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NOUVELLES COMPOSITIONS ACTIVES SUR LES ADIPOCYTES
La présente invention concerne le domaine technique des produits cosmétiques
de
comblement, des biomatériaux, des matériaux de reconstruction physiologique
cutanée, de la
médecine régénérative, de la chirurgie réparatrice en particulier de
l'antivieillissement cutané,
.. chez l'Homme ou éventuellement l'animal. En particulier, la présente
invention concerne une
composition aqueuse de chitosane permettant de viser spécifiquement les
adipocytes.
L'invention a également pour objet de telles compositions pour leur
utilisation comme
composition dermatologique, cosmétique, ou encore comme dispositif médical,
avantageusement comme implant biorésorbable.
Différents produits de comblement injectables notamment chez l'être humain
sont déjà
connus.
Le collagène a longtemps été le produit de choix comme produit de comblement
pour le
visage, en particulier pour le comblement des rides et des ridules ou encore
pour réourler les
lèvres. Cependant, depuis la mise sur le marché des acides hyaluroniques, ces
derniers sont
les plus utilisés. En effet, à la biodégradabilité du collagène jugée trop
rapide, s'ajoutent les
problèmes de sécurité liés à l'origine animale (bovine ou porcine) de celui-
ci. L'injection
directe d'acide hyaluronique présente l'avantage d'avoir un effet de
comblement immédiat
associé à une réaction inflammatoire mineure, du fait de sa biocompatibilité.
Toutefois, son
implantation est associée à une biodégradation rapide qui rend le produit
insatisfaisant, même
.. si la durée de vie du produit injecté a pu être prolongée grâce à
l'utilisation d'acides
hyaluroniques réticulés. Néanmoins, les produits les plus utilisés aujourd'hui
en médecine et
chirurgie esthétique sont des produits résorbables dont la durée de vie est
généralement
inférieure à 12 mois. On trouve encore sur le marché des produits de
comblement qualifiés de
permanents , dans le sens où leur biorésorption peut nécessiter plusieurs
années. Ces
produits contiennent entre autres des polymères synthétiques ou
biosynthétiques, tels que des
dérivés acryliques, des polyacrylamides, qui induisent une encapsulation
fibreuse importante
à l'origine de la longévité du comblement. Toutefois, la persistance du
produit injecté dans les
tissus présente un risque de complications à long terme ou de phénomènes
inflammatoires à
retardement, par exemple la formation de granulomes inflammatoires, kystes...
plusieurs
mois, voire plusieurs années, après leur injection.
D'autres produits synthétiques constituent une alternative intéressante : il
s'agit de PLA (acide
polylactique), un polymère dont la biodégradation est plus lente que celle des
autres
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polymères naturels, tels que le collagène ou l'acide hyaluronique. On estime
en effet que le
comblement persiste jusqu'à deux ans après l'injection. Ces produits ont été
commercialisés
notamment sous le nom de New-Fill@ (ou Sculptra@). Le principal défaut de
cette
technologie est que l'effet de comblement n'est visible qu'après un délai de
huit semaines, ce
qui n'apporte pas une complète satisfaction au patient. Par ailleurs, la
fibrose observée lors de
l'utilisation de produits non dégradables est apparue de grand intérêt en
terme d'effet
esthétique à long terme, et c'est ainsi qu'ont été développés des produits de
comblement
qualifiés de semi-permanents qui, par leur composition hétérogène
particules-vecteurs
ont un effet pro-fibrotique tout en demeurant biodégradables. On citera par
exemple le produit
Atlean@ qui propose une dispersion de particules de TCP (phosphate
tricalcique) dans de
l'acide hyaluronique et le produit Radiesse@ qui propose une dispersion de
particules
d'hydroxyapatite de calcium dans un gel de carboxyméthyl cellulose. Dans tous
les cas, le gel
vecteur assure l'effet esthétique de comblement immédiat, tandis que les
particules génèrent
petit à petit une fibrose qui garantit l'effet à long terme. L'intérêt de ces
produits, outre ce
double mécanisme d'action (mécanique et inducteur de tissu), est qu'ils sont
finalement
totalement résorbés.
Dans ce contexte, le chitosane est une autre molécule ayant trouvé son intérêt
dans le
domaine. En effet, le chitosane, de par sa structure chimique unique et
biomimétique, se
comporte vis-à-vis de l'organisme comme un leurre du milieu biologique (A.
Montembault, K. Tahiri, C. Korwin-Zmijowska, X, Chevalier, M. Corvol,
A.Domard,
Biochimie, 88 (2006), 551-64): d'une part, il est suffisamment reconnu
pour ne pas induire
de réaction inflammatoire dangereuse, et d'autre part suffisamment méconnu
pour ne pas
être dégradé trop rapidement.
La molécule est en effet constituée d'une succession de motifs N-acétyl-D-
glucosamine et D-
glucosamine, le premier étant un constituant de molécules de la matrice
extracellulaire (on
trouve ce résidu dans l'acide hyaluronique par exemple), et le second étant
complètement
absent de celle-ci, le chitosane est donc plus difficile à dégrader d'un point
de vue biologique.
Par ailleurs, le chitosane est connu dans la littérature pour stimuler
certaines cellules
immunitaires, telles que les macrophages, qui produisent en sa présence une
quantité accrue
de facteurs de croissance. Ces facteurs de croissance sont des médiateurs
biologiques qui
favorisent la production de matrice extracellulaire et la prolifération des
fibroblastes, cellules
productrices des fibres de collagène. Ainsi, le chitosane favorise la synthèse
de tissu fibreux,
ce qui permet un comblement biologique à long terme, notamment un
comblement des
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défauts cutanés ou des cavités du corps humain ou du visage, telles que les
rides. Le
Demandeur s'était précédemment attaché au chitosane en vue de l'application
susmentionnée,
ce qui a fait l'objet d'une demande de brevet WO 2013/07964.
Néanmoins, malgré ces avancées, il existe toujours un besoin pour des
molécules et des
moyens pour traiter la peau, permettant le comblement, le traitement des rides
et ridules et
plus généralement ayant une action antivieillissement et/ou la reconstruction
physiologique
cutanée chez l'homme ou éventuellement l'animal. De plus, des compositions
équivalentes
capables de traiter des dépressions cutanées plus importantes, suite à une
chirurgie ou une
maladie sont demandées par les praticiens.
Ainsi, de manière totalement surprenante, le Demandeur s'est aperçu qu'un
effet technique
supplémentaire inattendu sur la peau apparaissait lorsqu'une composition
aqueuse spécifique
de chitosane, inconnue jusqu'à présent, était utilisée. En effet une étude
plus méticuleuse a
permis de mettre en évidence que lorsqu'une solution de chitosane à une
concentration
particulière de ce composé était utilisée, il y avait une action directe sur
les adipocytes
présents dans les couches cutanées. Ainsi, les adipocytes soumis à ce
traitement prolifèrent et
gonflent de manière contrôlée, et permettent à la peau de se raffermir par
comblement des
rides et ridules ou de permettre le comblement de default(s) cutané(s) ou la
reconstruction
volumétrique de tissus. Ce constat a mené le Demandeur à s'intéresser plus
particulièrement
aux adipocytes. Ainsi, plusieurs points ont été dégagés par le Demandeur.
Celui-ci s'est
aperçu d'abord qu'une concentration trop élevée de chitosane, sans en retirer
les autres
bienfaits, pouvait néanmoins s'avérer toxique pour les adipocytes. Il a
également été observé
par le Demandeur que la présence d'au moins un composé de la matrice
extracellulaire dans la
composition aqueuse permet d'augmenter la capture d'acide gras des adipocytes.
In vivo la
composition de chitosane selon la présente invention induit la synthèse de
fibres de collagène.
Au vu des éléments recueillis par le Demandeur, l'ajout d'au moins un
composant de la
matrice extracellulaire (ou un substituant) permet de potentialiser l'action
du chitosane.
Ainsi, le Demandeur propose des compositions aqueuses ayant une action directe
sur les
adipocytes au niveau (sous)-cutané permettant d'ajouter une solution technique
originale à
l'art dans le domaine du traitement de la peau et de la chirurgie
reconstructive.
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RESUME DE L'INVENTION
L'objet de la présente invention concerne une composition aqueuse de chitosane
comprenant
entre 0,1 et 5 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la
composition, pour son
utilisation dans l'augmentation du volume et/ou du nombre d'adipocytes.
En particulier, l'augmentation du volume et/ou du nombre d'adipocytes ainsi
obtenue permet
une utilisation dans le traitement ou la lutte contre le vieillissement de la
peau, pour le
comblement des défauts cutanés tels que les rides ou pour la réparation ou la
reconstruction
des tissus cutanés ou sous-cutanés.
En d'autres termes, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une
composition aqueuse
de chitosane comprenant entre 0,1 et 5 % en poids de chitosane par rapport au
poids total de
la composition, pour augmenter le volume et/ou le nombre d'adipocytes. En
particulier, cette
utilisation est de préférence cosmétique, et non-thérapeutique.
En effet, hormis le fait qu'une injection ou l'introduction d'un implant selon
la présente
invention va de fait combler un volume au niveau cutané ou sous-cutané de par
le volume
inhérent de la composition, ladite composition selon la présente invention va
en outre générer
un gonflement local grâce à son action sur les adipocytes (augmentation du
nombre et/ou du
volume) aux alentours de cette composition. Ainsi, la composition aqueuse
selon la présente
invention peut être utilisée pour le comblement des cavités du corps ou du
visage, telles que
les rides ou les ridules, pour la création ou l'augmentation de volumes du
visage ou du corps
humain, ou encore pour la cicatrisation de la peau.
Les adipocytes sont communément connus pour être des cellules animales
présentes dans les
tissus adipeux, et spécialisées dans le stockage de la graisse. En outre, les
adipocytes sont
également compris au niveau du tissu viscéral et dans l'hypoderme qui est la
couche profonde
de la peau, contenant plus ou moins de tissu adipeux, servant d'interface
entre le derme et les
structures mobiles situées en dessous de lui (organes, muscles etc.). Ainsi,
les adipocytes
sous-cutanés se situent à une profondeur variable de la surface de la peau,
variant de quelques
millimètres à plusieurs centimètres de profondeur. De manière préférée, par
adipocytes
dans le cadre de la présente invention, il est considéré les adipocytes
humains.
L'objet de la présente invention concerne en outre une composition aqueuse
telle que décrite
présentement, pour son utilisation comme composition dermatologique ou encore
comme
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dispositif médical, avantageusement comme implant biorésorbable ou
partiellement
biorésorbable pour l'augmentation du volume et/ou du nombre d' adipocytes.
Par biorésorbable ou biorésorption , on entend une biodégradation qui
aboutit à la
dégradation totale ou essentiellement totale du produit injecté. De manière
avantageuse selon
5 la présente invention, la composition aqueuse présente une bonne
biocompatibilité et est
biorésorbable. En particulier, le produit selon l'invention a une durée de
biorésorption plus
longue que les produits à base d'acide hyaluronique du type acide hyaluronique
réticulé, pour
un effet prolongé, tel qu'un effet de comblement prolongé.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un
composé de la
matrice extracellulaire, et/ou au moins un substituant de la matrice
extracellulaire pour
diminuer la toxicité à l'égard des adipocytes d'une composition aqueuse de
chitosane
comprenant entre 0,1 et 5 % en poids de chitosane par rapport au poids total
de la
composition.
Composition
La présente invention a pour objet une composition aqueuse de chitosane.
Par composition aqueuse on entend une composition comprenant au moins 1% en
poids
d'eau, avantageusement au moins 50% en poids d'eau, encore plus
avantageusement au moins
80% en poids d'eau.
Les pourcentages, de manière générale pour la présente invention, lorsqu'ils
ne sont pas
précisés, correspondent à des pourcentages en poids par rapport au poids total
de la
composition considérée.
De manière préférée, la composition aqueuse de chitosane selon l'invention
présente un pH
inférieur à 8,5, avantageusement compris entre 4 et 7,6. Toutefois, lorsqu'on
souhaite injecter
la composition de chitosane directement dans les tissus qui se trouvent au pH
physiologique
(entre 6,8 et 7,4), il serait souhaitable d'utiliser une composition
présentant un pH le plus
proche possible du pH physiologique afin d'éviter la nécrose des tissus du
fait de l'acidité de
la formulation injectée. Dans un mode de réalisation particulier selon la
présente invention, le
pH de ladite solution est supérieur ou égal à 5,5, avantageusement compris
entre 5,5 et 7,5, de
préférence entre 6,2 et 6,8.
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La composition aqueuse selon la présente invention est avantageusement une
solution
aqueuse de chitosane, une solution gélifiante aqueuse de chitosane ou un gel
aqueux de
chitosane.
Par solution , on entend au sens de la présente invention une composition se
présentant
sous forme liquide, par opposition à une composition gélifiée. Une solution
présente une
phase liquide contenant au moins deux espèces chimiques. Une solution aqueuse
comprend au moins 1% en poids d'eau, avantageusement au moins 50% en poids
d'eau,
encore plus avantageusement au moins 80% en poids d'eau. De manière préférée,
une
solution aqueuse selon la présente invention comprend majoritairement de
l'eau, avec
éventuellement d'autres composés. Avantageusement la solution aqueuse selon la
présente
invention est une solution aqueuse chitosane.
Avantageusement la solution aqueuse selon la présente invention est une
solution aqueuse
homogène de chitosane. Par solution aqueuse homogène de chitosane , on
entend au sens
de la présente invention que tout le polymère de chitosane est solubilisé et
que la solution ne
contient pas de particules solides de chitosane en suspension dans la phase
liquide. La
solution aqueuse ainsi constituée, comprend au moins de l'eau dans les
proportions
mentionnées ci-dessus et du chitosane avec éventuellement d'autres composés.
La solution
aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention est typiquement
transparente.
La composition aqueuse de chitosane selon la présente invention peut être
utilisée pour
former un gel.
Par gel , il pourra être admis selon la présente invention qu'il s'agit d'un
corps ayant un
module de conservation supérieur au module de perte (cf. H.H. Winter, F.
Chambon Analysis
of linear viscoelasticity of a crosslinking polymer at the gel point J.
Rheol., 30 (1986), pp.
367-382). La stabilité et l'intégrité de ce corps sont maintenues soit par des
interactions non
covalentes (gel physique) soit par une réticulation chimique covalente (gel
chimique).
Ce gel peut être formé par toute technique connue dans l'art, par exemple par
une variation de
pH ou de température. Dans un mode de réalisation particulier, la composition
aqueuse selon
la présente invention est gélifiée à un pH compris entre 6 et 9,
avantageusement compris entre
6,5 et 8,5, plus avantageusement compris entre 7 et 8.
De manière préférée, la solution aqueuse (qu'elle soit homogène ou pas) de
chitosane est
d'abord préparée puis gélifiée.
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Par composition ou solution gélifiante aqueuse de chitosane, il est
compris dans le
contexte de la présente invention une composition ou une solution aqueuse de
chitosane telle
que définie ci-dessus, susceptible de fournir un gel aqueux de chitosane, en
particulier
lorsqu'elle est injectée dans le milieu biologique.
.. Ainsi, un objet selon la présente invention concerne un gel obtenu à partir
de la composition
ou solution aqueuse telle que décrite ci-dessus. Dans un mode de réalisation
particulier de la
présente invention, ce gel est formé avant son incorporation dans une
composition telle que
décrite présentement.
Dans un autre mode de réalisation particulier selon la présente invention, ce
gel est formé
après son incorporation dans une composition. Ceci peut être effectué par
variation de pH
(passage à un pH physiologique, i.e. entre 6,8 et 7,8, préférentiellement à un
pH de 7,4 0,2).
De manière particulièrement avantageuse, la composition aqueuse selon
l'invention est
injectable dans le corps humain ou animal, typiquement par injection
intradermique, sous-
cutanée ou intrapéritonéal. La composition peut être conditionnée dans une
seringue telle
qu'une seringue stérile.
Ainsi, la composition aqueuse présente une viscosité appropriée pour assurer
une bonne
seringuabilité (écoulement satisfaisant à travers une aiguille dans une
seringue) et une facilité
d'injection. Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse
selon l'invention
est stérilisée avant injection, par exemple par autoclavage.
Ainsi, la composition selon la présente invention peut être formulée pour être
administrée par
injection intradermique, par injection sous-cutanée ou intrapéritonéal.
Une injection intradermique est l'administration d'un composé dans le derme de
la peau, situé
juste en dessous de l'épiderme. Une injection sous-cutanée consiste à
introduire une aiguille
dans la couche sous-cutanée de la peau, pour y injecter une molécule
d'intérêt. Une injection
intrapéritonéale est localisée au-delà du péritoine dans la cavité abdominale,
i.e. dans le tissu
adipo-viscéral.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse selon la
présente invention
est comprise ou consiste en un implant permettant de traiter les dépressions
cutanées. Il peut
s'agir de dépressions cutanées de faibles volumes (i.e. égale ou inférieurs à
5 mL équivalent
environ à 5 gramme selon la densité de la composition) ou qui ne peuvent être
comblées par
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des injections de faibles volumes. C'est le cas par exemple, du comblement de
l'ablation d'un
organe ou d'un tissu suite à un accident ou une maladie (e.g. une
mammoplastie,
lipodystrophie aigüe, lipoatrophie aigüe, traitement de comblement suite à une
poliomyélite),
en chirurgie réparatrice.
Selon une caractéristique particulière de la présente invention, la
composition de chitosane
présente un temps de résorption long une fois injectée, typiquement de
quelques semaines à
plusieurs mois, par exemple de l'ordre de 3 ou 4 semaines jusqu'à 12 à 18
mois. Le produit ou
biomatériau constitué de ou contenant la composition aqueuse selon l'invention
bénéficie du
caractère bactério- et fongistatique du chitosane, bien connu dans le monde de
l'industrie
.. agro-alimentaire et des pansements cicatrisants. Ces propriétés facilitent
la conservation du
produit et contribuent à limiter les risques d'infection liés à l'injection ou
les phénomènes
inflammatoires à retardement pour d'autres produits tels qu'évoqués ci-dessus.
Face aux
molécules naturelles (collagène, acide hyaluronique) utilisées à ce jour pour
le comblement de
dépression ou la reconstruction de volume (e.g. rides, ridules, mamoplastie ou
encore
.. lipodystrophie), le chitosane est le seul à présenter de telles propriétés.
Par ailleurs, le produit
ou biomatériau constitué de ou contenant la composition aqueuse selon
l'invention assure un
comblement biologique efficace avantageusement immédiat. En outre, le
chitosane peut
favoriser la synthèse de collagène et permettre un comblement des défauts
cutanés, tels que
les rides, par stimulation de mécanismes naturels.
En outre, la composition aqueuse selon la présente invention est
avantageusement apte à
former des particules cristallines de chitosane après injection. En effet, de
cette manière les
effets tels que décrits précédemment dans W0201307964 sont cumulés aux effets
liés à la
présente invention.
Chitosane
La composition selon l'invention comprend au moins un chitosane.
Le chitosane est un amino-polysaccaharide généralement obtenu par N-
désacétylation de la
chitine, polysaccharide aussi répandu dans la biomasse que la cellulose. La
chitine est
notamment présente dans les cuticules des arthropodes, l'endosquelette des
céphalopodes, les
parois cellulaires de champignons, levures ou algues. Avantageusement selon la
présente
invention, le chitosane est un produit naturel qui provient d'une source
animale, par exemple
de crustacés du type crabes, crevettes ou calmars, ou d'une source végétale,
telle que des
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champignons ou des algues. Le chitosane et la chitine sont des copolymères
linéaires
respectivement de 2-acetamido-2-desoxy-D-glucane et de 2-amino-2-desoxy-D-
glucane. On
parle plus communément d'unités N-acétyl-D-glucosamine (G1cNAc) et D-
Glucosamine
(G1cN)), liées par des liaisons glycosidiques 13(1¨>4). Chitine et chitosane
se différencient par
la fraction molaire (exprimée en %) des unités GlcNAc présentes dans le
copolymère, appelée
aussi degré d'acétylation (DA).
Les structures chimiques du chitosane et de la chitine sont représentées
schématiquement ci-
dessous en fonction du degré d'acétylation (DA) :
1 r-
gze &H,
0 110 - = . (fie
= 0 .
h -
= ----""71-'"-µ0
H nlï
=.1%0L OUee4k4
Ds4 .0-.0M. Zà3e g:iteN)
N-eeee--D-gie unie
Le DA se calcule grâce à la formule :
e. .4.ee.'4:
e.eak.M.e.+eteeeN
avec nG1cNAc = nombre de motifs acétylés et nG1cN = nombre de motifs
désacétylés.
Le DA peut ainsi être déterminé selon les standards en vigueur actuellement (à
savoir
Standard Guide for Characterization and Testing of Chitosan Salts as Starting
Materials
Intended for Use in Biomedical and Tissue-Engineered Medical Product
Applications, Book
of Standards Volume: volume 13.01 ; ASTM-F2103 ).
Avantageusement selon la présente invention, le chitosane a un degré
d'acétylation (DA)
inférieur à 30 %, encore plus avantageusement inférieur ou égal à 20 %, par
exemple inférieur
à 15%. De manière préférée, le chitosane selon l'invention a un degré
d'acétylation DA
inférieur ou égal à 15 %, avantageusement inférieur à 10%, plus
avantageusement inférieur à
8%, encore par avantageusement inférieur à 5%. De manière encore préférée, le
chitosane
selon l'invention a un degré d'acétylation DA inférieur ou égal à 4 %,
avantageusement
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inférieur à 3%, plus avantageusement inférieur à 2%, encore par
avantageusement inférieur à
1%. Par exemple le chitosane selon l'invention a un degré d'acétylation DA
compris entre 1 et
20%, avantageusement compris entre 2 et 15 %, avantageusement compris entre 3
et 10 %,
par exemple entre 4 et 8%.
5 Le degré d' acétylation est de préférence mesuré selon la méthode décrite
dans la publication
Physico-chemical studies of the gelation of chitosan in a hydroalcoholic
médium A.
MONTEMBAULT, C. VITON, A. DOMARD Biomaterials, 26(8), 933-943, 2005).
Le chitosane mis en oeuvre dans les solutions de l'invention a de préférence
une masse
moléculaire moyenne en masse (déterminée avant stérilisation selon la méthode
décrite dans
10 Physico-chemical studies of the gelation of chitosan in a
hydroalcoholic médium A.
MONTEMBAULT, C. VITON, A. DOMARD Biomaterials, 26(8), 933-943, 2005) comprise
entre 100 000 et 1 500 000 g/mol, avantageusement entre 200 000 et 1 000 000
g/mol, plus
avantageusement entre 250 000 et 500 000 g/mol, et encore plus avantageusement
entre 300
000 et 400 000 g/mol.
Après stérilisation, le chitosane a typiquement une masse moléculaire moyenne
en masse
comprise entre 80 000 et 1 000 000 g/mol, et avantageusement comprise entre
120 000 et
300 000 g/mol.
Classiquement un chitosane de masse molaire comprise entre 100 000 à 1 000 000
g.mo1-1
peut aussi être caractérisé par sa viscosité (Classiquement à une
concentration de 1% dans une
solution aqueuse à 1% en acide acétique à 25 C). Avec cette considération, la
masse molaire
du chitosane peut aussi être définie par une viscosité comprise entre 5 Pa.s
et 20 Pa.s.
La viscosité de la composition est mesurée à 25 C à l'aide d'un rhéomètre
DHR1 (TA
Industries) et une géométrie plan de 40 mm selon un mode dynamique avec taux
de
cisaillement appliqué de 0,01 à 1 s-1.
Selon un mode préféré de réalisation, le chitosane mis en oeuvre dans les
solutions selon
l'invention n'est pas modifié chimiquement, et en particulier, n'est pas
greffé pour favoriser
sa solubilité en solution aqueuse à des pH proches de la neutralité (entre 6,2
et 7,2). Il se
distingue en ce sens des chitosanes mis en oeuvre dans la demande W003/042250
ou la
demande JP-H02-69502, dans la publication Synthesis and characterization of
sugar-
bearing chitosan derivatives : aqueous solubility and biodegradability , Jae
Hyung Park et
al., Biomacromolecules 2003, 4, 1087-1091, et dans la publication Water
solubility of
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partially N-acetylated chitosans as a function of pH. effect of chemical
composition and
depolymerization Varum K. M. et al., Carbohydrate polymers 25 (1994), 65-70.
Dans ce mode de réalisation, cet autre chitosane peut se présenter sous forme
de particules de
chitosane réticulé.
.. Selon un mode particulier de réalisation, la composition selon l'invention
est exempte de
chitosane présentant un degré d' acétylation élevé, en particulier supérieur à
20% et plus
spécifiquement compris entre 40 et 60%.
Selon un mode autre particulier de réalisation, la composition selon
l'invention est exempte
d'un oligomère additionnel, en particulier d'un oligomère de chitosane, de
faible masse
.. moléculaire moyenne, notamment inférieure à 20 000 g/mol.
Par exempte de chitosane présentant un degré d' acétylation élevé ou d'un
oligomère
additionnel, on entend au sens de la présente invention que la composition
aqueuse de
chitosane comprend moins de 1% en poids de ces composés, en particulier moins
de 0,5% en
poids, et plus préférentiellement, ne contient pas ces composés.
Agent de dispersion
Outre le chitosane, la composition aqueuse selon la présente invention peut
comprendre au
moins un agent de dispersion du chitosane. Ce type d'agent de dispersion est
très bien connu
dans l'art et peut par exemple être choisi parmi le mannitol, le glycérol, le
sorbitol et leurs
mélanges.
Tampon
La composition selon l'invention peut également comprendre un tampon pH pour
se placer au
pH physiologique. Tout tampon pH communément utilisé à cette fin peut être
utilisé, par
exemple le PBS ( Phosphate Buffer Saline - solution saline de tampon
phosphate).
Sel
Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention
comprend un sel tel
que le chlorure de sodium ou le chlorure de potassium, ou tout autre excipent
acceptable
avantageusement pour ajuster l'osmolarité de la composition. L'ajout d'un sel
tel que le
chlorure de sodium, ou de potassium, peut être intéressant pour obtenir une
solution
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isotonique. Selon une caractéristique particulière de la présente invention,
la composition peut
comprendre en outre au moins un composé ayant une activité thérapeutique
reconnue.
Composé ou un excipent additionnels
La composition aqueuse de chitosane selon la présente invention peut en outre
comprendre au
moins un composé ou un excipent pharmaceutiquement, dermatologiquement, et/ou
cosmétiquement acceptable.
Actifs
En outre la composition selon la présente invention peut comprendre au moins
un composé
actif tel qu'un composé analgésique, anesthésique local, tel que la lidocaïne,
mépivacaïne,
bupivacaïne ou ropivacaïne, un composé angiogénique, ou encore un composé
actif du type
facteur de croissance ou oligosaccharide bioactif.
Composé ou substituant de la matrice extracellulaire
Selon un mode particulier de réalisation, la composition selon l'invention
peut comprendre un
composé ou un substituant de la matrice extracellulaire.
La matrice extracellulaire désigne typiquement l'ensemble de macromolécules
extracellulaires du tissu conjonctif et des autres tissus. Un composé de la
matrice
extracellulaire selon la présente invention est avantageusement un polymère
organique, par
exemple d'une taille supérieure à 1000 Daltons (Da), ou encore supérieure 5000
Da. De
manière avantageuse, les polymères organiques de la matrice extracellulaire
selon la présente
invention peuvent être de nature protéique, glucosidique, protéoglucosique ou
encore
glucoprotéique. Typiquement les polymères organiques de la matrice
extracellulaire peuvent
être le collagène, l'acide hyaluronique ou la fibronectine. Un substituant de
la matrice
extracellulaire est un composé non ubiquitaire (i.e. qui n'est pas trouvé
naturellement chez
l'homme pour cette fonction) permettant de remplir le rôle de matrice
extracellulaire. Ce type
de composé est connu dans l'art (Jayakumar, R., Menon, D., Manzoor, K., Nair,
S. V., &
Tamura, H. (2010). Biomedical applications of chitin and chitosan based
nanomaterials¨A
short review. Carbohydrate Polymers, 82(2), 227-232).
Le composé de la matrice extracellulaire est de préférence choisi parmi les
protéines, les
glycosaminoglycanes et leurs mélanges.
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Les protéines et leurs dérivés glycosylés peuvent de préférence être choisies
parmi le
collagène, l'élastine, la fibronectine, la laminine ou leurs mélanges.
Les glycosaminoglycanes peuvent de préférence être choisis parmi l'acide
hyaluronique, la
chondroïtine sulfate, l'héparane sulfate, la kératane sulfate ou un mélange
d'au moins deux de
ces glycosaminoglycanes.
Selon un mode préféré de réalisation, le composé de la matrice extracellulaire
est choisi parmi
les protéines et leurs dérivés glycosylés, de préférence parmi le collagène,
la fibronectine, et
un mélange de collagène et de fibronectine.
Le substituant de la matrice extracellulaire peut quant à lui être choisi
parmi la
carboxymethylcellulose, l'ester de chitosane, l'ester de chitine ainsi que le
mélange d'au
moins deux substituants de la matrice extracellulaire.
Selon un mode préféré de réalisation, lorsque la composition selon l'invention
comprend un
composé ou un substituant de la matrice extracellulaire, elle est exempte d'un
oligomère
additionnel, en particulier d'un oligomère de chitosane, de faible masse
moléculaire moyenne,
notamment inférieure à 20 000 g/mol.
La composition aqueuse selon la présente invention contient préférentiellement
moins de 5%
en poids, par rapport au poids total de la composition d'au moins un composé
de la matrice
extracellulaire et/ou d'au moins un substituant de la matrice extracellulaire,
en particulier
entre 0,01 et 5% en poids, avantageusement entre 0,1 et 4% en poids, plus
avantageusement
entre 0,2 et 3% en poids, encore plus avantageusement entre 0,3 et 2% en
poids, voire entre
0,5 et 1% en poids.
La composition aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention,
lorsqu'elle
comprend un composé de la matrice extracellulaire et/ou un substituant de la
matrice
extracellulaire, contient de manière préférée une quantité de chitosane
inférieure ou égale à
5% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse,
avantageusement inférieure
ou égale à 4% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse,
plus inférieure
ou égale à 3% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse,
encore inférieure
ou égale à 2% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse.
De manière plus
préférée, la composition aqueuse homogène de chitosane selon la présente
invention,
lorsqu'elle comprend un composé de la matrice extracellulaire et/ou un
substituant de la
matrice extracellulaire, contient entre 0,1 et 5 %, avantageusement entre 0,5
et 3,5 %, en
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particulier entre 1 et 2 %, en poids de chitosane, par rapport au poids total
de la composition
aqueuse. De manière plus préférée, la composition aqueuse homogène de
chitosane selon la
présente invention, lorsqu'elle comprend un composé de la matrice
extracellulaire et/ou un
substituant de la matrice extracellulaire, contient entre 1,5 et 2 %,
avantageusement entre 1,6
et 1,9 %, en particulier entre 1,7 et 1,8 %, en poids de chitosane, par
rapport au poids total de
la composition aqueuse. De manière encore plus préférée, la composition
aqueuse homogène
de chitosane selon la présente invention, lorsqu'elle comprend un composé de
la matrice
extracellulaire et/ou un substituant de la matrice extracellulaire, contient
moins de 2 %,
avantageusement moins 1,9 %, en particulier moins de 1,8 %, plus
avantageusement moins
1,7 %, encore plus avantageusement moins de 1,6 %, en poids de chitosane, par
rapport au
poids total de la composition aqueuse.
Procédé de préparation des compositions
La composition aqueuse de chitosane selon l'invention, telle que décrite
présentement, peut
notamment être préparée par les étapes successives suivantes :
a. la dissolution du chitosane dans de l'eau par ajout d'acide tel qu'un acide
faible, ledit
acide faible étant avantageusement choisi dans le groupe constitué par l'acide
acétique, l'acide
glycolique, l'acide lactique, l'acide glutamique, ou tel qu'un acide fort,
ledit acide fort étant
avantageusement l'acide chlorhydrique, et leurs mélanges,
b. l'ajout le cas échéant d'au moins un composé et/ou un substituant de la
matrice
.. extracellulaire et
c. le réajustement optionnel du pH pour obtenir une composition aqueuse
présentant
un pH inférieur à 8,5.
De manière préférée, au moins un agent de dispersion (tel que le mannitol, le
glycérol, le
sorbitol...) est ajouté le cas échéant à l'une quelconque des étapes (a), (b),
ou (c) ou après
l'une quelconque des étapes (a), (b), ou (c) ci-dessus. Dans un mode de
réalisation particulier
selon la présente invention, la composition aqueuse de chitosane, gélifiée
peut être dispersée
par l'ajout d'un agent de dispersion tel que présenté ci-dessus,
éventuellement avec une étape
de fragmentation mécanique du gel de ladite composition aqueuse de chitosane.
La
composition obtenue peut dans tous les cas être une suspension ou une
solution, administrable
par exemple par injection, préférentiellement gélifiante.
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Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse de la présente
invention,
susceptible d'être obtenue par les étapes décrites ci-dessus.
Le contrôle du pH des solutions est très important pour éviter d'une part la
nécrose acide des
tissus après injection comme expliqué ci-dessus, et également pour protéger
les compositions
5 de l'hydrolyse et la dégradation du chitosane si l'on met en oeuvre une
stérilisation (par
exemple par autoclave à 121 C pendant 15 minutes). Le pH est réajusté si
nécessaire avec un
composé tel que le bicarbonate de sodium ou un tampon PBS, typiquement dans
des quantités
réduites. La valeur du pH est avantageusement contrôlée grâce à un pH-mètre.
Dans la cadre de la présente invention, l'ajustement du pH peut de préférence
être réalisé de
10 manière très progressive par dialyse.
La dialyse est un procédé de séparation par membrane des molécules ou des ions
en solution.
Ainsi, dans le cadre de la présente demande, la solution aqueuse de chitosane
selon
l'invention peut être dialysée contre une solution tampon présentant un pH
égal au pH final
souhaité pour la solution de chitosane (pH cible), c'est à-dire au moins
supérieur à 6,2,
15 avantageusement compris entre 6,2 et 7,2, de préférence entre 6,25 et
7,1. Lorsque la solution
tampon présente un pH supérieur au pH de gélification de la solution (par
exemple 7,5), la
dialyse devrait alors être surveillée pour éviter la gélification de la
solution.
La solution tampon peut, par exemple, être une solution saline de tampon
phosphate (PBS,
TBS, PBS-acide lactique), la tris (tris(hydroxymethyl)methylamine), 4-2-
hydroxyethy1-1-
piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 2-{
[tris (hydroxymethyl)methyl] amino } -
ethanesulfonic acid (TES), 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS),
piperazine-N,N'-
bis(2-ethanesulfonic acid)), MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (PIPES),
du chlorure
de sodium (NaCl).
Selon un mode préféré de réalisation, la solution tampon est une solution de
tampon
phosphate PBS ( Phosphate Buffer Saline - solution saline de tampon
phosphate)
composée d'un sel acide NaH2PO4, d'un sel basique le Na2HPO4 et de NaCl.
Selon un mode particulier de réalisation, le tampon est physiologiquement
acceptable, c'est-à-
dire qu'il ne présente aucun risque d'intolérance ou de toxicité lors de
l'injection dans les
tissus de la solution injectable selon l'invention. A ce titre, le tampon est
de préférence
différent du glycérophosphate, et en particulier du I3-glycérophosphate qui,
bien que peu
irritant pour la peau, pose des problèmes de calcification lorsqu'il est
injecté dans les tissus.
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Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la dialyse peut être
réalisée de manière
statique dans un seul bain contre une solution tampon telle que décrite
précédemment.
Lorsque la dialyse est réalisée de manière statique dans un seul bain contre
une solution
tampon, il est préférable que ladite solution tampon présente un pH égal au pH
final souhaité
pour la solution de chitosane (pH cible), par exemple entre 6,5 et 6,9.
Selon un mode plus préféré de réalisation, la dialyse peut être réalisée de
manière statique
dans plusieurs bains successifs contre des solutions tampon présentant des pH
différents de
plus en plus proches du pH final souhaité pour la solution de chitosane (pH
cible).
Selon un mode particulièrement préféré de réalisation, la dialyse est réalisée
de manière
dynamique, c'est-à-dire en faisant circuler en continu au moins une solution
permettant
l'augmentation progressive du pH au travers d'une ou plusieurs poches de
dialyse constituées
d'une membrane de dialyse renfermant la solution aqueuse de chitosane. Ce type
de dialyse
est par exemple décrit dans la demande de brevet WO 2016/170284 du Demandeur.
Dans un mode de réalisation particulier selon l'invention, le chitosane est
dissous dans l'eau à
l'aide d'un acide fort du type acide chlorhydrique. Dans ce cas, le pH est
réajusté avec un
composé de type bicarbonate de sodium ou d'ammonium ou PBS par exemple, et/ou
une base
de type NaOH ou KOH par exemple (toujours en contrôlant le pH de manière à ce
qu'il reste
inférieur à 8,5, préférentiellement inférieur à 6,9).
Dans un mode de réalisation particulier selon l'invention, lors de l'étape de
dissolution, l'acide
est ajouté en une quantité nécessaire à la dissolution du chitosane. On peut
utiliser ainsi un
excès d'acide pour certains chitosanes, par exemple les chitosanes difficiles
à solubiliser avec
la quantité strictement nécessaire d'acide, puis on reprécipite le chitosane,
à l'aide
d'ammoniaque par exemple. Après une série de lavages destinés à éliminer
l'excédent
d'ammoniaque et les sels, on peut alors lyophiliser le chitosane pour
récupérer la matière
sèche. Celle-ci sera alors plus facile à solubiliser.
Dans un autre mode de réalisation particulier selon l'invention, lors de
l'étape de dissolution,
l'acide est ajouté en une quantité au moins nécessaire à la dissolution du
chitosane, telle que la
quantité stoechiométrique strictement nécessaire à la protonation des sites
NH2.
De manière particulièrement avantageuse, le pH de la composition aqueuse selon
la présente
invention est inférieur à 8,5, et est typiquement compris entre 4 et 7,6. Dans
le cadre de
l'invention, le chitosane est solubilisé en solution aqueuse, telle que l'eau,
dans un
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environnement acide dans les gammes de pH mentionnées précédemment,
avantageusement
par protonation des groupes amine du chitosane. Ces gammes de pH ont été en
particulier
choisies afin de maximiser la stabilité de la composition aqueuse selon
l'invention.
L'objet de la présente invention concerne en outre une composition aqueuse,
telle que décrite
ci-dessus, caractérisée en ce que ladite composition est liquide, sous forme
de gel ou obtenue
après dispersion de ladite composition aqueuse de chitosane dans un véhicule
dermatologiquement et/ou cosmétiquement acceptable.
Par véhicule dermatologiquement et/ou cosmétiquement acceptable , il est
compris dans le
cadre de la présente invention tout excipient dermatologiquement et/ou
cosmétiquement
.. acceptable, ou toute matrice ou dispositif dermatologiquement et/ou
cosmétiquement
acceptable, permettant l'administration de la composition aqueuse selon la
présente invention.
Lorsqu'une composition aqueuse telle que décrite présentement est comprise
dans une
composition avec éventuellement un composé ou un excipent pharmaceutiquement,
dermatologiquement, et/ou cosmétiquement acceptable, son utilisation comme
composition
dermatologique ou encore comme dispositif médical, avantageusement comme
implant
biorésorbable ou partiellement biorésorbable peut être administré aux dosages
suivants. La
quantité de chitosane peut être comprise entre 0,1 et 5 % en poids,
avantageusement entre 1 et
2% en poids, plus avantageusement entre 1,1 et 1,9 % en poids, encore plus
avantageusement
entre 1,2 et 1,8% en poids, et de manière encore plus avantageuse entre 1,3 et
1,7% en poids
ou encore entre 1,4 et 1,6% en poids, par exemple à 1,5% 0,05% en poids de
chitosane par
rapport à la quantité totale de composition aqueuse administrée. En outre, la
quantité de
composition ou composition aqueuse administrée en une seule dose est comprise
entre 0,01 et
20 grammes par injection, avantageusement comprise entre 0,05 et 10 grammes
par injection,
plus avantageusement comprise entre 0,1 et 5 grammes par injection, encore
plus
avantageusement entre 0,4 et 1 gramme par injection, par exemple 0,7 grammes
0,1 gramme par injection. Le nombre d'injections peut varier de 1 à 20 fois
dans les cas les
plus extrêmes. De manière plus routinière, ce nombre d'injection est inférieur
à 5 fois pour
combler efficacement des cavités d'un volume inférieur à 50 mL (donc à
température
physiologique). Dans le cas de chirurgie réparatrices plus importantes tels
qu'évoqués
précédemment (e.g. mammoplastie, lipodystophie aigüe, lipoatrophie aigüe,
etc.) les quantités
de composition selon la présente invention pouvant être injecté et/ou
implantés peuvent
s'additionner à des masses égales ou inférieures à 500 grammes, plus
communément égales
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ou inférieures à 350 grammes, encore plus communément égales ou inférieures à
200 grammes, ou encore égales ou inférieures à 100 grammes. De manière
typique, la densité
de la composition aqueuse administrée est comprise entre 0,9 et 1,2 à 25 C
(donc avant
administration).
L'utilisation cosmétique selon la présente invention est définie de fait comme
n'étant pas
invasive dans l'administration de la composition selon la présente invention.
Ceci exclu tout
acte chirurgical. Néanmoins, l'utilisation cosmétique selon la présente
invention peut être
effectuée avec des seringues et aiguilles de petit calibre, dans un acte
comparable à
l'application d'un tatouage. Ainsi de manière arbitraire, les quantités
injectées de composition
selon la présente invention supérieures à 5 grammes par injection sont exclues
dans le cadre
d'une utilisation cosmétique. Dans ce cadre, le nombre d'injections est limité
arbitrairement à
5 fois au plus pour une quantité totale injectée de 10 grammes.
En outre, la quantité de composition aqueuse administrée en une seule dose
peut être
comprise entre 0,001 et 1 gramme par cm2 de surface de peau, avantageusement
comprise
entre 0,01 et 0,5 gramme par cm2 de surface de peau. De manière typique, la
densité de la
composition aqueuse administrée est comprise entre 0,9 et 1,2 à 25 C.
En outre l'utilisation selon la présente invention peut être faite de manière
in vitro ou in vivo.
L'utilisation in vitro est applicable à toutes les applications visées par la
présente invention, et
en particulier à des buts de détermination de concentrations/quantité d'actifs
à administrer.
DESCRIPTIF DES FIGURES
Figure lA et 1B : Effet sur la prolifération des 3T3L1. La figure 1 montre que
pour toutes les
concentrations, les cellules 3T3L1 sont capables de proliférer et d'atteindre
la confluence en
5 jours bien que deux jours après ensemencement, la morphologie des cellules
suggère un
milieu agressif, voire toxique pour la condition à 2 %. La figure 1B précise
où sur les images
expérimentales obtenues pouvait être vu le signal correspondant à l'Adipored
(vert
expérimentalement, vs. Rouge pour Hoecht).
Figures 2A, 2B et 2C : ces figures montrent l'influence de la concentration en
chitosane sur le
stockage d'acide oléique par les cellules 3T3L1 lors de la différenciation
adipocytaire. Le
marquage AdipoRed (Fig. 2A) montre une accumulation d'acides gras lorsque les
cellules
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sont en présence de chitosane à 0.5 %, 0.75 % et 1 % par rapport aux
conditions ne contenant
pas de chitosane. La figure 2B précise où sur les images expérimentales
obtenues pouvait être
vu le signal correspondant à l'Adipored (vert expérimentalement). La
quantification de cette
accumulation (Fig. 2C) démontre qu'elle est maximale lorsque les cellules sont
cultivées en
présence de chitosane à 0.5%.
Figure 3 : Cette figure montre une distribution des gouttelettes lipidiques
(n>10000) des
3T3L1 exposés une composition de chitosane et à une formulation comprenant du
chitosane
combinées à du collagène et de la fibronectine. La Figure 3 montre que (Col
2+FN1)+Chitosan2%) sont les meilleures formulations pour augmenter le nombre
et la taille
moyenne (volume) des gouttelettes lipidiques.
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation des solutions
Deux stratégies de préparation d'une gamme de concentration de solutions
gélifiantes de
chitosane sont utilisées.
Par dilution finale
4 g de chitosane sont agités dans 95 g de solution saline contenant 150 mM en
NaCl
(équivalent à 300 mOsmol.L-1). Une fois le chitosane complètement dispersé, 1
g de d'acide
acétique est ajouté. L'agitation est maintenue jusqu'à dissolution complète du
chitosane. Une
solution limpide de chitosane concentrée à 4 % est alors obtenue avec un pH
pouvant être
compris entre 3 et 4.5 en fonction de l'origine du chitosane.
Une solution de chitosane à 4 % (w/w) est obtenue dans une solution saline
(NaCl à
300 mOsmol.L-1) contenant 1 % (w/w) d'acide acétique.
Le pH de la solution de acide de chitosane est rehaussé jusqu'à ce qu'il soit
compris entre 6 et
6.5. Cette étape est réalisée par dialyse contre un tampon PBS présentant un
pH compris entre
6.5 et 7. Lors de cette étape, le gonflement de la solution de chitosane est
contrôlé pour
atteindre une concentration finale de 3 % (w/w) (taux de gonflement de 33 %).
Les solutions
de chitosane sont généralement stérilisées (121 C pendant 15 min dans un
autoclave) pour
être stockées avant utilisation.
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Cette solution est dialysée pour obtenir un pH proche de 6 et une
concentration de 3% (w/w).
Avant utilisation, la solution de chitosane à 3 % peut être diluée dans une
solution saline à
150 mM en NaCl + 1 % en acide acétique pour accéder à des concentrations
inferieures.
Les solutions obtenues peuvent gélifier en présence du milieu physiologique ou
d'un milieu
5 de culture.
Par dilution initiale
4 g de chitosane sont agités dans 95 g de solution saline contenant 150 mM de
NaCl
(équivalent à 300 mOsmol.1J1). Une fois le chitosane complètement dispersé, 1
g de d'acide
acétique est ajouté. L'agitation est maintenue jusqu'à dissolution complète du
chitosane. Une
10 solution limpide de chitosane concentrée à 4 % est alors obtenue avec un
pH pouvant être
compris entre 3 et 4.5 en fonction de l'origine du chitosane.
Une solution de chitosane à 4 % (w/w) est obtenue dans une solution saline
(NaCl à
300 mOsmol.L-1) contenant 1 % (w/w) d'acide acétique.
Cette solution mère (4 %) est ensuite diluée dans une solution saline (NaCl à
300 mOsmol.L-
15 1) contenant 1 % (w/w) d'acide acétique en différente concentration
allant de 4 % à 0.1 %.
Chaque solution est alors dialysée contre un tampon PBS présentant un pH
compris entre 6.5
et 7. Le taux de gonflement est mesuré afin de contrôler les concentrations
finales de chaque
solution. La dialyse est stoppée quand le pH des solutions est compris entre
6.0 et 7.4. Chaque
solution est stérilisée par autoclave (121 C pendant 15 min). Les solutions
sont utilisées en
20 l'état sans autre forme de dilution ce qui préserve leur pH.
Les solutions obtenues peuvent gélifier en présence du milieu physiologique ou
d'un milieu
de culture
Exemple 2: Effet de différentes dilutions de chitosane sur la prolifération,
la
différenciation et la capture d'acide gras par la lignée adipocytaire murine
3T3L1
Matériels et Méthodes
Différentes solutions de chitosane (2%, 1%, 0.75 % et 0.5 %) sont préparées
par dilution des
solutions obtenues dans l'exemple 1.
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Par exemple, une préparation de chitosane à 2 % (w/w) obtenue dans l'exemple 1
(DA: 2 %,
Mw : 450000 g.mo1-1, BIOXIS Pharmaceuticals S.A.S.) est diluée dans une
solution saline
(NaCl à 300 mOsmol.L-1) contenant 1 % (w/w) d'acide acétique dans un puits (en
plaques 24
puits) puis distribuée sur la moitié des autres puits, séchée, rincée au PBS
puis avec le milieu
de culture avant ensemencement cellulaire (lignée adipocytaire murine 3T3L1
ATCC CL-
173Tm). Lorsque les cellules sont à confluence, la différenciation est induite
par ajout d'un
milieu de différenciation. Les cellules sont alors traitées avec une faible
dose d'acide oléique
(OA, 2.51,1M) pendant 6 heures. Les cellules sont remises en milieu de culture
sans OA
jusqu'au lendemain afin d'éviter un bruit de fond éventuel de l'OA. La
prolifération est
analysée par microscopie à contraste de phase (x20) : les images sont prises à
différents temps
(2 jours et 5 jours post ensemencement), à une position identique pour chaque
puits. La
différenciation et le stockage d'acide oléique sont analysés en microscopie à
fluorescence : les
cellules sont fixées puis marquées avec AdipoRed (vert de manière
expérimentale ou tel
qu'identifié dans les figures) mettant en évidence la présence d'acides gras
sous forme de
triglycérides (TG) stockés dans plusieurs gouttelettes au cours de la
différenciation,
fusionnant en une seule gouttelette lorsque les adipocytes sont matures) et
avec Hoechst 3352
(rouge de manière expérimentale) pour le marquage des noyaux. Le marquage est
observé en
microscopie à fluorescence et la quantification effectuée par imagerie.
L'imagerie et la
quantification de fluorescence sont effectuées sur une station d'imagerie en
temps réel. Les
contrôles sont fixés avant induction de différenciation (confluence, DO).
Résultats
Deux jours après ensemencement, pour toutes les concentrations, les cellules
3T3L1 sont
capables de proliférer et d'atteindre la confluence en 5 jours (Figure lA et
1B). Ainsi, aux
concentrations testées, les adipocytes augmentent en nombre et en volume. La
morphologie
des cellules suggère toutefois un milieu agressif, voire toxique pour la
condition à 2 %.
La Figure 2 montre l'influence de la concentration en chitosane sur le
stockage d'acide
oléique par les cellules 3T3L1 lors de la différenciation adipocytaire. Ainsi,
les mêmes
cellules que celles testées à la figure 1 sont mise en oeuvre en présence
d'acide oléique (acide
gras que les cellules adipocytaires ont la capacité de capter). Le marquage
AdipoRed (Fig. 2A
et 2B) montre une accumulation d'acides gras lorsque les cellules sont en
présence de
chitosane à 0.5 %, 0.75 % et 1 % par rapport aux conditions ne contenant pas
de chitosane.
Ainsi, en présence de chitosane, les cellules 3T3L1 captent davantage d'acide
oléique que le
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témoin. La quantification de cette accumulation démontre qu'elle est maximale
lorsque les
cellules sont cultivées en présence de chitosane à 0.5% (figure 2C).
Conclusion
Les cellules 3T3L1 sont capables de proliférer en présence de chitosane. Après
deux jours en
culture, la présence de chitosane semble toutefois avoir un effet toxique sur
la lignée 3T3L1
pour des concentrations supérieures ou égales à 2 %. Le chitosane favorise la
capture d'acides
gras de manière dose-dépendante. Parmi les solutions testées, il semble que ce
soit les
solutions à 0.5 % qui présentent la meilleure efficacité. Cette capture
permettrait une
augmentation du volume des adipocytes et donc, par extrapolation, du tissus
graisseux in vivo.
Exemple 3: Effet de différentes dilutions de chitosane sur la capture d'acide
gras en
présence de fibronectine et de collagène par la lignée adipocytaire murine
3T3L1
Matériels et Méthodes
Différentes solutions de chitosane (2 %, 1 % 0.75 % et 0.5 %) sont préparées
par dilution des
solutions obtenues dans l'exemple 1.
Par exemple, une préparation de chitosane à 2 % (w/w) obtenue dans l'exemple 1
Pour cela,
une préparation de chitosane à 2 % (w/w) (DA: 2 %, Mw : 450000 g.mo1-1, BIOXIS
Pharmaceuticals S.A.S.) Les solutions ont été utilisées en l'état sans subir
de pré dilution en
solution saline acide. De plus, une solution à base de Collagène I 2mg/m1 +
Fibronectine I
lmg/mL + Chitosane à 2% (Noté Col FN Chi2) est aussi évaluée. Les compositions
sont
distribuées en plaque 96 puits après ensemencement cellulaire (lignée
adipocytaire murine
3T3L1, ref ATCC CL-173 Tm). Lorsque les cellules sont à confluence, la
différenciation est
induite par ajout d'un milieu de différenciation. Les cellules sont alors
traitées avec une faible
dose d'acide oléique (OA, 2.51,1M) pendant 6 heures. Les cellules sont remises
en milieu de
culture sans acide oléïque jusqu'au lendemain avant observation sur Cytation
3. La
distribution en taille des gouttelettes lipidiques (volume des adipocytes) est
observée.
Résultats
La Figure 3 montre que la solution Collagène I 2mg/m1+ Fibronectine I lmg/mL +
Chitosane
à 2% (Noté Col FN Chi2) présente moins d'adipocytes de taille inférieure à 15p
m et plus
d'adipocytes de taille comprise entre 15 et 55p m que la solution de chitosane
à 2%. L'ajout
CA 03040778 2019-04-16
WO 2018/078277 PCT/FR2017/052933
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de composés de la matrice extracellulaire comme le collagène ou la
fibronectine permet donc
de favoriser l'augmentation du nombre et de la taille moyenne (donc du volume)
des
gouttelettes lipidiques.
Conclusion
Le chitosane seul permet d'accroitre la taille des gouttelettes lipidiques.
Cet effet est encore
majoré en présence de fibronectine et de collagène.
