Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
1
Procédé d'immobilisation de ligands nucléiques
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention se rapporte au domaine de la purification de substances d'intérêt
à
l'aide de supports d'affinité utilisables à l'échelle industrielle, en
particulier pour
l'obtention de substances purifiées d'intérêt médical.
ART ANTERIEUR
Il existe un besoin récurrent de supports pour chromatographie d'affinité qui
permettent l'enrichissement sélectif d'un produit de départ en une substance
d'intérêt.
Dans le domaine médical, des supports de chromatographie d'affinité sont
utilisés pour
purifier des substances ultérieurement utilisées comme principes actifs de
médicament.
Principalement, sont utilisés des supports de chromatographie d'immuno-
affinité sur
lesquels sont immobilisés des anticorps. Les supports d'inununo-affinité sont
adaptés à
une purification de substances d'intérêt médical à l'échelle industrielle car
ils possèdent
une bonne capacité de rétention et une sélectivité élevée vis-à-vis de leur
molécule cible.
De tels supports d'immuno-affinité peuvent être régénérés à l'issue des
procédés de
purification sans altération substantielle de leur capacité de rétention ou de
leur sélectivité,
ce qui permet leur utilisation sur une longue période de temps. De plus, du
fait de leur
capacité de rétention élevée, les supports d'irnmuno-affinité permettent la
purification de
grandes quantités de la substance cible, ce qui rend leur utilisation
compatible avec les
exigences techniques et économiques de la fabrication des médicaments. Les
supports
d'imrnuno-affinité présentent toutefois des inconvénients lorsqu'ils sont
utilisés pour la
purification de substances d'intérêt médical, en raison notamment (0 du
relarguage de
fragments protéiques immunogènes dérivés des anticorps immobilisés durant la
phase
d'élution de la substance cible préalablement retenue et (ii) de la fragilité
des anticorps
vis-à-vis des conditions d'élution et des traitements périodiques de
sanitisation anti-
bactérienne et anti-virale.
Diverses études ont été entreprises afin de trouver des alternatives aux
supports d'immuno-affinité connus. Un nombre limité d'études concerne
l'utilisation des
aptamères en tant que ligands d'affinité pour la purification de substances
cibles, y
compris de protéines cibles. On pourra ainsi citer à titre d'exemple les
travaux de Romig
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
2
et al. (I Chromatogra. B Biomed Sei Appl, 1999, 731(2) :275-84) qui concernent
la
purification de la L-sélectine sur un support de chromatographie sur lequel
des aptamères
d'ADN anti-L-sélectine ont été immobilisés via le couple streptavidine-
biotine.
11 est connu de longue date que l'affinité et la spécificité des aptamères
pour
leur molécule cible peuvent être aussi élevées que celles des anticorps. Par
ailleurs, les
aptamères pouvant être obtenus par synthèse chimique, leur coût de fabrication
est
beaucoup plus faible que celui des anticorps. Néanmoins, l'utilisation de
supports
d'affinité d'aptamères pour la purification de substances cibles est à l'heure
actuelle
marginale en dépit des nombreux avantages économiques et techniques que
présentent les
aptamères en tant que ligands d'affinité. A la connaissance de la
Demanderesse, à l'heure
actuelle, aucun procédé industriel de purification d'une substance cible, y
compris d'une
protéine cible, ne comprend une étape basée sur l'utilisation d'un support
d'affinité
d' aptamères.
Une raison qui peut être avancée pour expliquer ce défaut d'utilisation des
aptamères dans les procédés de purification à l'échelle industrielle est la
difficulté à
obtenir des supports d'affinité sur lesquels sont fixés de manière stable et
quantitative les
aptamères.
La principale technique d'immobilisation des aptamères décrite dans l'état de
la technique est basée sur l'utilisation du couple biotine-streptavidine ou
biotine-avidine.
Cette technique tire parti de la sélectivité et de la forte affinité de la
biotine pour son
ligand avidine ou streptavidine ainsi que de la stabilité du complexe non-
covalent résultant
de leur association. Ce type de support d'affinité présente toutefois des
limitations
techniques résultant du caractère protéique des agents de couplage utilisés et
du caractère
non-covalent de la liaison formée entre le support et les aptamères. En effet,
la biotine et
l'avidine ou streptavidine sont sensibles aux traitements susceptibles
d'induire une
dénaturation protéique Par ailleurs, Le complexe biotine/streptavidine se
dissocie à faible
température, notamment dans des solutions aqueuses non ioniques ou à faible
concentration saline. Pour ces différentes raisons, les supports d'affinité
sur lesquels des
aptamères nucléiques immobilisés en tant que ligands par l'intermédiaire du
complexe
biotine/streptavidine ne sont pas adaptés à une utilisation dans des procédés
de
purification, en particulier industriels, pour lesquels la possibilité de
régénérer et de
sanitiser les supports d'affinité entre chaque cycle de purification est
primordiale.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
3
L'état de la technique décrit également plusieurs techniques permettant le
greffage covalent d'acides nucléiques sur des supports solides,
essentiellement dans
l'objectif de disposer de nouveaux outils destinés à la mise en oeuvre de
méthodes
analytiques. On a ainsi décrit le greffage d'aptamères nucléiques possédant un
groupe
amine réactif sur un support de sépharose activé par le bromure de cyanogène
(Madru et
al., 2009, Anal. Chem., Vol. 81: 7081-7086). On a aussi décrit le greffage
d'aptamères
ARNs oxydés par du periodate sur un support d'agarose activé par des groupes
dihydrazide d'acide adipique (Caputi et al., 1999, The EMBO Journal, Vol.
18(14) : 4060-
4067). On connait également des techniques de greffage d'aptamères nucléiques
par
l'inteimédiaire d'agents de couplage bi-fonctionnels comme le SIAB (Rehder et
al.,
Electrophoresis, Vol. 22(17) : 3759)
L'état de la technique divulgue également des techniques de couplage covalent
d'acides nucléiques, entre autres d'aptamères, sur des supports solides de
type silice ou
agarose comprenant des groupes acide carboxylique pré-activés par le N-
hydroxysuccinimide (NHS) (Goss et al., 1990, J Chromatogr, Vol. 508 : 279-287
; Larson
et al.,1992, Nucleic Acids research, Vol. 20(13) : 3525, Allerson et al.,
2003, RNA, Vol. 9
: 364-374). Ces techniques de couplage ont consisté en une application directe
des
techniques utilisées conventionnellement pour le couplage des protéines sur
des supports
solides.
Goss et al. (1990, J Chromatogr, Vol. 508 : 279-287) ont ainsi décrit le
greffage d'un oligonucléotide 5'-aminoéthyl-poly(dT)18 sur un support
macroporeux de
silice pré-activé par le NHS dans un tampon de phosphate de sodium à pH=7,4.
Le
support d'affinité obtenu par Goss et al. présente un taux de greffage de
poly(dT)18 de 0,5
faim' par g de silice, ce qui est très faible compte tenu du nombre de
groupements
carboxylates par g de gel de silice (500 j_tmol par g de silice). En d'autres
termes,
seulement 0.1% des groupements carboxylates présents à la surface du support
sont liés
via une liaison amidique à un oligonucléotide poly(dT)18. Goss et al. sont
parvenus à
capturer une faible quantité d'un mélange d'acides nucléiques modèles de oligo-
(dA)12-18
avec le support d'affinité ainsi obtenu, puis à les éluer successivement dans
un tampon
d'élution à gradient de salinité.
Dans leur article publié en 2003, Allerson et al. (2003, RNA, Vol. 9 : 364-
374)
ont déploré que la chromatographie basée sur l'utilisation d'acides nucléiques
en tant que
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
4
ligand d'affinité est rarement utilisée pour la purification de protéine à
l'échelle
industrielle en raison de la faible capacité et/ou de la faible stabilité des
supports d'affinité
obtenus jusqu'à ce jour. A la connaissance de ces auteurs, les méthodes de
couplage
connues permettent tout au plus de n'immobiliser que quelques nanomoles d'ARN
par
millilitre de support. Selon un procédé analogue à celui de Goss et al.,
Allerson et al.
(2003, RNA, Vol. 9 : 364-374) ont décrit une tentative de couplage d'
aptamères
nucléiques, dirigés contre une protéine régulatrice 1RP1 ou IRP2, sur un
support d'agarose
pré-activé par le NHS. Allerson et al. se sont référés aux recommandations du
fabricant
du support d'agarose pour la mise en uvre de ce couplage et ont donc réalisé
la réaction
de couplage à un pH basique égal à 8,3. On précise que le fabricant
recommande, encore
aujourd'hui, de réaliser le couplage d'un ligand sur un support pré-activé par
le NHS à un
pH compris entre 6 et 9 (voir par exemple le document d'instructions n 71-
5000-14 AC
de GE Healthcare concernant le gel NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow)).
Allerson et
al. ont eux-mêmes constaté que la réaction de couplage d' aptamères d'ARN
présentant
une fonction amine primaire avec un support préactivé par le NHS fournit un
rendement
de couplage très faible, de l'ordre de 2%, quels que soient la durée de la
réaction de
couplage ou le type de solutions tampon utilisées, sans parvenir à surmonter
cet
inconvénient technique. Allerson et al. (2003, Supra) se sont finalement
détournés de cette
technique de greffage au profit d'une technique de greffage multi-étape
comprenant (i)
l'introduction de fonctions alkyl-thiol sur le support, (ii) l'introduction du
groupe 5'-
iodoacétamide en position 5' des aptamères par l'intermédiaire de l'agent
bifonetionnel
Sulfo-SIAB et (iii) une étape de couplage proprement dite entre les fonctions
thiol du
support et les groupes iodo-acétamide des aptamères de manière à créer une
liaison thiol.
De la même manière, Ruta et al. (2008, Anal. Bioanal. Chem., Vol. 390: 1051-
1057) ont
montré que la phase stationnaire résultant du greffage d' aptamères d'ADN
dirigés contre
la D-adénosine sur un support de silice activé par le NHS présentait une
capacité de
liaison pour la D-adénosine très faible.
11 existe donc un besoin dans l'état de la technique pour de nouveaux procédés
de préparation de supports d'affinité, notamment de supports d'affinité
adaptés à la
purification àl'échelle industrielle de substances d'intérêt médical.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
RESUIVIE DE L'INVENTION
La présente invention est relative à un procédé d'immobilisation d'acides
nucléiques comprenant au moins une fonction amine réactive, par greffage sur
un support
solide présentant à sa surface des groupes acides carboxyliques activés, ledit
procédé
5 comprenant une étape de couplage desdits acides nucléiques sur ledit
support solide activé
à un pH inférieur à 6.
Selon une définition alternative, la présente invention concerne un procédé
d'immobilisation des ligands nucléiques comprenant au moins une fonction amine
primaire sur un support solide comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides
carboxyliques activés,
b) fournir un ligand nucléique comprenant au moins une fonction amine
primaire, et
c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides
carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des
conditions de pH
inférieur à 6
étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent.
Dans un mode de réalisation préféré, les groupes acides carboxyliques activés
sont obtenus par réaction avec le N-hydroxysuecinirnide ou l'un de ses
dérivés.
L'invention concerne également une méthode de préparation d'un support
d'affinité comprenant la mise en oeuvre du procédé d'immobilisation telle que
défini ci-
dessus.
Un autre objet de l'invention est un support solide d'affinité pouvant être
obtenu par la méthode de préparation telle que définie précédemment ainsi que
son
utilisation dans des procédés de purification ou de détection d'une protéine
cible.
Un objet supplémentaire est un complexe résultant de l'interaction d'un ligand
nucléique et d'une molécule cible, ledit complexe étant formé à la surface
d'un support
solide tel que défini précédemment.
Enfin, la présente invention a également trait à un procédé de purification
d'un
ligand cible avec un support d'affinité, comprenant les étapes suivantes :
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
6
a) mettre en contact une composition à purifier comprenant un ligand cible
d'intérêt avec un support d'affinité tel que défini ci-dessus, afin de former
un complexe
entre (i) les acides nucléiques greffés sur ledit support et (ii) ledit ligand
cible et
b) libérer ledit ligand cible à partir du complexe formé à l'étape a) et
récupérer
ledit ligand cible purifié.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une
composition comprenant 100 tag de Facteur VII humain transgénique sur un
support solide
de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain.
Le pic n 1
correspond à une fraction de FVII humain non retenu sur le support d'affinité.
Le pic n 2
correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n 3
correspond au
FVII humain contenu dans l'éluant de régénération. En abscisse : le temps,
exprimé en
minutes. En ordonnées: l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à
la
longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 2 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une
composition comprenant 200 g de Facteur VII humain transgénique sur un
support solide
de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain.
Le pie n 2
correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n 3
correspond au
FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse : le temps,
exprimé en
minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité Optique à
la
longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 3 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une
composition comprenant 1000 tag de Facteur VII humain transgénique sur un
support
solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII
humain. Le
pic n 2 correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. Le pic n
3
correspond au FVII humain contenu dans l'effluent de régénération. En abscisse
: le
temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de
Densité
Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 4 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une
composition comprenant 200 !_ig de Facteur VII humain transgénique sur un
support solide
de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain,
ledit
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
7
support ayant été préalablement soumis à un traitement par une solution de
sanitisation
comprenant 0,5 M de NaOH. Le pic n 2 correspond au FVII humain contenu dans la
fraction d'élution. Le pic n 3 correspond au FVII humain contenu dans
l'effluent de
régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées :
l'absorbance,
exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 5 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une
composition comprenant 1000 j.ig de Facteur VII humain transgénique sur un
support
solide de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII
humain, ledit
support ayant été préalablement soumis à un traitement par une solution de
sanitisation
comprenant 0,5 M de NaOH. Le pic n 2 correspond au FVII humain contenu dans la
fraction d'élution. Le pic n 3 correspond au FVII humain contenu dans
l'effluent de
régénération. En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées :
l'absorbance,
exprimée en unités de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 6 illustre un profil ehrornatographique obtenu par passage d'une
composition comprenant 2,7 mg de Facteur Vil humain transgénique sur un
support solide
de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain
dans les
conditions de couplage suivantes : 48h, 5 C, pH 4,2. Le point n 1 (à environ
45 min)
indique le moment de l'injection de Facteur VII humain. Le pic n 2 (à environ
70 min)
correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. En abscisse : le
temps,
exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité
Optique
à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 7 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une
composition comprenant 2,7 mg de Facteur VII humain transgénique sur un
support solide
de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain
dans les
conditions de couplage suivantes : 48h, 5 C, pH 3,8. Le point n 1 (à environ
35 min)
indique le moment de l'injection de Facteur VII humain. Le pic n 2 (à environ
70 min)
correspond au FVII humain contenu dans la fraction d'élution. En abscisse : le
temps,
exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité
Optique
à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 8 illustre un profil chromatographique obtenu par passage d'une
composition comprenant 2,7 mg de Facteur VII humain transgénique sur un
support solide
de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain
dans les
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
8
conditions de couplage suivantes : 2h, 5 C, pH 4,2. Le point n 1 (à environ
35 min)
indique le moment de l'injection de Facteur VII humain. Le pic n 2 (à environ
70 min)
correspond au EVII humain contenu dans la fraction d'élution. En abscisse : le
temps,
exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée en unités de Densité
Optique
à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
La Figure 9 illustre un profil chromatop-aphique obtenu par passage d'une
composition comprenant 2,7 mg de Facteur VII humain transgénique sur un
support solide
de l'invention sur lequel ont été greffés des aptamères ADN anti-FVII humain
dans les
conditions de couplage suivantes : lh, TA (température ambiante), pH 4,2. Le
point n 1
(à environ 40 min) indique le moment de l'injection de Facteur VII humain. Le
pic n 2 (à
environ 75 min) correspond au EVII humain contenu dans la fraction d'élution.
En
abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées : l'absorbance, exprimée
en unités
de Densité Optique à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention fournit de nouveaux supports d'affinité comprenant des
acides nucléiques immobilisés, ainsi que des procédés pour les préparer.
Un premier objet de l'invention est un procédé d'immobilisation d'acides
nucléiques présentant au moins une fonction amine réactive sur un support
solide
présentant des fonctions acides carboxyliques activées.
Par acide nucléique ou ligand nucléique , on entend selon l'invention
un
composé comprenant un polymère de nucléotides ou polynucléotide, c'est-à-dire
de
ribonucléotides et/ou de désoxyribonucléotides éventuellement modifiés
chimiquement,
ayant une longueur allant de 5 à 10 000 nucléotides de longueur, de préférence
une
longueur allant de 5 à 1000 nucléotides de longueur, et encore mieux de 5 à
120
nucléotides de longueur. Un acide nucléique englobe classiquement les
polpibonucléotides (ARN) et les polydésoxyribonucléotides (ADN), le cas
échéant
chimiquement modifiés.
Un nucléotide est composé (i) d'un groupement phosphate (mono-, di- ou tri-)
ou un analogue, (ii) d'un sucre choisi parmi le ribose, le désoxyribose et
leurs analogues
chimiques et (iii) une base azotée choisie parmi l'adénine, la guanine, la
thymine, la
cytosine, l'uracile et leurs analogues chimiques. Au sens de l'invention, un
nucléotide peut
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
9
être modifié aussi bien sur sa partie osidique que sur sa base azotée par des
méthodes bien
connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, on pourra se référer au
brevet
US5958691 qui décrit des aptamères présentant une modification chimique au
niveau d'un
ou plusieurs nucléotides. Dans certains modes de réalisation, un acide
nucléique consiste
en un polymère de nucléotides, ribonucléotides ou désoxyribonucléotides.
Dans d'autres modes de réalisation, un acide nucléique consiste
essentiellement en un polymère de nucléotides et comprend une partie non-
nucléotidique,
ladite partie non-nucléotidique étant préférentiellement de longueur réduite,
comparée à la
longueur de la partie nucléotidique, par exemple une longueur linéaire
inférieure à la
longueur occupée par une chaîne de cinq nucléotides, ribonucléotides ou
désoxyribonueléotides.
Selon l'invention, un acide nucléique comprend une fonction amine réactive
lorsque ledit acide nucléique possède une fonction amine accessible au solvant
et apte à
réagir avec un groupe réactif approprié porté par une autre entité
moléculaire. Les
fonctions amines réactives englobent en particulier les amines primaires.
Cette amine
primaire est distincte des amines aromatiques portées par les noyaux puriques
ou
pyrimidiques des nuel éofi des.
De tels acides nucléiques sont bien connus dans l'état de la technique et sont
classiquement utilisés pour leur couplage chimique à des supports ou à des
substances
marqueurs. Classiquement, il s'agit d'acides nucléiques qui ont été modifiés
par l'ajout
d'une fonction amine à leur extrémité 3' ou à leur extrémité 5'. Le plus
fréquemment, la
fonction amine est ajoutée à l'extrémité 5' de l'acide nucléique où son
incorporation est
plus aisée comme étape finale d'un procédé de synthèse d'un polynucléotide.
Dans
certains modes de réalisation, la fonction amine réactive et l'extrémité 5' ou
3' de l'acide
nucléique sont séparées par une chaîne espaceur.
Selon l'invention, un acide nucléique peut comprendre une fonction amine
réactive à son extrémité 3' ou 5', ce qui signifie que la fonction amine
réactive est couplée
sur la partie nucléotidique dudit acide nucléique.
Selon d'autres modes de réalisation, un acide nucléique peut comprendre une
fonction amine réactive du côté de son extrémité 3' ou 5', ce qui signifie
que ladite
fonction amine n'est pas couplée directement sur la partie nucléotidique dudit
acide
nucléique, mais est liée de manière covalente à une partie non-nucléotidique
dudit acide
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
nucléotidique, par exemple une chaîne espaceur non-nucléotidique qui est
interposée entre
ladite fonction amine réactive et ladite extrémité de la partie nucléotidique
dudit acide
nucléique.
Pour résumer, au sens de l'invention, un acide nucléique , également
5 désigné dans ce qui suit par ligand nucléique comprend :
^ un polynucléotide, ledit polynucléotide consistant en un enchaînement
de ribonueléotides et/ou de désoxyribonucléotides éventuellement chimiquement
modifiés,
et
^ en option, une partie non-nucléotidique de préférence une chaîne
10 espaceur,
Ledit ligand ou acide nucléique comprend, en outre, une fonction amine
réactive, ladite fonction amine réactive pouvant être fixée soit à une
extrémité 3' ou 5' du
polynucléotide ou le cas échéant sur la chaîne espaceur.
De manière générale, le polynucléotide est au moins modifié au niveau du
nucléotide en 3' ou 5' pour introduire la fonction amine réactive directement
ou par
l'intermédiaire d'une partie non-nucléotide, en particulier, une chaîne
espaceur.
L'acide nucléique peut comprendre une entité chimique supplémentaire à
celles précédemment citées par exemple un fluorophore ou un chromophore.
De manière générale, l'acide nucléique selon l'invention est un ligand c'est-à-
dire qu'il est capable de se lier spécifiquement à une ou plusieurs molécules
cibles. On
parlera donc indifféremment dans ce qui suit de ligand nucléique ou d' acide
nucléique . Les molécules cibles englobent des molécules d'ARN, d'ADN, des
molécules
chimiques de nature organique ou minérale, des peptides et des protéines
qu'elles soient
humaines, animales, végétales, virales ou bactériennes.
La demanderesse a montré qu'il était possible de préparer des supports
d'affinité sur lesquels sont immobilisés des acides nucléiques (ou ligands
nucléiques),
lesdits supports d'affinité étant utilisables dans des techniques préparatives
de purification
de substances d'intérêt thérapeutique, car ils possèdent à la fois une bonne
capacité de
rétention sélective des substances cibles, une excellente résistance aux
traitements de
régénération et leur utilisation n'entraîne pas de risque d'introduction de
substances
potentiellement toxiques ou immunogènes dans la préparation purifiée
résultante.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
11
Plus précisément, il a été montré selon l'invention que des supports
d'affinité à
base d'acides nucléiques peuvent être préparés par greffage chimique desdits
acides
nucléiques sur un support solide comprenant des fonctions acides carboxyliques
activées,
dans des conditions spécifiques de greffage permettant à la fois un haut
rendement de
La demanderesse a montré que, contrairement à ce qu'indiquait l'article de
Goss et al. (1990, Supra) la technique de couplage d'un ligand comprenant une
fonction
amine réactive sur un support pré-activé par NHS, qui est couramment utilisée
pour le
Les résultats des exemples montrent notamment qu'en utilisant la méthode
classique de couplage réalisée à un pH compris entre 6 et 9 avec une variété
d'acides
nucléiques distincts, on obtient un rendement de greffage variant de 0% à 10%
au
Dans l'objectif de rechercher des méthodes de couplage alternatives aux
méthodes connues, la demanderesse a testé des conditions de couplage sur
support activé
par NUS dans lesquelles les charges anioniques portées par les acides
nucléiques sont
Egalement, la demanderesse a testé l'efficacité d'un couplage mettant en
oeuvre des acides nucléiques dans lesquels la fonction amine réactive et
l'extrémité 5' du
30 polynucléotide sont séparées l'une de l'autre par une chaîne espaceur
chargée
positivement. La chaîne espaceur consistait en un polyamide comprenant au
moins une
fonction amine tertiaire. Les résultats, non présentés dans les exemples, ont
montré
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
12
l'obtention d'un excellent rendement de greffage, proche de 100%, sur le
support pré-
activé avec NHS. En revanche, la demanderesse a montré que la mise en contact
du
support ainsi greffé avec une solution à un pH alcalin d'environ 9-10 altérait
la structure
de la chaîne espaceur et entraînait le décrochement des acides nucléiques du
support. Une
telle technique de couplage, qui permet un excellent rendement de couplage,
fournit donc
un support (l'affinité qui s'est révélé inadapté à une mise en uvre dans des
procédés
industriels de purification, lesdits procédés comprenant généralement des
étapes drastiques
de lavage et/ou d'inactivation microbienne.
La solution technique qui a été finalement mise au point selon l'invention a
consisté à réaliser la réaction de couplage des acides nucléiques sur le
support pré-activé
par le N-hydroxysuccinimide, dans des conditions de pH inférieur à 6.
La solution technique de l'invention est tout à fait surprenante car à un pH
acide, l'homme du métier se serait nomialement attendu à ce que la réaction de
couplage
n'ait pas lieu du tout, ou à tout le moins ait lieu dans une si faible
proportion qu'un très
faible rendement de greffage soit obtenu en raison de la faible réactivité des
amines
primaires et à la dégradation par hydrolyse des acides nucléiques généralement
observées
aux pH acides
Or, on a montré dans les exemples que la réalisation de l'étape de couplage
d'un acide nucléique sur un support pré-activé par le NHS, dans des conditions
de pH
inférieur à 5, permet l'obtention d'un support greffé avec un rendement de
greffage d'au
moins 70%. Le rendement de greffage est même d'environ 100% lorsque la
réaction de
couplage est conduite à pH inférieur à 4,5.
C'est de manière tout aussi surprenante qu'il est montré que la réalisation de
l'étape de couplage à un pH acide n'affecte pas l'intégrité fonctionnelle des
acides
nucléiques, alors que la grande sensibilité des acides nucléiques aux
conditions de pH
acide est bien connue par l'homme du métier.
De manière encore plus surprenante, la Demanderesse a montré que cette
réaction de couplage ¨ qui conduit à la formation d'une liaison amidique entre
le support
solide et l'acide nucléique ¨ est très rapide, cette réaction étant
généralement achevée en
moins d'une heure, indépendamment de la température de réaction. Par ailleurs,
la
Demanderesse a montré que la mise en oeuvre de la réaction à basse température
n'est pas
une condition requise pour préserver l'intégrité fonctionnelle des ligands
greffés. En
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
13
d'autres termes, le procédé d'immobilisation des ligands nucléiques selon
l'invention peut
être effectué indépendamment à basse température ou à température ambiante.
On a aussi montré dans les exemples que les acides nucléiques greffés sur le
support conservent leur intégrité chimique et physique, du fait que leur
fonctionnalité est
intacte. Cet aspect est illustré dans les exemples par un support greffé avec
des aptamères
nucléiques aptes à se lier au Facteur VII humain (FVIIh). On montre que
l'aptitude desdits
aptamères nucléiques anti-FVIlh est intacte après leur greffage dans des
conditions de pH
acide, à basse température ou à température ambiante, sur le support pré-
activé par le
NHS. La demanderesse a aussi montré que lorsqu'on utilise pour le greffage un
aptamère
nucléique apte à se lier sélectivement à des formes de Facteur VII humain
actif
comprenant un domaine Gla correctement gamma-carboxylé, l'aptarnère greffé
conserve
l'aptitude de Paptamère non-greffé à discriminer (0 les formes actives du
Facteur VII
humain à domaine Gia correctement gamma-carboxylé des (ii) formes non actives
du
Facteur VII humain.
On a aussi montré que les conditions de couplage spécifiques divulguées dans
la présente description étaient adaptées au greffage de tout type d'acide
nucléique, c'est-à-
dire à la fois d'acides nucléiques ADN et d'acides nucléiques ARN.
De plus, les exemples montrent que le procédé de l'invention aboutit à
l'obtention de supports d'affinité possédant une forte densité d'acides
nucléiques greffés
et peiniet en conséquence la préparation de supports d'affinité possédant une
grande
capacité de capture de ligands cibles, utilisables à l'échelle industrielle. A
la connaissance
de la Demanderesse, de tels supports n'ont jamais été décrits dans l'état de
la technique.
Les caractéristiques combinées de haute sélectivité vis-à-vis d'un ligand
cible
et de grande capacité de capture dudit ligand cible illustrent la
compatibilité d'un support
d'affinité obtenu selon le procédé de l'invention avec une utilisation dans
une étape de
purification de ligands cibles à l'échelle industrielle. Il va de soi que le
procédé selon la
présente invention permet également la préparation de supports d'affinité
destinés à la
détection d'une molécule cible.
La présente invention a plus précisément pour objet un procédé
d'immobilisation de ligands nucléiques comprenant au moins une fonction amine
réactive,
par greffage sur un support solide présentant des groupes acides carboxyliques
activés,
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
14
ledit procédé comprenant une étape de couplage covalent desdits acides
nucléiques sur
ledit support solide à un pH inférieur à 6.
Selon une autre définition, le procédé d'immobilisation des ligands nucléiques
comprenant au moins une fonction amine réactive sur un support solide selon
l'invention
comprend les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides
CarbOXY1,44CS 0.411VéS,
. _ .
uri ligand nucléique comprenant au moins une fonction amine
réactive, et
c) réaliser le couplage dudit ligand nucléique avec les groupes acides
carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des
conditions de pH
inférieur à 6.
étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent.
Il va de soi que l'étape de couplage c) permet la création de liaisons
amidiques
entre le support solide et les ligands nucléiques, chaque liaison amidique
résultant de la
réaction entre une fonction acide carboxylique activée du support et une
fonction amine
primaire présente au niveau du ligand nucléique.
Selon l'invention, les conditions de couplage à un pH inférieur à 6 englobent
des conditions de couplage à un pH inférieur à 5,5, inférieur à 5, inférieur à
4,9, inférieur à
4,8, inférieur à 4,7, inférieur à 4,6, inférieur à 4,5, inférieur à 4,3.
Dans certains modes de réalisation, le pH de l'étape de couplage est compris
dans une gamme allant de 3 à 6, ce qui englobe un pH de 3,0, un pH de 3,1, un
pH de 3,2,
un pH de 3,3, un pH de 3,4, un pH de 3,5, un pH de 3,6, un pH de 3,7, un pH de
3,8, un
pH de 3,9, un pH de 4,0, un pH de 4,1, un pH de 4,2, un pH de 4,3, un pH de
4,4, un pH
de 4,5, un pH de 4,6 un pH de 4,7, un pH de 4,8, un pH de 4,9, un pH de 5,0,
un pH de
5,1, un pH de 5,2, un pH de 5,3, un pH de 5,4, un pH de 5,5, un pH de 5,6, un
pH de 5,7,
un pH de 5,8 et un pH de 5,9.
De préférence, le pH de l'étape de couplage est inférieur à 4,5. Dans certains
modes de réalisation, le pH de la réaction de couplage est compris dans une
gamme allant
3,5 à 4,5.
Comme cela est illustré dans les exemples, l'étape de couplage peut être
réalisée à un pH d'environ 4,2.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
De préférence, le couplage est réalisé en présence d'un milieu tamponné
aqueux présentant un pH inférieur à 6. Le milieu tamponné peut être préparé à
partir de
tout type d'acides et/ou de bases faibles, dans la mesure ou le ou les acides
et bases faibles
utilisées ne sont pas susceptibles de réagir au cours de la réaction de
couplage. Comme
5 cela est illustré dans les exemples, il peut s'agir d'une solution
aqueuse d'acétate de
sodium.
Sans vouloir être liée par une quelconque théorie, la demanderesse pense
qu'aux conditions de pH acide utilisées pour la réaction de couplage, les
acides nucléiques
à greffer sont sous forme linéaire, ce qui favorise l'accessibilité de leur
groupe amine
10 réactif au solvant, et en particulier favorise la réaction dudit groupe
amine réactif avec un
groupe acide carboxylique activé accessible à la surface du support solide.
Par fonction acide carboxylique activée ou groupe acide carboxylique
activé , on entend une fonction chimique dérivée de la fonction acide
carboxylique
apte à réagir avec un nucléophile. De manière plus spécifique, on entend par
fonction
15 acide carboxylique activée une fonction chimique dérivée de la fonction
acide
carboxylique apte à réagir avec une amine primaire de manière à foiiiier une
liaison
amidique. Les fonctions acides carboxyliques activées sont bien connues de
l'homme
du métier et englobent les fonctions chlorures d'acide, anhydrides mixtes et
esters.
Dans certains modes de réalisation, les fonctions acides carboxyliques
activées
sont sous foinie d'esters résultant de la réaction desdites fonctions acides
carboxyliques
avec un composé choisi parmi le groupe constitué par le l-hydroxybenzotriazole
(HOBt),
le HOAt, le N-hydroxysuccinimide ou l'un de leurs dérivés.
Dans un mode de réalisation préféré, les groupes acides carboxyliques du
support ont été activés par réaction avec le N-hydroxysuccinimide ou l'un de
ses dérivés
tels que le N-hydroxysulfosuccinimide.
Ceci signifie que les groupes acides carboxyliques activés du support
solide correspondent à des groupes esters de N-succinimidyle , ou encore
appelés
esters de succinimidyle ou esters de N-hydroxysuccinimide , de formule
suivante
(I) où R représente la ramification du support solide à laquelle la fonction
ester est fixée:
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
16
o
o
Ro/N
o
L'activation par le NHS ou le sulfo-NFIS présente l'avantage de générer des
esters activés réactifs vis-à-vis des amines primaires mais également
suffisamment stables
pour permettre le conditionnement et le stockage du support pré-activé obtenu.
Les supports solides présentant des fonctions acides carboxyliques activées
sont bien connus dans l'état de la technique et nombre d'entre eux sont
commercialisés.
Les supports solides peuvent être également préparés selon des méthodologies
bien
connues de l'homme du métier, par exemple en faisant réagir un support
présentant
initialement des fonctions acides carboxyliques à sa surface avec un agent
chimique
adapté permettant l'activation des fonctions acides carboxyliques en vue de la
formation
subséquente d'une liaison amidique. On pourra, en particulier, se référer aux
méthodes
classiques d'activation des fonctions acides carboxyliques utilisées en
synthèse peptidique,
en particulier par voie solide. A titre illustratif, on peut aussi utiliser,
dans les conditions
spécifiques de couplage prescrites par l'invention, la méthodologie
d'activation par une
combinaison de EDC (chlorhydrate de 1-Ethy1-343-
dimethylaminopropyl]carbodiimide)
et de NHS, bien connue de l'homme du métier.
Les supports solides présentant des fonctions acides carboxyliques activées
peuvent être de tout type. Ces supports englobent les supports classiquement
utilisés pour
la chromatographie, y compris les supports de silice etd'agarose, et qui ont
été traités afin
de présenter à leur surface des groupes acides carboxyliquesactivés. Les
supports solides
pré-activés englobent des gels de dextrane, d'agarose, d'amidon, des dérivés
cellulosiques,
ou encore des polymères synthétiques tels que des polyamides, du trisacryle,
du
sephaeryle des dérivés de méthacrylate, des dérivés du polystyrène et des
polyacrylamides, ou encore des supports minéraux tels que des supports de
silice
(notamment des supports de verre poreux) ou d'alumine, sur la surface desquels
sont
présents des groupes acides carboxyliques activés. De manière générale, les
supports
solides sur lesquels peuvent être immobilisés les ligands nucléiques selon
l'invention
englobent tout type de support ayant la structure et la composition retrouvée
communément pour les supports de filtre, des membranes, etc. Les supports
solides
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
17
englobent notamment les résines, les résines ou gels pour colonne de
chromatographie
d'affinité, les billes de polymères, les billes magnétiques, les billes
paramagnétiques, les
matériaux supports de membrane filtrante, etc. Les supports solides englobent
aussi
notamment les matériaux à base de verre ou de métal, tels que l'acier, l'or,
l'argent,
l'aluminium, le cuivre, le silicium, le verre, la céramique. Les supports
solides englobent
aussi notamment des matériaux polymères, tels qu'un polyéthylène, un
polypropylène, un
polyamide, un fluorure de polyvinylidène, des dérivés de polyacrylamide et des
combinaisons de ceux-ci.
Dans les modes de réalisation particuliers pour lesquels les fonctions acides
carboxyliques du support solide sont activées par le NHS, ledit support solide
peut être
obtenu en faisant réagir un gel commercial présentant des fonctions acides
carboxyliques
libres avec le N-hydroxysuccinimide (NHS), éventuellement en présence d'un
carbodiimide tel que le 1-éthy1-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) .
On peut également utiliser un support solide commercial pré-activé par le
NHS comme par exemple un gel NEIS Activated Sepharose 4 fast flow (GE)
commercialisé par la société General Electric Healthcare (Etats-Unis), un gel
HiTrapTm
NHS-activated commercialisé par la société General Electric Healthcare
(Etats-Unis) ou
encore un gel NHS-Activated Agarose commercialisé par la société Therrno
Scientific
Pierce.
Comme cela est expliqué ci-avant, un ligand nucléique selon l'invention
comprend un polynucléotide c'est-à-dire en un polymère de nucléotides. Le
polynucléotide du ligand nucléique est responsable en grande partie des
propriétés de
liaison spécifique dudit ligand vis-à-vis de sa ou ses molécules cibles. II
comprend
généralement de 5 à 120 nucléotides de longueur.
Le ligand nucléique peut comprendre, en outre, une partie non-nucléotidique.
Ladite partie non-nucléotidique étant de préférence lié au polynucléotide. On
entend par
une partie non-nueléotidique un motif chimique qui ne consiste pas
essentiellement à
un polynucléotide. Cette partie non-nucléotide est de préférence une chaîne
espaceur.
L'amine réactive dudit ligand nucléique est de préférence une amine primaire
présente à
l'extrémité 3' ou 5' du polynucléotide ou le cas échéant une amine primaire
présente au
niveau de la partie non-nucléotidique.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
18
De manière préférée, l'amine réactive est une amine primaire aliphatique, ce
qui signifie que la fonction amine n'est pas directement liée à un groupe
aromatique.
Ainsi, dans certains modes de réalisation, le ligand nucléique est un
polynucléotide de 5 à 120 nucléotides de longueur comprenant au moins une
fonction
amine réactive à son extrémité 3' ou 5'.
Dans d'autres modes de réalisation, le ligand nucléique comprend (i) un
polynucléotide de 5 à 120 nucléotides de longueur et (ii) une chaîne espaceur
liée audit
polynucléotide, la fonction amine réactive étant fixée à une extrémité 3' ou
5' dudit
polynucléotide ou à la chaîne espaceur.
La chaîne espaceur est liée préférentiellement à l'extrémité 5' ou à
l'extrémité
3' de l'acide nucléique.
Dans certain mode de réalisation selon l'invention, le ligand nucléique
comprend un polynucléotide et une chaîne espaceur, ladite chaîne espaceur
comprenant à
l'une de ces extrémités une fonction amine et étant lié par sa deuxième
extrémité à
l'extrémité 5' du polynucléotide.
Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement le
polynucléotide de la surface du support solide ce qui permet d'augmenter la
mobilité
relative de la partie nueléotidique du ligand nucléique et de diminuer
l'encombrement
stérique.
La chaîne espaceur peut être de tout type. Les exemples illustrent en
particulier la mise en uvre du procédé selon l'invention pour une chaîne
hydrophobe
consistant en une chaîne composé d'une chaîne hydrophobe consistant en une
chaîne
composé de 3, 6, 12 ou plus (par exemple 18) méthylène (CH2) nommé dans la
suite C3 ,
C6, C12 ou une chaîne hydrophile qui peut être de type polyéthylène glycol,
par exemple
Hexaéthylène glycol (FLEG) ou un 11-amino-3,6,9-trioxaundécan- I yl appelé
dans la suite
C11 hydrophile ou un oligonucléotide non spécifique De préférence, la chaîne
espaceur
ne comprend pas de groupements ionisables autres que des fonctions amines
primaires ou
des fonctions amines secondaires. De manière générale, la chaîne espaceur ne
comprend
pas de groupements ou de liaisons sensibles au pH alcalin ou aux réactions
d'oxydation ou
de réduction. En particulier, la chaîne espaceur ne contient pas de liaison
disulfide ou des
groupements thiols. La chaîne espaceur contient essentiellement des liaisons
de type
carbone-carbone, carbone-oxygène et carbone-azote. La chaîne espaceur est de
préférence
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
19
choisie parmi le groupe constitué par: une chaîne hydrophobe consistant en une
chaîne
composé de 3, 6, 12 ou plus (par exemple 18) méthylène (CH2) nommé dans la
suite C3,
C6, C12 ou une chaîne hydrophile qui peut être de type polyéthylène glycol,
par exemple
Hexaéthylène glycol (HEG) ou un 11-amino-3,6,9-trioxaundécan-1y1 appelé dans
la suite
Ci 1 hydrophile ou un oligonucléotide non spécifiquesubstitués par une
fonction amine
primaire
La chaîne espaceur peut être introduite selon des méthodes bien connues de
l'homme du métier, en particulier en tant qu'étape finale de la synthèse
chimique du
polynucléotide. Dans ce cas particulier on pourra introduire la chaîne
espaceur à
l'extrémité 5' du polynucléotide à l'aide d'un dérivé comprenant une fonction
phosphoramidite comme cela est décrit dans les exemples. Le principe général
de cette
réaction est présenté à la figure 2 de Greco et Tor, Nature Protocols, 2007,
2, 305-316
intitulée Key steps in solid DNA phospharimidite synthesis cycle . H est
également
possible d'introduire une molécule contenant une amine primaire en position 5'
du
polynucléotide par couplage d'une diamine telle que l'éthylènediamine en
présence
d'EDC et d'imidazole (voir Fiche technique n'TR0030.5 éditée par Thermo
scientific).
On pourra se référer à l'ouvrage de référence de Hennanson (Bioconjugate
Techniques,
2008, 2nd Edition, Academie Press, San Diego) et en particulier au chapitre
27, p.970.
Comme cela est illustré dans les exemples de la présente demande, l'étape de
couplage peut être effectuée indifféremment à basse température et à
température
ambiante. De manière remarquable, la mise en uvre de la réaction à
température
ambiante n'induit pas une diminution du rendement de la réaction. De la même
manière, la
mise en oeuvre de la réaction à basse température ¨ typiquement à une
température de 5 C
¨ n'induit pas une diminution substantielle de la vitesse de réaction.
Ainsi dans certains modes de réaction l'étape de couplage est effectuée à une
température comprise dans une gamme allant de 0 C à 50 C.
De manière préférée, l'étape de couplage peut être réalisée à une température
allant de 0 C à 35 C.
De manière pratique, la réaction de couplage pourra être réalisée à
température
ambiante, c'est-à-dire à une température allant de 15 C à 35 C, de préférence
à une
température allant de 15 C à 25 C. Néanmoins, l'étape de couplage pourra être
réalisée à
basse température, typiquement à une température allant de 0 C à 8 C, si les
réactifs mis
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
en jeu ¨ en particulier les ligands nucléiques ¨ présentent des groupements
chimiques
sensibles, en particulier, à l'hydrolyse.
La réaction de couplage étant particulièrement rapide, un avancement
satisfaisant de la réaction est généralement obtenu au bout d'environ d'une
heure, voire au
5 bout
de quelques minutes. En utilisant des techniques de suivi cinétiques adaptées,
l'homme du métier sera à même de déterminer la durée optimale de la réaction.
Il en est de
même pour la température de réaction.
De manière générale, comme cela est illustré dans les exemples, l'étape de
couplage peut être effectuée à un pH allant de 3,5 à 4,5, à température
ambiante et sur une
10 durée d'environ une heure.
Bien entendu, l'homme du métier peut, sur la base des conditions générales ci-
dessus, adapter les conditions de la réaction de couplage afin de détenniner
les conditions
optimales adaptées dans chaque cas précis, sur la base de ses connaissances
générales en
chimie. A titre illustratif, l'homme du métier peut facilement prévoir que,
pour l'obtention
15 d'un
rendement de couplage donné, l'abaissement de la température de réaction est
susceptible de nécessiter une augmentation de la durée de l'étape de couplage.
Dans certains modes de réalisation du procédé d'immobilisation selon
= l'invention, la réaction de couplage peut être achevée en plaçant la
combinaison support
pré-activé/acides nucléiques dans des conditions de pH alcalin pendant une
durée donnée.
20 Dans
ces modes de réalisation, l'étape de couplage du procédé de l'invention
comprend elle-même les deux étapes suivantes :
cl) faire réagir ledit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques
activés présents à la surface dudit support solide, dans des conditions de pH
inférieur à 6
et
c2) poursuivre la réaction de couplage dudit acide nucléique avec les groupes
acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide, dans
des conditions
de pH supérieur à 7,5
Sans vouloir être liée par une quelconque théorie, la demanderesse pense que,
la mise en oeuvre de la sous-étape c2) peut, dans certains cas spécifiques,
induire les acides
nucléiques immobilisés sur le support à adopter une conformation adaptée. La
demanderesse est d'avis que cette étape est facultative.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
21
Avantageusement, la phase finale de couplage à pH alcalin est réalisée à un pH
d'au moins 7,5, ce qui englobe les pH d'au moins 8, et d'au moins 8,5. Les
exemples
illustrent la réalisation de l'étape c2) à un pH d'environ 9
L'étape c2)) peut être réalisée à température ambiante ou à une température
basse. Par température basse pour l'étape finale de la réaction de couplage,
on entend une
température inférieure à 15 C, y compris une température inférieure à 14 C, 13
C, 12 C,
11 C, 10 C, 9 C, 8 C, 7 C, 6 C ou 5 C.
La durée de la phase finale de l'étape de couplage est variable. Elle est
comprise entre quelques minutes et quelques heures. De manière générale, la
durée de
l'étape c2) est inférieure à 9 heure ce qui englobe une durée inférieure à 8,
7, 6, 5, 4, 3, 2
et 1 heures. La durée l'étape c2) peut être d'environ 8 heures ou d'environ 3
heures,
comme cela est illustré dans les exemples.
Pour ladite phase finale de l'étape de couplage, l'homme du métier peut
aisément, sur la base des indications ci-dessus, déteiniiner les conditions
optimales de
combinaison de pH, température et durée, au cas-par-cas.
Dans des modes de réalisation avantageux, la réaction de couplage est suivie
par une étape de neutralisation d) ou de blocage des groupes acides
carboxyliques activés
n'ayant pas réagi au cours de l'étape de couplage proprement dit. A titre
illustratif, le
blocage des fonctions acides carboxyliques activées et n'ayant pas réagi peut
être réalisé
par incubation du support greffé avec une solution de blocage comprenant 0,5 M
d'éthanolamine, 0,5M de NaC1 à pH 8,3 ou bien avec une solution de blocage à
0,1M Tris-
HC1 à pH 8,5, comme cela est recommandé notamment par le fabricant et décrit
par
ailleurs dans les exemples. La durée de l'étape de neutralisation ou de
blocage est
avantageusement d'au moins une heure à température basse. Elle peut être
réalisée par
exemple pendant une durée de 2h30 à la température de 4 C, comme décrit dans
les
exemples.
En dernier lieu, le procédé selon l'invention comprend à l'issue de l'étape de
couplage c) et/ou à l'issue de l'étape de blocage ou de neutralisation d) une
ou plusieurs
étapes de lavage e) dudit support dans des conditions classiques de manière à
obtenir un
support d'affinité prêt à l'emploi. A titre illustratif, la ou les étapes de
lavage peuvent être
réalisées avec une solution tampon de 0,1M Tris-HC1 à un pH allant de 8 à 9,
ou bien avec
une solution tampon de 0,1M acétate, 0,5M NaCI à un pH allant de 4 à 5, comme
cela est
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
22
illustré dans les exemples. Dans certains modes de réalisation, une étape de
lavage
comprend successivement (i) un lavage par une solution tampon de 0,1M Tris-HC1
à un
pH allant de 8 à 9, suivi de (ii) un lavage par une solution tampon de 0,1M
acétate, 0,5M
NaCl à un pH allant de 4 à 5. Classiquement, on réalise une pluralité d'étapes
de lavage,
par exemple 3 étapes de lavage, comme cela est illustré dans les exemples.
Au vu de la description qui précède, le procédé d'immobilisation d'acides
nucléiques selon l'invention peut être aussi défini comme un procédé
comprenant les
étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides
carboxyliques activés, de préférence par le N-hydroxysuccinimide,
b) fournir un acide nucléique comprenant au moins une fonction amine
primaire,
c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides
carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des
conditions de pH
inférieur à 6, et
d) bloquer la réaction de couplage.
Le procédé d'immobilisation d'acides nucléiques selon l'invention peut être
aussi défini comme un procédé comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides
carboxyliques activés, de préférence par le N-hydroxysuccinimide,
b) fournir un acide nucléique comprenant au moins une fonction amine
primaire,
c) réaliser le couplage dudit acide nucléique avec les groupes acides
carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des
conditions de pH
inférieur à6,
d) bloquer la réaction de couplage, et
e) réaliser une ou plusieurs étapes de lavage du support.
Comme cela a déjà été précisé précédemment, dans certains modes de
réalisation, l'étape c) comprend elle-même les deux étapes suivantes :
cl) faire réagir ledit acide nucléique avec les groupes acides carboxyliques
activés, de préférence par le N-hydroxysuccinimide, présents à la surface
dudit support
solide dans des conditions de pH inférieur à 6, et
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
23
c2) poursuivre la réaction de couplage dudit acide nucléique avec les groupes
acides carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans
des conditions
de pH supérieur à 7,5
Le procédé d'immobilisation des ligands nucléiques selon l'invention trouve
une application directe pour la fabrication de supports d'affinité destinés à
la purification
ou à la détection de molécules cibles, y compris de protéines cibles.
Ainsi, de manière plus générale, la présente invention concerne une méthode
de préparation d'un support d'affinité comprenant la mise en oeuvre du procédé
d'immobilisation de ligands nucléiques tel que défini ci-avant. Ainsi, la
méthode de
préparation d'un support d'affinité selon l'invention comprend les étapes
suivantes :
a) fournir un support solide comprenant à sa surface des groupes acides
carboxyliques activés,
b) fournir un ligand nucléique comprenant au moins une fonction amine
primaire, et
c) réaliser le couplage dudit ligand nucléique avec les groupes acides
carboxyliques activés présents à la surface dudit support solide dans des
conditions de pH
inférieur à 6
étant entendu que l'ordre des étapes a) et b) est indifférent.
L'étape c) de la méthode peut comprendre les étapes cl) et c2) telles que
définies précédemment. De la même manière, la méthode peut comprendre en outre
les
étapes d) et e) décrites précédemment.
Comme cela est illustré dans les exemples, la méthode et le procédé selon
l'invention sont particulièrement adaptés pour la préparation d'un support
d'affinité
destiné à la purification d'une ou plusieurs molécules cibles, en particulier
par
chromatographie.
Ainsi dans certains modes de réalisation du procédé selon l'invention, le
support solide est un support adapté à la mise en uvre d'un procédé de
chromatographie,
de filtration ou d'extraction en phase solide. En d'autres termes le support
solide est
adapté pour une utilisation en tant que phase stationnaire dans un procédé de
chromatographie, ou de filtration ou d'extraction en phase solide. Pour la
mise en oeuvre
d'un support solide d'affinité pour l'extraction en phase solide, on pourra se
référer à
Madru et al., (Analytical Chemistry, 2009, 81, 7081-7086). Un tel support
solide peut être
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
24
choisi parmi le groupe constitué par les gels de silice et les gels de
polysaccharide tels que
les gels d'agarose, les gels de dextrane et leurs dérivés et également les
gels acrylamide et
leurs dérives, les géls methacrylate et leurs dérivés et les surfaces
polystyrene et leurs
dérivés.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier du procédé ou de la méthode
d'immobilisation l'invention,
(i) le support solide comprenant à sa surface des groupes acides carboxyliques
activés est un support choisi parmi le groupe constitué par les gels de
silice, les gels
d'agarose, les gels de dextrane et leurs dérivés et
(ii) le ligand acide nucléique comprenant au moins une amine réactive est
choisi parmi le groupe des polynucléotides de 5 à 120 acides aminés comprenant
éventuellement en leur extrémité 3' ou 5' une chaîne espaceur pouvant être
choisie parmi
le groupe constitué par une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne composé
de 3, 6,
12 ou plus (par exemple 18) méthylène (CH2) nommé dans la suite C3 ,C6, C12 ou
une
chaîne hydrophile qui peut être de type polyéthylène glycol, par exemple
Hexaéthylène
glycol (HEG) ou un 11-arnino-3,6,9-trioxaundécan-ly1 appelé dans la suite C11
hydrophile ou un oligonucléotide non spécifique
Dans un autre mode de réalisation particulier du procédé ou de la méthode
selon l'invention,
(i) le support solide est choisi parmi les gels d'agarose et leurs dérivés, et
(ii) le ligand nucléique est un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides lié par
son
extrémité 5' à une chaine espaceur choisie panai les polyéthylèneglyeol en C4-
C20, la
fonction amine réactive étant de préférence portée par la chaine espaceur.
Dans un mode de réalisation supplémentaire du procédé ou de la méthode
selon l'invention,
(i) le support solide est choisi parmi les gels d'agarose et leurs dérivés et
(ii) le ligand nucléique est un polynucléotide de 5 à 120 nucléotides lié par
son
extrémité 5' à une chaine espaceur choisie parmi les alkyles linaires en C4-
C20, la
fonction amine réactive étant de préférence portée par la chaine espaceur.
Les exemples montrent que les supports d'affinité obtenus selon le procédé de
l'invention peimettent la purification quantitative d'un ligand cible de
manière
extrêmement sélective.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
Egalement, les résultats des exemples montrent qu'un support d'affinité
obtenu selon le procédé de l'invention peut être utilisé sur une très longue
période de
temps, notamment selon un grand nombre de cycles de
capture/lavage/élution/lavage sans
perte significative de ses propriétés de rétention sélective et quantitative
du ligand cible.
5 On montre aussi, qu'un support d'affinité selon l'invention conserve ses
propriétés de
rétention sélective et quantitative du ligand cible, même après avoir subi les
étapes
drastiques de régénération ou de sanitisation antibactérienne, anti-fongique
ou anti-virale.
On a montré, en particulier, dans les exemples que la capacité de rétention
d'un support
d'affinité selon l'invention pour sa protéine cible ne sont pas altérées par
un traitement par
10 une solution ayant une concentration finale de NaOH de 0,5 M, ni même
par un traitement
par une solution de NaOH ayant une concentration finale de I M, c'est-à-dire à
une
concentration finale de NaOH bien supérieure à celle qui est usuellement
employée lors
des étapes de sanitisation, et ceci pendant une très longue période de temps
(100 heures)
également bien supérieure à la durée d'une étape conventionnelle de
sanitisation qui est en
15 générale de quelques minutes. On a également montré que les propriétés
chromatographiques d'un support d'affinité selon l'invention ne sont pas
altérées par un
traitement par une solution ayant une concentration finale de propylène glycol
de 50 %
(vol/vol).
Les résultats des exemples montrent aussi que les propriétés
20 chromatographiques d'un support d'affinité selon l'invention ne sont pas
altérées, même
après une incubation de longue durée dudit support avec le milieu biologique
de départ
contenant la molécule à purifier.
Il est également montré dans les exemples que les propriétés
chromatographiques d'un support d'affinité selon l'invention sont inchangées,
même après
25 de nombreux cycles d'utilisation.
En d'autres termes, les résultats des exemples illustrent la capacité d'un
support d'affinité selon l'invention a réaliser de manière parfaitement
reproductible des
étapes de purification quantitatives d'un ligand cible, et ceci dans des
conditions
d'utilisation industrielles classiques, qui sont en général délétères pour les
supports
d'affinité connus, y compris pour les supports d'immuno-affinité. Les
caractéristiques
techniques de chacune des étapes du procédé de l'invention, selon les
différentes
définitions ci-dessus, ont déjà été précisées précédemment dans la présente
description.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
26
Les supports d'affinité selon l'invention constituent donc des outils de
purification qui sont à la fois fiables et reproductibles, stables dans le
temps, et ne
nécessitant pas d'opérations de maintenance répétées. Les supports d'affinité
de
l'invention, du fait des nombreux avantages techniques qu'ils procurent,
permettent la mise
en ceuvre de procédés de purification d'une molécule cible à des coûts
modérés.
Les exemples décrivent l'obtention d'un support d'affinité de l'invention par
greffage d'aptamères nucléiques, et de manière illustrative par greffage
d'aptamères
d'ADN.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré du procédé ou de la méthode selon
la présente invention, le ligand nucléique est un aptamère nucléique.
Par aptamère nucléique ou par aptamère, on entend selon l'invention un
acide nucléique simple brin se liant spécifiquement à un ou plusieurs ligands
cibles. Les
aptamères englobent ceux pour lesquels on peut détecter des complexes avec un
seul
ligand cible ou avec une variété de ligands cibles donnés, après une étape
préalable de
mise en contact des partenaires respectivement nucléique et ligand cible. Les
aptamères
englobent les aptamères d'ARN et les aptamères d'ADN.
Le terme aptamère tel qu'utilisé ici désigne une molécule d'acide
nucléique monobrin, ADN ou ARN, capable de se lier de manière spécifique à un
ou
plusieurs ligands cibles, telle qu'une protéine. Les aptamères se lient à
leurs molécules
cibles par des mécanismes essentiellement distincts de l'hybridation. Les
aptamères sont
généralement caractérisés par une structure secondaire comprenant des boucles
et des
tiges. En d'autres termes, la conformation active des aptamères (c'est-à-dire
la
conformation dans laquelle les aptamères sont capables de se lier à leur
protéine cible) est
non Hilaire.
Les aptamères comprennent généralement entre 5 et 120 nucléotides et
peuvent être sélectionnés in vitro selon un procédé connu sous le nom de SELEX
(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Les aptamères
présentent
de nombreux avantages. De par leur nature oligonucléotidique, les aptamères
possèdent
une faible immunogénicité et une résistance importante à des conditions
physico-
chimiques stringentes (présence d'urée, de DMSO, d'un pH très acide ou très
basique,
utilisation de solvants organiques ou de température élevée) permettant des
stratégies de
sanitisation variées dans le cadre d'un usage en tant que ligand d'affinité.
De plus leur
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
27
sélectivité est importante. Enfin la production d'aptamères implique des coûts
relativement limités.
Dans certains modes de réalisation, un aptamère nucléique utilisé pour le
greffage au support solide pré-activé, selon le procédé ou la méthode définie
ci-dessus,
peut comprendre, par définition, une partie non nucléotidique ou
nucléotidique, par
exemple une chaîne espaceur non nucléotidique, qui relie l'une des extrémités
5' ou 3' de
la partie nucléique dudit aptamère et la fonction amine réactive utilisée pour
le greffage
chimique dudit support pré-activé. Dans ces modes de réalisation, un aptamère
nucléique
peut être de fouaille (I) suivante :
NH2-[SPAC]11- [NUCL] (I), dans laquelle :
- n étant indice valant 1 ou 0, 0 signifiant que l'aptamère ne comprend pas
une chaîne
espaceur libre et 1 signifiant que l'aptamère comprend une chaîne espaceur.
- NR2 signifie la fonction amine réactive utilisée pour le greffage sur le
support solide
pré-activé par des groupes NHS,
- [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et
- [NUCL1 signifie un acide nucléique se liant spécifiquement à un molécule
cible, ledit
acide nucléique comprenant de 5 à 120 nucléotides.
De préférence, l'acide nucléique [NUCL] comprend de 10 à 80 nucléotides et
de manière encore plus préférée de 20 à 60 nucléotides.
La chaîne espaceur désignée [SPAC] dans le composé de formule (I) peut
être de tout type connu. Il peut s'agir d'un composé non-nucléotidique, d'un
oligonucléotide ou d'un composé comprenant une ou plusieurs parties non-
nucléotidiques
et une ou plusieurs parties nucléotidiques. La chaîne espaceur ne participe
pas, en général,
à la liaison du ligand cible sur le support.
Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement l'acide
nucléique [NUCL] de la surface du support solide sur lequel ledit composé de
formule (1)
est greffé chimiquement ce qui permet une mobilité relative de l'acide
nucléique
[NUCIA, par rapport à la surface dudit support solide. La chaîne espaceur
limite ou évite
que des encombrements stériques, dus à une trop grande proximité du support
solide avec
la partie nucléique de l'aptamère, gênent les évènements de liaison entre
ledit acide
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
28
nucléique et des molécules du ligand cible susceptibles d'être mises en
contact avec celui-
ci.
Dans le composé de formule (II), la chaîne espaceur est liée
préférentiellement
à l'extrémité 5' ou à l'extrémité 3' de l'acide nucléique [NUCL].
Cette construction avec espaceur a pour avantage de ne pas immobiliser
directement l'aptamère sur le support solide. De préférence, comme cela a été
indiqué ci-
avant, la chaîne espaceur peut être une chaîne hydrophobe consistant en une
chaîne
composé de 3, 6, 12 ou plus (par exemple 18) méthylène (CH2) nommé dans la
suite C3 ,
C6, C12 ou une chaîne hydrophile qui peut être de type polyéthylène glycol,
par exemple
Hexaéthylène glycol (HEG) ou un 11-amino-3,6,9-trioxaundécan-ly1 appelé dans
la suite
Cl 1 hydrophile ou un oligonucléotide non spécifique. Lorsque la chaîne
espaceur consiste
en un oligonucléotide non spécifique, ledit oligonucléotide comprend
avantageusement au
moins 5 nucléotides de longueur, de préférence entre 5 et 15 nucléotides de
longueur.
Dans certains modes de réalisation, la chaîne espaceur peut être composite et
comprendre la succession d'HEG et d'un oligonucléotide, par exemple d'un
oligo(dT).
On rappelle que les exemples illustrent l'obtention de supports d'affinité
tels
que définis ci-dessus par greffage du support pré-activé par le NHS avec trois
aptamères
nucléiques distincts anti-FV1I comprenant des chaines espaceur de nature
également
distincte, à savoir, une chaîne hydrophobe consistant en une chaîne alkyle en
C6 une
chaîne hydrophobe consistant en une chaîne alkyle en C12, et une chaîne
hydrophile Cl 1-
TFA
Ainsi, les résultats des exemples montrent que le procédé d'obtention d'un
support
d'affinité qui est décrit dans la présente description peut être utilisé, quel
que soit l'identité
ou le type d'acide nucléique d'intérêt à greffer.
Comme cela a été évoqué ci-avant, les procédés et méthode selon l'invention
pennettent la préparation de supports d'affinité qui se distinguent des
supports d'affinité
connus par leur densité élevée en ligands nucléiques immobilisés à leur
surface. Cette
densité élevée de ligands nucléiques découle directement du procédé spécifique
d'obtention des supports d'affinité.
De manière remarquable, les supports d'affinité selon l'invention se
caractérisent également par une capacité élevée de rétention de la ou les
molécules cibles
contre lesquels sont dirigés les acides nucléiques greffés. En particulier, le
procédé selon
l'invention permet de préparer des gels de chromatographie d'affinité
présentant une
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
29
densité élevée en ligands nucléiques. Il a été ainsi observé que des gels de
chromatographie obtenus par le procédé selon l'invention présentent une
densité en
ligands nucléiques 0.2 Innol/m1 à 0.5 Innol/m1 alors que la densité initiale
en fonctions
acides carboxyliques activées des gels de chromatographie que l'on trouve dans
le
commerce est généralement comprise entre 5 jamol/m1 à 25 umol/m1 de gel.
Ainsi, selon le
procédé de couplage de l'invention, il est possible de dérivatiser selon le
procédé de
l'invention au moins 0,01% des fonctions carboxyliques activées initialement
présentes à
la surface du support solide, avantageusement au moins 0,1%, mieux au moins 1%
et
encore mieux au moins 2% desdites fonctions carboxyliques activées. A titre de
comparaison les taux greffage en chromatographie d'affinité avec les anticorps
comme
ligand sont souvent inférieurs à lmenl, c'est-à-dire inférieure à 0.06
umol/ml, soit moins
de 0,2% de fonctions carboxyliques dérivatisées.
Une dérivatisation d'au moins 0,01% des fonctions carboxyliques activées
englobe une dérivatisation d'au moins 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%,
0,6%, 0,7%,
0,8%, 0,9%, 1%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9% et au
moins 2%
desdites fonctions carboxyliques activées.
Dans certains modes de réalisation, le pourcentage de fonctions carboxyliques
dérivatisées est d'au plus 100%, ce qui englobe au plus 50%, 40%, 30%, et au
plus 25%
desdites fonctions carboxyliques activées.
Ainsi, un autre objet de la présente invention, un support d'affinité pouvant
être obtenu conformément au procédé et à la méthode décrits ci-avant dans la
présente
description.
De manière plus générale, la présente invention concerne un support solide
d'affinité sur lequel des ligands nucléiques sont immobilisés par une liaison
amidique et
dans lequel au moins des fonctions carboxyles présentes initialement à sa
surface sont
dérivatisées par à un ligand nucléique.
Il va de soi que la liaison amidique liant un ligand nucléique au support
résulte
de la réaction d'une fonction carboxyle présente initialement à la surface du
support avec
une fonction amine primaire présente au niveau du ligand nucléique.
Dans un mode de réalisation préféré, le support solide d'affinité est un gel
de
chromatographie.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
Un autre objet de la présente invention est un support solide d'affinité sur
lequel des ligands nucléiques sont immobilisés par une liaison amidique, ledit
support
d'affinité étant un gel de chromatographie présentant une densité en ligands
nucléiques
d'au moins 0,005 urnol/m1 de gel, ce qui englobe au moins 0,01 umol/ml, 0,05
umol/ml,
5 0,1 limai/mi, 0,15 tmol/ml, 0,2 Funol/ml, 0,25 umol/ml, 0,3 umol/ml, 0,35
umo1/m1 et au
moins 0,38 umol/m1 de gel.
Dans certains modes de réalisation, la densité en ligands nucléiques est d'au
plus 10 umol/ml, ce qui englobe au plus 5 umol/ml, au plus 1 umol/m1 et au
plus 0,5
p.mol/ml.
10 Les supports d'affinité selon l'invention peuvent présenter l'une
quelconque
des propriétes décrites ci-avant pour les supports solides ou les supports
d'affinité.
Ainsi, dans certains modes de réalisation, le support d'affinité peut être un
gel
utilisable en chromatographie, en filtration ou en extraction en phase solide
choisi parmi le
groupe constitué par les gels d'agarose, de dextrane, de silice et leurs
dérivés.
15 Comme cela est illustré dans les exemples, le support d'affinité peut
être un
gel d'agarose hautement réticulé sur lequel sont immobilisés les ligands
nucléiques. De
préférence, le support d'affinité est un gel (autrement dit une phase
stationnaire) utilisable
dans des procédés de chromatographie d'affinité.
Les supports d'affinité selon l'invention peuvent comprendre à leur surface
20 tout type de ligands nucléiques tels que décrits ci-avant dans la
présente description.
Dans certains modes de réalisation, le support d'affinité selon l'invention
est
caractérisé en ce que les ligands nucléiques sont des aptamères de formule
(II) présentés
ci-avant.
Dans des modes de réalisation particuliers, le support solide d'affinité selon
25 l'invention peut être représenté par la formule suivante (III) :
0
CI) N
H
dans laquelle :
- [SUI)] représente le support solide du support d'affinité
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
31
[SPAC]n et [NUCL] répondent aux définitions précédemment indiquées. En
d'autres termes, -NH-(SPAC)õ-NUCL représente un aptamère nucléique dans lequel
:
= n est indice valant 0 ou 1,
= SPAC représente une chaîne espaceur, et
= NUCL représente un acide nucléique se liant spécifiquement à une molécule
cible, ledit acide nucléique comprenant de 5 à 120 nucléotides.
Un autre objet selon l'invention est un complexe formé entre un ligand
nucléique et une molécule cible, ledit complexe étant formé à la surface d'un
support
solide tel que défini précédemment. Ledit complexe résulte essentiellement
d'interactions
no-covalentes entre la molécule cible et le ligand nucléique.
Un objet supplémentaire de l'invention concerne l'utilisation d'un support
d'affinité tel que décrit précédemment pour la purification ou la détection
d'une molécule
cible. Dans le contexte de la purification d'une molécule cible, le support
selon l'invention
peut être utilisé comme phase stationnaire dans des étapes de filtration, de
chromatographie ou d'extraction en phase solide.
La présente invention est également relative à un procédé de purification
d'une
molécule cible avec un support d'affinité tel que défini ci-dessus, comprenant
les étapes
suivantes :
a) mettre en contact une composition à purifier comprenant une molécule cible
d'intérêt avec un support d'affinité tel que défini dans la présente
description, afin de
foluier un complexe entre (i) les acides nucléiques greffés sur ledit support
et (ii) ledit
ligand cible et
b) libérer ladite molécule cible à partir du complexe formé à l'étape a) et
récupérer ladite molécule cible purifiée.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend une étape a'),
l'étape a' suivant l'étape a) et précédant l'étape b), qui consiste en une
étape de lavage du
support d'affinité avec un tampon de lavage.
On a également montré dans les exemples que l'utilisation à l'étape a') d'un
tampon de lavage ayant une hydrophobicité élevée, en particulier une
concentration élevée
en propylène glycol, permet d'éliminer efficacement les substances liées de
manière non-
spécifique au support d'affinité sans simultanément affecter de manière
détectable la
liaison du ligand cible au support d'affinité.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
32
A l'étape a'), on utilise ainsi de préférence un tampon de lavage ayant une
teneur finale en propylène glycol d'au moins 20% en volume, par rapport au
volume total
de la solution tampon.
Selon l'invention, un tampon de lavage ayant une teneur finale en propylène
glycol d'au moins 20% englobe les tampons de lavage ayant une teneur finale en
propylène glycol d'au moins 25% M, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, ou au moins
60%.en volume, par rapport au volume total de la solution tampon.
De préférence un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une
teneur finale en propylène glycol d'au plus 50%. Avantageusement, un tampon de
lavage
utilisé à l'étape a') du procédé a une teneur finale en propylène glycol
comprise entre 20%
et 50%, de préférence entre 30% et 50%.
Selon un mode de réalisation particulier, le tampon de lavage utilisé à
l'étape
a') contient à la fois du NaCl et du propylène glycol comme décrit dans les
exemples.
De plus, dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-
dessus, l'étape b) est réalisée par la mise en contact du support d'affinité
avec un tampon
d' élution contenant un agent chélateur des ions divalents, de préférence
l'EDTA.
A titre illustratif, le tampon d'élution peut contenir une concentration
finale
d'EDTA d'au moins 1 mM et d'au plus 30 mM.
L'expression au moins 1 mM englobe au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou
IO rriM.
L'expression au plus 30 mM englobe au plus 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22,
21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ou 11 mM.
Avantageusement, on utilise, pour la régénération du support d'affinité, un
tampon comprenant un mélange de NaC1 et de propylène glycol, qui peut être du
même
type que celui décrit ci-dessus pour l'étape de lavage.
Au sens de la présente invention et pour les différents objets décrits ci-
avant
compris dans l'invention, le terme molécule cible (ou substance cible ou
encore
ligand cible ) tel qu'utilisé ici désigne une molécule capable de se lier de
manière
spécifique à l'aptamère. 11 peut s'agir de d'acides nucléiques, de protéines
ou de
substances organiques ou minérales. Les protéines peuvent être tout type de
protéines, et
en particulier, les protéines plasmatiques.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
33
Par protéine plasmatique , on entend selon l'invention toute protéine,
spécialement toute protéine d'intérêt industriel ou thérapeutique, contenue
dans le plasma
sanguin. Les protéines du plasma sanguin englobent les anticorps, l'albumine,
alpha/macroglobuline, antichymotrypsine, antithrombine, antitrypsine, Apo A,
Apo B,
Apo C, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, beta XIIa, C 1-inhibiteur, protéine C-
réactive, C7,
C 1r, Cl s, C2 C3, C4, C4bP, C5, C6, Cl q, C8, C9, carboxypeptidase N,
céruloplasmine,
Facteur B, Facteur D, Facteur H, Facteur I, Facteur IX, Facteur V, Facteur
VII, Facteur
\Ma, Facteur VIII, Facteur X, Facteur XI, Facteur XII, Facteur XIII,
Fibrinogène,
Fibronectine, Haptoglobine, Hemopexine, Héparine cofacteur II, Histidine rich
GP, IgA,
IgD, IgE, IgG, III, IgM, Kininase II, Kininogène IIPM, Lysozyme, PAI 2, PAT I,
PC1,
Plasrnine, Inhibiteur de la plasmine, Plasminogène, Préalbumine,
Prokallicréine,
Properdine, Protéase Nexine INH, Protéine C, Protéine S, Protéine Z,
Prothrombine, TFPI,
Thiol-protéinase, Thrornbomoduline, Facteur tissulaire (TF), TPA,
Transcolabamine II,
Transcortine, Transferrine, Vitronectine, et le Facteur de Willebrand.
Notamment, les protéines plasmatiques englobent les protéines de la
coagulation, c'est-à-dire les protéines plasmatiques impliquées dans la chaîne
de réactions
en cascade aboutissant à la formation d'un caillot sanguin. Les protéines de
la coagulation
englobent le Facteur I (fibrinogène), le Facteur II (prothrombine), le Facteur
V
(proaecélérine), le Facteur VII (proconvertine), le Facteur VIII (facteur anti-
hémophilique
A), le Facteur IX (facteur anti-hémophilique B), le Facteur X (Facteur
Stuart), le Facteur
XI (Facteur Rosenthal ou PTA), le Facteur XII (Facteur Hageman), le Facteur
XIII
(Facteur stabilisant la fibrine ou FSF), la PK (Prékalicrine) le KHPM
(kininogène de haut
poids moléculaire), la thromboplastine tissulaire, le cofacteur II de
l'héparine (HC1I), la
protéine C (PC), la thrombomoduline (TM), la protéine S (PS), le facteur de
Willebrand
(Wt) et l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI), ou encore les
facteurs
tissulaires.
Dans certains modes de réalisation, la protéine plasmatique consiste en une
protéine de la coagulation à activité enzymatique.
Les protéines de la coagulation à activité enzymatique englobent le Facteur II
(prothrombine), le Facteur VII (proconvertine), le Facteur IX (facteur anti-
hémophilique
B), le Facteur X (Facteur Stuart), le Facteur XI (Facteur Rosenthal ou PTA),
le Facteur
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
34
XII (Facteur Hageman), le Facteur XIII (Facteur stabilisant la fibrine ou FSF)
et la PK
(Prékalicrine).
Dans certains modes de réalisation préférés, la protéine plasmatique consiste
en une protéine plasmatique humaine, naturelle ou recombinante.
Dans des modes de réalisation préférés, la protéine plasmatique est le Facteur
VII humain, naturel ou recombinant.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée,
par
les exemples suivants.
EXEMPLES
Exemple I : Obtention d'un support d'affinité
- Tampon de greffage : Acétate de sodium 100mM, pH = 4,2
- Préparation de 1595 pl d'aptamère à 2,5 g/1 dans tampon de greffage soit : 4
mg
d' aptamère.
- Pour le greffage, on a utilisé respectivement :
a) pour la réalisation d'un premier support d'affinité, un aptamère comprenant
le polynucléotide Mapt 2CS de séquence SEQ ID N 1 comprenant à son extrémité
5' une
chaîne C 11 hydrophile (11-amino-3,6,9-trioxaundécan-ly1)
b) pour la réalisation d'un second support d'affinité, un aptamère comprenant
le polynucléotide Mapt 1.2 de séquence SEQ ID N 2 lié à son extrémité 5'
à une
chaîne espaceur composée de 12 méthylènes (CH2) (espaceur C12) et lié à son
extrémité
3' à un oligo-dT
c) cpour la réalisation d'un troisième support d'affinité, un aptamère
comprenant le polynucléotide Mapt 2 CS de séquence SEQ ID N 1 lié à son
extrémité 5' à une chaîne espaceur composée de 6 méthylènes (CH2) (espaceur
C6)
- Préparation d' lml de gel comprenant des groupes acides carboxyliques
activés par le
NHS à savoir le gel pré-activé NHS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) en
réalisant un lavage avec HC1 1mM, puis un lavage avec le tampon de greffage.
- On a vérifié que le pH dans la préparation d'aptamère dans la solution
tampon était
de 4,2
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
- On a mélangé la préparation d'aptamère avec lml de gel pré-activé. Le gel
pré-activé
a été incubé en présence des aptameres sous agitation pendant 48h (+/- 2H) à 4
C
- On a ajouté un demi volume réactionnel (7970) de Tampon borate 200mM pH=9
en
agitant, puis on a incubé pendant 8h sous agitation à 4 C
5 - On a récupéré le surnageant et on a dosé la quantité d' aptamères non
greffés
- On a ajouté 2m1 de Tris-U CL 0,1M pH = 8.5 sous agitation pendant 2h30 à 4 C
pour
bloquer la réaction de couplage.
- On a réalisé 3 cycles d'ajout /agitation /élimination du surnageant
comprenant : 1)
lml de Tris-FIC1 0,1M pH = 8.5 puis 2) 1ml d'acétate de sodium à 0,1M NaC1 0,5
M,
10 pH = 4,0, afin d'obtenir un support d'affinité prêt à l'emploi.
A toute fin utile, on indique que le gel NFIS Activated Sepharose 4 fast
flow
(GE) est un gel d'agarose réticulé présentant à sa surface des fonctions
acides
carboxyliques activés par le NHS. Les fonctions acides carboxyliques ont été
introduites à
la surface du gel par greffage de l'acide 6-aminohexanoique. Ce gel d'agarose
pré-activé
15 est décrit dans le manuel d'instructions techniques N 71-5000-14 AD daté
de mars 2011
et édité par GE Healthcare. Le gel NHS activated Sepharose 4 Fast Flow
présente une
densité en fonctions acides carboxyliques activées allant de 16 à 23
..tino1/m1 de gel.
Les résultats montrent qu'à l'issue de la réaction de couplage, le surnageant
du
milieu réactionnel ne comprend pas de quantité détectable d'aptamère
nucléique, c'est-à-
20 dire, dans les conditions d'analyse utilisées, comprend une quantité
d'aptamère inférieure
0,08rrigiml
Il peut être déduit de ces résultats que le rendement de greffage est de 100%,
ou très proche de 100%.
25 Exemple 2: Utilisation d'un support d'affinité pour la purification de
Facteur VII
humain recombinant produit dans le tait de lapines transgéniques.
- Gel : 1ml greffé avec Mapt 2CS- PEG(C11) préparé comme décrit à l'exemple 1,
à
4mg/m1 paeké dans une colonne XK-16 (GE)
30 - Injection d'une composition de facteur FVII humain recombinant
purifié, produit
dans le lait de lapines transgéniques (FVII-TG) : 100 ou 200 ou 100Oug de FVII-
TG
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
36
La composition de FVII-TG utilisée pour l'injection est préparée par
neutralisation du citrate contenu initialement dans la foiniulation par du
CaC12 et
modification du tampon de formulation pour obtenir : entre 35 et 40 mM de NaCl
et entre
3,2 et 4 rnM de MgC12
- Tampon utilisé pour la chromatographie :Tris 50mM / NaCl 50mM / CaC12 10rnM
/
MgC124-mM
- Débit : 0,5m1/min
- Tampon d'Elution : Tris 50mM, EDTA 10mM, pH = 7.4
- Tampon de lavage ou régénération : NaCI1MfPropylène glycol 50%
- Solution de sanitisation utilisée entre chaque essai : 0,1 ou 0,5 M NaOH
(1m1) +
NaCl 1M/Propylène glycol 50% (2x 1m1)
Les résultats sont représentés sur les figures 1 à 5.
Les figures 1 et 2 montrent que la presque totalité du facteur VII humain est
retenu sur le support d'affinité au moment du passage de la composition à
purifier, quelle
que soit la quantité de Facteur VII contenue dans la composition de départ. On
a estimé,
pour les deux quantités de facteur VII à purifier (100 g et 200 lag) que moins
de 10% du
Facteur VII contenu dans la composition de départ n'est pas retenu sur le
support
d'affinité. Les figures 1 et 2 montrent aussi un pic d'élution étroit, ce qui
illustre les
excellentes propriétés chronaatographiques du support d'affinité de
l'invention.
La Figure 3 illustre le profil chromatographique obtenu avec une composition
de départ contenant 1 mg de Facteur VII humain. Le profil chromatographique de
la
Figure 3 est très similaire à ceux représentés sur les figures I et 2, ce qui
illustre la très
grande capacité de rétention d'un ligand cible du support d'affinité de
l'invention.
Les figures 4 et 5 illustrent les profils chromatographiques obtenus par
purification d'une quantité de Facteur VII humain de 200 ug (Figure 4) et 1000
g (Figure
5) sur un support d'affinité préparé comme décrit à l'exemple 1 et ayant subi
des étapes de
traitement drastique de sanitisation avec une solution de sanitisation
comprenant un
mélange de 0,5 M NaOH et de 504)/0 de propylène glycol. Les profils
chrornatographiques
obtenus montrent la capacité de résistance d'un support d'affinité selon
l'invention à des
traitements délétères de sanitisation.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
37
On précise que le même profil chromatographique est obtenu lorsqu'on réalise
une succession de purifications de Facteur VII humain transgénique et d'étapes
de lavage
et de sanitisation. Ceci démontre l'excellente stabilité du support
d'affinité, qui permet de
réaliser la purification de ligands cibles d'intérêt de manière extrêmement
reproductible.
Exemple 3 : rendement de greffage en fonction de la quantité d'aptamères
utilisés et
capacité de charge des supports d'affinités obtenus
L'influence de la quantité d'aptamères sur le rendement de greffage et la
capacité de charge des supports d'affinité a été étudiée pour les aptamères
Mapt 2CS-(C11
hydrophile) et Mapt 2.2CS-(C1 I hydrophile). Le protocole de greffage utilisé
est identique
à celui décrit dans l'exemple 1. L'aptamère Mapt 2.2CS-(C11-hydrophile)
résulte du
couplage de Mapt 2.2CS de séquence SEQ ID N 3 et du 11-(tiifluoroacétamido)-
3,6,9-
trioxaundécan-l-y1-[(2-cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)1-phosphoramidite
(Link
Technologies) suivie de la génération du groupe phosphodiester par oxydation
et
élimination du groupe cyanoéthyle et de la déprotection subséquente de la
fonction amine
primaire présente à l'extrémité de la chaîne espaceur. Mapt 2.2Cs est dirigé
contre le
facteur VII.
La capacité de charge (ou autrement dit la capacité de rétention) des supports
d'affinité, exprimée en mg de FVII par ml de gel, a été évaluée par injection
d'une
composition de FVII humain recombinant dans le tampon "Tp5" (Tris 50 mM, CaC12
10mM, pH" 7,5).
Les tableaux 1 et 2 ci-dessous présentent le rendement de la réaction de
greffage des aptamères Mapt 2CS-PEG(C11) et Mapt 2.2CS-PEG(C11) sur le gel pré-
activé NHS Activated Sepharose 4 fast flow (GE) en fonction de la quantité
d'aptamères engagée dans la réaction par ml de gel. Le rendement a été
déterminé par
quantification de la quantité d'aptamères présents dans le surnageant à
l'issue de la
réaction de couplage par PCR quantitative.
La quantité finale d'aptamères greffés par ml de gel est également indiquée
dans les tableaux 1 et 2 ci-dessous.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183 PCT/1B2011/056028
38
Tableau 1 : Influence de la quantité d'aptamère Mapt 2CS par ml de gel sur le
rendement
de la réaction de couplage et les caractéristiques du support d'affinité
obtenu
1
Quantité Rendement Quantité Quantité Pourcentage des
d'aptamères de la réaction d'aptamères d'aptamères sites
acides
engagée en de couplage greffés en greffés
en carboxyliques du
mg/mi de gel mg/m1 de gel fflol/m1 de gel gel couplés à
un
aptamère
0.1 99,97 % 0,1 0,007 0.04 %
0.2 99,96% 0,2 0,014 0.07 %
0.6 99,95% 0,6 0,042 0.21%
....
0.8 99,94% 0,8 0,056 0.29%
1,0 100% 1,0 0,07 0.36%
2,0 100% 2,0 0,12 0.6%
3,5 100% 3.5 0,23 1.2%
6,0 97% 5.8 0.39 2%
_
Tableau 2: influence de la quantité d'aptamère Mapt 2.2 CS par ml de gel sur
le
rendement de la réaction de couplage et les caractéristiques du support
d'affinité obtenu
Quantité Rendement Quantité Quantité Pourcentage des
d'aptamères de la réaction d'aptamères d'aptamères sites
acides
engagée en de couplage greffés en greffés
en carboxyliques du
mg/mi de gel mg/mi de gel ginol/m1 de gel gel couplés à
un
aptamère
0.1 100% 0,1 0,007 0.04 %
3,5 100% 3,5 0,23 1.2%
6,0 92,6% 5,55 0.37 1.9%
_
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
39
Les rendements de couplage obtenus pour les aptamères Mapt 2.2Cs-
PEG(C11) et Mapt2Cs-PEG(C11) sont compris entre 90% et 100% pour toutes les
quantités d'aptamères testées. De manière remarquable, il est possible de
greffer jusqu'à
0.4 urnol par ml de gel, ce qui correspond à un pourcentage de
fonctionnalisation des
fonctions acides carboxyliques activées présents à la surface du gel de 2%.
La capacité de charge des supports d'affinité pour le FVII humain recombinant
varie de manière linéaire avec la quantité d'aptamères greffés par ml de gel.
On n'observe
donc pas d'effet de saturation de la capacité de charge du support et donc de
perte de
fonctionnalité des aptamères pour les quantités élevées d'aptamères greffés.
Au vu de ces résultats, il pourrait être possible d'obtenir des supports
d'affinité
présentant une densité d'aptamères greffés supérieure à 6mg/m1 et ayant une
capacité de
charge pour le FVII supérieure à 8 mg de FVII recombinant humain par mL de
gel.
Le tableau 3 ci-dessous présente la capacité de charge des supports d'affinité
en fonction du nombre d' aptamères greffés à leur surface.
Tableau 3: Capacité de charge des supports d'affinité obtenus
Mapt 2CS-PEG(C11) Mapt 2.2CS-PEG(C11)
Quantité d'aptamères 0,1 1,00 3,50 5,80 1,00 3 ,50
5,60
greffés en mg/m1 de
gel
Quantité d'aptamères 0.007 0.07 0.23 0.39 0.07 0.23 0.37
greffés en umol/m1 de
gel
Capacité de charge en 0,05 1,00 3,60 5,40 1,6 5,2
8,0
FVII humain exprimée
en mg de FVII/ml de
gel
Exemple 4 : Essais comparatifs de greffage chimique d'acides nucléiques sur un
support solide pré-activé par des groupes NHS
4.1. Essais comparatifs en utilisant différentes conditions de pH
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
On a réalisé des essais comparatifs de greffage du support pré-activé de
départ
utilisé à l'exemple 1, dans des conditions de pH neutre ou légèrement alcalin,
comme
décrit dans le Tableau 4 présenté ci-après :
5 Tableau 4
Modification
Mapt2 Quantité Conditions:
(nature de Essai
CS d'aptamère Tampon de greffage
l'espaceur)
Oligo I Essai 1 6,5mg MOPS 100mM, CaC12 10mM,
Oligo 1 Essai 2 6,5mg 'pH7,0 (Condition 1)
5' amine
espaceur C6 MOPS 100mM, CaC12 10mM NaC1
Oligo 1 Essai 3 6,5mg
0,5M , pH7,0
(Condition 2)
NaFIC03 0,2M, NaC1 0,5M, pH 8.3
5' amine Essai 4 3,5mg
= (Condition 3)
Oligo 4 espaceur C12
NaHCO3 0,2M, NaC1 2 M, pH 8.3
3'dT Essai 5 3,5mg
(Condition 4)
5' amine
MOPS 100mM, CaC12 10mM,
Oligo 5 espaceur C11 Essai 5 6,5mg
Na.CI 0,5M pH7,0 (Condition 2)
hydrophile
On a utilisé le protocole suivant :
1m! de gel rincé avec 15m! HClImM puis 7m1 de tampon de greffage. Ajout des
6,5
ml (ou 3,5m1) de Mapt2CS à 1g/1 et incubation du gel avec Mapt2CS pendant 4
heures
10 à température ambiante
- Neutralisation des sites activés par un tampon Tris 50mM pH = 7.4
On a mesuré la quantité d'aptamères non greffés en sortie de colonne
après l'étape de greffage. Les résultats montrent que le rendement de greffage
varie de 0%
à 10% au maximum, quelles que soient les conditions de greffage décrites dans
le Tableau
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
41
1 qui ont été utilisées. Contrairement à ce qu'ont observé Goss et al.
(supra), une salinité
élevée n'est pas suffisante pour augmenter le rendement de couplage.
4.2. Essais comparatifs en neutralisant les charges négatives des acides
nucléiques à
greffer par l'ajout de cations divalents ou par l'ajout de NaCI.
On a utilisé le protocole suivant :
- 1000. de gel rincé avec 15ml HC1 imM puis 700p1 de tampon de greffage /
Ajout
des 650 ul de Mapt2CS (oligo 5) à 130mg,/1 et incubation du gel avec Mapt2CS
pendant 4 heures à température ambiante
- Conditions mises en oeuvre :
^ Condition 1: Tampon MOPS 92mM pH = 7,0, CaCl2 200mM, MgC12
200mM
it Condition 2: Tampon MOPS 92mM pH ¨ 7,0, CaC12 200mM, MgC12
200mM
= Condition 3 : NaHCO3 0,2M, NaC10,5M, pH 8.3
^ Condition 4 : NaHCO3 0,2M, NaC12 M, pH 8.3
On a mesuré la quantité d'aptamère non greffé en sortie de colonne après
l'étape de greffage. Les résultats montrent que le rendement de greffage,
quelles que
soient les conditions de greffage décrites ci-dessus, varie de 0% à 10% au
maximum.
Il résulte de l'ensemble des expériences ci-dessus présentées que la mise en
uvre de l'étape de couplage en présence d'un pH basique ou neutre tel que
recommandé
dans l'état de la technique ou dans les notices d'utilisation des gels pré-
activés fournit un
rendement de couplage des aptamères sur le gel pré-activé très faible c'est-à-
dire inférieur
à 10% .
L'augmentation de la force ionique par utilisation d'une solution de NaCl à
une concentration allant jusqu'à 2M ou l'utilisation de sels de cations
divalents
susceptibles de masquer les charges négatives des aptamères ne permettent pas
d'augmenter le rendement de couplage.
Contrairement à ce qu'aurait pu attendre l'homme du métier, la mise en oeuvre
de l'étape de couplage en présence d'un pH acide permet d'augmenter de manière
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
42
significative le couplage des aptamères sur le support pré-activé sans nuire à
la capacité de
liaison desdits aptamères à leur protéine cible.
Exemple 5 Modulation des paramètres de mise en oeuvre de mise en uvre de la
réaction de couplage selon la présente invention
L'influence du pH, de la température et de la durée de réaction a été évaluée
afin de déterminer les paramètres contrôlant la réaction de couplage des
fonctions acides
carboxyliques activées du gel ( NHS-activated Sepharose 4 fast Flow) avec les
fonctions
amines primaires aliphatiques présentes sur les chaînes espaceurs des aptamère
Mapt 2CS-
PEG (C11).
Le protocole suivant a été suivi :
- Le tampon de greffage a été préparé à l'aide partir d'acétate de sodium
100 mM avec
ajustement au pH désiré sauf pour la mise en uvre de la réaction à un pH =
8,3 où un
tampon de NaHCO3 a été préparé.
- Une solution d'aptamères Mapt 2CS-PEG (C11) à une concentration de 2 g/L
dans le
tampon de greffage a été préparée.
-1 mL de la solution d'aptamère a été mélangé à 1 mL de gel et incubé à la
température
désirée, sous agitation. L'avancement de la réaction de couplage est suivi par
quantification des aptamères présents dans le surnageant.
- A l'issue du suivi cinétique de la réaction, le milieu réactionnel a été
additionné de 1 mL
de tampon borate à 200 mM à pH 9 sous agitation puis incubé pendant 3h sous
agitation à
4 C. Le surnageant a été prélevé pour le dosage final du surnageant. La
neutralisation des
fonctions acides carboxyliques résiduelles du gel a été effectuée par ajout de
2 mL de
tampon Tris-HC1 à 0,1 M et à pH = 8,5 sous agitation pendant 2h30 à 4 C.
- 3 cycles d'ajout /agitation /élimination du surnageant comprenant : 1)
iml de Tris-HC1
0,1M pH = 8.5 puis 2) lml d'acétate de sodium à 0,1M NaC1 0,5 M, pH = 4,0 ont
été
effectués.
- Le surnageant a été éliminé. Le gel ainsi obtenu est stocké dans du
tampon Tpl
additionné de 0,2% d'azide pour stockage à 4 C.
Les résultats du suivi cinétique de la réaction de couplage en fonction de la
température, de la durée de réaction et du pH sont présentés dans le tableau 5
ci-après :
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183 PCT/1B2011/056028
43
Tableau 5 : Influence de la température de réaction (TA: température
ambiante), du pH et
de la durée de réaction
pH T C Durée Rdt de réaction
(%)
Influence du 3,8 5 C 48h 99,8
pH 4,3 5 C 48 h 98,4
4,8 5 C 48 h 75,9
5,6 5 C 48 h 64,9
8,3 5 C 481i 10
Influence de la 4,3 5 C 24h 99,5
température et 4,3 5 C 2h 100
de la durée de 4,3 5 C 4h 100
réaction 4,3 5 C 6h 100
4,3 5 C 8h 100
4,3 5 C 24h 100
4,3 5 C 48 h 97,8
4,3 TA* lh 100
4,3 TA* 2h 100
4,3 TA* 3h 100
4,3 TA* 3h 99,8
Comme cela est illustré dans le tableau 5 ci-dessus, le pH est un paramètre
crucial pour la mise en oeuvre de la réaction de couplage selon l'invention.
La mise en oeuvre de la réaction selon les conditions décrites dans l'état de
la
technique, c'est-à-dire à un pH basique de 8,3, offre un rendement de couplage
très faible
d'au plus 10%. La diminution du pH permet d'améliorer de manière significative
le
rendement de la réaction. On observe en particulier un rendement d'au moins
98% pour un
pH d'environ 3,8 à 4,3. Un tel résultat est tout à fait surprenant : l'homme
du métier
s'attendrait à un faible rendement de couplage à ces pH en raison de la
dégradation des
acides nucléiques par hydrolyse acide et de la diminution de la réactivité des
amines
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
44
primaires. Au vu de ces résultats expérimentaux, il apparaît que la réaction
de couplage
peut être conduite indifféremment à basse température ou à température
ambiante.
De manière remarquable, les supports d'affinité obtenus à pH = 3,8 ou à
température ambiante à pH = 4,3 présentent une capacité de charge (c'est-à-
dire une
capacité de rétention) du Facteur VII recombinant humain équivalent aux
supports obtenus
à pH = 4,2 et à 5 C. De manière générale, les capacités de charge obtenues
sont
particulièrement élevées ce qui traduit non seulement un haut taux de greffage
des
aptamères mais aussi le maintien de la capacité des aptamères à se lier
spécifiquement à
leur protéine cible. En d'autres ternies, la mise en uvre à température
ambiante et à un
pH inférieur à 4,5 de la réaction de couplage entre les fonctions acides
carboxyliques
activées du support et les fonctions amines primaires présentes au niveau de
I' espaceur des
aptamères pefinet non seulement d'obtenir un rendement de greffage proche de
100%
mais également un maintien de l'intégrité fonctionnelle des aptamères.
Exemple 6 : modes de réalisation additionnels d'un support d'affinité
D'autres supports d'affinité ont été préparés en faisant varier (i) les
conditions
de greffage ainsi que (ii) les types d'aptamères utilisés.
6.1. Types d'aptamères greffés
Concernant les types d'aptamères, on a utilisé respectivement des aptamères
comprenant un polynucléotide ADN et des aptamères comprenant un polynucléotide
ARN. De plus, pour certains aptamères, le polynucléotide est lié à une chaîne
espaceur par
son extrémité 5' alors que pour les autres aptamères, le polynucléotide est
lié à une chaîne
espaceur par son extrémité 3'. Egalement, on a utilisé des aptamères
comprenant une
chaine espaceur hydrophile ou une chaîne espaceur hydrophobe.
Les aptamères utilisés à l'exemple 6 sont les suivants :
Paptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt 2 CS" de séquence SEQ ID N
1 comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur C11 hydrophile décrite pour
la
préparation du premier support d'affinité divulgué au paragraphe "a)" de
l'exemple 1,
ledit aptamère étant désigné "Mapt2CS oligo5 (5'Amine C11 hydrophile)" dans le
Tableau 6;
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
- l'aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt 2 CS" de séquence SEQ
ID N 1
comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur C6 hydrophobe décrite pour la
préparation du troisième support d'affinité divulgué au paragraphe "c" de
l'exemple 1 et
comprenant à son extrémité 3' un résidu de désoxyribothymidine inversé (3'-dT-
5`), ledit
5 aptamère étant désigné "Mapt2CS oligo2 (S'Amine C6 et 3' dT) dans le
Tableau 6;
- l'aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt2 CS" de séquence SEQ ID
N 1
comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur C12 hydrophobe décrite pour
la
préparation du second support d'affinité divulgué au paragraphe "b" de
l'exemple 1, ledit
aptamère étant désigné "Mapt2CS oligo3 (5' Amine C12)" dans le Tableau 6;
10 - l'aptamère comprenant le polynucléotide ADN "Mapt2 CS" de séquence SEQ
N 1
comprenant à son extrémité 3' la chaîne espaceur C6 hydrophobe décrite pour la
préparation du troisième support d'affinité divulgué au paragraphe "c" de
l'exemple 1,
ledit aptamère étant désigné "Mapt2CS oligo7 (3' Amine C6)" dans le Tableau 6;
- l'aptamère comprenant le polynucléotide ARN "Mapt ARN Anti FIXa" de séquence
15 SEQ ID N 4 comprenant à son extrémité 5' la chaîne espaceur C11
hydrophile décrite
pour la préparation du premier support d'affinité divulgué au paragraphe "a)"
de
l'exemple 1 et comprenant à son extrémité 3' un résidu de désoxyribothymidine
inversé
(3'-dT-5'), ledit aptamère étant désigné "Mapt ARN Anti Ma 5' Amine C11
hydrophile" dans le Tableau 6.
20 On a aussi préparé un support d'affinité sur lequel a été greffé un
aptamère
comprenant le polynucléotide ADN "Mapt1.2 CSO" de séquence SEQ ID N 5
comprenant
à son extrémité 5' la chaîne espaceur Cl 1 hydrophile décrite pour la
préparation du
premier support d'affinité divulgué au paragraphe "a)" de l'exemple 1, ledit
aptamère étant
désigné "Mapt1.2CSO oligo5 (S'Amine C11 hydrophile)". Les résultats concernant
ce
6.2. Conditions de greffage de l'aptamère ARN
L'aptamère ARN de séquence SEQ ID N 5 a été greffé dans les conditions
- 300 ig d'aptamère ARN ont été incubés avec 500 uL de gel, à la
concentration finale
de gel de 0,6 g/L.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
46
- la réaction de greffage a été réalisée pendant 2,5 heures à 17 C (TA) et à
pH 4,2.
- puis la réaction a été stoppée par neutralisation avec un tampon borate 200
rnM
pendant 2,5 heures à 17 C et à pH 9.
- on a mesuré la quantité résiduelle d'aptamères non greffés dans le
surnageant afin de
déterminer le rendement de greffage, par électrophorèse en gel d'agarose et
coloration
au GelRed (à 3,5%), puis comparaison avec une gamme étalon de quantités
connues
de l'aptamère ARN chargées sur d'autres pistes du même gel d'électrophorèse.
Les résultats montrent que le rendement de greffage était supérieur à 99%. Ces
résultats montrent que le procédé de greffage à un pH inférieur à 5 est
efficace pour le
greffage de tous les types de ligands nucléiques, que ces ligands nucléiques
comprennent
un polynucléotide ADN ou un polynucléotide ARN (et donc également les ligands
nucléiques comprenant un polynucléotide hybride ADN/ARN), y compris les
ligands
comprenant un polynucléotide à bases modifiées, y compris un polynucléotide
ARN à
bases modifiées.
6.3. Efficacité de la réaction de greffage
La réaction de couplage a été réalisée comme décrit à l'exemple 5, sauf
indication spécifique concernant la durée, la température et le pH. Les
résultats sont
présentés dans le Tableau 6 ci-après.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
47
Tableau 6
Taux de greffage
Conditions de
visé Rdt de greffage
Aptamère greffage*
(mg/mL de (%)**
(durée; Temps; pH)
gel)**
48h; 5 C; pH 4,3 4,4 r---f100
48h; 5 C; pH 3,8 4,4 100
Mapt2CS oligo5
2h; 5 C; pH4,3 4,4 Fr, 100
(5' Amine Cil
lh; TA; p114,3 4,4 100
Hydrophile)
2h; 5 C; sans
4,4 100
neutralisation pH
Mapt2CS oligo2
(5' Amine C6 et 3'2h; TA; pH4,3 0,7 100
dT)
Mapt2CS oligo3 (5'
2h; TA; pH4,3 0,7 7--=, 100
Amine C12)
Mapt2CS oligo7 (3'
2h; TA; pH4,3 0,8 100
Amine C6)
Mapt1.2CSO oligo5
(5' Amine Ci 1 2h; 5 C; pH4,3 ND*** 100
Hydrophile)
Mapt ARN Anti
FIXa
5'Amine C11 2h; TA; pH4,2 0,6 100
Hydrophile et
3'dT5'
Durée de la réaction de couplage exprimée' en heures; Température exprimée en
degrés
Celsius ¨ TA= température ambiante (18 C-25 C)
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
48
** Le taux de greffage visé est atteint pour un rendement de greffage de 100%.
Le
rendement de greffage a été mesuré comme décrit à l'exemple 3
*** ND= Non Déterminé
Les résultats du tableau 6 montrent que, pour un aptamère donné, un
rendement de greffage de 100% est obtenu quelles que soient les conditions
testées.
En particulier, ces résultats confirment ceux de l'exemple 4, et plus
spécifiquement les résultats du Tableau 5, qui montrent qu'un rendement de
greffage
maximal est obtenu, même au pH très acide de 3,8. Ces résultats confirment
aussi la
cinétique rapide de la réaction de couplage réalisée à température ambiante.
Il est également montré que l'étape de neutralisation à pH 9, subséquente à la
réaction de couplage, n'est pas essentielle pour l'obtention d'un rendement de
greffage
maximal, puisque le taux et le rendement de greffage dans ces conditions sont
identiques à
ceux observés lorsque l'étape de neutralisation est réalisée (voir Tableau 6
ci-dessus).
Les résultats du Tableau 6 montrent aussi que la nature hydrophile ou
hydrophobe de la chaîne espaceur de Paptamère n'a pas d'influence sur
l'efficacité du
greffage. Il est également montré que le greffage est aussi efficace lorsque
la chaîne
espaceur, hydrophile ou hydrophobe, est liée à l'extrémité 5' ou à l'extrémité
3' du
polynucléotide ADN ou ARN.
On ajoute que la neutralisation préalable des charges du polynucléotide ADN
par incubation de celui avec un Polybrenee (Hexamethrine bromide, 1,5-Dimethy1-
1,5-
diazaundecamethylene polymethobromide) rend impossible la réalisation de la
réaction de
couplage.
6.4. Fonctionnalité des supports d'affinité.
On a testé la fonctionnalité de supports d'affinité sur lesquels a été
immobilisé
Paptamère "Mapt2CS oligo5" décrit au 6.1. ci-dessus, respectivement dans les
conditions
de température, durée et pH de la réaction de couplage suivantes :
- Conditions n 1 : 48h, 5 C, pH 4,2;
- Conditions n 2 : 48h, 5 C, pH 3,8;
- Conditions n 3 : 2h, 5 C, pH 4,2; et
= - Conditions n 4: lh, TA (Température Ambiante), pH 4,2.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
49
Pour le test, on a utilisé 500 Fil de gel greffé avec les aptamères dans
chacune
des conditions n 1 à 4 ci-dessus, à la concentration finale de 4,4 mg/mL.
Pour chacun des supports de chromatographie, on a injecté 2,7 mg d'une
composition de FVII humain recombinant purifié, produit dans le lait de
lapines
tyransgéniques (FVII-TG).
La composition de FVII-TG utilisée pour l'injection est préparée par
neutralisation du citrate contenu initialement dans la formulation par du
CaC12 et
modification du tampon de foimulation pour obtenir : entre 35 et 40 naM de
NaCl et entre
3,2 et 4 mM de MgC12
- Tampon utilisé pour la chromatographie : Tris 50mM / CaC12 10mM, pH 7,5
- Débit : 0,5m1/min
- Tampon d'Elution : Tris 50mM, EDTA 10mM, pH = 7,5
Les résultats sont représentés sur les figures 6 à 9, respectivement pour les
conditions de couplage n 1 à 4 décrites ci-dessus. Les résultats sont aussi
réprésentés dans
le Tableau 7 ci-dessous.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
Tableau 7
Conditions de couplage
fraction de FMI non fraction de FVH éluée
(durée; Température; pH) retenue sur la colonne (1)/0)
(%)
n 1 : 48h; 5 C; pH 4,2 5 95
n 2 : 48h; 5 C; pH 3,8 24 76
n 3 : 2h; 5 C; pH 4,2 15 85
n 4 : lh; TA; pH 4,2 5 95
5 Les résultats des figures 6 à 9 et du Tableau 7 ci-dessus montrent
que la
presque totalité du facteur VII humain est retenu sur le support d'affinité au
moment du
passage de la composition à purifier, à l'exception du support d'affinité
préparé par
greffage selon les conditions n 2 (4814 5 C, pH 3,8) pour lequel on observe
un taux de
rétention du facteur VII qui est substantiel mais pas maximal.
10 Les résultats montrent aussi que la totalité du facteur VII humain
retenu sur le
support d'affinité est libéré lors de l'étape d'élution.
Ces résultats montrent que des supports d'affinité totalement fonctionnels
peuvent être préparés en utilisant les conditions de greffage n 1 et n 3-4,
ce qui signifie
que les conditions de température et de durée du greffage ne sont pas
absolument
En particulier, on oberve que les conditions de couplage des aptamères
pendant une durée courte (1 heure) et à température élevée (température
ambiante) (i)
permet un taux de greffage de 100% des aptamères et (ii) n'entraîne aucune
altération dans
En revanche, les résultats moins bons obtenus avec le support d'affinité
préparé par couplage des aptamères à pH 3,8 montrent que les conditions de pH
sont
importantes pour le maintien de l'intégrité des aptamères gerffés, et en
partculier pour le
maintien de l'aptitude des aptamères greffés à se lier au facteur VII humain
cible. Lorsque
25 la réaction de couplage est réalisée à pH 3,8, on obtient un support
d'affinité qui reste
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
51
fonctionnel pour enrichir sélectivement un échantillon de départ en facteur
VII humain.
Toutefois, un tel support d'affinité ne peut être valablement utilisé dans le
cadre d'un
procédé industriel de purification du facteur VII humain, en raison de la
perte importante
de facteur VII (plus de 20%) et donc du caractère économiquement désavantageux
d'un tel
procédé.
Exemple 7 : Maintien de Pintergrité du support d'affinité dans des conditions
d'uilisation indutrielle impliquant des contacts en milieux biologiques et une
étape de
sanitisation puissante (soude à la concentration 1M)
Dans l'exemple 7, on montre que des supports d'affinité tels que définis dans
la
présente description conservent leur capacité de rétention et d'élution de la
protéine cible,
même après de nombreux cycles d'utilisation, dans des conditions de mise en
oeuvre
industrielles
7.1. Préparation des supports de greffage
Trois supports de greffage ont été préparés comme décrit à l'exemple 1, en
utilisant
respectivement chacun des trois a.ptamères suivants :
- support de greffage n 1 : un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt 2CS
de
séquence SEQ ID N 1 comprenant à son extrémité 5' une chaîne C11 hydrophile
(11-
amino-3,6,9-trioxaundécan- I yl),
- support de greffage n 2 : un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt
2.2CS de
séquence SEQ ID N 3 comprenant à son extrémité 5' une chaîne C11 hydrophile
(11-
amino-3,6,9-trioxaundécan-ly1), et
- support de greffage n 3 : un aptamère comprenant le polynucléotide Mapt
2.2
CS de séquence SEQ ID N 3 lié à son extrémité 5' à une chaîne espaeeur
composée
de 6 méthylènes (CH2) (espaceur C6)
Les rendements de greffage ont été respectivement de 100% (support de greffage
n 1), de 93% (support de greffage d 2) et de 87% (support de greffage n 3).
La capacité statique théorique des supports d'affinité préparés, c'est-à-dire
la
quantité de FVII humain qui devrait être retenue sur les supports d'affinité
si chacun des
aptamères greffés liait une molécule de FVII humain, était respectivement de
18.7 mg par
mililitre de support (support n 1), 17,3 mg/m1 (support n 2) et 16,3 mg/mi
(support n 3).
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
52
7.2. Conditions opératoires du procédé de purification de FVII humain.
On a utilisé une composition de FVII-TG enrichie en FVII humain, la
concentration finale de FVII-TG étant d'environ 50 000 ppm, ladite composition
comprenant une forte proportion de formes des-gla de FVII (foimes inactives de
FVII) et
ladite composition possédant une activité spécifique FVII d'environ 0,4
(activité exprimée
en activité amidolytique/antigène).
Le protocole général est le suivant :
- équilibrage du support dans le tampon TP4 (Tris 50 mM, CaCl2 10 mM, MgC12 4
mM,
pH 7,5), en utilisant un volume de tampon de cinq fois le volume du support
greffé,
- injection de la matière première (composition de FVII-TG), préalablement
dialysée
contre un tampon Tris 50 mM, CaC12 10 mM, MgC12 4 mM,
- lavage avec le tampon de lavage (huit fois le volume du support greffé),
et
- équilibrage avec le tampon d'équilibrage Tris 50 mM, EDTA I 0 mM à pH 7,5
(trois
fois le volume du support greffé)
7.3. Propriétés des supports pour la purification du FVII humain_
On a testé la capacité des trois supports préparés comme décrit au paragraphe
7.1.
ci-dessus à retenir sélectivement le FVlla humain actif
On a déterminé que les trois supports avaient une capacité dynamique de
rétention
du FVIIa humain d'environ 10 mg de FVIIa humain par mililitre de support
greffé, ce qui
représente entre 53% et 58% de la capacité statique maximale théorique
calculée au
pragraphe 7.1. ci-dessus. Ces résultats montrent que les aptamères respectifs
greffés sur
les trois supports sont largement accessibles et fonctionnels.
On a aussi montré que chacun des trois supports d'affinité préparés comme
décrit
au paragraphe 7.1. ci-dessus était capable de retenir sélectivement les
molécules de FVII
humain ayant un domaine GLA actif, comme cela est exposé dans le Tableau 8 ci-
dessous.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183 PCT/1B2011/056028
53
Tableau 8
Support Support Support
d'affinité n 1 d'affinité n 2 d'affinité n 3
Départ
FVII (D0280) mg 17 17 15
FVIIam UI 13906 139060 12270
Ratio FVIIam / FVII:Ag 0,41 0,41 0,41
Non retenu
FVII (D0280) mg 7,7 9,7 7,8
FVflam UI 94 273 134
Ratio FVIIam / FVII:Ag 0,006 0,014 0,009
Rendement FVII (DO) % 45,5 56,9 52,1
'Rendement FVIlam % 0,7 2,0 1,1
Eluat
FVII (D0280) mg 7,7 7,3 6,3
FVIIam UI 12270 10675 9055
Ratio FVIIam / FVII:Ag 080 0 71 0,72
Rendement FVII (DO) % 45,3 42,9 42,0
Rendement FVIIam % 88,2 76,8 73,8
Les résultats du Tableau 8 montrent que, à partir d'une composition comprenant
seulement 41% de FVII humain à domaine GLA actif par rapport à la quantité
totale de
FVII humain présente dans ladite composition, on obtient une composition
finale enrichie
en FVII humain qui comprend de 70% à 80% de FVII humain à domaine GLA actif
par
rapport à la quantité totale de FVII humain présente dans ladite composition
enrichie. Ces
résultats montrent que les trois supports d'affinité (i) petniettent la
purification de FVII
humain et (ii) permettent d'obtenir une composition de FVII purifié qui est
enrichie en
forme active de FVII humain, par élimination des foi mes inactives de FVII
humain.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183 PCT/1B2011/056028
54
7.4. Résistance des supports d'affinité vis-à-vis d'un traitement par la
soude.
On a testé la résistance des trois supports d'affinité à un traitement
prolongé par
une solution de soude à 1M.
Les supports préparés comme décrit au paragraphe 7.1. ont été mis en contact
avec
une solution de soude à 1M pendant une durée de 100 heures. Après lavage pour
éliminer
la soude, la capacité de chacun des trois supports d'affinité à purifier le
FVII humain a été
mesurée. Les résultats sont présentés dans le Tableau 9 ci-dessous.
Tableau 9
Support d'affinité Support Support
n 1 d'affinité n 2 d'affinité n 3
Départ
FVI1 (D0280) mg 17 17 15
FVIIam UI 13906 13906 12270
Ratio FVIIam / FVII:Ag 0,41 0,41 0,41
Non retenu
FVII (D0280) mg 8,1 9,2 7,9
FVIIam UI 156 434 163
Ratio FVIIam / FV1I:Ag 0,010 0,024 0,010
'Rendement FVII (DO) % 47,7 53,9 52,5
Rendement FVIIam % 1,1 3,1 1,3
,Eluat
FVII (D0280) mg 7,9 7,1 6,9
FVIIam UI 13560 11500 12215
Ratio FVIIam / FV11:Ag 0,9 0,82 0,89
Rendement FVII (DO) % 46,5 41,5 45,7
Rendement FVIIam % 97,5 82,7 99,6
Les résultats du Tableau 9 montrent qu'un traitement par de la soude à 1M
pendant
une très longue durée (100 heures) n'entraîne aucun changement significatif
dans la
capacité des supports n 1, n 2 et n 3 à purifier le FVII humain.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
7.5. Résistance des supports d'affinité vis-àvis d'un contact prolongé avec
divers milieux
biologiques.
On a testé la résistance des trois supports d'affinité à un traitement
prolongé avec
5 divers milieux biologiques, qui peuvent être utilisés comme produits de
départ dans des
procédés de purification de FVII humain. On a testé en particulier les deux
milieux
biologiques suivants : (i) un cryosurnageant de plasma sanguin humain et (ii)
une solution
de lait clarifié, le lait pouvant constituer une source de FVII humain, par
exemple lorsque
le FVII humain est produit dans le lait d'animaux transgéniques pour le gène
codant le
10 FVII humain,
Le support d'affinité n 1 préparé comme décrit au paragraphe 7.1. a été mis
en
contact avec (i) un cryosurnageant plasmatique humain ou (ii) un lait
clarifié, pendant une
durée de 100 heures, Après lavage pour éliminer le milieu biologique testé, la
capacité de
chacun des trois supports d'affinité à purifier le FVII humain a été mesurée.
Les résultats
15 sont présentés dans le Tableau 10 ci-dessous.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
56
Tableau 10
Support n 1 après Support n 1 après 100
100 heures heures d'incubation en
d'incubation en cryo lait clarifié
surnageant
Départ
FVII (D0280) mg 17 17
FVIIam Ul 13906 13906
Non retenu
FVII (D0280) mg 9,3 10,2
FVIIam UI 496 192
Ratio FVIIam / FVII:Ag 0,027 0,009
Rendement FVII (DO) % 54,6 60,2
Rendement FV1Iam % 3,6 1,4
Eluat
FVII (D0280) mg 7,3 7,1
FVIIam UI 12605 13180
Ratio FVIIam / FVII:Ag 0,87 0,93
Rendement FVII (DO) % 42,6 41,8
rendement FVIIam % 90,6 94,8
Les résultats du Tableau 10 montrent que l'incubation d'un support d'affinité
tel que
défini dans la présente description avec des milieux biologiques qui
représentent des
produits de départ pour la purification de FVII humain, pendant une très
longue durée
(100 heures), n'entraîne aucun changement significatif dans la capacité dudit
support à
purifier le FVII humain.
7.6. Résistance de supports d'affinité à la réalisation de cycles de
purification successifs
On a testé la résistance du support d'affinité n 3 préparé comme décrit au
paragraphe 7.1 ci-dessus à subir des cycles successifs de purification de FVII
humain.
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
57
Chaque cycle de purification comprenait les étapes suivantes :
- équilibrage du support d'affinité en tampon TP4 (5 fois le volume du support
d'affinité),
- simulation de mise en contact avec la composition à purifier: injection de
tampon TP4
(5 fois le volume du dupport d'affinité),
élution avec le tampon d'élution (5 fois le volume du support d'affinité),
sanifisation avec une solution de NaOH 1 M durant 10 minutes (5 fois le volume
du
support d'affinité), et
- ré-équilibrage du support d'affinité avec le tampon TP4 (10 fois le volume
du support
d'affinité).
On a réalisé respectivement 15 ou 30 cycles de purification ci-dessus avec le
support d'affinité n 3 et on a déterminé la capacité dudit support à l'issue
des 15 ou 30
cycles à purifier le FVII humain. Les résultats sont réprésentés sur le
Tableau 11 ci-
dessous.
Tableau 11
Support d'affinité n 3 -Support d'affnité n 3 -
15 cycles 30 cycles
Départ
FVII (D0280) mg 15 15
>Non retenu
FVII (D0280) mg 7,2 6,5
Rendement FVII (DO) % 48,3 43,1
Eluat
FVII (D0280) mg 6,5 6,2
Rendement FVII (DO) % 43,0 41,0
CA 02823030 2013-06-25
WO 2012/090183
PCT/1B2011/056028
58
Les résultats du Tableau 11 montrent que la capacité d'un support d'affinité
tel
défini dans la présente description à purifier le FVII humain est inchangée,
même après au
moins 30 cycles de réalisation d'un procédé mimant la purification d'une
protéine cible.
Tableau 12 liste des séquences
N SEQ ID Description
SEQ ID N 1 Aptamère Mapt 2 CS
SEQ ID N 2 Aptamère Mapt 1.2
SEO ID N 3 Aptamère Mapt 2.2 CS
SEQ ID N 4 Aptamère Mapt ARN Anti FIXa
SEQ ID N 5 Aptamère Mapt 1.2 CSO
