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Procédé pour la fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat
cellulosique
DOMAINE TECHNIQUE AUQUEL SE RAPPORTE L'INVENTION
La présente invention concerne de manière générale le domaine des
nanocelluloses, et plus particulièrement les procédés pour la fabrication de
ces
nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique.
ARRIERE- PLAN TECHNOLOGIQUE
La cellulose est un des polymères naturels les plus importants, une matière
première quasi inépuisable, et une source importante de matériaux durables à
l'échelle
industrielle.
A ce jour, différentes formes de cellulose ont été identifiées avec une
dimension
de l'ordre du nanomètre, désignées sous le nom générique de nanocelluloses
.
Les propriétés de ces nanocelluloses, notamment leurs propriétés mécaniques,
leur capacité à former des films et leur viscosité, leur confèrent un intérêt
majeur dans de
nombreux domaines industriels.
Les nanocelluloses sont ainsi utilisées par exemple en tant qu'additif
dispersant
ou stabilisant dans les industries papetière, pharmaceutique, cosmétique ou
agroalimentaire. Elles entrent également dans la composition de peintures et
de vernis.
Les nanocelluloses sont également employées dans de nombreux dispositifs
nécessitant un contrôle de la porosité nanométrique, en raison de leur surface
spécifique
élevée.
Enfin, de nombreux matériaux nanocomposites à base de nanocelluloses sont
actuellement développés. En effet, les propriétés mécaniques remarquables des
nanocelluloses, leur dispersion à l'échelle nanométrique ainsi que leur
caractère
hydrophile, leur confèrent des propriétés barrières au gaz excellentes. Ces
caractéristiques suscitent notamment un intérêt important pour la fabrication
d'emballages
barrières.
Sur la base de leurs dimensions, fonctions et méthodes de préparation, qui
elles-mêmes dépendent principalement de la source cellulosique et des
conditions de
traitement, les nanocelluloses peuvent être classées principalement dans deux
familles :
les fibrilles de cellulose et les nanocristaux de cellulose.
Les nanocristaux de cellulose (dits encore nanocelluloses cristallines ou
NCCs pour nanocrystalline cellulose ) sont en général obtenus par une
hydrolyse avec
un acide fort dans des conditions strictement contrôlées de température, de
durée et
d'agitation. Un tel traitement permet d'attaquer les régions amorphes des
fibres tout en
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laissant les régions cristallines, plus résistantes, intactes. La suspension
obtenue est
ensuite lavée par des centrifugations et des dialyses successives dans l'eau
distillée. Les
NCCs les plus classiquement obtenus ont une longueur de quelques dizaines de
nanomètres à environ 1 lm (notamment de 40 nm à 1 lm et de préférence de 40 nm
à
500 nm), et un diamètre allant de 5 à 70 nm, de préférence inférieur à 15 nm
(typiquement de 5 à 10 nm).
Les fibrilles de cellulose, couramment désignées microfibrilles de cellulose
(dites encore cellulose microfibrillée ou MFC pour microfibrillated
cellulose ) ou
nanofibrilles de cellulose (NFC pour nanofibrillated cellulose ) sont
typiquement isolées
à partir de matériaux cellulosiques issus de la biomasse, par des procédés
mécaniques
permettant de délaminer les fibres de cellulose et de libérer les fibrilles de
cellulose.
Par exemple, le document US 4 483 743 décrit un procédé de fabrication de
cellulose microfibrillée, qui implique le passage d'une suspension liquide de
cellulose au
travers d'un homogénéiseur type Gaulin à haute pression. Des passages répétés
de la
suspension de cellulose permettent d'obtenir des microfibrilles ayant
typiquement une
largeur allant de 25 à 100 nm et une longueur bien plus importante.
De manière générale, les procédés mécaniques d'obtention de fibrilles de
cellulose ont l'inconvénient de consommer d'importantes quantités d'énergie. A
titre
d'exemple, il a été évalué que l'utilisation d'un homogénéiseur entraîne une
consommation d'énergie de l'ordre de 70000 kWh/t. Cette consommation
énergétique
importante, et en corollaire les coûts élevés de la production de
nanocelluloses, restent
donc un frein considérable à leur développement industriel.
Différentes stratégies de prétraitements des fibres de cellulose ont ainsi été
développées afin de réduire la consommation d'énergie requise pour leur
délamination
mécanique.
Une première stratégie de prétraitement, décrite par exemple dans la demande
WO 2007/091942, consiste à prétraiter les fibres de cellulose par des
cellulases de
manière à déstructurer la fibre avant l'application du traitement mécanique
par
homogénéisation.
Cependant, ce prétraitement enzymatique est extrêmement versatile en
fonction de l'état de la fibre et notamment en fonction de l'histoire
thermochimique
préalable de la fibre.
De plus, la qualité des nanocelluloses obtenues (en particulier l'état de
dispersion et notamment la taille latérale des nanofibrilles qui conditionne
les propriétés
d'usage et les rendements énergétiques sont très variables.
Une seconde stratégie de prétraitement s'appuie sur une étape chimique
d'oxydation des fibres de cellulose (par exemple Saito et al., Biomacromolecu
les, Vol. 8,
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No. 8, 2007, pp. 2485-2491).
Typiquement, les fibres sont oxydées avec un oxydant tel que hypochlorite de
sodium catalysé par le radical 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl ( TEMPO
) avant de
subir le traitement mécanique précité.
Le traitement oxydatif convertit la fonction alcool primaire en position 06 de
l'unité de glucose de la cellulose en une fonction carboxylate, ce qui conduit
à
l'introduction de charges à la surface des fibres de cellulose. Ces charges
créent des
répulsions électrostatiques qui facilitent la délamination et qui augmentent
son efficacité.
Toutefois, l'élimination des produits de réaction conduit à de grandes
quantités
d'effluents fortement pollués. En outre, des résidus de réactifs persistent au
sein du
produit final et continuent à réagir, altérant in fine les propriétés des
nanocelluloses.
Ainsi, malgré les nouvelles stratégies de prétraitement développées, les coûts
de production des nanocelluloses restent élevés, les rendements incertains, et
la qualité
et les propriétés sont variables.
Il reste donc nécessaire de proposer de nouveaux procédés pour obtenir des
nanocelluloses, avec une moindre consommation énergétique et de façon simple
et
reproductible, selon une voie peu ou pas toxique.
OBJET DE L'INVENTION
Afin de remédier aux inconvénients précités de l'état de la technique, la
présente invention propose un procédé de fabrication de nanocelluloses
s'appuyant sur
une étape de prétraitement de fibres de cellulose avec au moins une enzyme
appartenant
à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides, couramment
désignés
LPM0s pour Lytic Polysaccharide MonoOxygenases .
Plus particulièrement, on propose selon l'invention un procédé pour la
fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique comprenant
des fibres de
cellulose,
lequel procédé comprend les étapes successives suivantes :
- au moins une étape de traitement enzymatique dudit substrat cellulosique,
par
la mise en contact avec au moins une enzyme de clivage, puis
- au moins une étape de traitement mécanique dudit substrat cellulosique
soumis à ladite au moins une étape de traitement enzymatique, pour délaminer
les fibres
de cellulose et pour obtenir lesdites nanocelluloses,
caractérisé en ce que ladite au moins une enzyme de clivage est choisie parmi
les enzymes appartenant à la famille des LPM0s.
Typiquement, les LPM0s sont aptes à assurer un clivage oxydatif des fibres de
cellulose, avantageusement des cycles de glucose des fibres de cellulose, en
présence
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d'un donneur d'électron.
Sans être limité par une quelconque théorie, l'action des LPM0s facilite la
fabrication de nanocellulose à travers deux actions :
- le clivage des chaînes cellulosiques provoque des fragilités au sein des
fibres,
facilitant la délamination mécanique,
- la formation de produits d'oxydation permet d'introduire des fonctions
chimiques chargées sur la surface des fibres en induisant des répulsions
électrostatiques.
Encore sans être limité par une quelconque théorie, ces modifications
structurales combinées ont pour conséquence de favoriser la séparation des
fibres
jusqu'à dispersion nanométrique et de former des nanocelluloses (fibrilles ou
nanocristaux) possédant des fonctionnalités nouvelles (taux de charges,
fonctions
chimiques actuellement non disponibles).
D'autres caractéristiques non limitatives et avantageuses du procédé de
fabrication conforme à l'invention, prises individuellement ou selon toutes
les
combinaisons techniquement possibles, sont également décrites ci-après ainsi
que dans
la description détaillée de l'invention.
Le donneur d'électron peut être choisi parmi l'ascorbate, le gallate, le
cathécol,
le glutathion réduit, les fragments de lignine et les carbohydrates
déshydrogénases
fongiques (notamment les glucoses déshydrogénases, et les cellobiose
déshydrogénases).
De préférence, les LPM0s sont choisies parmi les enzymes aptes à réaliser un
clivage de la cellulose par oxydation de l'un au moins des atomes de carbone
en
position(s) Ci, 04 et 06 du cycle de glucose. De préférence encore, les LPM0s
sont
choisies parmi les enzymes aptes à réaliser un clivage de la cellulose par
oxydation de
l'un au moins des atomes de carbone en position(s) Ci et/ou 04, éventuellement
en
combinaison avec 06, du cycle de glucose.
Les LPM0s peuvent être choisies parmi les familles d'enzymes fongiques AA9
(anciennement dénommées GH61) et d'enzymes bactériennes AA10 (anciennement
dénommées 0BM33) de la classification CAZy (www.cazy.org). Notamment, les
LPM0s
peuvent être choisies parmi les LPM0s issues de Podospora anserina et de
préférence
parmi PaLPM09A (Genbank 0AP68375), PaLPM09B (Genbank 0AP73254),
PaLPM09D (Genbank 0AP66744) PaLPM09E (Genbank 0AP67740), PaLPM09F
(Genbank 0AP71839), PaLPM09G (Genbank 0AP73072), et PaLPM09H (Genbank
CAP61476)
Suivant les modes de réalisation de l'invention, le substrat cellulosique est
obtenu à partir de bois, d'un végétal fibreux riche en cellulose, de
betterave, d'agrumes,
de plantes annuelles à paille, d'animaux marins, d'algues, de champignons ou
de
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bactéries.
De préférence, le substrat cellulosique est choisi parmi les pâtes papetières
chimiques, de préférence les pâtes papetières de bois chimiques, de préférence
encore
l'une au moins des pâtes papetières suivantes :
- les pâtes blanchies,
- les pâtes semi-blanchies,
- les pâtes écrues,
- les pâtes au bisulfite,
- les pâtes au sulfate,
- les pâtes à la soude,
- les pâtes kraft.
Ladite au moins une étape de traitement mécanique comprend généralement
l'un au moins des traitements mécaniques suivants :
- un traitement d'homogénéisation,
- un traitement de microfluidisation,
- un traitement d'abrasion,
- un traitement de cryobroyage.
Le procédé peut également comprendre une étape de post-traitement, par
exemple un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une
acétylation,
une silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques
portés par
les nanocelluloses.
L'invention se rapporte également aux nanocelluloses obtenues par la mise en
oeuvre du procédé de l'invention.
Typiquement, les nanocelluloses obtenues consistent en des nanofibrilles de
cellulose et/ou en des nanocristaux de cellulose.
De préférence, les nanocelluloses comportent des cycles de glucose dont au
moins un atome de carbone est oxydé en position(s) Ci et/ou 04, voire
également en
position 06.
FIGURES
Figure 1 : Aspect des fibres kraft de cellulose traitées avec l'enzyme
PaLPM09H selon différents ratios enzyme/substrat et soumises à un traitement
mécanique faible avec un homogénéiseur-disperseur du type d'Ultra-Turrax et un
traitement ultrasons. Images en microscopie optique des fibres non traitées
(témoin) avec
l'enzyme (A) ou traitées avec des ratios enzyme/substrat de 1:50 (B); 1:100
(C); et 1: 500
(D).
Figure 2 : Aspect des fibres kraft de cellulose traitées avec l'enzyme
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PaLPM09H à un ratio enzyme/substrat 1:50 et soumises à un traitement mécanique
faible avec un homogénéiseur-disperseur du type d'Ultra-Turrax et un
traitement
ultrasons. Images en microscopie optique des fibres témoins (A) et des fibres
traitées (B),
et visualisation des nanofibrilles obtenues par microcopie électronique à
transmission (C)
et microscopie de force atomique (D).
Figure 3 : Aspect des fibres kraft de cellulose traitées avec les enzymes
PaLPM09H et PaLPM09E selon un ratio enzyme/substrat de 1:50 puis soumises à un
traitement mécanique faible avec un homogénéiseur-disperseur du type d'Ultra-
Turrax et
un traitement ultrasons. Images en microscopie optique des fibres kraft
traitées avec
PaLPM09H (A) et avec PaLPM09E (B). Visualisation par microscopie de force
atomique
des nanofibrilles obtenues à partir des fibres kraft par traitement avec les
enzymes
LPM0s PaLPM09H (C) et PaLPM09E (D).
Figure 4 : Aspect des fibres kraft de cellulose soumises à deux traitements
successifs avec l'enzyme PaLPM09H à différents ratios enzyme/substrat puis
soumises à
un traitement mécanique faible avec un homogénéiseur-disperseur du type
d'Ultra-Turrax
et un traitement ultrasons. Images en microscopie optique des fibres traitées
selon les
ratios enzyme/substrat de 1:50 (A); 1:100 (B); 1: 500 (C) et 1:1000 (D).
Figure 5: Analyse des photos AFM pour l'enzyme PaLPM09H, pour
caractériser le profil des hauteurs (Figure 5A) et la distribution en taille
(Figure 5B) des
nanocelluloses. Légende Figure SA: exemple d'un profil de hauteur obtenu sur
la surface
largeur (x, pm) versus hauteur (y, nm); légende Figure 5B : histogramme de
distribution
des hauteurs avec hauteur (x, nm) versus nombre (y).
DESCRIPTION DETAILLEE
La description qui va suivre, en combinaison avec les Résultats Expérimentaux
donnés à titre d'exemples non limitatifs, fera bien comprendre en quoi
consiste l'invention
et comment elle peut être réalisée.
Définitions ménérales
La présente invention concerne un procédé pour la fabrication de
nanocelluloses, en particulier de fibrilles de cellulose et/ou de nanocristaux
de cellulose, à
partir d'un substrat cellulosique.
Par cellulose , on entend un homopolysaccharide linéaire issu de la
biomasse (englobant les matières organiques d'origine végétale, algues
incluses, la
cellulose d'origine animale ainsi que la cellulose d'origine bactérienne) et
constitué
d'unités (ou cycles) de glucose (D-Anhydroglucopyranose ¨ AGU pour Anhydro
glucose
unit ) reliées entre elles par des liaisons glycosidiques 6-(1 -4). Le motif
de répétition est
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un dimère de glucose également appelé dimère de cellobiose.
Les AGU possèdent 3 fonctions hydroxyles : 2 alcools secondaires (sur les
carbones en positions 2 et 3 du cycle de glucose) et un alcool primaire (sur
le carbone en
position 6 du cycle de glucose).
Ces polymères s'associent par des liaisons intermoléculaires de type liaison
hydrogène, conférant ainsi une structure fibreuse à la cellulose. En
particulier,
l'association des dimères de cellobiose forme une nanofibrille élémentaire de
cellulose
(dont le diamètre est d'environ 5 nm). L'association de nanofibrilles
élémentaires forme
une nanofibrille (dont le diamètre varie généralement de 50 à 500 nm).
L'agencement de
plusieurs de ces nanofibrilles forme ensuite ce qui est généralement appelé
une fibre de
cellulose.
Le terme nanocelluloses désigne les différentes formes de cellulose ayant
une
dimension de l'ordre du nanomètre. Ce terme englobe en particulier selon
l'invention,
deux familles de nanocelluloses : les nanocristaux de cellulose et les
fibrilles de cellulose.
Les termes fibrilles de cellulose , nanofibrilles (de cellulose) ,
nanofibres
(de cellulose) , cellulose nanofibrillée , microfibrilles (de cellulose)
, cellulose
microfibrillée , microfibrillated cellulose , cellulose nanofibrils
sont synonymes.
Dans la suite de la présente demande, le terme nanofibrilles de cellulose
(NFCs) sera
utilisé de manière générique.
Chaque nanofibrille de cellulose contient des parties cristallines stabilisées
par
un solide réseau de liaisons hydrogènes inter- et intra-chaines. Ces régions
cristallines
sont séparées par des régions amorphes.
L'élimination des parties amorphes des nanofibrilles de cellulose, permet
d'obtenir des nanocristaux de cellulose (NCCs).
Les NCCs comportent avantageusement au moins 50% de partie cristalline, de
préférence encore au moins 55% de partie cristalline. Ils ont généralement un
diamètre
allant de 5 à 70 nm (de préférence inférieur à 15 nm) et une longueur allant
de 40 nm à
environ 1 iim, de préférence allant de 40 nm à 500 nm.
Les termes nanocristaux de cellulose , cellulose nanocristalline ,
cellulose whiskers , microcristaux ou cellulose nanocrystal sont
synonymes.
Dans la suite de la présente demande, le terme nanocristaux de cellulose
(NCCs)
sera utilisé de manière générique.
Dans le cas de la cellulose bactérienne, les nanofibrilles, ou rubans, de
cellulose bactérienne ont généralement une longueur de plusieurs micromètres
et une
largeur allant de 30 à 60 nm, notamment de 45 à 55 nm.
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Procédé selon l'invention
Le procédé pour la fabrication de nanocelluloses, selon l'invention, comprend
les étapes successives suivantes :
- au moins une étape de traitement enzymatique d'un substrat cellulosique
comprenant des fibres de cellulose, par sa mise en contact avec au moins une
enzyme de
clivage appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de
polysaccharides
(LPM05), puis
- au moins une étape de traitement mécanique dudit substrat cellulosique
soumis à ladite au moins une étape de traitement enzymatique, pour délaminer
lesdites
fibres de cellulose et pour obtenir lesdites nanocelluloses.
Une ou plusieurs, et notamment au moins deux, étapes de traitement
enzymatique peuvent être mises en oeuvre selon le procédé de l'invention,
préalablement
à ladite au moins une étape de traitement mécanique. Par exemple, au moins
deux
étapes de traitement enzymatique peuvent être mises en oeuvre successivement,
préalablement à ladite au moins une étape de traitement mécanique.
Au moins une étape de traitement enzymatique peut également être mise en
oeuvre après ladite au moins une étape de traitement mécanique.
Lorsque plusieurs étapes de traitement enzymatique sont mises en oeuvre, les
conditions de traitement (durée, LPM0(s) choisie(s), ratio enzyme/cellulose,
etc.) peuvent
être identiques ou différentes entre elles.
Typiquement, ladite au moins une étape de traitement enzymatique,
éventuellement suivie d'au moins une étape de traitement mécanique, peut être
répétée,
comme décrit ci-dessus, jusqu'à obtenir une délamination complète des fibres
de
cellulose.
Par exemple, le procédé de l'invention peut comprendre au moins deux cycles
de traitement successifs, chaque cycle de traitement comprenant au moins une
étape de
traitement enzymatique du substrat cellulosique suivie d'au moins une étape de
traitement
mécanique dudit substrat.
Sans être limité par une quelconque théorie, la combinaison selon l'invention
(i)
d'un traitement enzymatique avec au moins une LPMO et (ii) d'un traitement
mécanique
de délamination, permet d'obtenir des nanocelluloses dont les caractéristiques
structurelles et les propriétés mécaniques sont tout à fait différentes des
nanocelluloses
existantes dans l'état de la technique.
Encore sans être limité par une quelconque théorie, le procédé de l'invention
permet d'obtenir des nanocelluloses de façon simple et reproductible. De
préférence, la
taille et les propriétés mécaniques de ces nanocelluloses sont homogènes.
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Substrat cellulosique
Le substrat cellulosique peut être obtenu selon l'invention à partir de toute
matière de la biomasse (englobant les matières organiques d'origine végétale,
algues
incluses, animale ou fongique) comprenant des fibres cellulosiques (c.à.d. des
fibres de
cellulose).
Le substrat cellulosique est obtenu avantageusement à partir de bois (dont la
cellulose est le composant principal), mais aussi de tout végétal fibreux
riche en cellulose,
comme par exemple, le coton, le lin, le chanvre, le bambou, le kapok, les
fibre de noix de
coco (coir), la ramie, la jute, le sisal, le raphia, le papyrus et certains
roseaux, la bagasse
de canne à sucre, la betterave (et notamment la pulpe de betterave), les
agrumes, les
tiges de maïs ou de sorgho, ou encore les plantes annuelles à paille.
Les substrats cellulosiques peuvent également être obtenus à partir d'animaux
marins (comme le tunicier par exemple), d'algues (comme par exemple Valonia ou
Cladophora) ou de bactéries pour la cellulose bactérienne (comme par exemple
les
souches bactériennes de types Gluconacetobacter).
On choisira, selon les applications, de la cellulose issue de parois primaires
comme le parenchyme des fruits (par exemple les betteraves, les agrumes etc.)
ou de
parois secondaires, comme le bois.
Le substrat cellulosique consiste avantageusement en un matériau cellulosique
préparé par des moyens chimiques ou mécaniques, à partir de toute source
cellulosique
telle que mentionnée ci-dessus (et notamment à partir du bois).
Le substrat cellulosique se présente avantageusement sous la forme d'une
suspension de fibres de cellulose dans un milieu liquide (de préférence un
milieu aqueux),
ou d'une pâte de cellulose.
Les pâtes de cellulose peuvent être conditionnées à l'état sec , soit
typiquement dans un état de siccité supérieur ou égal à 80%, notamment
supérieur ou
égal à 90%. La pâte de cellulose peut ensuite être redispersée dans un milieu
aqueux par
un traitement mécanique.
De préférence, le substrat cellulosique contient au moins 90%, notamment au
moins 95% et de préférence 100% de fibres de celluloses.
De préférence, le substrat cellulosique est adapté à la fabrication de papier
ou
d'un produit cellulosique. Le substrat cellulosique est ainsi de préférence
choisi parmi les
pâtes papetières (ou pâte à papier), et en particulier les pâtes papetières
chimiques.
De manière générale, la pâte de cellulose et notamment la pâte papetière peut
contenir, en association avec les fibres de cellulose, de l'hémicellulose et
de la lignine. De
préférence, la pâte de cellulose contient moins de 10% et notamment moins de
5% de
lignine et/ou d'hémicellulose.
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De préférence, les pâtes papetières chimiques contiennent quasiment
exclusivement, voire exclusivement des fibres de cellulose.
La pâte papetière peut être choisie parmi l'une au moins des pâtes papetières
suivantes : les pâtes blanchies, les pâtes semi-blanchies, les pâtes écrues,
les pâtes au
bisulfite (écrues ou blanchies), les pâtes au sulfate (écrues ou blanchies),
les pâtes à la
soude (écrues ou blanchies) et les pâtes kraft.
Il est également possible d'utiliser des pâtes à dissoudre ayant une faible
proportion d'hémicellulose, de préférence inférieure à 10% et notamment
inférieure ou
égale à 5%.
De préférence, les pâtes papetières utilisées dans un procédé de l'invention
sont des pâtes de bois, notamment des pâtes papetières chimiques de bois.
Mono-oxyqénases lytiques de polysaccharides - LPMO
Le substrat cellulosique est ainsi soumis à au moins une étape de
prétraitement
avec au moins une enzyme de clivage appartenant à la famille des mono-
oxygénases
lytiques de polysaccharides ( Lytic Polysaccharide Ponooxygenases ou LPMO).
Les LPM0s sont des enzymes mononucléaires de type II à cuivre. Elles
présentent des caractéristiques structurelles communes, notamment :
- une surface plane avec un site actif situé proche de son centre et
- un site de liaison fortement conservé pour un ion cuivre de type II exposé à
la
surface de la protéine.
L'interaction entre l'enzyme LPMO et la surface de la cellulose intervient par
l'intermédiaire de la face plane de l'enzyme LPMO et met en jeu des
interactions avec des
résidus aromatiques polaires. Les LPM0s utilisables selon l'invention sont
définies par
leur capacité à catalyser un clivage oxydatif des fibres de cellulose du
substrat
cellulosique, par oxydation de l'un au moins des atomes de carbone en
positions Ci, 04 et
06 d'un cycle glucose desdites fibres de cellulose.
Le principe du clivage oxydatif réalisé par les LPM0s implique l'activation
d'un
groupement C-H suivie par un clivage dépendant du dioxygène (02), produisant
ainsi des
oligomères oxydés sur l'un au moins des carbones en positions Ci, 04, et 06.
La ou les LPMO(s) mises en oeuvre sont aptes à catalyser un clivage des fibres
de cellulose par oxydation de l'un au moins des carbones choisis parmi les
carbones en
positions Ci et/ou 04 et/ou 06 d'un cycle glucose de la cellulose. Le clivage
oxydatif
conduit à la formation de groupements carboxyles à la surface des fibres de
cellulose :
- le clivage oxydatif en position Ci d'un cycle glucose d'une unité de
cellobiose
entraîne la formation d'une lactone, spontanément hydrolysée en acide
aldonique, et
- le clivage oxydatif en position 04 d'un cycle glucose d'une unité de
cellobiose
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conduit à la formation d'un kétoaldose.
L'oxydation du groupement alcool en position 06 d'un cycle glucose d'une unité
de cellobiose conduit à la formation d'un groupe carbonyle.
Dans certains modes de réalisation, la ou les LPMO(s) utilisées catalysent un
clivage des fibres de cellulose par oxydation de l'un au moins des carbones
choisis parmi
les carbones en position(s) Ci et/ou 04 d'un cycle glucose de la cellulose,
éventuellement
en combinaison avec le carbone en position 06.
Les LPM0s catalysent le clivage oxydatif d'une unité de cellobiose en présence
d'un donneur externe d'électron.
Ce donneur d'électron, généralement une molécule de faible poids moléculaire,
est choisi parmi l'ascorbate, le glutathion réduit, le gallate, le cathécol,
des fragments de
lignine, ou encore une enzyme de la famille des carbohydrates déshydrogénases.
De préférence, les carbohydrates déshydrogénases sont choisies parmi les
enzymes fongiques, notamment les cellobiose déshydrogénase (CDHs).
Les CDHs (ou Cellobiose oxidoréductases - EC 1.1.99.18) catalysent la
réaction [Cellobiose + accepteur d'électron <=> cellobiono-1,5-lactone +
accepteur réduit].
Ce sont des hémoflavoenzymes fongiques appartenant à la superfamille des
glucose-
méthanol-choline (GMC) oxydoréductases. Les CDHs sont des enzymes monomériques
portant deux groupes prosthétiques, un groupe hème b et une flavine adénine
dinucléotide. Le domaine flavoprotéine des CDHs catalyse l'oxydation à deux
électrons de
la cellobiose en lactone en utilisant un accepteur d'électrons. Cet accepteur
d'électron
peut être par exemple choisi parmi le dioxygène, les quinones et les radicaux
phénoxy ou
les LPM0s.
L'activité d'une enzyme CDH peut être déterminée en suivant la réduction du
réactif 2,6-dichlorophénol indophénol (DCPIP) dans un tampon sodium acétate
contenant
du cellobiose (Bey et al., 2011, Microb. Oeil Fact. 10:113).
Des exemples de CDHs utilisables en combinaison avec au moins une enzyme
LPMO et agissant également en tant que donneur d'électron peuvent être choisis
parmi
les CDHs provenant de Pycnoporus cinnabarinus, Humicola insolens, Podospora
anserina, ou Myceliophthora thermophila.
De préférence encore, on utilise une enzyme LPMO pour laquelle une activité
cellulolytique (c'est-à-dire catalysant le clivage oxydatif de la cellulose) a
été identifiée.
L'activité de clivage oxydatif des LPM0s sur un substrat cellulosique peut
être testée
dans des tests de clivage tels que décrit dans la partie Exemple de la
présente demande.
Plus précisément, les LPM0s mises en oeuvre dans l'invention sont
avantageusement choisies parmi les enzymes dites à activité auxiliaire (ou
Auxiliary
Activity ¨ AA) selon la classification établie dans la base de données CAZy,
relatives
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WO 2016/193617 12 PCT/FR2016/051306
aux enzymes actives sur les hydrates de carbone (CAZy ¨ Carbohydrate Active
enZyme
database - http://www.cazy.org/ - Voir aussi Levasseur et al., Biotechnology
for Bio fuels
2013, 6 :41).
De préférence encore, l'étape de traitement enzymatique est réalisée avec au
moins une enzyme choisie parmi les enzymes LPM0s des familles dites AA9, AA10,
AA11 et AA13, selon la classification établie dans la base de données CAZy.
L'enzyme LPMO selon l'invention peut contenir un module protéique de fixation
au carbohydrate ( carbohydrate binding module ) spécifique de la cellulose
de type
CBM1 selon la classification CAZy.
Les enzymes listées dans la présente demande sont identifiées par les
références Genbank (identifiant une séquence génétique) et Uniprot lorsque
cette
dernière est disponible (identifiant une séquence protéique ¨ voir tableau 1).
Par défaut, la
référence indiquée entre parenthèses pour chaque enzyme correspond à la
référence
Genbank .
De préférence, on utilise (avantageusement exclusivement) au moins une
enzyme de la famille AA9 et/ou au moins une enzyme de la famille AA10 de la
classification CAZy.
Les enzymes de la famille AA9, listées dans le tableau 1 ci-après, sont des
enzymes fongiques largement distribuées dans le génome de la plupart des
ascomycètes
et chez certains basidiomycètes (champignons).
De manière générale, les enzymes de la famille AA9 étaient initialement
classées dans la famille des glycosides hydrolases 61 (GH61) de la
classification CAZy.
Des analyses spécifiques ont montré depuis, que l'activité endoglucanase des
enzymes
AA9 était faible, voire inexistante (Morgenstern I et al., Briefings in
Functional Genomics
vol.3(6P) :471-481).
De préférence, on utilise des LPM0s dont l'activité endoglucanase est non
significative ou inexistante.
L'ion cuivre des LPM0s de la famille AA9 est lié à la protéine selon un modèle
d'hexacoordination impliquant au moins 2 résidus conservés d'histidine et des
molécules
d'eau.
Les enzymes de la famille AA9 catalysent un clivage oxydatif de l'unité
cellobiose sur le carbone en position Ci et/ou 04 de préférence sur le carbone
en position
Ci ou 04. Certaines enzymes (T. aurantiacus TaGH61A (G3XAP7) et Podospora
anserina
PaGH61B (B2AVF1)) pourraient catalyser un clivage oxydatif de la cellobiose
sur un
carbone en position 06.
Les LPM0s de la famille AA9 exprimée chez les champignons présentent
généralement une modification post-traductionnelle consistant en une
méthylation du
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WO 2016/193617 13 PCT/FR2016/051306
résidu histidine N-terminal.
De préférence, on utilise des LPM0s de la famille AA9 comprenant au moins un
domaine CBM1 ou CBM18 (CBM pour carbohydrate binding module ) en position
N-
terminale. Ces enzymes comprennent alors une surface plane formée de plusieurs
résidus aromatiques polaires formant un domaine de type CBM1 ou CBM18.
De préférence encore, ladite au moins une LPMO de la famille AA9 est issue de
Podospora anserina et/ou de Neurospora crassa.
Les enzymes de la famille AA9 issues de Podospora anserina sont typiquement
choisies dans le groupe constitué de PaLPM09A (CAP68375), PaLPM09B (CAP73254),
PaLPM09D (CAP66744), PaLPM09E (CAP67740), PaLPM09F (CAP71839),
PaLPM09G (CAP73072), PaLPM09H (CAP61476).
De préférence, on utilise les enzymes PaLPM09E (CAP67740) et/ou
PaLPM09H (CAP61476).
Les enzymes de la famille AA9 issues de Neurospora crassa sont typiquement
choisies dans le groupe constitué de NcLPM09C (EAA36362), NcLPM09D (EAA32426
/CAD21296), NcLPM09E (EAA26873), NcLPM09F (EAA26656/CAD70347), NcLPM09M
(EAA33178), NcU00836 (EAA34466), NcU02240 (EAA30263), NcU07760 (EAA29018).
Les enzymes de la famille AA10 (classification CAZy) étaient anciennement
classées dans la famille CBM33 (ou carbohydrate binding module family 33 )
de la
classification CAZy.
La famille AA10 des LPM0s comprend à ce jour plus d'un millier d'enzymes,
identifiées particulièrement chez les bactéries, mais aussi chez certains
eucaryotes ainsi
que dans quelques virus.
Les LPM0s de la famille AA10 possèdent une structure similaire à celle des
enzymes de la famille AA9 et notamment au moins un résidu tyrosine conservé en
position N-terminal qui est impliqué dans la liaison avec l'ion cuivre.
Cependant, dans la
plupart des LPM0s de la famille AA10, l'un des autres résidus tyrosine
impliqués dans la
liaison axiale de l'ion cuivre est remplacé par un résidu phénylalanine. Pour
ces enzymes,
une activité oxydative a été démontrée sur la chitine et sur la cellulose.
De préférence, les enzymes de la famille AA10 sont multimodulaires et
comprennent un domaine CBM en position N-terminal. Ces domaines sont
typiquement
des domaines CBM2, CBM5, CBM10, CBM12 ainsi que des modules fibronectine type
III.
La famille AA11 est caractérisée par des enzymes qui réalisent un clivage
oxydatif en C1 sur la chitine. On choisira de préférence l'enzyme
d'Aspergillus oryzae (voir
également Hemsworth et al., Nature Chemical Biology 2014(10):122-126 -
Discovery and
characterization of a new family of lytic polysaccharide monooxygenases).
La famille AA13 est caractérisée par des enzymes qui réalisent un clivage
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oxydatif en Ci sur l'amidon. On choisira de préférence l'enzyme d'Aspergillus
nidulans (Lo
Leggio et al., Nat Commun. 2015(22) 6: 5961 -Structure and boosting activity
of a starch-
degrading lytic polysaccharide monooxygenase).
De manière générale, l'étape de traitement enzymatique est mise en oeuvre au
moyen d'au moins une enzyme LPMO listée dans le tableau 2 ci-après.
Dans certains modes de réalisation du procédé de l'invention, ladite au moins
une enzyme de la famille des LPM0s (avantageusement de la famille AA9 et/ou de
la
famille AA10) est utilisée en combinaison avec au moins une cellulase.
La cellulase est avantageusement choisie parmi au moins une endoglucanase
(par exemple une endoglucanase) et/ou au moins une carbohydrate déshydrogénase
(avantageusement une cellobiose déshydrogénase (CDHs)). Les carbohydrates
déshydrogénases peuvent jouer le rôle de donneur d'électron pour les LPM0s.
En pratique, ladite au moins une enzyme LPMO mise en oeuvre est
avantageusement purifiée à partir d'un surnageant de culture d'un champignon
et/ou
produite en système hétérologue, notamment dans une bactérie, un champignon ou
une
levure, par exemple chez la levure Pichia pastoris.
Ladite au moins une enzyme LPMO est mélangée avec le substrat cellulosique,
de manière à permettre la mise en contact entre ladite au moins une enzyme et
les fibres
de cellulose.
L'étape de traitement enzymatique est de préférence réalisée sous agitation
douce, de façon à assurer une bonne dispersion des enzymes au sein des fibres.
Cette
étape de traitement enzymatique est par exemple mise en oeuvre pendant une
durée
allant de 24h à 72h (de préférence 48h).
De préférence, l'étape de traitement enzymatique est mise en oeuvre à une
température allant de 30 à 45 C.
Selon l'invention ladite au moins une enzyme LPMO peut être ajoutée au
substrat cellulosique selon un rapport (ou ratio) enzyme/cellulose allant de 1
:1000 à
1:50, notamment de 1:500 à 1:50 ou de 1:100 à 1:50 ou encore de 1:1000 à
1:500,
del : 500 à 1 :100.
De préférence, ladite au moins une enzyme LPMO est utilisée à une
concentration allant de 0,001 à 10 g/L, notamment de 0,1 à 5 g/L, et de
préférence encore
de 0,5 à 5 g/L.
Selon un mode de réalisation particulier, le substrat cellulosique est soumis
à
au moins deux (voire seulement à deux) étapes de traitement enzymatique
successives
(en série, avantageusement séparées par une étape de rinçage).
La ou les LPM0s mises en oeuvre au cours de chacune de ces étapes de
traitement enzymatique sont identiques ou différentes ; les conditions
(notamment le ratio
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enzyme/substrat) sont identiques ou différentes entre ces étapes successives.
Dans ce cas, les Exemples démontrent que les fibres sont entièrement
déstructurées, y compris à des rapports enzyme/cellulose faibles.
Etape(s) de traitement (s) mécanique(s)
Le substrat cellulosique prétraité est ensuite soumis à au moins une étape de
traitement mécanique qui est destinée à délaminer les fibres de cellulose pour
l'obtention
des nanocelluloses.
La délamination (dite encore fibrillation ou défibrillation ) consiste
à
séparer, par un phénomène mécanique, les fibres de cellulose en
nanocelluloses.
Comme démontré au travers des Exemples ci-après, le clivage oxydatif des
fibres de cellulose, catalysé par ladite au moins une LPMO, facilite la
délamination de ces
fibres de cellulose lors de l'étape de traitement mécanique.
Cette étape de délamination mécanique des fibres de cellulose peut alors être
réalisée dans des conditions moins drastiques et donc moins coûteuses en
énergie. Par
ailleurs, l'utilisation de LPM0s selon l'invention permet d'introduire dans
les fibres de
cellulose des groupements chargés induisant des répulsions électrostatiques,
sans
contamination avec des réactifs de traitement, comme lors de l'utilisation de
réactifs
TEMPO.
Les traitements mécaniques visant à délaminer les fibres de cellulose sont
connus de l'homme du métier et peuvent être mis en oeuvre dans le procédé de
l'invention.
De manière générale, on peut citer les traitements mécaniques faibles avec un
homogénéiseur-disperseur (par exemple du type d'Ultra-Turrax) et/ou les
traitements
ultrasons.
On peut encore par exemple se référer au document de Lavoine N et al
(Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (pages 740 à
744) des
traitements mécaniques pour la préparation de cellulose microfibrillée (par
exemple des
nanofibrilles de cellulose).
Typiquement, un traitement mécanique peut être choisi parmi des traitements
mécaniques d'homogénéisation, de microfluidisation, d'abrasion, ou de
cryobroyage.
Le traitement d'homogénéisation implique le passage du substrat cellulosique
prétraité, typiquement une pâte de cellulose ou une suspension liquide de
cellulose, au
travers d'un espace étroit sous pression élevée (tel que décrit par exemple
dans le brevet
US 4,486,743).
Ce traitement d'homogénéisation est de préférence effectué au moyen d'un
homogénéiseur de type Gaulin. Dans un tel dispositif, le substrat cellulosique
prétraité,
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typiquement sous forme d'une suspension de cellulose, est pompé à haute
pression et
distribué au travers d'une valve automatique de faible orifice. Une succession
rapide
d'ouvertures et de fermetures de la valve soumet les fibres à une importante
chute de
pression (généralement d'au moins 20 MPa) et à une action de cisaillement à
vitesse
élevée suivie d'un impact de décélération à vitesse élevée. Le passage du
substrat dans
l'orifice est répété (généralement de 8 à 10 fois) jusqu'à ce que la
suspension de cellulose
devienne stable. Afin de maintenir une température du produit dans une gamme
allant de
70 à 80 C durant le traitement d'homogénéisation, cb l'eau de refroidissement
est
généralement utilisée.
Ce traitement d'homogénéisation peut également être mis en oeuvre à l'aide
d'un dispositif de type microfluidiseur (voir par exemple Sisqueira et al.
Polymer 2010
2(4) :728-65). Dans un tel dispositif, la suspension de cellulose passe au
travers d'une
fine chambre typiquement en forme de z (dont les dimensions du canal sont
généralement comprises entre 200 et 400 lm) sous pression élevée (environ 2070
bars).
Le taux de cisaillement élevé qui est appliqué (généralement supérieur à
107.51 permet
d'obtenir des nanofibrilles très fines. Un nombre variable de passages (par
exemple de 2
à 30, notamment de 10 à 30 ou de 5 à 25, et en particulier de 5 à 20) avec des
chambres
de tailles différentes peut être utilisé, pour augmenter le degré de
fibrillation.
Le traitement d'abrasion ou de meulage (voir par exemple lwamoto Set al.,
2007 Applied Physics A89(2) :461-66) est basé sur l'utilisation d'un
dispositif de meulage
apte à exercer des forces de cisaillement fournies par des pierres de meulage.
Le substrat cellulosique prétraité, généralement sous forme d'une pâte de
cellulose, est passé entre une pierre de meulage statique et une pierre de
meulage en
rotation, typiquement à une vitesse de l'ordre de 1500 rotations par minute
(rpm).
Plusieurs passages (généralement entre 2 et 5) peuvent être nécessaires pour
obtenir
des fibrilles de taille nanométrique.
Un dispositif de type mixeur (par exemple tel que décrit dans Unetani K et
al.,
Biomacromolécules 2011, 12(2), pp.348-53) peut également être utilisé pour
produire des
microfibrilles à partir du substrat cellulosique prétraité, par exemple à
partir d'une
suspension de fibres de bois.
Le traitement de cryobroyage (ou cryoconcassage) (Dufresne et al., 1997,
Journal of Applied Polymer Science, 64(6) :1185-94) consiste à broyer une
suspension de
substrat cellulosique prétraité préalablement congelée avec de l'azote
liquide. Les
cristaux de glace formés à l'intérieur des cellules font exploser les
membranes cellulaires
et libèrent des fragments de parois. Ces procédés sont généralement utilisés
pour la
production de microfibrilles de cellulose à partir de produits, ou de résidus,
de
l'agriculture.
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Etape(s) de post-traitement du substrat cellulosique
Dans certains modes de réalisation, le procédé de fabrication comprend au
moins une étape de post-traitement du substrat cellulosique, mise en oeuvre
après que
ledit substrat ait été soumis au traitement mécanique.
Généralement, ladite au moins une étape de post-traitement vise à augmenter
le degré de fibrillation des nanocelluloses obtenues et/ou à conférer auxdites
nanocelluloses de nouvelles propriétés mécaniques, en fonction des
applications
envisagées.
Ladite au moins une étape de post-traitement peut notamment être choisie
parmi un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une
acétylation, une
silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques
portés par les
microfibrilles. On peut également se référer par exemple au document de
Lavoine N et al
(Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (point 2.3,
pages 747
à 748) des post-traitements qui peuvent être combinés à différents
prétraitements et
traitements mécaniques des fibres de celluloses.
Nanocelluloses selon l'invention
Le procédé selon l'invention permet ainsi l'obtention de nanocelluloses, en
particulier de nanocristaux de cellulose et/ou de nanofibrilles de cellulose.
Contrairement aux NFCs obtenues après oxydation par des réactifs chimiques
de type TEMPO, les nanocelluloses obtenues par le procédé de l'invention sont
dépourvues de résidus de réactifs d'oxydation (à savoir par exemple le bromure
de
sodium, l'hypochlorite de sodium, le chlorite de sodium, le radical (2,2,6,6-
tétraméthylpipéridin-1-yl)oxyl (TEMPO), les dérivés ou analogues).
De préférence, à l'issue du procédé selon l'invention, les nanocelluloses
comportent au moins un cycle de glucose (typiquement plusieurs cycles de
glucose) dont
l'un au moins des atomes de carbone en positions C1 et/ou C4, voire aussi C6,
est oxydé
par un phénomène de clivage oxydatif.
Les nanocelluloses selon l'invention comportent ainsi des cycles de glucose
qui
sont :
- mono-oxydés sur l'atome de carbone en position C1, et/ou
- mono-oxydés sur l'atome de carbone en position C4, et/ou
- doublement oxydés, sur les atomes en positions C1 et C4.
Ces cycles de glucose, oxydés sur les atomes en positions C1 et/ou C4, peuvent
encore comporter un atome de carbone oxydé en position C6.
Par atome de carbone oxydé , on entend en particulier un atome de carbone
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WO 2016/193617 18 PCT/FR2016/051306
qui comporte une fonction carbonyle, et avantageusement encore une fonction
carboxyle.
Les nanocelluloses selon l'invention sont ainsi avantageusement chargées
négativement, du fait de la présence de différents fonctions en surface dont
des fonctions
carboxylates sur les carbones en positions Ci et/ou 04 (contrairement au
procédé TEMPO
qui conduit à une oxydation spécifique du carbone en position C6).
RESULTATS EXPERIMENTAUX
1. Des tests de clivage de la cellulose par une enzyme LPMO peuvent être
menés selon le protocole suivant :
Le test de clivage est réalisé dans un volume de 300 I de liquide contenant
4,4
1.1M d'enzyme LPMO et 1 mM d'ascorbate et 0,1 % (poids/volume) de poudre de
cellulose
gonflée à l'acide phosphorique (PASC phosphoric acid-swoller cellulose -
préparée
comme décrit dans Wood TM, Methods Enzym 1988, 160 :19-25) dans 50 mM d'un
tampon acétate de sodium à pH 4,8 ou 5 1.1M de cello-oligosaccharides
(Megazyme,
Wicklow, Ireland) dans 10 mM de tampon acétate de sodium à pH 4,8.
La réaction enzymatique est mise en oeuvre dans un tube de 2 ml incubé dans
un thermomixer (Eppendorf, Montesson, France) à 50 C et 580 rpm (rotation par
minute).
Après 16h d'incubation, l'échantillon est porté à 100 C pendant 10 minutes
afin
de stopper la réaction enzymatique, puis centrifugé à 16 000 tours par minutes
(rpm)
pendant 15 minutes à 4 C afin de séparer la fracticn solution de la fraction
insoluble
restante.
Les produits clivés obtenus peuvent être analysés par chromatographie à
échange d'ions et/ou par spectrométrie de masse (MALDI-TOF).
2. Des essais préliminaires ont été menés pour démontrer l'efficacité du
procédé de fabrication de nanocellulose selon l'invention.
Ces essais ont été réalisés sur une fibre papetière (fibres kraft de
cellulose) au
moyen d'enzyme LMPO de la famille AA9 issues de Podospora anserina (PaLPM09E
(Genbank CAP67740) et/ou PaLPM09H (Genbank CAP61476)) et produites en système
hétérologue chez la levure (Pichia pastoris).
Les fibres sont mises en contact des enzymes (à une concentration d'1g/L et
selon des rapports enzyme/cellulose de 1:50, 1:100, 1:500 et 1:1000) et
d'ascorbate (2
mM) puis soumises à une agitation douce pendant 48 heures à 40 C.
Les fibres traitées sont ensuite soumises à une action mécanique avec un
homogénéiseur-disperseur (Ultra-Turrax puissance 500 W, vitesse maximum
pendant 3
minutes), suivie d'un traitement aux ultrasons pendant 3 minutes.
Comparativement aux substrats non traités à l'enzyme, on observe que la
défibrillation est facilitée pour l'ensemble des rapports enzyme/cellulose
utilisés (Figure
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WO 2016/193617 19 PCT/FR2016/051306
1B-D ¨ les photos montrent, de façon qualitative, la défibrillation).
En l'absence d'enzyme, les fibres restent intactes et aucune défibrillation
n'est
constatée (voir les fibres témoins non traitées, Figure 1A).
Les dispersions ont été ensuite analysées par TEM (Microscopie Electronique
en Transmission) et AFM (Microscopie de Force Atomique).
En l'absence d'enzymes LPM0s (figure 2A), on constate que très peu de
structures sont visibles à l'échelle nanométrique.
En revanche, pour les fibres traitées par l'enzyme LPMO, des structures de
dimensions nanométriques sont facilement repérées aussi bien dans le
surnageant que
dans les culots d'expérience. Les fibres sont entièrement déstructurées,
laissant
apparaître les zones cristallines de la fibre (Figure 20-D).
Le traitement des fibres avec l'enzyme PaLPM09E combiné au traitement
mécanique ultérieur (Figures 3B et D) produit une défibrillation de la
cellulose similaire à
celle obtenue avec un procédé identique impliquant l'enzyme PaLPM09H (voir
Figure 3A
et C).
De manière générale, les figures 20, 2D, 30 et 3D démontrent de façon
indiscutable que des nanocelluloses sont obtenues.
Si les fibres ayant subies un premier traitement avec l'enzyme LPMO sont à
nouveau soumises à un second traitement successif avec une enzyme LPMO aux
conditions décrites ci-dessus, suivi du traitement mécanique, les fibres sont
entièrement
déstructurées y compris aux rapports enzyme/cellulose faibles (c'est-à-dire
les ratios
1/500 et 1/1000) (Figure 4).
Les photos AFM pour l'enzyme PaLPM09H ont été analysées par le logiciel
WSxM pour caractériser le profil des hauteurs (Figure 5A) et la distribution
en taille
(Figure 5B) des nanocelluloses.
Cette analyse montre, qu'au ratio enzyme/cellulose 1 :50, les nanocelluloses
ont un diamètre inférieur à 100 nm.
Ce résultat confirme que les produits obtenus par le procédé selon l'invention
sont des nanocelluloses.
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Tableau 1 :
Enzymes fongiques répertoriées de la famille AA9 (classification CAZy)
Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot
Oeil Agaricus bisporus AAA53434.1 000023
D649
AfA5C5.025 Aspergillus fumigatus 0AF31975.1 Q6MYM8
endoglucanase / CMCase (Eng61) Aspergillus fumigatus AFJ54163.1
MKU1
endo-13-1,4-glucanase B (EgIB ; Aspergillus kawachii BAB62318.1 Q96WQ9
AkCeI61A) (CeI61A) NBRC4308
AN1041.2 Aspergillus nidulans EAA65609.1 C8VTW9
FGSC A4 Q5BEI9
AN3511.2 Aspergillus nidulans EAA59072.1 05B7G9
FGSC A4
AN9524.2 Aspergillus nidulans EAA66740.1 08VI93
FGSC A4 0BF83171.1 05A0A6
AN7891.2 Aspergillus nidulans EAA59545.1 Q5AUY9
FGSC A4
AN6428.2 Aspergillus nidulans EAA58450.1 08V0 F9
FGSC A4 05AZ52
AN3046.2 Aspergillus nidulans EAA63617.1 C8VIS7
FGSC A4 05B8T4
AN3860.2 (EgIF) Aspergillus nidulans EAA59125.1 08V6H2
FGSC A4 05B6H0
endo-13-1,4-glucanase (ANI 602.2) Aspergillus nidulans EAA64722.1 05B0X8
FGSC A4 ABF50850.1
AN2388.2 Aspergillus nidulans EAA64499.1 08VNP4
FGSC A4 Q5BAP2
An04g08550 Aspergillus figer 0AK38942.1 A2QJX0
CBS 513.88
An08g05230 Aspergillus figer 0AK45495.1 A20R94
CBS 513.88
Anl2g02540 Aspergillus figer CAK41095.1 A2QYU6
CBS 513.88
Anl 2g04610 Aspergillus figer CAK97151.1 A2QZE1
CBS 513.88
An14g02670 Aspergillus figer 0AK46515.1 A2R313
CBS 513.88
Anl5g04570 Aspergillus figer 0AK97324.1 A2R5J9
CBS 513.88
Anl5g04900 Aspergillus figer 0AK42466.1 A2R5NO
CBS 513.88
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 21 PCT/FR2016/051306
Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot
A0090005000531 Aspergillus oryzae BAE55582.1 Q2US83
RIB40
A0090001000221 Aspergillus oryzae BAE56764.1 Q2UNV1
RIB40
A0090023000056 Aspergillus oryzae BAE58643.1 Q2U1H2
RIB40
A0090023000159 Aspergillus oryzae BAE58735.1 Q2UI80
RIB40
A0090023000787 Aspergillus oryzae BAE59290.1 Q2UGM5
RIB40
A0090012000090 Aspergillus oryzae BAE60320.1 Q2UDP5
RIB40
A0090138000004 Aspergillus oryzae BAE64395.1 Q2U220
RIB40
A0090103000087 Aspergillus oryzae BAE65561.1 Q2TYW2
RIB40
Ce16 (E6) Bipolaris maydis C4 AAM76663.1 Q8JOH7
glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD34368.1
(Bof ut4_p103280.1) T4
glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD47228.1
(Bof ut4_p003870.1) T4
glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD48549.1
(Bof ut4_p109330.1) T4
glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD50139.1
(Bof ut4_p025380.1) T4
glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD50144.1
(Bof ut4_p025430.1) T4
glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD51504.1
(Bofut4_p018100.1) T4
glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD49290.1
(Bof ut4_p031660.1) T4
glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD52645.1
(Bof ut4_p000920.1) T4
Bof uT4P 143000045001 Botryotinia fuckeliana CCD50451.2
T4 CCD50451.1
ORF Chaetomium AGY80102.1
thermophilum CT2
ORF (fragment) Chaetomium AGY80103.1
thermophilum CT2
ORF (fragment) Chaetomium AGY80104.1
thermophilum CT2
ORF (fragment) Chaetomium AGY80105.1
thermophilum CT2
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 22 PCT/FR2016/051306
Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot
cellobiohydrolase family protein 61, Chaetomium AGY80103.1
partial (Cbh61-2) (fragment) thermophilum CT2
cellobiohydrolase family protein 61, Chaetomium AGY80104.1
partial (Cbh61-3) (fragment) thermophilum CT2
cellobiohydrolase family protein 61, Chaetomium AGY80105.1
partial (Cbh61-4) (fragment) thermophilum CT2
ORF (possible fragment) Colletotrichum CAQ16278.1 B5WYD8
graminicola M2
ORF Colletotrichum CAQ16206.1 B5WY66
graminicola M2
ORF Colletotrichum CAQ16208.1 B5WY68
graminicola M2
ORF Colletotrichum CAQ16217.1 B5WY77
graminicola M2
unnamed protein product Coprinopsis cinerea CAG27578.1
CGB A6300C Cryptococcus ADV19810.1
bacillisporus WM276
CNAG 00601 Cryptococcus AFR92731.1
neoformans var. AFR92731.2
grubii H99
(Cryne H99 1)
Oeil Cryptococcus AAC39449.1 059899
neoformans var.
neoformans
0NA05840 (Oeil) Cryptococcus AAW41121.1 F5HH24
neoformans var.
neoformans JEC21
(Cryne JEC21 1)
ORF (fragment) Flammulina velutipes ADX07320.1
KACC 42777
FFUJ 12340 Fusarium fujikuroi IMI CCT72465.1
58289 (Fusful)
FFUJ 13305 Fusarium fujikuroi IMI 00T671 19.1
58289 (Fusful)
FFUJ 07829 Fusarium fujikuroi IMI CCT69268.1
58289 (Fusful)
FFUJ 12621 Fusarium fujikuroi IMI 00T72729.1
58289 (Fusful)
FFUJ 12840 Fusarium fujikuroi IMI 00T72942.1
58289 (Fusful)
FFUJ 09373 Fusarium fujikuroi IMI 00T73805.1
58289 (Fusful)
FFUJ 10599 Fusarium fujikuroi IMI CCT74544.1
58289 (Fusful)
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 23 PCT/FR2016/051306
Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot
FFUJ 10643 Fusarium fujikuroi /Mi CCT74587.1
58289 (Fusful)
FFUJ 14514 Fusarium fujikuroi /Mi CCT67584.1
58289 (Fusful)
FFUJ 11399 Fusarium fujikuroi /Mi CCT75380.1
58289 (Fusful)
FFUJ 14514 Fusarium fujikuroi /Mi CCT67584.1
58289
FFUJ 11399 Fusarium fujikuroi /Mi CCT75380.1
58289
FFUJ 04652 Fusarium fujikuroi /Mi CCT64153.1
58289 (Fusful)
FFUJ 03777 Fusarium fujikuroi /Mi CCT64954.1
58289 (Fusful)
FFUJ 04940 Fusarium fujikuroi /Mi CCT63889.1
58289 (Fusful)
Sequence 122805 from patent US Fusarium ABT35335.1
7214786 graminearum
FG03695.1 (CeI61E) Fusarium XP 383871.1
graminearum PH-1
unnamed protein product Fusarium CEF78545.1
graminearum PH-1
unnamed protein product Fusarium CEF74901.1
graminearum PH-1
unnamed protein product Fusarium CEF78472.1
graminearum PH-1
unnamed protein product Fusarium CEF86346.1
graminearum PH-1
unnamed protein product Fusarium CEF87450.1
graminearum PH-1
unnamed protein product Fusarium CEF85876.1
graminearum PH-1
unnamed protein product Fusarium CEF86254.1
graminearum PH-1
unnamed protein product Fusarium CEF87657.1
graminearum PH-1
unnamed protein product Fusarium CEF76256.1
graminearum PH-1
unnamed protein product Fusarium CEF78876.1
graminearum PH-1
unnamed protein product Fusarium CEF79735.1
graminearum PH-1
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 24 PCT/FR2016/051306
Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot
unnamed protein product Fusarium CEF74460.1
graminearum PH-1
unnamed protein product Fusarium CEF84640.1
graminearum PH-1
endo-i3-1,4-glucanase (CeI61G) Gloeophyllum AEJ35168.1
trabeum
GH61D Heterobasidion AF072234.1
parviporum
GH61B Heterobasidion AF072233.1
parviporum
GH61A Heterobasidion AF072232.1
parviporum
GH61F Heterobasidion AF072235.1
parviporum
GH61G Heterobasidion AF072236.1
parviporum
GH61H Heterobasidion AF072237.1
parviporum
GH61I Heterobasidion AF072238.1
parviporum
GH61J Heterobasidion AF072239.1
parviporum
unnamed protein product Humicola insolens CAG27577.1
endoglucanase IV (EgiV) Hypocrea orientalis AFD50197.1
EU7-22
GH61A (GH61A) Lasiodiplodia CAJ81215.1
theobromae CBS
247.96
GH61B (GH61B) Lasiodiplodia CAJ81216.1
theobromae CBS
247.96
GH61C (GH61C) Lasiodiplodia CAJ81217.1
theobromae CBS
247.96
GH61D (GH61D) Lasiodiplodia CAJ81218.1
theobromae CBS
247.96
ORF Leptosphaeria CBX91313.1
E4ZJM8
maculans v23.1.3
ORF Leptosphaeria CBX93546.1
E4ZQ11
maculans v23.1.3
ORF Leptosphaeria CBX94224.1
E4ZS44
maculans v23.1.3
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 25 PCT/FR2016/051306
Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot
ORF Leptosphaeria CBX94532.1 E4ZSU4
maculans v23.1.3
ORF Leptosphaeria CBX94572.1 E4ZSY4
maculans v23.1.3
ORF Leptosphaeria CBX95655.1 E4ZVM9
maculans v23.1.3
ORF Leptosphaeria CBX96476.1 E4ZZ41
maculans v23.1.3
ORF Leptosphaeria CBX96550.1 E4ZYM4
maculans v23.1.3
ORF Leptosphaeria CBX96949.1 E5A089
maculans v23.1.3
ORF Leptosphaeria CBX97718.1 E5A201
maculans v23.1.3
ORF Leptosphaeria CBX98126.1 E5A3B3
maculans v23.1.3
ORF Leptosphaeria CBY01974.1 E5AFI5
maculans v23.1.3
ORF Leptosphaeria CBY02242.1 E5ACP0
maculans v23.1.3
ORF Leptosphaeria CBX91667.1 E4ZK72
maculans v23.1.3
ORF Leptosphaeria CBX93965.1 E4ZQA3
maculans v23.1.3
ORF Leptosphaeria CBX98254.1 E5A3P1
maculans v23.1.3
ORF (fragment) Leptosphaeria CBY00196.1 E5A955
maculans v23.1.3
ORF Leptosphaeria CBY01204.1 E5AC13
maculans v23.1.3
predicted protein (Lema p000430.1) Leptosphaeria CBY01256.1 E5ADG7
(fragment) maculans v23.1.3
ORF (fragment) Leptosphaeria CBY01257.1 E5ADG8
maculans v23.1.3
lytic polysaccharide monooxygenase Leucoagaricus CDJ79823.1
gongylophorus
Ae322
MG05364.4 Magnaporthe grisea EAA54572.1
70-15 (Maggr1) XP 359989.1
MG07686.4 Magnaporthe grisea EAA53409.1 G4N3E5
70-15 (Maggr1) XP 367775.1
MG07300.4 Magnaporthe grisea EAA56945.1 G4MUY8
70-15 (Maggr1) XP 367375.1
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 26 PCT/FR2016/051306
Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot
MG08020.4 Magnaporthe grisea EAA57051.1
70-15 (Maggr1) XP 362437.1
MG08254.4 Magnaporthe grisea EAA57285.1 G4MXC7
70-15 (Maggr1) XP 362794.1
MG08066.4 (fragment) Magnaporthe grisea EAA57097.1 G4MXS5
70-15 (Maggr1) XP 362483.1
MG04547.4 Magnaporthe grisea EAA50788.1 G4MS66
70-15 (Maggr1) XP 362102.1
MG08409.4 Magnaporthe grisea EAA57439.1 G4MVX4
70-15 (Maggr1) XP 362640.1
MG09709.4 Magnaporthe grisea EAA49718.1 G4NA15
70-15 (Maggr1) XP 364864.1
MG06069.4 Magnaporthe grisea EAA52941.1 G4N560
70-15 (Maggr1) XP 369395.1
MG09439.4 Magnaporthe grisea EAA51422.1 G4NHT8
70-15 (Maggr1) XP 364487.1
MG06229.4 Magnaporthe grisea EAA56258.1
70-15 (Maggr1) XP 369714.1
MG07631.4 Magnaporthe grisea EAA53354.1 G4N2Z0
70-15 (Maggr1) XP 367720.1
MGG 06621 Magnaporthe grisea XP 003716906.1
70-15 (Maggr1) XP 370106.1
MGG 12696 Magnaporthe grisea XP 003721313.1
70-15 (Maggr1)
MGG 02502 Magnaporthe grisea XP 003709306.1
70-15 (Maggr1) EAA54517.1
XP 365800.1
MGG 04057 Magnaporthe grisea XP 003719782.1
70-15 (Maggr1) EAA50298.1
XP 361583.1
MGG 13241 Magnaporthe grisea XP 003711808.1
70-15 (Maggr1)
MGG 13622 Magnaporthe grisea XP 003717521.1
70-15 (Maggr1)
MGG 07575 Magnaporthe grisea XP 003711490.1
70-15 (Maggr1) EAA53298.1
XP 367664.1
MGG 11948 Magnaporthe grisea XP 003709110.1
70-15 (Maggr1)
MGG 16080 (fragment) Magnaporthe grisea XP 003709033.1
70-15 (Maggr1)
MGG 16043 (fragment) Magnaporthe grisea XP 003708922.1
70-15 (Maggr1)
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 27 PCT/FR2016/051306
Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot
MGG 12733 (probable fragment) Magnaporthe grisea XP 003716689.1
70-15 (Maggr1)
copper-dependent polysaccharide Malbranchea CCP37674.1
monooxygenases (Gh61) (fragment) cinnamomea CBS
115.68
copper-dependent polysaccharide Melanocarpus CCP37668.1
monooxygenases (Gh61) (fragment) albomyces CBS
638.94
copper-dependent polysaccharide Myceliophthora CCP37667.1
monooxygenases (Gh61) (fragment) fergusii CBS 406.69
MYCTH 2112799 Myceliophthora AE061257.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH 79765 Myceliophthora AE056016.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH 110651 Myceliophthora AE054509.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH 2298502 Myceliophthora AE055082.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH 2299721 Myceliophthora AE055652.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH 2054500 Myceliophthora AE055776.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH 111088 Myceliophthora AE056416.1
thermophila ATCC
42464
8-glycan-cleaving enzyme Myceliophthora AE056542.1
(StCeI61a ; MYCTH 46583) thermophila ATCC
(CeI61A) 42464
MYCTH 2301632 Myceliophthora AE056547.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH 100518 Myceliophthora AE056642.1
thermophila ATCC
42464
lytic polysaccharide monooxygenases Myceliophthora AE056665.1
(active on cellulose) (MYCTH 92668) thermophila ATCC
42464
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 28 PCT/FR2016/051306
Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot
MYCTH 2060403 Mycetiophthora AE058412.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH 2306673 Mycetiophthora AE058921.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH 116175 (fragment) Mycetiophthora AE059482.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH 96032 Mycetiophthora AE059823.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH 103537 Mycetiophthora AE059836.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH 55803 Mycetiophthora AE059955.1
thermophila ATCC
42464
lytic polysaccharide monooxygenases Mycetiophthora AE060271.1
(active on cellulose) thermophila ATCC
(MYCTH 112089) 42464
MYCTH 85556 Mycetiophthora AE061304.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH 2311323 Mycetiophthora AE061305.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH 47093 (fragment) Mycetiophthora AE056498.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH 80312 Mycetiophthora AE058169.1
thermophila ATCC
42464
lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa CAD21296.1 Q1K8B6
(active on cellulose) (PM0- 0R74A EAA32426.1 Q8WZQ2
2;NcLPM09D;GH61- XP 326543.1
4;NCU01050) (LPM09D)
lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa CAD70347.1 Q1K4Q1
(active on cellulose) (PM0- 0R74A EAA26656.1 Q873G1
03328;NcLPM09F;GH61- XP 322586.1
6;NCU03328) (LPM09F)
lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa CAE81966.1 Q7SHD9
(PM0-01867 ; NcLPM09J ; GH61- 0R74A EAA36262.1
; NCU01867 ; XP 329057.1
B13N4.070) (LPM09J)
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 29 PCT/FR2016/051306
Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot
NCU02344.1 (B23N11.050) Neurospora crassa CAF05857.1 Q7S411
0R74A EAA30230.1
XP 331120.1
lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa EAA33178.1 Q7SA19
(active on cellulose) (PM0- 0R74A XP 328604.1
3;NcLPM09M;GH61-13;NcPM0-
3;NCU07898) (LPM09M)
NCU05969.1 Neurospora crassa EAA29347.1 Q7S1V2
0R74A XP 325824.1
lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa EAA36362.1 Q7SH18
(active on cellulose and 0R74A XP 330104.1
cellooligosaccharides) (PM0-
02916;NcLPM09C;GH61-
3;NCU02916) (LPM09C)
lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa EAA29018.1 Q7S111
(active on cellulose) (GH61- 0R74A XP 328466.1
2;NCU07760)
NCU07520.1 Neurospora crassa EAA29132.1 Q7S1A0
0R74A XP 327806.1
lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa EAA30263.1 Q7S439
(active on cellulose) (GH61- 0R74A XP 331016.1
1;NCU02240)
lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa EAA34466.1 Q7SCJ5
(active on cellulose) (NCU00836) 0R74A XP 325016.1
lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa EAA26873.1 Q7RWN7
(active on cellulose) (PM0- 0R74A XP 330877.1
08760;NcLPM09E;GH61-
5;NCU08760) (LPM09E)
NCU07974.1 Neurospora crassa EAA33408.1 Q7SAR4
0R74A XP 328680.1
NCU03000.1 (B24P7.180) Neurospora crassa EAA36150.1 Q7RV41
0R74A CAB97283.2 Q9P3R7
XP 330187.1
cellulose monooxygenase Penicillium oxalicum A1006742.1
GZ-2
Pc12g13610 Penicillium CAP80988.1 B6H016
chrysogenum
Wisconsin 54-1255
(PenchWisc1 1)
Pc13g07400 Penicillium CAP91809.1 B6H3U0
chrysogenum
Wisconsin 54-1255
(PenchWisc1 1)
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 30 PCT/FR2016/051306
Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot
Pc13g13110 Penicillium CAP92380.1 B6H3A3
chrysogenum
Wisconsin 54-1255
(PenchWisc1 1)
Pc20g11100 Penicillium CAP86439.1 B6HG02
chrysogenum
Wisconsin 54-1255
(PenchWisc1 1)
CeI61 (CeI61A) Phanerochaete AAM22493.1 Q8NJI9
chrysosporium BKM-
F-1767
Lytic polysaccharide mono- Phanerochaete BAL43430.1
oxygenase active on cellulose chrysosporium K-3
(Gh61D;PcGH61D)
PIIN 01487 Piriformospora indica CCA67659.1
(Pirinl)
PIIN 02110 Piriformospora indica CCA68244.1
(Pirinl)
PI IN 03975 Piriformospora indica CCA70035.1
(Pirinl)
P I IN 04357 Piriformospora indica CCA70418.1
(Pirinl)
PIIN 04637 Piriformospora indica CCA70703.1
(Pirinl)
PIIN 06117 Piriformospora indica CCA72182.1
(Pirinl)
PIIN 06118 Piriformospora indica CCA72183.1
(Pirinl)
PIIN 06127 Piriformospora indica CCA72192.1
(Pirinl)
PIIN 06155 Piriformospora indica CCA72220.1
(Pirinl)
PI IN 07098 Piriformospora indica CCA73144.1
(Pirinl)
PIIN 07105 Piriformospora indica CCA73151.1
(Pirinl)
PIIN 08199 Piriformospora indica CCA74246.1
(Pirinl)
PI IN 08783 Piriformospora indica CCA74814.1
(Pirinl)
PI IN 09022 Piriformospora indica CCA75037.1
(Pirinl)
PIIN 00566 (fragment) Piriformospora indica CCA66803.1
(Pirinl)
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 31
PCT/FR2016/051306
Nom Organisme Ref.
GenBank Réf.
Uniprot
Pli N_01484 Piriformospora
indica CCA67656.1
(Pirinl)
PIIN 01485 (fragment) Piriformospora
indica CCA67657.1
(Pirinl)
PIIN 01486 (fragment) Piriformospora
indica CCA67658.1
(Pirinl)
P I IN 04356 Piriformospora
indica CCA70417.1
(Pirinl)
PIIN 05699 (fragment) Piriformospora
indica CCA71764.1
(Pirinl)
PIIN 06156 Piriformospora
indica CCA72221.1
(Pirinl)
Pli N_08402 Piriformospora
indica CCA74449.1
(Pirinl)
PI IN 10315 (fragment) Piriformospora
indica CCA76320.1
(Pirinl)
P I IN 10660 (fragment) Piriformospora
indica CCA76671.1
(Pirinl)
PIIN 00523 (fragment) Piriformospora
indica CCA77877.1
(Pirinl)
Putative Glycoside Hydrolase Family Podospora anserina CDP30131.1 B2AL94
61 S mat+ (Podan2) CAP64732.1
Putative Glycoside Hydrolase Family Podospora anserina CDP30928.1 B2B346
61 S mat+ (Podan2) CAP71532.1
Pa 1 500 Podospora
anserina CAP59702.1 B2A9F5
S mat+ (Podan2) CDP22345.1
Pa 4 350 Podospora
anserina CAP61395.1 B2AD80
S mat+ (Podan2) CDP27750.1
Pa 4 1020 Podospora
anserina CAP61476.1 B2ADG1
S mat+ (Podan2) CDP27830.1
Pa 0 270 Podospora
anserina CAP61650.1 B2ADY5
S mat+ (Podan2) CDP28001.1
Pa 5 8940 Podospora
anserina CAP64619.1 B2AKU6
S mat+ (Podan2) CDP30017.1
Pa 5 4100 (fragment) Podospora
anserina CAP64865.1 B2ALM7
S mat+ (Podan2) CDP29378.1
Pa 5 6950 Podospora
anserina CAP65111.1 B2AMI8
S mat+ (Podan2) CDP29800.1
Pa 5 10660 Podospora
anserina CAP65855.1 B2APD8
S mat+ (Podan2) CDP30283.1
Pa 5 10760 Podospora
anserina CAP65866.1 B2APE9
S mat+ (Podan2) CDP30272.1
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 32
PCT/FR2016/051306
Nom Organisme Ref.
GenBank Réf.
Uniprot
Pa 5 11630 (fragment) Podospora
anserina CAP65971.1 B2AP19
S mat+ (Podan2) CDP30166.1
Pa 4 7570 Podospora
anserina CAP66744.1 B2ARG6
S mat+ (Podan2) CDP28479.1
Pa 1 21900 (fragment) Podospora
anserina CAP67176.1 B2AS05
S mat+ (Podan2) CDP24589.1
Pa 1 22040 Podospora
anserina CAP67190.1 B2AS19
S mat+ (Podan2) CDP24603.1
Pa 1 22150 (fragment) Podospora
anserina CAP67201.1 B2AS30
S mat+ (Podan2) CDP24614.1
Pa 6 11220 Podospora
anserina CAP67466.1 B2ASU3
S mat+ (Podan2) CDP30332.1
Pa 6 11370 Podospora
anserina CAP67481.1 B2ASV8
S mat+ (Podan2) CDP30347.1
Pa 6 11470 Podospora
anserina CAP67493.1 B2ASX0
S mat+ (Podan2) CDP30359.1
Pa 1 16300 Podospora
anserina CAP67740.1 B2ATL7
S mat+ (Podan2) CDP23998.1
Pa 7 5030 Podospora
anserina CAP68173.1 B2AUVO
S mat+ (Podan2) CDP31642.1
Pa 7 3770 Podospora
anserina CAP68309.1 B2AV86
S mat+ (Podan2) CDP31780.1
Pa 7 3390 Podospora
anserina CAP68352.1 B2AVC8
S mat+ (Podan2) CDP31823.1
lytic polysaccharide mono-oxygenase Podospora anserina CAP68375.1 B2AVF1
active on cellulose S mat+ (Podan2) CDP31846.1
(Gh61B;Pa 7 3160)(Gh61B)
Pa 6 7780 Podospora
anserina CAP71839.1 B2B403
S mat+ (Podan2) CDP31230.1
Pa 2 1700 Podospora
anserina CAP72740.1 B2B4L5
S mat+ (Podan2) CDP25137.1
Pa 2 4860 Podospora
anserina CAP73072.1 B2B5J7
S mat+ (Podan2) CDP25472.1
lytic polysaccharide mono-oxygenase Podospora anserina CAP73254.1 B2B629
active on cellulose S mat+ (Podan2) CDP25655.1
(Gh61A;Pa 2 6530)(Gh61A)
Pa 2 7040 Podospora
anserina CAP73311.1 B2B686
S mat+ (Podan2) CDP25714.1
Pa 2 7120 Podospora
anserina CAP73320.1 B2B695
S mat+ (Podan2) CDP25723.1
Pa 3 190 Podospora
anserina CAP61048.1 B2AC83
S mat+ (Podan2) CDP26500.1
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 33 PCT/FR2016/051306
Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot
Pa 3 2580 Podospora anserina CAP70156.1
B2AZV6
S mat+ (Podan2) CDP26748.1
Pa 3 3310 Podospora anserina CAP70248.1
B2AZD4
S mat+ (Podan2) CDP26841.1
endo-i3-1,4-glucanase (Egll ; Pyrenochaeta AEV53599.1
PIEGL1) lycopersici ISPaVe
ER 1211
copper-dependent polysaccharide Rasamsonia CCP37669.1
monooxygenases (Gh61) (fragment) byssochlamydoides
CBS 151.75
copper-dependent polysaccharide Remersonia CCP37675.1
monooxygenases (Gh61) (fragment) thermophila CBS
540.69
RHTOOS 28e01816g Rhodosporidium CDR49619.1
toruloides CECT1137
copper-dependent polysaccharide Scytalidium CCP37676.1
monooxygenases (Gh61) (fragment) indonesiacum CBS
259.81
SMU2916 (fragment) Sordaria macrospora CAQ58424.1 Cl
KU36
k-hell
lytic polysaccharide mono-oxygenase Thermoascus ABW56451.1
active on cellulose aurantiacus ACS05720.1
copper-dependent polysaccharide Thermoascus CCP37673.1
monooxygenases (Gh61) (fragment) aurantiacus CBS
891.70
ORF Thermoascus AG068294.1
aurantiacus var.
levisporus
copper-dependent polysaccharide Thermomyces CCP37672.1
monooxygenases (Gh61) (fragment) dupontii CBS 236.58
copper-dependent polysaccharide Thermomyces CCP37678.1
monooxygenases (Gh61) (fragment) lanuginosus CBS
632.91
unnamed protein product Thiela via terrestris CAG27576.1
TH ITE 2106556 Thiela via terrestris AE062422.1
NRRL 8126
THITE 2116536 Thiela via terrestris AE067662.1
NRRL 8126
TH ITE 2040127 Thiela via terrestris AE064605.1
NRRL 8126
THITE 2119040 Thiela via terrestris AE069044.1
NRRL 8126
TH ITE 115795 Thiela via terrestris AE064177.1
NRRL 8126
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 34 PCT/FR2016/051306
Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot
THITE 2110890 Thiela via terrestris AE064593.1
NRRL 8126
THITE 2112626 Thiela via terrestris AE065532.1
NRRL 8126
THITE 2076863 Thiela via terrestris AE065580.1
NRRL 8126
TH ITE 170174 Thiela via terrestris AE066274.1
NRRL 8126
THITE 2044372 Thiela via terrestris AE067396.1
NRRL 8126
THITE 2170662 Thiela via terrestris AE068023.1
NRRL 8126
TH ITE 128130 Thiela via terrestris AE068157.1
NRRL 8126
THITE 2145386 Thiela via terrestris AE068577.1
NRRL 8126
THITE 2054543 Thiela via terrestris AE068763.1
NRRL 8126
THITE 2059487 Thiela via terrestris AE071031.1
NRRL 8126
THITE 2142696 Thiela via terrestris AE067395.1
NRRL 8126
THITE 43665 Thiela via terrestris AE069043.1
NRRL 8126
THITE 2085430 (fragment) Thiela via terrestris AE063926.1
NRRL 8126
THITE 2122979 Thiela via terrestris XP 003657366.1
NRRL 8126
cellulase-enhancing factor (GH61B) Thiela via terrestris
ACE10231.1
NRRL 8126
Sequence 4 from patent US Thiela via terrestris ACE10232.1
7361495 (GH61C) NRRL 8126
Sequence 4 from patent US Thiela via terrestris ACE10232.1
7361495 (GH61C) NRRL 8126
Sequence 6 from patent US Thiela via terrestris ACE10233.1
7361495 (GH61D) NRRL 8126
Sequence 6 from patent US Thiela via terrestris ACE10233.1
7361495 (GH61D) NRRL 8126
lytic polysaccharide mono-oxygenase Thielavia terrestris AE071030.1
active on cellulose NRRL 8126 ACE10234.1
(131562 ;TtGH61E)(GH61E)
Sequence 10 from patent US Thiela via terrestris ACE10235.1
7361495 (GH61G) NRRL 8126
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 35 PCT/FR2016/051306
Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot
Sequence 10 from patent US Thiela via terrestris ACE10235.1
7361495 (GH61G) NRRL 8126
Lytic polysaccharide mono- Trichoderma reesei AAP57753.1 Q7Z9M7
oxygenase active on cellulose QM6A ABH82048.1
(EG7;HjGH616)(Ce161B=GH61B) ACK19226.1
ACR92640.1
endo-i3-1,4-glucanase IV Trichoderma reesei CAA71999.1 014405
(EGIV;Eg14;EG4) (CeI61A) RUTC-30
endoglucanase (EnGluIV;EndoGluIV) Trichoderma ADB89217.1 D3JTC4
satumisporum
endoglucanase IV (EgIV;EG IV) Trichoderma sp. SSL ACH92573.1 B5TYI4
endoglucanase VII (EgvII) Trichoderma viride ACD36971.1 B4YEW1
AS 3.3711
endoglucanase IV (EgIV) Trichoderma viride ADJ57703.1 B4YEW3
AS 3.3711 ACD36973.1 D9IXC6
AAA12YMO5FL uncultured eukaryote CCA94933.1
AAA2YGO1FL uncultured eukaryote CCA94930.1
AAA15Y110FL uncultured eukaryote CCA94931.1
AAA21YH11FL uncultured eukaryote CCA94932.1
ABA3YPO5FL uncultured eukaryote CCA94934.1
endoglucanasell(Eg11) Volvariella volvacea AFP23133.1
endoglucanasell(Eg11) Volvariella volvacea AAT64005.1 Q6E5B4
V14
unknown Zea mays 873 ACF86151.1
unknown (ZM BFc0036G02) Zea mays 873 ACF78974.1 B4FA31
ACR36748.1
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 36 PCT/FR2016/051306
Tableau 2:
LPM0s (familles AA9, AA10 et AA11 de la classification CAZy).
Par spécificité de substrat , on entend le type de substrat clivé (clivage
oxydatif) par l'enzyme LPMO correspondante.
Par sélectivité connue , on entend le carbone du cycle de glucose oxydé
par
l'enzyme LPMO correspondante
Par Modularité , on entend la classe CAZy (AA9, 10 ou 11) de l'enzyme et
la
présence connue d'un domaine conservé (CBM ou X278).
Réf. Réf. Spécificité
Sélectivité
Organisme
Uniprot GenBank Autres noms de
Modularité
substrat connue
champignons
A. oryzae Q2UA85 BAE61530 AoAAll chitine Cl AA11-X278
A. nidulan EAA AA13-
s C8VGF8 62623.1 AnAA13 amidon Cl CBM20
M. MYCTH 1120
thermophila G2QI82 AE060271 89 cellulose Cl
AA9
M. MYCTH 9266
thermophila G2QAB5 AE056665 8 cellulose Cl
AA9
Q7RWN
N. crassa 7 EAA26873
NcLPM09E cellulose Cl AA9¨CBM1
Q1K8B6
08WZ0 EAA32426
N. crassa 2 CAD21296 NcLPM09D
cellulose 04 AA9
N. crassa Q75A19 EAA33178 NcLPM09M cellulose 01,04 AA9
cellulose
hemicellu-
N. crassa Q75HI8 EAA36362 NcLPM09C lose 04 AA9¨CBM1
EAA26656
N. crassa Q1K4Q1 0AD70347 NcLPM09F cellulose Cl
AA9
N. crassa Q7SCJ5 EAA34466 NcU00836 cellulose Cl
AA9-CBM1
EAA AA13-
N. crassa 07SCE9 34371.2 NcAA13 amidon Cl CBM20
N. crassa 07S439 EAA30263 NcU02240 cellulose 04
AA9-CBM1
N. crassa Q7S111 EAA29018 NcU07760 cellulose Cl , 04 AA9-CBM1
P.
chrysosporium H1AE14 BAL43430 PcLPM09D cellulose Cl
AA9
PaGH61A
P. anserina B2B629 CAP73254 PaLMPOB cellulose Cl a, C4a AA9-CBM1
PaGH61B
P. anserina B2AVF1 CAP68375 PaLMPO9A cellulose Cl, 04 AA9-CBM1
AA9
P. anserina B2ARG6 CAP66744 PaLPM09D cellulose Cl CBM1
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 37 PCT/FR2016/051306
Réf. Réf. Spécificité
Sélectivité
Organisme Autres noms de
Modularité
Uniprot GenBank connue
substrat
AA9
CBM1
P. anserina B2ATL7 CAP67740 PaLPM09E cellulose Cl
AA9
CBM1
P. anserina B2B403 CAP71839 PaLPM09F cellulose n.d
AA9
CBM1
P. anserina B2B5J7 CAP73072 PaLPM09G cellulose n.d
AA9
CBM1
P. anserina B2ADG1 CAP64476 PaLPM09H cellulose Cl, 04
T. ABW5645
aurantiacus G3XAP7 1 TaGH61A cellulose Cl AA9
T. terrestris G2RGE5 AE071030 cellulose n.d. AA9
T. reesei Q7Z9M7 AAP57753 cellulose n.d. AA9
T. reesei 014405 CAA71999 CeI61A cellulose n.d. AA9
Bacteria
Bacillus
amyloliquefa-
ciens El UUV3 CBI42985 n.d. n.d. AA10
Burkholderia BURPS1710b
pseudomallei 0114
1710b Q3JY22 ABA49030 (BpAA10A) n.d. n.d. AA10
Bacillus
licheniformes Q62YN7 AAU22121 chitine Cl AA10
[3-1,4-
Caldibacillus man nanase
cellulovorans Q9RFX5 AAF22274 (ManA) n.d. n.d. AA10
Enterococcus
faecalis Q838S1 AA080225 EfLPM010A chitine Cl AA10
LPMO
(HcAA10-
Hahella 2;HCH 00807
chejuensis Q25N53 ABC27701 ) cellulose nd AA10
Serratia
marcescens 083009 AAU88202 SmLPM010A chitine Cl AA10
Streptomyces cellulose
coelicolor Q9RJC1 CAB61160 ScLPM010B chitine 01,04 AA10
Streptomyces AA10-
coelicolor Q9RJY2 CAB61600 ScLPM0100 cellulose Cl CBM2
CA 02988109 2017-12-01
WO 2016/193617 38 PCT/FR2016/051306
Réf. Réf. Spécificité
Sélectivité
Organisme
Uniprot GenBank Autres noms de
Modularité
substrat connue
Thermobifida cellulose
fusca Q47QG3 AAZ55306 TfLPM010A chitine Cl , C4 AA10
Thermobifida AA10-
fusca Q47PB9 AAZ55700 TfLPM010B cellulose Cl CBM2
V.
cholerae01 Q9KLD5 AAF96709 VcLPM010B n.d. n.d. AA10
