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PROCEDE DE PREPARATION DU FACTEUR H HUMAIN
La présente invention concerne un procédé de préparation de facteur H humain
recombinant dans une lignée cellulaire humaine, avec un rendement amélioré.
Le facteur H est une protéine plasmatique présente dans le plasma humain à un
taux
moyen de 500 mg/L. Il est produit principalement par les cellules du foie de
façon constitutive,
mais également produit localement par d'autres cellules, telles que les
cellules épithéliales du
pigment de la rétine, les cellules endothéliales, les plaquettes ou les
cellules souches
mésenchymateuses.
La fonction principale du facteur H est la régulation de l'activation de la
voie alterne
du complément. Le facteur H est impliqué dans cette régulation par trois
mécanismes: (i) la
régulation de l'activité du facteur I, qui permet l'inactivation de la
protéine C3b (iC3b); (ii)
l'inhibition de la formation de la C3 convertase alterne par compétition avec
le facteur B pour
la liaison au C3b ; (iii) l'accélération de la dissociation de la C3
convertase de la voie alterne
(C3bBb) (decay acceleration activity).
Le facteur H peut agir soit dans la phase fluide sanguine pour maintenir un
niveau bas
de molécules C3 activées (C3b), soit au niveau des surfaces cellulaires
présentant des
polyanions, tels que des glycosaminoglycanes, le sulfate d'héparane ou l'acide
sialique, pour
protéger les cellules hôtes vis-à-vis de la lyse cellulaire induite par
l'activation du
complément.
Le gène HF1 ayant 102,494 paires de bases (pb) et 23 exons (NCBI RefSeq:
NG 007259.1), est localisé dans le cluster de gènes RCA (reg ulator of
compiement activation)
sur le locus 1q32, Chrl. En raison de l'épissage alternatif, deux ARNm sont
transcrits à partir
du gène HF1, l'un ayant 3696 pb et codant la protéine FH et l'autre ayant 1347
pb et codant la
protéine FHL-1 (FH-like 1 protein).
La protéine facteur H (FH) (1213 aa, 155 kDa) est une glycoprotéine simple
chaîne,
constituée de 20 domaines répétés SCR (short consensus repeats) (également
appelés CCP ou
SHUSHI). La protéine FHL-1 (449 acides aminés, 42 kDa) possède les 7 premiers
domaines
SCR plus 4 acides aminés hydrophobes en C-terminal.
Naturellement, le facteur H (FH) humain présente un polymorphisme en position
402
de sa séquence en acides- aminés, caractérisé par la substitution d'une
tyrosine (Y) par une
histidine (H). Cette substitution elle-même résulte d'un remplacement de
nucléotide au niveau
du gène HF1, où un nucléotide T est remplacé par un C.
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Les domaines SCR sont présents dans de nombreuses protéines, telles que des
protéines de la famille du FH (FHR1, FHR2, FHR3, FHR4), des protéines de la
famille RCA
(CR1, CR2, C4BP, CD55, CD46) ou des protéines de pathogènes (vaccinia
virus,...)
Un domaine SCR est composé d'environ 60 acides aminés séparés par une courte
séquence linker (3 ¨ 8 acides aminés pour le FH humain). Les domaines SCR sont
constitués
principalement de brins beta et possèdent chacun deux ponts S-S répartis à
chaque extrémité
du domaine. Les analyses d'homologie de séquences montrent que 4 cystéines
conservées
sont impliquées dans la formation de deux ponts S-S intra-domaine et qu'un
tryptophane (W)
dans le domaine SCR est hautement conservé.
En raison du fort intérêt thérapeutique pharmacologique, de nombreuses études
ont été
effectuées dans les différents systèmes de production in vitro de protéine
dans le but
d'améliorer la productivité de facteur H humain recombinant Le facteur H
humain
recombinant a été produit dans le système de baculovirus (Sharma et Pangburn,
Gene 1994,
June 10 : 143 (2) : 301-2) et dans les cellules COS (Sanchez-Corral et al, Am.
J. Hum.
Genet.,71 :1285-1295, 2002). Plus récemment, le facteur H humain recombinant a
été produit
dans la mousse physcomitrella en photobioréacteur (Buttner-Mainik et al, Plant
biotechnol. J.
2010 Aug 17) ainsi que dans la levure Pichia pastoris (Schmidt CQ et al,
Protein Expr. Purif.
2011 Apr. 76(2) 254-63).
Malgré ces nombreux efforts, à ce jour, la productivité atteinte pour du
facteur H
humain recombinant n'est toujours pas satisfaisante pour un usage
thérapeutique chez
l'homme. Par conséquent, il existe toujours un grand besoin de développer une
méthode de
production de haute performance pour du facteur H humain.
L'un des buts de la présente invention est de proposer l'utilisation d'une
lignée
cellulaire humaine pour la production de facteur H humain recombinant.
L'un des autres buts de la présente invention est de mettre à disposition un
procédé de
préparation de facteur H humain recombinant.
La présente invention concerne l'utilisation d'une lignée cellulaire humaine
pour la
mise en oeuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain recombinant
avec un
rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite
lignée cellulaire.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation
d'une lignée
cellulaire humaine pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation de
facteur H humain
recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, ou une séquence ayant
au moins
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99%, notamment 99,4%, notamment 99,7% d'identité de séquence avec la séquence
SEQ ID
NO : 1.
Une protéine représentée par une telle séquence peut être le variant Y402 ou
le variant
H402 du facteur H humain ou un autre variant de facteur H humain, tel qu'un
variant
mentionné dans le site internet http://www.uniprot.org/uniprot/1308603.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation
d'une lignée
cellulaire humaine pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation de
facteur H humain
recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement
supérieur à la
quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.
Le facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 1
correspond au variant Y402, dans lequel l'acide aminé en position 402 est une
tyrosine.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne
l'utilisation d'une
lignée cellulaire humaine pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation
de facteur H
humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 13, avec un
rendement
supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée
cellulaire.
Le facteur H humain recombinant représenté par la séquence SEQ ID NO : 13
correspond au variant H402, dans lequel l'acide aminé en position 402 est une
histidine.
Cette lignée cellulaire peut être une lignée ne produisant pas de facteur H,
une lignée
produisant du facteur H en une quantité non détectable, ou une lignée
produisant du facteur H
endogène.
La quantité de facteur H endogène produite par une lignée cellulaire est
déterminée par
la méthode ELISA avec un couple d'anticorps judicieusement choisi qui permet
de détecter
des concentrations minimales de 5 ng/ml de Facteur H dans le surnageant
cellulaire. Des kits
commerciaux de dosage sont également disponibles (ex : Kit HK342 Hycult).
Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation d'une
lignée
cellulaire humaine produisant du facteur H endogène, pour la mise en oeuvre
d'un procédé de
préparation de facteur H humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID
NO : 1,
avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par
ladite lignée
cellulaire.
Par une lignée produisant du facteur H , on entend une lignée cellulaire
pour
laquelle il est possible de détecter la présence de facteur H endogène dans le
surnageant
cellulaire par les méthodes classiques de détection de protéines tel que
l'ELISA et le Western
Blot.
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Certaines lignées cellulaires humaines, telles que la lignée cellulaire
PER.C60 ou la
ligne HEK 293F, produisent du facteur H humain par voie endogène. Cependant,
la
productivité de facteur H endogène par ces cellules est relativement faible ;
elle est d'environ
70 iLtg/L pour la lignée cellulaire PER.C60, au bout de 48H de culture, et
d'environ 11 iLtg/L
de facteur H secrété dans le milieu de culture pour la lignée cellulaire HEK
293F après 7 jours
de culture.
Dans un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne
l'utilisation
d'une lignée cellulaire humaine, avec un rendement supérieur à 10 mg/L,
particulièrement
supérieur à 20 mg/L, ou à 30 mg/L, ou à 40 mg/L, ou à 50 mg/L, plus
particulièrement
supérieur à 60 mg/L, ou à 70 mg/L, ou à 80 mg/L, ou à 90 mg/L, notamment à 100
mg/L de
milieu de culture.
Lorsque le mode de production utilisé pour produire du facteur H recombinant
est un
des modes suivants : batch , Fedbatch ou culture avec filtration-
rétention ou un mode
qui dérive de l'un de ces 3 modes de production, on entend par rendement
la quantité de
facteur H recombinant produit par volume de milieu de culture final qui va
être traité en post-
production (nommé également Downstream Process ou DSP).
Lorsque le mode de production utilisé pour produire du Facteur H recombinant
est un
mode culture continu en perfusion ou qui dérive de ce mode de production, on
entend par
rendement la quantité de facteur H produit par volume de milieu de culture
contenue
initialement dans l'enceinte de production.
Le mode de production batch est caractérisé par un volume constant.
L'inoculum
est ajouté au milieu et on laisse se dérouler la culture. La biomasse évolue
selon la courbe de
croissance caractéristique de la lignée utilisée pour la production. On
intervient sur la vitesse
de rotation, sur l'aération (02 et CO2) ou encore l'ajustement du pH, mais
aucun milieu
nutritif n'est ajouté en cours de culture et rien n'est retiré.
A titre d'exemple illustratif, une quantité finale de protéines recombinantes
de 10 mg
produit dans un milieu de culture de volume final d'un litre, qui est
identique au volume
initial, correspond à un rendement de production de 10 mg/L,
Le mode de production Fedbatch (culture dite alimentée) est caractérisé
par un
volume variable. La production se fait dans un premier temps sous forme d'un
batch normal
dans un volume donné. Du milieu frais est ensuite ajouté pour maintenir les
cellules dans
l'état souhaité (viabilité cellulaire stable, phase exponentielle, phase
stationnaire). Il est
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possible d'adapter le feed pour ne jamais dépasser les valeurs limites
souhaitées (exemple :
concentration de glucose < 4 g/L).
La stratégie de feed dépend de la lignée utilisée pour la production. En
phase
exponentielle, la biomasse s'accumule rapidement, permettant d'accumuler
également du
produit très rapidement dans un volume réduit. En phase stationnaire la
biomasse est
maintenue constante permettant une accumulation progressive de produit dans un
volume
réduit.
A titre d'exemple illustratif, une quantité finale de 30 mg de facteur H
recombinant
produit dans 1,5 litre de volume final de milieu de culture, qui est
initialement un litre,
correspond à un rendement de production de 20 mg/L.
Le mode de production culture avec filtration-rétention (connu aussi sous
le terme
de XD process) est caractérisé par un accroissement de la biomasse dans un
volume constant.
C'est un mode mixte en les modes batch et fed-batch pour lequel l'ajout du
milieu frais est
compensé par le retrait d'un volume équivalent de surnageant sans le Facteur H
recombinant
qui va être retenu par l'intermédiaire d'une membrane de filtration dont le
seuil de coupure est
inférieur à la taille de la protéine recombinante. Le surnageant retiré est
éliminé. Le volume
reste ainsi constant alors que la biomasse s'accumule rapidement permettant
d'accumuler
également du Facteur H recombinant.
A titre d'exemple illustratif, une quantité finale de 60 mg du facteur H
recombinant
produit dans un litre de volume final de milieu de culture, qui est identique
au volume initial
de milieu de culture, correspond à un rendement de production de 60 mg/L.
Le mode de production culture avec perfusion est caractérisé par un volume
et une
biomasse constants. Comme pour le mode filtration-rétention, l'ajout du milieu
frais est
compensé par le retrait d'un volume équivalent de surnageant mais dans ce mode
de
production le surnageant retiré contient le Facteur H recombinant et est donc
conservé ce qui
conduit à un volume final à traiter en DSP supérieur au volume initial sans
accumulation de la
protéine d'intérêt.
A titre d'exemple, une quantité finale de 90 mg du facteur H recombinant
produit dans
litres de volume final de milieu de culture, qui est initialement un litre,
correspond à un
rendement de production de 90 mg/L.
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Avantageusement, les acides nucléiques codant respectivement le facteur H
représenté
par la séquence SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO: 13, ont fait l'objet d'une
optimisation de
codons.
La présente invention est basée sur la constatation inattendue faite par les
Inventeurs
que l'optimisation de codons de facteur H humain permet d'augmenter la
productivité de
facteur H humain recombinant dans plusieurs lignées cellulaires humaines.
L'optimisation de codon a pour but de remplacer les codons naturels par des
codons
dont les ARN de transfert (ARNt) portant les acides aminés sont les plus
fréquents dans le
type cellulaire considéré. Le fait de mobiliser des ARNt fréquemment
rencontrés à pour
avantage majeur d'accroitre la vitesse de traduction des ARN messagers (ARNm)
et donc
d'augmenter le titre final (Carton JM et al, Protein Expr Purif, 2007).
L'optimisation de
séquence joue aussi sur la prédiction des structures secondaires d'ARNm qui
pourrait ralentir
la lecture par le complexe ribosomal. L'optimisation de séquence a également
un impact sur le
pourcentage de G/C qui est directement lié à la demi-vie des ARNm et donc à
leur potentiel
d'être traduit (Chechetkin, J. of theoretical biology 242, 2006 922-934).
L'optimisation de codons peut être faite par substitution des codons naturels
en
utilisant des tables de fréquence des codons (codon Usage Table) pour
mammifères et plus
particulièrement pour Homo sapiens. Il existe des algorithmes présents sur
internet et mis à
disposition par les fournisseurs de gènes de synthèse (DNA2.0, GeneArt, MWG,
Genscript)
qui permettent de faire cette optimisation de séquence.
Dans un mode de réalisation plus avantageux, l'acide nucléique codant la
séquence
SEQ ID NO : 1 est représenté par:
(i) la séquence ID NO : 2,
(ii) une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment
90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO :
2, ou
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques peut être
calculé
selon la formule suivante :
le nombre des résidus identiques x 100 _______________
le nombre des résidus de la séquence la plus courte
La séquence SEQ ID NO: 2 ou une séquence ayant au moins 75%, de préférence au
moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la
séquence
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SEQ ID NO : 2 est une séquence obtenue par l'optimisation de codons à partir
de la séquence
d'acide nucléique naturel codant le facteur H humain.
L'acide nucléique naturel codant le variant Y402 du facteur H humain est
représenté
par la séquence SEQ ID NO : 8.
L'acide nucléique naturel codant le variant H402 du facteur H humain est
représenté
par la séquence SEQ ID NO: 17.
Dans un autre mode de réalisation plus avantageux, l'acide nucléique codant le
précurseur du facteur H humain comprenant en outre un acide nucléique est
choisi parmi :
- un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 5 et codant le
peptide
signal naturel du facteur H, ou
- un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 ou par une
séquence
ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence
avec la
séquence SEQ ID NO : 3, et codant le peptide signal du facteur H, (PS naturel
optimisé) ou
- un acide nucléique codant un peptide signal naturel d'une protéine
différente du
facteur H, ou
- un acide nucléique codant le peptide signal codé par la séquence SEQ ID
NO: 4
(PCT/FR2011/050544) ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%,
particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4.
Le peptide signal naturel d'une protéine différente du facteur H humain peut
être un
peptide signal choisi parmi les peptides signaux de toutes les protéines qui
sont sécrétées chez
les eucaryotes et notamment chez les mammifères et plus particulièrement chez
l'homme
comme ceux des immunoglobulines, de facteurs de croissance comme l'EPO, des
hormones
comme l'insuline, d'enzymes comme le trypsinogène, de facteurs de la
coagulation tel que la
prothrombine.
La séquence SEQ ID NO: 3 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%,
particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3 est
une
séquence obtenue par l'optimisation de codons à partir de la séquence SEQ ID
NO : 5.
L'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 4 ou par une séquence
ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence
avec la
séquence SEQ ID NO : 4 code un peptide signal artificiel.
La présence d'un peptide signal permet de conférer une meilleure sécrétion de
protéine
recombinante dans le milieu de culture.
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Dans un mode de réalisation, l'ensemble de l'acide nucléique codant le
précurseur de
facteur H humain, comprenant l'acide nucléique codant le peptide signal et
l'acide nucléique
codant le facteur H humain, fait l'objet de l'optimisation de codons.
Dans un mode de réalisation particulier, l'acide nucléique codant le
précurseur du
facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par:
- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant
choisi parmi
la séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment
90%,
particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et
- un acide nucléique codant le facteur H représenté par la séquence SEQ ID
NO : 1,
ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une
séquence ayant au
moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité
de
séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2,
ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la
séquence SEQ ID NO :
1.
Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H
humain
recombinant comprend ou est constitué par l'acide nucléique représenté par la
séquence SEQ
ID NO : 3 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2.
Encore plus particulièrement l'acide nucléique codant le précurseur du facteur
H est
représenté par la séquence SEQ ID NO : 6 ou une séquence ayant au moins 85%,
notamment
90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO :
6.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'acide nucléique
codant le
précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6.
La séquence SEQ ID NO: 6 correspond à une optimisation de codons du précurseur
du
facteur H humain qui comprend son peptide signal naturel.
Dans un autre mode de réalisation, l'acide nucléique codant le précurseur du
facteur H
humain recombinant comprend ou est constitué par:
- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant
choisi parmi
la séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment
90%,
particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et
- un acide nucléique codant le facteur H représenté par la séquence SEQ ID
NO : 13,
ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 14 ou une
séquence ayant
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au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95%
d'identité de
séquence avec la séquence SEQ ID NO: 14,
ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la
séquence SEQ ID NO :
13.
Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H
humain
recombinant comprend ou est constitué par l'acide nucléique représenté par la
séquence SEQ
ID NO : 3 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 14.
Encore plus particulièrement l'acide nucléique codant le précurseur du facteur
H est
représenté par la séquence SEQ ID NO : 15 ou une séquence ayant au moins 85%,
notamment
90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO:
15.
Dans un autre mode de réalisation, un acide nucléique codant un précurseur de
facteur
H humain recombinant comprend ou est constitué par:
- un acide nucléique codant le facteur H humain et ayant fait l'objet de
l'optimisation
de codons, et
- un acide nucléique codant un peptide signal artificiel, qui ne correspond
pas au
peptide signal naturel de facteur H humain, mais peut conférer une capacité de
sécrétion
meilleure ou similaire à celle du peptide signal naturel du facteur H humain.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'acide nucléique codant le
précurseur
du facteur H humain recombinant comprend ou est constitué par:
- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant
choisi parmi
la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment
90%,
particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et
- un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide
nucléique étant
choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une séquence présentant au moins
75%, de
préférence au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de
séquence avec
la séquence SEQ ID NO : 2,
ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la
séquence SEQ ID NO :
1.
Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H
humain
recombinant comprend ou est constitué par l'acide nucléique représenté par la
séquence SEQ
ID NO : 4 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 2.
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Encore plus particulièrement l'acide nucléique codant le précurseur du facteur
H
humain recombinant est représenté par la séquence SEQ ID NO : 7 ou une
séquence ayant au
moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la
séquence
SEQ ID NO :7,
ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la
séquence SEQ ID NO :
1.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'acide nucléique
codant le
précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 7.
Dans un autre mode de réalisation, l'acide nucléique codant le précurseur du
facteur H
humain recombinant comprend ou est constitué par:
- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant
choisi parmi
la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 85%, notamment
90%,
particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et
- un acide nucléique codant le facteur H représenté par la séquence SEQ ID
NO : 13,
ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 14 ou une
séquence ayant
au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95%
d'identité de
séquence avec la séquence SEQ ID NO : 14,
ledit précurseur permettant l'expression du facteur H, représenté par la
séquence SEQ ID NO :
13.
Plus particulièrement, l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H
humain
recombinant comprend ou est constitué par l'acide nucléique représenté par la
séquence SEQ
ID NO : 4 et l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 14.
Encore plus particulièrement l'acide nucléique codant le précurseur du facteur
H est
représenté par la séquence SEQ ID NO : 24 ou une séquence ayant au moins 85%,
notamment
90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO :
24.
Un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain comprenant ou
constitué
par l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 5 et l'acide
nucléique
représenté par la séquence SEQ ID NO : 8 peut être utilisé comme un contrôle
de la
productivité d'un acide nucléique optimisé codant le variant Y402 tel que
décrit dans la
présente invention.
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Plus particulièrement, cet acide nucléique de contrôle peut être l'acide
nucléique
représenté par la séquence SEQ ID NO : 9.
Un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain comprenant ou
constitué
par l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 5 et l'acide
nucléique
représenté par la séquence SEQ ID NO : 17, peut être utilisé comme un contrôle
pour un acide
nucléique optimisé codant le variant H402 tel que décrit dans la présente
invention.
Plus particulièrement, cet acide nucléique de contrôle peut être l'acide
nucléique
représenté par la séquence SEQ ID NO : 18.
Dans un mode de réalisation avantageux de la présente invention, le facteur H
humain
tel que défini ci-dessus est produit dans la lignée cellulaire PER.C60 ou la
lignée cellulaire
HEK 293F.
La lignée cellulaire PER.C60 est issue de cellules rétinales primaires
humaines dans
lesquelles un fragment d'ADN adénoviral Ad5 qui contient à la fois le gène E
lA et le gène
E 1B est inséré dans les cellules par un vecteur. Ce fragment d'ADN adénoviral
permet de
conférer l'immortalité aux cellules dans lesquelles il est inséré, par
l'intermédiaire de la
protéine ElB qui inhibe la p53. La protéine E lA quand à elle a un tropisme
pour le promoteur
viral hCMV et permet sa transactivation et la potentialisation de la séquence
génique qui sera
insérée en 3' de ce dernier et qui pourra être le Facteur H.
La lignée cellulaire PER.C60 produit, par voie endogène, à la fois le variant
H402 du facteur H humain et le variant Y402.
La présente invention concerne particulièrement l'utilisation de la lignée
cellulaire
PER.C60 pour la mise oeuvre d'un procédé de préparation de facteur H humain
recombinant,
représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement supérieur à la
quantité de
facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.
Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation de la
lignée
cellulaire PER.C60 pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation de
facteur H humain
recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, dans laquelle l'acide
nucléique
codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO :
6, 7 ou 9.
La présente invention concerne aussi particulièrement l'utilisation de la
lignée
cellulaire HEK 293F pour la mise oeuvre d'un procédé de préparation de facteur
H humain
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recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, avec un rendement
supérieur à la
quantité de facteur H endogène produit par ladite lignée cellulaire.
La lignée cellulaire HEK 293F produit par voie endogène uniquement le variant
Y402
de facteur H humain.
Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation de la
lignée
cellulaire HEK 293F pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation de
facteur H humain
recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, dans laquelle l'acide
nucléique
codant le précurseur du facteur H est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6
ou 7.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une lignée cellulaire
humaine,
telle que la lignée cellulaire PER.C60 ou HEK 293F pour la mise en oeuvre d'un
procédé de
préparation de facteur H humain recombinant, dans laquelle l'acide nucléique
codant le
précurseur du facteur H est un acide nucléique génomique comprenant des
introns artificiels
ou naturels de facteur H humain ou d'un autre gène humain et des exons
naturels de facteur H
humain.
La présente invention concerne également l'acide nucléique codant un facteur H
humain recombinant, tel que le variant Y402 du facteur H représenté par la
séquence SEQ ID
NO : 1 ou le facteur H variant H402 représenté par la séquence SEQ ID NO : 13.
Les SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 13 ne contiennent pas la séquence
correspondant
à celle du peptide signal du Facteur H.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique codant le
facteur
H humain recombinant ayant la séquence SEQ ID NO : 1, comprenant un acide
nucléique
représenté par:
(i) la séquence SEQ ID NO : 2, ou
(ii) une séquence ayant au moins 75%, de préférence au moins 85%, notamment
90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO :
2.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un acide
nucléique
codant le facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO: 1, comprenant ou
constitué par:
- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique
étant choisi
parmi la séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence présentant au moins 85%,
notamment
90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO :
3, et
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WO 2013/060995 13 PCT/FR2012/052461
- un acide nucléique codant le facteur représenté par la séquence SEQ ID NO
: 1,
ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une
séquence ayant au
moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité
de
séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2.
Plus particulièrement, ledit acide nucléique codant le facteur H humain
recombinant
de séquence SEQ ID NO : 1 est représenté par la séquence SEQ ID NO : 6 ou une
séquence
ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence
avec la
séquence SEQ ID NO : 6.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique
codant le
facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 1, comprenant ou
constitué par:
- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant
choisi
parmi la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 85%,
notamment
90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO :
4, et
- un acide nucléique codant le facteur représenté par la séquence SEQ ID NO
: 1,
ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 ou une
séquence ayant au
moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité
de
séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2.
Plus particulièrement, ledit acide nucléique codant le facteur H humain
recombinant
de séquence SEQ ID NO : 1 est représenté par la séquence SEQ ID NO : 7 ou une
séquence
ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence
avec la
séquence SEQ ID NO : 7.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique
codant le
facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 13, comprenant ou
constitué par:
- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant
choisi
parmi la séquence SEQ ID NO : 3 ou une séquence présentant au moins 85%,
notamment
90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO :
3, et
- un acide nucléique codant le facteur représenté par la séquence SEQ ID NO
: 1,
ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 14 ou une
séquence ayant
au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95%
d'identité de
séquence avec la séquence SEQ ID NO: 14.
Plus particulièrement, ledit acide nucléique codant le facteur H humain
recombinant
de séquence SEQ ID NO : 13 est représenté par la séquence SEQ ID NO : 15 ou
une séquence
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WO 2013/060995 14 PCT/FR2012/052461
ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence
avec la
séquence SEQ ID NO: 15.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un acide nucléique
codant le
facteur H humain recombinant de séquence SEQ ID NO : 13, comprenant ou
constitué par:
- un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant
choisi
parmi la séquence SEQ ID NO : 4 ou une séquence présentant au moins 85%,
notamment
90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO :
4, et
- un acide nucléique codant le facteur représenté par la séquence SEQ ID NO
: 1,
ledit acide nucléique étant choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 14 ou une
séquence ayant
au moins 75%, de préférence 85%, notamment 90%, particulièrement 95%
d'identité de
séquence avec la séquence SEQ ID NO: 14.
Plus particulièrement, ledit acide nucléique codant le facteur H humain
recombinant
de séquence SEQ ID NO : 1 est représenté par la séquence SEQ ID NO : 24 ou une
séquence
ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence
avec la
séquence SEQ ID NO : 24.
Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 16 est constituée de la SEQ ID NO :
4 et
SEQ ID NO : 19.
Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 21 est constituée de la SEQ ID NO :
4 et
de la SEQ ID NO :20.
Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 22 est constituée de la SEQ ID NO :
3 et
de la SEQ ID NO :20.
Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 23 est constituée de la SEQ ID NO :
3 et
de la SEQ ID NO : 19.
Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 19 correspond à la séquence FH 402H
optimisé 2.
Dans la présente invention, la SEQ ID NO : 20 correspond à la séquence FH 402Y
optimisé 2.
La présente invention concerne aussi un vecteur d'expression comprenant ou
constitué
par un acide nucléique tel que défini ci-dessus.
La présente invention a également pour objet des cellules humaines, notamment
transformées, produisant du facteur H recombinant humain avec un rendement
supérieur à la
quantité de facteur H endogène produit par lesdites cellules.
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Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne des cellules
humaines
ayant un rendement supérieur à 10 mg/L, particulièrement à 30 mg/L, plus
particulièrement à
50 mg/L, notamment à 100 mg/L de milieu de culture.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne des cellules
humaines
transformées par un vecteur tel que défini ci-dessus.
Dans un mode de réalisation plus particulier, l'invention concerne des
cellules
humaines produisant du facteur H recombinant représenté par la séquence SEQ ID
NO : 1
avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène produit par
lesdites cellules.
Dans un mode de réalisation encore plus particulier, des cellules humaines de
l'invention sont choisies parmi PER.C60 et HEK 293F.
Dans un mode de réalisation particulier, les cellules humaines de l'invention
forment
un clone cellulaire.
La présente invention concerne aussi un procédé de la préparation de facteur H
humain recombinant, représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, dans une lignée
cellulaire
humaine avec un rendement supérieur à la quantité de facteur H endogène
produit par ladite
lignée cellulaire, ledit procédé comprenant l'étape de culture de ladite
lignée cellulaire
transformée par un vecteur comprenant un acide nucléique codant le précurseur
du facteur H
humain.
Le vecteur comprenant un tel acide nucléique peut être un quelconque vecteur
d'expression pour les lignées cellulaires eucaryotes connues de l'homme du
métier.
La transformation de la lignée cellulaire peut être mise en oeuvre par des
techniques
d'électroporation, de nucléofection type AMAXA, un "pistolet à gène" (gène
gun) ou encore à
l'aide d'un agent de transfection connu de l'homme de métier, tel que des
agents cationiques
des liposomes ou des polymères tel que la fectine ou l'agent PEI.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon la présente
invention
comprend les étapes suivantes :
(i) la transformation d'une lignée cellulaire par un vecteur d'expression
comprenant un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain, pour
obtenir une
lignée cellulaire transformée,
(ii) la culture de ladite lignée cellulaire transformée, pour obtenir
l'expression du
facteur H dans le milieu de culture.
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WO 2013/060995 16 PCT/FR2012/052461
Ledit vecteur d'expression peut contenir un gène de résistance aux
antibiotiques pour
permettre la sélection des cellules transfectées lors de l'établissement de
cellules produisant de
façon stable la protéine d'intérêt.
Dans un mode de réalisation plus particulier, le procédé selon la présente
invention
comprend les étapes suivantes :
(i) la transformation d'une lignée cellulaire, par un vecteur comprenant un
acide
nucléique codant le précurseur de la protéine facteur H humain, pour obtenir
une lignée
cellulaire transformée,
(ii) la culture de ladite lignée cellulaire transformée pour obtenir
l'expression de
facteur H dans le milieu de culture,
(iii) la purification du facteur H humain à partir du milieu de culture, et
(iv) éventuellement la séparation de la forme endogène et de la forme
recombinante
du facteur H purifié à l'étape (iii).
La purification du facteur H humain est mise en oeuvre par des techniques de
chromatographie en une, deux ou plusieurs étapes. La purification en une étape
peut-être une
colonne échangeuse d'ions ou une colonne d'affinité (héparine, ligand du
facteur H ou
anticorps anti-facteur H). La purification en deux étapes peut-être une étape
de
chromatographie sur colonne échangeuse de cations suivi d'une étape de
chromatographie sur
colonne échangeuse d'anions ou une étape de chromatographie sur colonne
échangeuse
d'anions suivi d'une étape de chromatographie sur colonne échangeuse de
cations ou une
étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'ions suivi d'une étape de
chromatographie sur colonne d'affinité ou une étape de de chromatographie sur
colonne
d'affinité suivi d'une une étape de chromatographie sur colonne échangeuse
d'ions. La
purification en plus de deux étapes peut-être réalisé par une combinaison de
ces différentes
chromatographies. Une étape de diafiltration, d'ultrafiltration ou de gel
filtration peut-être
réalisée en complément. La pureté d'un produit après une telle purification
peut atteindre 99%
de produit purifié.
Plus particulièrement, le vecteur pour la transformation de la lignée
cellulaire
comprend un acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain,
représenté par la
séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique comprenant :
(i) un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique étant
choisi
parmi la séquence SEQ ID NO : 3 et une séquence ayant au moins 85%, notamment
90%,
particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, et
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- un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique
étant
choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 et une séquence ayant au moins 75 %, de
préférence
au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec
la
séquence SEQ ID NO : 2,
ou
(ii) - un acide nucléique codant un peptide signal, ledit acide nucléique
étant choisi
parmi la séquence SEQ ID NO : 4 et une séquence ayant au moins 85%, notamment
90%,
particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 4, et
- un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1, ledit acide nucléique
étant
choisi parmi la séquence SEQ ID NO : 2 et une séquence ayant au moins 75%, de
préférence
au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec
la
séquence SEQ ID NO : 2.
Dans un mode de réalisation avantageux, le vecteur pour la transformation de
la lignée
cellulaire comprend un acide nucléique, qui comprend :
(i) l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 3 et l'acide
nucléique
représenté par la séquence SEQ ID NO : 2, ou
(ii) l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 4 et l'acide
nucléique
représenté par la séquence SEQ ID NO : 2.
Dans un mode de réalisation plus avantageux, le vecteur pour la transformation
de la
lignée cellulaire comprend un acide nucléique, qui comprend :
(i) l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant
représenté
par la séquence SEQ ID NO : 6, ou
(ii) l'acide nucléique codant le précurseur du facteur H humain recombinant
représenté
par la séquence SEQ ID NO : 7.
La lignée cellulaire utilisée dans le procédé selon la présente invention peut
être la
lignée cellulaire PER.C60 ou HEK 293F.
La présente invention a également pour objectif de fournir un facteur H
recombinant
possédant une pureté supérieure à 90% de préférence supérieure à 95%.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit facteur H humain recombinant
conserve
l'activité biologique d'un facteur H humain plasmatique.
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L'activité biologique du facteur H humain plasmatique comprend la régulation
de
l'activité du facteur I, l'inhibition de la formation de la C3 convertase
alterne et l'accélération
de la dissociation de la C3 convertase.
Les méthodes pour déterminer les activités biologiques ci-dessus sont connues
de
l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation plus particulier, ledit facteur H humain
recombinant
conserve l'activité biologique d'un facteur H humain plasmatique pour
accélérer la
dissociation de la C3 convertase.
La quantité de C3 convertase dissociée peut être déterminée en fonction de la
concentration de FH ajouté. L'IC50 est déterminée à partir de l'équation
calculée pour une
sigmoïde à pente variable.
Dans un autre mode de réalisation plus particulier, ledit facteur H humain
recombinant
conserve l'activité biologique d'un facteur H plasmatique pour réguler
l'activité du facteur I.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique
comprenant uniquement un variant de facteur H humain recombinant en tant que
substance
active, ledit variant étant un variant mentionné dans le site internet
http://www.uniprot.orgfuniprot/P08603.
Particulièrement, la présente invention concerne également une composition
pharmaceutique comprenant uniquement le variant Y402 de facteur H humain
recombinant
représenté par la séquence SEQ ID NO : 1, sans le variant H402 de facteur H
humain.
Le variant Y402 de facteur H humain recombinant peut être produit par la
lignée
cellulaire HEK 293F qui produit par voie endogène uniquement le variant Y402.
La production du variant Y402 recombinant peut être également mise en oeuvre
par la
lignée cellulaire PER.C60 qui produit par voie endogène à la fois le variant
Y402 et le variant
H402, suivie par une purification ou une séparation qui permet de séparer le
variant Y402 du
variant H402. La lignée cellulaire PER.C60 peut également être modifiée pour
ne pas
produire par voie endogène le variant H402.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique
comprenant uniquement le variant H402 du facteur H humain, sans le variant
Y402 représenté
par la séquence SEQ ID NO: 1.
Le variant H402 du facteur H humain recombinant peut être produire par la
lignée
cellulaire PER.C60 ou la lignée cellulaire HEK 293F. Une purification ou une
séparation est
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nécessaire afin de séparer le variant H402 du variant Y402. Les lignées
cellulaires PER.C60
et HEK 293F peuvent également être modifiées pour ne pas produire par voie
endogène le
variant Y402.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique
comprenant le variant H402 et le variant Y402 en tant que substance active.
Une composition pharmaceutique selon la présente invention comprend également
un
véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique
comprenant plus de 99,5% d'un variant de facteur H humain et moins de 0,5%
d'un autre
variant de facteur H humain.
La présente invention est illustrée par les figures et les exemples ci-après.
Ces figures
et exemples ne visent en aucun cas la limitation de la portée de la présente
invention.
Figures
Figure 1 signifie dosage de facteur H endogène dans les cellules PER.C60 et
HEK
293F
Figure 2 signifie génération de pools stables PER.C60 exprimant de façon
stable le
facteur H recombinant (ici exemple pour le facteur H variant H402)
Figure 3 signifie cinétique de la production de facteur H recombinant (H402)
dans les
pools stables PER.C60 en mode batch.
Figure 4 signifie dosage par ELISA du Facteur H recombinant produit dans les
cellules HEK 293F en mode batch pendant 7 jours.
Figure 5 signifie dosage par ELISA du Facteur H recombinant produit dans les
pools
stables PER.C60 en mode batch pendant 7 jours.
Figure 6A signifie Analyse du Facteur H recombinant produit dans le surnageant
des
cellules PER.C60 et HEK 293F par SDS-PAGE
Figure 6B signifie Analyse du Facteur H recombinant produit dans le surnageant
des
cellules PER.C60 et HEK 293F par Western Blot.
Figure 6C illustre la comparaison du profil électrophorétique du facteur H
humain
recombinant purifié produit dans les cellules PERC6 et HEK avec celui du
facteur humain
plasmatique purifié (lot LFB) en SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie
après
traitement ou non par un agent réducteur (DTT).
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Figure 6D illustre l'analyse du facteur H humain recombinant purifié produit
dans les
cellules PERC6 et HEK et du facteur H humain plasmatique purifié (lot LFB) par
Western
Blot à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-facteur H (The Binding Site, réf
: PC030).
Figure 7A signifie Purification du Facteur H sur colonne Héparine suivi d'une
étape
de diafiltration.
Figure 7B illustre l'analyse en SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie
des
étapes de purification en une étape de chromatographie échangeuse de cations
(SP-sepharose)
du facteur H humain recombinant produit dans par les cellules PERC6. Le
surnageant de
départ (piste 2), les différentes fractions obtenues au cours du procédé de
purification (pistes
3-7, piste 3 : surnageant acidifié, piste 4 : fraction non retenue (FNA),
piste 5 : lavage, piste 6 :
eluât SPpiste 7: eluât NaC1 2M) et le produit final (FH recombinant humain
Y402) purifié,
concentré et filtré (piste 8 : bande majoritaire à 120,6 kDa, 98,4%)) ont été
déposés. Le
produit final a également été déposé en conditions réductrices (piste 9 bande
majoritaire à
143,5 kDa, 93,9%)). Les pistes 1 et 10 sont des témoins de masse.
Figure 7C illustre l'analyse en SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie
des
étapes de purification en deux étapes de chromatographie échangeuse d'ions (SP-
sepharose
puis Q-sepharose) du facteur H humain recombinant produit dans par les
cellules HEK. Le
surnageant de départ (piste 2), les différentes fractions obtenues au cours du
procédé de
purification (pistes 3-7 et 10-14 : piste 3 : surnageant acidifié, piste 4 :
fraction non retenue
(FNA) 1 ère chromatographie, piste 5 : lavage 1 ère chromatographie, piste 6 :
eluât 1 ère
chromatographie, piste 7 : eluât NaC1 2M 1 ère chromatographie, piste 10 :
eluât 1 ère
chromatographie, piste 11: fraction non retenu (FNA) 2ème chromatographie,
piste 12 :
lavage 2ème chromatographie, piste 13 : éluât 2ème chromatographie, piste 14 :
eluât NaC1
2M 2ème chromatographie) et le produit final (FH recombinant humain Y402)
purifié,
concentré et filtré (piste 15) ont été déposés. Le produit final a également
été déposé en
conditions réductrices (piste 16). Les pistes 1, 8, 9 et 17 sont des témoins
de masse.
Figure 8A signifie Détermination de l'activité d'accélération de la
dissociation de la
C3 convertase en présence de surnageant (Sn) des cellules PER.C60 et HEK 293F
contenant
du facteur H humain recombinant (variant Y402 ou variant H402).
Figure 8B décrit Détermination de l'activité d'accélération de la dissociation
de la C3
convertase du Facteur H humain recombinant purifié produit dans les cellules
PER.C60 et
HEK 293F et du Facteur H humain plasmatique.
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Figure 9A et 9B illustrent l'analyse du facteur H humain recombinant purifié
produit
dans les cellules PERC6 et HEK par tamisage moléculaire. 95 tg du facteur H
humain
recombinant purifié produit dans PERC6 (Figure 9A) et 50 ng du facteur H
humain
recombinant purifié produit dans HEK (Figure 9B) ont été injectés séparément
sur une
colonne de gel filtration (GE Healthcare, Superdex 200 10/300 GL, réf : 17-
5175-01). Un pic
majoritaire (99% et 97% respectivement pour PERC6 et HEK) d'une taille de 377-
378 kDa
correspondant au facteur H humain est observé.
Figure 10 A et 10B illustrent l'electrofocalisation par électrophorèse
capillaire du
facteur H humain recombinant purifié produit dans les cellules PERC6 (Figure
10A) et HEK
(Figure 10B).
Figure 11A et 11B illustrent l'analyse du facteur H humain recombinant purifié
produit dans les cellules PERC6 et HEK par électrophorèse capillaire en gel
SDS en
conditions non-réductrices (Figure 11A) ou en conditions réductrices (Figure
11B).
Figures 12A, 12B, 12C et 12D illustrent l'analyse de l'activité cofacteur du
Facteur I (FI) des
FH humains recombinants PERC6 et HEK et du facteur H humain plasmatique
formulé (FH
form.) ou en tampons PBS 1X (FH dess). lOng de protéine C3b et 14Ong de
facteur I sont
incubés à 37 C pendant 30min en présence de quantités croissantes de facteur H
(50, 100, 250,
500 et 1000 ng). Les différents échantillons sont déposés en SDS-PAGE afin de
quantifier les
bandes correspondants aux chaines a' et p de la molécule C3b ainsi qu'aux
fragments clivés
u'l et a'2 de la chaine a,'. Le pourcentage de molécules C3b inactivées est
ensuite calculé par
le rapport entre la quantité de chaines a' clivées et la quantité totale de
chaine u' .Figure 13
montre la courbe dose-réponse de l'inhibition de la lyse des globules rouges
de mouton par le
facteur H humain plasmatique (PB03 ou LP03) ou recombinant (PERC6 ou HEK).
Exemples
Exemple 1: Matériels et Méthodes
1.1 Optimisation de l'acide nucléique codant le facteur H humain
L'optimisation de séquence à été faite par l'algorithme du fournisseur de gène
de
synthèses avec optimisation pour Homo sapiens en évitant les sites de
restrictions nécessaires
au clonage moléculaire
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1.2 Transfection des vecteurs pcDNA2001neo contenant les séquences du Facteur
H dans les cellules PER.C60 pour générer des pools stables.
La transfection en pools stables est réalisée en parallèle avec le vecteur
pcDNA2001neo vide (= sans séquence de Facteur H). Les transfections en pool
stables sont
effectuées selon le nouveau protocole décrit ci-dessous.
L'électroporation sera effectuée avec les vecteurs suivants:
Vecteur d'expression
control pcDNA2001Neo
Facteur H MD1Y, MD1H
MD2Y, MD2H
MD3Y, MD3H
MD 1Y signifie le vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la
séquence
SEQ ID NO :9.
MD2Y signifie le vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la
séquence
SEQ ID NO :6.
MD3Y signifie le vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la
séquence
SEQ ID NO :7.
MD1H correspond au vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la
séquence
SEQ ID NO : 18.
MD2H correspond au vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la
séquence
SEQ ID NO : 15
MD3H correspond au vecteur comprenant l'acide nucléique représenté par la
séquence SEQ
ID NO :24.
- Pré-culture des cellules
Les cellules pour la transfection en pool stable, issues de la culture en
suspension à
partir de cellules en suspension stockées en cryotube dans du milieu sans
sérum, sont des
cellules PER.C6 SF adaptées en milieu Permab (Hyclone, ThermoFisher
Scientific) et sous
agitation. Elles ont été cultivées durant 3 semaines sous agitation à 125rpm.
Deux jours avant électroporation, les cellules sont passées en suspension à
5E5 cv/mL
par un changement complet du milieu Permab. Le volume est adapté au nombre de
cuvettes
planifié lors de l'électroporation.
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Le jour de l'électroporation, la concentration cellulaire et la viabilité sont
déterminées.
Les cellules doivent être en phase exponentielle de croissance et avoir une
viabilité supérieure
à 90%.
Avant l'électroporation, le milieu Permab (3 mM L-Glutamine) est préchauffé à
température ambiante.
- Electroporation
Les étapes suivantes sont effectuées dans 6 cuvettes :
- Pré-aliquoter 60 mL dans un T150 et préchauffer à 37 C (soit 10 mL par
cuvette)
Les étapes suivantes sont effectuées dans chaque cuvette :
- Centrifuger 6E6 cv à 300g durant 5 minutes et jeter le surnageant
- Re-suspendre les cellules en agitant le tube un dizaine de fois
- Ajouter 400 lut de milieu Permab (3 mM L-Glutamine) à température
ambiante, sans
laisser les cellules plus de 15 minutes.
- Ajouter 8 ug d'ADN dans un tube Eppendorf 1,5 mL stérile
- Ajouter délicatement 400 uL de suspension cellulaire sur les 8 tg d'ADN
- Transférer la suspension ADN/Cellules dans une cuvette d'électroporation
4mm.
Vérifier l'absence de bulles au fond de la cuvette.
- Après avoir transféré la cuvette dans la chambre à électroporation,
appliquer le
programme suivant de BioRad Gene Pulser Xcell :
Voltage (v) 250
Durée de la pulsation (msec) 5
Nombre de pulsations 1
Intervalle de pulsations (sec) 0
Cuvette (mm) 4
- Ecarter les amas blancs flottant en surface (débris cellulaires) et
prélever
délicatement la suspension cellulaire à l'aide d'une pipette de 1 mL.Ajouter
les
cellules directement dans les 60 mL de milieu préchauffé à 37 C. Ne pas le
faire au
goutte à goutte afin d'éviter la formation de précipités.
- Recommencer les étapes suivantes jusqu'à l'obtention des 6 cuvettes pour
la
génération du pool stable PER.C60.
D Sélection et génération d'un pool stable
48 heures après la transfection, l'efficacité de transfection est évaluée. La
culture
cellulaire est resuspendue et un comptage sur 1 mL est effectué. La
concentration en cellules
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viables divisée par celle de départ (6E5 cv/mL) permet d'obtenir le
pourcentage de
recouvrement de la viabilité.
Un récipient à 5E5 cv/mL est ensemencé par changement total du milieu et ajout
de
Permab (3 mM L-Glutamine) et G418 à 125 ug/mL. La totalité des cellules est
centrifugée à
300g pendant 5 min avant l'ajout du milieu de sélection.
Les cellules sont passées deux fois par semaine (le lundi et le vendredi) par
renouvellement complet du milieu de sélection. Le volume et le contenant sont
adaptés de
manière à obtenir une concentration de 3E5 cv/mL à chaque passage. Après 2-3
semaines la
viabilité cellulaire s'améliore. Lorsque celle-ci atteint environ 50 %, des
cultures en
conditions agitées peuvent être initiées. Dans ce cas, la concentration de
départ est de 5E5
cv/mL. Lorsque la culture atteint plus de 85 % de viabilité, une
cryoconservation est effectuée
à 5E6 cv/ampoule.
Ensemencement de la culture en Batch pour production de Facteur H recombinant:
Le volume du récipient utilisé pour le Batch est de 250 ml avec un volume
initial de
travail de 30 ml. Tout changement de volume de récipient entraîne
automatiquement une
adaptation des volumes et valeurs énoncés dans ce protocole.
Les cellules sont ensemencées à une concentration de 1E6 cv/ml par
renouvellement
complet du milieu de culture. Les cellules sont incubées pendant 7 jours à une
température de
36.5 C en agitation 125 rpm sans renouvellement ou ajout de milieu. Un
prélèvement est
réalisé tous les jours entre le 3" et 7' jour de culture afin de déterminer la
viabilité, la
densité cellulaire et la production de Facteur H recombinant.
Le 7" jour, les cellules sont centrifugées à 3000g pendant 15 minutes. Le
culot
cellulaire est éliminé et le surnageant cellulaire contenant le facteur H
recombinant est filtré
en 0.22 ium puis congelé à -20 C.
1.3: Transfection transitoire dans les cellules HEK 293F pour production
transitoire de Facteur H recombinant.
Pre-culture des cellules:
La veille de la transfection transitoire, les cellules HEK 293F sont repiquées
à une
concentration cellulaire de 7E5 vc/ml.
Transfection transitoire :
La densité cellulaire et la viabilité des cellules HEK 293F sont déterminées
le jour de
la transfection. Le volume de culture correspondant à 30E6 cv/ml est
centrifugé. Le
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surnageant est éliminé et le culot de cellules est repris dans 28 ml de milieu
de culture F17
(Invitrogen), transféré dans un erlen de 250 ml et incubé à 37 C.
Formation du complexe agent de transfection / ADN en rapport 2:1: L'agent de
transfection (Fectine ou PEI) et l'ADN correspondant au vecteur pCEP4
contenant une des
séquences du Facteur H sont préparés dans du milieu OptiMEM (Invitrogen) de la
façon
suivante:
- Ajout de 30 ,g d'ADN dans 1 ml d'OptiMEM
- Ajout de 60 lui_ de Fectine ou 60 lui_ de PEI dans 1 ml d'OptiMEM.
Ces deux préparations sont incubées séparément pendant 5 minutes à température
ambiante puis la solution contenant l'agent de transfection est ajoutée
délicatement à celle
contenant l'ADN. Le mélange est incubé pendant 25 minutes à température
ambiante avant
d'être ajouté au 28 ml de cellules HEK 293F préalablement préparées.
Les cellules sont alors incubées à 37 C en agitation à 125 rpm.
Témoin positif de transfection: un vecteur exprimant la GFP (Green Fluorescent
Protein) est également transfecté dans les mêmes conditions. 24h post-
transfection l'efficacité
de transfection est déterminée par microscopie à fluorescence (rapport nombre
de cellules
exprimant la GFP sur nombre total de cellules).
Témoin de croissance: des cellules HEK 293F sont transfectées dans les mêmes
conditions mais en l'absence de vecteur d'expression. Ce témoin permet de
déterminer la
viabilité post-transfection et si il y a une toxicité lié à la production
transitoire de la protéine
exogène (le facteur H recombinant).
Production transitoire de facteur H:
Les cellules sont maintenues en culture durant 7 jours sans ajout ou
renouvellement de
milieu de culture. La densité cellulaire et la viabilité est déterminé tous
les jours entre le 5'
et le 7' jour.
Le 7' jour, les cellules sont centrifugées à 3000g pendant 15 minutes. Le
culot
cellulaire est éliminé et le surnageant cellulaire contenant le facteur H
recombinant est filtré
en 0.22 ium puis congelé à -20 C.
1.4 Test de viabilité de cellules
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La densité cellulaire et la viabilité sont déterminées à l'aide d'un automate
analyse de
culture cellulaire (Cedex, Innovatis ¨ Roche Applied Science). La mesure de la
viabilité est
basée sur le comptage des cellules ayant incorporées du bleu trypan.
1.5 Caractérisation du facteur H humain recombinant
SDS-PAGE:
- Préparation des échantillons: l'équivalent de litg de protéine est
mélangé en vol/vol
avec du tampon Laemli 2X. Le mélange est chauffé 5 minutes à 95 C afin de
dénaturer les
protéines.
Les protéines sont alors déposées dans les puits d'un gel linéaire 10 % Bis-
Tris /Hcl
pH 6.4. La migration est réalisée en présence d'un tampon MOPS (50 mM MOPS, 50
mM
Tris Base, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, pH 7.7).Les protéines sont séparées à un
voltage constant
de 200 volts pendant 60 minutes.
Coloration au bleu de coomassie:
Après migration, le gel est lavé 3 fois 5minutes avec de l'eau distillée puis
coloré avec
une solution de bleu de coomassie durant la nuit. L'excès est éliminé par des
lavages
successifs avec de l'eau ditsillée. Une photo du gel est alors prise à l'aide
d'un imageur.
Révélation par Western Blot:
Après migration, le gel est transféré dans un tampon contenant 40mM d'acide
Amino-
6-hexanoïque, Tris 25mM pH 9.8.
Sur un appareil de transfert semi-sec (TE77, Amersham Pharmacia), un sandwich
est
réalisé de l'anode vers la cathode de la façon suivante:
- 6 papiers whatman pré-incubés dans du tampon Tris 0.3M pH 10.4
- 3 papiers whatman pré-incubés dans du tampon Tris 25mM pH 10.4
- 1 membrane de nitrocellulose (RPN 303E, GE Healtcare) pré-incubés dans du
tampon Tris 25mM pH 10.4
- le gel pré-incubé dans le tampon 40mM d'acide Amino-6-hexanoïque, Tris
25mM
pH 9.8
- 9 papiers whatman pré-incubés dans le tampon 40mM d'acide Amino-6-
hexanoïque,
Tris 25mM pH 9.8
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Le transfert est réalisé à intensité constante de 0.8mA/cm2 de membrane
pendant 60
minutes.
Après transfert, la membrane est saturée sur la nuit à 4 c dans un tampon PBS
contenant 1% de BSA et 0.1% de tween20. La membrane est ensuite lavée avec de
l'eau
physiologique contenant 0.1% de tween 20. Le facteur H est révélé à l'aide
d'un anticorps
monoclonal anti-facteur H (MCA 508G, Serotec) à la concentration de 0.5 ,g/m1
incubé à
température ambiante pendant 60 minutes, suivi d'un anticorps secondaire anti-
IgG de souris
couplé à la Peroxidase à la concentration de 8Ong/m1 incubé à température
ambiante pendant
60 minutes. Les protéines marquées sont alors révélées à l'aide d'un kit
enzymatique de
chimiluminescence et détectées à l'aide d'un imageur équipé d'un détecteur
photonique.
1.6 Dosage de facteur H humain dans le milieu de culture par ELISA
TAMPON ET SOLUTIONS:
1- Tampon de coating : PBS
Dissoudre le contenu d'un sachet de sels pour tampon PBS, pH 7.4 (Sigma : P-
3813 ou
sels de qualité équivalente) dans un litre d'eau PPI.
2- Anticorps de coating: Immunoglobulines de mouton anti-Facteur H humain (The
Binding Site - Réf: PC030)
Extemporanément, diluer l'anticorps dans le tampon de coating pour obtenir une
concentration comprise entre 3,5 et 5,5 iLtg/ml.
3 - Tampon de saturation: Tampon PBS - BSA 1 % (p/vol)
Pour une plaque, dissoudre 0,15 g de BSA (BSA: Sigma - Réf. : A7030 ou Jackson
Immuno Research Laboratories, Réf. : 001-000-162 ou une BSA de qualité
équivalente) dans 15 ml de tampon PBS.
4- Tampon de lavage: Tampon PBS - Tween 20 0,1 % (vol/vol)
Ajouter 1 ml de Tween 20 à 1 litre de PBS.
- Tampon de dilution: Tampon PBS - Tween 20 0,1 % (vol/vol) - BSA 0,1 %
(p/vol)
Tampon pour la dilution du standard, des échantillons à doser et de
l'anticorps de
révélation. Dissoudre le tampon de saturation au 1/10ème en tampon de lavage.
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6 - Solution standard: Calibrateur Facteur H humain NL (The Binding Site,
Réf.:
RP030)
Reprendre le lyophilisat par le volume d'eau PPI indiqué par le fournisseur et
attendre
30 min, puis répartir en fractions aliquotes de 200 et les congeler à ¨70 C.
Diluer le standard au 1/7000ème (pour un std à 700 mg/L), pour obtenir une
solution
mère de 100 ng/ml, soit :
lère prédilution au 1/70ème : 5 1 de Std + 345 1 de tampon de dilution,
2ème prédilution au 1/100ème : 50_ de la lère prédilution + 4950_ de tampon de
dilution.
Puis diluer de 'A en 'A dans le tampon de dilution sur 7 points,
Le blanc est réalisé avec le tampon de dilution.
7 - Echantillons
Les échantillons sont prédilués de façon à obtenir une concentration proche de
celle du
premier point de gamme. Puis diluer de 'A en 'A sur 8 points.
8- Anticorps monoclonal anti Facteur H: Immunoglobulines monoclonales de
souris
purifiées anti-Facteur H humain (SEROTEC - Réf : MCA508G).
Extemporanément diluer l'anticorps dans le tampon de dilution au 1/5000', soit
pour
1 plaque : 2 iLt1 dans 10 ml de tampon de dilution.
9 - Anticorps de révélation: Immunoglobulines de chèvre anti-IgG de souris
marquées
à la peroxydase (Jackson Immuno Research Laboratories, Réf. : 115-035-062).
Extemporanément diluer les anticorps dans le tampon de dilution au 1/10000ème
(1/50ème puis 1/200ème) soit pour une plaque :
1/50ème : 2 iil dans 98 iil de tampon dilution, puis 1/200ème : 50 iil dans 10
ml de
tampon dilution.
10- Solution de révélation: TMB Kit
Mélanger extemporanément volume à volume la solution de substrat de la
peroxydase
(3,3',5,5"-tetramethylbenzidine) et la solution de peroxyde.
11- Solution d'arrêt: Acide sulfurique 4 N ou 2 M (Fisher Scientific, Ref :
0379D).
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MODE OPERATOIRE
> Sensibilisation de la phase solide
Dans une plaque de microtitration, distribuer 100 pl par puits d'anticorps de
coating
dilué
Recouvrir d'une feuille adhésive.
Incuber une nuit à + 4 C et vider la plaque par retournement.
> Saturation de la phase solide
Distribuer 120 pl par puits de solution de saturation.
Recouvrir d'une feuille adhésive.
Incuber lh à 20 C.
Laver 3 fois en tampon de lavage.
> Capture de l'antigène
Distribuer 100 pl par puits de tampon de dilution (blanc), de chaque dilution
du
standard et des échantillons.
Recouvrir d'une feuille adhésive.
Incuber 1 heure 30 à 20 C.
Laver 5 fois en tampon de lavage.
> Reconnaissance de l'antigène par l'anticorps monoclonal
Distribuer 100 pl par puits de l'anticorps monoclonal.
Recouvrir d'une feuille adhésive.
Incuber 1 heure 30 à 20 C.
Laver 5 fois en tampon de lavage.
> Marquage par le conjugué HRP (HorseRadish Peroxidase) Distribuer 100 pl
par puits de l'anticorps de révélation.
Recouvrir d'une feuille adhésive.
Incuber 1 heure à 20 C.
Laver 5 fois en tampon de lavage.
> Réaction enzymatique
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Distribuer 100 pl par puits de TMB contenant le substrat à intervalle de temps
régulier
et loin de toute lumière intense.
Incuber à température ambiante entre 5 ¨ 15 minutes..
Ce temps doit être identique pour tous les points de dosage.
Arrêt de la réaction
Distribuer 100 pl d'H2SO4 4N par puits à intervalle de temps régulier.
Lire les densités optiques (DO) à 450 nm.
EXPLOITATION DES RESULTATS
La droite de régression linéaire de la courbe standard est définie par les
couples (Log
(DO à 450 nm-DO blanc), Log de la concentration de Facteur H en ng/ml).
Le résultat est la moyenne de tous les résultats obtenus pour un même
échantillon dans
la zone linéaire de la droite obtenu pour la gamme du standard.
1.7 Caractérisation du facteur H humain recombinant purifié
Le facteur H humain recombinant produit dans la lignée PER.C60 est purifié par
chromatographie échangeuse d'ions en une étape.
Le facteur H humain recombinant produit dans la lignée HEK 293 est purifié par
chromatographie échangeuse d'ions en deux étapes.
Les résultats de l'analyse en SDS-PAGE des étapes de purification du Facteur H
recombinant produit par les cellules PER.C60 ou HEK 293 sont illustrés aux
figures 7B et 7C.
La présence du facteur H humain recombinant purifié est révélée par gel SDS-
PAGE
qui est coloré par bleu de Coomassie et par Western blot selon la partie 1.5
décrite ci-dessus.
Les résultats de l'analyse du FH humain recombinant purifié par SDS-PAGE ou
par
Western-blot sont illustrés respectivement par les figures 6C et 6D.
Le facteur H humain recombinant ainsi purifié est analysé par tamisage
moléculaire,
par électrofocalisation en électrophorèse capillaire ou par électrophorèse
capillaire en gel SDS
selon les méthodes décrites ci-après.
Tamisage moléculaire
1.Mode opératoire
50 à 100 tg de facteur H humain recombinant sont injectés sur une colonne de
gel
filtration Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare, réf : 17-5175-01)
préalablement
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équilibrée en tampon PBS1X. La séparation est réalisée un débit constant de
0,4m1/min sur un
appareil FPLC couplé à un détecteur UV (GE Healthcare, Akta Prime).
Le résultat de l'analyse par tamisage moléculaire est illustré par les figures
9A et 9B.
2. Résultats
Le chromatogramme obtenu avec le FH recombinant purifié produit par la lignée
cellulaire HEK 293F présente un pic majeur ayant un temps de rétention de
27,88 min qui
correspond au FH (Fig. 9A)
Le chromatogramme obtenu avec le FH recombinant purifié produit par la lignée
cellulaire PER.C6 présente un pic majeur ayant un temps de rétention de 27, 89
min qui
correspond au FH et un pic mineur qui sort à 21,07 min correspondant à des
formes agrégées
du FH recombinant (Fig. 9B).
Electrofocalisation en électrophorèse capillaire
1 mode opératoire
La détermination des iso formes des FH recombinants est réalisée par
électrophorèse
capillaire en utilisant le kit Advanced cIEF Starter kit (Beckman Coulter,
A80976) et
l'appareil d'électrophorèse capillaire PA800 avec un détecteur UV (Beckman
Coulter).
75 itg de chaque échantillon de FH recombinant à analyser sont dessalés par
centrifugation sur Zeba Desalt Spin columns (Pierce), séchés au Speedvac à
température
ambiante puis repris par un volume d'eau ultra-pure de sorte à obtenir une
concentration en
protéine de 5 à 10 mg/ml.
iil chaque échantillon sont ensuite mélangés avec 240 lut de mix constitué de
200
lui d'urée 3M, 12 iil de Pharmalyte 3-10 carrier ampholytes, 20 iil de
stabiliseur cathodique, 2
iLt1 de stabiliseur anodique et 2 iLt1 de marqueurs de pI compris entre 4,1 et
10.
Les préparations d'échantillons sont injectés sur un capillaire eCAPTM
(Beckman
Coulter, 477441) en utilisant la méthode pré-programmée Basic pH Gradient
Separation
Method met. Afin de vérifier la linéarité de la migration en fonction des pI,
un mélange de 5
marqueurs (de pI 4,1 à 10) est injecté en début et en fin de séquence
d'analyse.
2 Analyse des résultats et calcul des pl
Après intégration des pics de l'électrophérogramme le logiciel 32 Karat
calcule
automatiquement les valeurs de pI de l'échantillon. Le résultat est illustré
aux figures 10A et
10B.
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L'analyse montre la présence de plusieurs iso formes dont le pi expérimental
varie
faiblement (entre 5.53 et 6.01 et entre 5.86 et 6.13 pour PERC6 et HEK
respectivement) avec
des valeurs proche du pi théorique du FH humain qui est de 6.12 (voir le
tableau ci-après).
FH humain produit dans la lignée PER.C6
pI 6,01 5,97 5,89 5,85 5,83 5,75 5,64 5,61 5,59
5,53
Aire 0,9 1,8 0,2 2,6 1,9 3,5 21,3 9,5 23,0 35,4
en %
FH humain produit dans la lignée HEK
pI 6,13 6,1 6,09 6,05 6,02 5,95 5,92 5,89 5,86
Aire 15,5 8,7 2,6 0,7 14,6 10,5 27,0 3,2 17,2
en %
Electrophorèse capillaire en gel SDS :
1. Mode opératoire :
La détermination des masses moléculaires des FH recombinants est réalisée par
électrophorèse capillaire en utilisant le SDS-MW Analysis kit (Beckman
Coulter, 390953)
et l'appareil d'électrophorèse capillaire PA800 avec un détecteur UV (Beckman
Coulter).
200 itg de chaque échantillon de FH recombinant à analyser sont mélanger avec
150 iil de
tampon échantillon (100 mM Tris-HC1 pH 9,0, 1% SDS) et centrifugé sur
Centricon YM-
(Millipore, PN 4205) à 4000 g pendant 10 min. L'opération est répétée 2 fois
(ajout de
150 iil de tampon échantillon et centrifugation à 4000 g 5 min) puis le volume
est
compléter à 100 iil par du tampon échantillon.
Pour l'analyse en conditions non-réduites, 50 iLt1 de l'échantillon sont
prélevés et mélangés
avec 45 iil de tampon échantillon, 2 iil de standard interne 10 kD, 5 iil
d'iodo-acétamide à
250 mM et chauffer à 70 C pendant 10 min. Pour l'analyse en conditions
réduites, les 50
itl restants sont mélangés avec 45 itl de tampon échantillon, 2 itl de
standard interne 10
kD, 5 itl de 2-mercaptoéthanol et chauffés à 70 C pendant 10 min.
Une solution se standard de poids moléculaire est également préparée en
mélangeant 85 itl
de tampon échantillon, 2 itl de SDS-MW marqueur de taille (10 à 225 kD) et 5
itl de 2-
mercaptoéthano1.
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Les échantillons ainsi préparés sont analysés par injection sur un capillaire
50 ium I.D.
bare-fused silica 2 en utilisant la méthode pré-programmée SDS MW Conditioning-
PA800 plus-met.
A partir de la courbe de calibration standard, le poids moléculaire des
échantillons est
déterminé par le logiciel 32 Karat. L'intégration des pics permet de calculer
le
pourcentage que représente chaque pic de l'échantillon.
2. Analyse des résultats :
A partir de la courbe de calibration du standard, le poids moléculaire des
échantillons
est déterminé à l'aide du logiciel 32 Karat. L'intégration des pics de permet
de calculer les
proportions de chaque pic de l'échantillon. Le résultat est illustré aux
figures 11A et 11B et le
tableau ci-après.
Le profil électrophorétique montre la présence d'un pic très majoritaire
(>95%) qui
correspond au facteur H humain purifié et dont la taille est de 173 ¨ 176 kDa
en conditions
non réductrices (Figure 11A) et de 143-148 kDa en conditions réductrices
(Figure 11B).
HEK PER.C6
Conditions pM
16 29 66 173 48 176
non (kDa)
réductrices Aire% 0,5 0,6 1,2 97,7 0,3 99,7
pM
Conditions 16 36 66 145 46 143
(kDa)
réductrices
Aire% 0,8 0,6 1,0 95,6 1,3 98,7
1.8 Caractérisation de l'activité biologique du facteur H humain recombinant
1.8.1 Activité anti-C3 convertase (C3 convertase Decav-accelerating activitv)
TAMPONS ET SOLUTIONS
Tampon de recouvrement
Tampon carbonate 0.1M ¨ pH 9.6
Na2CO3 : 5.3 g dans 500 ml d'eau PPI (pour préparations injectables) 0.1 M
NaHCO3 : 4.2 g dans 500 ml d'eau PPI 0.1 M
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Ajouter 30 ml de la solution Na2CO3 à 70 ml de la solution NaHCO3 et ajuster
éventuellement le pH à 9.6. Conserver à 4 C pendant 2 mois.
D Tampons de lavage
a) Tampon PBS pH 7.4 (Sigma) + Tween 20 0.1 % (= Tampon A)
Dissoudre 0.1 ml de Tween 20 dans 100 ml de tampon PBS pH 7.4.
Conserver à + 4 C (2 jours maximum).
b) Tampon phosphate de Sodium 10 mM , NaC125 mM , pH 7.2 0.05 (= Tampon B)
Dissoudre dans un litre d'eau PPI : 1.56 g de NaH2PO4, 2H20.
Dissoudre dans un litre d'eau PPI : 3.58 g de Na2HPO4,12 H20.
Ajouter environ 66 ml de la solution de Na2HPO4 à 34 ml de la solution de
NaH2PO4.
Ajuster le pH à 7.30. Ajouter le NaC1 nécessaire pour obtenir une
concentration finale à 25
mM. Ce tampon peut être conservé à 4 C pendant 1 mois.
Ce tampon sert de base pour les tampons de saturation, de dilution et de
lavage.
Pour obtenir le tampon de lavage (= Tampon C) :
Dissoudre 0.1 ml de Tween 20 dans 100 ml du tampon B.
Conserver à + 4 C (2 jours maximum).
D Tampon de saturation
Préparer un volume suffisant à partir du tampon B. Ajouter 1 % de BSA (m/v).
Conservation maximum de 2 jours à +4 C.
D Tampon de dilution D
Préparer le volume nécessaire avec du tampon B auquel on ajoute du Tween 20 à
la
concentration de 0.05 % et de la BSA à la concentration de 4 % (m/v) .
Conservation maximum de 2 jours à +4 C.
D Tampon de dilution E
Préparer le tampon de dilution E à partir de PBS pH 7.4 auquel on ajoute 0.1 %
de
BSA (m/v).
Conservation maximum de 2 jours à +4 C.
D Solution de NiC12 20 mM, NaC125 mM
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Peser 0.475 g de NiC12 qsp 100m1 d'une solution de NaC1 25 mM (conservation
maximum de 3 mois à +40 C).
D Tampon substrat
Tampon citrate 0.1M + H202 30%.
Tampon citrate :
Dissoudre dans un litre d'eau PPI 29 g de citrate de sodium et 4.1 g d'acide
citrique.
Ajuster si besoin le pH à 5.5.
Conserver à +40 C pendant 3 mois maximum.
Ajouter extemporanément 10 pl de H202 30 % à 10 ml de tampon citrate le jour
de
son utilisation et conserver à l'abri de la lumière.
D Solution d'arrêt.
Solution d'acide sulfurique 4N (2M) a préparer ou prête à l'emploi.
Préparer un litre : 100 ml H2504 18M + 900 ml d'eau PPI.
Stocker à température ambiante pendant 6 mois maximum.
MODE OPERATOIRE
Recouvrement des plaques
Diluer le C3b dans le volume nécessaire à l'essai dans le tampon de
recouvrement
pour avoir une concentration finale à 2.5 pg/m1 (10 ml pour une plaque de 96
puits). Ex : pour
le lot D28449 à 1 mg/ml, diluer 25 pl dans 10 ml de tampon de tampon de
recouvrement.
Distribuer 100 pl de la solution préparée dans chaque puits.
Recouvrir la plaque d'un adhésif.
Incuber la plaque 1 H à 1 H 15 à + 34 C puis une nuit à + 4 C.
D Lavages
Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3x280
pl de
tampon de lavage C). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette
opération.
Vider par retournement.
D Saturation
Distribuer 300 pl de tampon de saturation par puits.
Incuber 1 H à 1 H 15 à + 34 C.
Vider par retournement.
D Etape de la génération de la convertase.
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Préparer la solution suivante (10 ml pour une plaque de 96 puits) :
- Solution de NiC12 20 mM, NaC1 25 mM : 750 pl (concentration finale NiC12
: 1.5
mM)
- Facteur B Calbiochem (1 mg/mi) : 40 pl (concentration finale : 4 tg/ml)
- Facteur D Calbiochem (0.1 mg/mi) : 30 pl (concentration finale : 0.3
tg/ml)
- Tampon de dilution D : 9180 pl.
Déposer 100 pl / puits et incuber 2 heures à + 34 C.
Lavages.
Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3 x 280
pl de
tampon de lavage C). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette
opération.
Vider par retournement.
Préparation des gammes de facteur H.
Les gammes de facteur H sont faites à partir d'un pool plasma (ECQ 1) et d'un
lot de
référence ou de tout échantillon contenant du facteur H à doser. La
concentration antigénique
Elisa ou la DO 280 sert de base à l'établissement des gammes par des dilutions
successives
non indépendantes. Le choix de la méthode de dosage est la suivante :
- Technique en Elisa pour le Pool Plasma et les échantillons de pureté
intermédiaire.
- Mesure de la DO 280 pour le lot de référence, un PV ou un produit final
réhydraté.
- Incuber 32 à 34 minutes maximum à + 34 C.
Lavages
Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3 x 280
pl de
tampon de lavage 3.3.2 b). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour
cette opération.
Vider par retournement.
Incubation de l'anticorps anti¨facteur B humain
Pour 10 ml de tampon de dilution E, ajouter 5 pl de l'anticorps anti¨facteur B
humain
(Calbiochem réf. 341272) puis distribuer 100 pl/puits (dilution au 1/2000).
Incuber 1 Hàl H15 à34 C
Lavages
Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3 x 280
pl de
tampon de lavage A). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette
opération.
Vider par retournement.
Incubation de l'anticorps anti-IgG (H+L) de chèvre marquée à la péroxydase.
Les dilutions s'effectuent avec le tampon de dilution E :
- prédilution au 1/40 (10 pl d'anticorps + 390 pl de tampon)
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- dilution au 1/500 (20 pl de la prédilution + 9980 pl de tampon).
Distribuer 100 pl/puits et incuber à température ambiante pendant 25-30 mn à
l'abri de
la lumière.
> Lavages.
Laver la plaque manuellement avec une micropipette multidistributrice (3x280
pl de
tampon de lavage A). Un laveur automatique peut aussi être utilisé pour cette
opération.
Vider par retournement.
> Réaction enzymatique.
Distribuer 100 pl de TMB par puits avec une pipette multicanaux, à intervalle
régulier.
Incuber la plaque 5 à 15 minutes à température ambiante à l'abri de la
lumière.
> Arrêt de la réaction.
Distribuer 100 pl de la solution d'arrêt dans chaque puits, à intervalle
régulier.
> Lecture.
Lire extemporanément la plaque à 450 nm sur un lecteur de microplaque après
une
légère agitation.
EXPLOITATION DES RESULTATS.
> Elimination des points aberrants.
Les valeurs d'absorbance obtenues en double pour chaque concentration de la
gamme
de facteur H pour la substance de référence, l'ECQ ou pour tout autre
échantillon sont
moyennées après élimination des valeurs aberrantes. Par exemple, pour les
valeurs en
duplicate des échantillons, de la substance de référence ou de l'ECQ, on
accepte l'élimination
d'un point par gamme et par niveau de concentration. Le choix du ou des points
à éliminer
permet d'améliorer la valeur du coefficient de corrélation (R2) et la
précision de l'intervalle
de confiance à 95 % de l'EC 50 obtenu.
> Utilisation du logiciel Prism (Logi Labo).
Ce logiciel permet de déterminer la valeur de l'IC50 de chaque échantillon
dans un
système modélisé non linéaire (sigmoïde à pente variable). L'équation de
calcul de ce modèle
est la suivante :
Y : Bottom + ( Top ¨Bottom)/(1+10^((Log IC50-X)* Hillslope)
X est le logarithme de la concentration (tg/ml).
Y est la réponse (D.0).
Y débute à la ligne de base (Bottom) et va au sommet (Top) selon une forme
sigmoïdale. Hillslope est la pente.
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La valeur moyenne d'absorbance de chaque dilution obtenue pour l'ECQ ou
échantillon (gamme en double) est entrée dans la base de données pour chaque
concentration
correspondante.
L'analyse des données est agrémentée de la fonction Runs test qui permet
d'estimer la déviation de l'essai par rapport au modèle choisi.
L'écart-type de l'IC50 est donné pour un intervalle de confiance de 95 %.
L'étude des courbes permet de visualiser l'ensemble des échantillons entre eux
et de
les comparer à l'ECQ.
Critères d'acceptation du dosage.
Le AD.0 de la gamme de tous les échantillons (référence et ECQ compris) doit
être au
minimum de 0.35. Toute valeur inférieure entraîne automatiquement le rejet de
l'essai.
L'acceptation de cette condition permet ensuite de déterminer la valeur
respective de
leur IC50.
La valeur moyenne de l'IC50 du pool plasma est de 0.058 tg/ml.
Le dosage est valide avec une tolérance de deux écart-type ce qui donne une
valeur
moyenne de 0.058 0.030 tg/ml. Tout nouvel ECQ doit être testé en parallèle
de l'ancien sur
au moins dix dosages afin d'en déterminer ses caractéristiques.
La moyenne des IC50 de la substance de référence et l'intervalle de confiance
sont
déterminés après la validation.
La valeur du coefficient de corrélation doit être au minimum de 0.99 pour
chaque
échantillon.
Le résultat pour le surnageant de culture PER.C60 ou HEK293F contenant du FH
humain recombinant est illustré à la figure 8A et le tableau ci-après.
MMMMMMMMMPMMNMMTMAGEANTMfetjfgffXFMMMMMWN
FH
plasma
PERC6
FH FH
PERC6 PERC6 PERC6 HEK HEK HEK HEK HEK
plasmatique plasmatique calibrator MD2- MD3- MD2- MD2- MD3- MD1- MD2-
TPSvecteur
formulé PBS 1X
Y402 Y402 H402 Y402 Y402 Y402 H402 vide
bindi(The
vecteur ng vide
site)
IC50
17,85 15,25 68,12 48,72 55,86 54,56 50,72 52,78 53,76 52,03 ND
ND
(ng/ml)
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Le résultat de l'activité du facteur H purifié est montré à la figure 8B et le
tableau ci-
après.
FH plasmatique FH plasmatique FH purifié FH
purifié
purifiéformulé purifié PBS IX PER.C6 HEK
1050 (ng/ml) 54,57 43,84 45,11 50,64
1.8.2 Activité cofacteur du Facteur I:
D Mode opératoire
L'activité co-facteur du FH est déterminée dans un test de clivage du C3b en
phase liquide. Le
C3b (lOng) et le FI (140 ng) sont incubés seuls ou en présence de FH (250 ng)
dans un
volume de 100 iLt1 en tampon imidazole 20 mM, NaC175 mM, pH 7,3 pendant 30 min
à 37 C.
La réaction est arrêtée par addition de tampon échantillon de Laemmli
additionné de DTT
puis les différents échantillons sont soumis à une électrophorèse en gel de
polyacrylamide
comme décrit ci-dessus. Après coloration au bleu de Coomassie, les gels sont
scannés et
analyses par le logiciel Quantity-one pour déterminer les intensités relatives
de chacune des
bandes présentes dans chaque piste.
Tableau récapitulatif des mélanges réalisés
Facteur H Facteur I
C31)
(.50 gelai
"nsiwir. C3b
Temoin C3b Facteur H .10gg, 0.,25p:g
Témezrin. C3-1, FaCeuf.= I 1.(4.kg 0,1*g g
Témoin Fazteuf 0,-25gz,
Temo.in Facteu.kr 0,1.4p.g
=
Echmtillom 1.(4.kg De 500 à. ng 0,1*g.7
D Résultats:
Le C3b a un poids moléculaire de 176 kDa et il est composé de 2 chaines
reliées par
un pont disulfure: la chaine a' de 101 kDa et la chaine p. de 75 kDa. La
chaine a' est clivée par
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le facteur I en 2 fragments appelés a'l (63 kDa) et a'2 (39 kDa), la chaine p.
(75 kDa) reste
inchangée.
Afin de pouvoir comparer les résultats obtenus, les intensités relatives sont
normalisées par rapport à l'intensité de la bande f3 présente dans la piste du
témoin C3b seul.
On calcule alors le pourcentage d'inactivation du C3b.par le rapport entre les
chaines
a' clivées ((u'l + a'2)/2) et les chaines a' totales : (a' + ((u'l + a'2)/2))
(Figure 12).
L'analyse des résultats présentés sur la figure 12D montre que les FH
recombinants
produits par les lignées PER.C6 et HEK 293F ont une activité co-facteur du FI
similaire et
que cette activité est comparable à celle du FH humain plasmatique.
Exemple 2: Construction de vecteur comprenant pCDNA2001néo-MD1
Le vecteur pCDNA2001néo-MD1 comporte l'acide nucléique représenté par la
séquence SEQ ID NO: 8, qui correspond à la séquence naturelle de ce facteur H
humain.
Le vecteur pUC57-MD1 envoyé par Genscript contient le gène de synthèse
correspondant à l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 8
(MD1, séquence
naturelle du facteur H humain). La digestion du vecteur pUC57-MD1 par les
enzymes de
restriction NotI et BamHI produit 2 fragments de 3000pb et 3700pb. Ces deux
fragments sont
séparés par purification sur gel et extraction nucléospin.
Le vecteur pCDNA2001-néo est digéré par les enzymes de restriction NotI et
BamHI,
qui produit 2 fragments de 25pb et de 5533pb. Après extraction par nucléospin
et
déphosphorylation, le fragment de 3700 pb correspondant à l'acide nucléique
représenté par la
séquence SEQ ID NO: 8 (MD1) est inséré dans le vecteur pCDNA2001-néo digéré.
Après ligation, le vecteur ainsi obtenu est transformé dans des bactéries
TOP10.
L'insertion du fragment d'ADN correspondant à MD1 est vérifiée par PCR de
Screening, en utilisant les amorces CMV1 (SEQ ID NO : 10 5'-
CCATTGACGTCAATGGGAGTTTG-3') et MD1-lrev (SEQ ID NO : 11 5'-
GGTAAACACTTCACAACTTCACATATAG-3'), qui donne une bande de 758pb. Les
clones bactériens positifs en PCR de criblage sont ensuite séquencés pour
vérifier l'unité de
transcription du facteur H contenue au sein du vecteur d'expression.
Exemple 3: Construction des vecteurs pCDNA2001néo-MD2 et pCDNA2001néo-
MD3 comprenant les séquences d'acides nucléiques du facteur H optimisé MD2 et
MD3
Les vecteurs pCDNA2001néo -MD2 et pCDNA2001néo -MD3 comportent
respectivement l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 2 et la
SEQ ID NO:
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3, qui correspondent à la séquence optimisée de facteur H humain et la
séquence optimisée du
facteur H humain avec le peptide signal optimisé MB7.
Les vecteurs pUC57-MD2 et pUC57-MD3 envoyés par Genscript contiennent les
gènes de synthèses correspondant respectivement à l'acide nucléique représenté
par la
séquence SEQ ID NO: 2 (MD2) et la SEQ ID NO: 3 (MD3). Ils sont digérés par les
enzymes
de restrictions NotI et BamHI, ce qui génère 2 fragments d'acide nucléique de
3000 et de
3700pb. Pour chaque vecteur, ces deux fragments sont séparés par purification
sur gel et
extraction nucléospin.
Le vecteur pCDNA2001-néo est digéré par les enzymes de restrictions NotI et
BamHI,
ce qui génère 2 fragments de 25 et de 5533pb. Après l'extraction par
nucléospin et la
déphosphorylation, le fragment de 3700 pb correspondant à la séquence codante
MD2 ou
MD3 est insérée dans le vecteur pCDNA2001-néo digéré.
Après la ligation, le vecteur ainsi obtenu est transformé dans des bactéries
TOP10.
L'insertion de fragment de MD2 ou MD3 est vérifiée par PCR de Screening, en
utilisant les amorces CMV1 (SEQ ID NO : 10 5'-CCATTGACGTCAATGGGAGTTTG-
3')/MD2-lrev (SEQ ID NO: 12 5'-TGTCACACTCGCGGTAGTTG-3'), qui donne une bande
de 706pb.
Exemple 4: Génération de pools stables PER.C60 transfectés par
pCDNA2001néo-MD1 ou pCDNA2001néo-MD2 ou pCDNA2001néo-MD3. (figure 2).
Les cellules PER.C60 sont transfectées par le vecteur pCDNA2001néo-MD1 ou le
vecteur pCDNA2001néo-MD2 ou pCDNA2001néo-MD3 pour générer des pools stables
selon
le protocole décrit dans la partie ci-dessus (Exemple 1.2)
Il n'y pas de différence significative de viabilité entre les cellules
transformées par
différents vecteurs.
Exemple 5: Dosage par ELISA du Facteur H recombinant (variants Y402 et
H402) produits dans le surnageant de culture des cellules PER.C60 et HEK 293F
(figures 3, 4 et 5).
Le surnageant de culture est préalablement dilué au 1/500', point à partir
duquel une
gamme de dilution est réalisée de 1/2 en 1/2 sur 8 points. Chaque point de la
gamme et des
échantillons à doser sont réalisés en duplicate. Le dosage est réalisé selon
le protocole décrit
dans la partie ci-dessus (exemple 1.6).
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Exemple 6: Caractérisation par SDS-PAGE et Western blot du facteur H
recombinant présent dans le surnageant de culture ou purifié (variants Y402 et
H402)
(figures 6A, 6B et 7).
A partir de la concentration de facteur H recombinant déterminée par ELISA ou
mesure d'absorbance à 280nm (protéine purifiée), un volume correspondant à
litg de facteur
H recombinant est dilué au 1/2 dans du tampon Laemmli 2x, chauffé à 95 C
pendant 5 minutes
puis déposé sur un gel linéaire de 10% polyacrylamide. Après migration, le gel
est traité soit
pour une coloration des protéines au bleu de coomassie soit pour un transfert
sur membrane
de nitrocellulose suivi d'un immunomarquage (Western Blot) tel que décrit dans
ci-dessus
(exemple 1.5).
Exemple 7: Détermination de l'activité d'accélération de la dissociation de la
C3
convertase du facteur H recombinant (variants Y402 et H402).
A partir de la concentration de facteur H recombinant déterminée par ELISA ou
mesure d'absorbance à 280nm (protéine purifiée), le facteur H recombinant est
dilué à une
concentration finale de 20 iLtg/ml. A partir de ce tube une gamme est réalisée
par les dilutions
successives suivantes: 1/2; 1/10; 1/4; 1/4; 1/4; 1/4; 1/40. Cette gamme de
concentration
décroissante de facteur H est ajouté au complexe C3 convertase formé dans les
puits d'une
plaque 96 puits qui est alors incubée 32 à 34 minutes à +34 C. Après plusieurs
lavages, le
facteur B restant complexé avec la molécule C3 immobilisée au fond du puits
est alors dosé
par une réaction immuno-enzymatique de type ELISA. Les valeurs d'absorbances
obtenues en
fonction de la concentration de facteur H ajoutée sont alors traitées tel
qu'indiqué dans le
protocole décrit ci-dessus (exemple 1.8). L'activité déterminée dans le
surnageant d'extrait
cellulaire ou après la purification est montré respectivement dans la figure
8A (surnageant) et
8B (purifié).
Exemple 8: Détermination de l'activité cofacteur du facteur I des FH humains
recombinants
L'activité cofacteur du Facteur I (FI) des FH humains recombinants produits
dans la
lignée PERC6 ou HEK et celle du FH plasmatique formulé ou en tampons PBS 1X
(dessalé)
sont mesurées selon la méthode décrite dans la partie 1.8.2. 10 ,g de protéine
C3b et 14Ong de
facteur I sont incubés à 37 C pendant 30min en présence de quantités
croissantes de facteur H
(50, 100, 250, 500 et 1000 ng). Les différents échantillons sont déposés en
SDS-PAGE afin de
quantifier les bandes correspondants aux chaines a' et p de la molécule C3b
ainsi qu'aux
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fragments clivés a'l et a'2 de la chaine a'. Le pourcentage de molécules C3b
inactivées est
ensuite calculé par le rapport entre la quantité de chaines a' clivées et la
quantité totale de
chaine a,'.
Les résultats sont illustrés par les figures 12A, 12B, 12C et 12D.
Exemple 9: Test de dosage de l'activité anti-hémolytique du facteur H humain
sur des globules rouges de mouton (Test Sanchez-Corral)
Ce test permet de mesurer l'activité fonctionnelle de la partie C-terminale du
facteur H
recombinant humain purifié lors du développement de lots thérapeutiques en
évaluant sa
capacité à protéger des globules rouges de mouton de la lyse induite par un
sérum déplété ou
déficient en facteur H fonctionnel. Ce test est adapté de la méthode Sanchez-
Corral
permettant de mesurer l'activité anti-hémolytique du facteur H présent dans le
plasma de
patients atteints du syndrome hémolytique urémique. (P.Sanchez-Corral, C.
Gonzàlez-Rubio,
S. Rodriguez de Cordoba and M. Lopez-Trascasa. Molecular Immunology 41(2004)
81-84).
Dans ce cadre, un mélange de sérum déplété en facteur H et d'un pool plasma
humain
est réalisé en proportion égale afin de créer les conditions d'une lyse
spécifique. L'ajout de
facteur H recombinant humain purifié assure la protection des globules rouges
de mouton
(absence de lyse cellulaire) vis-à-vis d'une lyse induite par le complément
Sans CFH, la lyse spontanée des hématies est de 30%.
L'inhibition de la lyse des hématies de mouton par le rCFH est dose-dépendante
et
atteint son 100% d'inhibition à la dose de 4 tg. Il n'y a pas de différence
entre les 2 rCFH
mais une activité inhibitrice sensiblement supérieure à celle du CFH
plasmatique.
A 40 pi d'une suspension d'hématies de mouton (1x108 hématies/mi) sont ajoutés
successivement 20 pi du tampon de réaction (Hepes 10 mM, NaC1 144 mM, MgC12 7
mM,
EGTA 10 mM, pH 7.2), 2 pi de FH ou de PBS, puis 9 pi d'un pool de plasma
humain suivi de
9 pi de plasma humain déplété en FH. Après incubation 30 min à 37 C, 400 pi de
tampon
HBS-EDTA (Hepes 10 mM, NaC1 144 mM, EDTA 2 mM, pH 7.2) froid pour arrêter la
réaction. Après centrifugation 5 min à 1730 g, 200 pi de surnageant sont
prélevés, déposés
dans une plaque de microtitration afin de mesurer l'absorbance à 414 nm.
Le pourcentage de lyse est déterminé selon la formule :
1.)0424mm Tube réactwn -1.)0424mmTb ns--
_____________________________________ ) X100
µe()-114 nm100% LY2 e
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Le témoin 100% lyse correspond à la lyse maximale des globules rouges de
mouton observée en présence d'eau.
Le témoin blanc comprend le tampon de réaction + 50mM EDTA et correspond à la
lyse spontanée des globules rouges de mouton.
Le résultat de ce test est illustré au tableau ci-après et à la figure 13.
Facteur H ajouté LP03 PB03 PerC 6 HEK
(1-19) Lyse (%)
0 33,75 33,75 33,75 33,75
2 32,6 14,8 7,8
3 23,8 2,4 1
4 11,1 10,2 -1 -0,8
6 0,9 1,1 -0,2 -0,6
8 0,3 -1,5 -0,9 -1,4
