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DETERMINATION DU POUVOIR THROMBOGENE
D'IMMUNOGLOBULINES HUMAINES
La présente invention concerne la détermination du pouvoir thrombogène
d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester.
Les immunoglobulines humaines, contenant essentiellement des IgG, sont
utilisées couramment dans la thérapie des pathologies telles que
l'immunodéficience ou
des maladies auto-immunes et particulièrement par voie intraveineuse (MG).
Néanmoins, selon l'observation clinique, l'utilisation des MG chez des
patients
entraîne parfois des effets secondaires graves, comme par exemple des
accidents
thrombo-embo ligues.
Une thrombose embolique consiste en la formation d'un thrombus obturant un
vaisseau sanguin. Le thrombus peut se développer dans la circulation veineuse
et donner
lieu à une thrombose veineuse, ou dans la circulation artérielle et entraîner
une occlusion
artérielle avec ischémie voire infarctus. Un thrombus résulte de la
coagulation sanguine,
par l'agrégation plaquettaire et l'activation du système de coagulation, ceci
étant une
réaction en chaîne qui met en jeu les plaquettes et les facteurs de la
coagulation. Un
thrombus contient essentiellement de la fibrine, une protéine insoluble,
formée à partir du
fibrinogène.
Les facteurs XI et IX font partie des facteurs intervenant dans la coagulation
sanguine par voie intrinsèque. Le facteur IX est activé par le facteur XI
activé, ce dernier
étant lui-même activé par le facteur XII activé. Cette cascade d'activation
aboutit
finalement à la formation du fibrinogène (FI).
Les études de la Demanderesse présentées dans la présente demande ont permis
de montrer que la présence des facteurs de coagulation, tels que le facteur
VII, le facteur
IX, le facteur XI, le facteur XII ou le facteur X et/ou leurs formes activées
dans un
produit d'immunoglobuline humaine, tel que les MG, pourrait être la cause
d'accidents
thrombo-emboliques après l'injection des MG chez des patients.
Par conséquent, il y a une grande nécessité à mettre à disposition un procédé
fiable et sensible permettant de déterminer la présence de facteur VII activé,
de facteur XI
activé, de facteur IX activé, de facteur XII activé et/ou de facteur X activé
dans un
produit biologiquement acceptable contenant des immunoglobulines.
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Le test de génération de thrombine (TGT) est connu de l'homme du métier. Le
principe de ce test concerne l'analyse de la cinétique de la formation de
thrombine qu'un
plasma donné produit en réponse à une stimulation standardisée.
Parmi les TGT développés à ce jour, la thromboélastographie consiste à mesurer
les propriétés physiques d'un sang total en analysant de manière mécanique la
formation
du caillot en fonction du temps. Selon les paramètres extraits d'un graphique
(appelé
thromboélastogramme) généré par le thromboélastographe, on peut évaluer
l'aptitude à la
coagulation d'un patient.
Par ailleurs, Hemker et al. proposent en 2002 le concept de thrombinographie
permettant de mesurer la génération de thrombine par fluorométrie
(Pathophysiol
Haemost thromb 2002; 32: 249-53). La thrombinographie consiste à utiliser un
calibrateur de thrombine et un substrat fluorescent spécifique en plasma
pauvre en
plaquettes ou en plasma riche en plaquettes, afin d'établir un
thrombinogramme. Un
signal induit par la thrombine générée par le facteur tissulaire est confronté
au signal
généré par une quantité normalisée de thrombine exogène dans ce même plasma.
La Demanderesse de la présente demande a trouvé de manière surprenante
qu'un test de génération de thrombine permet également de déterminer la
présence de
FVII, de FXI, de FIX, de FXII, de FX et/ou de leurs formes activées dans un
échantillon.
La présente invention a pour l'objectif de fournir un kit pour la
détermination du
pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un produit
bio logiquement acceptable.
La présente invention a également pour l'objectif de fournir un procédé
permettant de déterminer le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur
VII activé,
XI activé, du facteur IX activé, du facteur XII activé et/ou du facteur X
activé dans un
échantillon susceptible d'être administré chez des humains.
Le premier aspect de l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant
les
éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes,
- des phospholipides,
- du CaC12, et éventuellement
- du facteur tissulaire humain,
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pour déterminer le pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues
dans
un échantillon à tester, notamment biologiquement acceptable, lesdits éléments
du kit et
l'échantillon à tester lorsqu'ils sont mélangés formant un milieu réactionnel.
Le deuxième aspect de l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant
les
éléments suivants:
- un plasma sanguin humain déficient en facteur XI,
- des phospholipides,
- du CaC12, et éventuellement
- du facteur tissulaire humain,
pour déterminer le pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues
dans
un échantillon à tester, notamment biologiquement acceptable, lesdits éléments
du kit et
l'échantillon à tester lorsqu'ils sont mélangés formant un milieu réactionnel.
On entend par plasma sanguin humain déficient en facteur XI , un plasma
sanguin humain contenant moins de 1% (essais fonctionnels et antigéniques) de
la
quantité normale de facteur XI et de facteur XI activé.
Un plasma sanguin déficient en facteur XI est préparé par immuno-adsorption
tel que le plasma déficient en facteur XI commercialisé par la société
Cryopep.
On entend par Immunoglobulines humaines ou IgG humaines dans le
cadre de l'invention, des immunoglobulines polyvalentes qui sont
essentiellement des IgG,
incluant éventuellement des IgM. Il peut s'agir d'immunoglobulines entières,
ou de
fragments tels que F(ab')2 ou F(ab) et toute fraction intermédiaire obtenue au
cours du
procédé de fabrication des immunoglobulines polyvalentes.
Dans le cadre de l'invention, on entend par pouvoir thrombogène , la
capacité d'immunoglobulines humaines à déclencher une coagulation et former un
thrombus chez des patients. Par conséquent, une préparation
d'immunoglobulines
thrombogène est une préparation d'immunoglobulines ayant la capacité
d'induire une
coagulation et former un thrombus chez des patients.
Etant donné que les facteurs de coagulation sont naturellement présents dans
les
plasmas humains, le pouvoir thrombogène d'immunoglobulines est un index
relatif par
rapport à la coagulation sanguine pouvant être déclenchée naturellement chez
des patients.
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On entend un échantillon biologiquement acceptable , un échantillon
susceptible d'être administré chez les humains par voix intraveineuse,
parentérale, ou
intramusculaire. Il peut s'agir notamment de préparations d'immunoglobulines
humaines
à visée thérapeutique.
Par préparations d'immunoglobulines humaines à visée thérapeutique on
entend tout médicament comprenant des immunoglobulines humaines sous une forme
pharmaceutiquement acceptable. Il peut s'agir notamment d'IvIG.
L'utilisation du kit selon la présente invention permet d'établir un
thrombinogramme pour l'échantillon à tester. Un thrombinogramme est représenté
par
une courbe de génération de thrombine caractérisée par plusieurs paramètres :
- Le Temps de latence ou Lagtime (en minutes) qui est corrélé au temps de
coagulation
- L'aire sous le pic ou ETP (Endogenous Thrombin Potential, en nM x min),
directement corrélée à la quantité totale de thrombine générée
- La hauteur de pic ou Peak (en nM), représentant la quantité maximale de
thrombine présente dans l'échantillon au cours de la lecture
- Le Temps au pic ou Time to peak : ttPeak (en minutes), qui est le temps
permettant d'atteindre le sommet du pic
- La Vélocité : Peak/(ttPeak-Lagtime) (en nM/min), représentative de la
vitesse
de formation de la thrombine.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant les
éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI,
- des phospholipides,
- du CaC12, et éventuellement
- du facteur tissulaire humain,
pour déterminer le pouvoir thrombogène, lié à la présence notamment du facteur
VII, du
facteur XI, du facteur IX, du facteur X et/ou de leurs formes activées,
d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester, notamment
biologiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester
formant un
milieu réactionnel.
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Encore plus avantageusement, l'invention concerne l'utilisation d'un kit
comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes,
5 - des phospholipides,
- du CaC12, et éventuellement
- du facteur tissulaire humain,
pour déterminer le pouvoir thrombogène, lié à la présence notamment du facteur
XII
et/ou de sa forme activée, d'immunoglobulines humaines contenues dans un
échantillon à
tester, notamment biologiquement acceptable, lesdits éléments du kit et
l'échantillon à
tester formant un milieu réactionnel.
Par plasma sanguin humain déficient en facteur XI et pauvre en plaquettes ,
on entend un plasma sanguin humain contenant moins de 1% (essais fonctionnels
et
antigéniques) de la quantité normale de facteur XI et moins de 10x 109
plaquettes/L de
plasma.
Un plasma sanguin pauvre en plaquettes est préparé selon une méthode connue
de l'homme du métier telle que la centrifugation.
Par facteur VII activé ou FVIIa , on entend une protéine de FVII capable
d'activer le facteur IX ou le facteur X.
Par facteur XII activé ou FXIIa , on entend une protéine de FXII capable
d'activer le facteur XI.
Par facteur XI activé ou FXIa , on entend une protéine constituée de
deux
sous-unités de 80 kDa, liées entre elle par un pont disulfure à la position
Cys-321 et
capable de reconnaître son substrat naturel : FIX.
Par facteur IX activé ou FIXa , on entend une protéine de FIX capable
de
reconnaître son substrat naturel : FX.
Par facteur X activé ou FXa , on entend une protéine de FX capable de
reconnaitre son substrat naturel la prothrombine.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
l'utilisation d'un kit selon l'invention comprenant en outre un tampon de
dilution tel
qu'un tampon physiologique Tris NaC1 ou un tampon identique à celui de
l'échantillon à
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tester. Il s'agit alors d'un tampon de formulation acceptable pour une
préparation
d'immunoglobulines à visée thérapeutique.
L'échantillon de plasma sanguin humain contenu dans le kit et le tampon de
dilution forment un témoin négatif.
Dans un mode de réalisation particulier, le kit selon l'invention comprend en
outre un substrat fluorogénique ou flurorescent.
Le plasma sanguin humain est prélevé chez des donneurs volontaires sains ne
présentant pas de maladies graves, et contient tous les facteurs de la
coagulation, en taux
normal, intervenant dans la coagulation sanguine par voie intrinsèque.
Dans un mode de réalisation avantageux, le plasma sanguin humain est un pool
de plasmas sanguins humains frais ou congelé ou un plasma sanguin commercial
calibré.
Le plasma sanguin utilisé dans l'invention peut contenir ou être dépourvu de
facteur tissulaire.
Dans un mode de réalisation avantageux, le plasma sanguin humain est
dépourvu de facteur tissulaire.
Dans un mode de réalisation avantageux, le facteur tissulaire humain du kit
est
d'origine plasmatique, d'origine recombinante, ou d'origine transgénique.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne
l'utilisation d'un kit comprenant :
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en FXI, dont
le volume représente de 80% à 40%, notamment de 75% à 50%, particulièrement
53% du
volume du milieu réactionnel.
- des phospholipides humains, dont la concentration finale dans le milieu
réactionnel est de 1 ILLM à 10 ILLM, particulièrement 4 ILLM,
- du facteur tissulaire humain, dont la concentration finale dans le milieu
réactionnel est de 0,05 pM à 10 pM, particulièrement 0,3 pM,
- du CaC12.
Ledit kit peut comprendre en outre un tampon de dilution, notamment du
tampon Tris NaCl.
Dans un mode de réalisation avantageux, le ratio entre le volume du plasma
sanguin et celui de l'échantillon à tester est de 8:1 à 2:1, particulièrement
4:1.
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Le ratio de 8:1 à 2:1 correspond aux conditions d'injection de
l'immunoglobuline au patient. Le ratio de 4:1 est physiologiquement
significatif pour une
concentration en Ig de 5%.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de mesure du pouvoir
thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester
notamment bio logiquement acceptable.
Ledit procédé comprend les étapes suivantes :
a) le mélange du tampon de dilution, notamment du tampon Tris NaC1, avec un
plasma sanguin humain pauvre en plaquettes pour former un témoin
négatif intermédiaire ;
b) le mélange d'un échantillon à tester avec le plasma sanguin humain pauvre
en
plaquettes pour former un milieu réactionnel intermédiaire ;
c) l'ajout dans le milieu réactionnel intermédiaire obtenu à l'étape
précédente et
dans le témoin négatif intermédiaire obtenu à l'étape a) d'un mélange
comprenant des
phospholipides, du CaC12, et éventuellement du facteur tissulaire humain, pour
former un
milieu réactionnel et un témoin négatif ;
d) l'obtention d'un premier thrombinogramme en effectuant un test de
génération de thrombine sur le milieu réactionnel obtenu à l'étape c) et d'un
second
thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine sur le témoin
négatif
obtenu à l'étape c) ;
e) la comparaison d'au moins l'un des paramètres de chacun des
thrombinogrammes obtenus de l'étape d) à un paramètre homologue obtenu à
partir de
thrombinogrammes standards établis sur la base d'une série de calibrateurs
dont le
pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé et/ou du facteur
XI activé
et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur XII activé et/ou du facteur X
activé est connu
et varie entre chaque calibrateur ;
f) la déduction de l'étape e) du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines
humaines contenues dans l'échantillon à tester.
Dans un mode de réalisation particulier, le plasma sanguin humain pauvre en
plaquettes est déficient en facteur XI.
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Dans un mode réalisation particulier, le thrombinogramme standard est obtenu
en effectuant un test de génération de thrombine sur un milieu réactionnel
comprenant i)
un calibrateur dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII
activé et/ou
du facteur XI activé et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur XII activé
et/ou du facteur
X activé est connu, ii) un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et
éventuellement
déficient en facteur XI , iii) un mélange réactionnel comprenant des phopho
lipides, du
CaC12 et éventuellement le facteur tissulaire humain. Le calibrateur est
utilisé par le
logiciel pour effectuer des corrections des signaux bruts et permet de palier
à certains
inconvénients de la fluorescence et de transformer le signal initialement en
Unités de
fluorescence par minute directement en nanomolaires de thrombine.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la concentration finale du
facteur
tissulaire humain dans le milieu réactionnel est de 0,05 pM à 10 pM,
particulièrement 0,3
pM. Le facteur tissulaire et le FVIIa forment un complexe pour activer des
facteurs IX et
X au niveau de la voie exogène de la coagulation.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la concentration finale des
phospholipides humains dans le milieu réactionnel est de 1 ILLM à 10 ILLM,
particulièrement
4 ILLM.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le volume du plasma sanguin
représente de 80% à 40%, notamment de 75% à 50%, particulièrement 53% du
volume
du milieu réactionnel.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le ratio entre le volume du
plasma
sanguin et celui de l'échantillon est de 8:1 à 2:1, particulièrement 4:1.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le thrombinogramme est obtenu
par la méthode de la thromboélastographie ou la méthode de thrombinographie.
La thromboélastographie peut être mise en oeuvre selon la méthode connue de
l'homme du métier, telle que décrite par Savry et al. (Ann Fr Anesth Reanim
2005;
24 :607-16).
La thrombinographie peut être mise en oeuvre selon la méthode connue de
l'homme du métier, telle que décrite par Hemker et al. (Pathophysiol Haemost
thromb
2002 ; 32 : 249-53).
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé selon
l'invention comprend les étapes suivantes :
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a) le mélange du tampon de dilution d'un échantillon à tester avec un plasma
sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI pour former un
témoin
négatif intermédiaire;
b) le mélange d'un échantillon avec un plasma sanguin humain pauvre en
plaquettes et déficient en facteur XI représentant 53% du volume du milieu
réactionnel,
dans lequel le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de
l'échantillon est de 8:1
à 2:1, particulièrement 4:1 pour former un milieu réactionnel intermédiaire ;
c) l'ajout dans le milieu réactionnel intermédiaire obtenu à l'étape
précédente et
dans le témoin négatif intermédiaire obtenu à l'étape a) d'un mélange
comprenant 4 M
des phopho lipides, et 3pM de facteur tissulaire humain et du CaC12, pour
former un
milieu réactionnel et un témoin négatif;
d) l'obtention de deux thrombinogrammes par la mise en oeuvre de
thrombinographie, en effectuant un test de génération de thrombine sur le
milieu
réactionnel et sur le témoin négatif obtenus à l'étape c) ;
e) la comparaison d'au moins l'un des paramètres de chacun des
thrombinogrammes obtenu à l'étape d) à un paramètre homologue obtenu à partir
de
thrombinogrammes standards établis sur la base d'une série de calibrateurs
dont le
pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé et/ou du facteur
XI activé
et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur X activé est connu et varie entre
chaque
calibrateur ;
f) la déduction de l'étape e) du pouvoir thrombogène lié à la présence du
facteur
VII, du facteur XI, du facteur IX, du facteur X et/ou de leur forme activée
dans
l'échantillon.
La présente invention est illustrée davantage par les figures et les exemples
ci-
dessous. Ces figures et exemples représentant les modes de réalisation
particuliers de
l'invention, ne visent en aucun cas à limiter la portée de l'invention.
Figures
Figure 1: la figure 1 représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène du facteur XI activé dans un pool de plasma normal, ou un pool de
plasma
normal dilué (1/9), du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, ou un
pool de
plasma normal dilué (1/9) respectivement, selon le premier protocole. La
concentration
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finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 20 pM. Les autres
conditions de
réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole
1 .
Figure 2 : la figure 2 représente la détermination respective du pouvoir
5 thrombogène du facteur XI activé dans un pool de plasma normal, ou du
FXIa dans un
pool de plasma normal dilué (1/9), et du tampon de dilution dans un pool de
plasma
normal, ou du tampon de dilution dans un pool de plasma normal dilué (1/9),
selon le
deuxième protocole. La concentration finale du facteur tissulaire dans le
milieu
réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans
le tableau 1,
10 sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 3 : la figure 3 représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène du facteur XI activé dans un pool de plasma normal, du FXI dans un
pool
de plasma normal dilué (1/9), du tampon de dilution dans un pool de plasma
normal, ou
du tampon de dilution dans un pool de plasma normal dilué (1/9), selon le
deuxième
protocole. Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire. Les
autres
conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne
désignée
Protocole 2 .
Figure 4 : la figure 4 représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène du facteur XI activé de concentrations différentes dans un pool de
plasma
normal contenant IgG, du XIa activé dans un pool de plasma normal, d'un pool
de plasma
normal contenant IgG, et du tampon de dilution dans un pool de plasma normal,
selon le
deuxième protocole. La concentration finale du facteur tissulaire dans le
milieu
réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans
le tableau 1,
sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 5 : la figure 5 représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène du facteur IX activé de concentrations différentes dans un pool de
plasma
normal contenant IgG, du IXa activé dans un pool de plasma normal, d'un pool
de plasma
normal contenant IgG, et du tampon de dilution dans un pool de plasma normal,
selon le
deuxième protocole. La concentration finale du facteur tissulaire dans le
milieu
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réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans
le tableau 1,
sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 6 : la figure 6 représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, du facteur XI
activé
dans un pool de plasma normal contenant IgG, du facteur IX activé dans un pool
plasma
normal contenant IgG, du facteur XI activé et du facteur IX activé dans un
pool de
plasma normal contenant IgG, des immunoglobulines de type Tégéline0 (LFB) dans
un
pool de plasma normal contenant, des immunoglobulines de type Clairyg0 (LFB)
dans
un pool de plasma normal, de des immunoglobulines de type IgNG (LFB) dans un
pool
de plasma normal, des immunoglobulines de type IVHEBEXO (LFB) dans un pool de
plasma normal. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu
réactionnel est
0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1,
sous la colonne
désignée Protocole 2 .
Figure 7 : la figure 7 représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène du plasma calibré commercialisé par la société Stago sous le nom
Unicalibrator0 , du plasma Unicalibrator0 contenant le tampon de
dilution, du
plasma Unicalibrator0 contenant le facteur IX activé, du plasma
Unicalibrator0
contenant le facteur XI activé, du plasma Unicalibrator0 contenant le
facteur IX
activé et le facteur XI activé, du plasma Unicalibrator0 contenant des
immunoglobulines de type ClairygO. La concentration finale du facteur
tissulaire dans le
milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont
décrites dans le
tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 8 : la figure 8 représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène du plasma Unicalibrator0 contenant le tampon de dilution, du
plasma
Unicalibrator0 contenant le facteur IX activé, du plasma Unicalibrator0
contenant le facteur XI activé, du plasma Unicalibrator0 contenant des
immunoglobulines de type IgNG. Le milieu réactionnel ne contient pas de
facteur
tissulaire. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau
1, sous la
colonne désignée Protocole 2 .
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Figure 9 : la figure 9 représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène du plasma déficient en FXI, du FIXa dans un plasma déficient en
FXI, du
FXIa dans un plasma déficient en FXI, du FIXa et du FXIa dans un plasma
déficient en
FXI, de des immunoglobulines de type Clairyg0 dans un plasma déficient en FXI.
La
concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3
pM. Les autres
conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne
désignée
Protocole 2 .
Figure 10 : la figure 10 représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène du plasma déficient en FXI, du FIXa dans un plasma déficient en
FXI, du
FXIa dans un plasma déficient en FXI, des immunoglobulines de type IgNG dans
un
plasma déficient en FXI. Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur
tissulaire. Les
autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la
colonne désignée
Protocole 2 .
Figure 11: la figure 11 représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène du plasma déficient en FIX, du FIXa dans un plasma déficient en
FIX, du
FIXa dans un plasma déficient en FIX, des immunoglobulines de type IgNG dans
un
plasma déficient en FIX. La concentration finale du facteur tissulaire dans le
milieu
réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans
le tableau 1,
sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 12 : la figure 12 représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène du plasma déficient en FIX, du FIXa dans un plasma déficient en
FIX, du
FIXa dans un plasma déficient en FIX, des immunoglobulines de type IgNG dans
un
plasma déficient en FIX. Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur
tissulaire. Les
autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la
colonne désignée
Protocole 2 .
Figure 13 : la figure 13 représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène du tampon de dilution dans le plasma Unicalibrator0 , du FXIa
dans le
plasma Unicalibrator0 , des immunoglobulines de type Tégéline dans le
plasma
Unicalibrator0 , des immunoglobulines de type Clairyg dans le plasma
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Unicalibrator0 , des immunoglobulines de type IVhebex dans le plasma
Unicalibrator0 , des immunoglobulines de type IgNG 10% dans le plasma
Unicalibrator0 , des immunoglobulines de type IgNG 5% dans le plasma
Unicalibrator0 . Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire.
La
concentration finale des phospholipides dans le milieu réactionnel est 8 M.
Les autres
conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne
désignée
Protocole 2 .
Figure 14A : la figure 14 A représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène des échantillons contenant 0,3 pM de facteur tissulaire, 4 ,M de
phospholipides, 10itL d'immunoglobuline intraveineuse thrombogène, 80 ,L de
plasma
normal et éventuellement 10itL d' anti-FXI.
Figure 14B : la figure 14 B représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène des échantillons contenant 0,3 pM de facteur tissulaire, 4 ,M de
phospholipides, 10itL d'immunoglobuline intraveineuse thrombogène, 80 ,L de
plasma
déficient en FXI et éventuellement 10itL d'anti-FXI.
Figure 15 : la figure 15 représente l'étude de la vélocité en fonction de la
concentration en inhibiteur du FXI.
Figure 16 : la figure 16 représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène des échantillons contenant respectivement de 1 à 16ng/m1 de FXIa
dilués
dans un lot d'IgNG 5% ou dans le tampon de dilution dudit lot d'IgNG 5%.
Figure 17A : la figure 17A représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène des échantillons contenant respectivement de 0,5U1/ml à 200UI/m1
de
FVIIa dans un plasma déficient en FXI ou le tampon Clairyg0 (tampon de
formulation
du produit Clairyg0 commercialisé par le Laboratoire LFB BIOMEDICAMENTS) dans
un plasma déficient en FXI.
Figure 17B : la figure 17B représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène des échantillons contenant respectivement de 0,5U1/ml à 200UI/m1
de
FVIIa dans un plasma normal ou le tampon Clairyg0 dans un plasma normal.
CA 02845790 2014-02-19
WO 2012/066260 PCT/FR2011/052703
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Figure 18A : la figure 18A représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène des échantillons contenant respectivement de 0,68 UI/ml à 5,5
UI/ml de
FIXa dans un plasma déficient en FXI ou le tampon Clairyg0 dans un plasma
déficient
en FXI.
Figure 18B : la figure 18B représente la détermination respective du pouvoir
thrombogène des échantillons contenant respectivement de 0,68 UI/ml à 5,5
UI/ml de
FIXa dans un plasma normal ou le tampon Clairyg0 dans un plasma normal.
Exemples
Exemple 1: détermination du pouvoir thrombogène d'un échantillon
Protocole 1 pour déterminer le pouvoir thrombogène d'un échantillon à
tester
Equipement: système CAT (Stago) Réactifs: Stago
D Plasma Normal : pool de Plasma congelé (interne)
Préparation des échantillons: 1 volume de produit pour 8 volumes de PN ou de
PN au 1/5ème en Tampon de dilution (R1).
D Conditions expérimentales:
- 80 lut Préparation. +20 lut PPP-reagent High (4 ILLM phospholipides et 20
pM
FT final)
- 20 lut FluCa-reagent ajoutés par l'appareil
D Fluorescence: X excitation = 390 nm, X émission = 460 nm
Protocole 2 pour déterminer le pouvoir thrombogène d'un échantillon à
tester
Equipement : Fuoroscan / système CAT (Stago) Réactifs: Stago
D Plasma Normal (PN): Pool de Plasma congelé (interne) ou Unicalibrator
(Stago)
D Préparation des échantillons: 1 vol de produit pour 4 ou 8 vol de PN
D mélange réactionnel : 500 lut MP-reagent repris avec 0,5mL d'eau + 300
I
PRP-reagent + 200 lut de tampon de dilution
D Conditions expérimentales:
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WO 2012/066260 PCT/FR2011/052703
- 80 ILLL Préparation
- 20 ILLL mélange réactionnel (4 ILLM phospholipides et 0,3 pM FT final)
- 20 ILLL FluCa-reagent ajoutés par l'appareil
Fluorescence: X excitation = 390 nm, X émission = 460 nm
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Les conditions de réactions selon le protocole 1 ou le protocole 2 sont
résumés
dans le tableau ci-dessous.
Protocole 1 Protocole 2
Equipement Fluoroscan système CAT (Hemker)
Normal 1/5 Normal pur ou
Plasma Normal pur
= R1 déficient FXI
Stago
Facteur Tissulaire Stago Stago PRP-reagent
PPP-reagent PPP-reagent
Phospholipides High High Stago
MP-reagent
FluCa kit FluCa kit FluCa kit
Substrat
Stago Stago Stago
fluorogénique
CaC12 CaC12 CaC12
FT finale 20 pM 20pM 0,3 pM
PL finale 4 i_tM 4 i_tM 4 i_tM
Plasma final 59% 12% 53%
Plasma / Ech 8:1 8:5 4:1
Exemple 2 : Concentration finale du facteur tissulaire
10 Le pouvoir thrombogène du FXIa dans un pool de plasma normal ou
dans un
pool de plasma dilué est déterminé selon le protocole 1 (Figure 1) ou le
protocole 2
(Figure 2), respectivement décrits ci-dessus.
Le protocole 2, effectué en faible concentration finale du facteur tissulaire,
permet d'obtenir un résultat plus sensible que celui obtenu par le protocole
1, utilisant
15 une forte concentration finale du facteur tissulaire.
Exemple 3 : Présence du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel
Le pourvoir thrombogène du FXIa dans un pool de plasma normal ou dans un
pool de plasma dilué est déterminé, selon le protocole 2, dans un milieu
réactionnel
contenant 0,3 pM du facteur tissulaire (Figure 2) ou sans facteur tissulaire
(Figure 3).
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La variabilité des réponses obtenues dans le milieu réactionnel sans FT est
plus
importante que celle dans le milieu réactionnel avec FT. En l'absence de FT,
La
spécificité de cette réponse qui intervient à des temps tardifs ( >20min)
n'est pas assurée.
Exemple 4: Concentration finale des phospholipides
Le pouvoir thrombogène du FXIa dans un pool de plasma commercial calibré
(Unicalibrator0, Stago) est déterminé, selon le protocole 2, dans un milieu
réactionnel
contenant 4 ,M (Figure 8) ou 8 ,M (Figure 13) des phospholipides et sans FT.
Il ressort que l'augmentation de la concentration en phospholipides de 4 1.M à
8
1.M en absence de facteur tissulaire n'a pas permis de stabiliser les
réponses.
Exemple 5: Détermination du pouvoir thrombogène des immunoglobulines de type
IgNG
Le protocole 2 décrit ci-dessus est mis en oeuvre pour déterminer le pouvoir
thrombogène lié à la présence du FXIa (Figure 4) ou du FIXa (Figure 5) des
immunoglobulines de type IgNG (LFB).
Le signal de l'apparition de la thrombine dans l'échantillon contenant
seulement
des immunglobulines de type IgNG est apparu quasiment en même temps que celui
de
l'apparition de la thrombine dans l'échantillon contenant le tampon de
dilution. Il ressort
que les immunoglobulines de type IgNG ne contient quasiment pas du FXIa ou
FIXa.
Exemple 6: Origine du pool de plasma sanguin
Le pouvoir thrombogène du FXIa ou du FIXa est déterminé, selon le protocole
2, dans un milieu réactionnel contenant respectivement un pool de plasma
normal
commercial calibré (Unicalibrator0) (Figures 7 et 8), un pool de plasma
déficient en FXI
(Figures 9 et 10), ou un pool de plasma déficient en FIX (Figures 11 et 12).
La capacité discriminant du signal vis-à-vis d'un échantillon contenant FXIa
dans un milieu réactionnel contenant un pool de plasma commercial n'est pas
significativement différente de celle dans un pool de plasma déficient en FXI
(Figures 12,
13, 14 et 15).
Il ressort que les modifications observées entre les résultats obtenus dans
les
milieux réactionnels contenant de différentes origines de pool de plasma sont
très faibles.
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Exemple 7: Pouvoir thrombogène de différentes immunoglobulines
Le pouvoir thrombogène respectif des immunoglobulines de type Tégéline0
(LFB), des immunoglobulines de type Clairyg0 (LFB), des immunoglobulines de
type
IvHEBEXO (LFB), et des immunoglobulines de type IgNG (LFB), lié à la présence
du
FXIa et/ou du FIXa, est déterminé, selon le protocole 2.
Les résultats sont illustrés par la figure 6.
Exemple 8 : Inhibition du potentiel FXIa de préparation d'Ig thrombogène
Une gamme d'anticorps monoclonal anti-FXIa humain, de 20 à 400 lag/m1 a été
réalisée et testée en présence de préparation d'Ig thrombogène (IgT), en
plasma normal
(figure 14A) et déficient en FXI (figure 14B).
Il a été observé une inhibition du potentiel thrombogène de l'Ig testée pure
en
fonction des doses croissantes en anticorps anti-FXI. L'inhibition n'est pas
totale à la
concentration la plus élevée en anti FXIa de 400 ltg/ml.
Afin de limiter la consommation de l'anticorps, le même essai a été refait sur
le
même lot d'immunoglobuline diluée au 1/10 et au 1/30. Les mêmes doses
d'anticorps ont
été testées de 20 à 4001.1g/uni.
Dans ces conditions, on observe une inhibition totale du FXIa exogène
(immunoglobuline) et du FXIa issu du zymogène FXI dans le cas du plasma normal
: un
phénomène de plateau est observé.
La figure 15 présente le paramètre de vélocité en fonction des doses
d'anticorps
anti FXIa, en plasma normal et en plasma déficient en FXIa.
En plasma normal, l'inhibition est maximale pour la dose de 100 lag/m1
d'anticorps aux 2 dilutions d'Ig testées. Dans ce cas, le thrombinogramme
obtenu
présente une vélocité inférieure à celle du tampon de dilution testé seul en
plasma normal,
le FXI activé issu du plasma étant également inhibé.
En plasma déficient en FXI et FXI a, l'inhibition est complète pour une dose
plus faible de 50 1.1g/uni d'anticorps. Dans ce cas, on retrouve une vélocité
comparable à
celle du tampon de dilution seul en plasma déficient en FXI et FXIa. Ce
résultat montre
que le FXIa exogène est pour ce lot le seul responsable de l'augmentation du
potentiel
thrombique.
Ces résultats démontrent que :
CA 02845790 2014-02-19
WO 2012/066260 PCT/FR2011/052703
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= Le pic de génération de thrombine observé pour la préparation d'Ig
thrombogène testé est bien lié à la présence de FXIa.
= L'utilisation d'un test sensible au FXIa pour l'étude du potentiel
thrombique
de lots d'immunoglobulines est pertinente.
Exemple 9 : Recherche d'un éventuel effet inhibiteur sur la génération de
thrombine : environnement protéique
Les lots d'immunoglobulines étant fortement concentrés (50 g/1), il a été
vérifié
que cet environnement n'avait pas un impact (effet inhibiteur) sur la
génération de
thrombine. Un tel phénomène conduirait en effet à conclure à un résultat
faussement
négatif.
Une gamme de FXIa de 1 à 15 ng/ml a été réalisée (figure 16) ; les dilutions
ont
été faites en parallèle dans un lot d'IgNG 5% (courbes FXIa + IgNG) et dans le
tampon
de formulation d'IgNG 5% (courbes FXIa + Tp).
La figure 16 montre que les profils de génération de thrombine ne diffèrent
pas
significativement en présence ou en absence d'immunoglobuline. L'absence
d'effet
inhibiteur lié aux immunoglobulines est démontrée, même pour des
concentrations très
faibles de FXIa, de l'ordre du ng/ml.
Exemple 10 : Détermination du pouvoir thrombogène du facteur Vila
La figure 17A et la figure 17B montrent que l'utilisation du kit de la
présente
invention contenant un plasma sanguin humain déficient en FXIa permet de
donner une
meilleure sensibilité à la présence éventuelle du facteur Vila dans un
échantillon à tester
par rapport à celle obtenue avec un plasma normal.
Exemple 11: Détermination du pouvoir thrombogène du facteur IXa
La figure 18A et la figure 18B montrent que l'utilisation du kit de la
présente
invention contenant un plasma sanguin humain déficient en FXI permet de donner
une
meilleure sensibilité à la présence éventuelle du facteur IXa dans un
échantillon à tester
par rapport à celle obtenue avec un plasma normal.
