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MUTATIONS DU GENE DE LA PARKINE, COMPOSITIONS,
METHODES ET UTILISATIONS
La présente invention est relative au domaine de la génétique et, plus
particulièrement, à l'identification de mutations du gène de la parkine. Elle
concerne
également des compositions et méthodes pour l'identification de ces mutations
dans
des échantillons, des formes de la parkine mutées, tronquées ou comportant des
multiplications d'exons, et leurs utilisations à des fins de diagnostique,
dépistage ou
thérapeutique, par exemple.
La maladie de Parkinson est une affection neurodégénérative fréquente dont
la prévalence est proche de 2% après l'âge de 65 ans [de Rijk et al., 1997].
Les signes
cardinaux de la maladie sont rigidité, bradykinésie, tremblement de repos et
bonne
réactivité, au moins initiale à la lévodopa. Les troubles sont dus à une perte
massive
des neurones dopaminergiques de la substantia nigra. Les causes de la maladie
restent
inconnues mais l'intervention de facteurs de susceptibilité génétique est
fortement
suspectée [Wood, 1997]. De nombreuses formes familiales avec une transmission
dominante ont été rapportées. Des mutations du gène codant pour la synucléine
alpha,
localisé en 4q21-q23, ont été décrites dans un petit nombre de familles avec
un début
précoce et une aggravation rapide [Polymeropoulos et al., 1997; Krüger et al.,
1998].
Un second locus est situé en 2p13 [Gasser et al., 1998]. Un syndrome
parkinsonien de
transmission autosomique récessive (AR-JP) a été décrit au Japon [Yamamura et
al.,
1973; Ishikawa and Tsuji, 1996]. Il se manifeste avec les signes cardinaux de
la
maladie de Parkinson avec certaines particularités: i) début précoce, en règle
avant
l'âge de 40 ans; ii) présence d'une dystonie, souvent aux membres inférieurs;
iii)
fluctuations au cours de la journée; et iv) évolution lentement progressive
mais
toujours associée à des dyskinésies sous lévodopa. L'examen neuropathologique
révèle une perte massive des neurones de la substantia nigra pars compacta
mais sans
corps de Lewy, stigmate histopathologique de la maladie de Parkinson
idiopathique
[Yamamura et al., 1973; Takahashi et al., 1994]. Une liaison génétique entre
la
maladie dans des familles japonaises et des marqueurs en 6q25.2-27 a été
démontrée
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qui définit le locus PARK2 [Matsumine et al., 1997]. Deux équipes ont ensuite
décrit
des familles PARK2 hors du Japon, en particulier aux Etats Unis, en Europe et
au
Moyen Orient [Jones et al., 1998; Tassin et al., 1998]. Très récemment, Kitada
et al
[Kitada et al., 1998] ont mis en évidence des délétions des exons (3-7) ou de
l'exon 4
d'un nouveau gène, appelé parkine, dans 4 familles japonaises.
La présente demande décrit maintenant la mise en évidence et la
caractérisation, dans 77 familles et 102 cas isolés principalement européennes
avec un
syndrome parkinsonien de début précoce, de la présence de nouvelles
altérations
génétiques affectant le gène de la parkine. En outre, la présente demande
montre que
ces altérations génétiques sont présentes non seulement dans les syndromes
parkinsoniens de début précoce, mais également dans les syndromes
parkinsoniens
plus tardifs ou atypiques. Ces nouvelles altérations offrent donc de nouveaux
outils, à
la fois pour le diagnostique et le traitement de la maladie de parkinson.
Un objet plus particulier de l'invention concerne un acide nucléique codant
pour la parkine humaine, caractérisé en ce qu'il comporte une ou plusieurs
altérations
génétiques choisies parmi:
a) une délétion de un ou plusieurs exons, en combinaison ou non,
b) une multiplication (p.ex. duplication, triplication) d'exons,
c) une mutation ponctuelle,
d) une délétion de 1 ou plusieurs paires de bases contiguës entraînant un
décalage du cadre de lecture, et
e) une insertion de 1 ou plusieurs paires de bases contiguës.
Le terme acide nucléique tel que défini dans la présente demande désigne les
acides désoxyribonucléiques (ADN) et ribonucléiques (ARN). En outre, parmi les
ADN, il peut s'agir d'ADN génomique (ADNg) ou complémentaire (ADNc). Les
acides nucléiques de l'invention peuvent être d'origine naturelle ou
synthétique. Il sont
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généralement préparés par les techniques classiques de biologie moléculaire,
incluant
le criblage de banques, la synthèse artificielle, la ligature, la restriction,
etc. Les
positions données dans la présente demande sont calculées par rapport à la
séquence
de la parkine humaine représentée sur la Figure 1 (SEQ ID No:1). Cette
séquence
représente la séquence de l'ADNc codant pour la parkine humaine. Par rapport à
la
séquence décrite par Kitada et al., elle comporte une modification au niveau
du
nucléotide 768 (C->T).
Les altérations génétiques définies ci-dessus a) à e) sont principalement des
altérations exoniques, c'est-à-dire affectant la région codante du gène de la
parkine
humaine. Toutefois, il a été également mis en évidence des altérations
introniques,
c'est-à-dire dans la partie non codante du gène.
Le gène de la parkine humaine comprend 12 exons, dont les positions
nucléotidiques sont données ci-après :
Exon 1: nucléotides 1 à 108 Exon 2: nucléotides 109 à 272
Exon 3: nucléotides 273 à 513 Exon 4: nucléotides 514 à 635
Exon 5: nucléotides 636 à 719 Exon 6: nucléotides 720 à 835
Exon 7: nucléotides 836 à 972 Exon 8: nucléotides 973 à
1034
Exon 9: nucléotides 1035 à 1184 Exon 10: nucléotides 1185 à
1268
Exon 11: nucléotides 1269 à 1386 Exon 12: nucléotides 1387 à
2960
Dans un premier mode de mise en oeuvre, l'invention concerne un acide
nucléique
codant pour la parkine, comportant des délétions de un ou plusieurs exons,
notamment des combinaisons de délétions d'exons. Plus particulièrement, ces
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délétions affectent les exons 2 à 9 séparément ou en combinaison. Des exemples
particuliers de ces délétions et combinaisons de délétions d'exons du gène de
la
parkine sont illustrés dans les tableaux 2 et 4. En outre, ces délétions
peuvent être
homozygotes c'est-à-dire affecter les deux chromosomes simultanément, ou
hétérozygotes (incidence sur un chromosome seulement).
La demanderesse a en particulier mis en évidence la délétion hétérozygote de
l'exon 2 ainsi que des combinaisons de délétions de cet exon avec d'autres
exons dont
notamment l'exon 3 et l'exon 4. Ainsi, neuf délétions ou combinaison de
délétions ont
été pour la première fois mises en évidence et notamment les délétions
suivantes :
exons 2, 2 + 3, 2 + 3 + 4, 3 - 6, 3 - 9, 6, 6 + 7, 7 + 8 + 9 et 8. Par
ailleurs, ces délétions
ou combinaisons de délétions peuvent être combinées entre elles en cas
d'hétérozygotes composites.
La demanderesse a également mis en évidence un certain nombre de
délétions homozygotes, seules ou combinées, telle que les délétions des exons
5 et 6.
Les positions particulières des délétions décrites ci-dessus peuvent être
définies en se rapportant à la numérotation des nucléotides sur la figure 1.
Dans un autre mode particulier, l'invention concerne un acide nucléique
codant pour la parkine, contenant une délétion de l'exon 3. Plus
particulièrement, cette
délétion affecte les nucléotides 273 à 513 sur la Figure 1.
Dans un autre mode particulier, l'invention concerne un acide nucléique
codant pour la parkine, comprenant une délétion des exons 8 et 9. Plus
particulièrement, cette délétion affecte les nucléotides 973 à 1184 sur la
Figure 1.
Les conséquences de ces délétions ou combinaison de délétions restent
souvent un décalage dans le cadre de lecture. Le tableau 4 résume les
conséquences
apparues en regard des délétions ou combinaisons de délétions relevées.
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Dans un autre mode de mise en oeuvre particulier, l'invention concerne un
acide nucléique codant pour la parkine comprenant une multiplication d'exons,
c'est-
à-dire la répétition d'un ou plusieurs exons dans le gène. La présente demande
montre
pour la première fois : soit une duplication homozygote et hétérozygote comme
cela
5 est illustré dans
les exemples par la duplication de l'exon 3, soit une duplication de
type hétérozygote comme illustré par la duplication de l'exon 6, 7 ou 11. La
présente
demande montre également pour la première fois une triplication d'exons : soit
une
triplication homozygote, soit une triplication hétérozygote comme cela est
illustré
dans les exemples par la triplication de l'exon 2.
Préférentiellement, le terme multiplication d'exons indique la présence de 2 à
5 copies de ou des exons considérés, de préférence de 2 à 3 copies.
Généralement,
chaque copie d'exon est positionnée dans la séquence à côté de l'exon
original.
Dans un autre mode particulier, l'invention concerne un acide nucléique
codant pour la parkine, comprenant une mutation ponctuelle, c'est-à-dire le
remplacement d'une paire de bases par une autre. La présente demande montre en
effet l'existence de mutants ponctuels de la parkine et le caractère causal de
certains
d'entre eux dans l'apparition et le développement d'un syndrome parkinsonien.
Plus
particulièrement, la ou les mutations ponctuelles selon l'invention sont des
mutations
ponctuelles non-sens ou faux-sens ou bien entraînant un décalage du cadre de
lecture.
Une mutation non-sens est une mutation introduisant dans la séquence un
codon stop. Une telle mutation conduit à l'arrêt prématuré de la traduction,
et donc à
la synthèse d'une protéine tronquée. Une telle mutation est donc également
désignée
dans ce qui suit par le terme "tronquante". Plus préférentiellement, selon la
présente
invention, l'acide nucléique comprend une mutation non-sens localisée dans une
région correspondant au domaine N- ou C-terminal de la Parkine humaine. La
présente invention montre en effet que ce type de mutation se rencontre chez
des
patients plus fréquemment dans les régions terminales du gène (et donc de la
protéine). Plus préférentiellement encore, la présente invention concerne un
acide
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nucléique codant pour la parkine humaine, comprenant une mutation ponctuelle
tronquante dans une région correspondant aux exons 2, 3, 11 ou 12. Il s'agit
encore
plus préférentiellement d'une mutation dans l'exon 12 du gène de la parkine,
préférentiellement conduisant à l'inactivation du site de myristoylation
(résidus 450-
455 de la protéine). A titre illustratif, on peut citer la mutation ponctuelle
G->A sur le
nucléotide 1459, introduisant un codon stop à la place du résidu Trp453. Ce
mutant
code donc pour une protéine tronquée comprenant les 452 premiers acides aminés
de
la protéine sauvage. De manière surprenante, la demanderesse a montré que ce
mutant
Parkine1-452, qui est dépourvu seulement des 12 derniers résidus de la
protéine
sauvage, cause la maladie de Parkinson.
Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un acide
nucléique codant pour la parkine humaine, comprenant une mutation ponctuelle
tronquante dans l'exon 7. A titre illustratif, on peut citer la mutation
ponctuelle T->A
sur le nucléotide 905, introduisant un codon stop à la place du résidu
Cystéine 268.
Un autre type de mutation ponctuelle selon l'invention est une mutation faux-
sens. Une mutation faux-sens comprend le remplacement d'une paire de bases
dans un
codon, conduisant à un codon codant pour un acide aminé différent de l'acide
aminé
naturel, sans interruption de la séquence. Une telle mutation, isolée, conduit
donc à
une protéine ayant un nombre inchangé de résidus, mais dont l'un des résidus
diffère
de la protéine sauvage. La présente demande a maintenant montré que des
mutants
ponctuels faux-sens de la parkine existent chez des sujets atteints de
syndromes
parkinsoniens, et que ces mutants peuvent avoir un caractère causal. Plus
préférentiellement, l'invention concerne un acide nucléique codant pour la
parkine
humaine, comprenant au moins une mutation ponctuelle faux-sens localisée
notamment dans une région correspondant aux exons 4 à 12 et de manière
préférée
aux exons 4,6, 7,9, 11 et 12.
Un premier type de mutations ponctuelles faux-sens plus particulières au
sens de l'invention comprend les mutations qui entraînent un changement non-
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conservatif d'acide aminé dans la protéine codée. De telles mutations sont en
effet
plus spécifiquement associées au phénotype de la maladie de parkinson. On
entend
par changement non-conservatif le remplacement d'un acide aminé par un autre
acide
aminé ayant des propriétés structurales, physicochimiques et/ou biologiques
différentes du premier. Ainsi, le changement d'un acide aminé basique par un
acide
aminé non-basique est dit non-conservatif. Ce type de changements comprend
plus
particulièrement le changement des acides aminés de l'une ou l'autre des
catégories
suivantes : acide, basique, neutre polaire, neutre non polaire. Des exemples
particuliers de mutants de ce type selon l'invention sont notamment les acides
nucléiques comprenant l'altération génétique suivante, seule ou en combinaison
:
- une mutation A->T sur le nucléotide 584 (Lys161Asp) dans l'exon 4,
- une mutation A->T sur le nucléotide 734 (Lys211Asn) dans l'exon 6,
- une mutation C->T sur le nucléotide 867 (Arg256Cys) dans l'exon 7,
- une mutation C->T sur le nucléotide 924 (Arg275Trp) dans l'exon 7,
- une mutation G->A sur le nucléotide 939 (Asp280Asn) dans l'exon 7,
- une mutation G->A sur le nucléotide 1084 (Gly328G1u) dans l'exon 9,
- une mutation C->T surie nucléotide 1101 (Arg334Cys) dans l'exon 9, et/ou
- une mutation G->A sur le nucléotide 1390 (Gly430Asp) dans l'exon 12.
Un deuxième type de mutations ponctuelles faux-sens plus particulières au
sens de l'invention comprend les mutations conservatrices. De telles mutations
couvrent tout remplacement d'un codon codant un acide aminé par un codon
codant
un acide aminé du même groupe. Par groupe d'acides aminés on entend les acides
aminés dont les propriétés structurales, physico-chimiques et/ou biologiques
sont très
proches et sont définis selon les catégories suivantes : acide, basique,
neutre polaire,
neutre non polaire. A titre d'exemple de mutation conservatrice, on peut citer
de
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manière générale le remplacement du codon AAA (Lys) par le codon AGA (Arg),
Lys
et Arg faisant partie du même groupe d'acides aminés basiques. Un exemple
particulier de ce type de mutation selon l'invention est notamment l' acide
nucléique
comprenant l'altération génétique suivante, seule ou en combinaison :
- une mutation T ->G sur le nucléotide 966 (Cys289Gly) dans l'exon 7.
Un troisième type de mutations ponctuelles faux-sens plus particulières au
sens de l'invention comprend les mutations qui affectent un site potentiel de
phosphorylation dans la protéine codée. La présente demande montre en effet
que des
mutants de ce type apparaissent chez certains sujets atteints de la maladie de
parkinson, et constituent donc des événements qui participent au développement
de la
pathologie, en raison des fonctions biologiques connues des événements de
phosphorylation. Des mutations particulières sont donc celles qui modifient un
acide
aminé phosphorylable en un résidu non-phosphorylable. A cet égard, les résidus
susceptibles d'être phosphorylés sont par exemple les résidus sérine,
thréonine et
tyrosine.
Des exemples particuliers de mutants de ce type selon l'invention sont
notamment les acides nucléiques comprenant l'altération génétique suivante,
seule ou
en combinaison :
- mutation C->A sur le nucléotide 1345 (Thr415Asn), exon 11.
Par ailleurs, comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne
également tout acide nucléique comprenant une délétion de une ou plusieurs
paires de
bases contiguës et entraînant un décalage du cadre de lecture (voir d). La
présente
demande démontre pour la première fois l'existence de mutants de délétion
restreinte
de la parkine, et leur implication dans l'apparition et le développement d'un
syndrome
parkinsonien. Plus préférentiellement, les délétions restreintes selon
l'invention
conduisent, en raison du décalage du cadre de lecture, à la synthèse de
protéines (i)
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tronquées et (ii) dont la séquence C-terminale est différente de la protéine
sauvage.
Dans le cas de délétions introniques, le décalage du cadre de lecture peut
conduire soit
à la non reconnaissance de l'intron si la mutation a lieu à la jonction exon-
intron et la
production d'une protéine aberrante, soit à un pliage incorrect de l'intron
empêchant
ainsi l'excision-épissage de celui-ci, lorsque la mutation a lieu à
l'intérieur de l'intron.
Comme indiqué ci-avant, cette protéine (ou le domaine original) constitue un
autre
objet de la présente demande.
Plus préférentiellement, l'invention concerne les acides nucléiques
comprenant une délétion de 1 à 10 paires de bases contiguës, de préférence de
1 à 5.
Encore plus particulièrement, les délétions selon l'invention sont localisées
dans une
région de l'acide nucléique correspondant à l'intron 8 ou à l'exon 9 ou à une
région
terminale de la protéine, notamment dans les exons 2 ou 3, par exemple l'exon
2. A
titre d'exemple spécifique, on peut citer un acide nucléique comportant les
altérations
suivantes, seules ou en combinaison :
- une délétion des nucléotides AG aux positions 202 et 203. Cette délétion
introduit un changement du cadre de lecture débutant au niveau du résidu
d'acide
aminé 34 (Gln->Arg), et se terminant par un codon stop (37). Cette protéine
est donc
tronquée et comprend une région C-terminale de 4 acides aminés originale.
- une délétion du nucléotide A en position 255. Cette délétion introduit un
changement du cadre de lecture débutant au niveau du résidu d'acide aminé 52
(Asn-
>Met), et se terminant par un codon stop (81). Cette protéine est donc
tronquée et
comprend une région C-terminale de 30 acides aminés originale.
- une délétion des cinq paires de bases TCTGC dans l'intron 8, en position -
21 -17 par rapport à l'exon 9 et pouvant entraîner une non reconnaissance du
site
d'épissage.
- une délétion de deux paires de bases dans l'exon 9 en position 1142-
1143delGA qui change l'Arg348 en Glu. Cette délétion a pour conséquence
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l'introduction d'un changement du cadre de lecture créant ainsi un codon stop
en
position 368 dans l'exon 10.
Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également un acide
nucléique comprenant une ou plusieurs altérations génétiques, telles que
notamment
5 une insertion de une ou plusieurs paires de bases contiguës (voir
e)). La présente
demande démontre en effet pour la première fois l'existence de mutants
d'insertion de
la parkine, et leur implication dans l'apparition et le développement de la
maladie de
parkinson. Plus préférentiellement, l'insertion selon l'invention est telle
qu'elle
entraîne un décalage du cadre de lecture. De ce fait, l'insertion entraîne un
10 changement des résidus situés en aval (du coté C-terminal) de la
mutation. En outre,
cette insertion conduit le plus généralement à la création d'un codon stop
prématuré,
et donc à la synthèse d'une protéine (i) tronquée et (ii) dont la séquence C-
terminale
est différente de la protéine sauvage. Comme indiqué plus loin, cette protéine
(ou le
domaine original) constitue un autre objet de la présente demande, et peut
être utilisée
comme outil diagnostique ou thérapeutique.
Plus préférentiellement, l'invention concerne les acides nucléiques
comprenant une insertion de 1 à 5 paires de bases contiguës, de préférence de
1 ou 2.
A titre d'exemple spécifique, on peut citer un acide nucléique comportant une
insertion GT entre les nucléotides 321 et 322. Cette insertion introduit un
changement
du cadre de lecture débutant au niveau du résidu d'acide aminé 74 (Trp->Cys),
et se
terminant par un codon stop (81). Cette protéine est donc tronquée et comprend
une
région C-terminale de 8 acides aminés originale.
Bien entendu, les altérations génétiques a) à e) décrites ci-dessus peuvent
être isolées ou combinées entre elles, telles que notamment une mutation faux-
sens et
une délétion ou encore deux mutations faux-sens cumulées. A titre d'exemples
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illustrant ce type de combinaison, on peut citer particulièrement la
combinaison de
modifications suivantes :
- une mutation faux-sens C->T en position 1101 (Arg334Cys) dans l'exon 9
avec une délétion de 5 paires de bases en position -21-17 par rapport à l'exon
9, dans
l'intron 8
- une mutation faux-sens C->T en position 924 (Arg275Trp) dans l'exon 7
avec une mutation faux-sens G->A en position 1390 (Gly430Asp) dans l'exon 12.
L'invention a également pour objet un acide nucléique codant pour la parkine
humaine, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence présentée sur la figure
1 (SEQ
ID No:1). Cette séquence comporte, par rapport à la séquence isolée par Kitada
et al,
une T en position 768, à la place d'une C, résultant, dans la protéine codée,
en un
acide aminé sérine en position 223, à la place d'une proline. Cet acide
nucléique code
pour la parkine sauvage rencontrée dans les populations européennes.
L'invention a également pour objet les variants polymorphiques de l'acide
nucléique présenté sur la figure 1. La présente demande montre en effet que le
gène
de la parkine humaine présente un certain polymorphisme, et décrit plus
particulièrement certains variants, présentant plus spécifiquement une des
modifications de séquence suivantes:
- mutation G->A sur le nucléotide 601 de l'exon 4 (Ser167Asn)
- mutation G->C sur le nucléotide 1239 de l'exon 10 (Va1380Leu)
- mutation G->A sur le nucléotide 1281 de l'exon 11 (Asp394Asn).
L'invention concerne aussi tout vecteur comprenant un acide nucléique tel
que défini ci-avant. Il peut s'agir d'un vecteur plasmidique, d'un cosmide,
vecteur
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viral, épisome, chromosome artificiel, etc. Dans un mode particulier, un tel
vecteur
comprend aussi une région promotrice permettant l'expression dudit acide
nucléique.
De tels vecteurs peuvent être utilisés pour produire en quantités importantes
les acides nucléiques de l'invention, ou pour produire les polypeptides
correspondants,
dans un hôte cellulaire approprié (cellule procaryote, eucaryote, animale ou
végétale,
par exemple). Des hôtes cellulaires préférés sont notamment des cellules de
bactérie
(E. coli par exemple) ou des cellules de levure, ou encore des cellules
mammifères,
animales ou humaines.
A cet égard, l'invention concerne aussi toute cellule recombinante
comprenant un acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-avant.
L'invention concerne aussi toute cellule mammifère, notamment humaine,
comprenant un acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-avant, en
remplacement du gène sauvage de la parkine.
Les cellules de l'invention peuvent être utilisées notamment pour l'étude des
propriétés de la parkine, ainsi que comme modèles pour la recherche de
composés
susceptibles de compenser les altérations génétiques du gène de la parkine.
L'invention concerne en outre tout mammifère non-humain comprenant un
acide nucléique tel que défini ci-avant dans ses cellules. Avantageusement,
ces
mammifères sont obtenus par "knock-in" des altérations identifiées ci-avant,
par
recombinaison homologue, ou également par "knock-out" du gène sauvage,
substitué
par la version altérée de l'invention.
De tels mammifères (rongeurs, canins, lapins, etc.) sont notamment
utilisables pour l'étude des propriétés de la parkine et l'identification de
composés à
visée thérapeutique, par exemple.
L'invention concerne également tout polypeptide codé par un acide nucléique
tel que décrit ci-avant. Ces polypeptides sont donc la parkine humaine, ses
variants
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polymorphes, et des variants mutés et/ou tronqués et/ou comportant une
multiplication d'exons, impliqués dans l'apparition et/ou le développement
d'un
syndrome parkinsonien. L'invention concerne en particulier les variants
tronqués ou
aberrants de la parkine tels que décrits ci-avant, ou une partie de ceux-ci
correspondant à la séquence créée par le décalage de cadre de lecture. De tels
polypeptides ou fragments, ou les acides nucléiques correspondants, sont
utilisables
pour identifier et/ou étudier des composés susceptibles de restaurer un
phénotype
normal à des cellules les exprimant. En particulier, les acides nucléiques
décrits ci-
dessus peuvent être transférés dans des cellules hôtes appropriées, de
préférence des
cellules eucaryotes (mammifère, levure par exemple), pour être utilisés dans
un test
de screening de composés capables de contrecarrer leur activité, qu'il
s'agisse de
composés chimiques, biochimiques ou génétiques. De tels polypeptides ou
fragments
sont également utilisables à titre d'antigènes, pour la préparation
d'anticorps
spécifiques, utilisables pour la détection des variants. En particulier, les
régions
polypeptidiques spécifiques des formes tronquées (en particulier les
extrémités)
peuvent être utilisées pour la préparation d'anticorps, selon les techniques
classiques
de l'immunologie, lesquels anticorps constituent alors des outils de détection
de la
présence de ces formes dans des échantillons biologiques issus de sujets. De
tels
anticorps peuvent être polyclonaux ou monoclonaux (préparés par exemple par
fusion
de cellules de rate d'animaux immunisés avec les antigènes, avec des cellules
de
myelome, puis sélection de clones producteurs d'anticorps monoclonaux).
A cet égard, l'invention concerne également tout anticorps spécifique d'un
polypeptide tel que décrit ci-avant, ou d'une région spécifique d'un tel
polypeptide. Le
terme "anticorps spécifique" désigne un anticorps ayant une affinité
particulièrement
supérieure pour l'antigène donné, par rapport à tout autre antigène.
L'invention concerne en outre toute composition comprenant un polypeptide
ou un anticorps ou encore un vecteur ou une cellule hôte transformée par
l'acide
nucléique de l'invention, tels que décrits ci-avant. Ces compositions peuvent
être
conditionnées dans différents types de milieux (solutions salines,
isotoniques, etc.) en
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présence de stabilisants ou de conservateurs, par exemple. Ces compositions
peuvent
être conservées au froid ou congelées, dans tout dispositif approprié (tube,
boite,
flacon, fiole, poche, etc.).
D'autre part, en plus des altérations génétiques exoniques décrites ci-avant,
l'invention décrit également des altérations génétiques introniques du gène de
la
parkine. Ces altérations n'induisent pas de changement dans la séquence de la
protéine
codée, et constituent essentiellement des variants polymorphiques. Ces
variants sont
plus particulièrement décrits dans le Tableau 2.
L'une des applications de l'invention réside dans la détection de la présence
de mutations dans le gène de la parkine, et leur corrélation avec la
susceptibilité à la
maladie de Parkinson, par exemple. A cet égard, l'invention concerne également
différents outils (sondes, amorces, anticorps, etc.), utiles à la mise en
oeuvre de telles
méthodes de détection.
En particulier, l'invention concerne toute sonde ou oligonucléotide hybridant
spécifiquement avec un acide nucléique tel que défini ci-avant.
Les sondes ou oligonucléotides spécifiques de l'invention comprennent
généralement moins de 500 pb, plus préférentiellement moins de 300 pb.
Typiquement un oligonucléotide spécifique de l'invention comprend de 5 à 100
pb,
avantageusement de 5 à 50 pb. La longueur de l'oligonucléotide peut bien
entendu
être ajustée par l'homme du métier. Les sondes ou oligonucléotides de
l'invention sont
par ailleurs généralement marqués, de manière à permettre leur détection.
Différents
types de marquages connus de l'homme du métier peuvent être utilisés (marquage
radioactif, fluorescent, enzymatique, chimique, terminal ou interne, etc.).
Enfin, les
sondes ou oligonucléotides de l'invention ont la capacité d'hybrider
spécifiquement
avec les acides nucléiques tels que définis ci-avant, c'est-à-dire avec les
différentes
formes altérées du gène de la parkine. L'hybridation est dite spécifique
lorsque la
sonde ou l'oligonucléotide hybrident, dans des conditions de stringence
élevée, avec
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,
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l'acide nucléique portant l'altération recherchée, et pas ou peu avec le même
acide
nucléique ne portant pas ladite altération. L'hybridation est donc dite
spécifique
lorsque le différentiel signal spécifique/bruit de fond est suffisamment grand
pour
pouvoir être détecté.
5 Les sondes ou
oligonucléotides de l'invention sont donc généralement
complémentaires d'une région au moins du gène de la parkine portant les
altérations
génétiques a) à d) décrites ci-avant. La complémentarité est généralement
parfaite, de
manière à assurer une meilleure sélectivité d'hybridation. Ces sondes ou
oligonucléotides peuvent être synthétisés par toute technique connue de
l'homme du
10 métier, par
exemple par clivage à partir des acides nucléiques décrits ci-avant, ou par
synthèse artificielle, ou en combinant ces techniques. Ces sondes ou
oligonucléotides
sont utilisables pour l'identification, sur des échantillons biologiques, de
la présence
d'altérations génétiques du gène de la parkine.
L'invention concerne aussi un couple d'amorce pour l'amplification de tout
15 ou partie d'un
acide nucléique tel que décrit ci-avant, caractérisé en ce qu'il comprend:
- une première amorce complémentaire d'une région du gène de la parkine
située en 5' d'une altération génétique, et
- une deuxième amorce complémentaire d'une région du gène de la parkine
située en 3' de ladite altération génétique.
20 Les amorces de
l'invention sont généralement complémentaires d'une région
du gène de la parkine, et comprennent avantageusement moins de 30 pb.
L'invention concerne encore un procédé pour l'identification d'une altération
génétique dans le gène de la parkine et en particulier la détection de
délétion(s) et/ou
multiplication (p.ex. duplication, triplication) d'exons à l'état homozygote
et
hétérozygote.
Ce procédé selon l'invention comprend :
CA 02872581 2016-10-27
16
i) la mise à disposition d'un échantillon comprenant le gène de la parkine,
ii) l'amplification (semi-quantitative) d'une partie au moins dudit gène,
ladite
partie comprenant une altération génétique telle que définie ci-avant, et
iii) la mise en évidence de la présence de l'altération génétique.
L'invention concerne également un procédé de détection d'un syndrome
parkinsonien de transmission autosomique récessive chez un sujet symptomatique
comprenant la détection dans un échantillon d'acide nucléique obtenu du sujet
de deux ou
plusieurs altérations génétiques hétérozygotes dans le gène de la parkine,
caractérisé en
ce qu'il comporte la séquence représentée par SEQ ID NO: 1, caractérisé en ce
que la
présence de deux ou plusieurs altérations génétiques hétérozygotes dans le
gène de la
parkine met en évidence la présence d'un syndrome parkinsonien de transmission
autosomique récessive chez le sujet et caractérisé en ce que les altérations
génétiques
hétérozygotes dans le gène de la parkine sont choisies parmi:
a) une mutation ponctuelle hétérozygote introduisant l'un des changements
d'acide aminé suivants:
GIn34Arg;
Asn52Met;
Lys161Asn;
Lys211Asn;
Arg256Cys;
Arg275Trp;
Asp280Asn;
Cys268Stop;
Cys289Gly;
Arg348G1u;
Gly328G1u; et
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16a
Gly430Asp,
caractérisé en ce que l'acide aminé est encodé par la séquence représentée
par la SEQ ID NO: 1 ; ou
b) une combinaison de a) et c), caractérisé en ce que c) est une délétion
hétérozygote, seule ou en combinaison, choisie parmi :
exons 2 et 3;
exon 2;
exons 2, 3 et 4;
exon 3;
exon 5;
exons 3, 4, 5 et 6;
exon 6;
exons 6 et 7;
exon 8;
exons 7, 8 et 9; ou
exons 3-9.
L'invention concerne également un procédé de détection d'un syndrome
parkinsonien de transmission autosomique récessive chez un sujet comprenant la
détection
dans un échantillon test d'acide nucléique obtenu du sujet de deux ou
plusieurs altérations
génétiques hétérozygotes dans le gène de la parkine, caractérisé en ce qu'il
comprend la
séquence représentée par SEQ ID NO: 1, et caractérisé en ce que les
altérations
génétiques hétérozygotes dans le gène de la parkine sont choisies parmi :
a) une mutation ponctuelle hétérozygote introduisant l'un des changements
d'acide aminé suivants :
GIn34Arg;
Asn52Met;
Lys161Asn;
Lys211Asn;
= CA 02872581 2016-10-27
16b
Arg256Cys;
Arg275Trp;
Asp280Asn;
Cys268Stop;
Cys289Gly;
Arg348G1u;
Gly328G1u;
Gly430Asp; et
caractérisé en ce que l'acide aminé est encodé par la séquence représentée par
la SEQ ID
NO: 1 ; ou
b) une combinaison de a) et c), caractérisé en ce que c) est une délétion
hétérozygote, seule ou en combinaison, choisie parmi :
exons 2 et 3;
exon 2;
exons 2, 3 et 4;
exon 3;
exon 5;
exons 3, 4, 5 et 6;
exon 6;
exons 6 et 7;
exon 8;
exons 7, 8 et 9; ou
exons 3-9;
caractérisé en ce que la présence de deux ou plusieurs altérations génétiques
hétérozygotes dans le gène de la parkine met en évidence la présence d'un
syndrome
parkinsonien de transmission autosomique récessive chez le sujet.
L'invention concerne également un procédé pour la détection d'un syndrome
parkinsonien de transmission autosomique récessive chez un sujet comprenant la
détection
dans un échantillon test d'acide nucléique obtenu du sujet de la présence
d'une ou
plusieurs altérations dans le gène de la parkine comprenant la SEQ ID NO: 1,
caractérisé
en ce que l'une ou plusieurs altérations génétiques du gène de la parkine
comportent deux
CA 02872581 2016-10-27
16c
ou plusieurs altérations génétiques hétérozygotes, et caractérisé en ce que
l'altération
génétique du gène de la parkine comprend :
a) une délétion de l'exon 4 ou des exons 3-4;
b) une mutation ponctuelle introduisant l'un des changements d'acide aminé
suivants :
GIn34Arg; et
Asn52Met;
caractérisé en ce que l'acide aminé est encodé par la séquence représentée
par la SEQ ID NO: 1,
c) une combinaison de a) et b),
caractérisé en ce que la présence d'une altération génétique homozygote ou de
deux ou
plusieurs altérations génétiques hétérozygotes, seule ou en combinaison dans
le gène de
la parkine met en évidence la présence d'un syndrome de transmission
autosomique
récessive chez le sujet.
L'invention concerne également un procédé pour la détection d'un syndrome
parkinsonien de transmission autosomique récessive chez un sujet comprenant la
détection
dans un échantillon d'acide nucléique obtenu d'un sujet d'une ou plusieurs
altérations
génétiques homozygotes du gène de la parkine comprenant la séquence
représentée par
SEQ ID NO: 1, caractérisé en ce que l'altération génétique comprend :
a) une délétion des exons 5 et 6, et
b) une mutation ponctuelle introduisant l'un des changements d'acide
aminé suivants :
Trp74Cys;
Arg334Cys;
Thr415Asn; et
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16d
Trp453Stop.
caractérisé en ce que l'acide aminé est encodé par SEQ ID NO: 1,
c) une triplication homozigote de l'exon 2;
d) une insertion de GT entre les nucléotides 321 et 322;
e) une délétion de TCTGC dans l'intron 8;
f) une combinaison de a), b), c), d) ou e); et
caractérisé en ce que la présence d'une altération génétique homozygote seule
ou en
combinaison dans le gène de la parkine met en évidence la présence d'un
syndrome
parkinsonien de transmission autosomique récessive chez le sujet.
Avantageusement, dans le procédé de l'invention, l'échantillon est un
échantillon de sang, tissu, plasma ou une culture de cellules, provenant d'un
sujet,
notamment d'un mammifère, en particulier d'un humain. Dans un mode préféré de
mise en
uvre, l'échantillon est prétraité de manière à rendre le gène de la parkine,
ou une partie
de celui-ci, accessible pour l'amplification. Ce prétraitement peut comprendre
la lyse des
cellules, un traitement enzymatique, une dénaturation, etc.
Avantageusement, l'amplification est réalisée au moyen d'un couple
d'amorces tel que décrit plus haut ou celles décrites par Kitada et al. et
incluses par
référence.
A titre d'exemple particulier de couple d'amorces selon l'invention, on peut
citer les amorces servant à la détection d'altérations dans l'exon 3 ou de
mutations
ponctuelles. Ainsi, la paire d'amorces suivante a été utilisée dans le cadre
de l'invention :
For: 5'-(Hex)AATTGTGACCTGGATCAGC-3' (SEQ ID No :2) et
Rev: 5'-CTGGACTTCCAGCTGGTGGTGAG-3' (SEQ ID No :3)
Les amorces suivantes ont également été utilisées pour la mise en évidence des
mutations
ponctuelles suivantes:
, = CA 02872581 2016-10-27
16e
Asp280Asn : 5'-GGCAGGGAGTAGCCAAGTTGAGGAT-3' (SEQ ID No :4)
séquence sauvage G
Arg334Cys: 5'-AGCCCCGCTCCACAGCCAGCGC-3'
séquence sauvage G
. CA 02872581 2014-11-26
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PCT/FR99/02833
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La mise en évidence d'une altération génétique telle que décrite ci-dessus
peut être réalisée par différentes techniques, et notamment par séquençage,
PCR/restriction, ASO, PAGE, par PCR/multiplexe semi-quantitative, comme
détaillé
dans la partie expérimentale. Brièvement, cette méthode repose sur
l'amplification par
PCR semi-quantitative et en phase exponentielle d'ADN matrice. Suivant cette
méthode la comparaison du taux relatif d'ADN matrice est suffisante pour
mettre en
évidence une perte de la quantité d'ADN (délétion d'exon(s)) ou au contraire
une
augmentation de la quantité d'ADN (multiplication d'exon(s)).
L'invention concerne en outre un kit pour la mise en oeuvre des procédés de
l'invention, comprenant une sonde ou un oligonucléotide ou un couple d'amorces
tels
que décrits ci-avant. Les kits de l'invention comprennent avantageusement les
réactifs
appropriés à une réaction d'amplification et/ou d'hybridation, et,
éventuellement, un
support pour de telles réactions (filtres, membranes, chips, etc.).
La présente invention est particulièrement adaptée au diagnostique d'une
susceptibilité à la maladie de parkinson, par la recherche d'une altération
génétique
telle que décrite plus haut dans le gène de la parkine.
La présente invention est également relative à l'utilisation des outils
décrits
ci-avant (acides nucléiques, sondes, polypeptides, anticorps, cellules,
animaux) pour
l'identification de composés capables de contrecarrer, au moins en partie, les
effets
d'une altération génétique du gène de la parkine, notamment dans un but
thérapeutique. Ainsi, de tels composés peuvent être mis en évidence par mise
en
contact d'une composition (ou d'un produit) test en présence d'une cellule ou
d'un
animal tel que décrit ci-avant, et détection d'un effet phénotypique ou
génotypique.
La méthode de l'invention peut notamment permettre l'identification de
composés susceptibles d'être utilisés, seuls ou en combinaison avec d'autres
produits
ou traitements, pour le traitement (i.e., la diminution) de la maladie de
Parkinson. De
tels composés constituent un autre objet de la présente invention.
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D'autres avantages et applications de la présente invention apparaîtront à la
lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme
illustratifs et non
limitatifs.
EXEMPLES
A - Légende des Figures
Figure 1: Séquence de l'ADNc codant pour la parkine humaine. Les jonctions
entre
les exons sont indiquées. Le codon initiateur (atg) et le codon stop (tag)
sont en gras.
Le changement C>T en position 768 est en gras et souligné.
Figure 2: Familles présentant des mutations ponctuelles dans le gène de la
parkine. La
coségrégation complète de la mutation avec la maladie est représentée. Les
carrés
(homme) et ronds (femmes) noirs représentent les individus affectés avec l'âge
d'apparition (en années) indiqué sous le symbole des patients. Les symboles
barrés
indiquent des patients décédés. Le nombre de frères et soeurs non affectés,
non
analysés est donné en losange. Pour chaque mutation (changement d'acide
aminé), le
génotype du membre de la famille est indiqué (+/+ homozygote sauvage, +/-
hétérozygote pour la mutation ; -/- homozygote pour la mutation). Sous chaque
génotype, les résultats de détection sont donnés. PAGE : électrophoregrammes
avec la
taille de l'allèle en pb ; ASO autoradiogrammes des allèles mutés et sauvages
;
PCR/restriction : produits PCR après digestion avec les enzymes de restriction
appropriées. La longueur des fragments en pb est donnée. Mut : muté ; nd : âge
d'apparition non déterminé, puisque patient n'est pas conscient des symptômes.
Figure 3 : Représentation et localisation des mutations ponctuelles du gène de
la
parkine. La séquence codante du gène, avec ses 12 exons, est représentée
(barre). Les
exons sont numérotés 1 à 12. 8 mutations ponctuelles causales sont
positionnées
selon leur effet sur la protéine (troncation vs faux-sens). Le domaine
ubiquitine-like et
le motif en anneau ("Ring Finger") sont hachurés. Pour les mutations Thr415Asn
et
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Trp453Stop, les sites de phosphorylation (P) et de myristoylation (M) sont
indiqués.
UTR ; région non traduite.
Figure 4: Résultats de la mise en évidence de délétions d'exons hétérozygotes
dans
une famille présentant le syndrome parkinsonien de début précoce (FPD-GRE-WAG-
155) selon la méthode PCR/multiplexe semi-quantitative de l'invention. Les
carrés
(homme) et ronds (femmes) noirs représentent les individus affectés.
Les pics représentent les exons produits par PCR/multiplexe semi-quantitative.
Les
chiffres entourés indiquent la hauteur des pics. La règle graduée au-dessus
des
éléctrophoregrammes indique la taille en paire de bases des produits de PCR.
Tableau 1 : Oligonucléotides utilisés pour la technique ASO, Les changements
de
nucléotide dans la séquence des oligonucléotides sont représentés en gras et
soulignés. WT = type sauvage ; V = variant.
Tableau 2 : Récapitulatif des mutations mises en évidence. Les positions des
nucléotides sont données selon la séquence de d'ADNc publiée dans la banque de
données d'ADN japonaise (DDBJ; numéro d'accès AB009973) et sont illustrées
dans
la figure 1. PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide; ASO = technique
de
détection des mutations mettant en oeuvre un oligonucléotide spécifique d'un
allèle.
Tableau 3 : Caractéristiques cliniques des patients en fonction du type
d'altération
génétique. Les patients de la famille IT-020 qui sont hétérozygotes composites
pour
une mutation faux sens et une mutation tronquante ne figurent pas dans le
tableau. a:
p<0,05 pour la comparaison entre les patients avec une délétion homozygote et
les
patients avec des mutations tronquantes.
Tableau 4 : Fréquence et conséquences des délétions/multiplications d'exons
del = délétion, het = hétérozygote; hom = homozygote
Tableau 5 : Ratio des résultats obtenus dans la figure 4. La hauteur des pics
est
donnée pour chaque exon dans la partie gauche du tableau, les valeurs des
doubles
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pics ayant été additionnées. La partie droite du tableau fourni le calcul des
ratios des
valeurs des pics. Italique = valeur normale; souligné = valeur pathologique
comparée
au contrôle. Dans la deuxième ligne du tableau, pour chaque cas, le ratio du
témoin
est divisé par le ratio du cas. Les valeurs pathologiques sont ou 50,625 ou
1,6
5 (=1/0,625). Des délétions d'exons ont été détectées pour les sujets FR
155 5 (exon 3),
FR 155 6 (exon 2), FR 155 8 et FR 155 9 (exons 2 + 3). Pour ces deux derniers
sujets
atteints, la valeur du ratio exon 3/2 est normale étant donné que les deux
exons ont été
délétés de manière hétérozygote.
B - Matériel et méthodes
10 1. Familles et patients
Dans une première série d'expériences, 38 familles ont été sélectionnées selon
les critères suivants: syndrome parkinsonien réactif à la lévodopa, ii) âge de
début au
plus de 45 ans pour au moins un des membres atteints, et iii) transmission
compatible
avec une hérédité autosomique récessive.
15 Dans une autre
série d'expériences, 77 familles ont été sélectionnées selon les
critères suivants (comme indiqué dans Lücking et al, 1998; Abbas et al, 1999):
i)
présence d'un syndrome parkinsonien avec une bonne réponse à la levodopa (k
30%
d'amélioration) chez au moins deux membres d'une fratrie (ou un seul s'il y a
notion
de consanguinité); ii) absence de critères d'exclusion tels que signe de
Babinski,
20 ophtalmoplégie, démence ou dysautonomie survenant avant deux ans
d'évolution;
iii) début 5 45 ans chez au moins un des atteints ; iv) hérédité compatible
avec une
transmission autosomique récessive (plusieurs patients dans une seule
génération avec
ou sans notion de consanguinité). Les familles étaient originaires de France
(n=20),
Italie (n=19), Grande-Bretagne (n=14), Pays-Bas (n=9), Allemagne (n=9), Liban
(n=2), Algérie (n=1), Maroc (n=1), Portugal (n=1), Vietnam (n=1).
De plus, 102 cas isolés, sans consanguinité connue, ont été sélectionnés avec
les même critères cliniques. Ils étaient originaires de France (n=31), Italie
(n=23) et
Grande¨Bretagne (n=26), Allemagne (n=21)n Pays-Bas (n=1).
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,
,
21
Tous les patients ont été évalués selon un protocole standardisé. Le
consentement
éclairé de tous les participants a été recueilli par écrit.
2. Analyse du gène de la parkine
L'ADN des 12 exons codants du gène de la parkine a été amplifié par PCR à
partir de leucocytes du sang périphérique, pour chaque cas index, selon les
conditions
décrites dans Kitada et al. Brièvement, l'amplification a été réalisée sur 100
ng
d'ADN, en présence de 3500/1 de chaque dNTP, 350 t.iM de chaque amorce, et de
la
polymérase Taq. Les conditions d'amplification sont de 35 cycles à 94 C
pendant
30sec., à 55-61 C pendant 30sec., puis à 68 C pendant 30 sec. Pour les exons
4 et 7,
seul le couple d'amorces introniques a été utilisé. La séquence des 12 exons a
été
réalisée sur les deux brins avec les amorces utilisées pour l'amplification
par PCR,
avec le kit de séquençage "Big Dye* Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction"
(ABI PRISM) et analysée après électrophorèse sur séquenceur ABI 377* avec le
logiciel
"Sequence Analysis* 3.0" (ABI PRISM).
La détection des mutations dans les échantillons et l'analyse d'une population
de 45 individus contrôle a été effectuée par trois techniques, qui peuvent
être utilisées
seules ou en combinaison(s) : PCR/restriction avec l'enzyme de restriction
appropriée
; technique ASO ("Allele Specific Oligonucleotide"), et électrophorèse sur gel
de
polyacrylamide ("PAGE"), comme illustré dans le Tableau 2. Plus
particulièrement,
ces techniques ont été mises en oeuvre comme décrit ci-après.
La technique ASO : Cette approche consiste à hybrider deux sondes
oligonucléotidiques sur un échantillon amplifié (par exemple par PCR), la
première
spécifique de et recouvrant une altération génétique, la seconde spécifique de
et
recouvrant la région correspondante sauvage. Ainsi, en présence d'un gène
muté, seule
* (marques de commerce)
CA 02872581 2014-11-26
22
la première sonde permet l'hybridation avec le fragment d'ADN, alors qu'en
présence
d'un gène non-muté, seule la seconde sonde permet l'hybridation avec le
fragment
d'ADN. Dans le cas d'un gène hétérozygote, une hybridation est obtenue avec
chacune
des sondes. Cette technique peut également être réalisée de manière
concomitante à
l'amplification, en utilisant deux couples d'amorces, le premier comprenant
une
amorce spécifique de et recouvrant la région correspondante sauvage. Dans ce
mode
de réalisation, en présence d'un gène muté, seul le premier couple permet
l'amplification d'un fragment d'ADN, alors qu'en présence d'un gène non-muté,
seul le
second couple d'amorce permet l'amplification d'un fragment d'ADN. Dans le cas
d'un
gène hétérozygote, un produit d'amplification est obtenu avec chacun des
couples
d'amorces.
Pour la mise en oeuvre de cette technique, 10 pl de produit PCR ont été
dénaturés à 95 C pendant 5 min, déposés sur des membranes nylon Hybond* N+
(Amersham), puis fixés au microonde à 600W pendant 2 min. Les amorces
spécifiques (ou oligonucléotides) utilisées pour la détection (ou, le cas
échéant, pour
l'amplification) sont décrites dans les exemples (voir Tableau 1). Pour l'exon
3, les
amorces exoniques Ex3iFor (avant) et Ex3iRev (arrière) ont été utilisées. La
séquence
de ces amorces est la suivante :
Ex3iFor :
5'-AATTGTGACCTGGATCAGC-3' (SEQ ID NO :6)
Ex3iRev :
5'-CTGGACTTCCAGCTGGTGGTGAG-3' (SEQ ID NO :7)
* (marque de commerce)
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23
Ces oligonucléotides (y compris les amorces, dans le cas d'une amplification
simultanée), marqués au dCTP32 au moyen du kit Terminal Transferase*
(Boehringer
Mannheim) ont été hybridés aux membranes à 44 C pendant la nuit dans un tampon
consistant en 5 X SSC, 5 X Denhardts et 0,1% SDS. Les membranes ont ensuite
été
lavées deux fois pendant 30 min dans un milieu 2 X SSC à 59 C et exposées à un
film
MP* (Amersham) pendant 3-6 heures.
Technique de PCR/restriction : Cette technique est basée sur l'utilisation
d'enzymes de restriction dont le profil de digestion se trouve modifié du fait
de
l'altération génétique. Préférentiellement, cette technique met donc en oeuvre
des
enzymes de restriction dont le site est modifié (détruit ou créé) par
l'altération
génétique. Ainsi, selon le profil de digestion de l'acide nucléique
(généralement du
produit d'amplification), il est possible de distinguer la présence ou non de
l'altération
génétique recherchée. Bien entendu, cette technique est tout particulièrement
adaptée
à la recherche d'altérations génétiques caractérisées, entraînant une
modification dans
un site de coupure enzymatique. Pour sa mise en oeuvre, 15 tl de produit
d'amplification est mis à digérer en présence de ou des enzymes de restriction
appropriées, selon les recommandations du fabricant. Les enzymes particulières
utilisées dans les exemples et la taille des fragments de restriction attendue
sont
donnés dans le Tableau 2.
Technique d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide ("PAGE") : Cette
technique permet de détecter la présence de mutations par mesure de la taille
des
produits d'amplification. Elle est donc tout particulièrement adaptée à la
détection
d'altérations génétiques de type insertion ou délétion. Pour sa mise en
oeuvre, une
amorce avant marquée (5'-fluorescente, Hex) a été utilisée pour amplifier
l'exon 2 du
gène de la parkine. La présence de l'altération 202-203delAG, résultant en un
produit
* (marques de commerce)
CA 02872581 2014-11-26
24
PCR plus court (306 vs 308 pb) a été établie par mesure de la taille du
fragment
amplifié en utilisant un séquenceur automatique ABI377 équipé des logiciels
"Genescan* 2Ø2" et "Genotyper* 1.1.1" (ABI PRISM).
La numérotation des nucléotides utilisée dans la présente demande est
donnée par référence à la séquence de l'ADNc qui figure dans la DNA Data Bank
of
Japan (DDRI; accession number: AB009973). La séquence est représentée sur la
figure I. Cette séquence diffère de la séquence décrite par Kitada et al. au
niveau du
nucléotide 768. La séquence présentée sur la figure 1 correspond à la protéine
sauvage
rencontrée dans les populations européennes.
3. PCR multiplexe semi-quantitative pour la détection
de
délétions/multiplieations d'exons à l'état homozygote et hétérozygote
a) Principes
La détection de délétions hétémgygotes ou des multiplications d'exons dans
le gène de la Parkine ne peut pas être réalisée par PCR non quantitative.
Ainsi, une
PCR semi-quantitative qui compare le taux relatif d'ADN matrice est suffisante
pour
savoir s'il manque 50% de l'ADN matrice pour un ou plusieurs exons ou, au
contraire
dans le cas d'une multiplication hétérozygote ou homozygote, s'il y a p.ex.
50%
(duplication hétérozygote), 100% (duplication homozygote ou triplication
hétérozygote) ou 200% (triplication homozygoyte) d'ADN de trop pour un ou
plusieurs exons. Pour réaliser cette comparaison, plusieurs exons d'un même
individu
sont amplifiés simultanément, dans une réaction de PCR (PCR multiplexe), les
exons
coamplifiés servant de standard interne de quantité. La PCR est réalisée avec
des
amorces fluorescentes, de telle sorte que la quantité de produit PCR peut être
mesurée
par la hauteur de pics sur un séquenceur automatique (ABI Prism 377), comme
appliqué par exemple dans le LOH Assay (Loss of Heterozygosity) d'Applied
Biosystems. La quantité de produit PCR (hauteur du pic) est directement liée à
la
quantité d'ADN matrice tant que la PCR est dans sa phase exponentielle qui
signifie
une absence de limitation par les substrats disponibles. Chaque PCR
multiplexe, pour
* (marques de commerce)
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une combinaison donnée d'exons, produit une distribution typique de hauteur de
pics
pour un individu témoin et ainsi des ratios déterminés entre les différents
pics.
Une délétion homozygote d'un exon sera démontrée par l'absence du pic
correspondant. Si un exon est délété à l'état hétérozygote, le pic
correspondant aura la
5 moitié de sa hauteur normale, ce qui changera le rapport entre les
exons délétés et non
délétés par un facteur 2 par rapport à un témoin (comparant la valeur haute à
la valeur
basse; figure 4 et tableau 4 relatif à la figure 4). Pour les duplications
d'exons, les
rapports changent d'un facteur 1,5 pour les hétérozygotes et d'un facteur 2
pour les
homozygotes (toujours en comparant la valeur haute à la valeur basse). Ainsi,
les
10 facteurs pour une triplication hétérozygote ou homozygote sont 2 ou 3,
respectivement (toujours en comparant la valeur haute à la valeur basse). De
façon à
pouvoir détecter également une délétion ou une multiplication de l'ensemble du
gène
de la Parkine, un produit de PCR de 328 paires de bases (C328) d'un gène situé
à
distance (gène de la Transthyrétine) est amplifié et sert de standard externe
dans une
15 des PCR multiplexes. Le fait que seulement les rapports des hauteurs
entre les pics
soient comparées rend, en première approximation, la méthode indépendante de
la
quantité et de la qualité de l'ADN.
b) Etablissement des conditions appropriées de PCR
multiplexe
Au cours d'expériences préliminaires, il a été noté que les exons qui
20 s'amplifient le mieux pouvaient influencer de façon négative
l'amplification d'autres
exons, pour lesquels l'efficacité était moins bonne. Ainsi, les exons dont
l'efficacité
d'amplification était comparable ont été regroupés. De plus, comme la taille
du
produit PCR peut influencer le rendement de l'amplification (les séquences
courtes
étant en règle mieux amplifiées que les longues), le regroupement des produits
de
25 PCR de taille comparable dans la réaction multiplexe a été effectué.
Ainsi, trois
combinaisons d'exons ont été choisies :
Comb 1: Ex 4o (261 bp) + 7o (239 bp) + 8(206 bp) + 11(303 bp),
Comb 2: Ex 5(227 bp) + 6 (268 bp) + 8(206 bp) + 10(165 bp) et
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Comb 3: Ex 2 (308 bp) + 3i (243 bp) + 9 (278 bp) + 12 (255 bp) + C328
(contrôle externe de 328 paires de base).
Les amorces utilisées sont celles décrites par Kitada et al (1998). Pour
l'exon 3, une paire d'amorces exoniques a été utilisée :
For :5'-(Hex)AATTGTGACCTGGATCAGC-3' (SEQ ID NO :8) et
Rev :5'-CTGGACTTCCAGCTGGTGGTGAG-3' (SEQ ID NO :9).
Les amorces pour C328 étaient :
TTRForHex : 5'-(Hex)ACGTTCCTGATAATGGGATC-3' (SEQ ID NO: 10)
et
T1'R328Rev :5' ¨CCTCTCTCTACCAAGTGAGG-3' (SEQ ID NO :11).
De façon à obtenir des pics de hauteurs comparables dans chaque PCR
multiplexe et pour se situer dans la phase exponentielle pour chaque exon, les
conditions de PCR ont été ajustées de façon permanente (en suivant en partie
les
recommandations de Henegariu et al (Henegariu et al, 1997). En particulier,
les
températures d'hybridation et d'extension ont été diminuées et la
concentration de
MgC12 et la durée de l'extension ont été augmentées. De plus, les
concentrations
d'amorces ont été ajustées à partir d'une concentration standard de 0,81.1M,
selon
l'efficacité d'amplification (les concentrations d'amorces étaient diminuées
pour les
exons qui s'amplifiaient bien, et augmentées pour les autres).
Chaque combinaison d'exons a été testée pour vérifier que l'on situait dans la
phase exponentielle et ce, dans deux PCR multiplexes en parallèle pour les 3
combinaisons d'amorces, sur un individu témoin avec 22, 23 et 24 cycles. Les
hauteurs de pics ont été corrigées pour les variations de dépôts selon le
marqueur de
poids moléculaire interne (TAMRA 500 XL* d'Applied Biosystems). Les hauteurs
de
pics corrigées étaient comparées au nombre de cycles, et représentent, sur une
échelle
logarithmique, une droite ascendante qui démontre que l'on situe dans la phase
exponentielle pour les conditions suivantes:
* (marque de commerce)
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minutes à 95 C pour un cycle,
30 secondes à 95 C, 45 secondes à 53 C et 2,5 minutes à 68 C pendant 23
cycles,
5 minutes à 68 C pendant un cycle.
5 La réaction
était réalisée avec 40 ng d'ADN dans un volume de 25 1 de solution de
PCR, avec 3mM de MgC12, 0,2 mM dNTP et 1U Taq/25 1. La concentration de
chaque primer était:
Ex 2 (0,8 M), Ex 3(0,4 J.M), Ex 4 (1.0 M), Ex 5(0,6 M), Ex 6 (1,4 M), Ex 7
(o,44 M), Ex 8 (dans comb 1: 1,0 M et dans comb 2: 0,8 M), Ex 9(0,4 M), Ex
10 10 (1,04 M), Ex 11(0,8 M), Ex 12 (1,2 M) et C328 (1,92 M).
c)
Applications de la PCR multiplexe, contrôles internes et
électrophorèse
En règle générale, les PCR multiplexes ont été effectuées au moins dans deux
réactions parallèles pour chaque individu. Pour chaque série de patient, au
moins un
15 contrôle
positif (avec une délétion hétérozygote d'exons connus) et un contrôle négatif
(individu témoin) ont été traités en parallèle pour obtenir les valeurs
normales et
pathologiques pour chaque premix de réaction, de façon à éviter les résultats
erronés
dus à des différences possibles dans le premix (variation de pipetage). Deux
témoins
additionnels ont été ajoutés, qui ne contenaient pas d'ADN matrice. 1.5 à 2,5
1 du
20 produit de PCR
ont été mélangés avec 41.t1 de tampon de chargement (incluant 0.3i1 du
marqueur de taille TAMRA 500 XL d'Applied Biosystems). 1,5 1 de ce mélange a
été
chargé sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 4%, contenant 96 puits sur un
séquenceur automatique ABI 377. Les gels sont analysés par les logiciels
GeneScan
3.1 et Genotyper 1.1.1 (Applied Biosystems). Les hauteurs de pics sont
mesurées
25 comme indiqué dans Genotyper. Pour les doubles pics avec une paire de bases
de
différence (causées par le fait que la polymérase Taq ajoute inconstamment un
A à
chaque extrémité), les deux hauteurs de pics sont additionnées. Les rapports
de chaque
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combinaison de pics sont calculés pour chaque réaction, utilisant le logiciel
Excel* 5.0
(tableau 5) et les valeurs moyennes sont calculées pour deux réactions.
d) Interprétation
Pour les délétions, les résultats sont interprétés comme pathologiques si la
différence de rapport était un facteur d'au moins 1,6 ou 50,625 (=1/1,6) dans
tous les
rapports respectifs entre le témoin et le cas (ratio du sujet/ ratio du
control - tableau 5
relatif à la figure 4). Lorsque des différences de rapports entre les
réactions parallèles
sont discordantes (par exemple, à cause d'une amplification faible dans l'une
des
PCR), les rapports obtenus avec une amplification satisfaisante sont pris en
compte à
condition qu'ils soient normaux.
Pour les duplications, un changement des rapports d'un facteur 1,30-1,65 ou
>1,75 est interprété comme une duplication hétérozygote ou homozygote,
respectivement (en comparant la valeur haute à la valeur basse).
Pour une triplication, un changement des rapports d'un facteur 1,6-2,4 ou >2,6
est interprété comme une triplication hétérozygote ou homozygote,
respectivement
(en comparant la valeur haute à la valeur basse).
Cependant, comme les conditions ont été ajustées en permanence pendant le
développement de la méthode, quelques-uns des résultats ont été obtenus dans
des
conditions légèrement différentes. Ces résultats sont pris en compte
lorsqu'ils sont
clairement normaux ou pathologiques et reproductibles. Dans les situations
ambiguës,
l'expérience était répétée dans des conditions adaptées.
4. Analyse de la coségrégation et d'une population témoin
a) Mutations ponctuelles
Les variants de séquence de la Parkine ont été testés pour leur coségrégation
dans les familles (selon la disponibilité d'autres échantillons) et pour leur
présence
dans une population de témoins sans syndrome parkinsonien (61 à 73 individus).
A
cause du caractère certainement pathogène de la mutation 1142-1143delGA, des
témoins n'étaient pas testés pour cette mutation. Les techniques utilisées
sont PCR et
digestion avec l'enzyme de restriction appropriée ou électrophorèse en gel de
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polyacrylamide (PAGE = polyacrylamide gel electrophoresis) (voir tableau 2).
Quand
le variant ne provoquait pas de changement de site de restriction par lui-
même, un site
était artificiellement créé à l'aide d'une amorce avec un mismatch. Les
amorces
étaient conçues de façon à introduire le changement d'une base à proximité de
la
position du variant de séquence, de façon à créer un site de restriction qui
inclut ce
variant. Les amorces sont indiqués dans le tableau ci-dessous.
Amorces modifiées (non complémentaires de la séquence sauvage pour une base)
pour PCR :
Mutation Enzyme de Primer F Primer R
restriction
Asp280Asn Alw I Ex 7o For 5'-GGCAGGGAGTAGCCAAGTTGAGGAT-3'
(SEQ ID NO :12)
séquence sauvage G
Arg334Cys BstU I Ex 9 For 5'-AGCCCCGCTCCACAGCCAGCGC-3'
(SEQ ID NO :13)
séquence sauvage G
Le changement de paire de bases introduit est souligné par comparaison à la
séquence
sauvage.
b) Délétions ou multiplication d'exons homozygotes et hétérozygotes
La coségrégation d'une délétion ou d'une multiplication d'exons dans les
familles était analysée à l'aide des méthodes précédemment décrites. Une
population
contrôle n'a pas été testée en raison du caractère très probablement pathogène
des
mutations, qui entraîne une délétion interne de la protéine, avec ou sans
décalage du
cadre de lecture.
5. Analyse des liaisons génétique
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Pour tester la liaison au locus PARK2, quatre marqueurs de type
microsatellite, situés à proximité du locus, étaient testés (D6S1579, D6S411,
D6S1550 et D6S305) comme décrits par Tassin et al (1998).
5 C - Résultats
a) Dans une première série
d'expériences, l'analyse du gène de la
parkine a été réalisée chez le cas index de 38 familles avec AR-JP qui
comportent
87 patients.
I. Détection de délétions d' exons
10 L'amplification
des exons a révélé la présence d'une délétion à l'état
homozygote dans trois familles: délétion de l'exon 3 dans une famille
française (SAL-
024) et une portugaise (SAL-711), et des exons 8 et 9 dans une famille
algérienne
(DEL-001). Ces délétions se transmettent avec la maladie car elles sont
détectées dans
chaque famille à l'état homozygote chez tous patients mais pas chez les
apparentés
15 sains prélevés (figure 2).
2. Détection de mutations ponctuelles
L'analyse de séquence dans les familles sans délétion homozygote a révélé la
présence de 16 variants de la séquence nucléique: 12 dans les exons et 4 dans
les
introns (tableaux 2 et 3, figure 3). Trois variants entrainent un décalage du
cadre de
20 lecture et la synthèse d'une protéine tronquée. Il s'agit des mutations
202-203delAG
(G1n34Arg(Stop37)) et 255de1A (Asn52Met(Stop81)) dans l'exon 2 et 321-322insGT
(Trp74Cys(Stop81)) dans l'exon 3 trouvées respectivement dans les familles IT-
020 et
UK-086, TOU-096, LYO-119. Ces mutations, à l'exception de 202-203delAG sont à
l'état homozygote. Une mutation non sens 1459G>A (Trp453Stop) dans l'exon 12
est
25 présente à l'état homozygote dans la famille IT-006. Huit des variants
sont de type
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faux sens. Dans l'exon 4, 584A>T (Lys161Asp) et 601G>A (Ser167Asn) sont à
l'état
hétérozygote chez les patients des familles IT-020 et SAL-730, respectivement.
Dans
l'exon 7, les variants 867C>T (Arg256Cys) et 924C>T (Arg275Trp) sont trouvés à
l'état hétérozygote dans les familles DE-012 et IT-015, respectivement. Dans
l'exon
5 10, le variant 1239G>C (Va1380Leu) est trouvé à l'état hétérozygote et
homozygote
dans Il familles (IT-014, IT-020, IT-058, SAL-017, GRE-029, SAL-038, TOU-096,
SAL-431,UK-006, UK-086, DE-022). Dans l'exon 11, le variant 1281G>A
(Asp394Asn) est détecté à l'état hétérozygote dans la famille UK-046 et
1345C>A
(Thr415Asn) à l'état homozygote dans la famille IT-014. Enfin, le variant
768C>T
10 (Pro223Ser) n'est pas pathogène, car il est détecté à l'état homozygote
chez tous les
individus séquences suggérant qu'il s'agit d'une erreur typographique dans la
séquence
de la parkine [Kitada et al., 1998]. La recherche de ces variants dans la
population
témoin révèle que trois d'entre eux représentent des polymorphismes (tableau
2) :
Ser167Asn, Va1380Leu et Asp394Asn. Les autres variants constituent très
15 probablement des mutations causales car ils entrainent la synthèse de
parkine
tronquée ou des substitutions non conservatives ou des substitutions portant
sur un
des acides aminés susceptible d'être phosphorylés. De plus, ils ségrègent avec
la
maladie dans les familles et ne sont pas détectés dans 90 chromosomes de
témoins.
Les variants identifiés dans les introns 2, 3, 6 et 7 (IVS2+25T>C
20 (272+25T>C), IVS3-20C>T (514-20C>T), FVS6+19T>C (835+19T>C) et FVS7-
35A>G (973-35A>G)) constituent des polymorphismes (tableau 2). Ils ne sont pas
localisés à proximité des sites d'épissage et sont détectés dans les
chromosomes de
témoins.
3. Domaines fonctionnels de la Parkine
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3/
Une étude des domaines fonctionnels de la parkine a été entreprise par
analyse et comparaison de séquences. Cette étude montre que le changement
conservatif d'acide aminé Thr415Asn est localisé dans la séquence consensus
d'une
protéine kinase cAMP- et cGMP-dépendante (KKTT) et dans le site de
5 phosphorylation d'une protéine kinase C (TTK). Cette étude montre en
outre que la
mutation non-sens Trp453Stop est localisée dans un site N-terminal de
myristoylation
(GCEWNR).
4. Corrélations phénotype génotype
Les délétions homozygotes et les mutations ponctuelles ont été détectées
10 dans 12 familles qui comportent 26 patients. L'âge moyen de début est de
36,7 ans
avec des extrèmes de 7 à 56 ans (tableau 3). La comparaison entre les familles
selon
les conséquences fonctionnelles des mutations (délétion homozygote, mutation
tronquante et mutation faux sens) ne révèle pas de différences significative
de l'âge de
début, de la sévérité ou de la fréquence des signes associés, sauf pour le
tremblement
15 qui est significativement moins fréquent dans les familles avec une
délétion
homozygote, comparé aux familles avec des mutations tronquantes (tableau 3).
b) Détection de nouvelles mutations ponctuelles
Huit nouvelles mutations ponctuelles dans des exons ont été identifiées, dont
20 six sont des mutations faux-sens, une tronquantes et une non-sens:
734A>T
(Lys211Asn) dans l'exon 6, 905T>A (Cys268Stop), 939G>A (Asp280Asn) et
966T>G (Cys289Gly) dans l'exon 7, 1084G>A (Gly328G1u), 1142-1143delGA et,
1101C>T (Arg334Cys) dans l'exon 9 et 1390G>A (Gly430Asp) dans l'exon 12. Cinq
des mutations faux-sens conduisent à des changements d'acides aminés non
25 conservatifs et une à un changement conservatif (Cys289Gly). De plus,
une délétion
de cinq paires de bases dans l'intron 8, localisée aux positions ¨21 à ¨17 par
rapport à
l'exon 9 a été mise en évidence. Tous ces variants de séquence n'ont pas été
détectés
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chez 61 à 73 individus témoins (la mutation 1142-1143delGA n'étant pas testée)
et ne
représentent donc pas des polymorphismes. Les résultats sont détaillés dans le
tableau 2.
c) Détection de nouvelles délétions homozygotes d'exons
Des délétions homozygotes d'exons ont été détectées dans 3 familles en plus
des délétions rapportées précédemment par Hattori et al (I 998a) et Lücking et
al
(1998) pour l'exon 3 et par Hattori et al (1998a) pour les exons 3+4. Ces
délétions
concernent les exons 3 (FDP-ANG-GEO-141), 3+4 (IT-064) et 5+6 (SPD-LIB-HAG-
076). Les conséquences des délétions d'exons sur le cadre de lecture et leur
fréquence
relative dans l'échantillon sont indiquée dans le tableau 4.
d) Détection des duplications/triplications homozygotes et hétérozygotes
Cinq nouveaux types de duplications d'exons ont été détectés: une duplication
de l'exon 3 à l'état homozygote (SPD-NIC-AIT-091) et une duplication de l'exon
3 à
l'état hétérozygote (SAL 399 213). En plus, des duplications hétérozygotes de
l'exon 6
(FPD-LIL-CHA-171), de l'exon 7(DE 4001) et de l'exon 11 (SAL 399 213) ont été
détéctées.Deux types de triplication ont été détectés: une triplication de
l'exon 2 à
l'état homozygote (RM 347) et a l'état hétérozygote (RM 330).
e) Détection de nouvelles délétions hétérozygotes
Treize différentes combinaisons de délétions hétérozygotes d'exons ont été
mises en évidence dans 21 familles. Les délétions suivantes ont été observées:
exons
2, 2+3, 2+3+4, 3, 3+4, 3-6, 3-9, 4, 5, 6, 6+7, 7+8+9 et 8. Les délétions
d'exons 2,
2+3, 2+3+4, 3-6, 3-9, 6, 6+7, 7+8+9 et 8 sont nouvelles.
Pour deux familles (Sal-Hab-436 et UK 12416), il n'a pas pu être établi avec
certitude si les mutations hétérozygotes des exons 2+3 ou 6-7, respectivement,
étaient
situées sur le même chromosome ou s'il s'agissait des cas hétérozygotes
composites à
cause de l'absence d'ADN pour d'autres membres de ces familles. Les
conséquences
des délétions et des multiplication d'exons décrites sur le cadre de lecture
et leur
fréquence relative dans notre échantillon sont indiquées dans le tableau 4.
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fi Mutations ponctuelles récurrentes
Cinq mutations ponctuelles ont été mises en évidence dans plus d'une famille.
Ces mutations sont 202-203delAG (à l'état hétérozygote ou homozygote dans
familles), 255delA (à l'état homozygote ou hétérozygote dans 6 familles),
5 Lys211Asn (à l'état hétérozygote dans 2 familles), et Arg275Trp (à l'état
hétérozygote dans 5 familles).
Fréquences des différents types de mutations et des hétérozygotes
composites
Parmi les familles avec des mutations de la Parkine, des délétions
homozygotes d'exons ont été détectées dans 8 familles, des mutations
ponctuelles à
l'état homozygote dans 10 familles, une duplication d'exon homozygote dans une
famille et une triplication d'exon dans une famille. Les patients de 21
familles étaient
hétérozygotes composites pour deux mutations différentes (3 fois pour les
mutations
ponctuelles différentes, 6 fois pour une mutation ponctuelle et une délétion
d'exon,
deux fois pour une mutation ponctuelle et une duplication, une fois pour une
triplication et une délétion d'exon, une fois pour deux duplications d'exon
différentes
et 6 fois pour deux délétions différentes d'exons; voir exemple figure 4).
Dans deux
cas, il n'était pas possible de déterminer s'il s'agissait d'hétérozygotes aux
délétions
de plusieurs exons adjacents composites, et dans 13 cas, seule une mutation à
l'état
hétérozygote (6mutations ponctuelles et 7 mutations d' exons) était détectée.
D) Discussion
La présente invention se rapporte à des variants du gène de la Parkine, leur
utilisation diagnostique et/ou thérapeutique, ainsi que des techniques pour la
détection
d'altérations (notamment de délétions d'exons hétérozygotes et de
multiplications
d'exons) du gène de la Parkine.
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La mise en évidence de différentes altérations génétiques (notamment de
délétions homozygotes, de mutations ponctuelles, d'insertions et de
multiplications
d'exons) causales démontre que les anomalies du gène de la parkine constituent
une
cause fréquente d'AR-JP.
5 1. Première étude sur 38 familles européennes
Une première étude a permis de mettre en évidence l'existence de délétions,
mutations et insertions dans le gène de la parkine.
Le rôle pathogène des délétions homozygotes parait facile a établir. Dans les
2 mutations décrites, délétions de l'exon 3 et des exons 8-9, la perte de
l'exon
10 s'accompagne d'un décalage du cadre de lecture conduisant à l'apparition
d'un codon
de terminaison prématuré. En l'absence d'épissage alternatif, il en résultera
un
protéine tronquée.
Huit des variants exoniques constituent des mutations causales.
Premièrement, ces mutations ségrègent avec la maladie dans les familles.
15 Deuxièmement, ces variants ne sont pas détectés par ASO, PAGE ou
PCR/restriction
dans 90 chromosomes de témoins. Troisièmement, les conséquences fonctionnelles
des mutations apparaissent délétères. Il est facile de concevoir que les 4
mutations
ponctuelles tronquantes (GIn34Arg(Stop37), Asn52Met(Stop81), Trp74Cys(Stop81),
Trp453Stop), détectées à l'état homozygotes chez les patients de 3 des 5
familles, vont
20 causer une perte de fonction de la parkine en accord avec la
transmission autosomique
récessive de la maladie. Trois des quatre mutations faux sens entraînent des
changements non conservatifs d'acides aminés. L'un d'entre eux (Lys161Asp) est
associé à une mutation tronquante sur l'autre allèle qui renforce l'hypothèse
d'un rôle
pathogène. Une mutation faux sens est conservative (Thr415Asn), mais affecte
un site
25 potentiel de phosphorylation. Trois des mutations faux sens sont
présentes à l'état
hétérozygote chez des patients dont l'autre mutation n'a pas été caractérisée.
Il est
probable qu'il s'agit de délétions d'un ou plusieurs exons à l'état
hétérozygote qui ne
peuvent être visualisées avec les techniques utilisées pour cette étude.
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Les anomalies du gène de la parkine mises en évidence sont variées et il
n'existe pas de hot spot de mutations. Il faut noter que les mutations
ponctuelles
tronquantes correspondent préférentiellement aux régions N- et C-terminales de
la
parkine (comprenant en particulier les motifs ubiquitine-like et en anneau
"RING-
S finger", respectivement) alors que les mutations de type faux sens
affectent la région
centrale. Seules deux des 11 mutations décrites dans cette première étude sont
rencontrées dans plusieurs familles. La délétion homozygote de l'exon 3 est
détectée
dans les familles française SAL-024 et portugaise SAL-711. La mutation avec
décalage du cadre de lecture 202-203delAG (G1n34Arg(Stop37)) est visualisée à
l'état
hétérozygote dans les familles italiennes IT-020 et anglaise UK-086. L'origine
différente des familles est en faveur de l'hypothèse de la survenue
indépendante de ces
mutations.
Les mutations décrites affectent des familles provenant de 6 pays: Algérie,
Allemagne, Angleterre, France, Italie et Portugal. L'étude du phénotype dans
les
familles avec une mutation montre que le spectre clinique associé aux
anomalies de la
parkine est plus étendu que dans les familles japonaises [Kitada et al.,
1998]. Ces
résultats confirment les observations faites dans des familles Européennes et
d'Afrique du Nord étudiées par liaisons génétiques [Tassin et al., 1998].
L'age de
début est supérieur à 50 ans chez plusieurs patients, allant jusqu'à 56 ans.
Certains
signes cliniques tels que la dystonie ou les signes pyramidaux aux membres
inférieurs
ne sont pas toujours présents chez les porteurs de mutation même après des
durées
d'évolution de plusieurs décennies. Globalement le phénotype reste très
similaire
entre les groupes de patients classés selon les conséquences fonctionnelles
des
mutations. Cependant, la présence d'épisodes de dystonie douloureuse semble
rencontrée exclusivement chez les patients porteurs de délétions homozygotes.
L'absence de différence significative pour l'âge de début, la sévérité et la
fréquence
des signes associés entre les mutations ponctuelles tronquantes et les faux
sens
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WO 00/31253 PCT/FR99/02833
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suggère que les acides aminés modifiés dans ces dernières jouent un rôle
important
dans la physiologie de la parkine.
En conclusion, cette première étude souligne la fréquence des mutations du
gène de la parkine dans les syndromes parkinsoniens familiaux de début précoce
en
Europe. Des anomalies de ce gène sont aussi à l'origine de syndromes
parkinsoniens
plus tardifs ou atypiques. Il reste à déterminer le rôle de mutations de la
parkine ou de
ses polymorphismes dans les cas isolés. Les mutations détectées sont très
diverses
tant par leur nature que par leur localisation. L'étude de leur localisation
dans la
parkine suggère que de nombreuses régions de la protéine concourent à sa
fonction,
encore inconnue.
2. Méthode de détection des
délétions d'exons et des multiplications
d'exons
Pour la première fois, la détection de délétions d'exons à l'état hétérozygote
et
de multiplications d'exons (p.ex. duplication, triplications) à l'état
homozygote et
hétérozygote dans le gène de la Parkine est décrite. Cet aspect est
intéressant car les
délétions d'exons sont relativement fréquentes (voir plus loin). Comme méthode
de
détection, un protocole de PCR multiplexe semi-quantitative a été choisi et
mis au
point. Cette méthode avait précédemment été validée pour le dosage génique,
par
exemple pour la détection de délétions du gène PMP22 (Poropat et Nicholson,
1998),
à condition que l'amplification par PCR soit dans la phase exponentielle. Dans
toutes
ces expériences, le choix de témoins co-amplifiés qui servent de standard pour
la
quantification est crucial (Prior, 1998). Dans l'expérience, les exons non
délétés
servent de témoins internes dans l'amplification par PCR multiplexe chez le
même
individu. Les combinaisons de 4 ou 5 exons ont été choisies de façon à ne pas
contenir plus de 2 exons adjacents, car de tels exons ne peuvent pas servir de
contrôles dans le cas d'une délétion des deux. L'exon d'un gène différent
(Transthyrétine) a été co-amplifié dans l'une des trois combinaisons pour
identifier
des délétions hétérozygotes de l'ensemble du gène Parkine. Ce contrôle externe
était
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,
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indirectement représenté dans les deux autres combinaisons, qui incluent des
exons de
par et autre de l'exon 9; ce dernier étant testé avec la Transthyrétine.
Les résultats obtenus par cette méthode étaient très reproductibles et les
résultats anormaux montrent des différences dans les rapports d'un facteur,
qui
correspond à celui attendu en théorie. Ces résultats montrent qu'il s'agit
d'une
méthode simple et validée pour un criblage rapide. De plus, des petites
délétions ou
insertions dans le produit PCR, qui sont relativement fréquentes (voir ci-
dessous)
peuvent être détectées simultanément par cette méthode.
3. Délétions d'exons et multiplications d'exons
Il a été possible d'identifier quatre duplications d'exons et une triplication
d'exons jamais décrites dans le gène de la Parkine auparavant, mais dont la
fréquence
relative est faible. De plus, 10 combinaisons de délétions d'exons nouvelles
ont été
identifiées avec, pour la première fois, la démonstration des délétions qui
emportent
l'exon 2. La fréquence relative des mutations ponctuelles et des délétions
d'exons a
été estimée à environ 50%. Ainsi, les délétions d'exons (hétérozygotes ou
homozygotes) peuvent représenter jusqu'à 50% des mutations de la Parkine,
soulignant l'intérêt de la technique décrite ici. De fait, cette technique a
permis de
détecter des mutations dans 26 des 53 familles. Ainsi, dans l'échantillon
étudié les
mutations ponctuelles et les délétions dans le gène de la Parkine ont la même
fréquence, alors que les délétions d'exons sont majoritaires dans la
population
japonaise (Hattori et al, 1998). Les conséquences fonctionnelles des délétions
ou des
multiplications d'exons décrites (décalage du cadre de lecture ou
délétion/multiplication en phase) ont été déduites des séquences d'ADNc
publiées de
la Parkine (Kitada et al, 1998) et sont spéculatives, car l'absence de produit
de PCR
n'indique pas qu'il y a forcément délétion de l'exon dans sa totalité (voir ci-
dessus).
Cependant, le rôle pathologique des modifications détectées est très probable,
car
elles se transmettent avec la maladie dans les familles qui ont pu être
testées, elles
sont associées à des mutation ponctuelles chez des hétérozygotes composites et
les
délétions sont identifiées avec une fréquence similaire à celle des mutations
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ponctuelles. De même, dans les cas isolés, la fréquence des délétions
hétérozygotes et
des mutations ponctuelles est similaire. Dans le cas de l'exon 3, des amorces
exoniques ont été utilisées, qui démontrent l'altération de cet exon lorsqu'il
n'y a pas
de produit de PCR. En plus, dans une partie des cas, plusieurs exons
juxtaposés
étaient délétés simultanément, ce qui est un argument pour une grande délétion
génomique.
Des délétions ou des multiplications hétérozygotes de l'ensemble du gène de
la Parkine n'ont pas été observées. Il s'agit probablement d'un événement rare
compte
tenu de la très grande taille (environ 500 kb) de ce gène (Kitada et al,
1998).
Les délétions d'exons observées touchent fréquemment les exons 3 à 5. Cette
observation est confirmée dans les familles européennes. De plus, il est
démontré que
l'exon 2 seul ou associé à d'autres, est aussi fréquemment impliqué dans les
familles
européennes (tableau 2).
4. Nouvelles mutations ponctuelles
L'identification de 8 nouvelles mutations ponctuelles (6 de type faux-sens, 1
tronquantes et 1 de type non-sens) augmente la diversité des mutations
ponctuelles du
gène de la Parkine. Les mutations décrites sont pathogènes, comme a montré la
ségrégation avec la maladie, et ne sont pas détectées chez 122 à 147
chromosomes de
témoins (la mutation 1142-1143delGA pas inclue). Même si le changement
Cys289Gly est conservatif, ce changement d'acide aminé peut avoir des
conséquences
délétères importantes, si la cystéine en position 289 est impliquée dans un
pont
disulfure, important pour la fonction de la protéine.
De façon intéressante, 2 patients de la famille UK-040 présentent 3 mutations
différentes (voir tableau 5) : une mutation faux-sens Arg334Cys dans l'exon 9
à l'état
homozygote, une délétion homozygote de 5 paires de bases en position -17 à -21
de
l'intron 8, et une mutation faux-sens non conservative Asp280Asn à l'état
hétérozygote. On peut suspecter que la mutation Arg334Cys à l'état homozygote
est
causale, mais la délétion de cinq paires de base à l'état homozygote, à
proximité du
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site accepteur épissage de l'exon 9, pourrait aussi avoir des conséquences
fonctionnelles.
Cinq mutations ponctuelles sont présentes dans plusieurs familles analysées.
Les trois plus fréquentes sont 255delA (détectée dans 6 familles) et 202-
203delAG
5 (trouvée dans 5 familles) et Arg275Trp (détectée dans 5 familles). Un
effet fondateur
pourrait être suspecté pour la mutation 255delA qui touche 5 familles
françaises.
Cependant, cette hypothèse ne pourra être vérifiée que par l'analyse des
haplotypes.
.5. Génétique épidémiologique
10 Les résultats obtenus montrent que 34 des 77 familles avec un syndrome
parkinsonien de début précoce présentent des mutations du gène de la Parkine,
soulignant l'importance de ce gène dans les familles européennes. La détection
de
mutations dans 18 des 102 cas isolés et analysés est plus difficile à
interpréter car
l'effectif est plus petit et l'analyse de certains cas n'est pas complète.
Cependant, il
15 est frappant de constater que l'âge de début des 7 cas pour lequel il
est connu est
particulièrement précoce (13 à 22 ans) et qu'il y a très peu de cas à début
très précoce
sans mutation du gène de la Parkine (par exemple, IT-NA-JMP-3). Ce résultat
suggère que la fréquence des mutations du gène de la Parkine dans des cas
isolés croît
lorsque leur âge décroît, spécialement avant l'âge de 25 ans. L'observation de
20 mutations du gène de la Parkine dans des cas isolés n'est pas
surprenante si l'on
considère que dans des familles de petite taille, une maladie autosomique
récessive a
toutes les chances d'apparaître comme un cas isolé. L'analyse d'un échantillon
plus
large sera utile pour déterminer précisément la fréquence des mutations de la
Parkine
chez les cas isolés, selon l'âge de début.
25 Des mutations ont été identifiées dans des familles d'origines très
variées :
France, Italie, Grande Bretagne, Allemagne, Pays Bas, Algérie, Portugal. Ces
résultats
montrent que les mutations du gène de la Parkine sont mises en évidence dans
toutes
les populations testées jusqu'à présent.
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41
6. Patients avec une anomalie du gène de la Parkine à l'état
hétérozygote
Bien que la technique de détection des délétions hétérozygotes d'exons ou des
multiplications d'exons nous ait permis d'identifier des cas hétérozygotes
composites,
dans environ 1/4 des familles (13 sur 53) une seule mutation a été détectée.
Il s'agit de
6 cas avec une mutation ponctuelle à l'état hétérozygote et de 7 avec une
délétion
d'exon à l'état hétérozygote. Le rôle pathogène de ces mutations est très
probable, car
ils causent un changement d'acide aminé non conservatif ou une protéine
tronquée.
De plus, une de ces mutations de type faux-sens (Arg275Trp) est associée à une
autre
mutation ponctuelle hétérozygote (Gly430Asp) et à des délétions d'exon
hétérozygotes (exon 3-6 ou exon 5+6), portée par l'autre allèle dans trois
familles
différentes. L'absence de détection d'une mutation sur l'autre allèle dans 13
familles
suggère qu'une seconde mutation non détectée affecte une autre région du gène.
Cette
hypothèse est renforcée par le fait que dans 6 familles probablement liées au
locus
PARK2, car les patients sont haploidentiques pour 4 marqueurs de la région,
aucune
mutation n'a été détectée. Ainsi, d'autres régions du gène pourraient être
affectées,
telles que les régions promotrices, les régions 5' et 3' non traduites, ou des
séquences
introniques.
7. Hétérogénéité génétique des syndromes parkinsoniens autosomiques
récessifs de début précoce
Dans 5 des 77 familles, une liaison génétique au locus Parkine a pu être
exclue. De plus, aucune mutation n'a été identifiée dans 21 familles pour
lesquelles ce
locus n'a pas pu être formellement exclu. Ces résultats suggèrent qu'il
pourrait exister
au moins un autre locus pour des familles avec un syndrome parkinsonien
autosomique récessif de début précoce en Europe. Cette hypothèse avait été
proposée
par Leroy et al (1998), qui rapporte une famille avec deux branches, dont
l'une
présente des délétions du gène de la Parkine, alors que l'autre ne présente ni
ces
délétions ni le même haplotype, ce qui exclu une liaison à ce locus.
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8. Conclusions
Une nouvelle méthode pour la détection de délétions hétérozygotes d'exons
ou des multiplications d'exons est rapportée. En particulier, les
duplications/triplications d'exons et des délétions de l'exon 2 et d'autres
5 combinaisons
d'exons sont nouvelles. En combinaison avec le séquençage d'exons,
huit nouvelles mutations ponctuelles et une délétion intronique qui pourrait
affecter
un site d'épissage, ont pu être identifiées. Ainsi, 34 des 77 familles
analysées (environ
50%) présentent des mutations du gène de la Parkine. De plus, les mutations de
ce
gène ont été détectées dans 19 cas isolés. Dans la population européenne, la
10 proportion de
mutations ponctuelles et de délétions d'exons semble identique. Deux
points chauds de mutations qui correspondent pour les délétions aux exons 3 à
5 et à
trois mutations ponctuelles (202-203delAG, 255delA et Arg275Trp) ont, en
outre, été
mis en évidence.
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47
TABLEAU 1
Position Changement Séquence oligonucléotidique
de nucléotide
Ex3 321-322insGT WT:5'-TGCAGAGACC=GTGGAGAAAA-3' (SEQ ID
N :14)
V: 5'-GCAGAGACCGTGTGGAGAAA-3' (SEQ ID N :15)
Ex4 584A>T WT: 5'-GCCGGGAAAACTCAGGGTA-3' (SEQ ID N
:16)
V: 5'-GCCGGGAAATCTCAGGGTA-3' (SEQ ID N :17)
Ex7 867C>T WT: 5'-TGCAACTCCCGCCACGTGA-3 (SEQ ID N
:18)
V: 5'-TGCAACTCCTGCCACGTGA-3' (SEQ ID N :19)
Ex10 1239G>C WT: 5'-TGCAGTGCCGTATTTGAAG-3' (SEQ ID N :20)
V: 5'-TGCAGTGCCCTATTTGAAG-3' (SEQ ID N :21)
Exil 1345 C>A WT: 5'-AGAAAACCACCAAGCCCTG-3' (SEQ ID N
:22)
V: 5'-AGAAAACCAACAAGCCCTG-3' (SEQ ID N :23)
,
,
TABLEAU 2
0
crt
nucléotide ainino acide changé/ type de mutation
technique de longueur attendue du uè
changé position du codon stop détection
fragment en bp
ut
ct,
exonique
Ex2 202-203deIAG Gln34Arg(Stop37) cadre de lecture
PAGE WT: 308
V:306
Ex2 255de1A Asn52Met(Stop81) cadre de lecture
FokI WT: 278+30
création de site V:
222+57+30
Ex3 321-322insGT Trp74Cys(Stop81) _ cadre de lecture
ASO
o
Ex4 584A>T Lys161Asn faux-sens ASO
0
tv
, (non conservative)
co
.4
Ex4 601G>A Ser167Asn faux-sens AlwN I
WT: 164+97 tv
(conservative) perte du site
V: 261 co co
1-
Ex6 734A>T Lys211Asn faux-sens Dra I
WT: 171+98 tv
(non conservative) perte du site V: 269 ct
1-
Ex7 867C>T . Arg256Cys faux-sens
ASO e
i
i-
, (non conservative)
1-
i
Ex7 905T>A Cys268Stop non-sens Dde 1
WT: 141+100 tv
m
gain de site V:
117+100+24
Ex7 924C>T Arg275Trp faux-sens Sau3A 1
WT: 142+97
(non conservative) perte du site V: 239
Ex7 939G>A Asp280Asn faux-sens AlwI avec
WT: 153+30
(non conservative) amorce à V: 183
mismatch
-ri
perte du site
n
-i
Ex7 966T>G Cys289Gly faux-sens BstN I
WT: 177+64 .21
(conservative) gain de site V: 118+64+59 s?g
_
.rt
Ex 9 1142-1143delGA Arg348Glu (Stop368) cadre de lecture -
PAGE WT: 278 e
t.)
00
V:276
(..,
tel
'
TABLEAU 2 (suite)
0
Ex9 1084G>A 61y328G1u faux-sens Mn1 I WT:
124+80+74
(non conservative) gain de site
V:124+74+60+20 ....La
k..>
-
CA
Ex9 110IC>T Arg334Cys faux-sens BstU 1 avec WT:
123+21 f..)
(non conservative) amorce à
V:144
mismatch
perte du site
Ex10 1239G>C Va1380Leu faux-sens ASO
(conservative) _
Exil 1281G>A Asp394Asn faux-sens Taq I WT:
221+84 o
(non conservative) perte du site V:
303
0
Exil 1345C>A Thr415Asn faux-sens ASO
tv
co
(conservative)
-4
tv
Ex 12 1390G>A Gly430Asp faux-sens Mn11 WT:
191+65 -rû.
ol
co
(non conservativ_e) perte du site V:
256 1¨
Ex12 I459G>A Trp453Stop non-sens Nia IV
WT: 142+17+35+61 iv
0
perte du du site V:
159+35+61 e
i
intronique
i-
_
1¨
Intron 2 IVS2+25T>C BstN I
WT: 308 bpF)
(272+25T>C) création de site V: 264+44 bp
0,
Intron 3 IVS3-20C>T MnI I WT:
201+60
(514-20C>T) perte du site V: 261
lntron 7 IVS7-35A>G Mae III
WT: 206
(973-35A)G) création de site V: 159+47
lntron 8 IVS8-21-17del splice site PAGE
(1035-21-17del)
0
TCTGC
--)
?t0:1
v0
cl,
t.)
00
t.,
u,
,
,
TABLEAU 3
CARACTÉRISTIQUES CLINIQUES DES FAMILLES AVEC MUTATIONS DU GENE DE LA PARKINE
0
cz.
0
(-J
r..=
t..
Délétions Mutations faux sens Mutations tronquantes
Total t/1
(..,
homozygotes _
Familles (Patients) 3(8) 3(8) 4 (9) 10(25)
Age moyen de début
30 16 (7-55) 44 9(30-56) 37 6 (29-45) 37 12(7-
56)
(extrêmes)
Durée moyenne d'évolution 13 6 (3-20) 13 7 (0.5-27) 16
10 (3-29) 14 8(0,5-29) 0
(extrêmes)
o
Echelle de Hoehn et Yahr 3.1 1.2 2.6 0.8 2.0 0.6 2,5
0,98 tv
co
.4
8/8 8/8 8/9 96%
vl tv
oi
Akinésie
cD co
Rigidité
1¨
8/8 8/8 9/9 100%
tv
o
Tremblement
3/8 4/8 8/9 60%
1¨
e
i
4/8 0/5 1/7 25%
1¨
Dystonie
1¨
i
tv
Bonne réactivité à la levodopa 7/7 (1) 6/6 (2) 7/7
100% 0,
(cas de novo)
Dyskinésies 4/7 5/6 6/9 68%
Fluctuations' 7/7 ND 2/6 62%
Réflexes vifs aux MI 2/8 3/4 0/6
28% -o
n
¨a
x
%D
s=D
O
t.)
00
(eJ
Ceà
C
GD
TABLEAU 4
t.,
tn
w
exon(s) nombre de familles conséquences
délété(s)/multiplié(s)
2 del 3 x het Décalage du cadre de lecture
2 triplication lx hom + lx het Pas de décalage du cadre de lecture
2+3 del 1 x het Pas de décalage du cadre de lecture
2+3+4 del 1 x het Décalage du cadre de lecture
o
3 del 3 x hom + 7 x het Décalage du cadre de lecture
cp
3 duplication lx hom + lx het Décalage du cadre de lecture
tv
3+4 del 1 x hom +3 x het Pas de décalage du cadre de lecture
...]
tv
3-6 del lx het Décalage du cadre de lecture
c..,
¨
Ln
op
1-
3-9 del 1 x het Pas de décalage du cadre de lecture
tv
4 del 1 x hom +3 x het Décalage du cadre de lecture
1-
e
del 3 x het Pas de décalage du cadre de lecture
i
1-
5+6 del 2 x hom Décalage du cadre de lecture
1-
i
tv
6 del 1 x het Décalage du cadre de lecture
0,
6 duplication lx het Décalage du cadre de lecture
6+7 del lx het Décalage du cadre de lecture
_
7 duplication lx het Décalage du cadre de lecture
7+8+9 del 1 x het Décalage du cadre de lecture
8 del 1 x het Décalage du cadre de lecture
8+9 del 1 x hom Décalage du cadre de lecture
n
-3
11 duplication lx het Décalage du cadre de lecture
?cg
".,
ce
c..,
w
o
TABLEAU 5
cas 3! 12 9 2 C328 C328/31 C328/12 C328/9 C328/2 Ex31/12
Ex3i/9 Ex3i/2 Ex12/9 Ex12/2 Ex9/2
T2 743 838 1040 935 455 0.61 0.54 0.44 0.49 0.89 0.71 0.79 0.81 0.90 1.11
FR 155 5 608 1245 1588 1466 635 1.04 0.51 0.40 0.43
0.49 0.38 0.41 0.78 0.85 1.08
T2/FR 155 5 0_59 1.06 1.09 1.12 1.82
1.87 1.92 1.03 1.06 1.03
co
FR 155 6 759 861 1120 540 498 0.66 0.58 0.44 OE92
0.88 0.68 1.41 0.77 1.59 2.07
co
T2/FR 155 6 0.93 0.94 0.98 0.53 1.01
1.05 OE57 1.05 0.56 0.54
o
FR 155 8 597 1185 1467 766 623 1.04 0.53 0.42 0.81
0.50 OE41 0.78 0.81 1.55 1.92
T2/FR 155 8 0.59 1.03 1.03 0.60 176
1.76 1.02 1.00 0.58 0.58
FR 155 9 495 1200 1438 754 688 1.39 0.57 0.48
0.91 0.41 0.34 0.66 0.83 1.59 1.91
T2/FR 155 9 0.44 0.95 0.91 0.53 2.15
2.08 1.21 0.97 0.56 0.58
2
