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UTILISATION DE SQUALAMINE OU ANALOGUE COMME AGENT
DESINFECTANT
La présente invention concerne une composition d'agent
désinfectant utile notamment pour désinfecter des objets matériels
inertes (ou inanimés).
On entend ici par "objet matériel inerte", un objet en matériaux
inerte, c'est-à-dire de la matière non vivante ou non biologique ou non
issue de matière vivante ou biologique.
Actuellement, ce type de désinfection est réalisé soit par
traitement thermique de stérilisation en autoclave, soit par lavage ou
trempage avec ou dans des solutions d'agents qualifiés de
désinfectants.
Un agent désinfectant est un produit chimique qui tue ou inactive
des micro-organismes tels que les bactéries, les virus et les
protozoaires. Toutefois, à la différence d'un agent antiseptique qui est
destiné à être appliqué sur le corps humain ou animal, ou d'un agent
antibiotique qui est destiné à être administré à l'intérieur du corps
humain ou animal, un agent désinfectant sert à désinfecter les objets
inertes. Il existe une différence majeure entre, d'une part, une activité
antibiotique (action directe sur les micro-organismes utilisable chez
l'homme à l'intérieur du corps) ou une activité antiseptique (destruction
des microorganismes sur les surfaces externes du corps, notamment des
tissus vivants, peau, muqueuse) et, d'autre part, une activité
désinfectante (destruction des microorganismes sur des objets inertes).
En pratique, l'activité antibiotique ou antiseptique d'une substance
chimique concerne l'action sur des concentrations relativement réduites
de bactéries utilisable chez ou sur l'homme à l'intérieur ou à l'extérieur
du corps et elle doit donc présenter une toxicité acceptable. Certains
de ces antibiotiques peuvent être formulés pour être utilisés comme
antiseptiques. En revanche, des agents antiseptiques ou antibiotiques
ne sont pas utilisables comme désinfectants car les propriétés
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antibactériennes et antifongiques requises pour un agent désinfectant
sont beaucoup plus drastiques, les concentrations de bactéries à tuer
étant beaucoup plus importantes, ce qui les rend inutilisables comme
médicaments, notamment à cause de leur toxicité.
Dans le langage courant le terme "désinfectant" comprend
souvent à la fois les désinfectants au sens strict et les antiseptiques ce
qui peut rendre les choses confuses. De plus, le terme "antibactérien"
est souvent utilisé par abus de langage comme synonyme d'antiseptique
ou de désinfectant, à des fins commerciales, pour mettre en valeur le
pouvoir stérilisant d'un produit, sans pour autant suivre les
spécifications médicales d'un désinfectant ou d'un antiseptique au sens
strict.
Les agents désinfectants au sens strict forment un des quatre
groupes (désinfectants, produits de protection, produits antiparasitaires,
autres produits) de produits Biocides au sens de la Directive 98/8/CE du
Parlement européen et du Conseil du 16 février 1998 concernant la mise
sur le marché des produits biocides. Les désinfectants selon la présente
invention ont donc une dénomination précise et un statut juridique
européen spécifique, ce ne sont ni des antibiotiques au sens strict ni
des antiseptiques.
Il existe des normes européennes EN EN 1040 (pour les bactéries)
et EN 1275 (pour les levures) pour qualifier un composé chimique
comme agent désinfectant chimique d'usage dans les secteurs
pharmaceutique, médical, dentaire, vétérinaire, agro-alimentaire,
industriel, et pour un usage domestique ou en collectivité. Selon les
normes en vigueur un agent désinfectant doit tuer 99,999% des germes
ciblés soit une diminution de 5 log en partant d'un inoculum de
108cfu/m1 bactéries gram + et gram ¨ S. Aureus et P. aeruginosa et de
99,99% pour les champignons soit une diminution de 4 log en partant
d'un inoculum de 108 cfu/ml champignons (A. niger et C. albicans).
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Actuellement, on utilise dans le domaine médical, notamment pour
le nettoyage et la pré-désinfection des instruments médicaux, des
solutions d'agents désinfectants, tels que des composés alcool, acide ou
oxydant, notamment de l'acide glutaraldéhyque, de l'alcool éthylique ou
isopropylique, de l'hypochlorite de sodium.
Plus particulièrement, dans le cas de la mucoviscidose qui est une
maladie génétique caractérisée par des infections récurrentes des
poumons, le traitement de cette maladie nécessite des thérapies
antibiotiques par voie aérosol au moyen de nébuliseurs (1-4).
Cependant, du fait de l'utilisation répétée de ces dispositifs, des germes
potentiellement pathogènes sont fréquemment retrouvés dans le
matériel de nébulisation et cette contamination microbienne peut être à
l'origine de la réinfection du patient et de l'échec des traitements (5-7).
Ainsi à l'heure actuelle, le nettoyage et la désinfection du matériel de
nébulisation sont recommandés (8). La désinfection peut être réalisée
par immersion par exemple dans des solutions contenant de l'acide
acétique (2%) ou dans de l'eau bouillante (9-10). D'autres méthodes
incluent l'immersion dans de l'éthanol (70%) ou de l'alcool isopropylique
(90%) pendant 5 minutes, rinçage avec l'eau du robinet suivie par un
séchage à l'air (18-19). On a également recommandé l'hypochlorite de
sodium mais avec des normes variant suivant le pays (11-12). Ainsi,
l'association française de lutte contre la mucoviscidose recommande
l'utilisation de solution hypochlorite à 0,08% de chlore actif pendant 15
à 30 minutes tandis que la fondation américaine recommande
l'immersion du matériel infecté dans une solution à 0,13% de chlore
actif pendant 3 minutes. En 2001, Rosenfield et al (18) ont été les
premiers à étudier la contamination de nébuliseur avec un mélange de
souches de S. aureus et P. aeruginosa, en les nettoyant avec de l'eau
du robinet à 35 C durant 30s suivi d'un séchage à température
ambiante. En 2006, une étude (20) sur le nettoyage de nébuliseurs
ultrasonique réalisé par les patients indiquent que ceux réalisant la
désinfection de nébuliseur avec le sodium hypochlorite (100 ppm)
pendant 1 heure une fois par jour
après utilisation étaient moins
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infectés que ceux réalisant la désinfection après 24 heures d'attente.
Plus récemment, Reychler. Et al (12,18) ont comparé l'efficacité in vitro
de nombreux désinfectants commerciaux vis-à-vis de nombreuses
bactéries Gram positive et Gram négative tels que l'hypochlorite de
sodium, l'acide acétique 3,5%, Hexanios 0,5%, le détergent de vaisselle
(0,5%) pendant 20 minutes et plongeur (lave-vaisselle) avec des
variations marquées quant à l'efficacité de ces méthodologies dépendant
des souches bactériennes considérées. Par ailleurs, Monforte et al (7)
ont démontré qu'une désinfection correcte pouvait consister dans le
lavage du nébuliseur par de l'eau savonneuse après utilisation du
matériel et immersion de ce dernier dans une solution d'hypochlorite de
sodium (de 1%) jusqu'à l'administration suivante. Suivant ce protocole,
seulement 12,5% des nébuliseurs des patients ont été contaminés
tandis que 60% ont été contaminés en suivant d'autres voies de
désinfection. D'autre part, la nature et la qualité des sources d'eau
utilisées pour le rinçage de nébuliseur sont variables (l'eau
déminéralisée, l'eau du robinet, l'eau stérile) pouvant conduire à de plus
ou moins bons résultats. La lourdeur de ces méthodes de
décontamination apparaît très rapidement puisque les patients font un
usage quotidien de ces matériels. Par ailleurs, ces patients étant très
largement tributaires de leurs familles, en particulier les enfants, pour
tout ce qui concerne les soins et l'entretien du matériel, le temps qui
devrait être consacré au simple nettoyage des nébuliseurs par exemple
constitue un inconvénient important.
En outre, ces agents désinfectants ne sont pas satisfaisants pour
les raisons additionnelles suivantes.
Certains agents comme l'acide glutaraldéhyque ne sont pas sans
effet sur le matériel en matière plastique ou métallique traité puisqu'ils
peuvent en entrainer la corrosion ou dégradation.
Par ailleurs, d'un point de vue écologique, un des problèmes
majeurs est que ces agents désinfectants sont déversés après usage
dans les réseaux d'eaux usées urbain alors qu'ils représentent des
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quantités importantes de produits corrosifs et/ou toxiques déversées
dans les réseaux d'eau usées ce qui en dégrade les conduites et rend
plus difficile le contrôle de l'épuration biologique au niveau des stations
d'épuration en aval. Un autre problème lié à la toxicité est la relative
5 dangerosité de la manipulation des produits par le personnel les
utilisant.
Un autre problème des agents désinfectants est qu'ils peuvent
induire des résistances des microorganismes ou présenter un spectre
d'activité antibactérienne ou antifongique relativement limité, au même
titre de ce qui est connu dans le domaine thérapeutique pour les
médicaments antibiotiques ou antiseptiques.
Enfin, A. Niger est un champignon filamenteux qui forme des
spores d'élimination difficile. Ainsi, à l'heure actuelle le traitement de
désinfection avec l'acide glutaraldéhyque (0,5%) ou bien le
glutaraldéhyde alcalin ne peut réduire que de 4 Log le nombre de spores
d'A. Niger et ceci en 100 minutes (23,24).
Le but de la présente invention est de fournir un agent de
désinfection simple, efficace, rapide, non dangereux et pratique
d'utilisation pour le confort du patient et de sa famille.
Plus particulièrement, un but de la présente invention est donc de
fournir un nouvel agent désinfectant moins toxique qui puisse être
recyclé après usage dans les réseaux d'eaux usées sans induire de
problème écologique et qui présente un spectre d'activité important
sans induire de résistance.
Un autre but est aussi de fournir un agent désinfectant qui tue
également les spores des champignons.
Un autre but de la présente invention était de fournir un agent
désinfectant qui présente une activité destructrice la plus rapide
possible, notamment en moins de 8 H et ce sous forme de composition
aqueuse.
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Pour ce faire, la présente invention a pour objet une utilisation
d'un composé choisi parmi la squalamine et un composé aminostéroïdien
analogue de la squalamine comme agent désinfectant d'un objet
matériel inerte, ledit composé étant formulé sous forme de composition
aqueuse ou hydrosoluble.
La présente invention fournit également une composition
désinfectante aqueuse ou hydrosoluble utile pour une utilisation selon
l'invention caractérisée en ce qu'elle comporte, comme composé actif
désinfectant, un dit composé choisi parmi la squalamine et un dit
composé aminostéroïdien analogue de la squalamine antibactérien et
antifongique, avec des excipients appropriés pour une formulation
hydrosoluble ou aqueuse.
On entend ici par "composé aminostéroïdien analogue de la
squalamine", un composé de formule I ci-après antibactérien et
antifongique.
La squalamine a été décrite (13-15,22) comme un agent
antibactérien et antifongique pour une utilisation thérapeutique dont le
mode d'action est original en ce qu'elle agit comme un détergent d'où il
résulte un spectre d'activité large et surtout une activité contre les
bactéries multi-résistantes et n'induisant pas de résistance de la part
des bactéries. Il a été décrit dans WO 20011/067501 que la squalamine
et ses analogues aminostéroïdiens présentent une activité d'antibiotique
antibactérien en application topique sous forme de formulation lipophile,
notamment de pommade, sans toxicité cutanée et sans induire de
résistance du fait d'un mécanisme d'action différent de celui des
antibiotiques, à des concentrations de 0,5 à 5 mg/m1 et permettant de
réduire une concentration en S. aureus de 106 cfu/ml de 4 log en 24
heures et 5 Log en 48 heures. En outre une activité antifongique in vitro
a été décrite à des concentrations de squalamine de 4-16mg/I
permettant de réduire une concentration d'A. figer de 106 de 4 log en
24 heures.
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De tels résultats ne qualifient pas la squalamine et ses analogues
aminostéroïdiens comme agent désinfectant conformément aux buts de
l'invention, à savoir pour éradiquer des quantités de microorganismes
beaucoup plus importantes et, ce, sous forme de solution aqueuse et à
des concentrations n'induisant pas de toxicité cutanée.
En effet, comme mentionné ci-dessus, pour un agent désinfectant,
il faut réduire dans les tests in vitro normalisés :
- une concentration en S. aureus et P. aeruginosae de 108 cfu/ml
de 5 log, et
- une concentration d'A. figer et C. albicans de 108 cfu/ml de 4
log.
En outre selon l'invention, on recherchait un agent désinfectant
sous forme de formulations en milieu aqueux à des concentrations
n'induisant pas de toxicité cutanée en milieu aqueux.
Les inventeurs ont découvert que la squalamine et ses analogues
aminostéroïdiens remplissaient ces critères à des concentrations en
solution aqueuses de 2 000 mg/I et que, à ces concentrations, ils
n'induisaient pas de toxicité cutanée et qu'en outre ils permettent de
réduire également les spores de 4 log.
Enfin, il a été observé que la squalamine et ses dits analogues
n'induisent aucune dégradation du matériel traité et/ou en contact avec
le produit.
Bien que la squalamine et ses analogues aminostéroïdiens fussent
capables, en application topique sous forme de composition lipophile, de
réduire une concentration de 106 5 aureus de 4 log en 24 heures sans
induire de résistance, il n'était pas du tout évident que ces composés
puissent réduire de 5 log en moins d'1 heure une concentration de 108
S. aureus ou P. aeruginosa ou de 4 log en moins de 8 heures une
concentration de 108 C. albicans ou A. figer (y compris éradication des
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spores pour A. figer). En effet les concentrations en microorganismes
impliquées pour la désinfection sont plus élevés (100 fois plus) et l'effet
désinfectant doit être obtenu plus rapidement. Les autres antibiotiques
utilisés chez l'homme n'ont pas cette capacité, la plupart des
antiseptiques non plus.
D'autre part, il n'était pas évident non plus que l'on puisse
fabriquer des compositions aqueuses ou hydrosolubles comme des
comprimés solubles dans l'eau pouvant avoir cette efficacité recherchée
pour pouvoir être qualifié de désinfectant.
Plus particulièrement, la présente invention concerne des
compositions d'agents désinfectants utiles notamment pour désinfecter
des objets utilisés notamment dans les secteurs de l'alimentation,
l'habitat, le transport, ainsi que les secteurs médicaux, notamment
pharmaceutique ou diagnostic, dentaire, chirurgical.
On peut citer plus particulièrement :
- les ustensiles pour l'alimentation dans les collectivités et
notamment pour l'alimentation des nourrissons comme les biberons,
tétines, sucettes, ...
- les instruments chirurgicaux tels que scalpels, prothèses
chirurgicales, broches, ...
- les dispositifs médicaux tels que les lentilles de contact oculaire,
et dispositifs endoscopiques tels que des sondes, endoscopes, masques
respiratoires, ...
- les dispositifs d'administration de compositions pharmaceutiques
tels que des nébuliseurs.
Il s'agit plus particulièrement d'objets, notamment rigides, en
matériau polymère plastique, matériau inorganique ou minéral,
notamment en acier ou métallique, ou encore matériau composite.
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On peut aussi citer le domaine du transport , notamment les
brancards et garnitures intérieures de véhicules, notamment
d'ambulance, ou encore le domaine de l'habitat ou du transport pour un
usage domestique ou en collectivité, notamment les objets d'habitation
comme les meubles et les objets immeubles tels que les sols, murs,
conduites d'eau, sièges, poignées de porte, brancards.
La méthode selon l'invention est plus particulièrement
avantageuse pour les matériels en matériaux plastiques qui ne peuvent
pas être stérilisé par traitement thermique en autoclave et/ou les
matériaux métalliques qui se corrodent en milieu acide ou oxydant.
Plus particulièrement, un dit composé et une dite composition
selon l'invention sont aptes à tuer in vitro :
a) au moins 99,999% de bactéries pathogènes S. aureus et P.
aeruginosa dans une suspension contenant une concentration de 108
cfu/ml d'une dite bactérie à 20 C, notamment en moins de 60 minutes,
et
b) au moins 99,990% de levures pathogènes C. albicans et A.
figer dans une suspension contenant une concentration d'au moins 107
cfu/ml d'une dite levure à 20 C, notamment en moins de 60 minutes.
Les caractéristique a) et b) correspondent aux critères requis
selon les normes européennes EN 1040 (pour les bactéries) et
respectivement EN 1275 (pour les levures) pour un agent désinfectant
chimique d'usage dans les secteurs pharmaceutique, médical,
vétérinaire, agro-alimentaire, industriel, et pour un usage domestique
ou en collectivité.
En l'espèce, les caractéristiques a) et b) sont obtenues avec des
concentrations de dit composé de squalamine et analogue
aminostéroïdien d'au moins 0,3 mM (0,2 g/1) pour la caractéristique a),
et au moins 3,2 mM (2 g/1) pour la caractéristique b).
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Plus particulièrement, dans une utilisation selon l'invention, on
met en contact ledit objet avec une composition aqueuse de dit composé
de squalamine et analogue aminostéroïdien.
Plus particulièrement encore, ledit objet est trempé avec dans
5 ladite solution aqueuse ou une dite composition aqueuse est appliquée
sur ledit objet.
Ladite composition aqueuse peut être contenue dans un substrat,
notamment dans un gel ou une lingette, apte à libérer ladite
composition sur ledit objet lorsque ledit substrat est en contact,
10 notamment en déplacement contre ledit objet.
Plus particulièrement encore, ledit composé est mis en oeuvre
sous forme de solution aqueuses à une concentration d'au moins 3 mM,
de préférence de 3 à 8 mM (environ 2 à 5 g/1).
Des solutions aqueuses de dits composés à des concentrations ci-
dessus permettent de désinfecter un dit objet infecté par des bactéries
pathogènes et/ou levures pathogènes, en tuant sur un dit objet :
i) au moins 99,999% de bactéries pathogènes S. aureus et P.
aeruginosa sur un dit objet en moins de 20 minutes à 20 C, et
ii) au moins 99,990% de levures pathogènes C. albicans et A.
niger, y compris les spores, en moins de 6 heures à 20 C.
Plus particulièrement encore, on dilue dans une solution aqueuse
une composition hydrosoluble solide, de préférence une composition
sous forme de poudre ou de comprimé, contenant un dit composé à une
concentration d'au moins 2,5% en poids, ladite composition étant
soluble en solution aqueuse.
Plus particulièrement encore, ledit composé est la squalamine de
formule la suivante :
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*NH2 OSO3H
çN H Oô,
OH
H
Plus particulièrement encore, ledit composé aminostéroïdien
analogue de la squalamine répond à une formule générale comprenant
un squelette de formule (I) ci-après sur lequel est greffée au moins 1
chaine polyaminée ¨NHR, R étant une chaine hydrocarbonée
éventuellement substituée comportant au moins un groupe ¨NH2 : (I)
2
18 0
12
19 11
16
21 9 14
' 10 8 15
3=
7
4 6
dans laquelle :
- soit toutes les liaisons doublées de traits en pointillés entre les
carbones des positions 7-8, 5-6, 4-5, et 3-4 représentent une simple
liaison, le squelette étant celui d'un 10, 13, 17 triméthyl cholestane,
- soit l'une des liaisons doublées de traits en pointillés entre les
carbones des positions 7-8, 5-6, 4-5, et 3-4 représente une double
liaison et les autres liaisons doublées de traits en pointillés sont des
simples liaisons, le squelette étant celui d'un 10, 13, 17 triméthyl
cholestène.
Plus particulièrement encore, ledit composé répond à une formule
générale comprenant un dit squelette de formule (I) comportant :
a) au moins 1 chaine -NHR sur un des carbones en positions 3, 7
et 20, et R représente ¨[(CH2)n¨(NR1)k¨(CH2),,-Jp¨NH2
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avec :
- n et m étant des entiers identiques ou différents de 1 à 7,
- k= 0 ou 1,
- p étant un nombre entier de 1 à 4, et
- R1 étant choisi parmi H, un alkyl en Cl à C8, notamment un
alkyle en Cl à C3, un phényl éventuellement substitué et un groupe ¨
C00alk, alk étant un alkyl en Cl à C3,
avec de préférence :
- lorsque k= 0, alors p=1 ou lorsque k= 1, alors p= 2, et
- lorsque ledit composé comprend une seule chaîne ¨NHR, celle-ci
est greffée de préférence en position 3 ou 7, et
b) les autres carbones dudit squelette comprenant un radical Ro
identique ou différent choisi parmi H, OH, NH2, SH, et R1, de préférence
Ro étant H ou OH mais avec 1 seul Ro représentant OH.
Plus particulièrement encore, ledit composé aminostéroïdien
répond à une des formules générales suivantes lia, IIb, IIc ou IId dans
lesquelles R représente ¨[(0-12)n¨(NR1)k¨(0-12)m]p¨NH2, n, m, p, k et
R1 ont les significations données ci-dessus, et, de préférence, R étant
choisi parmi ¨(CH2)n1¨NH2 avec n1 = 2 à 14, et
¨(CF12)3¨NH¨(CF12)3¨NH¨(CF12)3-NF12 :
ell>lia
HO NHR
Ou
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\
el> Ilb
Oô
HO NHR
Ou
-,
õ
SI He
ele
RHN
Ou
--,
õ
ell Ild
Oô
RHN
Plus particulièrement encore, ledit composé est un aminostéril
dénommé ASD 2 répondant à la formule générale II-1 suivante :
-õ,
01. II-1
HO OW i\j---NH2
H
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D'autres dits composés appropriés répondent à la formule
générale constituée par un dit squelette de formule (I) comportant :
a) 2 chaines identiques ¨NHR sur les carbones en positions 3 et,
respectivement, 20, et R représente ¨[(CH2)n¨(NR1)k¨(CH2)n-dp¨NH2
avec :
- n et m étant des entiers identiques ou différents de 1 à 7,
- k= 0 ou 1,
- p étant un nombre entier de 1 à 4,
- R1 étant choisi parmi H, un alkyl en Cl à C8, notamment un
alkyle en Cl à C3, un phényl éventuellement substitué et un groupe¨
COOalk, alk étant un alkyl en Cl à C3,
avec, de préférence, lorsque k= 0, alors p=1, ou lorsque k= 1,
alors p= 2, et
b) les autres carbones dudit squelette de formule (I) comprenant
un radical Ro identique ou différent choisi parmi H, NH2, SH, ou R1, de
préférence Ro étant H ou OH mais avec 1 seul Ro étant OH.
Plus particulièrement encore, ledit composé répond aux formules
générales suivantes IIIa ou IIIb, dans lesquelles R représente
¨[(CH2)n¨(NR1)k¨(CH2),Jp¨NH2, et, de préférence, R étant choisi
parmi ¨(CF12)n-NF12 avec n= 2 à 14, et ¨(CF12)3¨NH¨(CF12)3¨NH¨
(CH2)3¨N1-12 :
--,
" NHR
p.
go.RHN Illa
Ou
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RHN ece¨NHR
Illb
Plus particulièrement encore, ledit composé aminostéroïdien
répond à la formule III-1 suivante :
HN
NH2
H
N
HN
Oie HN
H H2N1-1\11/"--)
III-1
5 Plus particulièrement encore, une composition selon l'invention
comporte une concentration de 0,5 à 5%, de préférence d'au moins
2,5% en poids de dit composé squalamine ou un dit composé
aminostéroïdien analogue de la squalamine sous forme de sel
hydrosoluble.
10 Plus particulièrement encore, une composition selon l'invention se
présente sous forme de solution aqueuse ou de comprimé solide
hydrosoluble ou de poudre hydrosoluble, lesdits excipients étant choisis,
de préférence, parmi la cellulose microcristalline, le lactose, l'amidon, le
croscarmellose de sodium, la silice colloïdale et le stéarate de
15 magnésium.
Plus particulièrement encore, ledit composé squalamine ou dit
composé aminostéroïdien analogue de la squalamine antibactérien est
sous forme de sel hydrosoluble, de préférence sous la forme de sel de
chlorhydrate, bromhydrate, triflate, phosphate, lactate, ou succinate.
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Plus particulièrement encore, ledit objet matériel est un matériel
d'usage alimentaire, médical, dentaire, pharmaceutique, de diagnostic
ou chirurgical.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention
ressortiront mieux à la lecture de la description qui va suivre, faite de
manière illustrative et non limitative, en référence aux dessins annexés
sur lesquels :
- la figure 1 représente les résultats de désinfection de traitement
durant 1 heure sur du matériel infecté selon les normes FR-EN1040 et
FR-EN1275, pour des concentrations de squalamine de 0,5 g/I pour le
traitement de S. aureus et P. aeruginosa et 2 g/I pour le traitement de
C. albicans et A. niger,
- les figures 1A et 1B représentent les courbes de cinétique de
mortalité ("Time kill study") de la squalamine et du dérivé
aminostéroIdien ASD 2 sur S. aureus (figure 1A) et P. aeruginosa (figure
1B), et
- les figures 2A et 2B représentent les résultats de désinfection
d'un nébuliseur avec différentes concentrations de squalamine vis-à-vis
des bactéries (figure 2A) et des champignons (figure 2B).
Dans les différents essais ci-après, on a utilisé les souches de
Pseudomonas aeruginosa DSM 939 (ATCC 15442), Staphylococcus aureus
DSM 799 (ATCC 6538), Candida albicans DSM 1386 (ATCC 10231), et
Aspergillus niger ATCC 16404.
1) Test d'activité antibactérienne désinfectante selon la norme FR-
EN 1040.
1.1) Protocole.
La contamination microbienne de nébuliseurs a été réalisée in
vitro par immersion de la partie intérieure des nébuliseurs (Pari LC, le
SPRINT SP, Pari, Allemagne) dans une suspension bactérienne préparée
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dans un bouillon Mueller Hinton contenant 1.108 à 5. 108 cfu/mL de
bactéries. La désinfection est réalisée en trempant cette même partie
dans une solution d'eau stérile contenant de la squalamine durant 1h à
une concentration déterminée de 0.5g/L pour les bactéries considérées
(S. aureus ou P. aeruginosa). Le nébuliseur est par la suite rincé avec
deux solutions d'eau stériles successives. L'énumération bactérienne est
réalisée sur le deuxième bain de lavage sur gélose Agar-agar de Soja
Tryptone (24h).
1.2) Résultat.
Il a été constaté que la solution aqueuse de squalamine ou ASD 2
utilisée à 0,5 g/I permet de réduire de 8 log des cellules viables de S.
aureus, P. aeruginosa en 1 heure ce qui est plus efficace que ce qui est
recommandé par la norme qui stipule une réduction de 5 log en 1 heure
(figure).
2) Test d'activité antifongique désinfectante selon la norme FR-EN
1275.
2.1) Protocole.
La contamination par les champignons de nébuliseur a été réalisée
in vitro par immersion de la partie intérieure des nébuliseurs (Pari LC, le
SPRINT SP, Pari, Allemagne) dans une suspension de champignons 1.10'
à 5. 107 cfu/mL préparées dans le bouillon Sabouraud. Après incubation
le nébuliseur a été immergé dans l'eau stérile contenant de la
squalamine aux concentrations déterminées en fonction des souches de
champignons considérées (soit 0.5 g/L pour C. albicans (1 heure
d'immersion) et 2g/I pour A. figer (6h d'immersion). Le nébuliseur est
par la suite rincé avec deux solutions d'eau stériles successives.
L'énumération fongique est réalisée sur le deuxième bain de lavage.
L'énumération de colonies fongiques a été faite sur gélose agar-agar
d'extrait de malt (48h).
2.2) Résultat.
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Il a été constaté que la solution aqueuse de squalamine ou ASD 2
utilisée à 0,5 g/I permet de réduire de 6 log des cellules viables de C.
albicans et A. figer en 1h, ce qui est en total accord avec les
recommandations de la norme (4 log minimum (figure)). Mais, pour A.
Niger, du fait de la présence de spores, une concentration de 2 g/I était
nécessaire pour réduire de 4 log le nombre de cellules viables de spores
en 6 heures. Une concentration supérieure permettrait de réduire encore
ce temps d'action fongicide, si désiré.
3) Composition hydrosoluble de squalamine et ASD 2.
Une formulation de squalamine sous la forme de comprimés
hydrosolubles a pu être réalisée comme suit. Un batch de 20 g a été
préparé; le mélange a été réalisé dans un mixeur Turbula Tapent T 20,
Suisse. Les comprimés ont été fabriqués dans une presse de type Korsch
Erwika Tape EKO, Allemagne. Dans un premier temps les matières
premières ont été tamisées. La squalamine (0,5 g) a été mélangée avec
de la cellulose microcristalline (7,2 g), du lactose (10 g), de l'amidon
(1,4 g), du sodium croscarmellose (0,6 g), et de la silice colloïdale (0,04
g). Par la suite, du stéarate de magnésium tamisé a été ajouté et
mélangé. Le mélange final a été compressé sur une presse alternative
équipée de pistons de 8,0 mm. Les excipients avec des tailles de
particules spécifiques adaptées (50 Opm) pour réaliser la compression
ont été utilisés. Les comprimés hydrosolubles obtenus à 2,5% de
composé sont par la suite conservés dans une bouteille de polyéthylène
basse densité.
Les expériences de désinfection ont été faites moins de 10 jours
après squalamine la fabrication de comprimés. Nous avons pu
néanmoins démontrer la stabilité de ces comprimés puisque plus d'un an
après leur fabrication leur activité reste inchangée.
4) Traitement désinfectant d'un nébuliseur avec une solution
aqueuse de composition hydrosoluble de squalamine et ASD 2.
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La contamination bactérienne de nébuliseurs représente un
problème majeur pour des patients atteints par la mucoviscidose menant
à une diminution de performance des nébuliseurs et à l'augmentation du
risque de réinfection du patient par les bactéries polluantes.
Les inventeurs ont validé l'utilisation de la squalamine et ASD 2
dans le modèle in vitro de désinfection de nébuliseurs suivant.
4.1) Matériel et méthode.
Des nébuliseurs de type Pari LC ont été infectés par des bactéries
(S. aureus et P. aeruginosa) avec une suspension calibrée à 108 cfu/ml
et des champignons (C. albicans et A. niger) avec une suspension
calibrée à 107 cfu/ml. Ces nébuliseurs ont été par la suite désinfectés
par l'immersion dans une solution squalamine pendant 20 min, le
Glutaraldéhyde et le korsolex (acide peracétique) ayant été utilisés
comme contrôle d'inhibition.
La contamination microbienne de nébuliseur a été réalisée in vitro
par immersion de la partie intérieure du nébuliseur (Pari LC, le SPRINT
SP, Pari, Allemagne) dans une suspension bactérienne préparée dans un
bouillon Mueller Hinton contenant 1.108 à 5.108 cfu/ml de bactéries (NF
EN 1040, 1997) pendant 20 minutes. La désinfection est réalisée en
trempant cette même partie dans une solution d'eau stérile contenant
de la squalamine ou ASD 2 pendant 2 minutes aux concentrations
déterminées en fonction des bactéries considérées. Pour les
champignons des suspensions 1.10' à 5.10' cfu/ml (NF EN 1275, 1997)
ont été préparées dans le bouillon Sabouraud et après incubation le
nébuliseur a été immergé dans l'eau stérile contenant de la squalamine
ou ASD 2. Le nébuliseur est par la suite rincé avec deux solutions d'eau
stériles successives. L'énumération bactérienne ou fongique est réalisée
sur le deuxième bain de lavage. L'énumération de colonies bactériennes
ou fongiques a été faite sur gélose Agar-agar de Soja Tryptone pendant
24 heures pour la croissance de bactéries et l'agar-agar d'extrait de
malt pour les champignons à 37 C pendant 48 heures.
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Le test bactéricide et fongicide a été exécuté trois fois dans des
expériences indépendantes et chaque bactérie et moisissure a été
évaluée séparément. La concentration de squalamine et ASD 2 a été
augmentée jusqu'à l'obtention de l'activité bactéricide et fongicide
5 requise. Le temps de désinfection a été défini dans le premier cas à 20
minutes et étendu par la suite à 6 heures pour A. Niger.
4.2) Résultat.
Il a été constaté que la solution aqueuse de squalamine ou ASD 2
utilisée à 0,5 g/I permet de réduire de 5 log des cellules viables de S.
10 aureus, P. aeruginosa et 4 log de C. albicans en 20 minutes tandis
qu'une concentration à 2 g/I était nécessaire pour réduire de 4 log de
cellules viables pour A. Niger en 6 heures.
4.2.1) On a utilisé des nébuliseurs infectés par différentes
suspensions bactériennes (S. aureus et P. aeruginosa) calibrée à 108
15 cfu/ml ou fongiques (C. albicans et A. niger) calibrée à 107 cfu/ml.
Dans
un jeu préliminaire d'expériences, des valeurs de Concentration
Minimum d'inhibition (CMI) et la cinétique de mortalité ("Time Kill
Study") de la squalamine et de ASD 2 ont été déterminés contre les
bactéries et les champignons(CMI seulement) de référence choisis. Les
20 valeurs de CMI étaient 2, 4, 16 et 16 mg/I contre S. aureus, P.
aeruginosa, C. albicans et A. Niger, respectivement (Tableau 1 et
figures 1A-113). On a ainsi défini un temps de 20 minutes pour réaliser la
désinfection de nébuliseur en utilisant la squalamine tandis que le
korsolex PAA et la solution (de 2%) glutaraldéhyde sont utilisés durant
un temps de 15 minutes suivant les recommandations des fournisseurs
pour obtenir des propriétés désinfectantes. Dans une première
tentative, on a pu démontrer que l'utilisation d'une dose de 80 mg/m1
de squalamine ou ASD-2 pendant 20 minutes menait à une réduction de
2 et 3 Log pour les bactéries tandis qu'une réduction de 2 Log pour C.
albicans était seulement obtenue en utilisant une concentration de
squalamine ou ASD-2 de 190 mg/ml. Dans le même temps, aucune
diminution significative n'a été notée dans le cas d'A. Niger. Néanmoins,
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la squalamine et ASD 2 utilisés à une concentration plus forte de 0,5 g/I
sont capables de réduire de 5 Logic, les cellules viables de bactéries
telles que S. aureus, P. aeruginosa et de 4 Logio les champignons tels
que C. albicans pour un cycle de 20 min (figures 2A). En revanche, dans
le cas d'A. niger, la concentration permettant d'obtenir un effet
fongicide (c'est-à-dire, pas seulement fongistatique mais avec, en outre,
éradication des spores) est supérieure à celle des bactéries avec un
temps plus lent (2 g/I durant 6 heures) (figure 2B).
Les comprimés de squalamine se sont ainsi montrés capables de
réduire de 5 Log le nombre de cellules bactériennes viables après 20
minutes de contact de manière similaire à ce qui avait été obtenu dans
les conditions expérimentales homogènes. Il est remarquable de
constater également que ces comprimés se désagrègent en moins de
moins de 5 minutes dans l'eau suggérant une manipulation facile et non
dangereuse. Une amélioration de ce modèle de comprimé peut être
obtenue en préparant des comprimés effervescents qui assurent une
dispersion et une action plus rapide et homogène de la squalamine dans
le milieu.
En conclusion, la squalamine ou un analogue de squalamine
apparaît comme une solution simple, rapide et efficace pour la
désinfection de tout matériel susceptible d'être contaminé.
Dans ce contexte, une réduction de 5 Log de cellules viables
bactériennes et 4 Log de cellules viables fongiques est observée
démontrant l'activité de désinfection de la squalamine. Une réduction de
la croissance fongique de A. Niger de 4 log exige un temps de
traitement plus long (6 heures) que pour les bactéries, conformément à
la valeur de MICS de squalamine qui était plus haute dans le cas des
champignons en comparaison des bactéries. Mais, A. Niger est un
champignon filamenteux qui forme des spores d'élimination difficile et
les composés testés ont permis de réduire de 4 Log aussi le nombre de
spores d'A. Niger.
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Tableau 1. Activités antimicrobiennes et dose nécessaire pour
assurer la désinfection d'un nébuliseur
CMI (mg/1)
Souches Squalamine 1 et ASD 2 (mg/1)
Squalamine 1 ASD 2
S. aureus DSM 799 2 2 210
P. aeruginosa DSM 939 4 8 130
C albicans DSM 1386 16 8 500
A. mgerATCC 16404 16 8 2000
5) Toxicité et corrosion :
La toxicité cutanée à été regardée sur une période de 15 jours en
appliquant chaque jour une pommade à base de squalamine sur le dos
de souris rasées (lot de 10 souris). Aucune lésion cutanée, rougeur ou
inflammation de quelque sorte n'a pu être observée. Par ailleurs les
souris n'ont pas maigri et ont continué à s'alimenter et boire de façon
comparable aux souris non traitées.
Concernant un effet potentiel sur un matériau plastique ou
métallique, un nébuliseur est resté en solution durant 8 jours dans une
solution concentrée à 2g/L en squalamine et aucune altération du métal
et du plastique (notamment au niveau de la couleur et de la souplesse)
n'a été observée.
Aucune toxicité cutanée n'a été observée et les composés étaient
sans effet sur un matériel plastique ou métallique et n'ont entrainé
aucune dégradation ou corrosion de ces derniers.
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