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WO 2017/194903 1 PCT/FR2017/051165
PARTICULE VIRALE POUR LE TRANSFERT D'ARNS, NOTAMMENT DANS LES
CELLULES IMPLIQUEES DANS LA REPONSE IMMUNE
La présente invention concerne un système rétroviral de transfert d'ARN non
viraux dans des cellules cibles et plus particulièrement une particule
rétrovirale capable
de délivrer de multiples ARN. L'invention concerne également des compositions
comportant ces particules rétrovirales, des kits de production de celles-ci,
les procédés
de fabrication afférents ainsi que les utilisations des particules et des
compositions.
Introduire des ARN multiples dans une cellule cible est en enjeu majeur en
recherche et développement comme en thérapie génique.
L'utilisation de vecteurs dérivés de virus est devenue une méthode cruciale de
transfert de gènes. Les vecteurs viraux se répartissent aujourd'hui en deux
catégories
principales:
- les vecteurs intégratifs, qui s'intègrent dans le génome
receveur, et
- les vecteurs non-intégratifs, qui forment habituellement un élément
génétique extra-chromosomique.
Les vecteurs intégratifs tels que les vecteurs gamma-rétroviraux (RV) et
vecteurs lentiviraux (LV) sont intégrés de façon stable. Les vecteurs non-
intégratifs,
tels que les vecteurs adénoviraux (ADV) et les vecteurs adéno-associés (AAV)
sont
rapidement éliminés des cellules qui se divisent rapidement. Certains facteurs
influençant le choix d'un vecteur particulier, comprennent sa capacité
d'encapsidation,
sa gamme de cellules cibles ou hôtes, son profil d'expression génique, son
efficacité
de transduction et sa capacité à induire une réponse immunitaire, ce qui est
particulièrement problématique si des transductions répétées sont nécessaires.
Certaines applications nécessitent l'utilisation de vecteurs non-intégratifs
comme
en thérapie génique ou dans de nombreuses applications in vitro, ex vivo et in
vivo. A
titre d'exemples, on peut citer :
= l'induction de la reprogrammation de cellules spécialisées en cellules
pluripotentes, ainsi que l'induction de la différenciation de cellules souches
ou
pluripotentes en cellules spécialisées,
= l'expression d'antigènes ou de protéines (toxiques ou non) simultanément
dans
une cellule cible,
= l'expression de systèmes d'ingénierie du génome comme par exemple la
protéine CRE, TALEN ou le système CRISPR, ou de toute autre système
nécessitant une expression de protéine ou d'ARN.
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Un moyen d'introduire des ARN dans une cellule cible met en oeuvre des
vecteurs
viraux basé sur des virus appartenant à la famille des Retroviridae (également
désignée sous l'appellation famille des Rétrovirus ou virus à ARN). En effet,
durant son
cycle de réplication, un virus de la famille des Retroviridae possède la
capacité de
convertir son génome, constitué d'ARN, en ADN double brin qui sera intégré
dans le
génome de la cellule cible. Des exemples particuliers de cette famille de
Rétrovirus
sont les gamma-rétrovirus et les lentivirus.
Le cycle réplicatif d'un rétrovirus comporte une première phase de
reconnaissance
de la cellule cible (ou hôte) via la fixation à un récepteur membranaire.
Cette phase de
reconnaissance aboutit, après fusion membranaire, à l'entrée du rétrovirus
dans la
cellule hôte. L'ARN rétroviral est alors copié en ADN double brin par la
transcriptase
inverse, codée par le rétrovirus, puis intégré au génome de la cellule hôte.
Ce génome
viral est alors transcrit par la cellule hôte comme tous les autres gènes de
la cellule. Ce
génome code l'ensemble des protéines et des séquences permettant la
fabrication
d'autres virus.
Plus particulièrement, trois gènes sont communs à l'ensemble des rétrovirus :
gag,
pot et env.
Gag est un gène codant pour une polyprotéine, les protéines issues de cette
polyprotéine par clivage, étant des protéines de structure impliquées dans
l'assemblage des virus lors de la réplication. Ces protéines de structure sont
plus
spécifiquement la protéine de matrice (MA), la protéine de capside (CA) et la
protéine
de nucléocapside (NC).
Pol est un gène codant pour les enzymes intégrase, transcriptase inverse et
protéase.
Env est un gène codant pour des glycoprotéines d'enveloppe.
Ces trois gènes permettent donc de copier l'ARN rétroviral en ADN double brin,
d'intégrer cet ADN au génome de la cellule hôte puis de générer la structure
des
rétrovirus néo-synthétisés : protéines d'enveloppe, de capside et de
nucléocapside.
Toutefois, afin que les rétrovirus néo-synthétisés soient complets, il est
nécessaire
d'encapsider dans chacune de ces structures deux copies de l'ARN rétroviral.
Cette
encapsidation de deux copies de l'ARN rétroviral dans la structure s'effectue
par la
reconnaissance par la protéine de nucléocapside, d'une séquence
d'encapsidation
appelée Psi (pour Packaging Signal ) portée par la copie de l'ARN
rétroviral.
Lorsqu'un vecteur viral dérivé d'un rétrovirus est utilisé à des fins de
thérapie
génique, au moins une partie des régions codantes de gag, pot et/ou env est
dissociée
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entre le système d'encapsidation et le système d'expression de la séquence
d'intérêt.
Les séquences codantes gag et pot, par exemple, sont portées par le plasmide
d'encapsidation apportant en trans les protéines nécessaires à la production
de
vecteurs viraux. La séquence d'encapsidation comme la séquence d'intérêt sont
portée
par des systèmes indépendants, afin de rendre le rétrovirus non réplicatif.
Toutefois, dans certains cas, l'intégration de la séquence d'ARN d'intérêt
dans le
génome de la cellule hôte de façon aléatoire peut interrompre une phase
ouverte de
lecture et bloquer l'expression de gènes importants. De plus, pour certaines
applications, telles que la reprogrammation de cellules, l'édition des génomes
ou la
différenciation de cellules souches, il est recommandé que l'expression d'une
séquence d'intérêt soit réalisée de manière transitoire.
La demande W02007/072056 décrit un système de vectorisation viral comprenant
env, gag, optionnellement gag/pol ainsi qu'une séquence d'ARN contenant un
signal
d'encapsidation hétérologue qui est reconnu par un domaine de liaison à ARN
correspondant associé à gag ou à gag/poL Ce système est décrit dans la demande
comme étant non intégratif et permettant une expression transitoire.
Toutefois, l'efficacité de tels systèmes reste limitée. En particulier, pour
qu'une
cellule cible exprime un ARN d'intérêt véhiculé par ces systèmes, il est
généralement
nécessaire d'introduire dans la cellule plusieurs copies de cet ARN d'intérêt
et par
conséquent, d'utiliser de fortes multiplicités d'infection ( multiplicity of
infection ou
MOI). La MOI correspond au ratio du nombre de systèmes de vectorisation
introduit
sur le nombre de cellules à infecter. Une forte MOI permet en effet
d'introduire dans les
cellules plusieurs copies de l'ARN d'intérêt en permettant qu'une même cellule
subisse
plusieurs infections. Or, si elle permet d'améliorer le niveau d'expression de
l'ARN
d'intérêt véhiculé, l'utilisation de fortes MOI, du fait des multiples
infections subies par
la cellule, engendre également une certaine toxicité.
Ce type de système de transfert d'ARN présente également un intérêt pour
l'immunothérapie, et notamment l'immunothérapie anti-tumorale
L'immunothérapie anti-tumorale est une stratégie thérapeutique qui s'appuie
sur le
système immunitaire afin d'éradiquer les cellules tumorales. De nouvelles
approches
consistent à modifier génétiquement les cellules du patient pour induire une
réponse
immunitaire et améliorer le ciblage. Pour que ces nouvelles thérapies géniques
puissant être utilisées en clinique, une méthode de transfert de gènes
sécurisée et
efficace est nécessaire. La transfection d'ARN et l'utilisation de vecteurs
lentiviraux ont
respectivement émergé comme des technologies adaptées pour transférer soit un
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récepteur spécifique des lymphocytes T dans des lymphocytes soit un antigène
dans
des cellules dendritiques.
L'identification moléculaire d'antigènes spécifiques de cellules tumorales
humaines
est un élément clé du développement d'immunothérapie spécifique d'antigènes
ciblés:
= Une des
approches qualifiée d'immunothérapie passive consiste à amplifier
des cellules T spécifiques d'antigènes ex vivo et à les réimplanter chez les
patients (Cellules T TCR & CAR). Le transfert de gènes est ici utilisé pour
introduire des récepteurs chimériques d'antigènes synthétiques (CARs) ou
des nouveaux récepteurs de cellules T (TCRs) dans ces cellules T avant
de les réimplanter par transfert adoptif pour le traitement de cancers. Ici,
les vecteurs lentiviraux sont largement utilisés et des résultats très
encourageants ont été obtenus au stade clinique.
= L'autre approche qualifiée d'immunothérapie active est la vaccination.
Les
cellules dendritiques (DCs) sont des agents naturels de la présentation des
antigènes. Les cellules dendritiques sont au centre de nombreuses
stratégies thérapeutiques anti-tumorales du fait de leur capacité à stimuler
des cellules T naïves. En effet, les cellules dendritiques sont les
"détecteurs" de l'environnement et transmettent les informations récoltées
aux cellules T et B du système immunitaire. Ces cellules sont donc des
cibles essentielles pour générer une immunité thérapeutique anti-tumorale
et sont, de ce fait, qualifiées de Cellules Présentatices d'Antigènes (CPAs)
professionnelles. La finalité de la vaccination basée sur les cellules
dendritiques est à la fois d'induire in vivo une réponse des cellules T
effectrices pour réduire la masse tumorale spécifiquement et également
d'installer une réponse mémoire.
Ces deux approches thérapeutiques impliquent deux spécificités pour obtenir
une
réponse immunitaire anti-tumorale efficace et reproductible. Premièrement,
l'expression de séquences exogènes telles que les antigènes, dans les cellules
cibles
doit être contrôlée pour obtenir une réponse immunitaire sans induire de
toxicité. La
co-expression de plusieurs antigènes au même moment est une bonne opportunité
pour augmenter la réponse anti-tumorale et éviter l'échappement de cellules
tumorales.
Les CPA ont un rôle essentiel dans le système immunitaire et constituent un
élément déterminant dans une stratégie d'immunothérapie. Les CPA ont pour
mission
de présenter les peptides antigéniques aux cellules du système immunitaire. Si
le ou
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les antigène(s) sont immunogènes, le système immunitaire va être
spécifiquement
activé afin d'éliminer les cellules le ou les exprimant. Cette réponse va donc
être
dirigée contre les CPA mais également contre toute cellule qui exprimera
l'antigène, ce
qui est le cas des cellules tumorales. Toute cellule présentatrice d'antigène
(CPA) mise
en contact avec un antigène étranger va le processer pour l'associer aux
molécules du
CMH (Complexe Majeur d'Histocompatibilité) qui vont permettre la présentation
de
peptides antigéniques à sa surface. Cet ensemble va pouvoir générer une
activation
des lymphocytes avec lesquels les CPA vont entrer en contact dans les organes
lymphoïdes secondaires. Une tumeur donnée exprime généralement plusieurs
antigènes différents, contre lesquels il est clé d'éduquer les cellules du
système
immunitaire afin de les rendre efficaces contre la tumeur. Ces antigènes
tumoraux
peuvent également s'exprimer à différents niveaux selon les stades de
développement
d'une tumeur. Une manipulation de la réponse portant sur plusieurs antigènes
peut
donc se révéler cruciale dans l'efficacité du traitement par les cellules
immunitaires
modifiées.
Le second point est l'expression dans les cellules cibles d'agents immuno-
modulateurs qui déclenchent la maturation ou l'activation des cellules
immunitaires
ainsi modifiées. Ces co-expressions multiples au sein des cellules
immunitaires vont
permettre de mimer les réponses immunes innées et adaptatives. Ainsi ces
procédés
vont d'une part fournir des cellules exprimant spécifiquement des antigènes et
d'autre
part induire leur maturation ou différenciation qui est essentielle à une
réponse
immunitaire complète et efficace. Cela signifie que la thérapie la plus
efficace va
résulter de l'administration de gènes multiples pour améliorer les résultats
thérapeutiques, en combinant la spécificité de la réponse immunitaire contre
plusieurs
antigènes tumoraux avec des réponses stimulantes, de manière contrôlée et
dépendantes du temps. Le fait de délivrer en même temps dans les cellules
cibles ou
dans le corps à la fois des antigènes et des immunomodulateurs et en une seule
utilisation devrait fournir un avantage clinique.
Ces deux approches basées respectivement sur des cellules T et des cellules
dendritiques (CPA) sont plus particulièrement ciblées par l'invention.
Il existe donc toujours un besoin pour des systèmes de vectorisation viraux
plus
efficaces, moins toxiques et plus spécifiquement adaptés à l'immunothérapie.
Le travail des inventeurs a permis de réaliser un système de vectorisation
capable
de délivrer plusieurs ARN d'intérêt dans une même cellule en une seule
infection.
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La présente invention se rapporte donc à une particule rétrovirale comportant
une
protéine issue de la polyprotéine Gag, une protéine d'enveloppe,
optionnellement une
intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux
encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence
d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine
de
liaison introduit dans la protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou dans
l'intégrase, et
l'une au moins dédites séquences d'intérêt des ARN non viraux encapsidés
comporte
une partie codant pour au moins un épitope et/ou au moins une structure
moléculaire
reconnaissant spécifiquement un épitope.
La particule rétrovirale selon l'invention permet d'introduire au moins deux
ARN
non viraux, préférentiellement 3, dans une cellule par une seule infection.
L'introduction
de telles particules dans les cellules peut être effectuée par un procédé in
vivo, in vitro
ou ex vivo.
Par protéine issue de la polyprotéine Gag , on entend toute protéine
résultant
du clivage de la polyprotéine Gag. Plus particulièrement, il s'agit d'une
protéine de
nucléocapside, d'une protéine de matrice (par exemple, dans des particules
rétrovirales dérivées du virus murins de type MoMuLV) ou de la protéine p12,
spécifique aux gammaretrovirus.
Par protéine d'enveloppe , on entend toute protéine d'enveloppe, y compris
une
protéine d'enveloppe de pseudotypage. A titre d'exemple, on peut citer la
protéine
d'enveloppe Ampho, la protéine d'enveloppe écotrope, la protéine d'enveloppe
du virus
Moloney de la leucémie murine (MoMuLV), la protéine d'enveloppe du virus de
l'Immunodéficience Féline (FIV), la protéine d'enveloppe du virus du sarcome
murin
d'Harvey (HaMuSV), la protéine d'enveloppe du virus de la tumeur mammaire
murine
(MuMTV), la protéine d'enveloppe du virus du Sarcôme de Rous (RSV), la
protéine
d'enveloppe du virus de la rougeole (aussi MV pour meastes virus), la protéine
d'enveloppe du virus de la leucémie du Gibbon (GalV), la protéine du virus
endogène
félin (RD114) ou la protéine d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire
(VSV-G).
Plus particulièrement, la protéine d'enveloppe est la protéine d'enveloppe
Ampho, la
protéine d'enveloppe écotrope, la protéine d'enveloppe du virus Moloney de la
leucémie murine (MoMuLV), la protéine d'enveloppe du virus de
l'Immunodéficience
Féline (FIV), la protéine d'enveloppe du virus du sarcome murin d'Harvey
(HaMuSV),
la protéine d'enveloppe du virus de la tumeur mammaire murine (MuMTV), la
protéine
d'enveloppe du virus du Sarcôme de Rous (RSV), la protéine d'enveloppe du
virus de
la rougeole (aussi MV pour meastes virus), la protéine d'enveloppe du virus de
la
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leucémie du Gibbon (GalV) ou la protéine d'enveloppe du virus de la stomatite
vésiculaire (VSV-G). La protéine d'enveloppe peut ainsi être modifiée pour
cibler
certains types cellulaires ou certaines applications (utilisation de
récepteurs de surface
comme protéine d'enveloppe).
Il est également possible de modifier la protéine d'enveloppe avec un
anticorps, un
glycolipide et/ou un ligand particulier afin de cibler un récepteur et/ou un
type cellulaire
particulier.
Préférentiellement, la protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G.
Par intégrase , on entend la protéine enzymatique codée par le gène pol,
qui
permet l'intégration de l'ADN rétroviral dans l'ADN de la cellule infectée par
le
rétrovirus lors de la réplication dudit rétrovirus.
Par séquence d'encapsidation , on désigne un motif (séquence et structure
tridimensionnelle) ARN reconnu spécifiquement par un domaine de liaison.
Préférentiellement, la séquence d'encapsidation est un motif tige-boucle. Plus
préférentiellement encore, la séquence d'encapsidation de la particule
rétrovirale est le
motif tige-boucle de l'ARN du bactériophage MS2 ou du phage PP7 tel que par
exemple, celui résultant de la séquence ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ
ID
N 1) ou ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N 2) respectivement. Le
motif tige-boucle et plus particulièrement le motif tige-boucle de l'ARN du
bactériophage MS2 ou celui de l'ARN du phage PP7, peut être utilisé seul ou
répété
plusieurs fois, de préférence de 2 à 25 fois, plus préférentiellement de 2 à
18 fois, par
exemple de 6 à 18 fois.
Par domaine de liaison , on désigne tout ou partie d'une protéine se liant
spécifiquement à la séquence d'encapsidation liée à la séquence d'ARN
d'intérêt. Plus
particulièrement, il s'agit d'une protéine mutante ou non, définie par une
structure
tridimensionnelle, se liant spécifiquement à la séquence d'encapsidation.
Préférentiellement, le domaine de liaison est un domaine hétérologue. Plus
préférentiellement, le domaine de liaison est la protéine Coat du
bactériophage MS2,
du phage PP7 ou du phage (26, la protéine nun du prophage HK022, la protéine
U1A
ou encore la protéine hPum.
Plus préférentiellement, le domaine de liaison est la protéine Coat du
bactériophage MS2 ou du phage PP7.
Plus préférentiellement encore, lorsque le domaine de liaison est la protéine
Coat
du phage PP7, la séquence de celle-ci est déficiente pour l'auto-assemblage,
grâce à
une délétion des acides aminés 67 à 75 (PCPAFG) (Chao et al. 2008).
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Préférentiellement, la séquence de la protéine Coat du phage PP7 est codon-
optimisée
pour les cellules humaines, c'est-à-dire que les bases de l'ADN sont choisies
pour
coder pour des acides aminés préférentiellement présents dans l'espèce
humaine.
Par chaque séquence , on entend que les séquences d'encapsidation peuvent
être identiques ou différentes, selon que ces séquences d'encapsidation sont
reconnues par un domaine de liaison identique ou différent. En effet, la
particule
rétrovirale selon l'invention peut comporter un ou plusieurs domaines de
liaison.
Lorsque plusieurs domaines de liaison sont introduits, ceux-ci peuvent l'être
dans la
polyprotéine Gag et/ou dans l'intégrase.
Le domaine de liaison permet non seulement la reconnaissance de la séquence
d'encapsidation mais également l'encapsidation des ARN portant la séquence
d'encapsidation dans la particule (ou dans le cas présent, d'un ARN non viral
lié à une
séquence d'encapsidation).
Par encapsidation , on entend l'empaquetage d'un ARN dans la capside virale
d'une particule virale. On notera que dans la présente invention,
l'encapsidation des
ARN non viraux s'effectue par la reconnaissance d'un signal d'encapsidation
non viral,
en particulier autre que Psi.
Par séquence d'intérêt , on vise une séquence codant pour ou ayant une
fonction présentant un intérêt pour l'utilisateur. Plus particulièrement, la
séquence
d'intérêt portée par chacun des deux ARN non viraux encapsidés peut être
identique
ou différente.
A l'aide des particules selon l'invention, il est possible de transférer dans
des
cellules cibles des ARN non viraux identiques ou différents.
Les ARN encapsidés étant non viraux, ces ARN ne présentent pas les sites de
reconnaissance des protéines codées par le gène poL
En effet, ces ARN non viraux n'entrent pas dans les étapes précoces du cycle
réplicatif des rétrovirus, à savoir :
- La copie de l'ARN viral simple brin en ADN double brin par la transcriptase
inverse ;
- La maturation de l'ADN viral double brin par reconnaissance des extrémités
LTR par l'intégrase et maturation du complexe de pré-intégration
cytoplasmique en complexe de pré-intégration nucléaire.
Ces protéines virales (transcriptase inverse, intégrase), codées par le gène
pol
sont donc optionnelles dans la particule et le gène pol peut donc être soit
présent, soit
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délété partiellement ou totalement. Préférentiellement, le gène pol est soit
présent, soit
délété partiellement.
On notera que les particules rétrovirales selon l'invention comportent un
matériel génétique à la fois viral et non viral :
- le gène gag, qui peut être viral ou chimérique. Plus particulièrement, le
gène
gag est chimérique lorsque le ou les domaine(s) de liaison est/sont
introduit(s) dans celui-ci.
- Optionnellement, le gène pol, qui peut être viral ou chimérique. Le gène pol
codant pour plusieurs enzymes, les séquences afférentes à ces enzymes
peuvent être délétées totalement ou partiellement, présentes et non
fonctionnelles, ou présentes et fonctionnelles. Plus particulièrement, le gène
pol est chimérique lorsque le ou les domaine(s) de liaison est/sont
introduit(s) dans l'intégrase.
- Au moins deux ARN non viraux, chaque ARN non viral étant porteur d'une
séquence d'intérêt et d'une séquence d'encapsidation. Plus
particulièrement, par "ARN non viral", on entend un ARN dépourvu de toute
séquence rétrovirale (qui peut également être désigné par "ARN non
rétroviral").
Plus spécifiquement, les particules rétrovirales selon l'invention permettent
d'introduire dans des cellules cibles des ARN capables d'induire :
= Le transfert d'une ou plusieurs séquences d'intérêt codantes endogènes ou
exogènes de la cellule cible,
= Le transfert d'un ou plusieurs ARN non codants comme des ARN capables
d'induire un effet sur l'expression génétique, par exemple par le biais de
shRNA, miRNA, sgRNA, LncRNA ou circRNA.
= Le transfert d'ARN cellulaires, de type ARN messagers ou autres
(miRNA...),
des réplicons sous génomique de virus à ARN (VHC, etc...) ou de génomes
complets de virus à ARN,
= l'expression simultanée de séquences codantes ou non codantes endogènes,
exogènes de la cellule cible.
Plus particulièrement, les particules virales selon l'invention permettent
d'introduire
dans des cellules cibles des acides nucléiques capables d'induire :
- L'expression d'un ou plusieurs épitope(s) et notamment d'un ou plusieurs
antigène(s) dans des cellules impliquées dans la réponse immune (cellules
dendritiques ou autres cellules présentatrices d'antigènes) ;
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-
L'activation des cellules transduites pour déclencher leur maturation ou leur
activation ou celle de cellules avec lesquelles elles pourront interagir et
contrecarrer par exemple les mécanismes d'immunosuppression induits par
des mécanismes variés et complexes. Une telle activation peut être
effectuée par des agents immuno-modulateurs. Ce type d'approche peut
créer un micro-environnement favorable au déclenchement d'une réponse
immune contre les cellules tumorales.
Il est à noter que cette méthode peut être appliquée à d'autres types de
systèmes
d'induction de réponse immunitaire.
Par épitope , on entend une structure qui peut être reconnue
spécifiquement
par un anticorps ou un récepteur lymphocytaire.
Avantageusement, la séquence d'intérêt code pour plusieurs épitopes, notamment
pour un antigène.
Par antigène , on entend une substance étrangère à l'organisme capable de
déclencher une réponse immunitaire visant à l'éliminer. Ils peuvent être
naturels ou
synthétiques. Un antigène est généralement une macromolécule naturelle ou
synthétique, généralement des protéines, des polysaccharides et leurs dérivés
lipidiques. C'est la reconnaissance de l'antigène par les cellules
immunocompétentes,
directement ou via les cellules présentatrices d'antigène (CPA), qui active
l'immunité
spécifique. Un même antigène peut comporter plusieurs épitopes (identiques ou
différents) et ainsi induire une réponse immunitaire variée. La reconnaissance
de
l'antigène par les lymphocytes dépend de la nature de l'épitope. Les
lymphocytes B se
lient directement aux épitopes conformationnels grâce aux immunoglobulines de
leur
membrane. Les lymphocytes T reconnaissent les épitopes séquentiels,
correspondant
à une séquence d'acides aminés, présentés par les cellules présentatrices
d'antigènes.
Préférentiellement, l'épitope ou l'antigène provient d'un agent pathogène,
notamment d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite, d'une cellule tumorale,
etc.
L'épitope ou l'antigène peut être déduit à partir des biomarqueurs identifiés
comme
exprimés en grande quantité sur les cellules tumorales ou à partir de virus ou
de
toxine. Sa taille peut être variable. En général, un criblage est réalisé pour
sélectionner
le meilleur épitope ou antigène. A partir de la séquence protéique de
l'épitope ou de
l'antigène, la séquence des acides désoxyribonucléiques et des acides
ribonucléiques
peut être déduite.
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L'épitope est de préférence choisi parmi les peptides. Plus
préférentiellement,
l'épitope est un épitope peptidique comportant de 1 à 50 acides aminés (AA),
de
préférence moins de 30 AA, préférentiellement de 3 à 12 acides aminés.
L'antigène est de préférence choisi parmi les peptides, les protéines, les
glycoprotéines. En effet, la machinerie cellulaire de la cellule (hôte)
pouvant traduire
l'ARN encapsidé, elle peut également réaliser une ou plusieurs étapes
supplémentaires de modifications post traductionnelles telles qu'une
glycosylation. En
effet, lorsque la production de l'antigène a lieu dans des cellules
dendritiques,
l'antigène peut être maturé comme le biomarqueur qui a permis son obtention.
La particule selon l'invention permettant l'introduction d'ARN présentant une
taille
allant jusqu'à 10kb, il est possible d'introduire dans celle-ci des séquences
antigéniques de taille conséquente. Toutefois, la taille de la séquence
antigénique est
variable. De façon générale, plus une molécule est de grande taille et plus
elle est
immunogène.
Par séquence antigénique , on vise une séquence d'ADN codant pour un
épitope ou un antigène.
Avantageusement, l'épitope ou l'antigène est immunogène, c'est-à-dire qu'il
peut
initier une réponse immunitaire.
Par immunogène on entend le potentiel d'un antigène à un induire une
réponse
immune. Une substance peut être antigénique sans être immunogène. Ce potentiel
dépend de l'espèce, du degré de similitude entre l'antigène et les molécules
de l'hôte,
des caractéristiques physico-chimiques de l'antigène (taille, forme, rigidité)
et de la
dose d'antigène reçue.
De préférence, l'épitope est choisi parmi la liste constituée par des
molécules qui
sont identifiées comme reconnues par la partie variable d'un anticorps ou d'un
récepteur membranaire des lymphocytes T (TCR). Ces derniers sont identifiés et
sélectionnés selon leur potentiel immunogène.
De préférence, l'antigène est un antigène tumoral c'est-à-dire une molécule
spécifiquement présente à la surface des cellules tumorales, absente ou peu
abondante sur les cellules normales environnantes. Plus préférentiellement,
l'antigène
est choisi parmi le groupe constitué par les antigènes du groupe cancer
testis (Ex
MAGE-Al2, MAGE-A3, MAGE-A1 0, MAGE-A2, MAGE-Ai, CT7/MAGE-C1 , CT1 0,
SSX4, BRDT, NY-ES01 , SSX2, Xage1b, MAGE-A4...) qui sont exprimés
spécifiquement par le tissu tumoral en dehors d'une expression ectopique par
les
cellules germinales ; les antigènes de différenciation qui sont exprimés dans
un tissu
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donné aussi bien par des cellules normales que par les cellules tumorales
correspondantes ; les antigènes exprimés uniquement dans les cellules
tumorales qui
peuvent correspondre à des antigènes mutés (Alpha-actinin-4, NY-FC, P53,
elongation
factor 2, enzyme malic, EGF-R, Kras, Casp8, ACYN4, ALK-EML14...) ; les
néoantigènes générés à la suite d'une translocation chromosomique (Bcr-Abl) ;
les
antigènes exprimés par des cellules normales qui peuvent être surexprimés par
la
tumeur (WT1, ACE, Muc1, Survivin 2B, Telomerase ctalytic protein, Her2/neu,
EGF-R,
EGF, TGFalpha, cyclophillin B...) ; les antigènes dérivés d'agents pathogènes
notamment des virus (papillomavirus et cancers du col de l'utérus ou des voies
aérodigestives supérieures, virus des hépatites B et C et cancers du foie) ;
et les
antigènes dérivés des bactéries (Helicobacter pylori et cancer de l'estomac)
ou des
parasites (schistosome et cancer de la vessie), notamment chez l'homme. En
particulier, les antigènes tumoraux associés aux mélanomes ont été classés
dans trois
catégories selon qu'ils soient spécifiques de tissu (MART-1, tyrosinases TRP-1
et TRP-
2, gp-100), spécifiques de tumeurs, pour ceux qui sont également exprimés par
une
grande variété de cancer (MAGE-1, NY-ESO-1), ou qu'ils soient des antigènes
tumoraux uniques et mutés (8-catenin, CDC27).
Une particule rétrovirale selon l'invention comportant un ARN non viral
encapsidé
dont la séquence d'intérêt comporte une partie codant pour au moins un épitope
est
particulièrement avantageuse pour transduire des cellules présentatrices
d'antigène,
notamment les cellules dendritiques.
Par structure moléculaire reconnaissant spécifiquement un épitope ou
paratope , on vise une structure capable d'établir une interaction
spécifique avec un
épitope, et notamment un antigène. Il s'agit généralement d'un immunorécepteur
constitué par la partie variable d'un anticorps ou d'un récepteur membranaire
des
lymphocytes. De préférence, il s'agit d'immunorécepteur de type TCR (T cell
receptor)
ou de CAR (récepteur chimérique) présent à la surface d'un lymphocyte T.
De préférence, la structure moléculaire reconnaissant spécifiquement un
épitope est choisie parmi le groupe constitué par les récepteurs des
lymphocytes T
(TCR), natifs, modifiés ou chimériques ; les récepteurs des lymphocytes B,
membranaires (BCR) ou secrétés (immunoglobulines) ; et les récepteurs d'autres
cellules du système immunitaire intervenant dans la réponse immune, telles que
les
lymphocytes NK ou NKT.
Une particule rétrovirale selon l'invention comportant un ARN non viral
encapsidé
dont la séquence d'intérêt comporte une partie codant pour au moins une
structure
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moléculaire reconnaissant spécifiquement un antigène est particulièrement
avantageuse pour transduire des cellules lymphocytaires.
Avantageusement, la particule rétrovirale selon l'invention comporte une
protéine
de nucléocapside, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et
au
moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant
chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation,
chaque
séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit
dans la
protéine de nucléocapside et/ou dans l'intégrase.
Par protéine de nucléocapside , on entend la protéine de structure NC
codée
par le gène gag. Lorsque le domaine de liaison est introduit dans la protéine
de
nucléocapside, alors cette protéine est une protéine chimérique, issue d'un
gène gag
chimérique.
Lorsque le domaine de liaison est introduit dans l'intégrase, alors
l'intégrase est
une protéine chimérique, issue d'un gène pol chimérique.
Par protéine chimérique , on désigne une protéine recombinante comprenant
plusieurs séquences protéiques différentes fusionnées.
Selon un premier mode de réalisation, dans la particule rétrovirale selon
l'invention, le domaine de liaison est introduit dans la protéine de
nucléocapside et les
au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence
d'ARN.
Ce premier mode de réalisation permet une expression précoce et transitoire
des
ARN d'intérêt, sans événement d'intégration associé dans le génome des
cellules
cibles.
En effet, lors de la mise en contact d'une particule selon ce premier mode de
réalisation avec une cellule cible, la membrane de la particule rétrovirale et
celle de la
cellule cible vont fusionner et permettre la libération du contenu de la
particule dans la
cellule cible. Les ARN sont alors libérés dans le cytoplasme et la machinerie
cellulaire
permet de traduire directement ces ARN en protéine(s), c'est-à-dire sans
étapes
supplémentaires comme la transcription inverse, la translocation dans le noyau
ou
l'intégration dans le génome de la cellule cible.
Plus particulièrement, les au moins deux ARN non viraux présentent la même
séquence d'encapsidation. Dans ce cas, les au moins deux ARN non viraux
encapsidés se distinguent par leur séquence d'ARN d'intérêt, c'est-à-dire que
les
séquences d'ARN d'intérêt comprises dans les deux ARN non viraux encapsidés
sont
différentes. Par différentes , on vise des séquences d'intérêt non
identiques ou
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présentant une différence ne résultant pas d'une mutation spontanée ou non
intentionnellement choisie par le manipulateur.
Alternativement, les au moins deux ARN non viraux présentent deux séquences
d'encapsidation différentes. Ces au moins deux séquences d'encapsidation sont
alors
reconnues par au moins deux domaines de liaison différents, au moins un de ces
domaines étant introduit dans la protéine de nucléocapside. Dans ce cas, les
au moins
deux ARN non viraux encapsidés peuvent comporter des séquences d'intérêt
identiques ou différentes.
Il est possible d'encapsider au moins deux ARN non viraux, préférentiellement
trois ARN non viraux.
Selon un mode de réalisation particulier du premier mode de réalisation, un
second domaine de liaison est introduit dans la protéine de nucléocapside de
la
particule rétrovirale selon l'invention.
A titre d'exemple, le second domaine de liaison peut être la protéine Coat
du
bactériophage M52 lorsque le premier domaine de liaison est la protéine Coat
du
phage PP7 ou le second domaine de liaison peut être la protéine Coat du
phage
PP7 lorsque le premier domaine de liaison est la protéine Coat du
bactériophage
MS2.
Dans ce cas, au moins deux ARN non viraux encapsidés portent des séquences
d'encapsidation différentes, chaque séquence d'encapsidation correspondant
respectivement au premier et second domaine de liaison introduit dans la
protéine de
nucléocapside.
Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés :
- au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même séquence
d'encapsidation correspondant au premier domaine de liaison et se distinguent
uniquement par leur séquence d'ARN d'intérêt,
- le troisième ARN non viral encapsidé peut porter une séquence
d'encapsidation
identique ou différente. Lorsque la séquence d'encapsidation est différente,
celle-ci
peut correspondre à un second domaine de liaison introduit dans la protéine de
nucléocapside.
D'autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans la
protéine de nucléocapside.
Outre le ou les domaine(s) de liaison introduit(s) dans la protéine de
nucléocapside, il est également possible d'introduire un domaine de liaison
dans
l'intég rase.
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L'intégrase est alors une protéine chimérique, issue d'un gène pol chimérique.
Préférentiellement, lorsque le domaine de liaison est introduit dans
l'intégrase,
la séquence de l'intégrase est mutée au niveau du domaine C-terminal afin
d'insérer la
séquence du domaine de liaison. Plus préférentiellement encore, la séquence de
l'intégrase est mutée au niveau du domaine C-terminal de manière à introduire
celle de
la protéine Coat du bactériophage MS2 ou du phage PP7.
Dans ce cas, les au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent porter des
séquences d'encapsidation différentes, chaque séquence d'encapsidation
correspondant aux domaines de liaison introduits dans la protéine de
nucléocapside et
dans l'intégrase respectivement.
Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés :
- au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même
séquence d'encapsidation correspondant au premier domaine de liaison et
se distinguent uniquement par leur séquence d'ARN d'intérêt,
- le troisième ARN non viral encapsidé portant une séquence
d'encapsidation différente, correspondant à un second domaine de liaison
introduit dans l'intégrase.
D'autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans
l'intégrase.
Avantageusement, la particule rétrovirale selon l'invention est une particule
lentivirale.
Préférentiellement, dans une telle particule lentivirale :
- le domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage
MS2,
- la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-
boucle de MS2,
- la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV
appartenant à la polyprotéine Gag, chimérique, la séquence de NC étant
mutée au niveau du second doigt de zinc afin d'insérer la séquence de la
protéine Coat du bactériophage MS2.
Avantageusement :
- La protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine
d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire.
- La séquence d'encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la
séquence tige-boucle de MS2, préférentiellement, de 6 à 18 répétitions de
la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore de 10 à 14, par
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exemple 12 répétitions. De préférence, la séquence tige-boucle est la
suivante : ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N 1).
Ou, préférentiellement, dans une telle particule lentivirale :
- le domaine de liaison est la protéine Coat du phage PP7,
- la séquence
d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-
boucle de PP7,
- la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV
appartenant à la polyprotéine Gag, chimérique, la séquence de NC étant
mutée au niveau du second doigt de zinc afin d'insérer la séquence de la
protéine Coat du phage PP7.
Avantageusement :
- La protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine
d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire.
- La séquence d'encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la
séquence tige-boucle de PP7, préférentiellement, de 2 à 18 répétitions de la
séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore de 2 à 12, par
exemple 6 répétitions. De préférence, la séquence tige-boucle est la
suivante : ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N 2).
Avantageusement, la SEQ ID N 2 peut être optimisée pour favoriser le
repliement de la tige boucle. Notamment, il a été trouvé qu'il pouvait être
intéressent
d'insérer successivement et en alternance la SEQ ID N 2 et la SEQ ID N 3
(ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag).
Optionnellement, le second domaine de liaison introduit dans l'intégrase peut
être la protéine Coat du phage PP7 si le premier domaine de liaison est la
protéine
Coat du bactériophage MS2, ou le second domaine de liaison introduit dans
l'intégrase
peut être la protéine Coat du bactériophage MS2 si le premier domaine de
liaison est la
protéine Coat du phage PP7.
Selon un second mode de réalisation, l'invention concerne une particule
rétrovirale comportant une protéine issue de la polyprotéine Gag,
préférentiellement
une protéine de nucléocapside, une protéine d'enveloppe, une intégrase et au
moins
deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant
chacun
une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque
séquence
d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans
l'intégrase et,
optionnellement par un domaine de liaison introduit dans une protéine issue de
la
polyprotéine Gag, préférentiellement une protéine de nucléocapside.
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Ce second mode de réalisation permet une expression transitoire des ARN
d'intérêt, sans événement d'intégration associé dans le génome des cellules
cibles.
Préférentiellement, dans ce second mode de réalisation, la séquence de
l'intégrase est mutée au niveau du domaine C-terminal afin d'insérer la
séquence du
domaine de liaison.
Avantageusement, le domaine de liaison est un domaine hétérologue. Plus
particulièrement, le domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage
MS2, du
phage PP7 ou du phage C213, la protéine nun du prophage HK022, la protéine UlA
ou
encore la protéine hPum.
De préférence, la séquence de l'intégrase est mutée au niveau du domaine C-
terminal de manière à introduire celle de la protéine Coat du
bactériophage MS2 ou
du phage PP7.
Les au moins deux ARN non viraux peuvent présenter ou non la même
séquence d'encapsidation.
De même, les au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent présenter ou
non la même séquence d'ARN d'intérêt.
Préférentiellement, les au moins deux ARN non viraux encapsidés se
distinguent par leur séquence d'ARN d'intérêt c'est-à-dire que les séquences
d'ARN
d'intérêt comprises dans les deux ARN non viraux encapsidés sont différentes.
Plus particulièrement, les au moins deux ARN non viraux présentent la même
séquence d'encapsidation, celle-ci étant reconnue par le domaine de liaison
introduit
dans l'intégrase.
Il est possible d'encapsider au moins deux ARN non viraux, préférentiellement
trois ARN non viraux.
Selon un mode de réalisation particulier du second mode de réalisation, un
second
domaine de liaison est introduit dans l'intégrase de la particule rétrovirale
selon
l'invention.
A titre d'exemple, le second domaine de liaison peut être la protéine Coat
du bactériophage M52 lorsque le premier domaine de liaison est la protéine
Coat
du phage PP7 ou le second domaine de liaison peut être la protéine Coat du
phage
PP7 lorsque le premier domaine de liaison est la protéine Coat du
bactériophage
MS2.
Dans ce cas, au moins deux ARN non viraux encapsidés portent des
séquences d'encapsidations différentes, chaque séquence d'encapsidation
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correspondant respectivement au premier et second domaine de liaison introduit
dans
l'intégrase.
Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés :
- au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même séquence
d'encapsidation correspondant au premier domaine de liaison, ces deux ARN non
viraux pouvant éventuellement se distinguer par leur séquence d'ARN d'intérêt,
- le troisième ARN non viral encapsidé peut porter une séquence
d'encapsidation
identique ou différente. Lorsque la séquence d'encapsidation est différente,
celle-ci
peut correspondre à un second domaine de liaison introduit dans l'intégrase.
D'autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans
l'intégrase.
Outre le ou les domaine(s) de liaison introduit(s) dans l'intégrase, il est
également possible d'introduire un domaine de liaison dans la protéine de
nucléocapside.
La protéine de nucléocapside est alors une protéine chimérique, issue d'un
gène gag chimérique.
Dans ce cas, les au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent porter des
séquences d'encapsidation différentes, chaque séquence d'encapsidation
correspondant aux domaines de liaison introduits dans l'intégrase et dans la
protéine
de nucléocapside respectivement.
Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés :
- au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même
séquence d'encapsidation correspondant au premier domaine de liaison
introduit dans l'intégrase, ces ARN non viraux pouvant éventuellement se
distinguer par leur séquence d'ARN d'intérêt,
- le troisième ARN non viral encapsidé porte une séquence d'encapsidation
différente, correspondant à un second domaine de liaison introduit dans la
protéine de nucléocapside.
D'autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans la
protéine de nucléocapside.
L'invention vise donc une particule rétrovirale comportant une protéine de
nucléocapside, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au
moins
deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant
chacun
une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque
séquence
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d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la
protéine de
nucléocapside et/ou dans l'intégrase.
Optionnellement, les séquences d'intérêt des au moins deux ARN non viraux
encapsidés peuvent être identiques.
Alternativement et de préférence, les au moins deux ARN non viraux
encapsidés dans la particule rétrovirale se distinguent par leur séquence
d'ARN.
Dans ce cas, il est avantageux que la séquence d'intérêt de l'autre ARN non
viral encapsidé code soit pour un second épitope ou antigène, soit pour une
protéine
immunomodulatrice.
Dans le cas où la séquence d'intérêt de l'autre ARN non viral encapsidé code
pour un second épitope ou antigène, il est ainsi possible d'exprimer plusieurs
épitopes
et/ou antigène à la fois et de déclencher une réponse immunitaire combinée et
coordonnée. A titre d'exemple dans le domaine de l'immunothérapie tumorale,
les
cellules tumorales deviennent la cible de plusieurs réponses immunitaires
indépendantes.
Il existe de nombreux agents immunomodulateurs, c'est-à-dire des molécules
pouvant être utilisées pour contrôler et orienter le système immunitaire.
L'introduction
de ces agents immunomodulateurs par les particules selon l'invention peut donc
concerner toutes les cellules du système immunitaire (lymphocytes, monocytes)
dont il
est souhaité de moduler la réponse spécifique, l'activation ou la
différenciation. Dans le
cas des cellules dendritiques, ces agents exercent deux fonctions principales.
A l'état immature, les cellules dendritiques capturent l'antigène au niveau
des
tissus ciblés ou infectés puis migrent vers l'organe lymphoïde secondaire le
plus
proche tout en se différenciant.
A l'état mature, les cellules dendritiques présentent l'antigène aux
lymphocytes
T afin de les activer spécifiquement.
Cette activation spécifique des cellules dendritiques conduit à la production
de
cytokines essentielles pour la mise en place et le maintien de la réponse
immune. Ces
cytokines permettent de lier le système inné au système adaptif par un
mécanisme très
complexe. C'est pourquoi, généralement l'activation des cellules in vitro ou
ex vivo est
provoquée par l'ajout de cytokines ou de facteurs dans le milieu de culture.
Le micro-environnement, mais aussi différents agents immunomodulateurs,
peuvent induire ou contribuer à l'activation des cellules dendritiques. Par
exemple, les
PAMP (Pathogen Associated Molecular Pattern), les TLR (Toll-like Receptor),
des
molécules d'inflammation DAMP (Damage associated Molecular pattern Molecules)
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peuvent conduire à l'activation des cellules dendritiques. Beaucoup de
molécules sont
capables d'activer des cellules dendritiques. Le MCM (Monocyte-Conditioned
Medium),
les cytokines (TNFa, IL-113, PGL6), la prostaglandine E2, le CD4OL ou des
ligands des
TLRs. L'ensemble des protéines capables d'agir sur la voie d'activation des
cellules
dendritiques est potentiellement capable d'avoir un effet modulateur sur leur
maturation. De la même façon, des agents immunomodulateurs des Lymphocytes T
ou
B peuvent être de puissants régulateurs de la production et de l'activité de
ces cellules
et stimuler ainsi les interactions entre les différents acteurs de la réponse
immune et
donc améliorer celle-ci.
Par "protéine immunomodulatrice", on entend un agent immunomodulateur se
présentant sous la forme d'une protéine.
Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux lorsque des cellules
présentatrices d'antigène et notamment les cellules dendritiques, ou des
lymphocytes
sont transduits pour exprimer directement ces agents immunomodulateurs et
amplifier
la réponse immunitaire.
Ainsi l'induction de la maturation des cellules présentatrices d'antigène, et
notamment des cellules dendritiques, concomitante à l'expression d'un antigène
est
une stratégie particulièrement porteuse pour induire une réponse immune.
L'objectif
est d'amorcer le système immunitaire pour répondre au mieux à (aux)
l'antigène(s)
cible(s). Une telle stratégie d'amorçage visant à pousser le système
immunitaire est
susceptible de conduire à un renforcement de la réponse immunitaire.
De préférence, la protéine immunomodulatrice est choisie parmi les cytokines
telles que TNFa, IL-113, PGL6, les interleukines telles que IL-2, IL-4, IL-12,
IL-15, des
agents comme le GM-CSF, CD28, l'ICOS ( lnducible Costimulator ), 0X40, CD80,
ICOSL ou OX4OL, et des protéines permettant de réguler les voies d'activation
décrites
telles que des ligands des TLR ou des NLR (Nod-like recepteurs) comme
l'imiquimod
ou les CpGs.
Avantageusement, la particule rétrovirale comporte un troisième ARN non viral
encapsidé.
Le troisième ARN non viral encapsidé peut présenter une séquence d'intérêt
identique à au moins l'une des séquences d'intérêt des deux premiers ARN non
viraux
encapsidés ou se distinguer de chacune des séquences d'intérêt des deux
premiers
ARN non viraux encapsidés.
En particulier, la particule rétrovirale peut comporter plus de trois ARN non
viraux encapsidés.
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Avantageusement, dans le cas où la particule selon l'invention comporte une
protéine de nucléocapside, le domaine de liaison peut être introduit dans la
protéine de
nucléocapside, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la
nucléocapside et/ou dans l'intégrase.
Alternativement, dans la particule rétrovirale selon l'invention, le domaine
de
liaison peut être introduit dans l'intégrase, un second domaine de liaison
pouvant être
introduit dans la nucléocapside et/ou dans l'intégrase.
Avantageusement, la particule rétrovirale selon l'invention est une particule
lentivirale.
Lorsque la particule rétrovirale est une particule lentivirale, il est
possible
d'exprimer transitoirement des ARN d'intérêt, sans événement d'intégration
associé
dans le génome des cellules cibles, en particulier des cellules quiescentes.
En effet, en dehors de son rôle dans la réaction d'intégration elle-même,
l'intégrase (IN) participe à différentes étapes du cycle réplicatif des
rétrovirus comme la
morphogénèse de la particule virale, la transcription inverse et l'import
nucléaire du
complexe de préintégration (PIC).
Plus particulièrement, chez les lentivirus, l'intégrase contient des séquences
de
localisation nucléaire (NLS) permettant sa localisation dans le noyau grâce au
PIC. Par
conséquent, lorsque l'encapsidation des ARN non viraux est effectuée par un
domaine
de liaison porté par une intégrase d'un lentivirus, les ARN non viraux
encapsidés
seront transportées dans le noyau de la cellule cible. En effet, lors de la
mise en
contact d'une particule lentivirale selon ce second mode de réalisation avec
une cellule
cible, la membrane de la particule et celle de la cellule cible vont fusionner
et permettre
la libération du contenu de la capside dans la cellule cible. Les ARN sont
alors pris en
charge par l'intégrase qui, via les PIC, va permettre l'import des ARN dans le
noyau.
Cette prise en charge est particulièrement intéressante pour certaines
applications,
telles que l'expression dans des cellules quiescentes. Dans le cas de
particules
rétrovirales, autres que les lentivirus, l'intégrase ne contient pas ces NLS
et se trouve
donc localisée dans le cytoplasme. Il est toutefois possible de rajouter dans
ce type
d'intégrase, les séquences NLS afin d'induire une localisation nucléaire de
l'intégrase,
et donc des ARN pris en charge par cette intégrase.
Cette prise en charge est également particulièrement utile pour un système
CRISPR, qui fait appel à des guides ARN qui viennent s'hybrider spécifiquement
au
génome de la cellule cible. Une fois hybridés, ces guides ARN guident une
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endonucléase (Cas9), qui va permettre la modification d'un locus spécifique du
génome de la cellule cible.
Pour l'immunothérapie, le fait que la transduction soit réalisée en
particulier par
des particules lentivirales, permet une expression transitoire des ARN
transduits.
La particule selon l'invention est en conséquence capable de délivrer des ARNs
multiples, optionnellement distincts génétiquement, sans événement
d'intégration dans
le génome des cellules hôtes afin d'exprimer, d'une part de multiples
séquences
antigéniques tumorales différentes par exemple, et d'autre part des protéines
immuno-
modulatrices capables de déclencher l'activation des cellules transduites dans
le
mécanisme de réponse immunitaire.
Plus particulièrement, dans une telle particule lentivirale :
- le domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage
MS2,
- la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-
boucle de MS2,
- l'intégrase est une protéine enzymatique chimérique dont la séquence est
mutée au niveau du domaine C-terminal afin d'insérer la séquence de la
protéine Coat du bactériophage MS2.
Ou, plus particulièrement, dans une telle particule lentivirale :
- le domaine de liaison est la protéine Coat du phage PP7,
- la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-
boucle de PP7,
- l'intégrase est une protéine enzymatique chimérique dont la séquence est
mutée au niveau du domaine C-terminal afin d'insérer la séquence de la
protéine Coat du phage PP7.
Optionnellement, le second domaine de liaison introduit dans la nucléocapside
peut être la protéine Coat du phage PP7 si le premier domaine de liaison est
la
protéine Coat du bactériophage MS2 ou le second domaine de liaison introduit
dans
l'intégrase peut être la protéine Coat du bactériophage MS2 si le premier
domaine de
liaison est la protéine Coat du phage PP7.
En effet, l'intégrase (IN) est composée de 3 domaines fonctionnels distincts,
chacun indispensable pour assurer une réaction d'intégration complète. Le
domaine N-
terminal contient un motif de type doigt de zinc qui stabilise la structure
repliée de l'IN
et augmente l'activité catalytique de l'enzyme. Le domaine central de l'IN
contient le
motif d'acides aminés DDE auquel est attribuée l'activité catalytique de
l'enzyme. Ce
domaine central est aussi impliqué dans la reconnaissance de la séquence
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nucléotidique conservée à chaque extrémité de l'ADN rétroviral. Le domaine C-
terminal
est le moins conservé parmi la famille des rétrovirus. Il possède l'activité
de liaison à
l'ADN et est indispensable pour les réactions de maturation des extrémités 3'
de
transfert de brin. En dehors de son rôle dans la réaction d'intégration elle-
même, IN
participe à différentes étapes du cycle réplicatif des rétrovirus comme la
morphogénèse de la particule virale, la transcription inverse et l'import
nucléaire du
complexe de préintégration.
Comme décrit par Petit et al. (1999; J. Virol. P5079-5088), l'insertion d'une
séquence exogène en C-terminal de l'IN ne perturbe pas les étapes de
production et
de transduction de cellules cibles alors qu'une même insertion en N-terminal
ne permet
pas la détection d'un événement de transduction.
La particule rétrovirale a donc été modifiée pour contenir la protéine Coat
du
bacteriophage MS2 en fusion avec la protéine de l'intégrase (Figure I) ou la
protéine
Coat du phage PP7 (Figure XXXVII). Le plasmide d'encapsidation p8.74,
porteur
du gène pol codant pour la protéine de l'intégrase, est modifié afin d'insérer
la
séquence codant la protéine Coat en C-terminal de l'intégrase par PCR
d'assemblage.
Le plasmide p8.74 est linéarisé par PCR puis la séquence Coat, préalablement
amplifiée par PCR, est clonée au niveau C-terminal de l'intégrase, soit
directement
bout-à-bout soit avec l'ajout un linker.
Avantageusement :
- La protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine
d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire.
- La séquence d'encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la
séquence tige-boucle de MS2 et/ou de PP7, selon le domaine de liaison
introduit, préférentiellement, de 2 à 18 répétitions, plus préférentiellement
de 2 à 18 répétitions, tel que de 6 à 18 répétitions de la séquence tige-
boucle, plus préférentiellement encore pour la séquence tige-boucle de
MS2, de 10 à 14, par exemple 12 répétitions.
- Préférentiellement, la séquence tige-boucle
est la suivante :
ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N 1) lorsque le domaine de
liaison est la protéine Coat de MS2 et/ou la séquence tige-boucle est la
suivante : ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N 2) et/ou la
séquence tige-boucle SEQ ID N 2 en alternance avec la séquence tige-
boucle SEQ ID N 3 lorsque le domaine de liaison est la protéine Coat de
PP7.
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Plusieurs exemples de particule lentivirale selon l'invention sont décrits ci-
après, certains étant décrits de manière plus détaillée dans les exemples qui
suivent :
- une particule RLP ou MS2RLP ou MS2 (NC)-RLP 12X est une particule
lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du
bactériophage MS2, répété 12 fois, par l'insertion de la protéine Coat du
bactériophage MS2 dans la nucléocapside,
- une particule MS2 (NC)-RLP 2X est une particule lentivirale formée par
encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2,
répété 2 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans
la nucléocapside,
- une particule MS2 (NC)-RLP 6X est une particule lentivirale formée par
encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2,
répété 6 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans
la nucléocapside,
- une particule MS2 (IN)-RLP 2X est une particule lentivirale formée par
encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2,
répété 2 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans
l'intégrase,
- une particule MS2 (IN)-RLP 6X est une particule lentivirale formée par
encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2,
répété 6 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans
l'intégrase,
- une particule MS2 (IN)-RLP 12X est une particule lentivirale formée par
encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2,
répété 12 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2
dans l'intégrase,
- une particule PP7RLP ou PP7 (NC)-RLP 2X est une particule lentivirale
formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage
PP7, répété 2 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans la
nucléocapside,
- une particule PP7 (NC)-RLP 6X est une particule lentivirale formée par
encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 6
fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans la
nucléocapside,
- une particule PP7 (NC)-RLP 12X est une particule lentivirale formée par
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WO 2017/194903 25 PCT/FR2017/051165
encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 12
fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans la
nucléocapside,
- une particule PP7 (IN)-RLP 2X ou PP7 (IN)-RLP est une particule lentivirale
formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage
PP7, répété 2 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans
l'intégrase,
- une particule PP7 (IN)-RLP 6X est une particule lentivirale formée par
encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 6
fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans l'intégrase,
- une particule PP7 (IN)-RLP 12X est une particule lentivirale formée par
encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 12
fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans l'intégrase,
- une particule MS2/PP7RLP ou MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X est une particule
lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du
bactériophage MS2, répété 12 fois, par l'insertion de la protéine Coat du
bactériophage MS2 dans la nucléocapside, ou portant le motif tige boucle
du phage PP7, répété 2 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage
PP7 dans la nucléocapside.
Préférentiellement, la particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs
porte un motif tige boucle du bactériophage MS2 ou du phage PP7, répété de 2 à
25
fois, préférentiellement encore 2, 6 ou 12 fois.
Plus préférentiellement encore, la particule selon l'invention est choisie
parmi
MS2 (NC)-RLP 12X, PP7 (NC)-RLP 6X, PP7 (NC)-RLP 2X, MS2 (IN)-RLP 12X, PP7
(IN)-RLP 6X et PP7 (IN)-RLP 2X.
L'invention concerne également des compositions comportant des particules
selon l'invention.
Plus particulièrement, les compositions selon l'invention sont des
compositions
concentrées. Avantageusement, les compositions sont également purifiées. Ces
compositions peuvent être concentrées et purifiées selon le procédé décrit
dans la
demande W02013/014537.
Typiquement, les compositions selon l'invention comportent moins de 30 % de
contaminants ADN et moins de 45% de contaminants protéiques par rapport au
surnageant brut. Plus particulièrement, les compositions selon l'invention
comportent
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moins de 30 % de contaminants ADN et moins de 2% de contaminants protéiques
par
rapport au surnageant brut.
Par surnageant brut , on vise le surnageant de culture(s) cellulaire(s),
comportant des particules rétrovirales selon l'invention, après clarification.
Une telle
étape de clarification est plus particulièrement décrite ci-après dans les
procédés de
fabrication des particules selon l'invention. Lorsque la récupération du
surnageant est
effectué en plusieurs fois, le surnageant brut correspond alors à l'ensemble
des
surnageants collectés, réunis (ou poolés ) puis clarifié.
Optionnellement, les compositions selon l'invention comportent moins de 1 %
de contaminants ADN et moins de 1% de contaminants protéiques par rapport au
surnageant brut.
L'invention se rapporte aussi à des kits de production de particules selon
l'invention et aux procédés de fabrication de ces kits.
Plus particulièrement, l'invention concerne un kit de production de particules
selon l'invention, comportant :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt,
pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une
séquence d'encapsidation,
(ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la
polyprotéine Gag et/ou une intégrase, chimérique, comportant un
domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence
d'encapsidation, et,
(iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
Un tel kit peut également comporter une notice d'utilisation des plasmides
contenus dans le kit.
Plus spécifiquement, lorsque le kit vise à produire des particules selon le
premier mode de réalisation, ce kit comporte :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'ARN
non virales différentes, chaque séquence d'ARN comportant une
séquence d'intérêt pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence
d'intérêt est insérée une séquence d'encapsidation, ou alternativement
un premier et un second plasmide d'expression comportant chacun une
séquence d'intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une
séquence d'encapsidation,
(ii) un plasmide
d'encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside
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chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître
la séquence d'encapsidation, et,
(iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
Les au moins deux séquences d'ARN non virales sont différentes parce que les
séquences d'intérêt sont différentes et/ou les séquences d'encapsidation sont
différentes.
Un plasmide étant une structure d'ADN, il est bien entendu que par plasmide
d'expression comportant au moins deux séquences d'ARN non virales , on vise
un
plasmide d'expression codant pour au moins deux séquences d'ARN non virales.
En effet, les plasmides d'expression des kits contiennent toutes les séquences
d'ADN nécessaires à l'obtention d'au moins un ARN non viral par transcription.
Le
plasmide d'expression contient au moins un promoteur, suivi d'une séquence ADN
d'intérêt (ADNc ou ADN qui sera transcrit en un ARN non viral) et une séquence
d'encapsidation (un ADN codant par exemple pour des motifs répétés MS2 ou PP7)
et
optionnellement une séquence stabilisatrice de l'ARN.
Préférentiellement, le kit produisant des particules selon le premier mode de
réalisation comporte :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences
d'intérêt, pour lesquelles en amont ou en aval de chacune de ces
séquences est insérée une séquence d'encapsidation, ou
alternativement un premier et un second plasmide d'expression
comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de
laquelle est insérée une séquence d'encapsidation,
les séquences d'intérêt étant différentes et les séquences d'encapsidation
étant
identiques,
(ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside
chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître
la séquence d'encapsidation, et,
(iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
Avantageusement, le kit produit des particules lentivirales.
Préférentiellement :
- Dans le plasmide d'expression, la séquence d'encapsidation comporte de 2
à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de MS2, préférentiellement de
6 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement
encore de 10 à 14, par exemple 12 répétitions. Avantageusement, la
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WO 2017/194903 28 PCT/FR2017/051165
séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag
(SEQ ID N 1).
- Dans le plasmide d'encapsidation, la protéine de nucléocapside est la
protéine de nucléocapside (NC) de HIV appartenant à la polyprotéine Gag,
laquelle NC est mutée au niveau du second doigt de zinc afin d'insérer la
séquence de la protéine Coat du bactériophage MS2.
- Dans le plasmide d'enveloppe, la protéine d'enveloppe est la protéine
VSV-
G codant pour la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire.
Ou, préférentiellement :
- Dans le plasmide d'expression, la séquence d'encapsidation comporte de 2
à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de PP7, préférentiellement, de 2
à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore
de 2 à 12, par exemple 6 répétitions. Avantageusement, la séquence tige-
boucle est la suivante : ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID
N 2) et/ou la séquence tige-boucle SEQ ID N 2 en alternance avec la
séquence tige-boucle SEQ ID N 3.
- Dans le plasmide d'encapsidation, la protéine de nucléocapside est la
protéine de nucléocapside (NC) de HIV appartenant à la polyprotéine Gag,
laquelle NC est mutée au niveau du second doigt de zinc afin d'insérer la
séquence de la protéine Coat du phage PP7.
-
Dans le plasmide d'enveloppe, la protéine d'enveloppe est la protéine VSV-
G codant pour la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire.
Optionnellement, le kit comporte un second plasmide d'encapsidation codant
pour une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de
reconnaître une séquence d'encapsidation. Le second domaine de liaison peut
être
identique ou différent du domaine de liaison de la protéine de nucléocapside
chimérique.
A titre d'exemple de domaines de liaison différents :
- le domaine de liaison introduit dans la nucléocapside peut être la protéine
Coat de MS2 et le domaine de liaison introduit dans l'intégrase peut être la
protéine Coat de PP7, ou
- le domaine de liaison introduit dans la nucléocapside peut être la protéine
Coat de PP7 et le domaine de liaison introduit dans l'intégrase peut être la
protéine Coat de MS2.
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WO 2017/194903 29 PCT/FR2017/051165
Plusieurs domaines de liaison peuvent être introduits dans chacune des
protéines chimériques.
Alternativement, lorsque le kit vise à produire des particules selon le second
mode de réalisation, ce kit comporte :
(i) un plasmide
d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt,
pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une
séquence d'encapsidation,
(ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une intégrase chimérique
comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la
séquence d'encapsidation, et,
(iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
Avantageusement, les kits de production selon l'invention, peuvent comporter
en outre un second plasmide d'encapsidation codant pour :
- une protéine issue de la polyprotéine Gag sauvage, lorsque le premier
plasmide d'encapsidation code pour une protéine issue de la polyprotéine Gag
chimérique, et/ou
- une intégrase sauvage, lorsque le premier plasmide d'encapsidation code
pour une intégrase chimérique.
Des procédés de fabrication des kits selon l'invention sont également
proposés.
Typiquement, un procédé de fabrication d'un kit selon l'invention comporte :
(i) la préparation d'un plasmide d'expression comportant au moins une
séquence d'intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette
séquence est insérée une séquence d'encapsidation
(ii) la préparation d'un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine
issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase, chimérique,
comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une
séquence d'encapsidation, et
(iii) la préparation d'un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine
d'enveloppe.
Plus spécifiquement, lorsque le procédé concerne un kit qui vise à produire
des
particules selon le premier mode de réalisation, il comporte :
(i) la préparation d'un plasmide d'expression comportant au moins deux
séquences d'ARN non virales différentes, chaque séquence d'ARN
comportant une séquence d'intérêt pour laquelle en amont ou en aval de
cette séquence d'intérêt est insérée une séquence d'encapsidation, ou
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WO 2017/194903 30 PCT/FR2017/051165
alternativement un premier et un second plasmide d'expression
comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de
laquelle est insérée une séquence d'encapsidation,
(ii) la préparation d'un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine
de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison
permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et,
(iii) la préparation d'un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine
d'enveloppe.
Les au moins deux séquences d'ARN non virales sont différentes parce que les
séquences d'intérêt sont différentes et/ou les séquences d'encapsidation sont
différentes.
Préférentiellement, ce procédé comporte :
(i) la préparation d'un plasmide d'expression comportant au moins deux
séquences d'intérêt, pour lesquelles en amont ou en aval de chacune de
ces séquences est insérée une séquence d'encapsidation, ou
alternativement d'un premier et d'un second plasmide d'expression
comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de
laquelle est insérée une séquence d'encapsidation,
les séquences d'intérêt étant différentes et les séquences d'encapsidation
étant
identiques,
(ii) la préparation d'un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine
de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison
permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et
(iii) la préparation d'un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine
d'enveloppe.
Alternativement, lorsque le procédé concerne un kit qui vise à produire des
particules selon le second mode de réalisation, ce procédé comporte :
(i) la préparation d'un plasmide d'expression comportant au moins une
séquence d'intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette
séquence est insérée une séquence d'encapsidation,
(ii) la préparation d'un plasmide d'encapsidation codant pour une intégrase
chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître
la séquence d'encapsidation, et,
(iii) la préparation d'un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine
d'enveloppe.
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WO 2017/194903 31 PCT/FR2017/051165
L'invention se rapporte également à des procédés de fabrication des particules
selon l'invention.
Un tel procédé comporte une étape de co-transfection de cellules avec :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt,
pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une
séquence d'encapsidation,
(ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la
polyprotéine Gag et/ou une intégrase chimérique comportant un
domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence
d'encapsidation, et,
(iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les
particules.
Les cellules mises en oeuvre dans les procédés de fabrication de particules
selon l'invention sont des cellules productrices, c'est-à-dire des cellules,
qui une fois
transfectées avec les plasmides portant le matériel génétique nécessaire à la
formation
des particules rétrovirales, permettent la formation desdites particules. A
titre
d'exemple de cellules productrices, on peut citer HEK293T.
Par étape de co-transfection , on entend une étape de transfection lors de
laquelle la transfection est effectuée par mise en contact des cellules
productrices avec
l'ensemble des plasmides du procédé de fabrication des particules.
Plus spécifiquement, lorsque le procédé de fabrication vise à produire des
particules selon le premier mode de réalisation, il comporte une étape de co-
transfection de cellules avec :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'ARN
non virales différentes, chaque séquence d'ARN comportant une
séquence d'intérêt pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence
d'intérêt est insérée une séquence d'encapsidation, ou alternativement
un premier et un second plasmide d'expression comportant chacun une
séquence d'intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une
séquence d'encapsidation,
(ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside
chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître
la séquence d'encapsidation, et,
(iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe,
et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les
particules.
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Les au moins deux séquences d'ARN non virales sont différentes parce que les
séquences d'intérêt sont différentes et/ou les séquences d'encapsidation sont
différentes.
Préférentiellement, ce procédé de fabrication de particules comporte une étape
de co-transfection de cellules avec :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences
d'intérêt, pour lesquelles en amont ou en aval de chacune de ces
séquences est insérée une séquence d'encapsidation, ou
alternativement un premier et un second plasmide d'expression
comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de
laquelle est insérée une séquence d'encapsidation,
les séquences d'intérêt étant différentes et les séquences d'encapsidation
étant
identiques,
(ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside
chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître
la séquence d'encapsidation, et,
(iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe,
et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les
particules.
Alternativement, lorsque le procédé de fabrication vise à produire des
particules
selon le second mode de réalisation, ce procédé comporte une étape de co-
transfection de cellules avec :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence
d'intérêt,
pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une
séquence d'encapsidation,
(ii) un plasmide
d'encapsidation codant pour une intégrase chimérique
comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la
séquence d'encapsidation, et,
(iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe,
et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les
particules.
Préférentiellement, tous les procédés de fabrication de particules selon
l'invention sont réalisés conformément aux procédés décrits dans la demande
W02013/014537.
Plus particulièrement, ces procédés de fabrication de particules sont réalisés
sur des cellules productrices cultivées en milieu sans sérum et aucune
induction au
sodium butyrate n'est effectuée.
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Avantageusement, le surnageant est collecté en plusieurs fois, par exemple
entre 3 et 6 fois, à des intervalles de temps spécifiques, tels qu'à des
intervalles de
temps de l'ordre de la demi vie des particules rétrovirales. Typiquement, la
récupération du surnageant est effectuée en 4 à 5 fois, à des intervalles de
temps de
l'ordre de 6 à 18h, préférentiellement de 8 à 16h, tels que 8h, 12h et/ou 16h.
Préférentiellement, cette collecte est effectuée après changement du milieu de
culture
des cellules, ce changement étant effectué préférentiellement à 24h post-
transfection.
Les procédés de fabrication de particules selon l'invention comportent
également une étape dans laquelle le surnageant est clarifié.
Préférentiellement, la clarification du surnageant est effectuée par
centrifugation.
Plus préférentiellement encore, ces procédés de fabrication de particules
selon
l'invention comportent en outre une étape dans laquelle le surnageant est
concentré
et/ou purifié.
De préférence, la concentration et purification est effectuée par
ultrafiltration
frontale sur des unités de centrifugation.
Avantageusement, le surnageant subit une ou plusieurs étapes
supplémentaires de purification. Ces étapes de purification sont effectuées de
préférence par ultrafiltration tangentielle et/ou diafiltration. Plus
préférentiellement
encore, le surnageant subit une étape d'ultrafiltration tangentielle suivie
d'une étape de
diafiltration.
L'ultrafiltration tangentielle est avantageusement effectuée sur des
cartouches
de fibres creuses en polysulfone.
Optionnellement, la composition peut ensuite subir une étape de
chromatographie par échange d'ions, en particulier une chromatographie par
échange
d'anions. L'éluât issu de cette étape de chromatographie est ensuite récupéré
puis
concentré à nouveau par ultrafiltration frontale sur des unités centrales de
centrifugation. Une composition résultant d'un tel procédé comporte moins de 1
% de
contaminants ADN et moins de 1% de contaminants protéiques par rapport au
surnageant brut.
Dans le procédé de fabrication selon l'invention, l'étape de co-transfection
peut
en outre être réalisée avec un second plasmide d'encapsidation codant pour :
- une protéine issue de la polyprotéine Gag sauvage, lorsque le premier
plasmide d'encapsidation code pour une protéine issue de la polyprotéine Gag
chimérique, et/ou
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- une intégrase sauvage, lorsque le premier plasmide d'encapsidation code
pour une intégrase chimérique.
Avantageusement, le ratio du second plasmide d'encapsidation sur le premier
plasmide d'encapsidation est dans la gamme allant de [10 :90] à [60 :40],
préférentiellement, dans la gamme allant de [20 :80] à [50 :50].
Des avantages liés à l'utilisation d'un second plasmide d'encapsidation et
plus
particulièrement aux ratios définis ci-avant sont plus amplement décrits à
l'Exemple 8.
L'invention concerne également des compositions susceptibles d'être obtenues
par l'un quelconque des procédés de fabrication de particules selon
l'invention.
Typiquement, ces compositions comportent moins de 30 % de contaminants
ADN et moins de 45% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut.
Plus particulièrement, les compositions selon l'invention comportent moins de
30 % de
contaminants ADN et moins de 2% de contaminants protéiques par rapport au
surnageant brut.
Optionnellement, les compositions selon l'invention comportent moins de 1 %
de contaminants ADN et moins de 1% de contaminants protéiques par rapport au
surnageant brut.
Enfin, l'invention concerne l'utilisation d'une particule selon l'invention,
ou d'une
composition selon l'invention pour transduire des cellules, et notamment des
cellules
impliquées dans la réponse immune.
L'utilisation des particules et des compositions selon l'invention est
particulièrement avantageuse pour transduire des cellules primaires et des
lignées
immortalisées, afin de les modifier de façon transitoire. Les cellules peuvent
être des
cellules de mammifères ou d'autres eucaryotes. En particulier, la transduction
de ces
cellules peut être effectuée in vivo, in vitro ou ex vivo.
Les cellules impliquées dans la réponse immune sont notamment les cellules
présentatrices d'antigène (CPA) et les cellules du système immunitaire. Plus
particulièrement il s'agit des monocytes (les cellules dendritiques, les
macrophages),
les lymphocytes T ou B, les Natural Killers et les cellules souches
hématopoïétiques.
Ces particules ou compositions peuvent être qualifiés de vaccins et ont
pour but d'induire des cellules T effectrices spécifiques de cancer ou de
virus pour
diminuer la taille de tumeurs ou éradiquer un développement viral et aussi
pour induire
des cellules T mémoires qui pourront éviter la perte de contrôle sur la tumeur
ou le
virus.
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WO 2017/194903 35 PCT/FR2017/051165
Introduire des acides nucléiques multiples et hétérogènes dans une cellule
cible
est en enjeu majeur en recherche & développement comme en thérapie pour des
applications in vitro, ex vivo et in vivo.
L'invention sera mieux comprise au vu des exemples qui suivent donnés à titre
illustratif, avec référence aux Figures, qui représentent respectivement :
- La Figure I est un schéma de constructions de la cassette d'expression
issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt,
un rapporteur fluorescent, ce plasmide d'expression étant utilisé pour la
production de particules lentivirales MS2RLP selon l'invention ;
- La Figure II présente un schéma de construction de la cassette
d'expression issue du plasmide d'encapsidation lentiviral p8.74 dans lequel
un domaine de liaison MS2 Coat a été introduit dans la séquence de
nucléocapside, ce plasmide d'encapsidation étant utilisé pour la production
de particules lentivirales MS2RLP selon l'invention ;
- La Figure III est un schéma de construction de la cassette d'expression
issue du plasmide d'enveloppe ;
- La Figure IV présente trois schémas de construction de la cassette
d'expression issue du plasmide d'expression lentiviral intégratif portant
comme séquence d'intérêt la luciférase (IVa), un gène fluorescent (IVb) ou
Cre (IVc) ;
- La Figure V est un schéma de construction de la cassette d'expression
issue du plasmide d'encapsidation p8.74 utilisé pour la production de
vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ;
- La Figure Vla est un diagramme illustrant l'efficacité de la
transduction de
lymphocytes humains avec une particule selon l'invention ;
- La Figure Vlb est un diagramme illustrant l'efficacité de la
transduction de
lymphocytes humains avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;
- La Figure Vila est un diagramme illustrant l'efficacité de la
transduction de
lymphocytes murins avec une particule selon l'invention ;
- La Figure Vllb est un diagramme illustrant l'efficacité de la
transduction de
lymphocytes murins avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;
- La Figure Villa est un diagramme illustrant l'efficacité de la
transduction de
cellules dendritiques humaines immatures avec une particule selon
l'invention ;
- La Figure VIllb est un diagramme illustrant l'efficacité de la
transduction de
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cellules dendritiques humaines immatures avec un vecteur lentiviral
intégratif (ILV) ;
- La Figure VIIIc illustre la cinétique d'expression de la ZsGreen
dans des
cellules dendritiques humaines immatures transduites avec une particule
selon l'invention ;
- La Figure VIlld illustre la cinétique d'expression de la ZsGreen
dans des
cellules dendritiques humaines immatures transduites avec un vecteur
lentiviral intégratif (ILV) ;
- La Figure Ville est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules
dendritiques humaines immatures transduites avec une particule selon
l'invention ;
- La Figure VIllf est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules
dendritiques humaines immatures transduites avec un vecteur lentiviral
intégratif (ILV) ;
- La Figure IXa est un diagramme illustrant l'efficacité de la transduction
de
cellules dendritiques humaines matures avec une particule selon
l'invention ;
- La Figure IXb est un diagramme illustrant l'efficacité de la
transduction de
cellules dendritiques humaines matures avec un vecteur lentiviral intégratif
(ILV) ;
- La Figure IXc est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules
dendritiques humaines matures transduites avec une particule selon
l'invention ;
- La Figure IXd est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules
dendritiques humaines matures transduites avec un vecteur lentiviral
intégratif (ILV) ;
- La Figure Xa est un diagramme illustrant l'efficacité de la
transduction de
cellules dendritiques issues de la moelle osseuse de souris (BMDC) avec
une particule selon l'invention ;
- La Figure Xb est un diagramme illustrant l'efficacité de la transduction
de
cellules BMDC avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;
- La Figure Xc illustre la cinétique d'expression de la ZsGreen dans des
cellules BMDC transduites avec une particule selon l'invention ;
- La Figure Xd illustre la cinétique d'expression de la ZsGreen dans des
cellules BMDC transduites avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;
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WO 2017/194903 37 PCT/FR2017/051165
- La Figure Xe est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules
BMDC transduites avec une particule selon l'invention ;
- La Figure Xf est un diagramme illustrant le phénotypage des
cellules BMDC
transduites avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;
- La Figure Xla est un schéma de construction de la cassette d'expression
issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt,
une séquence antigénique complète codant pour l'antigène MAGE A3, ce
plasmide d'expression étant utilisé pour la production de particules
lentivirales MS2RLP selon l'invention ;
- La Figure Xlb est un schéma de construction de la cassette d'expression
issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt,
une séquence antigénique partielle codant pour l'antigène MAGE A3 (PS-
MageA3 ou PS-MAGEA3), ce plasmide d'expression étant utilisé pour la
production de particules lentivirales MS2RLP selon l'invention ;
- La Figure Xlc est un schéma de construction de la cassette d'expression
issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt,
une séquence antigénique partielle codant pour l'antigène gp100 (PS-gp100
ou PS-GP100), ce plasmide d'expression étant utilisé pour la production de
particules lentivirales MS2RLP selon l'invention ;
- La Figure Xld est un schéma de construction de la cassette d'expression
issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt,
une séquence antigénique partielle codant pour la tyrosinase (PS-Tyr ou
PS-TYR), ce plasmide d'expression étant utilisé pour la production de
particules lentivirales MS2RLP selon l'invention ;
- La Figure Xlla est un schéma de construction de la cassette d'expression
issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt,
une séquence antigénique complète codant pour l'antigène MAGE A3, ce
plasmide d'expression étant utilisé pour la production de vecteurs lentiviraux
intégratifs (ILV) ;
- La Figure Xllb est un schéma de construction de plasmide d'expression
portant comme séquence d'ARN d'intérêt, une séquence antigénique
partielle codant pour l'antigène MAGE A3 (PS-MageA3 ou PS-MAGEA3),
ce plasmide d'expression étant utilisé pour la production de vecteurs
lentiviraux intégratifs (ILV) ;
- La Figure XlIc est un schéma de construction de la cassette d'expression
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issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt,
une séquence antigénique partielle codant pour l'antigène gp100 (PS-gp100
ou PS-GP100), ce plasmide d'expression étant utilisé pour la production de
vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ;
- La Figure
XIld est un schéma de construction de la cassette d'expression
issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt,
une séquence antigénique partielle codant pour la tyrosinase (PS-Tyr ou
PS-TYR), ce plasmide d'expression étant utilisé pour la production de
vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ;
- La Figure XIlla est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules
BMDC transduites avec une particule selon l'invention comportant des ARN
codant pour l'antigène MAGE A3 ;
- La Figure XIllb est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules
BMDC transduites avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) comportant un
ARN codant pour l'antigène MAGE A3;
- La Figure XIV est un diagramme illustrant le suivi de la croissance
tumorale
induite par des cellules Renca exprimant MAGE A3 chez la souris ;
- La Figure XV présente le schéma de la cassette d'expression issue du
plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt la
Luciférase utilisé pour la production de particules lentivirales PP7RLP,
comprenant le motif tige-boucle PP7 répété 2 fois, selon l'invention ;
- La Figure XVI présente un schéma de la modification du plasmide
d'encapsidation lentiviral p8.74 afin d'insérer un domaine de liaison dans la
séquence de l'Intégrase ;
- La Figure XVII présente un schéma de la cassette d'expression issue du
plasmide d'encapsidation utilisé pour la production de particules lentivirales
PP7 (IN)-RLP selon l'invention, obtenu par la modification du plasmide
d'encapsidation lentiviral p8.74 présenté Figure XVI ;
- La Figure XVIII présente les profils d'expression du marqueur CD8 murin et
du CFSE sur les cellules issues de rates de souris BABL/c, sauvages ou
ayant développé une tumeur, après tri magnétique sur l'expression de CD8
puis marquage CFSE;
- La Figure XIX présente les profils d'expression du marqueur CD8 murin et
du CFSE obtenus avec des cellules CD8+ marquées au CFSE et cultivées
seules pendant 5 jours (contrôle, en bas), ainsi que ceux obtenus avec des
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WO 2017/194903 39 PCT/FR2017/051165
cellules CD8+ issues de rates de souris BABUc sauvages (en haut) ou
ayant développé une tumeur (au milieu), marquées au CFSE, puis co-
cultivées pendant 5 jours avec des BMDC non transduites (à gauche) ou
transduites (à droite) avec les particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr ; les
résultats sont exprimés en pourcentage de cellules ayant proliféré ;
- La Figure XX est un diagramme illustrant la réponse proliférative relative
des cellules CD8+ marquées au CFSE et co-cultivées avec les BMDC non
transduites ou transduites avec les particules RLP-PS-MAGEA3
/Gp100/Tyr ; les résultats de co-cultures au ratio 1 DC :2T et 1 DC :4T sont
montrés ; les résultats sont donnés par le ratio du pourcentage de cellules
proliférant en réponse au contact avec les BMDC transduites avec les
particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr sur le pourcentage des cellules
répondant de façon non spécifique face aux BMDC non transduites. (n=3
expériences) ;
- La Figure XXI est un diagramme illustrant les résultats d'une expérience de
comparaison des réponses prolifératives relatives de cellules CD8+ co-
cultivées au ratio 1 DC :2T avec des BMDC transduites par des particules
RLP.MAGE A3.IRES.GFP ou bien transduites par les particules RLP-PS-
MAGEA3/Gp100/Tyr ;
- La Figure
XXII est un diagramme illustrant la viabilité cellulaire et la dose-
réponse d'expression de la ZsGreen1 de BMDC transduites avec
RLP.ZsGreen1 ;
- La Figure XXIII le shéma de la cassette d'expression issue d'un
plasmide
d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt un rapporteur
fluorescent, utilisé pour la production de particules lentivirales PP7 (NC)-
RLP et PP7 (IN)-RLP selon l'invention ;
- La Figure XXIV est un diagramme illustrant la viabilité cellulaire et
la
cinétique d'expression de la ZsGreen1 de BMDC transduites avec PP7 (IN)-
RLP.ZsGreen1 à une dose de 1 pg p24/cellule ;
- La Figure XXV est un diagramme illustrant la mise en évidence du transfert
d'ARN codant pour MAGEA3 dans des cellules U937 transduites avec le
RLP MAGEA3, à 5h post-transduction et à 20h post-transduction ;
- La Figure XXVI est un diagramme illustrant la mise en évidence du
transfert
d'ARN codant pour les 3 AATs (PS-MAGEA3, PS-GP100, PS-TYR), dans
des cellules U937 transduites avec le RLP AATs (Antigène Associés à une
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WO 2017/194903 40 PCT/FR2017/051165
Tumeur ou antigène tumoral) (PS-MAGEA3, PS-GP100, PS-TYR), à 5h
post-transduction ;
- La Figure XXVII est un diagramme illustrant la mise en évidence du
transfert d'ARN codant pour les 3 AATs (PS-MAGEA3, PS-GP100, PS-
TYR), dans des cellules U937 transduites avec le RLP AATs (PS-MAGEA3,
PS-GP100, PS-TYR), à 20h post-transduction ;
- La Figure XXVIII est un diagramme illustrant la mise en évidence du
transfert d'ARN codant pour MAGEA3 dans des cellules hDC transduites
avec le RLP MAGEA3, à 5h post-transduction et à 20h post-transduction ;
- La Figure XXIX est un diagramme illustrant la mise en évidence du transfert
d'ARN codant pour les 3 AATs (PS-MAGEA3, PS-GP100, PS-TYR), dans
des cellules hDC transduites avec le RLP AATs (PS-MAGEA3, PS-GP100,
PS-TYR), à 5h post-transduction ;
- La Figure XXX est un diagramme illustrant la mise en évidence du
transfert
d'ARN codant pour les 3 AATs (PS-MAGEA3, PS-GP100, PS-TYR), dans
des cellules hDC transduites avec le RLP AATs (PS-MAGEA3, PS-GP100,
PS-TYR), à 20h post-transduction ;
- La Figure XXXI présente le schéma de la cassette d'expression issue du
plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt la protéine
immunomodulatrice IL12, formée par les deux sous-unités IL12b (p40) et
IL12a (p35), utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP
selon l'invention ;
- La Figure XXXII est un diagramme illustrant la mise en évidence du
transfert d'ARN codant pour MAGEA3 et IL12 dans des cellules U937
transduites avec le RLP-IL-12/PSMAGEA3, à 5h post-transduction ;
- La figure XXXIII est un diagramme illustrant la mise en évidence
du transfert
d'ARN codant pour MAGEA3 et IL12 dans des cellules U937 transduites
avec le RLP-IL-12/PSMAGEA3, à 20h post-transduction ;
- La Figure XXXIV est un diagramme illustrant la mise en évidence du
transfert d'ARN codant pour MAGEA3 et IL12 dans des cellules hDC
transduites avec le RLP-IL-12/PSMAGEA3, à 5h post-transduction ;
- La Figure XXXV est un diagramme illustrant la mise en évidence du
transfert d'ARN codant pour MAGEA3 et IL12 dans des cellules hDC
transduites avec le RLP-IL-12/PSMAGEA3, à 20h post-transduction ;
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- La
Figure XXXVI est un diagramme illustrant la quantification de la protéine
immunomodulatrice 1L12, sécrétée par les hDC transduites avec le RLP-
IL12/MAGEA3 (48h post-transduction) ;
- La Figure XXXVII présente un schéma de construction de la cassette
d'expression issue du plasmide d'encapsidation lentiviral p8.74 dans lequel
un domaine de liaison PP7 Coat a été introduit dans la séquence de
nucléocapside, ce plasmide d'encapsidation étant utilisé pour la production
de particules lentivirales PP7RLP selon l'invention ;
- La
Figure XXXVIII est un diagramme illustrant la viabilité cellulaire et la
cinétique d'expression de la ZsGreen1 de BMDC transduites avec RLP-
PP7(NC).ZsGreen1 à une dose de 1 pg p24/cellule ;
- La Figure XXXIX est un diagramme illustrant l'effet du précurseur GAG-
POL sauvage pour la production de particules MS2RLP 12X sur le transfert
d'ARN dans des cellules Jurkat à une dose de 2 pg p24/cellule ;
- La Figure XXXX est un diagramme illustrant l'effet du précurseur GAG-POL
sauvage pour la production de particules MS2RLP 12X sur le transfert
d'ARN dans des cellules Jurkat à une dose de 10 pg p24/cellule ;
- La Figure XXXXI illustre l'analyse de la maturation des particules
virales
MS2RLP par Western blot anti-p24 au bout de 15 secondes (XXXXIb) et 1
minute (XXXXIa) ; et
- La Figure XXXXII est un diagramme illustrant l'efficacité des
particules
MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X pour le transfert d'ARN encapsidés par les
séquences d'encapsidation MS2 et PP7 dans des cellules HCT116.
Dans les exemples qui suivent, l'ensemble des tests de transduction sont
réalisés avec des vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ou avec des
particules
lentivirales porteuses d'ARN (RLP) porteurs de matériel génétique codant pour
une
protéine fluorescente. Les particules RLP étant non intégratives, le titre des
lots est
déterminé en particules physiques par millilitre (PP/ml) alors que pour les
vecteurs
lentiviraux intégratifs le titre est classiquement exprimé en unités de
transduction par
millilitre (TU/ml). Ainsi la multiplicité d'infection (MOI) avec les
particules RLP est
exprimée en PP ou pg de protéine p24 par cellule et la MOI avec les vecteurs
ILV est
exprimée en TU/ml. Les tests de transduction sont réalisés pour chaque type de
vecteurs en prenant soin de ne pas se placer dans des conditions saturantes et
de
privilégier des conditions permettant de visualiser un effet dose pour chaque
type de
particules. Il est important de rappeler que les deux types de produits RLP et
ILV sont
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produits sans sérum et de façon à minimiser la production de protéines
toxiques dans
le surnageant en privilégiant des récupérations séquentielles des virions. Une
fois
clarifiés les surnageants sont concentrés et purifiés par ultrafiltration
tangentielle de
façon à obtenir une grande pureté.
EXEMPLE 1 : Transduction de cellules du système immunitaire par la particule
virale selon l'invention et comparaison de l'efficacité de transduction avec
d'autres systèmes
I. Préparation de la particule virale selon l'invention et des systèmes
comparatifs
1. Constructions des plasmides
1.1 Plasmides pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon
l'invention
= Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide d'expression
est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt-polyA
avec ou
non une séquence intronique ou stabilisatrice d'ARN. Afin de véhiculer les
ARNm dans
les particules lentivirales, 12 répétitions du motif tige-boucle de l'ARN MS2
(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N 1) ont été insérées au sein d'une
cassette d'expression en aval du gène rapporteur. Le promoteur utilisé peut
être celui
du CMV ou EF1 mais d'autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence
d'intérêt
peut être un ADN codant une protéine reportrice comme la luciférase Firefly
native,
une protéine fluorescente verte (ZsGreen1), rouge (mCherry) ou bleue (mtBFP)
(dont
la cassette d'expression est telle que décrite en Figure l). La séquence
d'intérêt peut
être un ADNc codant une protéine, par exemple une protéine immunogène ou une
protéine immunomodulatrice. La séquence d'intérêt peut également être celle
d'un
ADNc, d'un shRNA, d'un miRNA, d'un sgRNA, d'un LncRNA ou d'un circRNA.
= Plasmide d'encapsidation : La particule lentivirale a été modifiée pour
contenir au sein de la protéine de nucléocapside, en lieu et place du second
domaine
en doigt de Zn, la séquence de la protéine Coat du bactériophage MS2. Le
plasmide d'encapsidation p8.74, porteur des gènes codant les protéines de
structures
et de fonction (Gag, Pol), utilisé pour la production des particules MS2RLP
est modifié
selon la stratégie suivante : ce plasmide p8.74 est utilisé pour générer, par
PCR
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d'assemblage, un plasmide dépourvu du second doigt de zinc de la protéine de
nucléocapside p8.74.82F. Le second doigt de zinc est substitué par la protéine
Coat du
phage MS2 par clonage Hpal, pour générer le plasmide p8.74.82F-MS2-Coat (dont
la
cassette d'expression est telle que décrite en Figure II). La séquence codant
Pol peut
être délétée ou mutée dans certains éléments de fonction comme par exemple la
séquence codant la transcriptase inverse (RT) ou l'intégrase (IN) sans altérer
la
fonction des MS2RLP.
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant
une protéine d'enveloppe, qui peut être par exemple la séquence du gène VSV-G
codant la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (dont la
cassette
d'expression est telle que décrite en Figure III).
1.2 Plasmides pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs ILV
= Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide d'expression
est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt. La
séquence du
gène d'intérêt peut être par exemple celle de la luciférase (Figure IVa), d'un
rapporteur
fluorescent (Figure IVb) ou de la CRE recombinase (Figure IVc). Ce plasmide
peut
contenir d'autres éléments comme la séquence native WPRE (Woodchuck Hepatitis
Virus Posttranscriptional Regulatory Element) ou encore la séquence cPPT/CTS.
La
pathogénicité virale est éliminée par la substitution de régions du génome
viral
requises pour la réplication rétrovirale par le transgène.
= Plasmide d'encapsidation : Le plasmide d'encapsidation p8.74, porteur des
gènes codant les protéines de structures et de fonction (Gag, Pol) est utilisé
pour la
production des vecteurs lentiviraux intégratifs (dont la cassette d'expression
est telle
que décrite en Figure V).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant
une protéine d'enveloppe, qui peut être par exemple la séquence du gène VSVG
codant la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (dont la
cassette
d'expression est telle que décrite en Figure III).
2. Productions des lots
Après la transfection des plasmides sur des cellules, les surnageants sont
récoltés et utilisés bruts ou concentrés/purifiés selon le procédé décrit dans
la
demande WO 2013/014537.
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WO 2017/194903 44 PCT/FR2017/051165
2.1 Production des vecteurs lentiviraux et particules lentivirales
Les productions sont réalisées en CelISTACK 10 étages (6360 cm2, Corning)
avec des cellules HEK293T (ATCC, CRL-11268), cultivées dans Dulbecco's
Modified
Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Paisley, UK) supplémenté par 1%
penicillin/streptomycin et 1% d'ultraglutamine (PAA) à 37 C en atmosphère
humide à
5% CO2 Pour l'expérience d'étude de l'impact du sérum, le DMEM est supplémenté
avec 10% de SVF. En particulier, aucune induction au sodium butyrate n'est
effectuée.
Pour chaque lot (MS2RLP et ILV), le mélange de transfection est composé des
trois
plasmides suivants :
- Un des plasmides d'expression décrit ci-avant, selon que l'on forme une
particule (MS2RLP) ou un vecteur ILV,
- p8.74AZF Coat (MS2RLP), p8.74 (ILV) et
- pENV portant l'enveloppe VSV-G.
Les proportions respectives des plasmides sont les suivantes: 40% du plasmide
d'expression, 30% du plasmide p8.74 (ou p8.74AZF), 30% du plasmide pENV.
24 heures après transfection standard au phosphate de calcium, le surnageant
de culture est remplacé par du milieu DMEM frais et non supplémenté. Les
cellules
sont incubées à 37 C / 5% 002. Après changement du milieu, le surnageant est
collecté quatre fois (32h, 48h, 56h et 72h post transfection). Chaque
récupération est
clarifiée par centrifugation 5min à 3000g avant d'être microfiltrée sur filtre
de 0,45pm
(Stericup, Millipore). Toutes les récupérations sont alors mélangées pour
composer le
surnageant brut.
2.2 Concentration et purification des vecteurs lentiviraux et particules
lentivirales
Les vecteurs et particules sont concentrés et purifiés selon l'une des deux
procédés ci-après :
= Le procédé P1 vise à réaliser une ultrafiltration frontale du surnageant
sur des unités centrales de centrifugation.
= Le procédé P2 vise à réaliser une ultrafiltration tangentielle puis une
diafiltration du surnageant. Le surnageant brut est concentré et purifié par
ultrafiltration
tangentielle via l'utilisation de cartouches de fibres creuses en polysulfone.
Le
surnageant est traité par diafiltration pour 20 diavolumes en mode continu
contre du
tampon DMEM ou TSSM. Après la diafiltration, le rétentat est récupéré puis
concentré
à nouveau par ultrafiltration frontale sur des unités centrales de
centrifugation.
La production/concentration/purification des lots pour cet Exemple est
réalisée
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WO 2017/194903 45 PCT/FR2017/051165
selon le procédé P2.
3. Titration
3.1 Titration des particules fonctionnelles par qPCR
Les cellules HCT116 (ATCC, COL-247) sont ensemencées en plaque 96 puits
dans 100 L de DMEM supplémenté de 10% SVF, 100 pg/mL Stretomycin, 100 U/mL
Penicillin et 2mM L-Gln puis incubées 24h à 37 C / 5% 002. Six dilutions
sériées sont
réalisées pour chaque vecteur ainsi que pour un étalon interne. Les cellules
sont
transduites par ces dilutions sériées en présence de Polybrene 81..tg/mL
(Sigma) puis
incubées trois jours à 37 C / 5% 002. Pour chaque série d'échantillons, un
puits de
cellules non transduites est rajouté en contrôle. Les cellules sont ensuite
trypsinées et
le titre (Unité de Transduction/mL) est déterminé par qPCR après extraction de
l'ADN
génomique en utilisant le Nucleospin tissue gDNA extraction kit (Macherey-
Nagel). Le
titre obtenu (TU/mL) par qPCR est normalisé par l'étalon interne dont le titre
a été
précédemment déterminé par FACS.
3.2 Quantification des particules physiques par test ELISA P24
La protéine de capside p24 est détectée directement sur le surnageant viral en
utilisant et en suivant les recommandations du kit HIV-1 p24 ELISA kit (Perkin
Elmer).
La protéine p24 capturée est complexée avec un anticorps polyclonal biotinylé,
puis
détectée par une streptavidine conjuguée à la péroxydase HRP. Le complexe
résultant
est détecté par spectrophotométrie après incubation avec le substrat ortho-
phenylenediamine-HCI (OPD) produisant une coloration jaune qui est directement
proportionnelle à la quantité de protéine p24 capturée. L'absorbance de chaque
puits
est quantifiée au lecteur de plaque Synergy H1 Hybrid (Biotek) et calibrée
contre
l'absorbance d'une gamme étalon de protéine p24. Le titre viral exprimé en
particules
physiques par mL est calculé à partir de la concentration de protéine p24
obtenue
sachant que lpg de protéine p24 correspond à 104 particules physiques.
Il. Transduction de cellules du système immunitaire
1. Cellules lymphocytaires
1.1 Préparation des cellules lymphocytaires humaines
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Les lymphocytes humains totaux sont préparés à partir de sang total humain
par isolation des cellules mononucléaires périphériques ou PBMC (Peripheral
Blood
Mononuclear Cells) sur gradient de Ficoll. Le prélèvement de sang est récupéré
à
température ambiante et dilué au 1/2 avec du PBS 1X pH 7,4 dans un tube
adéquat (15
ou 50 ml).
1 volume de solution de Ficoll (GE Healthcare) est déposé délicatement sous 2
volumes de sang dilué. Il est important d'obtenir 2 phases distinctes non
mixées : Une
phase inférieure correspondant au Ficoll et une phase supérieure correspondant
au
sang dilué. Le tube est centrifugé 30 minutes à 400g à température ambiante.
Le frein
de la centrifugeuse est arrêté pour éviter de perturber les différentes phases
obtenues
après centrifugation.
La phase supérieure correspond au plasma, la phase inférieure correspond au
Ficoll et un anneau s'est formé entre ces deux phases, qui contient la
population
d'intérêt (PBMC).
L'anneau de PBMC est pipeté délicatement et transféré dans un nouveau tube.
Les PBMC sont ensuite lavées 2 fois avec au moins 3 volumes de solution de PBS
1X
pH 7,4. Les cellules sont centrifugées 10 minutes à 100g à température
ambiante.
Une fois le surnageant retiré, les PBMC sont resuspendues dans un milieu de
culture RPMI, 10 % Serum de Veau Foetal, 2mM L-Glutamine, 1%
Pénicilline/Streptomycine et numérées.
Les cellules sont resuspendues à une concentration de 1.10e6 cellules par ml
et sont déposées sur un support de culture en plastique pendant 2h à 37 C / 5%
002.
Cette étape permet aux cellules monocytaires d'adhérer au plastique alors que
les
lymphocytes restent en suspension et peuvent donc être récupérés dans le
surnageant
des cultures avant d'être ensemencés à 1,56.10e5 cellules par cm2 en prévision
de la
transduction.
1.2 Préparation des cellules lymphocytaires murines
Les lymphocytes murins sont préparés à partir de rate. La rate d'une souris
est
récupérée après euthanasie de l'animal par dislocation cervicale. La rate est
déposée
dans un puits d'une plaque de culture 6 puits et gonflée par injection de 1 ml
de
solution de collagénase D (Roche diagnostics) à 2mg/m1 avec une seringue
montée
d'une aiguille 26G 1/2. La rate est émincée en petits morceaux dans le puits
avec un
scalpel stérile dans 1 ml de solution de collagénase D à 2 mg/ml. Les 2 ml de
solution
contenant les éminçâts de rate sont transférés dans un tube de 15 ml et
incubés 30
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WO 2017/194903 47 PCT/FR2017/051165
minutes dans un bain-marie à +37 C. La digestion enzymatique est stoppée par
ajout
de 13 ml de Tampon MACS froid (PBS 1X pH 7.4, 0,5% SVF, 2mM EDTA) pour un
volume final de 15 ml. La suspension cellulaire est filtrée sur un tamis
cellulaire de 70
pm posé sur un tube de 50 ml. Le volume est complété à 30 ml avec du tampon
MACS
froid. La suspension cellulaire est centrifugée 10 minutes à 300g, à +4 C.
Un tri positif sur l'expression du marqueur CD8 est ensuite réalisé. Pour
cela, le
surnageant est éliminé par aspiration et le culot cellulaire est repris dans
90 pl de
tampon MACS froid et 10 pl de billes anti-CD8 (Miltenyi Biotec) pour 10e7
cellules. Le
mélange est incubé 15 minutes à +4 C. A la fin de l'incubation, un volume de
tampon
MACS qsp 15 ml est rajouté à la suspension. La suspension est centrifugée 10
minutes à 300 g, à +4 C. Le surnageant est éliminé et le culot cellulaire est
repris dans
l'équivalent de 500 pl de tampon MACS froid pour 10e8 cellules. La suspension
est
déposée sur une colonne de type MS (Miltenyi Biotec) adaptée sur un aimant et
préalablement équilibrée avec du tampon MACS froid. La colonne est lavée avec
3 x
5000 de tampon MACS froid. La fraction négative (environ 2 ml) est complétée à
5 ml
avec du tampon MACS froid puis on réalise une numération cellulaire. La
suspension
cellulaire est centrifugée 10 minutes à 300g, à +4 C et les cellules
resuspendues dans
une plaque 6 puits type TCT (Corning) à raison de 1.10e6 cellules par ml en
milieu
RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Foetal, 1%
Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine pour être transduites.
Après tri, les différentes fractions obtenues sont analysées par cytométrie en
flux (Miltenyi Biotec) avec des marquages anticorps anti-CD8 pour contrôler la
pureté
des populations triées.
1.3 Transduction des lymphocytes (humains et murins)
Le jour de la transduction, les lymphocytes sont resuspendus à raison de
0,5x106
cellules par ml dans une plaque 96 puits à fond plat, traitée pour la culture
cellulaire,
dans un volume de 500 par puits. Un milieu de transduction contenant 4pg/m1
final de
Polybrene et les différents vecteurs aux MOI choisies (à savoir 10, 20 ou 30
pg p24
par cellule dans le cas du RLP et MOI 10, 20, 25 ou 50 dans le cas de l'ILV
pour les
lymphocytes T humains ; 0,1, 0,5, 1, ou 5 pg p24/cellule dans le cas du RLP et
MOI 5,
10, 25, 50 ou 75 dans le cas de l'ILV pour les lymphocytes T CD8+ murins) est
préparé
et ajouté aux cellules dans un volume de 50 pl, pour un volume final de 100 pl
par
puits. La plaque est ensuite centrifugée pendant 75 minutes, à 1000g, à 30 C.
Le
milieu de transduction est laissé sur les cellules pendant 4 h après l'étape
de
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WO 2017/194903 48 PCT/FR2017/051165
centrifugation, à 37 C, 5% 002. Après cette incubation, 80% du milieu de
transduction
(800) est retiré et 180111 de milieu RPMI, 10% Serum de Veau Foetal, 2mM L-
Glutamine, 1% Péniciline/Streptomycine est rajouté à chaque puits. Les
cellules sont
incubées à 37 C, 5% CO2 jusqu'à l'analyse.
2. Cellules dendritiques
2.1 Préparation des cellules dendritiques humaines
2.1.1 Isolation des cellules mononucléaires périphériques (PBMC) humaines à
partir de sang total humain
Les cellules dendritiques humaines sont préparées à partir de sang total
humain par isolation des PBMC sur gradient de Ficoll. Le prélèvement de sang
est
récupéré à température ambiante et dilué au 1/2 avec du PBS 1X pH 7,4 dans un
tube
adéquat (15 ou 50 ml).
1 volume de solution de Ficoll (GE Healthcare) est déposé délicatement sous 2
volumes de sang dilué. Il est important d'obtenir 2 phases distinctes non
mixées : Une
phase inférieure correspondant au Ficoll et une phase supérieure correspondant
au
sang dilué. Le tube est centrifugé 30 minutes à 400g à température ambiante.
Le frein
de la centrifugeuse est arrêté pour éviter de perturber les différentes phases
obtenues
après centrifugation.
La phase supérieure correspond au plasma, la phase inférieure correspond au
Ficoll, et un anneau s'est formé entre ces deux phases, qui contient la
population
d'intérêt (PBMC).
L'anneau de PBMC est pipeté délicatement et transféré dans un nouveau tube.
Les PBMC sont ensuite lavées 2 fois avec au moins 3 volumes de solution de PBS
1X
pH 7,4. Les cellules sont centrifugées 10 minutes à 100g à température
ambiante.
Une fois le surnageant retiré, les PBMC sont resuspendues dans un milieu de
culture SFM, 2mM L-Glutamine, 1% Pénicilline/Streptomycine et numérées.
Les cellules sont resuspendues à une concentration de 1.10e6 cellules par ml
(2,5.10e6 cellules par cm2) et sont déposés en plaque 48 puits type TCT
(Corning)
pendant 2h à 37 C / 5% 002. Cette étape permet aux cellules monocytaires
d'adhérer
au plastique alors que les lymphocytes restent en suspension. Après 2h
d'incubation la
plaque est lavée avec du PBS1X afin de ne garder que les monocytes en culture,
qui
vont être transduits.
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WO 2017/194903 49 PCT/FR2017/051165
2.1.2 Différenciation de la population des monocytes en cellules dendritiques
Les cellules dendritiques sont cultivées dans une plaque 48 puits type TCT
(Corning) à raison de 1.10e6 cellules par ml en milieu SFM supplémenté 1%
Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, 200 nM IL4 humain et 50 mM GM-CSF
humain. Ces conditions de culture permettent d'obtenir des cellules
dendritiques de
phénotype immature (iDC). Les cellules dendritiques sont laissées en culture
pendant
5 jours à 37 C / 5% CO2 avec un renouvellement du milieu de culture le
troisième jour.
Pour obtenir des cellules dendritiques matures (mDC), au troisième jour de
culture les cellules sont mises dans un milieu de maturation contenant 0,1
pg/m1 de
LPS.
2.2 Préparation des cellules dendritiques murines
Les cellules dendritiques (DC) murines sont préparées à partir de moelle
osseuse issue des membres inférieurs (culture de BMDC). Les os longs que sont
les
fémurs et les tibias sont récupérés à partir de souris adultes et transférés
dans un tube
de 50 ml contenant du milieu RPMI 1640 supplémenté 1%
Pénicilline/Streptomycine.
Les os sont vidés de leur moelle à l'aide d'une seringue portant une aiguille
26G 1/2 et
contenant du milieu RPMI 1640 supplémenté 1% Pénicilline/Streptomycine. La
suspension cellulaire est centrifugée 5 minutes 300 g, +4 C. Le surnageant est
éliminé
et le culot est repris dans 1 ml de milieu RPMI 1640 supplémenté 1%
Pénicilline/Streptomycine + 3 ml de solution de Gey's (155 mM NH4CI, 1 mM
KHCO3).
La suspension est incubée 5 minutes à température ambiante afin de lyser des
globules rouges contenus dans la suspension cellulaire. Après l'incubation, le
volume
est ajusté à 15 ml avec du milieu RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau
Foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine pour stopper la réaction
et la
suspension cellulaire est centrifugée 5 minutes 300 g, +4 C. Le surnageant est
éliminé
et le culot est repris dans un volume de milieu RPMI 1640 supplémenté à 10% de
Sérum de Veau Foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine. Cette
suspension cellulaire est filtrée sur un tamis cellulaire de 70 lm posé sur un
tube de 50
ml. Le tamis est rincé jusqu'à obtenir un volume final d'environ 30 ml. Les
cellules sont
comptées et la suspension cellulaire est centrifugée 5 minutes à 300 g. Le
surnageant
est éliminé et le culot est repris dans volume de milieu RPMI 1640 supplémenté
à 10%
de Sérum de Veau Foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, 50 M 2-
MercaptoEthanol, 25 ng/ml IL4 murine et 25 ng/ml GM-CSF murine, permettant
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d'obtenir une concentration cellulaire de 1.10e6 cellules par ml. Les cellules
dendritiques sont mises en culture dans une plaque 6 puits type ULA (Corning)
à
raison de 1.10e6 cellules par ml. Les cellules dendritiques sont laissées en
culture
pendant 5 jours à 37 C / 5% CO2 avec un renouvellement du milieu de culture
tous les
2-3 jours. Le troisième jour, les BMDC sont remises en culture dans une
nouvelle
plaque 6 puits ULA afin de les séparer des cellules de type macrophages qui
restent
adhérées à la plaque ayant servi à la mise en culture.
2.3 Transduction des cellules dendritiques humaines
Le jour correspondant à l'isolation des PBMC, les cellules sont transduites
par
le vecteur ILV.EF1.ZsGreen1 aux MOI choisies (1, 2 ou 4 pg p24 par cellule
dans le
cas du RLP et MOI 25, 50 ou 75 dans le cas de l'ILV) en milieu de culture SFM,
2mM
L-Glutamine, 1% Pénicilline/Streptomycine avec les agents de transfection
suivant :
Polybrene à 41..tg/mL (Sigma) et BX795 61.1M (lnvivogen) et incubées à +37 C
/ 5%
002. 4h après la transduction, le milieu de transduction est remplacé par le
milieu de
différenciation spécifique aux cellules dendritiques (SFM, 2mM L-Glutamine, 1%
Pénicilline/Streptomycine, 200 nM IL4 humaine et 50 mM GM-CSF humaine). Ce
milieu permet la culture des cellules dendritiques immatures (iDC). Les
cellules sont
transduites 4h post-ensemencement par les différents vecteurs (RLP ou ILV)
pour
établir une mise au point de transduction sur la cassette EF1.ZsGreen1.
Les cellules transduites sont analysées à différents temps (1, 2, 3 et 4 jours
post-transduction).
Pour obtenir des cellules dendritiques matures (mDC), les cellules sont mises
dans un milieu de maturation contenant 0,1 pg/m1 de LPS au troisième jour de
culture
et elles sont analysées au jour 4.
2.3.1 Transduction des cellules dendritiques humaines par RLP.ZsGreen1
Les cellules dendritiques transduites par le vecteur RLP.ZsGreen1 ont fait
l'objet d'une mise au point liée à la caractérisation de l'expression de la
fluorescence
analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules RLP
allant
de 1 pg p24 à 4 pg p24 par cellule et à différents temps d'analyse (1, 2, 3 et
4 jours
post-transduction pour les iDC et 4 jours post-transduction pour les mDC). Un
contrôle
négatif de transduction est préparé avec uniquement le milieu contenant les
agents de
transduction Polybrene à 41..tg/mL (Sigma) et BX795 61.1M (lnvivogen).
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des
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anticorps spécifiques anti-CD11c, anti-0D209 DC SIGN, anti-0D86 (Miltenyi
Biotec) et
caractérisées par cytométrie en flux.
2.3.2 Transduction des cellules dendritiques humaines par ILV.EF1.ZsGreen1
Les cellules dendritiques transduites par le vecteur ILV.EF1.ZsGreen1 ont fait
l'objet d'une mise au point liée à la caractérisation de l'expression de la
fluorescence
analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules
lentivirales
ILV allant d'une multiplicité de d'infection MOI de 25 à 75 et à différents
temps
d'analyse (1, 2, 3 et 4 jours post-transduction pour les iDC et 4è jour post-
transduction
.. pour les mDC). Un contrôle négatif de transduction est préparé avec le
milieu
contenant uniquement les agents de transduction Polybrene à 4pg/mL (Sigma) et
BX795 6pM (Invivogen).
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des
anticorps spécifiques anti-CD11c, anti-0D209 DC SIGN, anti-0D86 (Miltenyi
Biotec) et
caractérisées par cytométrie en flux.
2.4 Transduction des cellules dendritiques murines (BMDC)
6 jours après la mise en culture, les cellules dendritiques sont récupérées et
centrifugées 5 min à 300 g. Le surnageant est éliminé et les cellules sont
lavées dans
1 ml de RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Foetal, 1%
Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, et centrifugées 5 min à 300 g. Les
cellules dendritiques sont ensemencées à 0,5.10e6 cellules/mi en plaque 96
puits ou
24 puits en RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Foetal, 1%
Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, 50pM 2-MercaptoEthanol, 25 ng/ml
IL4
.. murine et 25 ng/ml GM-CSF murine. Les cellules sont transduites 24h post-
ensemencement par les différents vecteurs (RLP ou ILV) pour établir une mise
au point
de transduction grâce à l'expression de la fluorescence ZsGreen1. Les
transductions
se font en présence de Polybrene 4pg/mL (Sigma), suivi d'une spinoculation de
la
plaque à 1000 g pendant 75 minutes à +30 C. Le milieu de transduction est
ensuite
laissé pendant 4h à +37 C / 5% 002.
Après l'incubation 80% du milieu de transduction est éliminé par pipetage et
remplacé par un volume équivalent de RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de
Veau Foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, 50pM 2-
MercaptoEthanol, 25nM IL4 murine et 25 ng/ml GM-CSF murine préchauffé. Les
cellules sont ensuite remises à 37 C / 5% 002.
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2.4.1 Transduction des cellules dendritiques murines par RLP.ZsGreen1
Les cellules dendritiques transduites par le vecteur RLP.ZsGreen1 ont fait
l'objet d'une mise au point liée à la caractérisation de l'expression de la
fluorescence
analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules RLP
allant
de 0,1 pg p24 à 5 pg p24 par cellule et à différents temps d'analyse (1, 2, 3
et 4 jours
post-transduction). Un contrôle négatif de transduction est préparé avec
uniquement le
milieu contenant l'agent de transduction Polybrene à 4pg/mL (Sigma).
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des
anticorps spécifiques anti-CD11c, anti-0D86, anti-CD80 (Miltenyi Biotec) et
caractérisées par cytométrie en flux.
2.4.2 Transduction des cellules dendritiques murines par ILV.EF1.ZsGreen1
Les cellules dendritiques transduites par le vecteur ILV.EF1.ZsGreen1 ont fait
.. l'objet d'une mise au point liée à la caractérisation de l'expression de la
fluorescence
analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules
lentivirales
ILV allant d'une multiplicité de d'infection MOI de 5 à 75 et à différents
temps d'analyse
(1, 2, 3 et 4 jours post-transduction). Un contrôle négatif de transduction
est préparé
avec uniquement le milieu contenant l'agent de transduction Polybrene à
4pg/mL
(Sigma).
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des
anticorps spécifiques anti-CD11c, anti-0D86, anti-CD80 (Miltenyi Biotec) et
caractérisées par cytométrie en flux.
3. Phénotypage et caractérisation des cellules
3.1 Immunomarquaqe des cellules lymphocytaires
Après tri ou bien aux différents temps d'analyse après transduction les
lymphocytes sont récupérés des plaques de culture dans lesquels ils sont en
suspension et les cellules sont transférées dans les puits d'une plaque de
culture 96
puits à fond conique. Les cellules sont lavées avec une solution de PBS 1X pH
7.4, 5%
SVF et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par
retournement.
Les cellules lymphocytaires sont phénotypées par immunomarquage avec les
.. anticorps spécifiques suivants conjugués à des fluorochromes : anti-CD8,
anti-CD4,
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anti-CD3 ou anti-TCR (Miltenyi Biotec). Pour cela, des mélanges de solution
d'anticorps sont réalisés et 50 pl par puits sont déposés sur les cellules.
Les cellules
sont incubées 20 minutes à température ambiante dans le noir. 500 de PBS 1X pH
7.4, 5% SVF sont ajoutés et les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5
minutes.
Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans
1000 de
PBS 1X pH 7.4, 5% SVF. Les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5
minutes. Le
surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans 1000
de
PBS 1X pH 7.4, 5% SVF et analysées en cytométrie en flux.
3.2 Immunomarquaqe des cellules dendritiques humaines
A chaque temps d'analyse, les puits sont grattés avec un cône de pipette ou un
grattoir, selon le format de la plaque de culture, et les cellules sont
transférées dans les
puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique. Les cellules sont
lavées avec
une solution de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF et centrifugées à 300 g pendant 5
minutes. Le
surnageant est éliminé par retournement.
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec les
anticorps spécifiques suivants conjugués à des fluorochromes : anti-CD11c,
anti-
0D209 DC SIGN, anti-0D86 (Miltenyi Biotec). Pour cela, des mélanges de
solution
d'anticorps sont réalisés et 50 pl par puits sont déposés sur les cellules
dendritiques
récupérées. Les cellules sont incubées 20 minutes à température ambiante dans
le
noir. 500 de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF sont ajoutés et les cellules sont
centrifugées à
300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les
cellules
sont reprises dans 1000 de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF. Les cellules sont
centrifugées à
300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les
cellules
sont reprises dans 1000 de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF et analysées en cytométrie en
flux.
3.3 Immunomarquaqe des cellules dendritiques murines
A chaque temps d'analyse, les cellules sont transférées dans les puits d'une
plaque de culture 96 puits à fond conique. Les cellules sont lavées avec une
solution
de PBS 1X pH 7.4 et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est
éliminé par retournement.
L'analyse de la viabilité des cellules dendritiques est réalisée par
immunomarquage spécifique avec le marqueur de viabilité ViobilityTM 485/520
(Miltenyi Biotec). Pour cela, 1pl de ViobilityTM, en solution dans du DMSO,
est appliqué
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pour chaque puits de cellules, dans 100111 de PBS 1X pH7,4. Les cellules sont
incubées 20 minutes à température ambiante dans le noir. Les cellules sont
centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par
retournement.
Les cellules sont reprises dans 100111 de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF et à nouveau
centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par
retournement.
Les cellules sont reprises dans 100111 de PBS 1X pH 7,4, 5% SVF pour être
marquées
avec des anticorps spécifiques comme décrit ci-après pour phénotypage.
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec les
anticorps spécifiques suivants conjugués à des fluorochromes : anti-CD11c,
anti-0D86,
anti-CD80 (Miltenyi Biotec). Pour cela, des mélanges de solution d'anticorps
sont
réalisés et 50 I par puits sont déposés sur les cellules dendritiques
récupérées. Les
cellules sont incubées 20 minutes à température ambiante dans le noir. 50111
de PBS
lx pH 7,4, 5% SVF sont ajoutés et les cellules sont centrifugées à 300 g
pendant 5
minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont
reprises dans
100111 de PBS 1X pH 7,4, 5% SVF. Les cellules sont centrifugées à 300 g
pendant 5
minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont
reprises dans
100 I de PBS 1X pH 7,4, 5% SVF et analysées en cytométrie en flux.
3.4 Cytométrie en flux
Les cellules dendritiques immunomarquées sont analysées en cytométrie en
flux (Miltenyi Biotec) et analysées. Les échantillons ont été calibrés selon
leur taille
(SSC) et leur granulosité (FSC). Les cellules marquées au ViobilityTM sont
mortes ou
en train de mourir, les cellules viables sont donc les cellules négatives
(marquage par
exclusion). Les cellules sont caractérisées sur le MacsQuantVYB (Miltenyi
Biotec) et
analysées avec le logiciel MacsQuant (Miltenyi Biotec).
III. Résultats :
1.
Comparaison de l'efficacité de transduction de cellules immunitaires
par RLP et ILV
1.1 Lymphocytes T
La transduction de lymphocytes T par les particules RLP ou les vecteurs ILV
montre une efficacité plus importante chez l'Homme (Figures Vla et Vlb) que
chez la
souris (Figures Vila et VIlb). En effet, les lymphocytes T humains naïfs sont
transduits
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avec une efficacité de 70% avec RLP de façon comparable à ce qui est obtenu
avec
des vecteurs ILV. De même, nous obtenons plus de 90% de cellules positives
après
activation avec RLP comme avec ILV. En revanche les lymphocytes T murins
restent
plus difficiles à transduire avec un résultat allant de 20% pour RLP à 70%
avec ILV
dans les conditions de multiplicité d'infection testées. En augmentant la
multiplicité
d'infection (MOI), nous pourrions obtenir des efficacités plus fortes sur les
lymphocytes
T murins mais risquons d'induire une toxicité cellulaire.
1.2 Cellules dendritiques
Les premiers tests de transduction de cellules dendritiques (DC) ont été
réalisés sur des cellules humaines préparées à partir de sang périphérique
provenant
de donneurs humains sains.
La transduction de cellules dendritiques humaines (DC) immatures par les
particules lentivirales porteuses d'ARN (RLP) ou les vecteurs lentiviraux
intégratifs
.. (ILV) montre une efficacité comparable. Cette expression reste stable
jusqu'à 4 jours
post-transduction (Figure \Mb). La transduction des DC humaines par les
particules
RLP à une MOI de 4 pg p24/cellule (Figure Villa) conduit à 40% de cellules
positives.
Cette même efficacité de 40% est obtenue avec des vecteurs ILV à MOI 75
(Figure
VII1b). Du fait de l'intégration, l'expression résultant de la transduction
par les vecteurs
ILV reste stable au cours du temps (Figure VII1d). L'analyse de 4 bio-
marqueurs
caractéristiques des DC humaines sur les DC transduites montre que
l'expression de
ces bio marqueurs n'est pas significativement modifiée par la transduction par
les
particules RLP (Figure Ville) démontrant que la transduction ne modifie pas le
phénotype des cellules cibles. Le même résultat est obtenu avec les vecteurs
lentiviraux intégratifs avec seulement une légère hausse du marqueur CD209
(Figure
VIllf). Ces résultats indiquent que la transduction par des vecteurs ILV et
particules
RLP ne vient pas perturber le phénotype immature des DC immatures et ne les
engagent pas dans un processus ou une voie d'activation ou de différenciation.
En parallèle des tests de transductions ont été menés sur des cellules
dendritiques maturées par l'ajout de LPS dans les cultures. Les résultats
montrent une
efficacité de transduction des DC matures de 30% avec les particules RLPs à
une MOI
de 4 pg p24/cellule (Figure IXa) et de 50% avec les vecteurs ILVs à une MOI de
75
(Figure IXb). Comme précédemment, les transductions par les particules RLPs
(Figure
IXc) et par les vecteurs ILVs (Figure IXd) ne perturbent pas significativement
l'expression des biomarqueurs caractéristiques des cellules dendritiques.
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Les mêmes tests de transductions ont été réalisés sur des cellules
dendritiques
issues de la moelle osseuse de souris (BMDC). Les résultats obtenus montrent
une
transduction des BMDCs par les particules RLPs de 80% à une MOI de 5pg
p24/cellule
(Figure Xa) et de 90% par les vecteurs ILVs à une MOI de 75 (Figure Xb). Dans
les
deux cas, les transductions par les particules RLPs ou les vecteurs ILVs
mettent en
évidence un effet dose. La cinétique de transduction des BMDCs par les
particules
RLPs montre que la fluorescence reste stable à 4 jours post-transduction
(Figure Xc).
La cinétique d'expression de la fluorescence dans les BMDC transduites par le
vecteur
ILV n'a été regardée que de façon classique pour un vecteur intégratif, à
partir du
troisième jour (Figure Xd). En parallèle, l'expression des biomarqueurs
spécifiques des
DCs murines ne sont pas modifiés après transduction, que ce soit avec les
particules
RLP (Figure Xe) ou le vecteur ILV (Figure Xf).
2.
Analyse de la toxicité induite par des doses croissantes de RLP et ILV
dans les cellules dendritiques murines (BMDC)
Les tests de transductions ont été réalisés sur des cellules dendritiques
issues de la
moelle osseuse de souris (BMDC) comme précédemment décrit, mais en incluant un
marquage spécifique des cellules mortes afin d'évaluer si une toxicité était
induite par
la transduction à des doses croissantes d'ILV ou de RLP. Les BMDC transduites
ont
été analysées à J2 sur le pourcentage de cellules viables totales ainsi que
sur le
pourcentage de cellules exprimant la ZsGreen1 parmi les cellules exprimant le
marqueur CD11c spécifique des cellules dendritiques. Les résultats obtenus
(Figure
XXII) montrent que, 48h après la transduction, l'analyse spécifique de
l'expression de
la ZsGreen1 dans les BMDC exprimant CD11c montre une transduction par les
particules RLPs de 50% des BMDC CD11c+ à partir d'une MOI de 0,5 pg
p24/cellule et
de 75% par les vecteurs ILVs à une MOI de 75. On observe également un effet
dose
dans l'analyse de l'intensité de fluorescence exprimées par ces cellules, avec
des
niveaux équivalents pour les RLP utilisés à MOI 1 pour les ILV ou 5 pg
p24/cellule pour
les RLP. Enfin, quelle que soit la dose de particules RLP appliquées aux BMDC
(0,1 à
5 pg p24/cellule) on n'observe pas de toxicité significative (viabilité >80%).
Dans les
deux cas, les transductions par les particules RLPs ou les vecteurs ILVs
mettent donc
en évidence la non-toxicité des particules lentivirales sur des cellules
primaires et en
particulier des CPA.
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EXEMPLE 2: Efficacité de l'expression de récepteurs ou d'antigènes dans les
cellules immunitaires
I. Préparation de la particule virale selon l'invention et des
systèmes
comparatifs
1. Constructions des plasmides
1.1 Plasmides pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon
l'invention
= Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide d'expression
est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt-polyA
avec ou
non une séquence intronique ou stabilisatrice d'ARN. Afin de véhiculer les
ARNm dans
les particules lentivirales, 12 répétitions du motif tige-boucle de l'ARN MS2
(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N 1) ont été insérées au sein d'une
cassette d'expression en aval du gène rapporteur. Le promoteur utilisé peut
être celui
du CMV ou EF1 mais d'autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence
d'intérêt
peut coder un antigène ou un épitope. La séquence d'intérêt peut être un ADNc
codant
une protéine, par exemple une protéine immunogène ou une protéine
immunomodulatrice. De nombreux biomarqueurs ont été identifiés sur les
cellules
tumorales et leur séquence complète et/ou des séquences partielles sont
utilisées en
immunothérapie. Par exemple, la séquence utilisée pour exprimer l'antigène
MAGEA3
peut être entière (Figure Xla) ou partielle (Figure Xlb). D'autres séquences
partielles de
biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisées comme celles de gp100 (Figure
Xlc) ou
de la tyrosinase (Figure Xld). Beaucoup d'autres exemples de séquences
complètes
ou partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisées.
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure
II).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit
à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure
III).
1.2 Plasmides pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs ILV.
= Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide d'expression
est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt (dont la
cassette
d'expression est telle que décrite en Figure XII). Ce plasmide peut contenir
d'autres
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éléments comme la séquence native WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus
Posttranscriptional Regulatory Element) ou encore la séquence cPPT/CTS. La
pathogénicité virale est éliminée par la substitution de régions du génome
viral
requises pour la réplication rétrovirale par le transgène. Comme précédemment,
la
séquence d'intérêt peut coder une protéine antigénique entière, un antigène ou
un
épitope. De nombreux biomarqueurs ont été identifiés sur les cellules
tumorales et leur
séquence complète et/ou des séquences partielles sont utilisées en
immunothérapie.
Par exemple les séquences utilisées pour exprimer MAGEA3 peuvent être entières
(Figure Xlla) ou partielles (Figure XI lb). D'autres séquences partielles de
biomarqueurs
tumoraux peuvent être utilisées comme celles de gp100 (Figure XlIc) ou de la
tyrosinase (Figure XlId). Beaucoup d'autres exemples de séquences complètes ou
partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisées.
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure V).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure
III).
2. Productions des lots et titration
La production des lots et la titration est effectuée selon le procédé P2,
comme
décrit à l'Exemple 1, en utilisant l'un des plasmides d'expression suivants :
- pcDNA-EF1.Gène Fluorescent.MS2 12X (dont la cassette d'expression
est telle que décrite en Figure l).
- pILV-EF1.Gène Fluorescent.WPRE (dont la cassette d'expression est
telle que décrite en Figure IVb).
- pcDNA.EF1.PPRV.MAGEA3.IRES.GFP.WPRE.MS2 12X (dont la
cassette d'expression est telle que décrite en Figure Xla).
- pILV.EF1.MAGEA3.IRES.GFP.WPRE (dont la cassette d'expression est
telle que décrite en Figure XI la).
La titration des lots est réalisée selon un procédé identique à celui décrit à
l'Exemple 1.
Il. Transduction de cellules dendritiques murines (BMDC)
La préparation des cellules dendritiques murines est effectuée selon un
procédé identique à celui décrit à l'Exemple 1.
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1. Transduction des cellules dendritiques murines avec un antigène tumoral
simple, par un RLP-MAGE A3-IRES-GFP
Les cellules dendritiques transduites par la particule RLP.MAGE A3-IRES-GFP
ont fait l'objet d'une mise au point liée à la caractérisation de l'expression
de la
fluorescence analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de
particules RLP allant de 0,1 pg p24 à 5 pg p24 et à différents temps d'analyse
(1, 2, 3
et 4 jours post-transduction). Un contrôle négatif de transduction est préparé
avec le
milieu contenant uniquement l'agent de transduction Polybrene à 4pg/mL
(Sigma).
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des
anticorps spécifiques anti-CD11c, anti-0D86, anti-CD80 (Miltenyi Biotec) et
caractérisées par cytométrie en flux.
2. Transduction des cellules dendritiques murines avec un antigène tumoral
simple, par un ILV-MAGE A3-IRES-GFP
Les cellules dendritiques transduites par le vecteur ILV-MAGE A3-IRES-GFP
ont fait l'objet d'une mise au point liée à la caractérisation de l'expression
de la
fluorescence analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de
particules lentivirales ILV allant d'une multiplicité de d'infection MOI de 5
à 75 et à
différents temps d'analyse (1, 2, 3 et 4 jours post-transduction). Un contrôle
négatif de
transduction est préparé avec le milieu contenant uniquement l'agent de
transduction
Polybrene à 4pg/mL (Sigma).
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des
anticorps spécifiques anti-CD11c, anti-0D86, anti-CD80 (Miltenyi Biotec) et
caractérisées par cytométrie en flux.
3. Phénotypage et caractérisation des cellules
3.1 Immunomarquaqe des cellules dendritiques murines
A chaque temps d'analyse, les cellules sont transférées dans les puits d'une
plaque de culture 96 puits à fond conique. Les cellules sont lavées avec une
solution
de PBS 1X pH 7,4, 5% SVF et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le
surnageant
est éliminé par retournement.
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec les
anticorps spécifiques suivants conjugués à des fluorochromes : anti-CD11c,
anti-0D86,
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anti-CD80 (Miltenyi Biotec). Pour cela, des mélanges de solution d'anticorps
sont
réalisés et 50 I par puits sont déposés sur les cellules dendritiques
récupérées. Les
cellules sont incubées 20 minutes à température ambiante dans le noir. 50111
de PBS
lx pH 7,4, 5% SVF sont ajoutés et les cellules sont centrifugées à 300 g
pendant 5
minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont
reprises dans
100111 de PBS 1X pH 7,4, 5% SVF. Les cellules sont centrifugées à 300 g
pendant 5
minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont
reprises dans
100 I de PBS 1X pH 7,4, 5% SVF et analysées en cytométrie en flux.
3.2 Cytométrie en flux
Les cellules dendritiques immunomarquées sont analysées en cytométrie en
flux (Miltenyi Biotec) et analysées. Les échantillons ont été calibrés selon
leur taille
(SSC) et leur granulosité (FSC). Les cellules sont caractérisées sur le
MacsQuantVYB
(Miltenyi Biotec) et analysées avec le logiciel MacsQuant (Miltenyi Biotec).
III. Présentation du modèle d'étude
1. Modèle tumoral Renca
Ce modèle utilise les cellules tumorales du cancer rénal murin (Balb/c) de
type
Renca. Ces cellules murines sont préalablement transduites avec le vecteur
ILV.EF1.MAGE A3.IRES.GFP (M01 100) de façon à exprimer l'antigène MAGE A3 qui
est d'origine humaine. Le modèle consiste ensuite à réimplanter un nombre
prédéfini
de ces cellules (1.10e6 cellules) par voie sous cutané, dans le flanc de
souris adultes
syngéniques Balb/c. Une étude préliminaire a permis de déterminer le nombre de
cellules à réimplanter pour générer une tumeur qui se développe chez tous les
animaux, et sans atteindre de points limites (tumeur >2mm3, perte de poids des
animaux >20% du poids au jour de l'implantation de la tumeur) trop rapidement.
Les
animaux proviennent d'un éleveur agréé (Janvier Europe ou Charles River Labs)
et le
protocole mis en place pour l'ensemble de ces expérimentations a été soumis et
approuvé par un comité d'éthique local (comité d'éthique CEEA-122).
2. Réimplantation des cellules dendritiques modifiées
Les BMDC sont transduites comme décrit dans l'Exemple 1 (2.4) avec les
particules de type RLP (Exemple 1, paragraphe 2.4.1) ou ILV (Exemple 1,
paragraphe
2.4.2) et sont réimplantées le lendemain de la transduction chez les souris
Balb/c, par
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voie intra-dermique au niveau du ganglion inguinal situé du même côté que
celui de la
réimplantation tumorale. Différentes quantités de cellules peuvent être
réimplantées
pour évaluer leur pouvoir thérapeutique dans ce modèle.
3. Suivi du développement tumoral
Tous les animaux sont surveillés quotidiennement pour leur état général. Trois
fois par semaine ils sont pesés et on mesure le développement tumoral par
mesure
manuelle à l'aide d'un pied à coulisse. Le volume tumoral est donné en mm3
selon la
formule suivante : V= a*(b2/2) où a=le plus grand diamètre et b=le plus petit
diamètre.
Pour des raisons éthiques le développement tumoral est limité à un volume de 2
000
mm3, les animaux atteignant cette limite ou ayant perdu plus de 20% de leur
poids
initial (= au jour de la réimplantation des cellules tumorales) sont
sacrifiés.
IV. Résultats: Comparaison de l'efficacité de l'expression d'un
antigène
par RLP et ILV
Une première expérience a été réalisée pour tester l'efficacité de
présentation
antigénique d'un antigène tumoral (MAGE A3) par des cellules dendritiques
murines
(BMDC). Des BMDC ont été transduites par des particules RLP.MAGE A3.IRES.GFP
ou un vecteur ILV.EF1.MAGE A3.IRES.GFP dans les conditions optimales
déterminées par les essais avec la fluorescence ZsGreen1. Une gamme de MOI a
été
faite dans les deux cas et les cellules ont été phénotypées le troisième jour
pour
l'expression des marqueurs spécifiques des cellules dendritiques (Figure XIlla
et X111b).
Comme précédemment, ces analyses montrent que le phénotype n'est pas altéré
par
la transduction, quelle que soit la MOI appliquée.
Des BMDC transduites par des particules RLP.ZsGreen1 ou RLP.MAGE A3 ont
été par ailleurs utilisées pour tester le développement de tumeurs exprimant
MAGE A3
in vivo, chez la souris Balb/c. Deux groupes de souris ont reçus des cellules
tumorales
syngéniques de type Renca (0,75x10e6 cellules), elles-mêmes préalablement
modifiées pour exprimer l'antigène tumoral MAGE A3 d'origine humaine. Le même
jour
ces animaux ont reçu par voie intra-dermique, près du ganglion inguinal
correspondant, une suspension de BMDC (1x10e5 cellules) modifiées par RLP-
ZsGreen1 pour le groupe contrôle ou par RLP.MAGE A3 pour le groupe test. Le
suivi
du développement tumoral a ensuite montré que les animaux ayant reçu les
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BMDC.MAGE A3 ne développaient pas de tumeur, à l'inverse des animaux du groupe
contrôle (Figure XIV).
EXEMPLE 3 : Efficacité d'une particule lentivirale PP7 (IN)-RLP 2X par
modification de l'intéqrase
I.
Préparation de la particule virale selon l'invention et des systèmes
comparatifs
1. Constructions des plasmides
= Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide d'expression
est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt-polyA
(Figure XV
ou XXIII) avec ou non une séquence intronique ou stabilisatrice d'ARN. Afin de
véhiculer les ARNm dans les particules lentivirales, 2 répétions du motif tige-
boucle de
l'ARN PP7 (ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID N 2 et
ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag SEQ ID N 3) ont été insérées au sein
d'une
cassette d'expression en aval du gène rapporteur (Figure XV ou XXIII).
Le promoteur utilisé peut être celui du CMV ou EF1 (Figure XV ou XXIII) mais
d'autres
promoteurs peuvent être utilisés. La séquence d'intérêt peut être un ADN
codant une
protéine reportrice comme la Luciferase Firefly native (Figure XV), une
protéine
fluorescente verte (ZsGreen1)(Figure XXIII), rouge (mCherry) ou bleue (mtBFP),
ou un
ADNc codant une protéine, par exemple la protéine CRE. Préférentiellement,
l'ADNc
code une protéine immunogène ou une protéine immunomodulatrice. La séquence
d'intérêt peut également être celle d'un shRNA, d'un miRNA, d'un sgRNA, d'un
LncRNA ou d'un circRNA.
= Plasmide
d'encapsidation : La particule lentivirale a été modifiée pour
contenir au sein de l'intégrase, la séquence de la protéine Coat du
bactériophage
PP7. Le plasmide d'encapsidation p8.74, porteur des gènes codant les protéines
de
structures et de fonction (Gag, Pol), utilisé pour la production des
particules PP7 (IN)-
RLP 2X est modifié selon la stratégie illustrée par la Figure XVI : ce
plasmide p8.74 est
utilisé pour générer, par PCR d'assemblage, un plasmide sur lequel la protéine
Coat
du phage PP7 est fusionnée au domaine C terminal de l'intégrase. Cette fusion,
obtenue par clonage Hpal, permet de générer le plasmide P8.74- POL-PP7 Coat.
On
obtient ainsi la construction dont la cassette d'expression est illustrée en
Figure XVII.
La séquence codant Pol peut être délétée ou mutée dans certains éléments de
fonction comme par exemple la séquence codant la transcriptase inverse (RT).
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= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant
une protéine d'enveloppe, qui peut être la VSV-G codant la protéine
d'enveloppe du
Virus de la stomatite vésiculaire (dont la cassette d'expression est telle que
décrite en
Figure III).
2. Production, concentration/purification et titration des particules
lentivirales
Les particules lentivirales sont produites comme décrit à l'Exemple 1,
concentrées et purifiées selon le procédé P2. Les particules sont titrées
comme décrit
à l'Exemple 1.
Il. Transduction de cellules dendritiques murines (BMDC)
La préparation des cellules dendritiques murines est effectuée selon un
procédé
identique à celui décrit à l'Exemple 1.
1. Transduction des cellules dendritiques murines avec PP7 (IN)-RLP 2X
Les cellules dendritiques sont transduites par le vecteur PP7 (IN)-
RLP.ZsGreen1
comme décrit dans l'exemple 1 (paragraphe 2.4), à une MOI de 1 pg p24 par
cellule et
analysées sur leur viabilité et l'expression de la fluorescence ZsGreen1 par
cytométrie
en flux à différents temps d'analyse (1, 2 et 3 jours post-transduction). Un
contrôle
négatif de transduction est préparé avec uniquement le milieu contenant
l'agent de
transduction Polybrene à 41..tg/mL (Sigma).
La viabilité des cellules dendritiques est réalisée grâce à un immunomarquage
spécifique ViobilityTM 485/520 (Miltenyi Biotec) et analysée par
cytométrie en flux.
2. Phénotypage et caractérisation des cellules
2.1 Immunomarquaqe des cellules dendritiques murines
A chaque temps d'analyse, les cellules sont transférées dans les puits d'une
plaque de culture 96 puits à fond conique. Les cellules sont lavées avec une
solution
de PBS 1X pH 7,4 et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est
éliminé par retournement.
La viabilité des cellules dendritiques est réalisée par immunomarquage
spécifique avec le ViobilityTM 485/520 (Miltenyi Biotec) selon un procédé
identique
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à celui décrit dans l'Exemple 1.
2.2 Cytométrie en flux
Les cellules dendritiques immunomarquées sont analysées en cytométrie en
flux (Miltenyi Biotec) et analysées. Les échantillons ont été calibrés selon
leur taille
(SSC) et leur granulosité (FSC). Les cellules marquées au ViobilityTM sont
mortes, les
cellules viables sont donc les cellules négatives (marquage par exclusion).
Les cellules
sont caractérisées sur le MacsQuantVYB (Miltenyi Biotec) et analysées avec le
logiciel
MacsQuant (Miltenyi Biotec).
III. Résultats
La Figure XXIV montre la mesure de la viabilité cellulaire et la cinétique
d'expression de la ZsGreen1 de BMDC (CPA) transduites avec les particules PP7
(IN)-
RLP.ZsGreen1 à une dose de 1pg p24 par cellule. La proportion de BMDC murines
transduites avec les particules PP7 (IN)-RLP qui expriment la ZsGreen1 est de
70%,
dès 24h post transduction et de façon stable jusqu'à 3 jours. Les cellules
restent au
même niveau de viabilité sur les 3 jours d'analyse, seule l'intensité
d'expression
diminue dans le temps. Il est donc possible de véhiculer des ARN dans les
particules
lentivirales avec PP7-Coat dans l'intégrase. Préférentiellement, les
particules PP7 (IN)-
RLP sont utilisées pour véhiculer des ARN portant des séquences antigéniques
dans
des CPA, telles que les BMDC.
EXEMPLE 4: Mise en évidence du transfert d'ARN codant pour plusieurs
antigènes par une particule RLP dans des cellules immunitaires
I.
Préparation de la particule virale selon l'invention et des systèmes
comparatifs
1. Constructions des plasmides
= Plasmides d'expression d'une séquence d'intérêt : Les plasmides
d'expression sont porteurs d'une cassette d'expression promoteur-séquence
d'intérêt-
polyA avec ou non une séquence intronique ou stabilisatrice d'ARN. Afin de
véhiculer
les ARNm dans les particules lentivirales, 12 répétitions du motif tige-boucle
de l'ARN
MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N 1) ont été insérées au sein
d'une
cassette d'expression en aval du gène rapporteur. Le promoteur utilisé peut
être celui
du CMV ou EF1 mais d'autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence
d'intérêt
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peut coder un antigène ou un épitope. De nombreux biomarqueurs ont été
identifiés
sur les cellules tumorales et leur séquence complète et/ou des séquences
partielles
sont utilisées en immunothérapie. Par exemple, la séquence utilisée pour
exprimer
l'antigène MAGEA3 peut être entière (Figure Xla) ou partielle (Figure Xlb).
D'autres
séquences partielles de biomarqueurs peuvent être utilisées comme celles de
gp100
(Figure Xlc) ou de la tyrosinase (Figure Xld). Beaucoup d'autres exemples de
séquences complètes ou partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être
utilisés.
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (Figure 11).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (Figure 111).
2. Productions des lots et titration
La production des lots et la titration est effectuée selon le procédé P2
décrit à
l'Exemple 1, en utilisant l'un ou plusieurs des plasmides d'expression
suivants :
- Lot RLP MAGEA3 :pcDNA.EF1.PPRV.MAGEA3.IRES.GFP.WPRE.MS2
12X (Figure Xla).
- Lot RLP AATs : pcDNA.EF1long.PPRV.PS-AgMageA3.WPRE.MS2 12X
(Figure Xlb) + pcDNA.EF1long.PPRV.PS-Aggp100.WPRE.MS2 12X
(Figure Xlc) +pcDNA.EF1long.PPRV.PS-AgTyrosinase.WPRE.MS2 12X
(Figure Xld).
- Lot
RLP.ZsGreen1 : pcDNA. EF1.Gène Fluorescent. MS2 12X (Figure
1).
Les proportions respectives des plasmides sont les suivantes: 40% du plasmide
d'expression ou des plasmides d'expression (dans le cas du RLP-AATs), 30% du
plasmide p8.74 (ou p8.74AZF), 30% du plasmide pENV.
Il. Transduction de CPA
1. Lignée U937 (ATCC CRL-1593.2 Tm)
La lignée cellulaire U937 est une lignée cellulaire établie à partir du
lymphome
histiocytique d'un homme de 37 ans et qui présente de nombreuses
caractéristiques
de monocytes. C'est un modèle très utilisé pour les études in vitro sur la
différenciation
des monocytes et des macrophages. Les cellules U937 sont cultivées dans des
flasques de cultures Ultra Low Attachement (ULA) à 100 000 cellules par ml de
milieu
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WO 2017/194903 66 PCT/FR2017/051165
RPMI 1640 en présence de 10% de Serum de Veau Foetal (SVF), 1%
Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-glutamine (=milieu RPMI complet).
1.1 Transduction des cellules U937 avec des particules RLP.MAGE A3.IRES.GFP
ou des particules contenant un mélange de 3 antigènes tumoraux (RLP-AATs)
Le jour de la transduction, les cellules sont récupérées et comptées. Elles
sont
resuspendues pour obtenir une suspension cellulaire à 500 000 cellules/mi dans
5000
de milieu. Les ensemencements en prévision de la transduction sont réalisées
en
plaque 24 puits ULA, à raison de 5000 par puits et en triplicate.
Les cellules sont transduites en milieu de culture RPMI complet supplémenté
avec les
agents de transfection suivants : Polybrene à 16pg/mL et BX795 1,2pM et
incubées à
+37 C / 5% CO2 pendant 4 heures. 5000 des milieux de transduction sont ajoutés
à
chaque puits correspondant, pour lesquels les agents de transfection se
retrouvent à
une concentration finale de 8pg/mL de Polybrene et 0,6pM de BX795.
5 heures après la transduction, 8000 du milieu de transduction (80%) sont
retirés et
remplacés par 8000 de milieu de culture RPMI complet.
1.2 Récupération des cellules
5 heures et 20 heures post-transduction, les cellules sont resuspendues et
prélevées en tube de 15 ml, puis centrifugées à 200g pendant 5 minutes pour
les
culoter. Le surnageant est rejeté et les cellules sont lavées dans 1 ml de PBS
1X avant
d'être à nouveau centrifugées à 200g pendant 5 minutes. Le surnageant est
rejeté et le
culot cellulaire est resuspendu dans 1 ml de Trypsine 0,05%-0,53mM EDTA
(Corning).
Les cellules sont incubées 5 minutes à 37 C. A la fin de l'incubation, 2 ml de
milieu de
culture RPMI complet sont ajoutés à la suspension cellulaire. Les cellules
sont
centrifugées à 200g, pendant 5 minutes, puis le surnageant est rejeté et les
cellules
sont lavées avec 1 ml de PBS 1X avant d'être une dernière fois centrifugées à
200g,
pendant 5 minutes. Le surnageant est rejeté et les cellules sont congelées
immédiatement à -80 C sous forme de culots secs.
1.3 Extraction des ARN totaux
Chaque culot sec est déposé sur la glace pour une décongélation lente. 1m1 de
solution de Trizol est ajouté à chaque culot sec à température ambiante et les
cellules
sont incubées 5 minutes avant d'y ajouter 200p1 de Chloroforme. Les
échantillons sont
homogénéisés par 10 retournements et incubées 2-3 minutes à température
ambiante.
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WO 2017/194903 67 PCT/FR2017/051165
Les échantillons sont centrifugés à 12000g, pendant 15 minutes, à +4 C. A la
fin de la
centrifugation, les échantillons sont déposés sur la glace. La phase
supérieure est
transférée dans un nouveau tube (500-600p1). Un volume équivalent d'éthanol à
700
est ajouté puis les échantillons sont homogénéisés à l'aide d'un vortex.
La purification des ARN totaux se fait selon le protocole du kit "RNA
purification
mini kit" (Ambion). L'élution se fait dans 30p1 de solution d'eau purepar
échantillon. Le
dosage des ARNs des échantillons se fait par utilisation du Nanodrop puis les
échantillons sont stockées à -80 C.
1.4 Retro-Transcription des ARNs
La retro-transcription des ARNs en ADN complémentaire est réalisée sur 500ng
d'ARN de chaque échantillon par l'utilisation de l'enzyme "Maxima First
Strand"
(ThermoFisher), en suivant les recommandations du fournisseur.
1.5 Amplification des ADNc par RT-qPCR
Les amplifications se font sur 5p1 d'ADNc dilué au 1/10ème dans de l'eau
ultrapure, avec le mix de PCR en temps réel, SYBR@Premix Ex Taq (Takara ¨ cat
RR420L), en présence de 200nM d'oligonucléotides sens et antisens dans un
volume
final de 200.
A chaque puits, on ajoute 5p1de cDNA dilué au 1/10ème.
La PCR en temps réel est réalisée avec un thermocycleur StepOnePlus (Applied
Biosystems) avec la chimie SYBR Green selon le protocole suivant : 1 cycle de
30
secondes à 95,0 C puis 40 cycles comprenant 5 secondes à 95,0 C et 30 secondes
à
60,0 C.
Les oligonucléotides Sens utilisés sont :
- Q-hGAPDH-S (GACAAGCTTCCCGTTCTCAG) (SEQ ID N 4)
- Q-MAGEA3-F (CTGCCGACCACCATGAACTA) (SEQ ID N 5)
- Q-PSMAGEDC-F (TCAGCACTCTTTGAGGATCTAATGA) (SEQ ID N 6)
- Q-PSTyrDC-F (ATGAGCCAGGTGCTTAACAACA) (SEQ ID N 7)
- Q-PSGP100DC-F (TGGCGCCTCAGCACTCTT) (SEQ ID N 8)
Les oligonucléotides AntiSens utilisés sont :
- Q-hGAPDH-AS (GAGTCAACGGATTTGGTCGT) (SEQ ID N 9)
- Q-MAGEA3-R (GGTTGCTGGAGTCCTCATAGGA) (SEQ ID N 10)
- Q- PSMAGETyrDC-R (GGTAGGCAATGAGGACGATGA) (SEQ ID N 11)
- Q-PSGP100DC-R (ACCTGGTCCATGATGGTGAAG) (SEQ ID N 12)
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WO 2017/194903 68 PCT/FR2017/051165
Les associations des couples d'oligonucléotides à utiliser sont les suivantes
selon les
cibles :
- Cible hGAPDH avec Q-hGAPDH-S et Q-hGAPDH-AS
- Cible MAGEA3 avec Q-MAGEA3-F et Q-MAGEA3-R
- Cible PS-MAGEDC avec Q-PSMAGEDC-F et Q-PSMAGETyrDC-R
- Cible PS-TyrDC avec Q-PSTyrDC-F et Q-PSMAGETyrDC-R
- Cible PS-Gp100DC avec Q-PSGP100DC-F et Q-PSGP100DC-R
Des expériences de validation de la spécificité des oligonucléotides ont été
menées
préalablement.
2. Préparation des cellules dendritiques humaines immatures (iDC
également appelée hDC)
La préparation des cellules dendritiques humaines immatures (hDC) est
effectuée
selon un procédé identique à celui décrit à l'Exemple 1 (partie II, 2.1).
2.1. Transduction des cellules dendritiques humaines avec des
particules
RLP.ZsGreen1, RLP.MAGE A3 ou des particules contenant un mélange de
3 antigènes tumoraux (RLP-AATs)
La transduction des hDC est effectuée selon un procédé identique à celui
décrit à
l'Exemple 1 (partie II, paragraphe 2.3). Les cellules sont transduites avec 4
pg de
p24/cellule et sont analysées à différents temps (5h, 20h post-transduction).
Un contrôle négatif de transduction est préparé avec le milieu contenant
uniquement l'agent de transduction Polybrene à 4pg/mL (Sigma).
Les cellules dendritiques sont analysées le jour de la transduction et aux
différents
temps d'analyse, par RT-qPCR sur les ARN issus de culots de cellules
transduites.
2.2. Récupération des cellules
5 heures et 20 heures post-transduction, les surnageants de culture sont
retirés
des puits contenant les hDC qui sont adhérées au plastique de culture. Celles-
ci sont
lavées avec 0,5 ml de PBS 1X, qui est ensuite retiré. Les cellules reçoivent
alors 0,25
ml de Trypsine 0,05 /0-0,53mM EDTA (Corning) et sont incubées 2 minutes à 37
C. A
la fin de l'incubation, 0,25 ml de milieu de culture RPMI complet sont ajoutés
et les
hDC sont récupérées par grattage du puits. Les cellules sont centrifugées à
200g
pendant 5 minutes. Les puits sont lavés avec 0,5 ml de PBS 1X qui servent à
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WO 2017/194903 69 PCT/FR2017/051165
resuspendre les culots de hDC après centrifugation. La totalité des hDC ainsi
récoltée
est à nouveau centrifugée 5 minutes à 200g. Le surnageant est rejeté et les
cellules
sont lavées une dernière fois avec 0,5 ml de PBS 1X avant d'être centrifugées
à 200g
pendant 5 minutes. Le surnageant est rejeté et les cellules sont congelées
immédiatement à -80 C sous forme de culots secs.
2.3. Extraction des ARN totaux
La préparation des ARN est effectuée selon un procédé identique à celui décrit
dans ce même exemple en 11.1.3 avec le kit "RNA purification mini kit"
d'Ambion.
L'élution se fait dans 30p1 de solution d'eau pure par échantillon. Le dosage
des ARNs
des échantillons se fait par utilisation du Nanodrop puis les échantillons
sont stockées
à -80 C.
2.4. Retro-Transcription des ARNs
La retro-transcription des ARNs en ADN complémentaire est réalisée sur 500ng
d'ARN selon le procédé décrit dans ce même exemple en 11.1.4.
2.5. Amplification des ADNc par RT-qPCR
L'amplification des ADNc par RT-qPCR est réalisée selon le procédé décrit dans
ce même exemple au paragraphe 11.1.5.
III. Résultats
L'analyse spécifique par RT-qPCR permet de mettre en évidence le transfert
d'ARN codant pour les 3 antigènes (PS-MAGEA3, PS-GP100 et PS-TYR) par des
particules RLP dans des CPA, en particulier dans des cellules U937 et dans des
cellules dendritiques humaines, à 5h et 20h post-transduction (respectivement
Figures
XXVI et XXVII, XXIX et XXX). Les résultats obtenus sont analysés et
interprétés selon
la présence ou non d'une amplification spécifique et significative au cours de
la PCR
quantitative en temps réel (RT-qPCR).
Les résultats montrent que les différents ARNs contenus dans les particules,
qu'ils
soient d'un seul type comme c'est le cas pour les particules RLP-MAGE A3
(Figures
XXV et XXVIII) ou de trois types différents, comme pour les particules RLP-
AATs
(figures XXVI, XXVII et XXIX, XXX), sont donc bien transférés dans les CPA par
les
CA 03023788 2018-11-08
WO 2017/194903 70 PCT/FR2017/051165
particules RLP. Dans le cas de la lignée cellulaire U937, les quantités
relatives des
différents ARNs sont significatives dès 5h post transduction (Figure XXVI) et
elles
augmentent à 20h post-transduction (Figure XXVII). Dans le cas des cellules
primaires
hDC, les niveaux d'ARN spécifiques relatifs sont significatifs à 20h (Figure
XXX) même
s'ils sont moins importants à 5h (Figure XXIX). Les particules RLP sont donc
efficaces
pour le transfert dans des CPA (lignées et cellules primaires) de molécules
d'ARNs
codant pour différents peptides antigéniques. Ceci constitue un avantage
thérapeutique dans l'efficacité du traitement par les cellules immunitaires
modifiées, en
particulier des CPA. Les particules RLP s'inscrivent donc dans une stratégie
d'immunothérapie, basée sur une modulation de la spécificité de la réponse
immune.
EXEMPLE 5: Evaluation de l'efficacité d'une particule RLP pour l'expression
d'antigènes multiples
I. Préparation
de la particule virale selon l'invention et des systèmes
comparatifs
1. Constructions des plasmides
1.1 Plasmides pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon
l'invention
= Plasmides d'expression d'une séquence d'intérêt : Les plasmides
d'expressions sont porteurs d'une cassette d'expression promoteur-séquence
d'intérêt-
polyA avec ou non une séquence intronique ou stabilisatrice d'ARN, telles que
décrites
en Figures Xllb, XlIc et XlId. Afin de véhiculer les ARNm dans les particules
lentivirales, 12 répétitions du motif tige-boucle de
l'ARN MS2
(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N 1) ont été insérées au sein d'une
cassette d'expression en aval du gène rapporteur. Le promoteur utilisé peut
être celui
du CMV ou EF1 mais d'autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence
d'intérêt
peut coder un antigène ou un épitope. De nombreux biomarqueurs ont été
identifiés
sur les cellules tumorales et leur séquence complète et/ou des séquences
partielles
sont utilisées en immunothérapie. Beaucoup d'autres exemples de séquences
complètes ou partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisées.
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure
II).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit à
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WO 2017/194903 71 PCT/FR2017/051165
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure
III).
1.2 Plasmides pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs ILV
= Plasmides d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide
.. d'expression est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence
d'intérêt. La
séquence du gène d'intérêt peut être par exemple celle d'un rapporteur
fluorescent
(Figure IVb), ou bien celle d'un antigène ou un épitope. De nombreux
biomarqueurs
ont été identifiés sur les cellules tumorales et leur séquence complète et/ou
des
séquences partielles sont utilisées en immunothérapie. Par exemple, les
séquences
utilisées pour exprimer MAGEA3 peuvent être entières (Figure Xlla) ou
partielles
(Figure XlIb). D'autres séquences partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent
être
utilisées comme celles de gp100 (Figure XlIc) ou de la tyrosinase (Figure
XlId).
Beaucoup d'autres exemples de séquences complètes ou partielles de
biomarqueurs
tumoraux peuvent être utilisées. Ce plasmide peut contenir d'autres éléments
comme
la séquence native WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional
Regulatory
Element) ou encore la séquence cPPT/CTS. La pathogénicité virale est éliminée
par la
substitution de régions du génome viral requises pour la réplication
rétrovirale par le
transgène.
= Plasmide d'encapsidation : Le plasmide d'encapsidation p8.74, porteur des
gènes codant les protéines de structures et de fonction (Gag, Pol) est utilisé
pour la
production des vecteurs lentiviraux intégratifs (dont la cassette d'expression
est telle
que décrite en Figure V).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant
une protéine d'enveloppe, qui peut être par exemple la séquence du gène VSV-G
codant la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (dont la
cassette
d'expression est telle que décrite en Figure III).
2. Productions des lots et titration
La production des lots est effectuée selon le procédé P2, comme décrit à
l'Exemple 1, en utilisant l'un des plasmides d'expression suivants :
- Lot RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr, également appelé RLP-AATs :
pcDNA.EF1long.PPRV.PS-AgMAGEA3.WPRE.MS2 12X (dont la
cassette d'expression est telle que décrite en Figure Xlb) +
pcDNA.EF1long.PPRV.PS-Aggp100.WPRE.MS2 12X (dont la cassette
d'expression est telle que décrite en Figure Xlc) +
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WO 2017/194903 72 PCT/FR2017/051165
pcDNA.EF1long.PPRV.PS-AgTyrosinase.WPRE.MS2 12X (dont la
cassette d'expression est telle que décrite en Figure Xld).
- Lot RLP. MAGEA3.IRES.GFP, également appelé RLP-
MAGEA3 :pcDNA.EF1.PPRV.MAGEA3.IRES.GFP.WPRE.MS2 12X
(dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure Xla).
- Lot ILV.EF1.PS-MAGEA3/Gp100/Tyr, également appelé ILV-AATs :
pILV.EF1.PS-AgMAGEA3.WPRE (figure XlIb) + pILV.EF1.PS-
Aggp100.WPRE (dont la cassette d'expression est telle que décrite en
Figure XlIc) + pILV.EF1.PS-AgTyrosinase.WPRE (dont la cassette
d'expression est telle que décrite en Figure XlId).
Les proportions respectives des plasmides sont les suivantes: 40% du plasmide
d'expression ou des plasmides d'expression (dans le cas du RLP-AATs ou ILV-
AATs),
30% du plasmide p8.74 (ou p8.74AZF), 30% du plasmide pENV.
La titration des lots est réalisée selon le procédé identique à celui décrit à
l'Exemple 1.
Il. Description des modèles utilisés
1. Modèles cellulaires
1.1 Modèle tumoral Renca
Ce modèle est celui décrit dans l'Exemple 2, pour lequel on utilise les
cellules
tumorales Renca qui auront été préalablement transduites à MOI 100 avec le
vecteur
ILV.EF1.PS-MAGEA3/Gp100/Tyr contenant un mélange des 3 plasmides d'expression
dont les cassettes d'expression sont telles que décrites aux Figures Xllb, c
et d de
façon à exprimer de façon stable les peptides antigéniques MAGE A3, gp100 et
tyrosinase, tous les trois d'origine humaine. Le modèle consiste ensuite à
réimplanter
0,75.106 de ces cellules par voie sous cutané dans le flanc de souris adultes
syngéniques de fond BALB/c. Les animaux proviennent d'un éleveur agrée
(Janvier
Europe) et le protocole mis en place pour l'ensemble de ces expérimentations a
été
soumis et approuvé par un comité d'éthique local (comité d'éthique CEEA-122).
Tous les animaux sont surveillés quotidiennement pour leur état général. Deux
fois par semaine, ils sont pesés et le développement tumoral est mesuré
manuellement
à l'aide d'un Caliper. Le volume tumoral est donné en mm3 selon la formule
suivante :
V= a*(b2/2) où a=le plus grand diamètre et b=le plus petit diamètre.
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WO 2017/194903 73 PCT/FR2017/051165
1.2 Préparation des cellules lymphocytaires murines
Les lymphocytes murins sont préparés à partir de rate de souris BALB/c
sauvage ou de souris ayant développé une tumeur de type Renca >1 mm3. La rate
est
récupérée après euthanasie de l'animal par dislocation cervicale. Elle est
dissociée
mécaniquement par écrasement sur un tamis cellulaire de 70 m. La suspension
cellulaire est centrifugée 5 minutes à 300 g, à +4 C. Le culot cellulaire est
ensuite
repris dans 10m1 de tampon MACS froid, la suspension filtrée sur un tamis
cellulaire de
40 lm posé sur un tube de 50 ml puis une numération cellulaire est réalisée.
La
suspension cellulaire est centrifugée 10 minutes à 300 g, à +400 avant de
procéder à
un tri positif sur l'expression du marqueur CD8 selon un procédé identique à
celui
décrit à l'Exemple 1. La fraction positive est récupérée par un lavage de la
colonne de
tri hors de l'aimant, avec 1 ml de tampon MACS. Cette fraction est complétée à
5 ml
avec du tampon MACS froid puis une numération cellulaire est réalisée. La
suspension
cellulaire est centrifugée 10 minutes à 300g, à +4 C et les cellules sont
resuspendues
à une concentration de 1.106 cellules par ml en PBS 1X.
1.3 Marquage CFSE des splénocytes murins CD8+ triés
Les lymphocytes T CD8+ issus du tri des splénocytes murins sont marqués au
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CellTrace TM
CFSE dye, In
Vitrogen/thermoFisher Scientific) selon le procédé suivant : une suspension
cellulaire à
1.106 cellules par ml est préparée dans du PBS 1X. La solution stock de CFSE
est à
1mM dans du DMSO, et 2 1 de cette solution par ml de suspension cellulaire
sont
ajoutés de façon à obtenir des lymphocytes marqués à 2 M. Les cellules sont
ensuite
incubées pendant 20mn à 37 C, à l'abri de la lumière. La réaction est arrêtée
en
diluant les cellules 5 fois dans du RPMI supplémenté à 1% de Sérum de Veau
Foetal et
en incubant à nouveau la suspension 5 mn. La suspension cellulaire est ensuite
centrifugée 5 minutes à 300 g, à température ambiante et les cellules
resuspendues à
une concentration de 1.6.106 cellules par ml en milieu RPMI 1640 supplémenté à
10%
de Sérum de Veau Foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine pour
être
co-cultivées à différents ratios avec des BMDC murines, dans une plaque 96
puits à
fonds plats type ULA (Corning). Après marquage, les lymphocytes T CD8+ ainsi
obtenus sont analysés par cytométrie en flux (Miltenyi Biotec) en présence
d'un
anticorps anti-CD8 pour contrôler la pureté de la population triée et le
marquage CFSE
(Figure XVIII).
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WO 2017/194903 74 PCT/FR2017/051165
1.4 Préparation des cellules dendritiques murines
La préparation des cellules dendritiques murines est effectuée selon un
procédé identique à celui décrit à l'Exemple 1.
2. Transduction des cellules immunitaires et analyse de la réponse
proliférative
2.1 Transduction des cellules dendritiques murines (BMDC) avec des particules
RLP.MAGE A3.IRES.GFP ou des particules RLP.AATs contenant un mélange
de 3 antigènes tumoraux (RLP-PS-MAGEA3 /Gp100/Tyr)
Au 7eme jour de culture les cellules dendritiques BMDC sont transduites par
les
particules RLP.MAGE A3. I RES.G FP ou par les
particules RLP-PS-
MAGEA3/Gp100/Tyr (mélange des 3 plasmides d'expression dont les cassettes
d'expression sont telles que décrites aux Figures Xlb, c et d) à raison de 3
pg p24 par
cellule. Un contrôle négatif de transduction est préparé avec le milieu
contenant
uniquement l'agent de transduction Polybrene à 4pg/mL (Sigma).
Les cellules dendritiques sont phénotypées le jour de la transduction et 24h
plus tard par immunomarquage avec des anticorps spécifiques anti-CD11c, anti-
0D86,
anti-CD80 (Miltenyi Biotec) et caractérisées par cytométrie en flux.
2.2 Co-culture des lymphocytes T CD8+ marqués CFSE avec les BMDC
synciéniques
Les lymphocytes T CD8+ marqués CFSE, issus des souris BALB/c sauvage ou
ayant développé une tumeur Renca, sont cultivées en présence de BMDC murines
syngéniques transduites soit avec les particules RLP.MAGE A3.IRES.GFP, soit
avec
les particules RLP-PS-MAGEA3 /Gp100/Tyr, ou bien avec des BMDC non
transduites.
Deux ratios ont été testés dans le cas des co-cultures avec les BMDC
transduites avec
les particules RLP-PS-MAGEA3./Gp100/Tyr: 1 BMDC pour 2 lymphocytes T CD8+
(1DC:2T) ou 1 BMDC pour 4 lymphocytes T CD8+ (1DC:4T).
Le ratio entre lymphocytes T CD8+ et les BMDC transduites avec les particules
RLP.MAGE A3.IRES.GFP est de 1 BMDC pour 2 lymphocytes T CD8+ (1DC:2T). Ces
co-cultures sont faites dans un volume final de 200111 de milieu RPMI 1640
supplémenté à 10% de Sérum de Veau Foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-
Glutamine, dans une plaque 96 puits à fonds plats de type ULA (Corning). Les
BMDC
sont incubées à raison de 40 000 cellules par puits et le nombre de
lymphocytes T
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CD8+ varie donc de 80 000 à 160 000 cellules par puits.
2.3 Analyse de la réponse proliférative des lymphocytes T CD8+
Cinq jours après la mise en co-culture, les mélanges de cellules sont
récupérés
des plaques de culture pour être transférés dans les puits d'une plaque de
culture 96
puits à fond conique afin d'être marquées pour les analyses par cytométrie en
flux. Les
cellules sont lavées avec une solution de PBS 1X pH 7,4, 5% SVF et
centrifugées à
300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les
cellules
lymphocytaires sont analysée par immunomarquage avec un anticorps anti-CD8
conjugué à un fluorochrome (Miltenyi Biotec) selon le procédé décrit
précédemment
dans l'Exemple 1. Les cellules sont reprises dans 100111 de PBS 1X pH 7,4, 5%
SVF et
analysées en cytométrie en flux, à la fois selon leur expression pour le
marqueur CD8
(ce qui permet de les discriminer des BMDC toujours présentes dans les
suspensions)
et l'expression du CFSE, dont le niveau de fluorescence relative est divisé
par deux à
chaque division cellulaire, ce qui permet donc de quantifier la réponse
proliférative des
cellules.
La Figure XIX montre les profils d'expression du CFSE obtenus avec des
lymphocytes T CD8+ cultivés seuls ainsi que ceux obtenus après les 5 jours de
co-
culture avec les BMDC non transduites ou transduites avec les particules RLP-
PS-
MAGEA3 /Gp100/Tyr.
2.4 Cytométrie en flux
Les cellules lymphocytaires immunomarquées sont analysées en cytométrie en
flux (Miltenyi Biotec). Les échantillons ont été calibrés selon leur taille
(SSC) et leur
granulosité (FSC). Les cellules sont caractérisées sur le MacsQuantVYB
(Miltenyi
Biotec) et analysées avec le logiciel MacsQuant (Miltenyi Biotec).
Il. Résultats
Dans ces expériences, des BMDC non transduites, transduites par les
particules RLP.MAGE A3.IRES.GFP ou transduites par les particules RLP-PS-
MAGEA3 /Gp100/Tyr ont été co-cultivées à différents ratios avec des
lymphocytes T
triés en fonction de leur expression du marqueur CD8 spécifique des
lymphocytes T
suppresseurs -impliqués dans la mise en place de la réponse tumorale- et
préalablement marqués au CFSE. La Figure XVIII valide la pureté des cellules
issues
des rates des souris sauvages et tumorales (expression du marqueur CD8 dans
toute
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WO 2017/194903 76 PCT/FR2017/051165
la population), ainsi que le marquage au CFSE à JO. La figure XIX montre que
les
lymphocytes T CD8+ marquées au CFSE co-cultivées pendant 5 jours avec des BMDC
(ratio DC:2T) répondent en proliférant. Ceci se traduit en cytométrie par une
diminution
de l'intensité de fluorescence du marquage CFSE vers la gauche, sur un ou
plusieurs
pics. L'analyse porte sur le pourcentage de cellules dans ces pics. Les
profils montrés
sont représentatifs de 3 expériences. La réponse des lymphocytes T CD8+
provenant
d'une souris sauvage est similaire qu'elles soient en contact avec des BMDC
transduites ou non transduites. Ce phénomène s'explique par le fait que des
lymphocytes naïfs mis en contact avec des cellules dendritiques sont capables
de
proliférer, même en l'absence d'antigène (Q. Ge et al. PNAS. 2002 99(5) : 2983-
2988).
Au contraire, les lymphocytes T CD8+ issus d'une souris ayant développé une
tumeur
Renca exprimant les 3 antigènes tumoraux (MAGE A3/gp100/Tyr) répondent peu aux
BMDC non transduites. Ils répondent de façon spécifique lorsqu'ils sont à
nouveau
exposés aux antigènes exprimés par la tumeur, lors de la co-culture avec les
BMDC
transduites par les particules RLP-PS-MAGEA3 /Gp100/Tyr (31,42% des cellules
prolifèrent dans ce cas, contre 14,94% seulement face aux BMDC non
transduites). Il a
été montré que certains facteurs produits par la tumeur (IL-10, PGE2) peuvent
conduire à la mise en place d'un phénomène d'anergie des lymphocytes T in vivo
(M.
Ahmadi et al. Cancer Res. 2008 September 15; 68(18): 7520-7529). Ceci explique
pourquoi ces lymphocytes T CD8+ prolifèrent beaucoup moins que les lymphocytes
T
CD8+ naïfs lorsqu'ils sont exposés à des BMDC non transduites.
En contrôle, les lymphocytes T CD8+ marquées au CFSE cultivées seules
pendant les 5 jours, sans être exposées à des cellules dendritiques, ne
prolifèrent pas
et leur profil d'expression du CFSE est alors similaire à celui observé à JO
(Figure
XVIII). Les profils sont identiques quelle que soit l'origine des lymphocytes
T CD8
(souris sauvage ou tumorale).
La Figure XX montre l'analyse de la réponse proliférative des lymphocytes T
CD8+ co-cultivés avec des BMDC transduites avec les particules RLP-PS-MAGEA3
/Gp100/Tyr, par rapport à la réponse de ces mêmes lymphocytes T CD8+ co-
cultivées
avec des BMDC non transduites. Les analyses ont été faites sur 3 co-cultures
différentes avec des lymphocytes T CD8+ issues de trois souris sauvages ou de
trois
souris ayant développée une tumeur Renca et des BMDC provenant également de 3
cultures différentes. Les réponses des lymphocytes T CD8+ ont été analysées à
partir
de co-cultures à un ratio 1DC:2T ou à un ratio 1DC:4T. La réponse
proliférative relative
est donnée par le ratio du pourcentage de cellules proliférant en réponse aux
BMDC
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transduites avec les particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr par rapport au
pourcentage des cellules répondant de façon non spécifique aux BMDC non
transduites. Les résultats montrent que les lymphocytes T CD8+ issus des
souris ayant
développé une tumeur Renca exprimant les 3 antigènes associés aux tumeurs
(AATs)
humaines répondent spécifiquement à une nouvelle stimulation par ces AATs
(2,67
pour les co-cultures 1DC:2T et 3.90 pour les co-cultures 1DC:4T) alors que les
lymphocytes T CD8+ issus de souris naïves répondent de façon similaire aux
BMDC
transduites avec les particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr (1.59 pour les co-
cultures
1DC:2T et 1.78 pour les co-cultures 1DC:4T).
Enfin, la Figure XXI compare les réponses prolifératives relatives de
lymphocytes T CD8+ co-cultivées dans la condition 1DC:2T avec des BMDC
transduites par des particules RLP.MAGEA3.IRES.GFP ou bien transduites par les
particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr. Comme présenté en figure XX, ces analyses
montrent que les lymphocytes T CD8+ issues de de souris ayant développé une
tumeur Renca portant les 3 AATs répondent de façon plus importante que les
lymphocytes T CD8+ issues de souris sauvages aux BMDC transduites avec les
particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr. De plus, elles répondent spécifiquement à
des BMDC transduites avec des particules portant un seul de ces antigènes
(MAGE
A3).
L'ensemble de ces résultats montrent que les BMDC transduites avec les
particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr sont donc bien capables de présenter les
peptides antigéniques correspondant aux 3 AATs (MAGE A3, gp100 et tyrosinase).
Les molécules d'ARN correspondants aux 3 peptides sont donc pris en charge par
la
machinerie cellulaire spécifique aux cellules présentatrices d'antigènes qui
présentent
ces peptides en surface suffisamment longtemps et efficacement pour que les
lymphocytes T CD8+ qui les rencontrent puissent être activés.
Les approches de vaccination par les cellules dendritiques transduites avec
des
particules d'ARN s'avèrent particulièrement intéressantes, une expression
constante
du ou des antigènes n'est pas nécessaire pour induire et maintenir une
population de
cellules T mémoires (MJ. Bevan and AW. Goldrath. Curret Biology. 2000, 10
:R338-
R340).
EXEMPLE 6 : Mise en évidence du transfert d'ARN codant pour un antigène et
une protéine immunomodulatrice par une particule RLP dans des cellules
immunitaires et efficacité de la particule RLP
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I.
Préparation de la particule virale selon l'invention et des systèmes
comparatifs
1. Constructions des plasmides
= Plasmides d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide
d'expression est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence
d'intérêt-
polyA avec ou non une séquence intronique ou stabilisatrice d'ARN. Afin de
véhiculer
les ARNm dans les particules lentivirales, 12 répétitions du motif tige-boucle
de l'ARN
MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N 1) ont été insérées au sein
d'une
cassette d'expression en aval du gène rapporteur. Le promoteur utilisé peut
être celui
du CMV ou EF1 mais d'autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence
d'intérêt
peut coder un antigène ou un épitope. De nombreux biomarqueurs ont été
identifiés
sur les cellules tumorales et leur séquence complète et/ou des séquences
partielles
sont utilisées en immunothérapie. Par exemple, la séquence utilisée pour
exprimer
l'antigène MAGEA3 peut être entière (Figure Xla) ou partielle (Figure Xlb). La
séquence d'intérêt peut également coder pour une protéine immunomodulatrice,
comme une cytokine ou une interleukine telle que l'IL-12 par exemple.
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure
II).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure
III).
2. Productions des lots et titration
La production des lots et la titration est effectuée selon le procédé P2,
comme
décrit à l'Exemple 1, en utilisant les plasmides d'expression suivants :
- Lot RLP-PS-MAGEA3/IL-12 . pcDNA.EF1long.PPRV.PS-
AgMAGEA3.WPRE.MS2 12X linéaire (dont la cassette d'expression est
telle que décrite en Figure Xlb) et pcDNA.EF1.1L12b-linker-
DeltalL12a.MS2 12X (dont la cassette d'expression est telle que décrite
en Figure XXXI).
Les proportions respectives des plasmides sont les suivantes: 40% des
plasmides d'expression, 30% du plasmide p8.74 (ou p8.74AZF), 30% du plasmide
pENV.
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Il. Transduction de cellules du système immunitaire
1. Lignée U937 (ATCC CRL-1593.2 Tm)
La lignée cellulaire U937 a été cultivée dans les conditions décrites dans
l'exemple
4 (II.paragraphe 1).
1.1. Transduction des cellules U937 avec des particules contenant un
mélange
d'un antigène tumoral et d'une protéine immunomodulatrice (RLP-PS-
MAGEA3/1L-12)
Les transductions des cellules U937 sont réalisées selon le procédé décrit
dans
l'Exemple 4 (II.paragraphe 1.1).
1.2. Récupération des cellules
5 heures et 20 heures post-transduction, les cellules sont récupérées et
traitées
selon le procédé décrit dans l'Exemple 4 (II.paragraphe 1.2).
1.3. Extraction des ARN totaux
Chaque culot sec est traité selon le procédé décrit dans l'Exemple 4 (II.
paragraphe 1.3) pour extraire et purifier les ARN totaux.
1.4. Retro-Transcription des ARNs
La retro-transcription des ARNs en ADN complémentaire est réalisée selon le
procédé décrit dans l'Exemple 4 (II.paragraphe 1.4).
1.5. Amplification des ADNc par RT-qPCR
Les amplifications se font sur 5p1 d'ADNc dilué au 1/10eme dans de l'eau
ultrapure, avec le mix de PCR en temps réel, SYBR@ Premix Ex Taq (Takara ¨ cat
RR420L), en présence de 200nM d'oligonucléotide sens et antisens dans un
volume
final de 20111. A chaque puits, on ajoute 5p1d'ADNc dilué au 1/10ème.
La PCR en temps réel est réalisée avec un thermocycleur StepOnePlus
(AppliedBiosystems) avec la chimie SYBR Green selon le protocole suivant : 1
cycle
de 30 secondes à 95,0 C puis 40 cycles comprenant 5 secondes à 95,0 C et 30
secondes à 60,0 C.
Les oligonucléotides Sens utilisés sont :
- Q-hGAPDH-S (GACAAGCTTCCCGTTCTCAG) (SEQ ID N 4)
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- Q-PSMAGEDC-F (TCAGCACTCTTTGAGGATCTAATGA) (SEQ ID N 6)
- Q-IL12ap35-F (CGGATCTAGGGTCATTCCAGTCT) (SEQ ID N 13)
Les oligonucléotides AntiSens utilisés sont :
- Q-hGAPDH-AS (GAGTCAACGGATTTGGTCGT) (SEQ ID N 9)
- Q- PSMAGETyrDC-R (GGTAGGCAATGAGGACGATGA) (SEQ ID N 11)
- Q- IL12ap35-R (GTTTTTCTCTGGCCGTCTTCA) (SEQ ID N 14)
Les associations des couples d'oligonucléotides à utiliser sont les suivantes
selon les
cibles :
- Cible hGAPDH avec Q-hGAPDH-S et Q-hGAPDH-AS
- Cible PS-MAGEDC avec Q-PSMageDC-F et Q-PSMAGETyrDC-R
- Cible IL12ap35 avec Q- IL12ap35-F et Q- IL12ap35-R
Des expériences de validation de la spécificité des oligonucléotides ont été
menées préalablement.
2. Préparation des cellules dendritiques humaines immatures (hDC)
La préparation des cellules dendritiques humaines immatures est effectuée
selon
un procédé identique à celui décrit à l'Exemple 1 (partie 11, paragraphe 2.1).
2.1 Transduction des cellules dendritiques humaines avec des particules
contenant
un mélange d'un antigène tumoral et d'une protéine immunomodulatrice (RLP-
PS-MAGEA3/I L-12)
La transduction des cellules dendritiques humaines est effectuée selon un
procédé
identique à celui décrit à l'Exemple 1 (partie 11, paragraphe 2.3). Les
cellules sont
transduites avec 4 pg de p24/cellule et sont analysées à différents temps (5h,
20h
post-transduction).
Un contrôle négatif de transduction est préparé avec le milieu contenant
uniquement l'agent de transduction Polybrene à 4pg/mL (Sigma). Les cellules
dendritiques sont analysées le jour de la transduction et aux différents temps
d'analyse, par RT-qPCR sur les ARN issus de culots de cellules transduites.
2.2. Récupération des cellules
Pour l'analyse de l'expression en ARN, la récupération des cellules
dendritiques
humaines aux différents temps après transduction est réalisée selon le
protocole décrit
dans l'Exemple 4 (II. paragraphe 2.2). Les cellules sont congelées à -80 C
sous forme
de culots secs. Pour l'analyse de la sécrétion d'IL12, les surnageants de
culture
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cellulaire sont prélevés aux temps 20h et 48h post-transduction.
Les surnageants sont conservés à -20 C
2.3. Extraction des ARN totaux
La préparation des ARN est effectuée selon un procédé identique à celui décrit
dans l'Exemple 4 (II. paragraphe 2.3).
2.4. Retro-Transcription des ARNs
La retro-transcription des ARNs en ADN complémentaire est réalisée sur 500ng
d'ARN selon le procédé décrit dans l'Exemple 4 (II. paragraphe 2.4).
2.5. Amplification des ADNc par RT-qPCR
L'amplification des ADNc par RT-qPCR est réalisée selon le procédé décrit dans
l'Exemple 4 (II. paragraphe 2.5).
2.6. Test ELISA pour la sécrétion d'1 L12
Le test ELISA pour la quantification de la sécrétion d'IL12 dans les
surnageants de
culture cellulaire est réalisé selon le protocole fourni avec le kit Human
IL-12
Standard ABTS ELISA Development Kit (Peprotech).
III. Résultats :
L'analyse spécifique par RT-qPCR permet de mettre en évidence le transfert
d'ARN codant pour un antigène et une protéine immunomodulatrice, par des
particules
RLP dans des CPA, en particulier dans des cellules U937 et dans des cellules
dendritiques humaines immatures (hDC), à 5h et 20h post-transduction
(respectivement Figures XXXII et XXXIII, XXXIV et XXXV). Les résultats obtenus
sont
analysés et interprétés selon la présence ou non d'une amplification
spécifique et
significative au cours de la PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR). Les
résultats
sont normalisés par rapport aux valeurs obtenues pour les cellules contrôles
non
transduites (U937 NT et hDC NT). Ces contrôles expriment de l'ARN endogène
codant
pour l'IL12 (résultats non montrés). Il est connu que les cellules
dendritiques
produisent de l'1 L12, lequel joue un rôle dans la réponse des lymphocytes T
in vivo.
Dans le cas de la lignée cellulaire U937, les quantités relatives des
différents
ARNs sont significatives à 5h post transduction (Figure XXXII) et à 20h post-
transduction (Figure XXXIII).
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Dans le cas des cellules primaires hDC, les niveaux d'ARN spécifiques relatifs
sont significatifs à 20h (Figure XXXV) même s'ils sont moins importants à 5h
(Figure
XXXIV). Enfin, l'analyse des surnageants de culture par ELISA (Figure XXXVI)
met en
évidence une forte augmentation des niveaux d'IL12 sécrétés par les hDC, 48h
après
transduction par les particules RLP-PS-MAGEA3/IL-12.
Les particules RLP sont donc efficaces pour le transfert dans des CPA (lignées
et cellules primaires) de différentes molécules d'ARNs codant pour un peptide
antigénique et pour une protéine immuno-modulatrice comme l'IL-12. Les
particules
RLP s'inscrivent donc dans une stratégie d'immunothérapie, basée sur une
modulation
de la spécificité de la réponse immune, par le transfert dans des CPA d'ARNs
codant
pour des antigènes et pour des protéines immunomodulatrices .
Il est donc possible de moduler finement la réponse immmunitaire. D'une part
au niveau de sa spécificité, via l'utilisation de particules RLP contenant des
ARNs
codant pour différents antigènes comme montré dans l'Exemple 4, et d'autre
part en
combinant cette stratégie à l'induction de réponses stimulantes par une
protéine
immunomodulatrice. Le fait de délivrer en même temps dans les cellules cibles
ex vivo
ou in vivo à la fois des antigènes et des immunomodulateurs en une seule
intervention
fournit donc un avantage clinique conséquent.
EXEMPLE 7 : Efficacité d'une particule lentivirale PP7 (NC)-RLP dans des
cellules immunitaires
I. Préparation de la particule virale selon l'invention et des
systèmes
comparatifs
1. Constructions des plasmides
= Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide d'expression
est porteur d'une cassette d'expression telle que décrite en Figure XXIII avec
ou non
une séquence intronique ou stabilisatrice d'ARN. Afin de véhiculer les ARNm
dans les
particules lentivirales, 2 répétitions du motif tige-boucle de l'ARN PP7 :
séquence
ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N 2) suivie de la séquence
ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag (SEQ ID N 3) ont été insérées au sein
d'une cassette d'expression en aval du gène rapporteur (Figure XXIII).
Le promoteur utilisé peut être celui du CMV ou EF1 (Figure XXIII). La séquence
d'intérêt peut être un ADN codant une protéine reportrice comme la Luciferase
Firefly
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native (Figure XV), une protéine fluorescente verte (ZsGreen1), rouge
(mCherry) ou
bleue (mtBFP), ou un ADNc codant une protéine, par exemple protéine CRE.
Préférentiellement, l'ADNc code une protéine immunogène ou une protéine
immunomodulatrice. La séquence d'intérêt peut également être celle d'un shRNA,
d'un miRNA, d'un sgRNA, d'un LncRNA ou d'un circRNA.
= Plasmide d'encapsidation : La particule lentivirale a été modifiée pour
contenir au sein de la protéine de nucléocapside, en lieu et place du second
domaine
en doigt de Zn, la séquence de la protéine Coat du bactériophage PP7
(Figure
XXXVII). Le plasmide d'encapsidation p8.74, porteur des gènes codant les
protéines
de structures et de fonction (Gag, Pol), utilisé pour la production des
particules
PP7RLP est modifié selon la stratégie suivante : ce plasmide p8.74 est utilisé
pour
générer, par PCR d'assemblage, un plasmide dépourvu du second doigt de zinc de
la
protéine de nucléocapside p8.74.82F. Le second doigt de zinc est substitué par
la
protéine Coat du phage MS2 par clonage Hpal, pour générer le plasmide
p8.74.82F-
PP7-Coat. La séquence codant Pol peut être délétée ou mutée dans certains
éléments
de fonction comme par exemple la séquence codant la transcriptase inverse (RT)
ou
l'intégrase (IN) sans altérer la fonction des PP7RLP.
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant
une protéine d'enveloppe, qui peut être la VSV-G codant la protéine
d'enveloppe du
Virus de la stomatite vésiculaire (dont la cassette d'expression est telle que
décrite en
Figure III).
2. Production, concentration/purification et titration des particules
lentivi raies
Les particules lentivirales sont produites comme décrit à l'Exemple 1, selon
le
procédé P2, en utilisant le plasmide d'expression
pcDNA-
EF1.RapporteurFluorescent.PP7 2X décrit en Figure XXIII.
Il. Transduction de cellules dendritiques murines (BMDC)
La préparation des cellules dendritiques murines est effectuée selon un
procédé
identique à celui décrit à l'Exemple 1.
1. Transduction des cellules dendritiques murines avec PP7 (NC)-
RLP.ZsGreen1
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Les cellules dendritiques sont transduites par le vecteur PP7 (NC)-
RLP.ZsGreen1 comme décrit dans l'Exemple 1 (II, paragraphe 2.4), à une dose de
1
pg p24 par cellule et analysées sur leur viabilité et l'expression de la
fluorescence
ZsGreen1 par cytométrie en flux à différents temps d'analyse (1, 2 et 3 jours
post-
transduction). Un contrôle négatif de transduction est préparé avec uniquement
le
milieu contenant l'agent de transduction Polybrene à 4pg/mL (Sigma).
La viabilité des cellules dendritiques est réalisée grâce à un immunomarquage
spécifique ViobilityTM 485/520 (Miltenyi Biotec) et analysée par cytométrie
en flux.
2. Phénotypage et caractérisation des cellules
2.1 Immunomarquaqe des cellules dendritiques murines
A chaque temps d'analyse, les cellules sont transférées dans les puits d'une
plaque de culture 96 puits à fond conique. Les cellules sont lavées avec une
solution
de PBS 1X pH 7,4 et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est
éliminé par retournement.
La viabilité des cellules dendritiques est réalisée par immunomarquage
spécifique avec le ViobilityTM 485/520 (Miltenyi Biotec) selon un procédé
identique
à celui décrit dans l'exemple 1 au paragraphe 11.3.3.
2.2 Cytométrie en flux
Les cellules dendritiques immunomarquées sont analysées en cytométrie en
flux (Miltenyi Biotec) et analysées. Les échantillons ont été calibrés selon
leur taille
(SSC) et leur granulosité (FSC). Les cellules marquées au ViobilityTM sont
mortes, les
cellules viables sont donc les cellules négatives (marquage par exclusion).
Les cellules
sont caractérisées sur le MacsQuantVYB (Miltenyi Biotec) et analysées avec le
logiciel
MacsQuant (Miltenyi Biotec).
III. Résultats: Cinétique d'expression de la ZsGreen1 et viabilité des BMDC
La Figure XXXVIII montre que les BMDC murines transduites avec 1pg
p24/cellule de particules PP7 (NC)-RLP expriment la ZsGreen1 pour 50% d'entre
elles
dès 24h post transduction. Trois jours post transduction les BMDC sont moins
viables,
20% seulement d'entre elles expriment la ZsGreen1 et à une intensité de
fluorescence
plus faible. Cela s'explique du fait que les particules PP7(NC)-RLP se
produisent à des
concentrations inférieures en comparaison avec les particules MS2RLP ou PP7
(IN)-
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RLP et la transduction des BMDC à des doses équivalentes nécessite donc
d'utiliser
de plus gros volumes de suspension lentivirales lesquels diluent d'autant le
milieu de
culture contenant les nutriments vitaux aux cellules. Cela est encore plus
notable pour
la culture de cellules primaires sensibles comme le sont les BMDC murines. Il
reste
néanmoins possible de véhiculer des ARN dans les particules lentivirales
modifiées
avec PP7-Coat dans la nucléocapside.
EXEMPLE 8 : Impact du précurseur GAG-POL sauvage pour la production
des particules MS2RLP-ZsGreen1 12X en vue de l'optimisation des particules
MS2RLP, PP7RLP et/ou PP7 (IN)-RLP
I. Préparation de la particule virale selon l'invention et des systèmes
comparatifs
1. Constructions des plasmides
1.1 Plasmides pour la production d'une particule lentivirale MS2RLP selon
l'invention
= Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Ce plasmide est
identique
à celui décrit à l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que
décrite en
Figure l).
= Plasmides d'encapsidation : Ces plasmides sont identiques à ceux décrits
à
l'Exemple 1 : p8.7432F-MS2-Coat (dont la cassette d'expression est illustrée
en Figure
Il) et le plasmide p8.74 (dont la cassette d'expression est illustrée en
Figure V)
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit
à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure
III).
1.2 Plasmides pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs ILV
= Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Ce plasmide est
identique
à celui décrit à l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que
décrite en
Figure IVb).
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure V).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit
à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure
III).
2. Productions des lots
2.1 Production des particules lentivirales et des vecteurs lentiviraux
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Les productions sont réalisées en CelISTACK 10 étages (6360 cm2, Corning)
avec des cellules de production HEK293T (ATCC, CRL-11268), cultivées dans
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Paisley, UK) supplémenté par
1% pénicilline/streptomycine et 1% d'ultraglutamine (PAA) à 37 C en atmosphère
humide à 5% CO2
La production des particules MS2RLP est réalisée par transfection des quatre
plasmides suivants :
- Le plasmide
d'expression décrit ci-avant, dont la cassette
d'expression est illustrée en Figure I ;
- p8.74.82F-MS2-Coat
(dont la cassette d'expression est illustrée
en Figure II) et le plasmide p8.74 (dont la cassette d'expression est
illustrée
en Figure V), en utilisant quatre ratios différents des deux plasmides
d'encapsidation, respectivement [100% - 0%] ; [90% - 10%] ; [80% - 20%] et
[50% - 50%] ;
- pENV portant
l'enveloppe VSV-G (dont la cassette d'expression
est illustrée en Figure III).
Les particules lentivirales MS2RLP-ZsGreen1 12X sont produites comme décrit à
l'Exemple 1, c'est-à-dire avec les proportions respectives des plasmides
suivantes:
40% du plasmide d'expression, 30% du plasmide p8.74 (ou p8.74AZF), 30% du
plasmide pENV (ratio [100% - 0%]).
- Plus particulièrement,
les proportions respectives des plasmides
sont les suivantes:
- - ratio [90% - 10%]
:40% du plasmide d'expression, 27% du
plasmide p8.74AZF, 3% du plasmide p8.74, 30% du plasmide pENV;
- - ratio [80% - 20%] :
40% du plasmide d'expression, 24% du
plasmide p8.74AZF, 6% du plasmide p8.74, 30% du plasmide pENV
- - ratio [50% - 50%] :
40% du plasmide d'expression, 15% du
plasmide p8.74AZF, 15% du plasmide p8.74, 30% du plasmide pENV.
Dans le cas d'une production de particules lentivirales RLP-AATs, les
proportions
de plasmides décrites ci-avant restent inchangées.
24 heures après transfection standard au phosphate de calcium, le surnageant
de culture est remplacé par du milieu DMEM frais et non supplémenté. Les
cellules de
production sont incubées à 37 C / 5% 002. Après changement du milieu, le
surnageant est collecté quatre fois (32h, 48h, 56h et 72h post transfection).
Chaque
récupération est clarifiée par centrifugation 5min à 3000g avant d'être
microfiltrée sur
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filtre de 0,45 m (Stericup , Millipore). Toutes les récupérations sont alors
mélangées
pour composer le surnageant brut.
Les vecteurs lentiviraux intégratifs ILV-ZsGreen1 contenant la cassette
d'expression EF1-ZsGreen1 sont produits en contrôle, tel que décrit à
l'Exemple 1.
2.2 Concentration et purification des particules lentivirales
Les particules lentivirales et les vecteurs lentiviraux sont concentrés et
purifiés
selon le procédé P1 décrit à l'Exemple 1.
3. Titration
Les particules lentivirales et les vecteurs lentiviraux sont titrés comme
décrit dans
l'Exemple 1.
Il. Transduction
1. Préparation des cellules cibles Jurkat et transduction par des particules
lentivirales MS2RLP 12X selon l'invention
Des cellules cibles Jurkat (ATCC TIB-152) sont ensemencées à 200000
cellules/mL en plaque 96 puits, transduites par les particules MS2RLP selon
deux
doses (2 et 10 pg p24/cellule), ou par des vecteurs lentiviraux contrôles ILV-
ZsGreen1
à M0140, en présence de 41..tg/mL Polybrene puis incubées à 37 C / 5% CO2. Un
inhibiteur des mécanismes de défense cellulaire, le BX795 (lnvivogen), est
utilisé à une
concentration de 6 1.1M dans le cas des particules MS2RLP. Le surnageant de
transduction est éliminé 5 heures après et remplacé par du milieu de culture
supplémenté frais. 24h post-transduction, les cellules cibles sont récupérées
et le
pourcentage de cellules exprimant la ZsGreen1 est quantifié par cytométrie
(Macs
Quant VYB, Miltenyi Biotec).
2. Analyse de la maturation des particules virales MS2RLP par Western blot
anti-p24
48h après la transfection des cellules de production (HEK293T) avec les
plasmides de production des particules MS2RLP, les surnageants de cultures
sont
récupérés puis concentrés selon le procédé Pi, tel que décrit à l'Exemple 1,
et titrés
par quantification de la protéine p24, tel que décrit à l'Exemple 1.
L'équivalent de 15ng
de p24 sont chargés pour chaque condition de ratio des plasmides p8.74.82F-MS2-
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WO 2017/194903 88 PCT/FR2017/051165
Coat/p8.74 sur un gel dénaturant SDS-PAGE 4/12% puis migrés 1h à 200V en
tampon
MOPS1X. Après transfert sur membrane de nylon, les protéines sont hybridées
avec
un anticorps anti-p24 (clone 39/5.4A, Abcam). Le western blot est révélé à
l'aide du kit
PierceTM Fast Western Blot Kit, ECL Substrate (Pierce). La visualisation des
bandes
est réalisée par chimioluminescence sur film d'autoradiographie.
III. Résultats
Cet exemple vise à montrer qu'il est possible d'améliorer la fonctionnalité
des
particules MS2RLP et PP7RLP pour le transfert d'ARN codants pour des antigènes
différents ou pour le transfert d'ARN codants pour des antigènes et pour une
protéine
immunomodulatrice. Ceci passe par l'amélioration de la maturation du
précurseur GAG
lors de la production des particules, démontré par la preuve de concept sur la
production de particules MS2RLP. Le plasmide p8.74.82F-MS2 permet l'expression
d'un précurseur GAG comportant la protéine Coat du bactériophage à la place du
second doigt de Zinc de la protéine Nucléocapside. Cette protéine Coat est
susceptible
de perturber la maturation du précurseur GAG, lorsqu'il est clivé en trois
protéines : la
protéine de Matrice, la protéine de Capside et la protéine de Nucléocapside.
Ces trois
protéines sont indispensables à la structure des particules virales.
L'apport du précurseur GAG sauvage, par le plasmide p8.74 en plus du plasmide
d'encapsidation p8.74.82F-MS2-Coat lors de la production des particules MS2RLP-
ZsGreen1 12X pourrait permettre d'augmenter la maturation du précurseur GAG
lorsqu'il est exprimé grâce au plasmide p8.74.82F-MS2, et ainsi, augmenter la
fonctionnalité des particules MS2RLP et PP7RLP.
L'objectif de cette expérience est d'évaluer l'impact du plasmide p8.74
lorsqu'il
est co-transfecté, dans les cellules de production des particules MS2RLP et
PP7RLP,
en même temps que le plasmide d'encapsidation p8.74.82F-MS2-Coat permettant
d'améliorer la maturation du précurseur GAG, et ainsi rendre les particules
finales plus
fonctionnelles pour la transduction de cellules cibles.
Dans cet exemple, quatre ratios de plasmides d'encapsidation p8.74.82F-MS2-
Coat/p8.74 sont testés : 100/0; 90/10; 80/20 et 50/50. Un vecteur intégratif
ILV
exprimant la ZsGreen1 est utilisé comme contrôle. Les cellules sont
transduites selon
deux quantités de p24/m1 : 2 pg p24/cellule (Figure XXXIX) et 10 pg
p24/cellule (Figure
XXXX).
Dans un premier temps, les résultats présentés sur la Figure XXXIX montrent
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WO 2017/194903 89 PCT/FR2017/051165
que pour les cellules non transduites, le pourcentage de cellules
fluorescentes est très
proche de 0, alors que les cellules transduites par les particules MS2RLP-
ZsGreen1
12X sont fluorescentes à plus de 99% quelque soit le ratio de plasmides
d'encapsidation utilisé. Il est important de noter que l'intensité de
fluorescence de la
ZsGreen1 augmente en fonction de l'augmentation de la quantité du plasmide
p8.74.
Les cellules transduites par les particules MS2RLP-ZsGreen1 12X produites avec
50%
du plasmide d'encapsidation p8.74.82F-MS2-Coat et 50% du plasmide p8.74
présentent une intensité de fluorescence de 7,76 alors que celle des cellules
transduites par les particules MS2RLP-ZsGreen1 12X produites uniquement avec
le
plasmide d'encapsidation p8.74.82F-MS2-Coat est de 3,5.
La Figure XXXX montre le même résultat en termes de pourcentage de cellules
transduites. Concernant l'intensité de fluorescence, plus la quantité de
plasmide p8.74
augmente, et plus l'intensité de fluorescence augmente, comme montré en Figure
XXXIX. Les cellules transduites par les particules MS2RLP-ZsGreen1 12X
produites
avec 50% du plasmide d'encapsidation p8.74.82F-MS2-Coat et 50% du plasmide
p8.74
présentent une intensité de fluorescence de 60,67 alors que celle des cellules
transduites par les particules MS2RLP-ZsGreen1 12X produites uniquement avec
le
plasmide d'encapsidation p8.74.82F-MS2-Coat est de 11,48.
Cela signifie qu'aux doses de 2pg et 10pg p24/cellule, la fluorescence obtenue
est respectivement deux et cinq fois plus importante lorsque les particules
sont
produites avec 50% du plasmide d'encapsidation p8.74.82F-MS2-Coat et 50% du
plasmide p8.74 que lorsqu'elles sont produites uniquement avec le plasmide
p8.7432F-MS2-Coat.
L'utilisation du plasmide p8.74 lors de la production de particules MS2RLP, en
co-transfection avec le plasmide p8.74.82F-MS2-Coat, a donc apporté un gain
sur
l'amélioration de la fonctionnalité des particules MS2RLP-ZsGreen1 12X, en vue
d'une
optimisation des particules MS2RLP pour le transfert d'ARN codants pour des
antigènes différents ou pour le transfert d'ARN codants pour des antigènes et
pour une
protéine immunomodulatrice.
La Figure XXXXI montre la maturation des particules MS2RLP-ZsGreen1 12X
sur le plan biochimique, par recherche de la protéine p24 dans le surnageant
de
production contenant les particules. Elle correspond à une analyse des
surnageants
viraux par western blot anti-p24, selon deux temps d'exposition du film
d'autoradiographie, une minute (Figure XXXXIa) et quinze secondes (Figure
XXXXIb).
Dans le cas d'une particule lentivirale intégrative dérivée de HIV, produite
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uniquement avec le plasmide p8.74 en tant que plasmide d'encapsidation, la
protéine
p24 est détectable à quatre niveaux :
- dans le précurseur protéique p160 (GAG-POL)
- dans le précurseur protéique p55 (GAG),
- à l'état de protéine mature (p24)
- dans d'autres précurseurs protéiques intermédiaires en cours de
maturation (entre p160 et p55, et entre p55 et p24).
Si la maturation se fait normalement, la protéine p24 doit être détectée en
quantité plus importante à l'état mature (p24) qu'à l'état de précurseurs
protéiques
(p160, p55) ou de précurseurs protéiques intermédiaires. En effet, la
maturation des
particules virales se fait après la libération de la particule par la cellule
de production.
Autrement dit, lors de leur production, les particules bourgeonnent à la
surface de la
cellule de production, puis sont libérées de la cellule à l'état de particules
immatures.
Ce n'est qu'après la libération des particules dans le surnageant, que les
précurseurs
protéiques GAG-POL et GAG maturent en protéines définitives.
Dans le cas d'une particule MS2RLP ou PP7RLP dérivée de HIV, produite
uniquement avec le plasmide p8.74.82F-MS2-Coat en tant que plasmide
d'encapsidation, la protéine p24 est détectable à quatre niveaux :
- dans le précurseur protéique p172 (GAG.82F-MS2-Coat-POL)
- dans le précurseur protéique p67 (GAG.82F-MS2-Coat),
- à l'état de protéine mature (p24)
- dans d'autres précurseurs protéiques intermédiaires en cours de
maturation (entre p172 et p67, et entre p67 et p24).
Dans cette particule MS2RLP-ZsGreen1 12X, chaque précurseur est plus lourd de
12kDa, ce qui correspond à la taille de la protéine Coat du bactériophage M52
insérée
dans le second doigt de zinc de la protéine Nucléocapside.
La figure XXXXI montre, sur la piste ILV, les différentes formes de
précurseurs
protéiques, p160 (GAG-POL), p55 (GAG) ainsi que la protéine p24 parfaitement
mature. Il y a une majorité de protéine p24 mature, comparée aux formes
précurseurs
protéiques. Sur la piste 100/0, correspondant à des particules MS2RLP-ZsGreen1
12X
produites uniquement avec le plasmide p8.74.82F-MS2-Coat en tant que plasmide
d'encapsidation, la proportion de précurseurs/protéine p24 mature augmente par
rapport à l'ILV, montrant que l'insertion de la protéine Coat du bactériophage
MS2
diminue la maturation des particules virales. Sur les pistes 90/10, 80/20 et
50/50, la
proportion de précurseurs protéiques p172 et p67 diminue au profit
respectivement des
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WO 2017/194903 91 PCT/FR2017/051165
précurseurs protéiques p160 et p55, pour arriver à un même niveau d'expression
pour
la piste 50/50. L'ajout du plasmide p8.74 au plasmide p8.7432F-MS2-Coat, en
tant
que plasmide d'encapsidation pour la production de particules a pour
conséquence
l'augmentation de la proportion de la protéine p24 mature (Figure XXXXIb, 15
secondes d'exposition). Ce résultat montre que pour favoriser la maturation
des
précurseurs protéiques dans les particules MS2RLP, il est possible de rajouter
au
moins 10% de plasmide p8.74 en plus du plasmide p8.7432F-MS2-Coat en tant que
plasmide d'encapsidation pour la production de particules. La production des
particules
MS2RLP utilisant au moins 10% de plasmide p8.74 en plus du plasmide p8.74.82F-
MS2-Coat en tant que plasmide d'encapsidation permet non seulement une
augmentation de la maturation des précurseurs en protéines matures, mais en
plus
permet d'augmenter la fonctionnalité des particules après transduction de
cellules
cibles.
En conclusion, l'utilisation du plasmide p8.74 lors de la production de
particules
selon l'invention, en co-transfection avec le plasmide p8.7432F-MS2-Coat
permet
l'optimisation des particules selon l'invention pour le transfert d'ARN
codants pour des
antigènes différents ou pour le transfert d'ARN codants pour des antigènes et
pour une
protéine immunomodulatrice.
EXEMPLE 9: Recrutement d'ARN non viraux dirigé par deux séquences
d'encapsidation différentes (MS2 et PP7) en vue de l'optimisation du transfert
efficace d'ARN codants pour des antigènes différents ou pour le transfert
d'ARN
codants pour des antigènes et pour une protéine immunomodulatrice, par une
particule RLP (modulation des types d'ARN encapsidés)
I. Préparation de la particule virale selon l'invention et des systèmes
comparatifs
1. Constructions des plasmides
1.1 Plasmides pour la production de particules lentivirales MS2/PP7-(NC) RLP
12X 2X selon l'invention
= Plasmides d'expression d'une séquence d'intérêt : Ces plasmides sont
identiques à celui décrit à l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est
telle que
décrite en Figure I) et à l'Exemple 7 (dont la cassette d'expression est telle
que décrite
en Figure XXIII).
= Plasmides d'encapsidation : Ces plasmides sont identiques à celui décrit à
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WO 2017/194903 92 PCT/FR2017/051165
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure II)
et à
l'Exemple 7 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure
XXXVI I).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant
une protéine d'enveloppe, qui peut être la VSV-G codant la protéine
d'enveloppe du
Virus de la stomatite vésiculaire (Figure III).
Préférentiellement, ces plasmides sont utilisés pour la production de
particules
lentivirales MS2/PP7-RLP-mCherry 12X- ZsGreen1 2X.
1.2 Plasmides pour la production de particules lentivirales contrôles MS2-(NC)
RLP 12X selon l'invention
= Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Ce plasmide est
identique
à celui décrit à l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que
décrite en
Figure l).
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure
II).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit
à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure
III).
Préférentiellement, ces plasmides sont utilisés pour la production de
particules
lentivirales MS2RLP-mCherry 12X.
1.3 Plasmides pour la production de particules lentivirales contrôles PP7-(NC)
RLP
2X selon l'invention
= Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Ce plasmide est
identique
à celui décrit à l'Exemple 7 (dont la cassette d'expression est telle que
décrite en
Figure XXIII).
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 7 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure
XXXVI I).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant
une protéine d'enveloppe, qui peut être la VSV-G codant la protéine
d'enveloppe du
Virus de la stomatite vésiculaire (Figure III).
Préférentiellement, ces plasmides sont utilisés pour la production de
particules
lentivirales PP7RLP-ZsGreen1 2X.
2. Productions des lots
Après la transfection des plasmides sur des cellules de production, les
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WO 2017/194903 93 PCT/FR2017/051165
surnageants sont récoltés et utilisés bruts ou concentrés/purifiés selon l'un
des
procédés P1 ou P2 mentionnés précédemment et décrits dans la demande WO
2013/014537.
2.1 Production des particules lentivirales
Les productions sont réalisées en CelISTACK 10 étages (6360 cm2, Corning)
avec des cellules de production HEK293T (ATCC, CRL-11268), cultivées dans
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Paisley, UK) supplémenté par
1% pénicilline/stréptomycine et 1% d'ultraglutamine (PAA) à 37 C en atmosphère
humide à 5% CO2
La production des particules lentivirales MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X,
préférentiellement MS2/PP7-RLP-mCherry 12X- ZsGreen1 2X, est réalisée par
transfection des cinq plasmides suivants :
- Les deux plasmides d'expression décrits ci-avant dont le plasmide
pcDNA.EF1.mCherry.MS2 12X (dont la cassette d'expression est illustrée
en Figure I) et le plasmide pcDNA.EF1.ZsGreen1.PP7 2X (dont la cassette
d'expression est illustrée en Figure XXIII) utilisés en quantité simple ou
double;
- p8.74.82F-PP7-Coat (50%) dont la cassette d'expression est illustrée en
Figure XXXVII et p8.7432F-MS2-Coat (50%) dont la cassette d'expression
est illustrée en Figure II;
- pENV portant l'enveloppe VSV-G dont la cassette d'expression est illustrée
en Figure III.
La production des particules lentivirales contrôles MS2-(NC) RLP 12X,
préférentiellement MS2-RLP-mCherry 12X, est réalisée par transfection des
trois
plasmides suivants :
- Le plasmide d'expression décrit ci-avant pcDNA.EF1.mCherry.MS2 12X
(dont la cassette d'expression est illustrée en Figure I) ;
-
p8.74.82F-MS2-Coat dont la cassette d'expression est illustrée en Figure II ;
- pENV portant l'enveloppe VSV-G dont la cassette d'expression est illustrée
en Figure III.
La production des particules lentivirales contrôles PP7-(NC) RLP 2X,
préférentiellement PP7-RLP-ZsGreen1 2X, est réalisée par transfection des
trois
plasmides suivants :
- Le plasmide d'expression décrit ci-avant pcDNA.EF1.ZsGreen1.PP7 2X
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(dont la cassette d'expression est illustrée en Figure XXIII);
- p8.74.82F-PP7-Coat dont la cassette d'expression est illustrée en
Figure XXXVII ;
- pENV portant l'enveloppe VSV-G dont la cassette d'expression est illustrée
en Figure III.
24 heures après transfection standard au phosphate de calcium, le surnageant
de culture est remplacé par du milieu DMEM frais et non supplémenté. Les
cellules de
production sont incubées à 37 C / 5% 002. Après changement du milieu, le
surnageant est collecté quatre fois (32h, 48h, 56h et 72h post transfection).
Chaque
récupération est clarifiée par centrifugation 5min à 3000g avant d'être
microfiltrée sur
filtre de 0,45 m (Stericup , Millipore). Toutes les récupérations sont alors
mélangées
pour composer le surnageant brut.
2.2 Concentration et purification des particules lentivirales
Les particules lentivirales sont concentrées et purifiées selon le procédé P1
décrit à l'Exemple 1.
3. Titration des lots de particules lentivirales
Les particules lentivirales sont titrées comme décrit dans l'Exemple 1.
4. Transduction par des particules lentivirales MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X
selon l'invention
Cet exemple est réalisé en utilisant des particules MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X
permettant le transfert de plusieurs types d'ARNs et donc l'expression de
plusieurs
protéines différentes (ZsGreen1 + mCherry).
Des cellules cibles HCT116 (ATCC, COL-247) sont ensemencées en plaque 24
puits et incubées 24h à 37 C / 5% CO2 et ont été transduites par les
particules
MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X à une dose de 10pg p24/ce11u1e.
Les contrôles réalisés sont les suivants :
- Transduction avec les particules lentivirales MS2RLP-mCherry 12X et
PP7RLP-ZsGreen1 2X, à une dose de 10pg p24/ce11u1e chacune ;
- Transduction avec les particules lentivirales MS2RLP-mCherry 12X
seul, à
une dose de 10pg p24/ce11u1e ;
-
Transduction avec les particules lentivirales PP7RLP-ZsGreen1 2X seul, à
une dose de 10pg p24/ce11u1e.
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WO 2017/194903 95 PCT/FR2017/051165
La transduction par les particules lentivirales est réalisée en présence de
81..tg/mL de Polybrene . Un inhibiteur des mécanismes de défense cellulaire,
le BX795
(Invivogen), est utilisé à une concentration de 6 1.1M dans le cas des
particules
MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X, MS2RLP-mCherry 12X et PP7RLP-ZsGreen1 2X. Les
cellules cibles sont récupérées à 48h post-transduction et le pourcentage de
cellules
exprimant la ZsGreen1 et la mCherry est quantifié par cytométrie (Macs Quant
VYB,
Miltenyi Biotec).
Il. Résultats
La Figure XXXXII illustre l'efficacité des particules MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X
pour le transfert d'ARN encapsidés par les séquences d'encapsidation provenant
des
bactériophages MS2 et PP7 dans des cellules cibles HCT116. La Figure montre
que
la proportion de cellules bifluorescentes est de 97% après transduction des
particules
MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X et de 98% après transduction des particules MS2RLP-
mCherry 12X et PP7RLP-ZsGreen1 2X à 20pg p24/cellule. On observe donc le même
ordre d'efficacité de transduction avec les particules MS2/PP7-(NC) RLP 12X
2X, pour
une dose deux fois moins importante de MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X.
Les cellules cibles transduites par les particules MS2RLP-mCherry 12X seules
ou
PP7RLP-ZsGreen1 2X seules présentent un pourcentage d'efficacité de
transduction
similaire au pourcentage obtenu après transduction des cellules cibles par les
particules MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X pour une seule protéine fluorescente. Les
résultats montrent donc que les particules RLP sont capables de transporter et
de
transférer au moins 2 types d'ARN encapsidés par deux systèmes différents (PP7
et
MS2) en une seule transduction des cellules cibles.
La mise en évidence de la capacité de transfert de différents types d'ARN
dirigés par deux séquences d'encapsidation différentes, MS2 et PP7, en une
seule
transduction d'un même lot de RLP représente un gain significatif sur la
modulation
des types d'ARN encapsidés, en particulier pour le transfert efficace d'ARN
codants
pour des antigènes différents ou pour le transfert d'ARN codants pour des
antigènes et
pour une protéine immunomodulatrice.
