10-12 M (en triplicate pour
chaque concentration).
Les cellules sont cultivées à 37 C dans une atmosphère à 5% de CO2 en présence
des
immunoconjugués anticorps-cytotoxique pendant 3 jours. Le zle jour, 10 pl
d'une solution de
thymidine 14C (0,1 pCi/puits, Perkin Elmer #NEC56825000) sont ajoutés dans
chaque puits.
L'incorporation de thymidine 14C est mesurée 96 h après le début de
l'expérience avec un
CA 02766762 2011-12-23
WO 2011/001052 PCT/FR2010/050986
119
compteur radioactif microbétâ (Perkin Elmer). Les données sont exprimées sous
la forme d'un
pourcentage de survie en faisant le ratio entre le décompte obtenu avec les
cellules traitées par
l'immunoconjugué et celui obtenu avec les cellules des puits contrôles
(traitées par le milieu de
culture seul). Dans certaines expériences, l'anticorps nu hu2H11 a été ajouté
dans les puits à
une concentration de 1 pM au début de l'expérience et l'inhibition de la
prolifération a été
mesurée comme précédemment décrit.
IC50 (nM), MDA-MB-231
Tableau IV ______________________________________________________
Conjugué seul en présence d'anticorps nu
Ex.9 0,150 0,856
Ex.25 0,710 4,918
