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Peptides immunogènes et leur utilisation
[1] La présente invention concerne des peptides immunogènes et leur
utilisation,
notamment dans le cadre du diagnostic de pathologies.
[2] Avec un tiers de la population mondiale infectée et un décès toutes les 20
secondes, la tuberculose (TB) reste une des maladies les plus meurtrières au
monde.
Aucun test de diagnostic rapide, précis et validé selon les attentes des
autorités de
santé, et notamment de l'Organisation Mondiale pour la Santé (OMS) n'est
commercialisé à ce jour, le test de référence nécessitant plusieurs semaines
avant de
donner un résultat.
[3] Aujourd'hui, les méthodes internationales de référence pour le diagnostic
de la
TB sont longues (jusqu'à 8 semaines pour la culture bactériologique),
insuffisamment
performantes, coûteuses et difficiles à mettre en oeuvre car elles utilisent
des
prélèvements pulmonaires, nécessitent un laboratoire de niveau de sécurité 3
ainsi que
l'hospitalisation du malade.
[4] Pour la première fois de son histoire, l'OMS a publié en 2011 une
recommandation de politique générale explicitement négative contre
l'utilisation de la
première génération commercialisée de tests sérologiques pour le diagnostic de
la TB
(OMS 2011, commercial sérodiagnostic tests for diagnosis of TB:
policystatement).
[5] Plus d'un million de ces tests non validés cliniquement et avec de
mauvaises
performances étaient vendus chaque année dans le monde notamment dans les pays
du Sud (Afrique, Asie) en profitant des faibles contraintes réglementaires
locales. La
quasi-totalité de ces tests utilisent les mêmes antigènes et ils n'ont jamais
fait l'objet
d'une validation clinique rigoureuse entrainant des performances très faibles
avec un
risque pour les patients.
[6] L'OMS ouvre ainsi la porte à une opportunité pour une nouvelle génération
de
tests satisfaisants à des critères stricts de qualité et de validation
clinique.
[7] Au
cours de l'infection latente, le bacille de la TB est contenu dans un
macrophage qualifié de spumeux en raison de l'aspect microscopique de son
cytoplasme saturé de vacuoles lipidiques. Mycobacteriumtuberculosis stocke les
acides
gras sous forme de triglycérides (TG) permettant l'entrée de la bactérie en
phase de
dormance (TB latente). Ces vacuoles lipidiques constituent une source de
carbone pour
la bactérie et sont utilisées par celle-ci pour la sortie de la dormance et sa
réactivation
(TB active). La réduction des niveaux de TG lors de la réactivation de la TB
coïncide
avec l'augmentation de l'activité de certaines protéines dégradant les TG.
Certaines de
ces protéines, jusqu'alors peu étudiées, semblent étroitement associées à la
réactivation de la TB à partir des formes latentes et présentent donc un
intérêt majeur
pour l'identification précoce de la TB active ou pour le suivi des cas de TB
latente à
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haut risque de développer la forme grave de la maladie.
[8] On
connait de l'état de la technique la demande de brevet WO/2012/164088 qui
enseigne une méthode de diagnostic de la tuberculose active basé sur des
ELISpot B
utilisant des protéines lipases à activité lipolytique.
[9] Toutefois,
une telle méthode, bien qu'efficace dans la cadre de la détection
précoce de la tuberculose active ne peut être mise en oeuvre qu'avec un
matériel lourd
dans un laboratoire équipé, nécessite des compétences techniques spécifiqueset
ne
peut donc être utilisée simplement sur le terrain auprès des populations à
risque.
[10] Aussi, existe-t-il un besoin de fournir une méthode plus simple qui
conserve un
niveau de sensibilité de détection de la TB active au moins aussi bon que
celui obtenu
avec la méthode de la demande W0/2012/164088.
[11] Un des buts de l'invention est donc de fournir une méthode de diagnostic
de la
tuberculose active qui puisse être mise en oeuvre facilement en toute
situation, et en
particulier en l'absence de d'infrastructures hospitalières fortement
équipées.
[12] Un autre but de l'invention est de déterminer les meilleurs candidats
peptidiques
permettant de mettre en oeuvre cette nouvelle méthode de diagnostic efficace
et rapide.
[13] Aussi l'invention concerne une méthode de criblage in vitro d'au moins un
peptide immunogène d'intérêt capable de reconnaitre au moins un anticorps issu
du
sérum d'individus atteints de tuberculose active, ledit au moins un peptide
immunogène
étant un peptide hydrophile issu d'une protéine hydrophobe, ladite protéine
hydrophobe
étant une protéine de paroi, ou sécrétées, de bactéries du genre
Mycobacterium, ladite
protéine hydrophobe présentant une activité lipolytique, ladite méthode
comprenant les
étapes suivantes:
+ la mise en contact d'au moins un peptide hydrophile issu d'au moins une
protéine
hydrophobe avec
- successivement au moins deux pools indépendants de sérums issus de
patients
atteints de tuberculose active confirmée, pour permettre la formation de
complexes immuns entre lesdits anticorps et lesdits peptides à cribler, et
- au moins un échantillon contrôle issu d'un individu n'étant pas atteint
de
tuberculose,
+ ,la détection de la formation de complexes immuns à l'étape précédente,
+ une première sélection des peptides d'intérêt pour lesquels la valeur
d'un ratio R est
supérieure ou égale à 1,5 pour au moins un des pools indépendants de sérums
issus
de patients atteints de tuberculose active confirmée,
le ratio R étant la valeur normalisée de mesure de la formation de complexe
immun, par
rapport aux bruits de fond respectifs des sérums et des composants utilisés
pour
détecter les complexes immuns, sur, ou divisé par, la valeur de mesure
normalisée
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obtenue à partir de l'échantillon issu d'un individu sain par rapport aux
bruits de fond
respectifs des sérums et des composants utilisés pour détecter les complexes
immuns.
[14] L'invention repose sur la constatation surprenante faite par les
inventeurs selon
laquelle certains peptides issus de protéines déterminées sont de très bons
candidats
pour mettre en oeuvre une méthode de diagnostic de la tuberculose active, tout
en
proposant une sensibilité et une efficacité de détection de la pathologie à un
niveau
élevé.
[15] Le diagnostic proposé par l'invention peut être réalisée chez l'homme
mais aussi
chez les animaux.
[16] Ci-après, la tuberculose sera désignée de manière uniforme "la
tuberculose ou
T B)>.
[17] Dans l'invention, les termes "protéine hydrophobe présentant une activité
lipolytique" sont utilisés pour désigner une enzyme à activité lipolytique et
comprennent,
phospholipases A, 6, C ou D, et les lipases, notamment de triglycérides
lipases, des
lipases ou des diglycérides, de monoglycérides lipases.
[18] Durant l'infection, Mycobacteriumtuberculosis accumule des corps
d'inclusion
intracellulaires chargés de lipides dont les lipides sont probablement issus
de la
dégradation de la membrane cellulaire de l'hôte. On dispose désormais de
fortes
évidences supportant le fait que les acides gras représentent une source de
carbone
durant la dormance. Mycobacteriumtuberculosis stocke des acides gras sous la
forme
de triacylglycérol (TAG) lors de son entrée dans le stade non réplicatif
persistant (état
latent). De plus, des granulomes contenant des macrophages spumeux qui sont
des
cellules contenant dans leur cytoplasme une grande quantité de lipides neutres
entourés de phospholipides ont été trouvés. Ces corps lipidiques sont induits
par
l'internalisation de la bactérie et par conséquent fournissent une source de
carbone
pour la survie et la réactivation du pathogène. Plus généralement, ces
découvertes
supportent le fait que les enzymes impliquées dans la dégradation des lipides
peuvent
assumer des fonctions physiologiques importantes et peuvent participer à
l'extraordinaire capacité de survie et à laréactivation de
Mycobacteriumtuberculosis à
partir des cellules infectées. La dégradation des lipides de l'hôte par
Mycobacteriumtuberculosis est probablement réalisée par des enzymes
lipolytiques,
telles que les lipases et les phospholipases, comprenant la famille des
enzymes
cutinases.
[19] Les lipases sont des protéines solubles dans l'eau ayant une activité
lipolytique
appartenant au groupe des estérases et catalysant l'hydrolyse de substrats
insolubles
dans l'eau comme les liaisons ester du triacylglycérol et des phospholipides.
[20] Dans ce contexte, la réaction catalytique de lipolyse implique différents
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processus à l'interface et dépend étroitement de la structure des substrats
lipidiques
présents dans les émulsions huile dans, eau, les bicouches membranaires, les
monocouches, les micelles et les vésicules. Le processus catalytique peut être
décrit
comme une étape réversible d'adsorption/désorption des lipases ayant lieu à
l'interface
huile/eau, suivie par la formation d'un complexe enzyme/substrat à l'interface
et la
libération des produits de lipolyse. Parmi les lipases de M. tuberculosis
identifiées, 24
ont été classées dans la famille des enzymes appelée "famille Lip". Toutefois,
cette
classification est seulementbasée sur la présence de la séquence consensus
GXSXG
qui est caractéristique des estérases et des membres de la famille des
hydrolases
possédant des feuillets a/6.
[21] Dans l'invention, la méthode de détection de peptides immunogènes repose
donc sur la mise à profit des propriétés des protéines à activité lipolytique
(qui
permettent de détecter la tuberculose active) tout en s'affranchissant de la
difficulté de
travailler avec des protéines entières, qui peuvent être difficiles à
manipuler et/ou
couteuses et complexe à produire.
[22] En effet, il est particulièrement pertinent de trouver de petits
fragments
immunogènes desdites protéines à activité lipolytiques, puisque celles-ci sont
des
protéines membranaires (insérées dans la bicouche lipidique) et sont par
conséquent
hydrophobes, ou tout simplement car il s'agit de protéines dégradant les
lipides, donc
hydrophobes.
[23] Par protéine hydrophobe , en entend dans l'invention une protéine qui
est
considérée, dans sa globalité comme présentant peu d'affinité pour les
solutions
aqueuses et qui sera peu à même de se dissoudre dans un liquide aqueux.
[24] Les protéines sont composés d'acides aminés qui peuvent être polaires
(hydrophiles) ou hydrophobes. Lorsque la protéine est synthétisée, elle adopte
une
conformation tridimensionnelle spécifique liée à son activité ou sa fonction
de sorte que
les acides aminés éloignés les uns des autres dans la séquence peuvent se
retrouver à
proximité dans l'espace. Si au cours du repliement d'une protéine, l'ensemble
des
acides aminés polaires se retrouvent à l'intérieur d'une poche qui est
entourée d'acides
aminés hydrophobes, la protéine entière sera alors considérée comme
hydrophobe,
ceci même si la proportion d'acides aminés hydrophiles est plus importante que
celle
des acides aminés hydrophobes.
[25] De la même manière, une protéine sera considérée comme hydrophile, si sa
conformation tridimensionnelle est telle que la majorité des acides aminés
présents à la
surface de la protéine sont hydrophiles.
[26] La notion d'hydrophilie et d'hydrophobicité d'une protéine sont bien
connus de
l'homme du métier. Il est d'ailleurs possible pour l'homme du métier, à partir
de la
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séquence primaire d'une protéine de déterminer son profil
hydrophilie/hydrophobicité
en prédisant sa structure et son indice d'hydrophobicité.
[27] Dans l'invention on appelle peptide hydrophile issu d'une protéine
hydrophobe)> un fragment de ladite protéine hydrophobe, telle que définie ci-
dessus,
dont les propriétés sont d'être facilement soluble et stable dans un liquide
aqueux,
c'est-à-dire dans l'eau ou des solvants polaires.
[28] Pour prédire les peptides hydrophiles à cribler selon l'invention à
partir de
protéines hydrophobes, il est notamment possible de se baser sur la solubilité
desdits
peptides. Les séquences possédant de nombreux résidus basiques sans résidus
acides intercalant (balance acide/basique) peuvent être difficiles à
solubiliser. De ce
fait, une balance est déterminée afin d'analyser la solubilité de chacune des
séquences
peptidiques qui seront susceptibles d'être immunogènes après criblage.
[29] Il est donc important de choisir les peptides dont la balance
acide/basique Bab
est la plus grande, selon la formule :
Bab = Aaa-Bbb
OU
Aaa = (Na/N)x100 avec Na = le nombre de résidu d'acides aminés acides dans la
séquence et N = le nombre d'acides aminés, et
Bbb = (NbiN)X1 00 avec Na = le nombre de résidu d'acides aminés basiques dans
la
séquence et N = le nombre d'acides aminés.
[30] La solubilité peut aussi être prédite en comptabilisant le nombre de
résidus
chargés et en ajoutant les extrémités terminales libres du peptide.
Théoriquement, au
moins une charge tous les 5 résidus est requise pour obtenir une solubilité
minimale. Il
faut par ailleurs éviter un enchainement de plus de 3 à 4 résidus hydrophobes.
L'hydrophobicité à pH 6.8 permet de vérifier la solubilité du peptide dans un
tampon
aqueux. Cette valeur permet de vérifier la compatibilité avec les tampons de
couplage
lors de l'étape de conjugaison à la protéine porteuse.
[31] On notera que l'hydrophobicité à pH=6,8 correspond à la valeur de
l'hydrophobicité de chacun des acides aminés à pH= 6,8 sur le nombre total
d'acides
aminés du peptide considéré.
[32] Il peut notamment être avantageux de vérifier, avant de tester leur
immunogénicité que les peptides à cribler sont par exemple i) flexibles, c'est-
à-dire non
contraints spatialement, c'est à dire avec des épitopes libres d'accès pour
les éventuels
anticorps par rapport à la structure globale du peptide, ii) s'ils sont
retrouvés dans des
motifs protéiques conservés ou des structures secondaires (hélices, feuillets
6) ce qui
diminuerait leur spécificité, iii) s'ils sont retrouvés dans des régions
exposées sur la
protéine entière dont ils dérivent. L'homme du métier pourra également trouver
d'autres
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caractéristiques appropriées qui pourraient compléter son choix de peptides
potentiellement immunogènes.
[33] Une fois les peptides hydrophiles identifiés, leur immunogénicité est
alors testée
selon le procédé suivant :
1- chaque peptide est mis en contact avec au moins deux pools de sérums, les
sérums étant issus de patients atteints de TB active confirmée cliniquement,
et
2- en parallèle avec un échantillon contrôle issus d'un individu sain, qui
n'est pas
atteint de tuberculose, notamment active, c'est-à-dire un individu qui n'a
jamais
été en contact avec la tuberculose ou un patient qui est en phase latente de
la
tuberculose (et n'a donc pas développé de tuberculose active).
[34] L'objectif est de déterminer si les peptides testés sont capables de
former des
complexes immuns avec au moins un anticorps contenu dans lesdits pools de
sérums
d'individus atteints de TB active, ce qui signifie que les peptides sont
potentiellement
immunogènes.
[35] Les potentiels complexes immuns sont détectés selon des méthodes
classiques
qui consistent à marquer et identifier la présence d'un complexe immun en
détectant la
partie constante des anticorps qui ont potentiellement interagi avec les
peptides à
cribler au moyen d'immunoglobuline spécifiques des parties constantes des
anticorps
couplées à des marqueurs permettant une quantification.
[36] Une méthode de laboratoire classique de détection de ces complexes immuns
consiste en un test ELISA (Enzyme-linkedImmunoSorbentAssay). Cette méthode de
détection peut aussi être adaptée sur différents supports solides pour
faciliter
l'identification des complexes immuns en dehors des laboratoires.
[37] Afin de déterminer lesquels des peptides sont intéressant, un ratio R est
calculé,
le ratio R étant la valeur normalisée de mesure de la formation de complexe
immun, par
rapport aux bruits de fond respectifs des sérums et des composants utilisés
pour
détecter les complexes immuns, sur, ou divisé par, la valeur de mesure
normalisée
obtenue à partir de l'échantillon issu d'un individu sain par rapport aux
bruits de fond
respectifs des sérums et des composants utilisés pour détecter les complexes
immuns.
[38] Cela signifie que la formule suivante est appliquée :
R(Vp + e ¨ VBIanc) ¨ (Vs + e ¨ VBIanc)
= _______________________________________________________
(Vp + n ¨ VBIanc) ¨ (Vs + n ¨ VBIanc)
où:
- Vp+e correspond à la valeur mesurée lors de la détection d'un complexe immun
lorsque le peptide (p) est mis en contact avec le sérum de patient atteint de
TB
active (e),
- Vs+e correspond à la valeur mesurée lors de la détection d'un complexe immun
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lorsque le solvant du peptide (s) est mis en contact avec le sérum de patient
atteint
de TB active (e),
- Vp+n correspond à la valeur mesurée lors de la détection d'un complexe
immun
lorsque le peptide (p) est mis en contact avec le sérum d'un individu sain
(n),
- Vs correspond à la valeur mesurée lors de la détection d'un complexe immun
le
solvant du peptide (s) est mis en contact avec le sérum d'un individu sain
(n), et
- VBIanc correspond à la valeur mesurée lors de la détection d'un complexe
immun
à en l'absence de sérum quel qu'il soit, de peptide et de solvant.
[39] Les valeurs sont dites normalisées, puisque pour chaque mesure, il est
tenu
compte du potentiel bruit de fond de chaque matériel biologique : le sérum (on
compare
les sérums positifs avec le sérum d'un individu sain), le peptide (on compare
le peptide
avec son solvant)...
[40] Quelle que doit la méthode utilisée pour obtenir le ratio R, si pour un
peptide
déterminé le ratio tel que calculé ci-dessus est supérieur ou égal à 1,5, le
peptide sera
considéré comme particulièrement intéressant et susceptible de détecter
efficacement
des anticorps marqueurs de la TB active. A contrario, si le ratio R est
inférieur à 1,5 il ne
sera pas retenu.
[41] Dans l'invention, comme cela a été mentionné ci-dessus, chaque peptide
est
mis en contact avec au moins deux pools de sérums. On utilise dans une
première
approche un pool ou mélange de plusieurs sérums issus de patients distincts
chacun
atteints d'une TB active cliniquement établie (résultats de culture
microbiologique
positive ¨ test clinique de référence). Ces pools permettent de disposer d'un
mélange
de sérums et ainsi d'augmenter la diversité d'anticorps susceptibles d'être
détectés.
[42] On utilise des pools indépendants, c'est-à-dire des mélanges de sérums
qui
n'ont pas les mêmes origines. Par exemple, si un premier pool comprend 4
sérums
venant de 4 individus différents, un second pool indépendant comportera
plusieurs
sérums dont aucun ne sera en commun avec l'un au moins des sérums du premier
pool.
[43] Avantageusement, comme il est mentionné plus haut, les complexes immuns
entre le peptide et les anticorps contenus dans les pools sont quantifiés par
immunodétection en utilisant des immunoglobulines couplées à un agent de
détection.
Il est par exemple possible, selon le marqueur utilisé de mesurer la densité
optique DO.
Selon le marqueur utilisé, l'homme du métier saura déterminer la meilleure
méthode de
quantification des complexes immuns.
[44] Dans l'invention, les peptides préférés sont ceux qui ont un ratio R
supérieur à
1,5 pour la totalité des pools des au moins deux pools de sérums. Bien
évidemment,
seront également intéressants les peptides qui ont un ratio R supérieur ou
égal à 1,5
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pour un pool des au moins deux pools de sérum. Par contre, ne seront pas
sélectionnés les peptides pour lesquels les ratios R, quel que soit le pool
considéré des
au moins deux pools de sérum, sont inférieurs à 1,5.
[45] Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode
de
criblage susmentionnée, comprenant en outre les étapes suivantes :
- la mise en contact des peptides sélectionnés à la première étape de
sélection avec
chacun des sérum individuels composants lesdits pools indépendants de sérums
issus
de patients atteints de tuberculose active confirmée, pour permettre la
formation de
complexes immuns entre lesdits anticorps et lesdits peptides à cribler,
- la détection de la formation de complexes immuns à l'étape précédente, et
- une seconde sélection des peptides d'intérêt pour lesquels la valeur du
ratio R est
supérieure ou égale à 1,5 pour avec chacun des sérums individuels composants
lesdits
pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active
confirmée.
[46] Avantageusement, une fois qu'un peptide a été identifié selon le procédé
susmentionné, il est également avantageux de procéder à un second test de
réactivité
avec individuellement chacun des sérums composant les au moins deux pools. Un
tel
double criblage confirme la sélection, et permet d'éliminer éventuellement des
peptides
sélectionnés qui ne reconnaitraient que des anticorps surreprésentés dans l'un
des
sérums des pools.
[47] Tout comme lors du premier criblage, on mesure le ratio R selon la
formule
susmentionnée, et les peptides pour lesquels le ratio R est supérieur ou égal
à 1,5 sont
retenus comme étant des peptides les plus performants, c'est-à-dire les
peptides qui
ont une bonne affinité pour des anticorps spécifiques de la tuberculose active
(TB
active).
[48] Avantageusement, l'invention concerne la méthode susmentionnée dans
laquelle lors de la première sélection, seuls sont sélectionnés les peptides
pour
lesquels la valeur d'un ratio R est supérieure ou égale à 1,5 pour au moins
deux des
pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active
confirmée.
[49] Il est bien évidemment particulièrement intéressant et avantageux de
sélectionner les peptides pour lesquels, lors du premier criblage en pool, le
ratio R est
supérieur ou égal à 1,5, pour chacun desdits au moins deux pools, et pour
lesquels le
ratio R pour chacun desdits sérums composant lesdits au moins deux pools
supérieur
ou égal à 1,5.
[50] Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la
méthode
telle que définie ci-dessus, dans laquelle les peptides hydrophiles sont
identifiés par
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bioinformatique, sur la base de leur hydrophilie apparente.
[51] Comme il a été discuté ci-dessus, différents critères peuvent être
utilisés pour
déterminer les peptides hydrophiles potentiels qui doivent être testés pour
déterminer
leur immunogénicité selon le procédé de l'invention. Cette sélection de
peptide peut
être réalisée par informatique en estimant différents critères pertinents pour
l'homme du
métier, tels que l'hydropathie, la stabilité, la solubilité, la structure
secondaire,
l'accessibilité du peptide dans la protéine entière, la flexibilité... L'homme
du métier
saura choisir le ou les critères les plus pertinents pour déterminer si le
peptide est
considéré comme hydrophile au sens de l'invention et s'il doit être criblé
selon le
procédé susmentionné.
[52] Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la
méthode
susmentionnée, dans laquelle les peptides hydrophiles ont une taille de 15 à
25 acides
aminés.
[53] Les peptides qui a cribler dans l'invention sont des peptides de taille
moyenne
présentant une talle de 15 à 25 acides aminés, c'est-à-dire ayant 15, 16, 17,
18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, ou 25 acides aminés naturels.
[54] Ces peptides peuvent également être modifiés sur un ou plusieurs résidus
d'acides aminés, par exemple en protégeant certains résidus tels que les
résidus
cystéine Il est possible d'ajouter sur ces peptides d'autres groupes chimiques
en N-
terminal ou C-terminal facilitant leur manipulation et leur utilisation dans
un test rapide
(greffage au support, présentationépitopique, conformation, etc). Ces groupes
peuvent
être par exemple la Biotine, protéine carrier)> soluble type BSA, thiol ou
NH2 à
condition que celle-ci soit absente de la séquence peptidique d'intérêt.
[55] Avantageusement, l'invention concerne la méthode décrite précédemment
dans
laquelle les complexes immuns sont détectés par immunodétection à l'aide
d'anticorps
marqués dirigés contre la partie constante des immunoglobulines.
[56] L'invention concerne également au moins un peptide hydrophile, destiné à
détecter la tuberculose active dans un échantillon sanguin de patient,
susceptible d'être
obtenu ou criblé par la méthode telle que définie ci-dessus.
[57] En outre, l'invention concerne un peptide susceptible d'être criblé par
la
méthode susmentionnée, pour son utilisation dans le cadre du diagnostic de la
tuberculose active chez un individu.
[58] L'invention concerne en outre au moins un peptide hydrophile, comprenant
de
15 à 25 acides aminés, issu d'une protéine hydrophobe, ladite protéine
hydrophobe
étant une protéine de paroi de bactéries du genre Mycobacterium, ladite
protéine
hydrophobe présentant une activité lipolytique.
[59] L'invention concerne aussi un peptide un peptide hydrophile, comprenant
de 15
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à 25 acides aminés, issu d'une protéine hydrophobe, ladite protéine hydrophobe
étant
une protéine de paroi de bactéries du genre Mycobacterium, ladite protéine
hydrophobe
présentant une activité lipolytique, pour son utilisation dans le cadre du
diagnostic de la
tuberculose active chez un individu
[60] Comme cela a été évoqué précédemment, les peptides criblés par la méthode
susmentionnée sont particulièrement avantageux pour mettre en oeuvre une
méthode
de diagnostic de la tuberculose active chez des individus. En effet, puisque
ces
peptides sont sélectionnés sur leur capacité de détecter des anticorps
présents
spécifiquement dans le sérum de patients atteints de la tuberculose active,
ils seront
particulièrement efficaces pour déterminer le statut sérologique d'un individu
vis-à-vis
de la tuberculose.
[61] Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un peptide
hydrophile, tel que défini ci-dessus, ledit peptide étant représenté par l'une
quelconque
des séquences suivantes : SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 30.
[62] Par peptides de séquence SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 30 on entend dans
l'invention les peptides de sequences suivantes : SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2
,
SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7,
SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO :
12 , SEQ ID NO : 13 , SEQ ID NO : 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ ID NO : 16 , SEQ
ID
NO: 17 , SEQ ID NO : 18 , SEQ ID NO : 19 , SEQ ID NO : 20 , SEQ ID NO : 21,
SEQ ID NO : 22 , SEQ ID NO : 23 , SEQ ID NO : 24 , SEQ ID NO : 25 , SEQ ID NO
:
26 , SEQ ID NO : 27 , SEQ ID NO : 28 , SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30.
[63] Les peptides les plus avantageux de l'invention sont les peptides de
séquence :
SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5,
qui ont des ratios R très supérieurs à 1,5 pour quatre pools indépendants de
sérums.
[64] Les peptides SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO :
9
, SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO : 13 , SEQ ID
NO
: 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ ID NO : 16 , SEQ ID NO : 17 , SEQ ID NO : 18 et
SEQ
ID NO : 19 sont également intéressants dans la mesure où les ratios R sont
supérieurs
à 1,5 pour 3 sur 4 sérums testés.
[65] L'invention concerne aussi avantageusement une composition comprenant au
moins un des peptides choisis parmi les peptides de sequences suivantes : SEQ
ID NO
: 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO
:
6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO
:
11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO : 13 , SEQ ID NO : 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ
ID
NO: 16 , SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 18 , SEQ ID NO: 19 , SEQ ID NO: 20,
SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22 , SEQ ID NO : 23 , SEQ ID NO : 24 , SEQ ID NO
:
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WO 2017/144830 PCT/FR2017/050418
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25 , SEQ ID NO : 26 , SEQ ID NO : 27 , SEQ ID NO : 28 , SEQ ID NO : 29 et SEQ
ID NO : 30, pour son utilization dans le cadre du diagnostic de la tuberculose
active
chez un individu.
[66] Avantageusement, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, comprenant au moins un des peptides choisis parmi les peptides
de
séquences suivantes : SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO :
4 et SEQ ID NO: 5.
[67] Avantageusement, l'invention concerne une composition pour son
utilization
susmentionnée, comprenant au moins un des peptides choisis parmi les peptides
de
sequences suivantes : SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO
: 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID
NO :
9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO : 13 , SEQ ID
NO: 14 , SEQ ID NO: 15 , SEQ ID NO: 16 , SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 18,
SEQ ID NO: 19.
[68] L'invention concerne par ailleurs une méthode de diagnostic in vitro chez
un
individu susceptible d'être atteint de la tuberculose active, ladite méthode
comprenant :
- une étape de mise en contact d'un échantillon sanguin dudit individu avec
au moins
un peptide hydrophile tel que défini ci-dessus, et
- une étape de détection d'un complexe immun entre au moins un anticorps
dudit
échantillon sanguin et lesdits peptides.
[69] Dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode de diagnostic de
la
tuberculose active chez un individu comprenant une étape de mise en contact
d'un
échantillon sanguin, notamment du sérum, dudit individu avec au moins un
peptide
choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO
:
3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO
:
8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID
NO
: 13 , SEQ ID NO : 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ ID NO : 16 , SEQ ID NO : 17 , SEQ
ID NO : 18 , SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20 , SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22,
SEQ ID NO : 23 , SEQ ID NO : 24 , SEQ ID NO : 25 , SEQ ID NO : 26 , SEQ ID NO
:
27 , SEQ ID NO : 28 , SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30, et
une étape de détection d'au moins un complexe immun entre au moins un
anticorps
dudit échantillon sanguin et ledit au moins un peptide.
[70] L'invention concerne en outre un kit de diagnostic de la tuberculose
active,
comprenant :
- au moins un peptide hydrophile tel que défini ci-dessus, et
- des moyens d'identification de complexes immuns entre au moins un
anticorps
issus d'un échantillon sanguin d'un individu et ledit au moins un peptide.
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[71] Dans le kit de l'invention, le dit au moins un peptide est notamment un
peptide
choisi parmi les peptides des sequence SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:
3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO
:
8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID
NO
: 13 , SEQ ID NO : 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ ID NO : 16 , SEQ ID NO : 17 , SEQ
ID NO : 18 , SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20 , SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22,
SEQ ID NO : 23 , SEQ ID NO : 24 , SEQ ID NO : 25 , SEQ ID NO : 26 , SEQ ID NO
:
27 , SEQ ID NO : 28 , SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30.
[72] Par moyens de détection de complexes immuns, on peut prévoir des
immunoglobulines reconnaissant spécifiquement la partie constante des
anticorps, en
particulier des anticorps humains, lesdites immunoglobulines pouvant être
notamment
couplés avec des fluorochromes, avec des enzymes, ... L'homme du métier sait
quels
types d'immunoglobulines marquées sont appropriés pour réaliser un tel kit et
permettre la détection de complexes immuns.
[73] Avantageusement, l'invention concerne un kit tel que défini ci-dessus,
comprenant moyens d'identification de complexes immuns entre au moins un
anticorps
issus d'un échantillon sanguin d'un individu sont disposés sur un support de
type
chromatographique. D'autres formats tels que les billes magnétiques ou les
electricsensors sont également utilisables.
[74] Dans un aspect avantageux de l'invention, il est prévu un kit de
détection de la
tuberculose active sous la forme d'un kit portable, utilisable dans toutes les
situations et
dans toutes les situations, en déposant une goutte de sang. Un tel kit est un
kit de
détection rapide, en seulement quelques minutes. Un exemple d'un tel kit
portable est
illustré à la figure 1.
[75] Avantageusement, l'invention concerne le kit susmentionné, comprenant en
outre au moins un contrôle positif. Qu'il s'agisse d'un kit à utiliser dans un
laboratoire, et
surtout d'un kit portable, il est particulièrement pertinent de disposer d'un
contrôle
positif, c'est-à-dire d'un sérum issu d'un ou plusieurs patients dont la
tuberculose active
est ou a été confirmée cliniquement.
[76] La possibilité de diagnostiquer la TB active de manière simple, fiable et
rapide à
partir de sang veineux ou capillaire est un succès médical et économique au
moins
identique à celui des tests rapides pour la détection d'autres infections (VIH
par
exemple). Même si la spécificité du test n'est pas optimale, une bonne valeur
prédictive
négative permet à un test de ce type un très large usage en première ligne
pour le
dépistage de la maladie et l'orientation vers un test de confirmation. Le
développement
d'un test rapide pour le dépistage ou le diagnostic de la TB active contribue
très
significativement à la réalisation des objectifs fixés par l'OMS pour
l'éradication de la
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tuberculose.
[77] Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne le kit
susmentionné, dans lequel ledit au moins un peptide hydrophile est couplé à
des
nanobilles magnétiques.
[78] Le couplage des peptides de l'invention à des nanobilles magnétiques
permet
d'obtenir des résultats similaires à un test immunologique ELISA classique,
avec une
quantité moindre de peptides et surtout en moins de 10 minutes (contre environ
2 h
pour un ELISA classique). L'avantage d'un tel couplage est qu'il limite les
temps de
lavages nécessaires pour éliminer les interactions non spécifiques, car les
complexes
immuns sont isolés par magnétismes grâces aux billes sur lesquels ils se sont
formés.
[79] L'invention concerne en outre un peptide hydrophile tel que défini ci-
dessus,
notamment un peptide consistant essentiellement en ou consistant en l'une
quelconque
des séquences SEQ ID NO : 1 à 30, pour son utilisation dans le cadre du
diagnostic de
la tuberculose active chez un individu.
[80] Comme mentionné ci-dessus, les peptides spécifiques de l'invention sont
très
appropriés pour détecter des anticorps dirigés contre des peptides de
Mycobactrium
tuberculosis, et donc pour permettre de poser un diagnostic de tuberculose
active chez
un individu.
[81] L'invention sera mieux comprise à la lumière des figures et des exemples
suivants :
[82] Légende des figures
[83] La figure 1 représente un exemple de kit portable selon l'invention
[84] La figure 2 représente un schéma représentatif du mode de réalisation de
la
figure 1.
[85] La figure 3 est une représentation schématique du résultat visuel obtenu
lors
d'un diagnostic positif de la tuberculose active (++) ou lors d'un diagnostic
négatif (-). T
désigne le marquage significatif de la positivité de l'échantillon, et T+
indique le témoin
positif de la réaction. La flèche indique le sens de migration.
[86] Les figures 4 à 7 montrent des histogrammes de la réactivité des peptides
testés sous la forme d'index (ratio R selon l'invention).
[87] La figure 8 montre un histogramme la réactivité des peptides C2, C12, M3,
V5
et G9 (respectivement représentés par les séquences SEQ ID NO : 1 à 5) sous
forme
d'index (ratio R selon l'invention). Les barres représentent les 4 pools
testés pour
chacun des peptides
[88] La figure 9 représente un histogramme montrant la comparaison des
résultats
obtenus entre la technique ELISA classique (colonnes en gris foncé) et la
technologie
nanobilles (colonne en gris clair), en utilisant le peptide SEQ ID NO : 3. Les
échantillons
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1. et 2. correspondent à des contrôles positifs, les échantillons 3. et 4.
correspondent à
des échantillons négatifs, les échantillons 5. à 7. correspondent à des sera
de patients
et l'échantillon 8. correspond à un échantillon annoncé comme négatif.
[89] La figure 10 représente un histogramme montrant la comparaison des
résultats
d'évaluation de 19 sera humains (13 positifs avec une TB active, échantillons
1 à 27, et
6 négatifs non infectés, échantillons Neg1 à Neg6) entre la version
paillasse)>
(colonnes noires) du laboratoire et la version transportable du prototype
mis au
point (colonnes grises)
[90] La figure 11 représente un histogramme montrant la moyenne des signaux
obtenus pour l'analyse de 20 échantillons testés en simple aveugle (15
positifs et 5
négatifs) sur le prototype transportable optimisé. Les échantillons positifs
sont les n 1,
3, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20. Les échantillons négatifs
sont les n 2, 6,
9, 13, 18.
[91] La figure 12 représente un histogramme montrant l'évaluation de la
stabilité du
couplage nanobilles magnétiques-peptides candidats diagnostic au cours du
temps, sur
des échantillons négatifs (Neg6) ou positifs (Pos1). L'histogramme représente
ici
l'évaluation de deux échantillons de sérum de patient (un négatif et un
positif) avec la
même technique sur nanobilles magnétiques en utilisant le même peptide (M3)
greffé à
différents intervalles de temps sur les nanobilles. Les deux sera ont été
analysés avec
le peptide greffé et testé le 24/11/2016 (histogramme de droite pour chacun
des deux
patients) comparativement avec le même peptide greffé le 12/09/2017 et testé
le
30/11/2016 et le 01/12/2016 (deux premiers histogrammes pour chacun des deux
patients). Il apparait une diminution du signal au cours du temps pour ce
peptide qui
pourrait être expliquée par une instabilité des peptides en solution ou un
manque de
reproductibilité du greffage.
[92] Si l'on se réfère à la figure 1, le kit de diagnostic de la tuberculose
active selon
l'invention est constitué d'un dispositif comprenant une cassette 1,
comprenant trois
fenêtres 2 ; 3 ; 4 permettant respectivement de détecter la réactivité d'un
échantillon
avec un contrôle positif, de détecter la réactivité d'un échantillon avec au
moins un
peptide selon l'invention, et de déposer un échantillon de sérum à tester. La
cassette 1
recouvre un réservoir comprenant, positionné sous la fenêtre 4,
- un support d'échantillon 5 permettant la filtration macromoléculaire de
l'échantillon
déposé (sang, sérum, plasma humain) et permettant le contrôle de la matrice
(force
ionique, vitesse d'absorption...),
- un support de conjugaison 6 comprenant des anticorps de détection dirigé
contre
les anticorps susceptibles d'être contenus dans l'échantillon a tester, et
couplé à un
traceur tel que de l'or colloïdal, du latex, du carbone.
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[93] Positionné sous les fenêtres 3 et 2 se trouve positionné une membrane 7
de
nitrocellulose, de nylon, ou de polyfluorure de vinylidène (PVDF) sur la
quelle est fixée,
sous la forme d'une ligne, au moins un peptide selon l'invention (sous la
fenêtre 3) et
une ligne d'albumine bovine biotinylée (sous la fenêtre 2).
[94] Le réservoir comprend en outre, juxtaposé à la membrane 7, un support
absorbant 8 dont la fonction est de servir de réservoir de liquide résiduel et
stabilisation
de la vitesse de migration.
[95] La figure 2 représente le dispositif de la figure 1 en utilisation. Dans
un premier
temps, un échantillon biologique (notamment du sang ou du sérum) est déposé
sur le
support d'échantillon 5 via la fenêtre 4. Sous l'effet de la capillarité
générée par un
support absorbant 8 et un tampon de migration spécifique facilitant la
capillarité, le
contenu de l'échantillon est progressivement et a vitesse constante, transféré
vers le
support de conjugaison 6, où les anticorps de l'échantillon biologique sont
alors
capables de se coupler avec les anticorps de détection.
[96] Toujours sous l'effet de la capillarité, le contenu de l'échantillon
migre du support
de conjugaison 6 vers la membrane 7. Lors de leur passage sur la ligne de
peptide
selon l'invention, les anticorps dirigés contre le peptide de l'invention sont
immobilisés
par réaction immunologique, le reste de l'échantillon continuant de migrer. Il
en est de
même pour la ligne de contrôle.
[97] Comme l'indique la figure 3, lorsque l'échantillon à tester comprend des
anticorps dirigés contre les peptides de l'invention qui ont été déposés sur
le membrane
7, ceux-ci sont immobilisés et s'accumulent, et grâce au couplage avec des
anticorps
marqués, il est possible de voir apparaitre une ligne indicatrice de la
réactivité, au
niveau de la zone de test T.
[98] Exemples
[99] Exemple 1 ¨ identification des peptides à cribler
[100] A partir des 25 protéines recombinantes de la famille des enzymes
lipolytiques,
les inventeurs ont réalisé un criblage d'épitopes afin de hiérarchiser in
silico plus de 800
peptides en fonction de différentes caractéristiques : hydrophobicité,
structure
secondaire, etc. Ce classement leur a permis de sélectionner les 200 candidats
qui
rassemblent les caractéristiques les plus prometteuses pour faire du
diagnostic de la
tuberculose active. L'immunogénicité de chacun des 200 peptides a ensuite été
évaluée dans un test ELISA pour faire le criblage de ces peptides. A partir
des résultats
obtenus sur des pools de patients, les 30 meilleurs candidats ont été
conservés pour la
suite des évaluations techniques.
[101] A l'aide d'un algorithme informatique et à partir des séquences
génétiques
fournies, les principales caractéristiques des protéines candidates
diagnostiques ont
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été identifiées et un classement des meilleurs peptides potentiels a été
établi. Au total,
les inventeurs ont obtenu une liste de 833 peptides chevauchants de 15 acides
aminés
classés en 4 groupes (1, 2, 3 et bad ) en fonction de leur immunogénicité
théorique
in silico (avec 1 le meilleur et bad le plus mauvais). Les informations
concernant les
200 peptides testés sont indiquées dans le tableau 1 suivant :
Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0
14
o
,-.
LipC (Rv0220) C2 71-85aa
DLLTPGINEVRRRDR 1 -4
,-.
4-
LipC (Rv0220) C12 321-335aa
RNAPPFLVIHGSRDC 2 4-
00
Coà
0
1 LipM (Rv2284) M3 131-145aa
GGTAKTPGPLRMLRI 3
Rv2349c (PLCC) V5 351-365aa
TPLTAPEGTPGEWIP 4
LipG (Rv0646c) G9 141-155aa
KTLAVIFSSNNHRFL 5
Lip0 (Rv1426c) 07 301-315aa
FTTDAPGRREFVGLL 6
Rv2301 Z1 31-45aa
TAACPDAEVVFARGR 7
Rv1984 E8 101-115aa
QRTVASCPNTRIVLG 8 P
Rv3452 D7 191-205aa
CNNGDPICSDGNRWR 9 ,
,
Rv3452 D1 1-15aa
MIPRPQPHSGRWRAG 10
,
' Rv2351c (PLCA) P2
91-105aa AGVTIPFRLDTTRGP 11 .. ' .. =,
,
LipT (Rv2045c) T9 481-495aa
RAVLVFDRRCRIEFD 12
2 LipW (Rv0217c) W3 81-95aa
GYVMGTAQQDDRLCL 13
LipW (Rv0217c) W5 181-195aa
DDRPSIAPANPHYRL 14
LipW (Rv0217c) W7 211-225aa
DADARVAVPGRRDDL 15
Rv0183 B15 251-265aa
MPRRAPALTAPLLVL 16
so
n
LipC (Rv0220) C14 61-75aa
ASDFLSATAKDLLTP 17
LipC (Rv0220) C18 221-235aa
VDKFGGDRNFIAVAG 18 ol
Rv1984 E5 31-45aa
HADPCSDIAVVFARG 19 -4
o
u,
LipC (Rv0220) C6 141-155aa
QLLDVWRRKDMPTKP 20 =
4-
--,
00
Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0
14
o
,-,
LipC (Rv0220) C7 241-255aa
H LSALAG LTAN D PQY 21 -4
,-,
4-
Rv3452 D5 161-175aa
AIALFGNPSGRAGGL 22 4-
00
Coà
0
Rv2301 Z3 161-175aa
NFSPAYNDRTIELCH 23
LipF (Rv3487c) F7 1-15aa
VRAPGVRAADGAGRV 24
Rv0183 B6 271-285aa
RLI PI EGSRRLVECV 25
LipG (Rv0646c) G3 51-65aa
AKGLRVIRYDNRDVG 26
Rv2351c (PLCA) P6 341-355aa
DENGGFFDHVTPPTA 27
Rv2350c (PLCB) S13 501-512aa
TAPTRGIPSGLC 28 P
LipT (Rv2045c) T6 451-465aa
RVSNEVQRRWRCFSQ 29 .
,
LipC (Rv0220) C20 281-295aa
DRSTPERARFVDFLE 30 .
eo
.
,
, 3 Rv0183 B1 1-15aa
MWAEKSPRRSSAGSR 31 .
,
Rv0183 B16 281-295aa
LVECVGSADVQLKEY 32
LipC (Rv0220) Cl 1-15aa
MNQRRAAGSTGVAYI 33
LipC (Rv0220) C10 301-315aa
RTIDRHPEVFRDASP 34
LipC (Rv0220) C4 111-125aa
APERTPPVCGALRHR 35
LipC (Rv0220) C24 361-375aa
ELPGAGHGFDLLDGA 36
so
n
LipC (Rv0220) C3 101-115aa
SP D D LAVEWPAP E RT 37
LipC (Rv0220) C5 121-135aa
ALRHRRYVHRRRVLY 38 ol
LipC (Rv0220) C21 331-345aa
GSRDCVIPVEQARSF 39 -4
o
u,
LipC (Rv0220) C19 261-275aa
EGSDTSVDAVVGIYG 40 '
4-
--,
00
Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0
I.)
o
Rv3452 D9 91-105aa
PANGDFLAAADGAND 41
-4
,-.
Rv1984 E2 E2 91-105aa
NGSDDASAHIQRTVA 42 4-
00
Coà
0
Rv1984 E9 201-217aa
MTSQAATFAANRLDHAG 43
Rv1984 El 41-55aa
VFARGTHQASGLGDV 44
LipF (Rv3487c) F12 131-145aa
PNIGTDAMFPARAFD 45
Lipl (Rv1400c) 11 1-15aa
MPSLDNTADEKPAID 46
Rv3802c K5 71-85aa
SCPDVQMISVPGTWE 47
Lip0 (Rv1426c) 03 121-135aa
ATLPTEPMRSRGRNL 48 P
Lip0 (Rv1426c) 06 271-285aa
TPNDPRFQPGFEQVD 49 .
,
Rv2351c (PLCA) P9 501-512aa TPVRGTPSGLCS
50 . .
(70µ
Rv2351c (PLCA) P3 101-115aa
TTRGPFLDGECVNDP 51
,
LipQ (Rv2485c) Q6 201-215aa
ICVSINYSKSPRCTW 52 .
LipQ (Rv2485c) Q9 341-355aa
GEKDPMVPSAQSRAF 53
LipQ (Rv2485c) Q10 401-415aa
IYGRRMGARKGSLAL 54
LipQ (Rv2485c) Q4 151-165aa
ENLLDIWRRPDLAPG 55
LipQ (Rv2485c) Q8 331-345aa
SEAPPFFVLHGEKDP 56
so
LipR (Rv3084) R3 121-135aa
EEMAAVYTRLLDDGL 57 n
ol
Rv2350c (PLCB) S7 261-275aa
FKQAADPRSNLARFG 58
Rv2350c (PLCB) S3 91-105aa
DPAGVTLPYRFDTTR 59 -4
o
u,
Rv2350c (PLCB) S8 281-295aa
PLDFAADVRNNRLPK 60 =
4-
--,
00
Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0
14
o
Rv2350c (PLCB) S4 101-115aa
FDTTRGPLVAGECVN 61
-4
,-,
LipT (Rv2045c) (Rv2045c) T4 431-445aa
IYRTRFGALLTAAAD 62 4-
00
Coà
0
LipT (Rv2045c) T2 31-45aa
DGVH RWRS I PYARAP 63
LipT (Rv2045c) T7 461-475aa
RCFSQIGVPGDDWPA 64
LipU (Rv1076) U1 71-85aa
GGAFLTCGANSHGRL 65
Rv1755c (PLCD) X6 271-280aa
PTRGIPSGPC 66
LipY (Rv3097c) Y1 221-235aa
SVVQITPAHPTGEYV 67
bad Rv0183 B12 161-175aa
FAYGVERPDNYDLMV 68 P
Rv0183 B10 131-145aa
DFDTLVGIATREYPG 69 ,
Rv0183 B8 81-95aa
HGLGEHARRYDHVAQ 70
0
0
r
03
' Rv0183 B14
241-255aa GRALLQVGETMPRRA 71 '
,
Rv0183 B7 11-25aa
SAGSRPEFSASTLTS 72
Rv0183 B17 301-315aa
EVFNEPERNQVLDDV 73
Rv0183 B11 141-155aa
REYPGCKRIVLGHSM 74
Rv0183 B2 61-75aa
RIVYDVWTPDTAPQA 75
Rv0183 B13 211-225aa
D FTAISRDPEVVQAY 76
so
n
Rv0183 B9 121-135aa
LVRDISEYTADFDTL 77
Rv0183 B5 261-275aa
PLLVLHGTDDRLI PI 78 ol
Rv0183 B3 101-115aa
GLVTYALDHRGHGRS 79 -4
o
u,
Rv0183 B4 111-125aa
GHGRSGGKRVLVRD I 80 =
4-
--,
00
Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0
14
o
LipC (Rv0220) C22 341-355aa
QARSFVERLRAVSRS 81
-4
,-.
LipC (Rv0220) (Rv0220) C15 81-95aa
RRRDRASTQEVSVAA 82 4-
00
Coà
0
LipC (Rv0220) C13 11-25aa
GVAYIRWLLRARPAD 83
LipC (Rv0220) C8 251-265aa
NDPQYQAELPEGSDT 84
LipC (Rv0220) C16 131-145aa
RRVLYGDDPAQLLDV 85
LipC (Rv0220) C9 271-285aa
VGIYGRYDWE D RSTP 86
LipC (Rv0220) C11 311-325aa
RDASPIQRVTRNAPP 87
LipC (Rv0220) C17 201-215aa
H RWPRH I LDVKTAIA 88 P
LipC (Rv0220) C23 351-365aa
AVSRSQVGYLELPGA 89 .
,
LipC (Rv0220) C25 371-385aa
LLDGARTGPTAHAIA 90 ,
N,
0
Rv3452 D6 181-195aa
PQFGSKTINLCNNGD 91
,
Rv3452 D2 51-65aa
EVVFARGTGEPPGLG 92 .
Rv3452 D8 41-55aa
PPASAGCPDAEVVFA 93
Rv3452 D3 71-85aa
FVSS LRQQTN KS I GT 94
Rv3452 D10 151-165aa
LPPAADDHIAAIALF 95
Rv3452 D4 101-115aa
DGANDASDHIQQMAS 96
so
Rv1984 E3 81-95aa
ASD DYRASAS N GS D D 97 n
ol
Rv1984 E4 21-35aa
VSAPAGGRAAHAD PC 98
Rv1984 E6 51-65aa
GLGDVGEAFVDSLTS 99 -4
o
u,
Rv1984 E7 71-85aa
S I GVYAVNYPASD DY 100 =
4-
--,
00
Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0
I.)
o
Li pF (Rv3487c) F13 151-165aa VRAAAAKNMVDGRPE
101
-4
,-.
.1-
Li pF (Rv3487c) F11 101-115aa
QRLQCDDEKPAAIVA 102
00
Coà
0
Li pF (Rv3487c) F4 241-255aa
FIRDATADSSLSPVH 103
Li pF (Rv3487c) F1 71-85aa
YQWLRARGYRPEQIV 104
Li pF (Rv3487c) F2 161-175aa
DGRPEDLYEPLDHIE 105
Li pF (Rv3487c) F5 251-265aa
LSPVHRSRYVAGSPR 106
Li pF (Rv3487c) F14 231-245aa
ATRSLRQIGQFI RDA 107
Li pF (Rv3487c) F8 31-45aa
SHSRIVNALSGFAES 108 P
Li pF (Rv3487c) F10 81-95aa
PEQIVLAGDSAGGYL 109 .
,
Li pF (Rv3487c) F3 171-185aa
LDHIESSLPPTLIHV 110 .
N,
0
N.)
Li pF (Rv3487c) F6 261-277aa
AGSPRAASRGAFGQSPI 111
,
Li pF (Rv3487c) F9 61-75aa GMALDDCHDAYQWLR
112 .
03
Li pG (Rv0646c) G5 171-185aa
PPDSPRDVIVDNAVR 113
Li pG (Rv0646c) G2 11-25aa
GDVKLYYEDMGDLDH 114
Li pG (Rv0646c) G4 61-75aa
NRDVGLSTKTERHRP 115
Li pG (Rv0646c) G7 291-301aa GELTRNFSEAG
116
so
Li pG (Rv0646c) G11 191-205aa
GSPAYPIPEDQVRAE 117 n
ol
Li pG (Rv0646c) G1 1-15aa
VDIRSGTAVSGDVKL 118
Li pG (Rv0646c) G10 181-195aa
D NAVRVS KI I GS PAY 119 -4
o
u,
Li pG (Rv0646c) G8 71-85aa
ERHRPGQPLATRLVR 120 =
.1-
--,
00
Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0
I.)
o
LipG (Rv0646c) G6 281-295aa
LPRQLWDRVIGELTR 121
-4
,-.
4-
LipH (Rv1399c) H1 41-55aa
QLKTPPELLPELRIE 122 4-
00
Coà
0
Lipl (Rv1400c) 13 41-55aa
RLRDLPRQPVHPELR 123
Lipl (Rv1400c) 12 31-45aa
IDDGIEAVRQRLRDL 124
Rv3451 J3 91-105aa
RLQLHGGDGANDAIS 125
Rv3451 J2 41-55aa
ADGCPDAEVTFARGT 126
Rv3451 J5 191-205aa
TDPICHVGPGNEFSG 127
Rv3451 J1 1-15aa
VNNRPIRLLTSGRAG 128 P
Rv3451 J4 161-175aa
VFGNPSNRAGGSLSS 129 .
,
Rv3451 J7 251-262aa TAAPAPESLHGR
130 . .
0
GO
Rv3451 J6 221-235aa
FVVQRLRAGSVPHLP 131
,
Rv3802c K6 131-145aa
HNPLTTDNQMSYNDS 132 .
Rv3802c K9 251-265aa
QGDLICAAPAQAFSP 133
Rv3802c K8 211-225aa RQQGVGNQVPPSPRG
134
Rv3802c K4 61-75aa
HKPRPAFQDASCPDV 135
Rv3802c K2 31-45aa
AVVIMLRGAESPPSA 136
so
Rv3802c K7 181-195aa
AGDVASDIGNGRGPV 137 n
ol
Rv3802c K1 1-15aa
MAKNSRRKRHRILAW 138
Rv3802c K3 51-65aa
LPPGPTPAHPHKPRP 139 -4
o
u,
LipM (Rv2284) M2 121-135aa SAGLWRRPAGGGTAK
140 =
4-
--,
00
Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0
14
o
,-.
LipM (Rv2284) M4 141-155aa
RMLRIYRDYAHDGDI 141 -4
,-.
LipM (Rv2284) (Rv2284) M5 271-285aa
ALTPNDPRFQPGFEE 142 4-
00
Coà
0
LipM (Rv2284) M1 111-125aa
SGLGPDRRTASAGLW 143
LipN (Rv2970c) N3 281-295aa
YLRDSDVDPADPRLS 144
LipN (Rv2970c) N2 271-285aa
KRDIDWFHTQYLRDS 145
LipN (Rv2970c) Ni 111-125aa
DLSIPGPAGEIPARH 146
Lip0 (Rv1426c) 05 211-225aa
VCVSLNYRVSPRHTW 147
Lip0 (Rv1426c) 08 321-335aa
KRKFSTHRDIFVDAS 148 P
Lip0 (Rv1426c) 04 161-175aa
ANLADIWRRRDLPRD 149 .
,
Lip0 (Rv1426c) 02 61-75aa ALRRGRRGDFGGLKG
150 ,
N,
0
e.
Lip0 (Rv1426c) 01 1-15aa
MRFRRMARPRPLTRA 151
,
Rv2351c (PLCA) P8 411-425aa
SQLKLIRARFGVPVP 152 .
Rv2351c (PLCA) P1 1-15aa
MSRREFLTKLTGAGA 153
Rv2351c (PLCA) P7 351-365aa
TPPTAPPGTPGEFVT 154
Rv2351c (PLCA) P5 251-265aa
NNGLVQAFRQAADPR 155
Rv2351c (PLCA) P4 221-235aa
IMPENLEDAGVSWKV 156
so
LipQ (Rv2485c) Q2 131-145aa
GPHRRYAAQTSDIPY 157 n
ol
LipQ (Rv2485c) Q1 101-115aa
PDFRDLVWHPTGEQS 158
LipQ (Rv2485c) Q7 261-275aa
SANDPALQPGFESAD 159 -4
o
u,
LipQ (Rv2485c) Q3 141-155aa
SDIPYGPGGRENLLD 160 =
4-
--,
00
Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0
14
o
,-.
LipQ (Rv2485c) Q5 161-175aa
DLAPGRRAPVLIQVP 161 -4
,-.
LipR (Rv3084) (Rv3084) R1 1-15aa
MNLRKNVIRSVLRGA 162 4-
00
Coà
0
LipR (Rv3084) R5 241-255aa
I CVDAD KI ETACAAS 163
LipR (Rv3084) R2 41-55aa
RAPKGTRFQRVSIAG 164
LipR (Rv3084) R7 291-308aa
RLRGHLHQSQGQPRGVVK 165
LipR (Rv3084) R4 131-145aa
LDDGLDPKTTVIAGD 166
LipR (Rv3084) R6 251-265aa
ACAASKTSI E H RRFA 167
Rv2350c (PLCB) S5 221-235aa
SWRIMPENLEDAGVS 168 P
Rv2350c (PLCB) S10 401-415aa
RGPLMVHDTFDHTST 169 .
,
Rv2350c (PLCB) S12 491-505aa
PFPQSMPTQETAPTR 170 ,
n,
0
01
Rv2350c (PLCB) S6 251-265aa
VVGYN GLVN D FKQAA 171
,
Rv2350c (PLCB) S9 361-375aa
GTPGEFVTVPDIDSV 172 .
Rv2350c (PLCB) S2 51-65aa
QENRSFDHYFGTLSD 173
Rv2350c (PLCB) Si 41-55aa
TDIEHIVLLMQENRS 174
Rv2350c (PLCB) S11 451-465aa
PNPSKPNLDHPRLNA 175
LipT (Rv2045c) T5 441-455aa
TAAADRRAALRVSN E 176
so
LipT (Rv2045c) Ti 1-15aa
VALESATVGSMHERT 177 n
ol
LipT (Rv2045c) T3 401-415aa
YLYRYDYAPRTLRWS 178
LipT (Rv2045c) T10 491-505aa
RIEFDPHQHRRIAWD 179 -4
o
u,
LipT (Rv2045c) T8 471-485aa
D DWPAYTQ D D RAVLV 180 =
4-
--,
00
Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0
14
o
,-.
LipU (Rv1076) U3 281-297aa
AIRSLRQIGEYIREATG 181 -4
,-.
4-
LipU (Rv1076) U2 201-215aa
VASAAARNQVDGEPE 182 4-
00
Coà
0
Rv2349c (PLCC) V4 251-265aa
RNGYVGSFKQAADPR 183
Rv2349c (PLCC) V7 401-415aa
GLMVHDRFDHTSQLQ 184
Rv2349c (PLCC) V1 71-85aa
TPTPLFQQKGWNPET -- 185
Rv2349c (PLCC) V6 361-375aa
GEWIPNSVDIDKVDG 186
Rv2349c (PLCC) V2 191-205aa
ISATVNPDGDQGGPQ 187
Rv2349c (PLCC) V8 451-465aa
PSPPNLDHPVRQLPK 188 P
Rv2349c (PLCC) V3 241-255aa
LGGLNDTSLSRNGYV 189 .
,
LipW (Rv0217c) W1 41-55aa
MSRTPPDIEVLTLES 190 ,
N,
0
C
LipW (Rv0217c) W6 191-205aa
PHYRLWNGRANRFGW 191
,
LipW (Rv0217c) W2 51-65aa
LTLESGVGVRLYRPA 192
LipW (Rv0217c) W4 91-105aa
DRLCLRFSSRLGITV -- 193
Rv1755c (PLCD) X4 251-265aa
NRGIPYRVPDPQIMP 194
Rv1755c (PLCD) X1 131-145aa
TPGEYVTVPDIDQVP 195
Rv1755c (PLCD) X3 171-185aa
GPQMVHDTFDHTSQL 196
so
Rv1755c (PLCD) X5 261-275aa
PQIMPTQETTPTRGI 197 n
ol
Rv1755c (PLCD) X2 141-155aa
IDQVPGSGGIRGPIG 198
Rv2301 Z2 61-75aa
ALRSKVNKNVGVYAV 199 -4
o
u,
Rv2301 Z4 171-185aa
IELCHGDDPVCHPAD 200 =
4-
--,
ce
Tableau 1 : Liste des 200 peptides testés
CA 03014034 2018-08-08
WO 2017/144830 PCT/FR2017/050418
-27-
[102] Afin de déterminer l'immunogénicité des peptides, ceux-ci sont testés
par le test
ELISA suivant :
[103] Les peptides sont fixés sur une plaque Maxisorp (high binding):
Incubation toute
la nuit à 4 C, concentration de la protéine en pg/ml de 20 à 50.
[104] Les puits sont rincés avec 300pL de tampon phosphate salin (PBS)
[105] Les puits)> sont bloqués pendant 2h à température ambiante (19 C-25
C)avec
200pL d'albumine sérique bovine (BSA) 2% et 0.01% de Tween 20
[106] Les puits sont rincés avec 300pL de PBS
[107] Ondépose 100pL de sérums de patients atteints de TA active dilués au
1/100ième en solution de blocage et on incube 1h à 37 C
[108] Faire 3 lavages (300pL) PBS-Tween 20 (0,05%)
[109] On ajoute 100pL d'anticorps conjugué à la peroxydase, dilué au 1/20 000
en
solution de blocage et on incube 1h à 37 C
[110] Faire 3 lavages (300pL) PBS-Tween 20 (0.05%)
[111] On ajoute 100pL de substrat 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) et
incube
20min à l'obscurité
[112] On déposer 50pL d'acide sulfurique à 1N
[113] On lit au spectrophotomètre à 450 nm la quantité de TMB convertie par la
peroxydase (indicatif de la formation d'un complexe immun entre les peptides
et les
anticorps contenus dans le sérum).
[114] Les figures 4 à 7 représentent des histogrammes montrant le ratio R
(Index) des
différents peptides testés.
[115] La figure 8 montre la réactivité des peptides les plus prometteurs C2,
C12 M3,
V5 et G9 (respectivement représentés par les séquences SEQ ID NO: 1 à 5).
[116] Exemple 2 ¨ réactivité des 4 peptides sur des échantillons de patients
individuels différents des pools utilisés pour le criblage
[117] Afin de confirmer que les peptides sectionnés sont bien capables de
diagnostiquer la tuberculose active, les inventeurs ont testé la réactivité de
4 peptides
(M3 : SEQ ID NO : 3 ; C12 : SEQ ID NO : 2 ; C2 : SEQ ID NO : 1 et 07 : SEQ ID
NO :
6).
[118] Le tableau suivant montre les résultats obtenus avec le sérum de 16
patients
CA 03014034 2018-08-08
WO 2017/144830 PCT/FR2017/050418
-28-
Patient M3 C12 C2 07
#1 +++ +++ +++ +++
#2 +++ +++ + +1-
#3 +++ +1_ +1- +1-
#4 +++ +++ +1_ +
#5 +++ + + +1-
#6 +++ + +1- +++
#7 +++ +++ +1- +1-
#8 +++ +1- +++ +++
#9 +++ +++ +1- _
#10 +++ +++ +++ +++
#11 + +/- +/- -
#12 + +/- +/- +/-
#13 + + +/- -
#14 +/- + + +
#15 +/- - +/- -
#16 - +++ -
-
[119] +++ : très fortement positif ; + : positif ; +/- : valeur positive
limite ; -: négatif.
[120] Les résultats montrent que parmi les 5 meilleurs candidats identifiés, 3
(M3, C2,
C12) détectent la grande majorité des individus atteints de TB active testés
(soit 94%),
confirmant les résultats obtenus avec les pools de patients. En revanche les
performances diagnostiques de 07 sont plus faibles avec moins de 70% de
sensibilité
pour l'identification des cas de TB active sur ces patients testés.
[121] Exemple 3 ¨ Comparaison de la réactivité des peptides selon le nombre de
pools d'échantillons utilisés
[122] Dans le but d'évaluer la réactivité des peptides et de sélectionner les
plus
prometteurs pour le test de diagnostic de la Tuberculose active, les
inventeurs ont
évalué l'immunogénicité de chacun des peptides sur plusieurs pools différents
d'échantillons. Ceux avec une réactivité pour tous les pools testés ont été
sélectionnés
comme les meilleurs candidats. Le tableau ci-dessous représente un exemple de
3
peptides testés avec deux pools différents d'échantillons positifs.
Peptides DO Pool négatif Ratio Pool positif 1
Ratio Pool positif 2
D7 0,303 1,7 1,7
C4 0,077 -0,3 1,8
B4 0,408 0,9 1,0
[123] Les peptides pour lesquels un ration de 1,5 a été retrouvé ont été
sélectionnés à
CA 03014034 2018-08-08
WO 2017/144830 PCT/FR2017/050418
-29 -
l'issue du screening et font partie des meilleurs candidats diagnostiques pour
la TB
active. Parmi l'ensemble des peptides testés, certains ont un ration > 1,5
pour les deux
pools de patients (exemple D7) alors que d'autres sont positifs pour un des
deux pools
(exemple C4) ou sont négatifs pour les deux pools (exemple B4). Le screening
des
peptides a été affiné ensuite en utilisant des échantillons de patients
individuels infectés
ou non par la TB active.
[124] Exemple 3 ¨ méthode alternative de détection de la tuberculose
[125] A la suite de la preuve de concept en ELISA faite par les inventeurs,
des tests
lateral flow ont été mis au point en intégrant les meilleurs peptides
candidats diagnostic
pour la Tuberculose, décrits dans l'invention. Ces résultats n'ont pas été
suffisamment
bons pour répondre aux attentes du cahier des charges et du targeted product
profile
de l'OMS. Les inventeurs ont donc préféré mettre de côté cette stratégie
lateral flow
pour chercher une alternative plus performante.
[126] Les inventeurs ont développé une technologie sur nanobilles magnétiques,
permettant d'améliorer significativement les performances du test ELISA, sans
lavages
et en quelques minutes seulement. Cette stratégie est pertinente dans
l'optique de
miniaturiser les éléments existants actuels pour proposer une solution de
diagnostic
rapide de laboratoire, ainsi qu'un futur test Point-of-Care. La technologie
nanobilles a
été développée sur une version de paillasse au laboratoire, non délocalisable.
Il s'agit
de la version initiale du test. Les premiers tests réalisés avec cette version
montraient
qu'en couplant les nanobilles magnétiques avec les meilleurs peptides
candidats
diagnostiques de l'invention, et en utilisant une stratégie de détection des
anticorps
dans le sérum de patients, les inventeurs obtenaient des résultats au moins
aussi bons
que les résultats d'ELISA mais avec une quantité moindre de peptides et
surtout en
moins de 10 minutes (contre environ 2 h pour un ELISA classique). Un exemple
des
résultats pour un des 5 meilleurs peptides est illustré en figure 9.
[127] Les inventeurs ont donc poussé les expérimentations et après des tests
d'optimisation (dilution des sera, test en combinaison de peptides, choix de
l'anticorps
de détection, contrôle du bruit de fond, etc) les inventeurs ont identifié le
meilleur
peptide à utiliser parmi les 5 meilleurs candidats. En parallèle, un prototype
transportable a été développé et les inventeurs ont testé 19 échantillons (13
patients
avec une TB active et 6 négatifs pour la maladie). Les résultats de la figure
10 montrent
que ce prototype transportable permet d'obtenir des résultats au moins aussi
bons que
ceux obtenus avec le système de paillasse précédemment mis au point par les
inventeurs, permettant ainsi de discriminer clairement les patients positifs
des patients
négatifs.
[128] Enfin les derniers tests réalisés sur 20 autres échantillons ont évalué
en simple
CA 03014034 2018-08-08
WO 2017/144830
PCT/FR2017/050418
- 30 -
aveugle la capacité du prototype transportable à discriminer les patients avec
une TB
active de ceux non infectés (figure 11) confirmant les performances du test
intégrant la
combinaison de peptides candidats diagnostiques avec la technologie sur
nanobilles
dans sa version transportable.
[129] Des tests de reproductibilité ont aussi été réalisés et ne montrent pas
de
variation. La stabilité du couplage nanobille-peptide peut être améliorée car
une
diminution progressive dans le temps du signal du test a été observée (figure
12).
[130] Le prototype transportable montre donc des résultats très encourageants.
[131] L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation présentés et
d'autres
modes de réalisation apparaîtront clairement à l'homme du métier.
