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PCT/EP2010/065566
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"PRODUIT ET PROCEDE D'ELIMINATION DES BIOFILMS"
L'invention se rapporte au domaine de l'élimination des
biofilms. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à une composition
et un procédé pour éliminer des biofilms.
L'hygiène prend une importance croissante dans l'industrie
alimentaire, dans les hôpitaux, et en particulier dans la sphère
chirurgicale, dans les installations de potabilisation et de désalinisation
d'eau, dans le traitement des eaux de procédé, et en particulier dans les
eaux utilisées dans les tours de refroidissement et dans les nécessités
de la vie courante, par exemple les lentilles de contact. On observe
fréquemment que, lors de la circulation d'eau sur un support, des
microorganismes circulant librement dans l'eau peuvent adhérer à la
surface. Ces microorganismes peuvent alors développer une matrice
extracellulaire adhésive composée de substances polymères. Une
communauté de microorganismes adhérés à une surface et englobée
dans une telle matrice est appelée un biofilm. Généralement ces biofilms
sont composés de bactéries.
On observe malheureusement que cette matrice est très
résistante, et peut constituer une barrière pour des agents qui agiraient
contre les microorganismes. Les traitements classiques à base de soude
et/ou comportant différents biocides n'agissent pas de manière
suffisamment efficace car ils ne pénètrent pas le biofilm sur toute son
épaisseur ou sont inhibés par certaines molécules composant cette
matrice. Le traitement n'est alors que partiellement efficace sur la
surface supérieure du biofilm. En outre, ce dernier peut également
piéger d'autres microorganismes, pathogènes notamment, que celui qui
s'est installé initialement.
On connaît par W098/26807 un procédé de traitement
enzymatique d'un film biologique. Dans ce procédé, on met en contact le
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biofilm avec une composition de nettoyage comportant une ou plusieurs
hydrolases pour éliminer ou libérer la couche de biofilm de la surface.
Dans une seconde étape le biofilm est mis en contact avec une
composition désinfectante bactéricide pour détruire les cellules
bactériennes présentes dans le film. Cependant, l'utilisation simultanée
de ces deux compositions est à l'origine d'un degré d'inactivation de
certaines enzymes dans le mélange final. La rapidité et l'efficacité du
nettoyage peuvent donc être améliorées en utilisant une composition où
l'inactivation des enzymes est absente.
On connaît également du document US2003/0205247 une
utilisation de solutions aqueuses contenant des enzymes pour le
nettoyage de cuves de stockage ou de fermentation, contenant une ou
plusieurs enzymes choisies parmi les suivantes : laccases, peroxydases,
oxydoréductases, transférases, isomérases, lyases ou ligases et un
agent épaississant avec un amplificateur de mousse. Le domaine
d'action des solutions précitées est relativement étroit, propre à la
brasserie, puisque les enzymes choisies et illustrées sont
particulièrement connues pour être actives sur des polyphénols qui
constituent principalement les résidus de fermentation, tannins et
analogues. L'agent épaississant est un agent modifiant la viscosité et la
thixotropie de la solution utilisée dans le but de permettre une meilleure
adhérence de la solution et/ou de la mousse, sur les surfaces à traiter
des cuves. Ces solutions ne conviennent pas pour le nettoyage
d'installations différentes de cuves ou réservoirs (comprenant par
exemple de nombreuses tubulures) et ne conviennent pas pour
l'élimination d'autres types de microorganismes.et donc pas pour une
large gamme de biofilms.
Le document WO 92/13807 divulgue l'utilisation d'une
composition permettant l'élimination de la biomasse et de biofilm sur des
substrats dans des systèmes aqueux, c'est-à-dire dans des systèmes
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dans lesquels de l'eau est mise en circulation ou entreposée. Ce type de
système souffre de la présence de biomasse et de biofilms alcalins ou
acides dus au type d'organisme généralement présent dans ce type
d'installation.
Pour résoudre ce problème, le document WO 92/13807
prévoit l'utilisation de polysaccharidases et/ou de protéases et de
tensioactifs anioniques tels que du SDS ou DBS (respectivement du
dodécylsulfate de sodium et de l'acide dodécylbenzènesulfonique) pour
l'élimination de la biomasse et des biofilms.
Malheureusement, ce type de composition ne sera pas
efficace pour une large gamme de biofilms provoqués par divers
microorganismes et présentera une efficacité limitée pour l'élimination de
biofilms.
Comme on peut le constater de ce qui précède, ces
compositions sont toujours ciblées pour un type de biofilm ou un
microorganisme ciblé et/ou pour une application particulière.
Il existe donc un besoin pour une composition et un
procédé capable d'éliminer des biofilms, qui soient efficaces dans un
délai raisonnable, agissent sur une large classe de biofilms produits par
une large classe de microorganismes ou de groupes de
microorganismes, qui ne soient pas nuisibles pour le support du biofilm,
et agissent tant pour prévenir le développement de biofilms que sur des
biofilms constitués depuis longtemps, et ayant atteint un stade de
cohésion et de résistance important.
Pour résoudre ce problème, la présente invention procure
une composition pour l'élimination des biofilms présents sur un substrat
caractérisée en ce qu'elle comprend :
- au moins
un composant détergent comprenant un agent
séquestrant ainsi qu'un agent simultanément mouillant et
dispersant,
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- au moins
un composant enzymatique contenant au moins
une protéase, au moins une laccase et au moins une
polysaccharidase.
La constitution d'une composition comprenant un
composant détergent et un composant enzymatique contenant au moins
une protéase, au moins une laccase et au moins une polysaccharidase
permet, de manière surprenante, d'améliorer significativement la rapidité
et l'efficacité de l'élimination d'un biofilm tout en pouvant attaquer divers
types de biofilms. Cette composition permet d'éliminer la totalité ou la
quasi-totalité du biofilm et peut agir sur des biofilms même matures ou
ayant un cycle de développement plus précoce et développés par de
multiples espèces ou microorganismes différents.
A ce jour, il faut savoir qu'aucune composition efficace ne
permet d'assurer l'élimination complète des biofilms présents dans les
installations. Par exemple, dans le domaine de l'industrie alimentaire, les
biofilms se forment de manière inévitable (au vu de la richesse du milieu
environnant). Les biofilms présentent une activité de croissance cyclique
comprenant une phase de croissance durant laquelle se produit
l'accumulation des microorganismes et une phase de détachement
durant laquelle des morceaux entiers de biofilms se détachent par
érosion et sous l'effet de leur propre poids. Lorsqu'un industriel est
confronté à ce phénomène, il devrait en réalité arrêter sa chaîne de
production et effectuer différents cycles de lavages alternés à la soude,
et avec de nombreux détergents et ou nettoyants chimiques et/ou
enzymatiques puisqu'il n'existe pas de composition polyvalente. Or ceci
représente de nombreuses heures de travail et de perte de rendement
de l'installation.
Par conséquent, en pratique, la production n'est pas
arrêtée et lorsque le biofilm est en phase de rupture, les lots produits
sont contaminés et écartés jusqu'à ce que le niveau de contamination
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par les microorganismes des aliments produits soient à nouveau
acceptable au vu des normes en vigueur. En outre, il n'est pas
envisageable pour les industriels d'avoir en stock une solution
détergente ou enzymatique particulière pour chaque microorganisme
5 susceptible de contaminer sa chaîne de production.
C'est donc de manière très surprenante que la présente
invention permet la mise à disposition d'une composition détergente
parfaitement polyvalente qui permet d'éliminer un large spectre de
biofilms, dans divers types d'installation et ne nécessitant pas de
précaution particulières d'emploi. Le détergent élimine une partie
superficielle du biofilm et mouille et gonfle les structures organiques du
biofilm grâce au caractère dispersant et au caractère mouillant de l'agent
simultanément mouillant et dispersant présent dans le composant
détergent. Ceci favorise donc l'accessibilité du composant enzymatique
qui fragilise et dégrade la matrice du biofilm. Cette action combinée des
trois types d'enzyme et du composant détergent favorise l'accessibilité à
la composition des couches plus profondes et permet un détachement
optimal de tout type de biofilm tout en préservant le substrat.
Ce type d'agent simultanément mouillant et dispersant
réduit en outre l'apport de composés extérieurs dans les installations lors
de l'étape de nettoyage et simplifie donc les procédures de validation
des étapes de nettoyage.
Dans un forme de réalisation particulière selon l'invention,
la composition est une solution de nettoyage aqueuse présentant un pH
compris entre approximativement 8 et 11, préférentiellement compris
approximativement entre 9,5 et 10,5 et plus préférentiellement compris
approximativement entre 9,5 et 10. La valeur du pH de ladite
composition influence de manière importante son efficacité vis-à-vis du
biofilm. Une solution de ladite composition dont le pH est compris
approximativement entre 8 et 11 permet donc d'éliminer de manière
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surprenante la totalité ou la quasi-totalité du biofilm.
Alternativement, ladite composition peut être sous forme
solide puis être dissoute dans un solvant avant utilisation afin d'obtenir
par dilution dans une phase aqueuse, une solution de nettoyage dont le
pH est compris approximativement entre 8 et 11.
Dans une variante avantageuse selon l'invention, la
composition est une solution liquide qui être ensuite diluée dans une
phase aqueuse pour obtenir une solution de nettoyage aqueuse
présentant un pH compris entre 6,5 et 7,5, plus particulièrement autour
de 7. De cette façon, le pH de la composition est particulièrement
approprié à l'action du composant enzymatique, en particulier de la
laccase. En outre, il est prévu selon l'invention d'augmenter le pH dans
une phase ultérieure d'application de la composition selon l'invention de
manière à obtenir un pH alcalin particulièrement approprié à l'élimination
du biofilm comme mentionné ci-dessus tout en gardant l'optimum
d'efficacité du composant enzymatique.
Alternativement, ladite composition peut être sous forme
solide puis être dissoute dans un solvant avant utilisation avant d'être
diluée dans une phase aqueuse afin d'obtenir une solution de nettoyage
dont le pH est compris approximativement entre 6,5 et 7,5.
De préférence, ledit au moins un composant enzymatique
comprend une proportion en protéase(s) comprise entre 10 et 50%, une
proportion en laccase(s) comprise entre 5 et 35% et une proportion de
polysaccharidase(s) comprise entre 5 et 20% en poids par rapport au
poids du composant enzymatique, un excipient ou solvant conventionnel
étant éventuellement ajouté pour atteindre 100% en poids du composant
enzymatique, par exemple un alcool.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le
composant enzymatique peut contenir entre 1 et 10 protéases,
préférentiellement entre 1 et 5 protéases, plus préférentiellement peut
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contenir 2, 3, 4 ou 5 protéases.
Des exemples non limitatifs d'enzymes protéases
appartenant à la classe EC 3.4 et susceptibles d'être utilisées dans
l'invention sont les amino-peptidases (EC 3.4.11), les dipeptidases (EC
3.4.13), les dipeptidyl-peptidases et tripeptidyl-peptidases (EC 3.4.14),
les peptidyl-dipeptidases (EC 3.4.15), les sérine carboxypeptidases (EC
3.4.16), les métallo carboxypeptidases (EC 3.4.17), les cystéine
carboxypeptidases (EC 3.4.18), les oméga peptidases (EC 3.4.19), les
sérine endopeptidases (EC 3.4.21), les cystéine endopeptidases (EC
3.4.22), les aspartique endopeptidases (EC 3.4.23), les métallo
endopeptidases (EC 3.4.24), les thréonine endopeptidases ((EC 3.4.25),
et les endopeptidases appartenant à la classe EC 3.4.99.
Préférentiellement, les protéases appartiennent à la classe
EC 3.4.21. Les protéases sont disponibles commercialement et sous
différentes formes incluant les poudres, les granulés, les suspensions,
les solutions liquides.
Les laccases utilisées dans l'invention appartiennent à la
classe EC 1.10.3.2. Les laccases sont des enzymes contenant du cuivre
et ont pour fonction d'oxyder un substrat en présence d'oxygène. Plus
spécifiquement, les laccases sont des oxydoréductases qui fonctionnent
avec l'oxygène moléculaire comme accepteur d'électrons.
La au moins une polysaccharidase utilisée dans l'invention
est une enzyme ayant pour fonction de briser des liaisons au sein des
polysaccharides. Préférentiellement, la au moins une polysaccharidase
peut être une alpha-amylase, cellulase, hemi-cellulase, glucosidase,
beta-glucanase ou pectinase.
Plus préférentiellement, la au moins une polysaccharidase
peut être une alpha-amylase appartenant à la classe EC 3.2.1.1, ayant
pour fonction de briser des liens (1-4)-alpha-glycosidiques dans des
polysaccharides contenant trois unités ou plus alpha-(1-4)-D-glucose.
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Préférentiellement, le composant enzymatique peut
comprendre une proportion de laccase(s) d'approximativement de 30%,
une proportion de protéase(s) d'approximativement 30%, une proportion
en alpha-amylase(s) d'approximativement 10% en poids par rapport au
poids du composant enzymatique, un excipient ou un solvant
conventionnel étant éventuellement ajouté pour atteindre 100% en poids
du composant enzymatique.
Selon un autre mode de réalisation préféré, si le composant
enzymatique comprend 2 protéases, la proportion de laccase(s) peut
être d'approximativement 30%, la proportion totale de protéases
d'approximativement 30%, la proportion d'alpha-amylase(s)
d'approximativement 10% en poids par rapport au poids du composant
enzymatique, un excipient ou solvant conventionnel étant
éventuellement ajouté pour atteindre 100% en poids du composant
enzymatique.
Selon un autre mode de réalisation préféré, si le composant
enzymatique comprend 2 protéases, la proportion en laccase peut être
de 30%, la proportion totale en protéases de 30%, la proportion en
alpha-amylase de 10% en poids par rapport au poids du composant
enzymatique, un excipient ou solvant conventionnel étant
éventuellement ajouté pour atteindre 100% en poids du composant
enzymatique.
Par exemple, le rapport entre chaque protéases peut être
compris entre 1:2 et 2:1, préférentiellement le rapport entre chaque
protéases peut être de 1:1. Les enzymes présentes dans le composant
enzymatique ont une action complémentaire sur le biofilm. Par exemple,
la laccase présente une grande efficacité sur les souillures non
attaquées par l'alpha-amylase ou les protéases.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le
composant enzymatique peut être une solution ou sous forme solide.
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Préférentiellement, le composant enzymatique est une
solution dont le pH peut être compris entre 8 et 10. Préférentiellement, le
composant enzymatique est une solution aqueuse dont le pH peut être
compris entre 8,5 et 9,5; plus préférentiellement le pH peut être
approximativement de 9,0.
Alternativement, le composant enzymatique peut être sous
forme solide tel que par exemple sous forme d'un lyophilisat, de
poudres, de granulés ou sous tout autre forme permettant la
solubilisation dudit composant dans un solvant, puis il sera
ultérieurement dissous dans un solvant. Le solvant peut être de l'eau ou
une solution aqueuse, acide, alcoolique, basique, tamponnée ou neutre.
Le composant enzymatique solubilisé pourra alors dans ce cas être
ultérieurement dilué dans une solution aqueuse contenant
éventuellement un ou plusieurs composés tels que par exemple des
détergents pour former la solution de nettoyage.
Dans une forme de réalisation avantageuse selon
l'invention, ledit au moins un composant détergent comprend une
proportion d'agent séquestrant comprise entre 1 et 10% en poids par
rapport au poids total du composant détergent, ce qui représente un
optimum entre efficacité, stabilité et coût.
L'agent séquestrant est une substance chimique ayant la
capacité à former des complexes avec des ions minéraux qu'il fixe sous
une forme empêchant leur précipitation par les réactions habituelles. A
titre d'exemple, l'agent séquestrant peut être l'acide éthylène-diamine-
tétraacétique, le glucono-delta-lactone, le gluconate de sodium, le
gluconate de potassium, le gluconate de calcium, l'acide citrique, l'acide
phosphorique, l'acide tartrique, l'acétate de sodium, le sorbitol, un
composé comportant un atome de phosphore. Préférentiellement, l'agent
séquestrant peut être un oxyde de phosphore tel qu'un phosphonate, un
phosphinate ou un phosphate ou leur mélange, ou un sel de celui-ci, une
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amine ou un oxyde d'amine portant au moins, dans sa structure, un
groupement fonctionnel phosphine, oxyde de phosphine, phophinite,
phosphonite, phosphite, phosphonate, phosphinate ou phosphate, seul
ou en combinaison, ou un sel de ceux-ci.
5 Plus préférentiellement l'agent séquestrant peut être un
phosphonate ou un sel de celui-ci, une amine ou un oxyde d'amine
comportant au moins, dans sa structure, un groupement fonctionnel
phosphine, oxyde de phosphine, phosphinite, phosphonite, phosphite,
phosphonate, phosphinate ou phosphate, seul ou en combinaison ou un
10 sel de ceux-ci. A titre d'exemple non limitatif, le phosphonate peut
être
de formule générale R1(R20)(R30)P=0 dans lequel R1, R2 et R3
représentent indépendamment un groupe hydrogène, alkyle, alkyle
substitué, alkyle-amino substitué ou non, aminoalkyl substitué ou non,
aryle ou aryle substitué. A titre d'exemple non limitatif, l'amine ou l'oxyde
d'amine peuvent comporter un, deux ou trois substituant(s) de formule
générale CR4R5W dans laquelle R4 et R5 représentent indépendamment
l'un de l'autre un groupe hydrogène, alkyle, alkyle substitué, alkyle-
amino substitué ou non, aminoalkyl substitué ou non, aryle ou aryle
substitué, et W représente un groupe phosphonate, phosphinate ou
phosphate. L'agent séquestrant peut être sous la forme d'un sel de
sodium, calcium, lithium, magnésium ou potassium ; préférentiellement,
l'agent séquestrant peut être sous la forme d'un sel de sodium, calcium,
ou potassium.
Dans une forme de réalisation avantageuse selon
l'invention, la proportion d'agent simultanément mouillant et dispersant
comprise entre 15 et 50% en poids par rapport au poids total du
composant détergent, de préférence de 20 à 30 %, ce qui représente un
compromis entre efficacité, stabilité et prix.
Un agent simultanément mouillant et dispersant est une
substance chimique amphiphile, qui modifie la tension superficielle entre
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deux surfaces qui a pour avantage de favoriser l'étalement d'un liquide
sur un solide (anionique, cationique, non-ionique ou zwitterionique) tout
en présentant un caractère dispersant, c'est-à-dire ayant la capacité
d'améliorer la séparation des particules d'une suspension afin de
prévenir l'agglutination, l'agrégation et/ou la décantation.
Avantageusement, ledit agent simultanément mouillant et
dispersant est choisi dans le groupe constitué des agents mouillants non
moussants à chaud et comprend de préférence un alkylglucoside en Cg à
010, de préférence en Cg, issu de matière premières renouvelables et
éventuellement un alcool éthoxylé.
L'agent mouillant et dispersant est de préférence une
préparation comportant un alcool éthoxylé et un alkylpolyglucoside (en
particulier un octyl glucoside) issu de matières premières renouvelables.
Comme on peut le constater, cet agent simultanément mouillant et
dispersant permet des performances tensioactives et émulsionnantes
particulièrement élevées sans déstabiliser les enzymes présentes dans
la composition selon l'invention puisque cet agent simultanément
mouillant et dispersant est un agent anionique qui présente une charge
globale nette faible de façon à ne pas interférer avec les échanges
d'ions entre les enzymes et substrats de ces dernières. Les agents
simultanément mouillants et dispersants issus des matières premières
renouvelables sont particulièrement appropriés et agissent
synergiquement avec les enzymes en ne les déstabilisant pas par
rapport aux tensioactifs courant d'origine pétrolière (à plus longue
chaîne carbonnée). En outre, selon la présente invention, l'agent
simultanément mouillant et dispersant peut être anionique, cationique ou
non ionique, mais dans tous les cas, il présentera une charge globale
ionique faible pour être compatible et ne pas déstabiliser les enzymes.
De plus, l'agent simultanément mouillant et dispersant
selon l'invention comprenant un alcool éthoxylé et un alkylpolyglucoside
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est particulièrement polyvalent en ce qu'il est compatible avec une large
gamme de pH, avec la présence de nombreux acides ou bases et de
builders, tout en étant non moussant à chaud.
Le fait que l'agent simultanément mouillant et dispersant
soit un agent mouillant, non moussant à chaud permet une utilisation
polyvalente, que ce soit dans des cuves et surfaces ou dans les
installations comportant de nombreuses tubulures et tuyaux, évitant de
cette façon la formation de mousse, sans altérer, bien au contraire les
performances tensioactives et/ou émulsionnantes de la composition
selon l'invention. En outre, comme on l'a déjà mentionné ci-avant, la
présence d'un agent simultanément dispersant et mouillant limite l'apport
de substance polymère dans les installations, par exemple, dans les
installations de circulation ou traitement d'eau. Il est bien entendu que
l'apport d'une solution détergente efficace sans génération de mousse
limite les étapes de rinçage, ce qui est particulièrement souhaitable,
surtout dans les installations à tubulures ou tuyaux multiples.
D'autres formes de réalisation de la composition selon
l'invention sont mentionnées dans les revendications annexées.
L'invention a aussi pour objet un procédé pour l'élimination
des biofilms présents sur un substrat caractérisée en ce qu'elle comporte
les étapes suivantes de :
- a) mise à disposition d'un composant détergent comprenant un agent
séquestrant ainsi qu'un agent mouillant et un agent dispersant et d'un
composant enzymatique contenant au moins une protéase, au moins
une laccase, et au moins une polysaccharidase,
- b) mise en solution du composant détergent dans une phase aqueuse,
- c) mise en solution du composant enzymatique dans la solution formée
à l'étape b) pour former la solution de ladite composition selon l'invention
ou b') mise en solution du composant enzymatique dans une phase
aqueuse,
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- c') mise en solution du composant détergent dans la solution formée à
l'étape b') pour former la solution de ladite composition selon l'invention
- d) application de la solution de ladite la composition formée à l'étape
c)
ou c') sur le substrat pendant une période de temps prédéterminées, en
particulier comprise entre 15 minutes et 4 heures.
Par les termes mise en solution, on entend au sens de la présente
invention soit une mise en solution d'un composé solide dans une phase
liquide, soit une dilution d'un composé liquide dans une phase liquide
dans lequel le composé liquide est miscible.
Alternativement, les étapes b) et c), ou b') et c'), peuvent
être effectuées de manière simultanée pour former une solution de ladite
composition selon l'invention.
Préférentiellement, la méthode comporte les étapes
suivantes de :
a) mise à disposition d'un composant détergent contenant un agent
séquestrant ainsi qu'un agent mouillant et un agent dispersant; et d'un
composant enzymatique contenant au moins une protéase, au moins
une laccase, et au moins une polysaccharidase,
b) mise en solution du composant détergent dans l'eau,
c) mise en solution du composant enzymatique dans la solution formée à
l'étape b) pour former la solution de ladite composition selon l'invention,
d) application de la solution de ladite la composition formée à l'étape c)
sur le substrat pendant une période de temps prédéterminée, de
préférence comprise entre 15 minutes et 4 heures.
Avantageusement, le pH de la solution de ladite composition
formée à l'étape c) ou c') est compris entre 8 et 11, préférentiellement
compris approximativement entre 9,5 et 10,5 et plus préférentiellement
compris entre 9,5 et 10.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le pH de
la solution formée lors de l'étape b) est compris approximativement entre
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11,0 et 14,0, préférentiellement compris approximativement entre 12,0 et
14,0 et plus préférentiellement compris entre 12,8 et 13,8.
Dans une variante selon l'invention, le pH de la solution de
ladite composition formée à l'étape c) ou c') est compris entre 6,5 et 7,5 et
une solution basique est ajoutée après ladite application d) de la solution de
ladite composition sur ledit substrat pendant ladite période de temps
prédéterminée, de façon à effectuer un saut de pH jusqu'à environ 8 à 9.
De cette façon, lorsque la composition selon l'invention est
appliquée sur le substrat, le pH régnant est compris entre 6,5 et 7,5, ce qui
permet à la laccase d'être dans des conditions optimales d'activité. Ensuite,
le fait d'effectuer un saut de pH jusqu'à environ 8 à 9 permet aux autres
enzymes d'avoir à leur tour leur efficacité optimale. De cette façon, elles
auront aussi à leur tour des conditions d'activité optimales, ce qui a pour
résultat que le biofilm sera éliminé de manière particulièrement avantageuse
puisque chaque enzyme présente aura des conditions optimales pour
effectuer son action et le biofilm sera détaché et éliminé complètement. En
outre, puisque les composants basiques sont généralement utilisés dans les
installations dans lesquelles un biofilm peut se former, il n'y a pas d'ajout
de
composant exogène qui pourrait être problématique pour valider l'étape de
nettoyage. Par exemple, pour sanitiser une installation, il est courant
d'appliquer de la soude et donc, l'apport de substance de nature différente
est limité dans le cadre de la présente invention.
De préférence, la température de la solution du composant
détergent formée lors de l'étape b) ou c') peut être comprise entre
approximativement 35 C et 50 C.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la
composition selon l'invention est appliquée sur un substrat couvert d'un
biofilm pendant approximativement 30 à 50 minutes, ce qui représente un
temps d'application relativement court pour une telle efficacité.
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Préférentiellement, le composant détergent comprend une
proportion de séquestrant comprise entre 1 et 10%, une proportion de
dispersant simultanément mouillant comprise entre 15 et 50%, un excipient
conventionnel comme de l'eau est éventuellement ajouté pour atteindre les
5 100% en poids du composant détergent.
Préférentiellement, le composant enzymatique comprend une
proportion en protéase(s) comprise entre 10 et 50%, une proportion de
laccase(s) comprise entre 5 et 35% et une proportion de
polysaccharidase(s) comprise entre 5 et 20%. Plus préférentiellement, la au
10 moins une polysaccharidase peut être une alpha-amylase. Un excipient ou
solvant conventionnel est éventuellement ajouté pour atteindre 100% en
poids du composant enzymatique, comme par exemple un alcool.
La présente méthode permet d'éliminer efficacement la
totalité ou la quasi-totalité du biofilm, ne laissant alors sur le substrat
que
15 des cellules isolées sans protection de la matrice. L'action postérieure
d'un
biocide permet de détruire la souche microbienne. Une phase de
désinfection ultérieure sera donc beaucoup plus efficace suite à l'application
d'une solution de la composition selon l'invention que suite à l'application
d'une phase de nettoyage conventionnelle ne permettant pas cette
élimination totale de la matrice.
Ainsi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la
méthode comprend en outre une étape ultérieure d'application d'un biocide.
Par exemple, les biocides peuvent être, de manière non limitative, de type
oxydant tel que l'acide peracétique, le peroxyde d'hydrogène, le
monopersulfate de potassium, l'hypochlorite de soude. Selon l'invention,
l'application d'un biocide doit être postérieure à l'application de la
composition selon l'invention pour éviter la désactivation des enzymes
présentes dans ladite composition par les biocides.
D'autres formes de réalisation du procédé selon l'invention
sont mentionnées dans les revendications annexées.
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L'invention se rapporte aussi à une utilisation d'une
composition selon l'invention pour l'élimination de biofilms présents sur
un substrat, en particulier pour le nettoyage des sols et des surfaces,
pour le nettoyage en place ou le trempage. La composition peut s'utiliser
dans des installations fermées ou par trempage. Le nettoyage par
trempage est notamment utilisé pour nettoyer du matériel chirurgical, les
lentilles de contact. La composition selon l'invention peut être utilisée
pour le nettoyage de circuit d'eau technique et de process, les systèmes
d'échangeurs de conditionnement d'air ou dans l'industrie alimentaire.
D'autres formes d'utilisation selon l'invention sont
mentionnées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte également à une trousse
pour l'élimination de biofilms présents sur un substrat caractérisée en ce
qu'elle comprend
- au moins un échantillon de composant détergent en solution ou sous
forme solide, contenant un agent séquestrant, un agent simultanément
mouillant et dispersant, et
- au moins un échantillon de composant enzymatique en solution ou
sous forme solide contenant au moins une protéase, au moins une
laccase et au moins une polysaccharidase.
Préférentiellement, la au moins une polysaccharidase peut
être une alpha-amylase.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention,
l'échantillon du composant enzymatique peut contenir entre 1 et 10
protéases, préférentiellement entre 1 et 5 protéases, plus
préférentiellement peut contenir 2, 3, 4 ou 5 protéases.
Selon un autre mode de réalisation préféré, l'échantillon du
composant enzymatique contenu dans la trousse peut comprendre 2
protéases. Préférentiellement, si l'échantillon du composant enzymatique
comprend 2 protéases, la proportion en laccase peut être
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approximativement de 30%, la proportion totale en protéases peut être
approximativement de 30%, la proportion en alpha-amylase peut être
approximativement de 10% en poids par rapport au poids total de
l'échantillon du composant enzymatique, un excipient ou sovlant
conventionnel étant ajouté pour atteindre 100% en poids du composant
enzymatique.
Préférentiellement, si l'échantillon du composant
enzymatique comprend 2 protéases, la proportion en laccase(s) peut
être de 30%, la proportion totale en protéases peut être de 30%, la
proportion en alpha-amylase(s) peut être de 10%. Par exemple, le
rapport entre chaque protéase peut être compris entre 1:2 et 2:1,
préférentiellement le rapport entre chaque protéase peut être de 1:1.
Si l'échantillon du composant enzymatique contenu dans la
trousse est une solution, le pH de celle-ci peut être compris entre 8 et
10, préférentiellement, le pH peut être compris entre 8,5 et 9,5, plus
préférentiellement le pH peut être approximativement de 9,0.
Préférentiellement, l'échantillon du composant détergent
comprend une proportion de séquestrant comprise approximativement
entre 1 et 10%, une proportion d'agent simultanément mouillant et
dispersant de 15 à 50% en poids par rapport au poids total du
composant détergent, les 100% étant éventuellement atteint à l'aide d'un
excipient conventionnel, comme par exemple de l'eau.
A titre d'exemple, l'agent séquestrant peut être l'acide
éthylène-diamine-tétraacétique, le glucono-delta-lactone, le gluconate de
sodium, le gluconate de potassium, le gluconate de calcium, l'acide
citrique, l'acide phosphorique, l'acide tartrique, l'acétate de sodium, le
sorbitol, un composé comportant un atome de phosphore.
Préférentiellement, l'agent séquestrant peut être un oxyde de phosphore
tel que phosphonate, phosphinate ou phosphate, ou un sel de celui-ci,
une amine ou un oxyde d'amine, ou un sel de ceux-ci portant au moins,
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dans sa structure, un groupement fonctionnel phosphine, oxyde de
phosphine, phophinite, phosphonite, phosphite, phosphonate,
phosphinate ou phosphate.
Plus préférentiellement, l'agent séquestrant peut être un
phosphonate ou un sel de celui-ci, une amine ou un oxyde d'amine, ou
un sel de ceux-ci, comportant au moins, dans sa structure, un
groupement fonctionnel phosphine, oxyde de phosphine, phosphinite,
phosphonite, phosphite, phosphonate, phosphinate ou phosphate. A titre
d'exemple non limitatif, le phosphonate peut être de formule générale
R1(R20)(R30)P=0 dans lequel R1, R2 et R3 sont indépendamment
sélectionnés parmi le groupe hydrogène, alkyle, alkyle substitué, alkyle-
amino substitué ou non, aminoalkyl substitué ou non, aryle ou aryle
substitué. A titre d'exemple non limitatif, l'amine ou l'oxyde d'amine
peuvent comporter un, deux ou trois substituant(s) de formule générale
CR4R5W dans laquelle R4 et R5 sont indépendamment sélectionnés
parmi le groupe hydrogène, alkyle, alkyle substitué, alkyle-amino
substitué ou non, aminoalkyl substitué ou non, aryle ou aryle substitué,
et W est sélectionné parmi le groupe phosphonate, phosphinate ou
phosphate. L'agent séquestrant peut être sous la forme d'un sel de
sodium, calcium, lithium, magnésium ou potassium ; préférentiellement,
l'agent séquestrant peut être sous la forme d'un sel de sodium, calcium,
ou potassium.
Avantageusement, ledit agent simultanément mouillant et
dispersant est choisi dans le groupe constitué des agents mouillants non
moussants à chaud et comprend de préférence un alkylglucoside Cg à
010, de préférence en Cg, issu de matière premières renouvelables et
éventuellement un alcool éthoxylé.
L'agent mouillant et dispersant est de préférence une
préparation comportant un alcool éthoxylé et un alkylpolyglucoside (en
particulier un octyl glucoside) issu de matières premières renouvelables.
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Comme on peut le constater, cet agent simultanément mouillant et
dispersant permet des performances tensioactives et émulsionnantes
particulièrement élevées sans déstabiliser les enzymes présentes dans
la composition selon l'invention puisque cet agent simultanément
mouillant et dispersant est un agent anionique qui présente une charge
globale nette faible de façon à ne pas interférer avec les échanges
d'ions entre les enzymes et substrats de ces dernières. Les agents
simultanément mouillants et dispersants issus des matières premières
renouvelables sont particulièrement appropriés et agissent
synergiquement avec les enzymes en ne les déstabilisant pas par
rapport aux tensioactifs courant d'origine pétrolière (à plus longue
chaîne carbonnée). En outre, selon la présente invention, l'agent
simultanément mouillant et dispersant peut être anionique, cationique ou
non ionique, mais dans tous les cas, il présentera une charge globale
ionique faible pour être compatible et ne pas déstabiliser les enzymes.
De plus, l'agent simultanément mouillant et dispersant
selon l'invention comprenant un alcool éthoxylé et un alkylpolyglucoside
est particulièrement polyvalent en ce qu'il est compatible avec une large
gamme de pH, avec la présence de nombreux acides ou bases et de
builders, tout en étant non moussant à chaud.
Avantageusement, dans la trousse selon l'invention
l'échantillon du composant enzymatique est une solution aqueuse dont
le pH est compris entre 8 et 10.
Si l'échantillon du composant détergent est une solution, le
pH de celle-ci est compris entre 8,5 et 14,0.
Si la solution de nettoyage formée par dilution dans une
phase aqueuse du composant détergent et du composant enzymatique
doit avoir un pH entre 6,5 et 7,5, alors le composant détergent, s'il est
sous la forme d'une solution présentera un pH compris entre 9 et 10. La
mise en solution dans la phase aqueuse des deux composés, par
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exemple grâce à la présence de tampons dans l'un ou l'autre composant
ou à l'effet de dilution aura pour effet de diminuer le pH de la solution de
nettoyage pour qu'il soit optimal au fonctionnement des laccases.
Si la solution de nettoyage formée par dilution dans une
5 phase aqueuse du composant détergent et du composant enzymatique
doit avoir un pH d'environ 10, alors le composant détergent, s'il est sous
la forme d'une solution présentera un pH préférentiellement compris
entre 12,0 et 14,0, plus préférentiellement entre 12,8 et 13,8. La mise en
solution dans la phase aqueuse des deux composésaura pour effet
10 d'amener le pH de la solution de nettoyage à environ 9,5 à 10,5. Par
exemple, les composant peuvent contenir en outre des composés alcalin
à cet effet.
De préférence, la trousse selon l'invention comprend en
outre un biocide.
15 D'autres formes de réalisation de la trousse selon
l'invention sont mentionnées dans les revendications annexées.
D'autres caractéristiques, détails et avantages de
l'invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre non
limitatif et en faisant référence aux dessins annexés et aux exemples.
20 La figure 1 illustre les résultats de tests comparant
l'efficacité de la composition suivant l'invention avec de la soude
La figure 2 illustre les résultats de tests comparant
l'efficacité de la composition suivant l'invention avec d'autres
compositions détergentes
La figure 3 illustre les résultats de tests comparant
l'efficacité de la composition suivant l'invention avec d'autres
compositions détergentes en effectuant un saut de pH.
Exemple 1.-
Un essai permettant de comparer l'efficacité de la
composition suivant l'invention à un rinçage à l'eau et au NaOH a été
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effectué.
Des biofilms sont développés sur des membranes à
osmose inverse utilisée dans des installations de dessalement.. Un
inoculum bactérien (Pseudomonas aeruginosa) est préparé par culture
durant 16h dans un milieu TSB 10% (tryptone soy broth). Cette
préculture est diluée pour obtenir une densité optique (DO) de 0,05 à
600nm et 500 pl de cette solution ont été étalés sur chaque membrane.
Les coupons sont incubés durant 48h dans des boîtes de pétri
maintenues humides et placées en étuve à 30 C. Après 2 heures, la
solution bactérienne est remplacée par 500 pl de milieu frais, TSB 10%.
Après 24h, ce milieu de culture est renouvelé.
Les coupons sont ensuite nettoyés et sont placés dans les
solutions de nettoyage. Les membranes sont laissées à tremper dans les
solutions de nettoyage susdites pendant un temps total de 120 minutes à
200 rpm, à 35 C.
Les solutions de nettoyages sont les suivantes :
1. Eau
2. NaOH liquide à 0,5 %
3. Composition suivant l'invention à pH 7.
Les résultats de cet essai sont présentés au tableau 1 .-
Tableau 1.-
Solution 1 Solution 2 Solution 3
Etat visuel Des grands
Environ 50 % La plupart des
des sillons de des
sallisures sallisures présentes
membranes sallisures sont ont disparu à la surface de la
encore présents membrane ont
sur la disparu
membrane
Ces résultats sont également présentés à la figure 1 qui
illustre de gauche à droite la membrane après traitement à l'eau, au
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NaOH liquide et à la composition suivant l'invention à pH 7.
Comme on peut le voir, seule la composition suivant
l'invention permet une élimination substantielle du biofilm.
Exemple 2.-
Un essai permettant de comparer l'efficacité de la
composition suivant l'invention à d'autres composition détergentes a été
effectué. La procédure est identique à celle de l'exemple 1 à l'exception
des solutions de nettoyage qui sont les suivantes:
1. Composition contenant 3 agents différents, à savoir un agent
séquestrant, un agent mouillant, et un agent dispersant et un composant
enzymatique contenant au moins une laccase, une protéase et une
polysaccharidase.
2. Composition contenant deux agents différents à savoir un agent
séquestrant et un agent simultanément mouillant et dispersant et un
composant enzymatique similaire au point 1 à pH 7
3. Composition contenant deux agents différents à savoir un agent
séquestrant et un agent simultanément mouillant et dispersant et un
composant enzymatique similaire au point 1 à pH 10.
Les résultats sont présentés au tableau 2 et à la figure 2.
Tableau 2.-
Solution 1 Solution 2 Solution 3
Etat visuel quelques sillons Presque tous La plupart des
des de
sallisures les sillons des sallisures présentes
membranes sont encore sallisures ont à la
surface de la
présents sur la disparu membrane ont
membrane disparu
(25% par
rapport au
départ)
Ces résultats sont également présentés à la figure 2 qui
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illustre de gauche à droite la membrane après traitement par la solution
1, la solution 3 et la solution 2.
Comme on peut le voir, seule la composition suivant
l'invention à pH 7 ou 10 permet une élimination substantielle du biofilm.
Exemple 3.-
Des coupons en acier ont été traité par une composition
semblable à la composition 1 de l'exemple 2 et par une composition
suivant l'invention initialement à pH 7 avec un saut de pH à 10 après 15
minutes suivnat le protocole ci-dessous.
Les biofilms sont développés sur des coupons en inox
préalablement lavés et stérélisés. Un inoculum bactérien (Pseudomonas
aeruginosa) est préparé par culture durant 16h dans un milieu TSB 10%
(tryptone soy broth). Cette préculture est diluée pour obtenir une densité
optique (DO) de 0,05 à 600nm et 500 pl de cette solution ont été étalés
sur chaque coupon. Les coupons sont incubés durant 48h dans des
boîtes de pétri maintenues humides et placées en étuve à 30 C. Après 2
heures, la solution bactérienne est remplacée par 500 pl de milieu frais,
TSB 10%. Après 24h, ce milieu de culture est renouvelé.
Les coupons ont ensuite été placés dans des tubes à essai
contenant 10 ml d'une solution TSB + 0,5% Tween 80 pour le comptage
des bactéries. Les tubes à essai ont été incubés pendant 5 minutes sur
la table avant d'être soniques pendant 2 minutes trente et vortexés
pendant 30 secondes. Les étapes d'incubation, sonication et vortex ont
été répétées.
Les coupons ont ensuite été récupérés et le milieu
comprenant la solution TSB + 0,5 % de tween a fait l'objet de dilutions
sérielles en utilisant de l'eau peptonée (Eau peptonée exempte d'indole:
préparer 10 ml d'une dissolution à 15g/I. Puis diluer 1m1 de cette solution
dans 1 litre d'eau stérile) et a ensuite été étalé sur boîte de pétri et
incubé à 30 C pendant une nuit avant comptage.
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Le biofilm a également été coloré de la manière suivante:
les coupons sont égouttés et plongés dans la solution de coloration
durant 10 minutes sélectif pour les protéines de la matrice du biofilm.
Ensuite, les coupons sont plongés dans les différentes solutions de
nettoyage 1 et 2 mentionnées ci-dessous pendant deux fois 10 minutes
(les solutions de nettoyage sont remplacées entre les deux étrapes de
nettoyage).avant de sécher à l'air libre.
Composition de nettoyage:
1. Composition contenant 3 agents différents, à savoir un agent
séquestrant, un agent mouillant, et un agent dispersant et un composant
enzymatique contenant au moins une laccase, une protéase et une
polysaccharidase.
2. Composition contenant deux agents différents à savoir un agent
séquestrant et un agent simultanément mouillant et dispersant et un
composant enzymatique similaire au point 1 à pH 7 et ensuite à pH 10
Résultats :
Dans 1/3 des boîtes de Petri (4 sur 12) correspondant aux coupons
nettoyés avec la composition n 1, des bactéries ont poussé (moyenne>
109 CFU).
Les bactéries ne se sont pas développées sur les boîtes de Pétri
correspondant aux coupons nettoyés avec la composition selon
l'invention.
La figure 3 illustre les résultats des colorations des biofilms.
La figure 3 A illustre les témoins avant nettoyage tandis que la figure B
illustre les coupons d'acier après nettoyage par la solutions 1 à différents
pH et la figure C illustre les coupons d'acier après nettoyage par la
composition suivant l'invention.. Comme on peut le voir, les coupons
après le nettoyage avec la composition suivant l'invention présentent un
aspect plus propre que ceux nettoyés avec la composition n 1, et ne
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présentent pas de bactéries accrochées à leur surfaces alors que du
biofilm est détecté pour 1/3 des coupons nettoyés avec la composition
n 1.
D'autres caractéristiques, détails et avantages de
5 l'invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre
non
limitatif et en faisant référence aux dessins annexés et aux exemples.
