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UTILISATION D'UN SIRNA POUR LE TRAITEMENT DES CANCERS
La présente invention concerne une nouvelle utilisation d'oligonucléotides
double brin, et
plus particulièrement une utilisation selon une nouvelle formulation et un
nouveau mode
d'administration.
Depuis la découverte du mécanisme d'ARN interférence en 1998, des efforts
considérables ont été entrepris pour développer le potentiel thérapeutique de
cet outil pour les
maladies humaines. Les micro RNAs (miRNAs) sont des petits ARN codés par le
génome de
tous les organismes eucaryotes. Après transcription et maturation, ils sont
chargés dans un
complexe protéique : RNA Induced Silencing Complex (RISC). Lorsqu'ils
s'hybrident avec
un ARN messagers (ARNm) soit ils induisent sa coupure, conduisant à la
dégradation de
l'ARNm, soit ils inhibent sa traduction en protéine. Les ARN interférents ou
Small Interfering
RNA (siRNA) sont des oligoribonucléotides double brins synthétiques qui une
fois introduits
dans les cellules miment l'action des miRNAs et déclenchent le mécanisme d'ARN
interférence. Leur mécanisme d'action n'est donc comparable à aucun autre type
d'o ligonucléotide.
Un oligonucléotide double brin dans ce qui suit s'entend plus
particulièrement d'un
siRNA. Plus précisément, lorsque l'oligonucléotide double brin est un siRNA,
il est chargé
dans le complexe RISC. L'un des deux brins, dit "passager" est coupé puis
dégradé, l'autre
brin, dit "guide", reste dans le complexe RISC. Ce brin guide s'hybride avec
une région d'un
ARNm dont il est complémentaire. Cet ARNm est nommé "ARNm cible" du siRNA et
par
extension, le gène qui est transcrit pour générer cet ARN est appelé le "gène
cible" du siRNA.
Cet ARNm cible peut être codant ou non codant. Un siRNA coupe l'ARNm cible
avec lequel
il s'hybride et entraîne sa dégradation, ou bien il en empêche sa traduction.
Ceci se traduit par
une diminution de la quantité de l'ARNm cible, et/ou par une diminution de la
quantité de
protéine codée par l'ARNm si celui-ci est un ARNm codant. Ces effets d'un
siRNA sont
collectivement nommés dans la suite de la description "effet inhibiteur de
l'expression
génique".
L'obstacle majeur qu'il faut surmonter pour pouvoir utiliser un siRNA dans un
but
thérapeutique, en particulier chez l'homme, est d'obtenir que le siRNA pénètre
dans le ou les
tissus d'intérêt, qu'il s'y maintienne dans un état actif en concentration
suffisante et
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suffisemment longtemps pour y produire l'inhibition de l'expression génique
recherchée. La
méthode d'administration du siRNA doit de plus être cliniquement acceptable,
non toxique et
ne pas déclencher de réaction immunitaire indésirable. La méthode doit être
utilisable pour
délivrer tout type de siRNA, quel que soit l'ARNm cible du siRNA et son niveau
d'expression.
Par le passé des méthodes ont été développées pour distribuer dans l'organisme
d'autres
types d'oligonucléotides tels que par exemple des oligodeoxynucléotides
antisens (ODN), des
ribozymes, des aptamères, des morpholinos, ou des oligonucléotides formant
triple hélice.
Plusieurs de ces oligonucléotides pénètrent dans les cellules par un mécanisme
d'endocytose
médiée par un récepteur (Vlassov et al., 1994) mais de tels mécanismes n'ont
pas été mis en
évidence pour les siRNA. Les méthodes développées pour administrer des
oligonucléotides
simple brins ARN ou ADN, notamment en absence d'agents de vectorisation, ne
sont donc pas
transposables aux siRNA et d'autres méthodes ont dû être développées dans ce
but (Tatiparti
et al., 2017).
La plupart des utilisations thérapeutiques nécessitent que le siRNA soit
délivré de façon
systémique dans l'organisme. Dans ce qui suit, on entend par systémique le
fait que le siRNA
est véhiculé dans l'organisme pour agir à distance de l'endroit où il est
administré, par
opposition à une administration locale ou loco-régionale, notamment par
opposition à une
administration intratumorale. La distribution de façon systémique dans
l'organisme est
obtenue par toute méthode qui entraîne un passage du siRNA dans les fluides
extracellulaires
comme par exemple le sang, la lymphe ou le liquide céphalo-rachidien, que le
composé
contenant le siRNA soit ingéré (voie orale), ou injecté (voie parentérale), ou
qu'il pénètre à
travers la peau ou les muqueuses.
Les acides nucléiques en général et les siRNAs en particulier sont chargés
négativement.
Lorsqu'ils sont à l'extérieur des cellules, cette charge négative limite leur
pénétration dans les
cellules. Pour cette raison, de nombreuses méthodes, comme par exemple
l'électroporation,
des liposomes, des nanoparticules, des polymères de différentes natures, ont
été développées
pour faire pénétrer un siRNA dans une cellule en culture. Cependant ces outils
ne sont pas
applicables pour administrer un siRNA de façon systémique dans un organisme
vivant. La
charge négative des siRNA facilite leur association avec des molécules
cationiques telles que
des compositions lipidiques ou polymériques. Pour utiliser des siRNA dans des
organismes
vivants, les siRNA ont été chimiquement conjugués ou incorporés dans
différents agents de
vectorisation. Un agent de vectorisation dans ce qui suit s'entend d'un
agent qui a pour but
de véhiculer l'oligonucléotide dans les fluides biologiques du point
d'administration jusqu'au
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tissu cible et de le faire pénétrer à l'intérieur de la cellule, soit en
pénétrant avec
l'oligonucléotide jusqu'à l'intérieur de la cellule, soit en fusionnant avec
la membrane
plasmique de la cellule et en libérant l'oligonucléotide à l'intérieur de
celle-ci. Ces agents de
vectorisation sont d'une part des composés contenant des macromolécules qui
forment des
complexes avec les oligonucléotides, sous forme d'une particule d'une taille
supérieure à 20
nm, et d'autre part des conjugués chimiques associant par une liaison
covalente l'un et/ou
l'autre brin d'un siRNA à un composé destiné à le faire pénétrer dans la
cellule, comme par
exemple du cholestérol ou un peptide pénétrant. Les "peptides pénétrants" sont
des peptides
capables de pénétrer spontanément à l'intérieur des cellules et conservent
cette propriété
lorsqu'ils sont conjugués avec une molécule, entraînant la traversée de cette
dernière. Ainsi,
les agents de vectorisation peuvent être composés de différents types de
macromolécules,
comme des lipides micellaires, du cholestérol, des liposomes, des polymères,
des polyplexes,
des chitosans, des quantum dots, des peptides pénétrants, des dendrimères, des
dérivés de la
polyéthylènimine, des nanoparticules, des sphères magnétiques ou supra
magnatiques, ou des
nanostructures inorganiques ou organiques.
Le consensus le plus général dans la communauté scientifique et médicale est
de dire
que les siRNA non vectorisés sont inefficaces, et qu'ils doivent être
stabilisés et vectorisés
pour être actifs (Scomparin et al., 2015). De très nombreux agents de
vectorisation ont ainsi
été développés pour les siRNA. Plusieurs sont utilisés dans des essais
thérapeutiques chez
l'homme, dans différentes indications. La mise en oeuvre de ces outils de
vectorisation est
généralement complexe, nécessitant des étapes successives et des processus
bien contrôlés
et/ou le couplage covalent de l'oligonucléotide à un autre composant. Il a été
montré que
plusieurs classes d'agents de vectorisation, du fait de leur nature chimique
ou structurale, ou
du fait de leur association avec un oligonucléotide, présentaient des effets
toxiques ou
déclenchaient une réponse immunitaire indésirable chez l'animal ou les humains
(Robbins et
al., 2009) ce qui n'est pas le cas avec des siRNAs non vectorisés (Heidel et
al., 2004). De
plus, ces agents de vectorisation distribuent souvent préférentiellement les
siRNAs dans
certains organes, en particulier le foie, ce qui limite leur utilisation
thérapeutique dans
d'autres organes. Une méthode d'administration ne nécessitant pas d'ajouter
des agents de
vectorisation est donc avantageuse.
Différentes méthodes ont ainsi déjà été proposées pour administrer des siRNAs
non
vectorisés de façon systémique et inhiber l'expression d'un gène dans un tissu
ou dans une
tumeur. La première méthode proposée, dite hydrodynamique, a été d'injecter
par voie
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intraveineuse une solution saline contenant le siRNA en quelques secondes et
dans un grand
volume : 1.8 mL chez la souris, correspondant à plus de la moitié de son
volume sanguin
(McCaffrey et al., 2002). Cette méthode est inapplicable à l'homme et aux
animaux de grande
taille.
D'autres auteurs ont utilisé une administration de siRNAs non vectorisés par
voie
intrapéritonéale chez la souris. Cette méthode est efficace et permet
d'inhiber l'expression de
la cible du siRNA, et d'inhiber la croissance de tumeurs xenogreffées chez des
souris. Ceci
est illustré dans la littérature (Delloye-Bourgeois et al., 2009; Pannequin et
al., 2007).
L'injection intrapéritonéale de siRNAs dirigés contre le récepteur des
androgènes (siAR-1)
(Compagno et al., 2007) ou contre la thrombospondine-1 (siTSP1-1) (Firlej et
al., 2011)
inhibe efficacement la croissance de tumeurs prostatiques xenogreffées chez
des souris.
La voie intrapéritonéale est efficace chez l'animal mais elle est complexe à
utiliser
chez l'homme, surtout si elle doit être utilisée de façon répétée, notamment
du fait de risques
infectieux car elle nécessite la pose chirurgicale d'un cathéther et son usage
est généralement
restreint au traitement de pathologies se développant dans le péritoine ou
dans des organes
intrapéritonéeaux comme les ovaires. Même dans ces indications thérapeutiques,
cette voie
d'administration présente des obstacles importants qui en limitent l'usage et
l'efficacité et il est
donc nécessaire de disposer de solutions alternatives (Zeimet et al., 2009).
L'administration de siRNA non vectorisés par voie intraveineuse a également
été testée.
Cependant, comme d'autres oligonucléotides, les siRNA injectés par voie
intraveineuse sont
éliminés par filtration rénale (van de Water et al., 2006).
Il n'existe donc pas à ce jour de mode d'administration de siRNA compatible
avec un usage
en clinique humaine, sans agent de vectorisation, permettant de les adresser
efficacement dans
de nombreux organes cibles, notamment dans la prostate, et/ou dans des tumeurs
et/ou les
métastases de tumeurs, dans le but de prévenir et/ou traiter des pathologies.
Il existe un réel
besoin de fournir un tel moyen. L'un des buts de l'invention est ainsi de
fournir des modes
d'administration permettant de distribuer efficacement des siRNA dans de
nombreux organes
cibles, notamment dans la prostate, et/ou dans des tumeurs et/ou dans les
métastases de ces
tumeurs, afin de prévenir et/ou traiter des pathologies résultant directement
ou indirectement
de l'expression d'un gène, le siRNA ciblant l'ARNm transcrit à partir de ce
gène.
Des solutions ont été décrites pour adresser des oligonucléotides vers des
cellules
particulières de l'organisme. Dans ce qui suit, une "molécule d'adressage" est
une molécule
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adressant l'oligonucléotide vers un type cellulaire particulier, comme par
exemple les cellules
endothéliales ou les cellules cancéreuses. Une molécule d'adressage n'est pas
destinée à faire
pénétrer l'oligonucléotide à l'intérieur de la cellule ou à pénétrer avec
l'oligonucléotide mais à
augmenter sa concentration à la membrane externe de la cellule d'intérêt. Par
exemple et de
façon non exhaustive, une molécule d'adressage peut être un aptamère, un
anticorps, la
transferrine, un peptide RGD, le ligand d'un récepteur, cette molécule
d'adressage
interagissant ou se liant à une molécule exprimée à la surface des cellules
ciblées, comme par
exemple un récepteur, une intégrine, un antigène membranaire comme par exemple
le PSMA
(Prostate Specific Membrane Antigen).
La molécule d'adressage est usuellement soit couplée de façon covalente avec
l'oligonucléotide, soit incorporée dans un agent de vectorisation, par exemple
une
nanoparticule ou un liposome contenant l'oligonucléotide, de façon à adresser
l'agent de
vectorisation vers la cellule ou le tissu cible. Il n'y a pas de solution
décrivant le mélange d'un
siRNA avec un composé dans une mise en oeuvre simple, notamment sans couplage
covalent
ou sans incorporation dans un agent de vectorisation, et permettant d'adresser
un siRNA vers
un type cellulaire particulier.
Le récepteur CD36 est un récepteur membranaire exprimé à la membrane des
cellules
endothéliales vasculaires et lymphatiques et exprimé par de nombreux types de
cellules,
notamment des cellules tumorales, par exemple des cellules leucémiques. Le
récepteur CD36
lie des molécules de différentes natures. C'est en particulier un récepteur
des acides gras à
longues chaînes, en particulier des acides gras en C16 ou C18, un récepteur
des lipoprotéines
de basse densité oxydées, ou LDL oxydées, un récepteur des phospholipides
oxydés, un
récepteur de la Thrombospondine, un récepteur du peptide hexaréline, un
récepteur de
l'amyloide fibrillaire.
L'effet inhibiteur de l'expression génique d'un siRNA est transitoire :
lorsqu'un siRNA
pénètre dans une cellule, il inhibe l'expression de son gène cible pendant une
durée qui est
d'autant plus courte que les cellules se divisent fréquemment, ce qui est
notamment le cas de
la plupart des cellules cancéreuses. On observe ensuite une restauration de la
quantité
d'ARNm transcrite à partir de ce gène cible et/ou de la proteine codée par cet
ARNm, créant
un effet de "pics et de vallées" (Bartlett and Davis, 2006).
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L'efficacité d'un siRNA est dépendante de sa concentration dans les cellules
du tissu ciblé
et de son temps de résidence dans ce tissu. Cette concentration dépend elle-
même de la dose
de siRNA administrée, de la stabilité de celui-ci dans les milieux
extracellulaires, de sa
capacité à pénétrer dans les cellules des tissus cibles, de la cinétique de
cette pénétration, et de
celle de son élimination. L'un des buts de l'invention est de fournir des
méthodes
d'administration systémique de siRNA, et notamment des formulations, qui
augmentent la
concentration du siRNA dans le sérum et/ou dans les tissus et /ou prolongent
la durée de ses
effets en évitant les effets de pics et de vallées.
L'invention concerne ainsi une composition comprenant au moins un siRNA, ledit
siRNA
s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la dégradation
ou dont il
inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle
il code étant
impliquée dans une pathologie, la composition étant utilisée pour la
prévention et/ou le
traitement de ladite pathologie, ladite composition étant formulée pour un
mode
d'administration systémique continue.
Un siRNA selon la présente invention s'entend d'un couple de deux
oligoribonucléotides
qui s'hybrident entre eux, chaque oligoribonucléotide comprenant de 2 à 100,
notamment 5 à
50, de préférence 13 à 25 et plus particulièrement 19, 20 ou 21
ribonucléotides. De 2 à
100 signifie 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25,
26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,
45, 46, 47, 48, 49, 50,
51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,
70, 71, 72, 73, 74, 75,
76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,
95, 96, 97, 98, 99, 100.
Selon l'invention, et dans un aspect particulier, ledit siRNA peut présenter
des
modifications chimiques telles que des modifications chimiques sur le brin
guide ou le brin
passager, sur un ou plusieurs nucléotides situés aux extrémités terminales 3'
ou 5', et/ou sur
un ou plusieurs nucléotides constituant le squelette interne.
Lesdites modifications chimiques selon l'invention se situent sur le ribose
et/ou la base
et/ou l'acide phosphorique. Lesdites modifications chimiques selon l'invention
comprennent
au moins une substitution du groupement OH en 2' du ribose par un groupement
2'-0-methyl
RNA (2'0Me) ou 2'-0-methoxyethyl (2'MOE) ou 2'-fluoro (2'F) ou 2'-fluoro-13-
arabinonucleotide (FANA), une allylation de l'oxygène en 2' en aminoethyl-,
guanidinoethyl-
, cyanoethyl- ou alkyl, un remplacement du groupement phosphodiester par un
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phosphorothioate, une alkylation ou une thiolation de un ou plusieurs
nucléotides du siRNA,
le remplacement d'un ribonucléotide par un desoxyribonucléotide, ou le
remplacement d'un
nucléotide par un Locked Nucleic Acid (LNA).
Dans un autre aspect particulier, ledit siRNA est dépourvu de modification
chimique.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA est dépourvu de modification chimique,
et
comporte deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux
désoxythymidines.
Dans un autre aspect particulier, ledit siRNA est dépourvu de modification
chimique,
et ne comporte pas deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3',
notamment deux
désoxythymidines.
L'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans
laquelle ledit siRNA peut être n'importe quel type de siRNA. En effet, la
formulation et la
méthode d'administration, objet de la présente invention, ne dépend ni du
siRNA administré
ni de la cible du siRNA comme illustré par les exemples 3 et 9.
Dans un aspect particulièrement préféré, l'invention concerne une composition
pour
son utilisation susmentionnée (systémique et continue), dans laquelle au moins
un siRNA
comprend ou est constitué par l'un des couples d'oligonucléotides tels que
définis dans le
Tableau 1.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ledit au moins un siRNA est l'un des siRNA
suivants: siAR-1,
siAR- lb, siAR-2, siAR-2b, siAR-3, siAR-3b, siAR-4, siAR4b, siAR-5, siAR-5b,
siVEGF-1,
siVEGF-lb, siTSP1-1, siTSP1-1b, siTSP1-2, siTSP1-2b, siTSP1-3, siTSP1-3b,
siTSP1-4,
siTSP1-4b, siTSP1-5, siTSP1-5b, siFoxP3-1, siFoxP3-1b, siFoxP3-2, siFoxP3-2b,
tels
qu'indiqués dans le Tableau 1 et de sequences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 52.
La présente invention repose également sur les résultats inattendus des
Inventeurs qui ont
mis en évidence de nouveaux siRNA ciblant le facteur de transcription FoxP3.
Les siRNA ciblant FoxP3 sont plus particulièrement utilisés pour cibler les
cellules
suppressives ou immunosuppressives en particulier les lymphocytes T
suppresseurs
également appelés lymphocytes T régulateurs, et en particulier dans tous les
types de cancers
ou dans les maladies auto immunes. Les oligonucléotides ciblant FoxP3 sont
aussi utilisés
pour cibler des cellules cancéreuses exprimant ce facteur de transcription.
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Dans un aspect particulier, la présente invention concerne également un siRNA
inhibant
la synthèse du facteur de transcription FoxP3, dans lequel ledit siRNA est
l'un des siRNA
suivants : siFoxP3-1, siFoxP3-1b, siFoxP3-2 ou siFoxP3-2b tels que définis
dans le Tableau 1
pour son utilisation comme médicament ou pour son utilisation pour la
prévention et/ou le
traitement d'une pathologie associée à l'expression du facteur de
transcription FoxP3 en
association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Dans un aspect particulier, dans ladite composition pour son utilisation dans
la prévention
et/ou le traitement d'une pathologie associée à l'expression du facteur de
transcription FoxP3,
ledit siRNAprésente des modifications chimiques.
Dans un aspect particulier, ladite composition pour son utilisation dans la
prévention
et/ou le traitement d'une pathologie associée à l'expression du facteur de
transcription FoxP3,
ledit siRNAest dépourvu de modification chimique.
Dans un aspect particulier, ladite composition pour son utilisation dans la
prévention
et/ou le traitement d'une pathologie associée à l'expression du facteur de
transcription FoxP3,
ledit siRNAest dépourvu de modification chimique et comporte deux
désoxynucléotides
débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxythymidines.
Dans un aspect particulier, ladite composition pour son utilisation dans la
prévention
et/ou le traitement d'une pathologie associée à l'expression du facteur de
transcription FoxP3,
ledit siRNAest dépourvu de modification chimique et ne comporte pas deux
désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxythymidines.
Tels que définis dans le Tableau 1, dans l'invention, les siRNA siAR-1, siAR-
lb,
siAR-2, siAR-2b, siAR-3, siAR-3b, siAR-4, siAR-4b, siAR-5, siAR-5b sont
collectivement
dénommés famille des siRNA-AR.
Tels que définis dans le Tableau 1, dans l'invention, les siRNA siVEGF-1,
siVEGF-
lb sont collectivement dénommés famille des siRNA-VEGF.
Tels que définis dans le Tableau 1, dans l'invention, les siRNA siTSP1-1,
siTSP1-1b,
siTSP1-2, siTSP1-2b, siTSP1-3, siTSP1-3b, siTSP1-4, siTSP1-4b, siTSP1-5,
siTSP1-5b sont
collectivement dénommés famille des siRNA-TSP1.
Tels que définis dans le Tableau 1, dans l'invention, les siRNA siFOXP3-1,
siFOXP3-
lb, siFOXP3-2, siFOXP3-2b, sont collectivement dénommés famille des siRNA-
FoxP3.
L'expression au moins 75% d'identité avec une séquence dans le Tableau 1
signifie 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,
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89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et 100%, notamment 79%,
81%, 84%, 86%, 90%, 95% et 99%.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ledit au moins un siRNA est un mélange de siRNA.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ledit mélange est un mélange de deux siRNA.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ledit mélange est un mélange de trois siRNA.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ledit mélange de siRNA comprend ou est constitué
des siRNA
suivants :
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-AR avec un siRNA appartenant
à la
famille des siRNA-VEGF, et en particulier le siRNA siAR-1 et le siRNA siVEGF-1
;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-AR avec un siRNA appartenant
à la
famille des siRNA-TSP1, et en particulier le siRNA siAR-1 et le siRNA siTSP1-1
;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-AR avec un siRNA appartenant
à la
famille des siRNA-FoxP3, et en particulier le siRNA siAR-1 et le siRNA siFoxP3-
2 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF avec un siRNA
appartenant à la
famille des siRNA-TSP1, et en particulier le siRNA siVEGF-1 et le siRNA siTSP1-
1 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF avec un siRNA appartenant à
la
famille des siRNA-FoxP3, et en particulier le siRNA siVEGF-1 et le siRNA
siFoxP3-2 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-TSP1 avec un siRNA
appartenant à la
famille des siRNA-FoxP3, et en particulier le siRNA siTSP1-1 et le siRNA
siFoxP3-2 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF avec un siRNA
appartenant à la
famille des siRNA-TSP1, et avec un siRNA appartenant à la famille des siRNA-
FoxP3, et en
particulier le siRNA siVEGF-1 avec le siRNA siTSP1-1 et avec le siRNA siFoxP3-
2 ; un
siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF avec un siRNA appartenant à la
famille des
siRNA-TSP1, avec un siRNA appartenant à la famille des siRNA-AR, et en
particulier le
siRNA siVEGF-1 avec le siRNA siTSP1-1 et avec le siRNA siAR-1.
Un aspect avantageux de l'invention concerne une composition dans laquelle
ledit siRNA
est le siAR-1, de SEQ ID NO 1 et 2, pour son utilisation comme médicament ou
pour son
utilisation pour la prévention et/ou le traitement d'une pathologie associée à
l'expression du
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récepteur des androgènes, notamment pour la prévention et/ou le traitement du
cancer de la
prostate ou des métastases de ce cancer, en association avec un véhicule
pharmaceutiquement
acceptable, selon un mode d'administration systémique continue.
Dans tous les aspects de la présente invention, la pathologie selon
l'invention est une
pathologie humaine ou animale.
Selon un aspect particulier de l'invention, la pathologie selon l'invention
est plus
particulièrement associée à l'expression de l'ARNm codant le récepteur des
androgènes (AR),
ou la Thrombospondine-1 (TSP1), ou le facteur de transcription FoxP3, ou le
Vascular
Endothelial Growth Factor A (VEGF).
La pathologie selon l'invention, qu'elle soit associée ou non à l'expression
d'AR, ou de la
TSP1, ou de FoxP3, ou du VEGF, est plus particulièrement une tumeur primaire,
une tumeur
métastatique, ou une pathologie associée à la présence de cellules
suppressives ou
immunosuppressives.
Une "tumeur primaire" selon l'invention est notamment et de façon non
limitative un
cancer de l'anus, de l'appendice, de la bouche, des bronches et/ou des voies
aériennes
supérieures, du canal biliaire, de la cavité nasale et paranasale, du cerveau,
du coeur, du col de
l'utérus, du colon, du corps de l'utérus, de l'estomac, du foie, des glandes
salivaires, de la
gorge, de la langue, des lèvres, du nasopharynx, de l'oesophage, des os, de
l'ovaire, du
pancréas, de la parathyroïde, du pénis, de la plèvre, du poumon, de la
prostate, du rectum, du
rein, du sein, des surrénales, des testicules, de la tête et du cou, du
thymus, de la thyroïde, de
l'urètre, du vagin, de la vésicule biliaire, de la vessie, de la vulve, un
cancer gastro-intestinal,
un lymphome, un mélanome ou un cancer de la peau hors mélanome, un myélome, un
sarcome, une leucémie, un mésotheliome, un cholangiocarcinome, un
ostéosarcome, un
glioblastome, un astrocytome, un oligodendrogliome, un chondrosarcome, un
liposarcome, un
rhabdomyosarcome, ou un pheochromocytome, collectivement nommés tumeurs
primaires
dans la suite de la description, ou les métastases de n'importe laquelle de
ces tumeurs
primaires se développant dans d'autres organes. Les métastases représentent
une complication
fréquente et majeure des cancers et les échecs thérapeutiques en cancérologie
sont
majoritairement liés au développement de métastases. Une tumeur primaire peut
se
disséminer pour former une ou plusieurs métastases, dans un seul ou dans
plusieurs types de
tissus tels que les os, le foie, la rate, les ganglions ou le cerveau. Pour
traiter les cancers avec
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un siRNA ou une combinaison de siRNA, il est donc particulièrement utile et
avantageux de
disposer de méthodes d'administration qui distribuent le ou les siRNAs dans
plusieurs tissus.
L'expression pathologie associée à la présence de cellules suppressives ou
immunosuppressives signifie que lesdites cellules suppressives ou
immunosupressives
facilitent le développement d'une pathologie et notamment l'initiation,
l'implantation ou le
développement d'une tumeur ou sa dissémination métastatique. Ce terme regroupe
en
particulier les lymphocytes T régulateurs, également appelés T suppresseurs,
les lymphocytes
Th17 et les MDSC (myeloid-derived suppressor cells).
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ledit siRNA est utilisée en association avec au
moins un agent
anti-angiogénique et/ou un agent anti-tumoral et/ou un agent
immunothérapeutique, pour une
utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps. L'expression séparée
ou étalée dans
le temps signifie également successives .
Selon l'invention, le terme agent anti-angiogénique signifie un agent destiné
à inhiber
la formation de vaisseaux sanguins, notamment en inhibant l'expression ou la
fonction de
VEGF, FGF2, PDGF, HGF, MET, FLT3, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, KIT, TIE1, TIE2,
RET, TRKB, AXL. De tels agents sont notamment Cilengitide, Vandetanib,
Lenalidomide,
Thalidomide, Arsenic Trioxide, Bevacizumab, ou encore des agents listés dans
le Tableau 2.
Selon l'invention, un agent immunothérapeutique est un agent qui a pour
objectif de
stimuler, notamment par une vaccination, et/ou de rétablir une réponse
immunitaire,
notamment par l'inhibition des cellules immunosuppressives ou suppressives,
et/ou par
inhibition de l'anergie des lymphocytes. Les immunothérapies au sens de
l'invention sont
notamment les thérapies mettant en oeuvre l'administration de cytokines,
d'anticorps ciblant
les points de contrôle et de régulation du système immunitaire (check-point
immunitaires, par
exemple PD1, PDL1, CTLA4, Tigit), le traitement par des lymphocytes T,
génétiquement
modifiés (Car-T) ou non, ou par des cellules dendritiques, la vaccination, les
traitements anti-
helminthes. Un tel agent est notamment choisi parmi Ipilimumab, nivolimumab, T-
Vec,
Sipuleucel-T, Blinatumomab, Pembrolizumab, ou parmi les agents du Tableau 3.
Selon l'invention, un agent anti-tumoral ou chimiothérapeutique est un agent
possédant des propriétés anti-cancéreuses choisi parmi : les agents alkylants,
les agents anti-
métabolites, les antibiotiques cytotoxiques, les inhibiteurs de topoisomérase
I, les inhibiteurs
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de topoisomérase II, les antibiotiques anti-tumoraux, les agents génotoxiques,
les inhibiteurs
de la PARP, les agents anti-microtubules. Un tel agent est par exemple choisi
parmi :
Bendamustine, Temozolomide, Mechlorethamine, Cyclophosphamide, Carmustine,
Cisplatine, Busulfan, Thiotepa, Decarbazine, Pentostatine, Methotrexate,
Pemetrexed,
Floxuridine, Fluorouracil, Cytarabine, Mercaptopurine, Thiguanine, Rubitecan,
Mitomycine
C, Daunorubicin, Doxorubicine, Bleomycin, Plicamycin, Mitoxantrone HC1,
Oxaliplatine,
Vinorelbine, BMS 184476, Vincristine sulfate, Vinblastine, Taxotere, Taxol, ou
encore les
agents mentionnés dans le Tableau 4.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ladite composition comprend un siRNA appartenant
à la famille
des siRNA-AR en association avec un agent anti-tumoral et/ou un agent
immunothérapeutique et/ou un agent antiangiogénique.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ladite composition comprend un siRNA appartenant
à la famille
des siRNA-VEGF en association avec un agent anti-tumoral et/ou un agent
immunothérapeutique et/ou un agent antiangiogénique.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ladite composition comprend un siRNA appartenant
à la famille
des siRNA-TSP1 en association avec un agent anti-tumoral et/ou un agent
immunothérapeutique et/ou un agent antiangiogénique.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ladite composition comprend un siRNA appartenant
à la famille
des siRNA-FoxP3 en association avec un agent anti-tumoral et/ou un agent
immunothérapeutique et/ou un agent antiangiogénique.
Dans tous les aspects de la présente invention, ledit mode d'administration
systémique
selon l'invention est choisi parmi le groupe comprenant ou étant constitué de
l'un des modes
d'administration suivants: sous-cutané, intrapéritonéal, intraveineux, intra
artériel,
intracardiaque, intramusculaire, intradermique, intranasal, intravaginal,
intrarectal, sublingual,
oral, intrathécal, intra rachidien, épidural, respiratoire, cutanée,
transdermique, transmuqueux.
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Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ladite composition est formulée pour un mode
d'administration
à une dose thérapeutiquement efficace, et notamment à des doses de 0.005
mg/kg/jour à 30
mg/kg/jour, notamment 0.01 mg/kg/jour à 10 mg/kg/jour, et plus
particulièrement de 0.01
mg/kg/jour à 2 mg/kg/jour chez l'homme.
De 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour s'entend de toutes les doses allant de
0.005
mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour, par exemple 0.008 ; 0.01 ; 0.05 ; 0.1 ; 0.5; 1.0;
1.5; 10.0; 10.5;
14.0; 14.5 ; 20 ; 20.5 ; 25 ; 25.5 ; 29.5 mg/kg/jour.
Dans un premier aspect, la présente invention repose sur les résultats
inattendus des
Inventeurs selon lesquels l'efficacité d'un siRNA administré par un mode
d'administration
systémique continue est meilleure que lorsque le même siRNA, formulé dans la
même
solution, est administré par un mode d'administration systémique en bolus, "en
bolus" étant
défini comme l'administration de la dose complète en une seule fois, cette
dose pouvant être
répétée au cours du traitement, par exemple chaque jour ou plusieurs fois par
jour. Le mode
d'administration continu est défini comme étant un mode qui évite les effets
de pics et de
vallées observés sur la concentration de siRNA dans le sang, le sérum et les
différents organes
lorsque ledit siRNA est administré en bolus. Le mode d'administration continu
a pour objectif
de maintenir sensiblement constante la concentration du siRNA dans le sang et
les tissus
périphériques pendant tout le temps d'administration du siRNA. L'expression
maintenir
sensiblement constante signifie que la concentration du siRNA dans le sang et
les tissus
périphériques peut légèrement varier selon le métabolisme de l'individu qui
reçoit ladite
composition.
Le temps d'administration peut varier de quelques heures à plusieurs semaines
suivant le
dispositif utilisé pour administrer le siRNA. Ce dispositif peut être une
pompe ou toute
composition visant une libération lente et prolongée dans le temps du siRNA.
Dans cet aspect particulier, l'invention concerne ainsi une composition
comprenant au
moins un siRNA, ledit siRNA s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant,
dont il
induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm
ou de la
protéine pour laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, la
composition étant
utilisée pour la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ladite
composition étant
formulée pour un mode d'administration systémique continue.
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Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode
d'administration
systémique continue est délivré sans interruption de l'administration pendant
une durée
supérieure ou égale à 2 jours.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode
d'administration
systémique continue est délivré sans que l'administration ne soit interrompue
au delà du temps
nécessaire pour recharger ou échanger le dispositif délivrant le siRNA, par
exemple 4 heures,
pendant une durée allant de 2 jours à 1 an, par exemple 2 jours, 3 jours, 4
jours, 5 jours, 6
jours, 7 jours, 8 jours, 9 jours, 10 jours, 11 jours, 12 jours, 13 jours, 14
jours, 15 jours, 3
semaines, 1 mois, 2 mois, 3 mois, 4 mois, 5 mois, 6 mois, 9 mois, 1 an.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode
d'administration
systémique continue est délivré par cycles successifs, interrompus par une
période sans
traitement allant de plus de 24 heures à quelques semaines, chaque cycle étant
défini par
l'administration systémique continue sans interruption supérieure au temps
nécessaire pour
recharger ou échanger le dispositif délivrant le siRNA, par exemple 4 heures,
et pendant une
durée allant de 2 jours à 1 mois.
Dans un aspect préféré selon l'invention, ledit mode d'administration
systémique
continue est sous-cutané.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ladite composition est formulée pour un mode
d'administration,
en continu et en sous-cutané, à une dose thérapeutiquement efficace, et
notamment à des
doses de 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour, notamment 0.01 mg/kg/jour à 10
mg/kg/jour et
plus particulièrement de 0.01 mg/kg/jour à 2 mg/kg/jour.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle la séquence de l'un des brins dudit
oligonucléotide est différente
de:
- SEQ ID NO :53 (GGGUUAUGUCUAUGUUCAUUCUU), ou
- SEQ ID NO :54 (GGAAUGGCCUGUGCUUUCUCAUU)
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Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ledit mode d'administration systémique continue
est l'un des
modes d'administration suivants : intrapéritonéal, intraveineux,
intramusculaire,
intradermique, intranasal, intravaginal, intrarectal, sublingual, oral,
intrathécal, ET ledit au
moins un siRNA appartient à l'une des 4 familles de siRNA suivantes : famille
des siRNA-
AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ledit mode d'administration systémique continue
est sous-
cutané et ledit au moins un siRNA appartient à l'une des 4 familles de siRNA
suivantes :
famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille
des
siRNA FoxP3.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ladite pathologie est n'importe laquelle des
tumeurs primaires
susmentionnées, ou des métastases d'une de ces tumeurs primaires se
développant dans
d'autres organes, et ledit au moins un siRNA appartient à l'une des 4 familles
de siRNA
suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-
TSP1,
famille des siRNA FoxP3.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ladite pathologie est un cancer du sein, ou un
mélanome, ou un
glioblastome, ou un cancer du rein, ou un cancer du foie, ou un cancer de la
vessie, ou un
cancer du colon ou des métastases d'un de ces cancers se développant dans
d'autres organes,
ou une leucémie ou un myélome, et ledit au moins un siRNA appartient à l'une
des 4 familles
de siRNA suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des
siRNA-
TSP1, famille des siRNA FoxP3, et en particulier le siRNA siAR-1, ou le siRNA
siVEGF-1,
ou le siRNA siTSP1-1, ou le siRNA siFoxP3-1, seuls ou en association deux à
deux ou trois à
trois.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
susmentionnée, dans laquelle ladite pathologie est un cancer de la prostate ou
des métastases
de ce cancer se développant dans d'autres organes, et ledit au moins un siRNA
appartient à
l'une des 4 familles de siRNA suivantes : famille des siRNA-AR, famille des
siRNA-VEGF,
famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3, et en particulier le siRNA
siAR-1, ou le
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siRNA siVEGF-1, ou le siRNA siTSP1-1, ou le siRNA siFoxP3-2, seuls ou en
association
deux à deux ou trois à trois et plus particulièrement le siRNA siAR-1.
Dans un autre aspect, l'invention concerne également un dispositif fournissant
un moyen
d'administration systémique et continue d'une composition formulée pour un
mode
d'administration systémique continue comprenant au moins un siRNA ledit siRNA
s'hybridant avec un ARNm codant ou non codant dont il induit la dégradation ou
dont il
inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle
code ledit
ARNm étant impliquée dans une pathologie, et la composition étant utilisée
pour la
prévention et/ou le traitement de ladite pathologie.
Dans un aspect particulier, ledit moyen d'administration systémique continu
est
notamment une pompe osmotique, une pompe-seringue, une pompe élastomérique,
une
pompe péristaltique, une pompe multi-canaux, une pompe contrôlée par le
patient, une pompe
intelligente , ou une pompe patch , ou une matrice polymérique ou un
hydrogel, ou tout
autre composé biodégradable visant à libérer de façon lente et continue le
siRNA de telle sorte
qu'il soit distribué de façon systémique dans l'organisme. Certains de ces
dispositifs peuvent
être utilisés dans d'autres indications thérapeutiques, pour délivrer un agent
thérapeutique de
façon discontinue, notamment en bolus. Dans le présent aspect, ils sont
utilisés pour libérer la
composition sus mentionnée avec un débit sensiblement constant et sans
interruption pendant
plusieurs jours à plusieurs semaines ou d'avantage. L'expression débit
sensiblement
constant signifie que le débit peut légèrement varier selon la précision du
dispositif utilisé.
Par exemple, la variation peut être d'environ plus ou moins 10% par rapport au
débit fixé.
Le dispositif peut être mécanique ou électronique. Il peut être porté à
l'extérieur ou
implanté chirurgicalement, par exemple sous la peau, ou dans le péritoine, ou
en
intramusculaire. De façon non exhaustive ces dispositifs utilisables en
clinique humaine sont :
des pompes osmotiques, composées d'un réservoir souple entouré d'un
compartiment
contenant un gel salin qui en s'hydratant compresse le réservoir interne en
forçant l'expulsion
du liquide. Ce mécanisme, qui est utilisé par exemple dans les pompes Duros de
la société
Durect utilisées en clinique humaine, est similaire à celui des pompes Alzet
qui sont
uniquement autorisés pour une utilisation chez les animaux ;
- des seringues automatisées comme par exemple : McKinley T34 ou T60,
Bodyguard
323, AD syringe driver (Cardinal health), MS drivers (Smiths Medical) ;
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- des pompes en élastomère : le produit est contenu dans un réservoir
compressible lui-
même contenu dans un ballon exerçant une pression contrôlée sur le réservoir
interne et
forçant l'expulsion du liquide comme par exemple : Accufuser (WOO YOUNG
Medical),
Dosi-fuser (spirit medical), Exacta (Gamastech), Myfuser ;
- des pompes péristaltiques : une tubulure flexible est comprimée
mécaniquement pour
délivrer le contenu comme par exemple : iPrecio, SP100 (APT instruments) ;
- des pompes multicanaux ou simple canal contrôlées par le patient comme
par exemple :
Accucheck, one touch ping (Animas), Accufuser ;
- des pompes patch : le réservoir de produit adhère directement à la
peau et contient
un système intégré, sans tubulure, d'administration comme par exemple :
CeQurPaQ,
Omnipod (Insulet), Finesse (Calibra), V-Go (Valeritas) ;
- des pompes dites intelligentes équipées de dispositifs de sécurité
qui modulent
l'administration du produit en fonction de paramètres prédéfinis ou mesurés
chez le patient
comme par exemple : miniMed 530G, paradigm Veo (medtronics), Vibe (Animas);
- des pompes implantables comme par exemple : Replenish minipump, Medtronic,
Duros
Durect, Infusaid, promedos. Ces pompes permettent de délivrer de faibles
volumes du produit
thérapeutique, à des débits précis ou de façon automatique à des intervalles
de temps
prédéfinis.
Il peut également être envisagé de mettre les oligonucléotides secs dans un
dispositif qui
une fois mis sous la peau capture l'eau des tissus, et libère le siRNA qui est
solubilisé dans les
fluides extracellulaires. On peut également envisager d'incorporer le siRNA
dans une matrice
polymérique, un gel ou tout autre composé qui libère le siRNA de façon lente
et prolongée
dans le temps. Ce dispositif peut être un comprimé adhérant à la muqueuse et
libérant le
siRNA à travers celle-ci.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA administré par le dispositif
susmentionné est
associé à une molécule d'adressage.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA administré par le dispositif
susmentionné n'est
pas associé à une molécule d'adressage.
Dans un aspect particulier, ledit au moins un oligonucléotide qui est
administré par ledit
dispositif comprend ou est constitué par l'un des siRNA appartenant aux
familles de siRNA
suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-
TSP1,
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famille des siRNA FoxP3, et en particulier le siRNA siAR-1, ou le siRNA siVEGF-
1, ou le
siRNA siTSP1-1, ou le siRNA siFoxP3-2.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode
d'administration
.. systémique continue est dilué dans une solution aqueuse contenant 154mM de
NaCl.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode
d'administration
systémique continue par voie sous cutanée dilué dans une solution aqueuse
contenant 154
mM de NaCl appartient à l'une des 4 familles de siRNA suivantes : famille des
siRNA-AR,
famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3, et en
particulier le siRNA siAR-1, ou le siRNA siVEGF-1, ou le siRNA siTSP1-1, ou le
siRNA
siFoxP3-1, seuls ou en association deux à deux ou trois à trois.
Dans un autre aspect, la présente invention repose sur les résultats
inattendus des
Inventeurs, selon lesquels la concentration de siRNA dans le sérum, dans de
nombreux tissus
et/ou dans des tumeurs est plus élevée lorsque le siRNA est administré par
voie systémique en
étant formulé dans une solution tampon à pH acide que lorsque ce même siRNA
est formulé
dans une solution aqueuse contenant 154 mM de NaCl. La présence de cations
comme le
Zn2+ ou le Mg2+ dans une solution aqueuse de siRNA conduit à leur dégradation
et lorsque
le siRNA est administré de façon systémique, la présence de tels cations dans
la solution
d'injection réduit la concentration du siRNA dans le sérum et dans les
organes. De façon
inattendue, les Inventeurs ont observé que l'addition de cations dans une
solution tampon à
pH acide augmentait la concentration de siRNA dans le sérum, dans de nombreux
tissus
et/ou dans des tumeurs, lorsque ledit siRNA est administré par voie
systémique.
Une solution tampon suivant la présente invention assure la stabilité du pH de
la solution
de dilution du siRNA. Des exemples de tels tampons sont donnés dans le Tableau
5.
Dans cet autre aspect, l'invention concerne ainsi une composition comprenant
au moins
un siRNA, ledit siRNA s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il
induit la
dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la
protéine pour
laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, la composition étant
utilisée pour la
prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ladite composition étant
formulée pour un
mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA
est dans une
solution tampon à pH acide.
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Dans un aspect préféré de l'invention, le pH de la solution tampon est acide,
allant de pH
3 à pH 7, préférentiellement de pH 5 à pH 6.5 et préférentiellement à pH 6.
Dans un aspect préféré de l'invention la solution tampon est un tampon citrate
ou histidine
à pH 6.
La présente invention repose également sur des résultats inattendus des
Inventeurs selon
lesquels la concentration de siRNA dans le sérum, dans de nombreux tissus
et/ou dans des
tumeurs est plus élevée lorsque le siRNA est administré par voie systémique
continue en étant
formulé dans une solution tampon à pH acide contenant des cations provenant de
sels
minéraux ou organiques, que lorsque ce même siRNA est formulé dans une
solution tampon à
pH acide sans cations ou dans une solution de NaCl 154mM. Ces cations au sens
de
l'invention ne sont pas des constituants de la solution tampon, ils ne sont
pas destinés à
assurer un effet tampon, mais ils sont ajoutés à cette solution tampon. Ces
cations sont par
exemple et de façon non limitative des polyamines, notament la putrescine,
et/ou la
spermidine, et/ou la spermine, et/ou des sels dont le cation est choisi parmi
les cations
métalliques tels que par exemple Zn2+, Co2+, Cu2+, Mn2+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, le
contre ion
pouvant être d'une nature quelconque, par exemple un ion chlorure, nitrate,
sulfate, ou
carbonate. Dans un aspect préféré de l'invention, la solution tampon contient
du MgCl2, du
ZnC12, du MnC12, ou un mélange deux à deux de ces sels, ou un mélange des
trois sels.
Dans un aspect particulier, qu'ils soient utilisés seuls ou en combinaison, la
concentration
de chaque cation est comprise de 0.02 mM à 200 mM, préférentiellement de 0.05
à 100 mM
et préférentiellement de 1 à 50mM. Dans un aspect préféré de l'invention, les
cations sont
ajoutés à une solution tampon qui est un tampon citrate ou un tampon
histidine. Dans un
aspect préféré de l'invention, le pH de cette solution est de 6.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode
d'administration
systémique continue est dilué dans un tampon citrate ou histidine à pH 6
contenant du MgCl2
à 10mM.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode
d'administration
systémique continue, dilué dans un tampon acide contenant des cations
appartient à l'une des
4 familles de siRNA suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF,
famille
des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3, et en particulier le siRNA siAR-1, ou
le siRNA
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siVEGF-1, ou le siRNA siTSP1-1, ou le siRNA siFoxP3-1, seuls ou en association
deux à
deux ou trois à trois.
Dans un autre aspect, la présente invention repose sur les résultats
inattendus des
Inventeurs selon lesquels la concentration de siRNA dans le sérum, de nombreux
tissus et/ou
des tumeurs est plus élevée lorsque le siRNA est administré par voie
systémique continue
contenant une molécule d'adressage.
Ainsi, selon l'invention et dans un aspect particulier, ladite composition
contient un agent
d'adressage, en particulier, ladite composition contient un agent d'adressage
non couplé de
façon covalente au siRNA.
Selon l'invention et dans un aspect particulier, ladite composition ne
contient pas d'agent
d'adressage.
Selon l'invention et dans un aspect particulier, ladite composition est
formulée pour un
mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA
est dans une
solution tampon à pH acide, ladite composition contient un agent d'adressage,
en particulier,
ladite composition contient un agent d'adressage non couplé de façon covalente
au siRNA.
Selon l'invention et dans un aspect particulier, ladite composition est
formulée pour un
mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA
est dans une
solution tampon à pH acide, ladite composition ne contient pas d'agent
d'adressage.
Dans un aspect particulier de l'invention, cette molécule d'adressage est un
ligand du
récepteur CD36, par exemple des LDL oxydés, de l'hexareline ou un acide gras à
longue
chaine (plus de 16 carbones), ou un mélange de ces composants deux à deux ou
trois à trois.
Dans un aspect préféré de l'invention, la composition susmentionnée contient
des LDL
oxydés dans un rapport poids:poids de 1 siRNA pour 0.01 à 10 LDL oxydés et
préférentiellement de 0.1 à 1, ou de l'hexaréline, dans un rapport poids:poids
de 1 siRNA
pour 0.01 à 10 hexaréline, préférentiellement de 0.1 à 1.
Dans un aspect préféré de l'invention, la composition susmentionnée contient
des LDL
oxydés dans un rapport poids:poids de 1 siRNA pour 0.01 à 10 LDL oxydés et
préférentiellement de 0.1 à 1, ou de l'hexaréline, dans un rapport poids:poids
de 1 siRNA
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pour 0.01 à 10 hexaréline, préférentiellement de 0.1 à 1 et est administrée
par voie systémique
continue.
Dans un aspect préféré de l'invention, la composition susmentionnée est
formulée pour un
mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA
est dans une
solution tampon à pH acide, notamment dans un tampon citrate ou histidine, et
ladite
composition contient un agent d'adressage non couplé de façon covalente au
siRNA, ledit
agent d'adressage étant un ligand du récepteur CD36, ledit ligand au récepteur
CD36 étant de
préférence des LDL oxydés, de l'hexaréline, un acide gras à longue chaîne, ou
un mélange de
ces composant deux à deux ou trois à trois
Dans un aspect préféré de l'invention, la composition susmentionnée est
formulée pour un
mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA
est dans un
tampon citrate et ladite composition contient un agent d'adressage, ledit
agent d'adressage
étant des LDL oxydés
Selon l'invention, ladite composition comprend au moins un siRNA, ledit siRNA
s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la dégradation
ou dont il
inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle
il code étant
impliquée dans une pathologie, la composition étant utilisée pour la
prévention et/ou le
traitement de ladite pathologie, ledit siRNA étant dans une solution contenant
ou ne contenant
pas d'agent de vectorisation.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition susmentionnée
comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA étant dans une solution ne contenant
pas
d'agent de vectorisation ou dans laquelle ledit siRNA n'est pas associé à un
agent de
vectorisation.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition susmentionnée
comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA étant dans une solution contenant un
agent de
vectorisation.
Dans autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant au moins un
siRNA,
ledit siRNA s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la
dégradation
ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine
pour laquelle il
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code étant impliquée dans une pathologie, la composition étant utilisée pour
la prévention
et/ou le traitement de ladite pathologie, ladite composition étant formulée
pour un mode
d'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue. Une
administration
en bolus unique ou répétée dans le temps ou une administration en infusion
lente sur une
durée allant de quelques minutes à quelques heures sont des exemples non
limitatifs de mode
d'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue.
Dans un aspect particulier de l'invention, l'administration systémique autre
qu'un mode
d'administration continue de ladite composition comprenant au moins un siRNA
peut être
associée à une administration systémique continue de ladite composition, de
façon
simultanée, séparée ou étalée dans le temps.
Dans un aspect particulier, ladite composition peut être formulée pour un mode
d'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue dans
laquelle ledit au
moins siRNA est dans une solution tampon à pH acide, notamment dans un tampon
citrate ou
histidine.
Dans un aspect particulier de l'administration systémique autre qu'un mode
d'administration continue, la solution tampon à pH acide peut être additionnée
de sels
minéraux ou organiques, notamment de sel dont le cation est choisi parmi les
polyamines,
notamment choisi parmi la spermine, la spermidine ou la putrescine ou
notamment de sel
dont le cation est choisi parmi les cations métalliques, notamment choisi
parmi les sels de
zinc, cobalt, cuivre, manganèse, calcium, magnésium ou de fer, en particulier
de manganèse,
zinc, magnésium, seuls ou en combinaison deux à deux ou trois à trois
Dans un aspect particulier de l'administration systémique autre qu'un mode
d'administration continue, ladite composition peut contenir un agent
d'adressage,
Dans un aspect particulier de l'administration systémique autre qu'un mode
d'administration continue, ladite composition contient un agent d'adressage,
de préférence
non couplé de façon covalente au siRNA.
Dans un aspect particulier de l'administration systémique autre qu'un mode
d'administration continue, ladite composition ne contient pas d'agent
d'adressage.
Ladite molécule d'adressage peut, par exemple, être un ligand du récepteur
CD36, tels
que des LDL oxydés, de l'hexaréline, un acide gras à longue chaîne, ou un
mélange de ces
composant deux à deux ou trois à trois
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Dans un aspect particulier, ledit siRNA est dans une solution ne contenant pas
d'agent de
vectorisation ou dans laquelle ledit siRNA n'est pas associé à un agent de
vectorisation.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA est dans une solution contenant un
agent de
vectorisation.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son
utilisation
selon un mode d'administration systémique, dans laquelle ledit siRNA est
utilisé en
association avec au moins un agent anti-angiogénique et/ou un agent anti-
tumoral et/ou un
agent immunothérapeutique, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée
dans le temps.
Dans un autre aspect, la présente invention repose également sur les résultats
inattendus des Inventeurs selon lesquels l'administration de siRNA ciblant la
Thrombospondine-1 ou le VEGF, par un mode d'administration continue, en
intracérébral ou
en intrathécal, permet également de délivrer efficacement lesdits siRNA et
d'inhiber ainsi
l'expression génique du gène cible di siRNA.
Ainsi, et dans cet aspect, la présente invention concerne une composition
comprenant au
moins un siRNA, ledit siRNA s'hybridant avec un ARNm codant ou non codant dont
il induit
la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de
la protéine pour
laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, la composition étant
utilisée pour la
prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ladite composition étant
formulée pour un
mode d'administration continue, en intracérébral ou en intrathécal.
Dans un aspect de l'invention, ladite composition pour son utilisation
susmentionnée en
continue et en intracérébral, est notamment utilisée pour la prévention et/ou
le traitement d'un
cancer du cerveau, notamment un glioblastome. Lorsque la pathologie est un
cancer du
cerveau, notamment un glioblastome, les siRNA sont plus particulièrement
choisis
parmi l'une des 2 familles de siRNA suivantes : famille des siRNA-VEGF,
famille des
siRNA-TSP1, et en particulier le siRNA siVEGF-1, ou le siRNA siTSP1-1, seuls
ou en
association.
Dans un aspect particulier de l'invention, ladite composition pour son
utilisation
susmentionnée, est formulée pour un mode d'administration à une dose
thérapeutiquement
efficace en intracérébral ou intrathécal continue, en particulier à des doses
de 0,01 mg/kg/jour
à 10 mg/kg/jour, notamment 0,01 mg/kg/jour à 2 mg/kg/jour
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Dans autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique
comprenant
comme substance active au moins un siRNA, ledit siRNA s'hybridant avec un
ARNm, codant
ou non codant, dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction,
l'expression dudit
ARNm ou de la protéine pour laquelle il code étant impliquée dans une
pathologie, ledit au
moins siRNA étant en association avec un véhicule pharmaceutiquement
acceptable dans une
solution tampon à pH acide, notamment dans un tampon citrate ou histidine,
additionnée ou
non de sels minéraux ou organiques, notamment de sel dont le cation est choisi
parmi les
polyamines, notamment choisi parmi la spermine, la spermidine ou la putrescine
ou
notamment de sel dont le cation est choisi parmi les cations métalliques,
notamment choisi
parmi les sels de
zinc, cobalt, cuivre, manganèse, calcium, magnésium ou de fer, en
particulier de manganèse, zinc, magnésium, seuls ou en combinaison deux à deux
ou trois à
trois
Dans un aspect particulier, ledit au moins un siRNA est dans une solution ne
contenant
pas d'agent de vectorisation et est associé à une molécule d'adressage, ou est
dans une
solution contenant un agent de vectorisation et est associé à une molécule
d'adressage, ou est
dans une solution contenant un agent de vectorisation et n'est pas associé à
une molécule
d'adressage, ou est dans une solution ne contenant pas d'agent de
vectorisation et n'est pas
associé à une molécule d'adressage
25
Tableau 1: Couples d'oligonucléotides constituant les siRNA selon la présente
invention c)
_______________________________________________________________________________
_________________________________________ I.)
o
SEQ
eo¨
Famille siRNA composé de:
Séquence 5 - 3' ce
ID NO èce;::_e,
ce
F1,;.;
siAR-1 Brin 1, dont la séquence est: SEQ ID NO: 1 ou une
GACUCAGCUGCCCCAUCCA [ dT ] [ d un
1 r, so, Si,
siAR- séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 1
T ]
c
1
et de siAR-1 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO: 2 ou une
UGGAUGGGGCAGCUGAGUC [ dT ] [ d
2
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 2
T ]
h,
siAR-1 Brin lb, dont la séquence est: SEQ ID NO : 3 ou une
3 GACUCAGCUGCCCCAUCCA r, so, si,
siAR- séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 3
c
lb
P
et de siAR-1 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 4 ou une
4 UGGAUGGGGCAGCUGAGUC 0
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 4
o
_______________________________________________________________________________
___________________________________________ ,
h,
siAR-2 Brin 1, dont la séquence est: SEQ ID NO : 5 ou une
GACUCAGCUGCCCCAUCCACG [ dT ]
5 r, so, si,
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 5
[ dT ] .
siRNA- siAR-2
c à
'
AR et de siAR-2 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO
: 6 ou une CGUGGAUGGGGCAGCUGAGUC [ dT ]
N)
6
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 6
[ dT ]
h,
siAR-2 Brin lb, dont la séquence est: SEQ ID NO : 7 ou une
siAR- 7 GACUCAGCUGCCCCAUCCACG r, so, si,
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 7
2b
c
et de siAR-2 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 8 ou une
8 CGUGGAUGGGGCAGCUGAGUC
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 8
________________________________________________________ so
n
siAR-3 Brin 1, dont la séquence est: SEQ ID NO : 9 ou une
UCCCCAAGCCCAUCGUAGA [ dT ] [ d
9
siAR-3 séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 9
T ]
et de siAR-3 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO: 10 ou une
UCUACGAUGGGCUUGGGGA [ dT ] [ d
10 --4
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 10
T ] o
_______________________________________________________________________________
_________________________________________ un
I.)
siAR- siAR-3 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO: 11
ou une "
11 UCCCCAAGCCCAUCGUAGA
3b séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID
NO: 11 I
26
SEQ
esp I
Famille siRNA composé de:
Séquence 5 - 3'
ID NO èce
0
et de siAR-3 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 12 ou
I.)
o
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
12 UCUACGAUGGGCUUGGGGA --,
oe
12
-a-,
-4
oe
siAR-4 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO: 13 ou une
GUAGUUGUGAGUAUCAUGA [ dT ] [ d I.)
13 IVI
siAR-4 séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 13
T ]
et de siAR-4 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO : 14 ou une
UCAUGAUACUCACAACUAC [ dT ] [ d
14
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 14
T ]
siAR-4 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO: 15 ou une
15 GUAGUUGUGAGUAUCAUGA h
siAR- séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 15
4b et de siAR-4 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO :
16 ou
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
16 UCAUGAUACUCACAACUAC
P
16
c,
.,
.
siAR-5 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO: 17 ou une
GCAUCAGUUCGCUUUUGAC [ dT ] [ d .
,
17 h
siAR-5 séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 17
T ] .
N)
.
et de siAR-5 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO: 18 ou une
GUCAAAAGCGAACUGAUGC [ dT ] [ d ,
' 18 .
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 18
T ] .
,
_______________________________________________________________________________
__________________________________________ N)
siAR-5 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO: 19 ou une
19 GCAUCAGUUCGCUUUUGAC h
siAR- séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 19
5b et de siAR-5 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO :
20 ou
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
20 GUCAAAAGCGAACUGAUGC
20
h,
siVEGF-1 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 21 ou une
AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA [ dT ] e'd
21 r, so, .n
siVEG séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 21
[ dT ]
c
F-1
siRNA- et de siVEGF-1 Brin 2, dont la séquence est: SEQ ID NO:
22 ou
UUCUUUGGUCUGCAUUCACAU [ dT ]
VEGF une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ
ID NO: 22
[ dT ]
--4
22
o
un
siVEG siVEGF-1 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 23
ou une ['Id
23 AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA
F-lb séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID
NO : 23 .1-
r, so, s., I
27
SEQ
esp I
Famille siRNA composé de:
Séquence 5 - 3'
ID NO èce
0
et de siVEGF-1 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO: 24 ou
c
0
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
oe
24
-.1
24 UUCUUUGGUCUGCAUUCACAU ce
I.)
I.)
un
h,
siTSP1-1 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 25 ou une
CCUUGACAACAACGUGGUG [ dT ] [ d
séquence ayant au moins 75% d 25
'identité avec ladite SEQ ID NO : 25 T] r, so, si,
siTSP1
c
-1 et de siTSP1-1 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO: 26 ou
CACCACGUUGUUGUCAAGG [ dT ] [ d
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
26
T ]
26
h,
siTSP1-1 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 27 ou une
P
27 CCUUGACAACAACGUGGUG r, so, si, .
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 27
siTSP1
c g
,-,
-lb
et de siTSP1-1 Brin 2b, dont la
séquence est: SEQ ID NO: 28 ou 0,
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
28 CACCACGUUGUUGUCAAGG
.
,
28
.
,
siRNA- ' ,
TSP1 siTSP1-2 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 29
ou une UACCCGAGACGAUUGUAUG [ dT ] [ d
séquence ayant au moins 75% d
29 h'
identité avec ladite SEQ ID NO : 29 T ]
siTSP1
et de siTSP1-2 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO : 30 ou
-2 CAUACAAUCGUCUCGGGUA [ dT ] [ d
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
30
T ]
30
siTSP1-2 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 31 ou une
31 UACCCGAGACGAUUGUAUG h
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 31
siTSP1
so
et de siTSP1-2 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 32 ou
n
-2b ,-3
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
32 CAUACAAUCGUCUCGGGUA
32
siTSP1 siTSP1-3 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 33
ou une GCCAGAACUCGGUUACCAU [ dT ] [ d --4
-3
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 33 T ]
un
I.)
I.)
--,
.1-
28
SEQ
esp I
Famille siRNA composé de:
Séquence 5 - 3'
ID NO
èce
0
et de siTSP1-3 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO : 34 ou
I.)
AUGGUAACCGAGUUCUGGC [ dT ] [ d
ID
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 34
T]
oe
34
-.1
oe
siTSP1-3 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 35 ou une
I.)
I.)
35
GCCAGAACUCGGUUACCAU s Un
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 35
siTSP1
et de siTSP1-3 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 36 ou
-3b
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 36
AUGGUAACCGAGUUCUGGC
36
siTSP1-4 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 37 ou une
CCAACAAACAGGUGUGCAA [ dT ] [ d
37
h
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 37
T]
siTSP1
et de siTSP1-4 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO : 38 ou
-4
UUGCACACCUGUUUGUUGG [ dT ] [ d P
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 38
T]
.
38
0
,-,
0,
siTSP1-4 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 39 ou une
39
CCAACAAACAGGUGUGCAA h e
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 39
c,
siTSP1
,
et de siTSP1-4 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 40 ou
c,
-4b
.
,
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 40
UUGCACACCUGUUUGUUGG
40
siTSP1-5 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 41 ou une
GCAACUACCUGGGUCACUA [ dT ] [ d
41
so
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 41
T]
siTSP1
et de siTSP1-5 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO : 42 ou
-5 UAGUGACCCAGGUAGUUGC [ dT ] [ d
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 42
T]
42
so
n
siTSP1-5 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 43 ou une
43
GCAACUACCUGGGUCACUA s---
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 43
0=1
siTSP1
et de siTSP1-5 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 44 ou
-5b
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 44
UAGUGACCCAGGUAGUUGC --4
o
44
un
I.)
I.)
,¨,
4¨
29
SEQ
esp I
Famille siRNA composé de:
Séquence 5 - 3'
ID NO
èce
0
siFoxP3-1 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 45 ou une
CACAACAUGGACUACUUCA [ dT ] [ d ID
45
r, so, !,e,
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 45
T]
siFoxP
c
ce
3-1 et de siFoxP3-1 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO
: 46 ou I.)
UGAAGUAGUCCAUGUUGUG [ dT ] [ d
"
un
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
46
T]
46
h,
siFoxP3-1 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 47 ou une
47
CACAACAUGGACUACUUCA r, so, si,
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 47
siFoxP
c
3-lb et de siFoxP3-1 Brin 2b, dont la séquence est : SEQ ID
NO : 48 ou
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
48 UGAAGUAGUCCAUGUUGUG
siRNA- 48
P
FoxP3
h
siFoxP3-2 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 49 ou une
CAUGGACUACUUCAAGUUC [ dT ] [ d ,
49
r, so, si, g
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 49
T] r.,
siFoxP
c .
N)
3-2 et de siFoxP3-2 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO
: 50 ou .
,
GAACUUGAAGUAGUCCAUG [ dT ] [ d
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
50 ..
T ]
1
r.,
50
.
h,
siFoxP3-2 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 51 ou une
51
CAUGGACUACUUCAAGUUC r, so, si,
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 51
siFoxP
c
3-2b et de siFoxP3-2 Brin 2b, dont la séquence est : SEQ ID
NO : 52 ou
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
52 GAACUUGAAGUAGUCCAUG
52
so
n
, - q
; =1-
- 4
Pour chacune des séquences (SE ID NO) numérotées de 1 à 52 du Tableau 1 :
ui
I.)
I.)
- La première colonne indique la famille à laquelle appartient le
siRNA. .1-
30
- La deuxième colonne indique la dénomination de l'oligonucléotide.
-
La troisième colonne indique la
composition du siRNA, constitué par l'association d'un oligonucléotide de type
brin 1 (respectivement c2,
o
lb) ou d'un oligonucléotide dont la séquence présente au moins 75% d'identité
avec cet oligonucléotide de type brin 1 et d'un 5:0,
tl
oligonucléotide de type brin 2 (respectivement 2b) ou d'un oligonucléotide
dont la séquence présente au moins 75% d'identité avec cet
oligonucléotide de type brin 2 (respectivement 2b).
- La quatrième colonne indique la numérotation de l'oligonucléotide telle
que déposée
- La cinquième colonne indique la séquence dans l'orientation 5' vers 3'.
La notation [dT][dT] est utilisée pour indiquer la présence de
deux désoxythymidines débordantes.
P
La sixième colonne indique si le siRNA constitué par l'association des deux
oligonucléotides dont la séquence est à 100% identique à celle .
,
inscrite en colonne 5 s'hybride avec un ARNm humain (h), de rat (r), de souris
(s), de singe (si) ou de chien (c). La conservation de la séquence
rõ
cible d'un siRNA entre l'homme et d'autres espèces animales est avantageuse
car elle augmente fortement la probabilité que les résultats des ,9
,
études précliniques, notamment celles de toxicologie, soient prédictives des
effets chez l'humain. ,
rõ
Lorsque les siRNA indiqués dans le Tableau 1 sont constitués de deux
oligonucléotides simple brin dont la séquence est à 100% identique à
celle inscrite dans le Tableau, ces siRNA ont de plus les caractéristiques
suivantes :
-
Le siRNA siAR-2 est décrit dans
la demande PCT/FR2002/003843. La séquence cible (c'est-à-dire la séquence de
l'ARNm à laquelle le .0
n
brin guide de ce siRNA s'hybride) de ce siRNA est présente chez l'homme dans
tous les ARNm codant pour le récepteur des androgènes, que ce
-=1.-
récepteur soit sauvage, muté, ou qu'il présente des variations d'épissage
conduisant à la délétion partielle ou totale du domaine de liaison des e,
-4
hormones (variant AR-V7 par exemple). Le siRNA siAR-1 correspond au siAR-2
délété de 2 nucléotides à l'extrémité 3'. o
ui
I.)
"
.1-
31
- Les séquences cibles des siRNA siAR-1, siAR- lb, siAR-2, siAR-2b sur
l'ARNm codant le récepteur des androgènes sont conservées
chez de nombreuses espèces dont l'homme, le rat, la souris, le singe, le
chien. o
I.)
-
La sequence cible des siRNA siAR-
3 et siAR-3b est située sur l'ARNm humain codant pour le récepteur des
androgènes. Cette séquence e
-,..--,
cible n'est que partiellement conservée chez les autres espèces.
-4
ce
I.)
I.)
- La sequence cible des siRNA siAR-4 et siAR-4b est située sur l'ARNm humain
codant pour le variant V7 du récepteur des androgenes '
exprimé notamment dans les cancers de la prostate résistants à la castration.
Cette séquence cible n'est que partiellement conservée chez les
autres espèces.
- Le siRNA AR-5 est décrit dans la demande PCT/FR2002/003843. La séquence
cible de ce siRNA et du siRNA AR-5b est située sur
l'ARNm humain codant pour le récepteur des androgènes présentant la mutation
T877A fréquemment retrouvée dans les cancers de la prostate.
P
Cette séquence cible n'est que partiellement conservée chez les autres
espèces.
5'
..
-
Le siRNA siVEGF-1 est décrit
dans la demande de brevet PCT/FR2002/003843. La séquence cible des siRNA
siVEGF-1, siVEGF-lb g
sur l'ARNm codant le VEGF est conservée chez de nombreuses espèces dont
l'homme, le rat, la souris, le singe, le chien.
,9
-
Les siRNA siTSP1-1, siTSP1-
1b, siTSP1-2 et siTSP1-2b ont été décrits dans la demande PCT/EP2010/061156.
La séquence cible des o'r
siRNA siTSP1-1, siTSP1-lb sur l'ARNm codant la Thrombospondine-1 est conservée
chez de nombreuses espèces dont l'homme, le rat, la
souris, le singe, le chien.
- La séquence cible des siRNA siTSP1-2 et le siTSP1-2b sur l'ARNm humain
codant la Thrombospondine-1 est partiellement conservée
chez les autres espèces.
-
Les siRNA siTSP1-3, siTSP1-3b,
siTSP1-4, siTSP1-4b, siTSP1-5, siTSP1-5b sont les siRNA correspondant aux
shRNAs mentionnés '(ej
,-q
dans la demande de brevet US2011/0166199.
- Les siRNA siFOXP3-1, siFoxP3-1b, siFOXP3-2 et siFoxP3-2b sont nouveaux et
sont décrits pour la première fois dans la présente 77;
o
demande de brevet. Les séquences cible de ces siRNA sont situées sur l'ARNm
humain codant le facteur de transcription FoxP3 et sont ;?4'
.1-
conservées chez de nombreuses espèces dont l'homme, le rat, la souris, le
singe, le chien.
CA 03041624 2019-04-24
WO 2018/078225
PCT/FR2017/052214
cq
cn
CA 03041624 2019-04-24
WO 2018/078225 33
PCT/FR2017/052214
Tableau 2 : Exemples d'agents anti-angiogéniques (Drug name) pouvant être
utilisés
dans la
présente invention
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CA 03041624 2019-04-24
WO 2018/078225 34 PCT/FR2017/052214
Tableau 3 : Exemples d'agents nTirri= unothérapeutiques (colonne
"Modality,, ) pouvant être
utilises dans la présente invention
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;Z:k.e.=::::i...Z:ei.e.ee enek: VS.,Y.S:Zei. ="yl.l.e=.,:,.*.,F,.;:e
.....
..
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W.,:',,'N`. .:.:.i.,,: \.=*ei:i.s :=ZWz.ez:...
....
e=AR:e.,:, eze=eek,kem .... :.:=,,::tye<0.1 ,okumIt4 s:,:e.. ; zen, kkk.tme.:-
.e.:=,*e t ese:::.:.,,k->. ,b;:i.=:=:,t,õ,,,=:=,x
zse.ek.:.,,e..,,k*.:..ceeetk.ieee.e<ek.w. k:.L.z. ;:a'geti:;;ikiek= ?,;
:'IMsri=21,,fe==:'>;$44\sec$::=e:e=trt 1;
?,,tc,i .::::ze ereg.e0.¨:: :?µ..etee
*eeete,*.:NY=ezem,e,tless=rAwk,exice,ckeice; e.e=%. ".z eece .:>:=1
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I.: ,-r..e."..sze..,:bee iot=sepeet>=== ,"e.e: z=*'>".i:)..ekzq>.i=ti .4t
eleeeetheeey ee:emx.e.e.liieee i .oc .8 .e.k.
Tableau 4: Exemples d'agents anti-tumoraux (Drtig Name) pouvant être utilisés
dans la
présente invention
CA 03041624 2019-04-24
WO 2018/(178225 35
PCT/FR2017/052214
IN1:::.444;i:e:ggi.:..U:=..e:410gekeikeeg{:ig::=:M!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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kse.%e
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kt:;.*et e ku;i:XekkI
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e..e..O.::e:ie2'e!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
"I'ableati 4 (suite)
CA 03041624 2019-04-24
W Ce 2018/078225 36
PCT/FR2017/052214
v;','.'Yemagwagewe'Eewfweneammegmemmen.emmegmemegmegmeameweggeigi*:.em
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emi,
Tableau 5: principaux tampons
tampon déP.HK 2$C
maleate (pK1) 1.2-2.6 1.97
phosphate (pK1) 1.7-2.9 2.15
CABS 10.0-11.4 10.7
piperidine 10.5-12.0 11.12
glycine (pK1) 2.2-3.6 2.35
citrate (pK1) 2.2-6.5 3.13
glycylglycine (pK1) 2.5-3.8 3.14
malate (pK1) 2.7-4.2 3.4
formate 3.0-4.5 3.75
citrate (pK2) 3.0-6.2 4.76
succinate (pK1) 3.2-5.2 4.21
acetate 3.6-5.6 4.76
propionate 3.8-5.6 4.87
malate (pK2) 4.0-6.0 5.13
pyridine 4.9-5.9 5.23
piperazine (pK1) 5.0-6.0 5.33
cacodylate 5.0-7.4 6.27
succinate (pK2) 5.5-6.5 5.64
MES 5.5-6.7 6.1
CA 03041624 2019-04-24
WO 2018/078225 37
PCT/FR2017/052214
riniori :. Whe deea: A>Ka 2ve
citrate (pK3) 5.5-7.2 6.4
maleate (pK2) 5.5-7.2 6.24
histidine 5.5-7.4 1.70, 6.04, 9.09
bis-tris 5.8-7.2 6.46
phosphate (pK2) 5.8-8.0 7.2
ethanolamine 6.0-12.0 9.5
ADA 6.0-7.2 6.59
carbonate (pK1) 6.0-8.0 6.35
ACES 6.1-7.5 6.78
PIPES 6.1-7.5 6.76
MOPSO 6.2-7.6 6.87
imidazole 6.2-7.8 6.95
BIS-TRIS propane 6.3-9.5 6.80, 9.00
BES 6.4-7.8 7.09
MOPS 6.5-7.9 7.14
HEPES 6.8-8.2 7.48
TES 6.8-8.2 7.4
MOBS 6.9-8.3 7.6
DIPSO 7.0-8.2 7.52
TAPSO 7.0-8.2 7.61
triethanolamine (TEA) 7.0-8.3 7.76
0.91, 2.10, 6.70,
pyrophosphate 7.0-9.0
9.32
HEPPSO 7.1-8.5 7.85
POPSO 7.2-8.5 7.78
tricine 7.4-8.8 8.05
hydrazine 7.5-10.0 8.1
glycylglycine (pK2) 7.5-8.9 8.25
Trizma (tris) 7.5-9.0 8.06
EPPS, HEPPS 7.6-8.6 8
BICINE 7.6-9.0 8.26
HEPBS 7.6-9.0 8.3
TAPS 7.7-9.1 8.4
2-amino-2-methy1-1,3-propanediol
7.8-9.7 8.8
(AMPD)
TABS 8.2-9.6 8.9
AMPSO 8.3-9.7 9
taurine (AES) 8.4-9.6 9.06
9.23, 12.74,
borate 8.5-10.2
13.80
CHES 8.6-10.0 9.5
2-amino-2-methy1-1-propanol (AMP) 8.7-10.4 9.69
glycine (pK2) 8.8-10.6 9.78
ammonium hydroxide 8.8-9.9 9.25
CAPSO 8.9-10.3 9.6
carbonate (pK2) 9.5-11.1 10.33
methylamine 9.5-11.5 10.66
piperazine (pK2) 9.5-9.8 9.73
CAPS 9.7-11.1 10.4
phosphate (pK3) 12.33
CA 03041624 2019-04-24
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treatment of epithelial ovarian cancer. Anticancer Res 29:2803-2808.
L'invention sera mieux illustrée par les exemples et les figures suivantes.
Les
exemples ci-après visent à éclaircir l'objet de l'invention et illustrer des
modes de réalisation
avantageux, mais en aucun cas vise à restreindre la portée de l'invention.
Légende des figures :
Figure 1: Représentation schématique de la méthode de quantification d'un
siRNA par
RT-qPCR. Exemple de gamme de référence.
Figure 2 : L'injection intraveineuse du siRNA siAR-1 ne permet pas d'inhiber
la
croissance d'une tumeur prostatique xénogreffée chez la souris.
Croissance des tumeurs 22RV1 xenogreffées sur des souris traitées
quotidiennement par
voie intraveineuse par un siRNA contrôle (cont; courbe grise) ou par siAR-1 à
0.12 mg/kg
(courbe noire). Moyenne SEM, n=4 souris par groupe.
Figure 3 : L'administration systémique continue d'un siRNA Luciférase (siLuc),
qui ne
cible pas d'ARNm exprimé chez la souris, permet sa distribution dans le sérum
et différents
organes.
Concentration moyenne (moles/L) du siRNA siLuc dans le sérum et différents
organes de
souris (n=3) ayant reçu par administration sous cutanée continue pendant 3
jours le siLuc à la
dose de 2mg/kg/jour dilué dans une solution de NaCl 154mM.
Figure 4 : Les siRNA FoxP3-1 et FoxP3-2 inhibent l'expression de FoxP3 dans
des
cellules tumorales. Les cellules prostatiques C4-2 ont été transfectées par
siFoxP3-1 ou par
siFoxP3-2 ou par un siRNA contrôle (cont). Deux jours après transfection, la
quantité
d'ARNm FoxP3 dans les cellules, rapportée à la quantité de l'ARNm de la
Cyclophiline A
considérée comme invariable (méthode delta-delta CT) a été mesurée et
rapportée à la valeur
mesurée dans la condition contrôle.
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Figure 5 : le siRNA siFoxP3-2 administré de façon systémique par voie sous
cutanée se
distribue dans le sérum et différents organes. Concentration (moles/L, moyenne
SEM, n=4
souris par groupe) dans le sérum et différents organes du siRNA siFoxP3-2 chez
des souris
ayant reçu quotidiennement pendant 4 jours consécutifs le siRNA siFoxP3-2
dilué dans un
tampon citrate contenant 10mM de MgCl2, administré à la dose de 0.12mg/kg en
bolus par
voie sous cutanée.
Figure 6 : l'administration quotidienne du siRNA siFoxP3-2 pendant 3 jours
consécutifs à
des souris mâles réduit la quantité d'ARNm codant FoxP3 dans les testicules.
Quantification
de l'ARNm codant FoxP3, rapporté à la quantité d'ARNm codant la cyclophiline A
dans les
testicules des souris traitées quotidiennement pendant 4 jours consécutifs en
bolus par voie
sous cutanée par le siRNA siFoxP3-2 dilué soit dans un tampon citrate
contenant 10mM de
MgCl2, administré à la dose de 0.12mg/kg (noté siFoxP3-2), soit par le
véhicule (noté
"cont").
Figure 7 : L'administration simultanée de 3 siRNAs permet leur distribution
dans le
sérum et différents organes. Concentration des siRNA siAR-1 (barres noires),
siTSP1-1
(barres gris foncé) et siLuc (barres gris clair) dans le sérum, la prostate et
les os 10 minutes
après injection sous cutanée d'un mélange de ces 3 siRNA dilués dans un tampon
citrate
10mM à pH 6 contenant 10mM de MgCl2. Pour chaque siRNA, la concentration
sérique a été
considérée comme ayant une valeur 1 et les concentrations dans les organes ont
été rapportées
à cette valeur dans le sérum.
Figure 8 : L'administration continue pendant 4 semaines du siAR-1 permet de
maintenir
sensiblement constante sa concentration sérique chez des singes. Concentration
au cours du
temps du siAR-1 formulé en NaCl 154mM administré de façon continue par voie
sous
cutanée pendant 4 semaines à des singes (n=4) à la dose de 0.05 mg/kg/jour. La
concentration
sérique moyenne mesurée à la fin de la seconde, troisième et quatrième semaine
de traitement
est rapportée à la moyenne de celle mesurée à la fin de la première semaine de
traitement.
Figure 9 : Comparaison de la pharmacocinétique dans le sérum d'un siRNA après
administration sous cutanée en bolus ou en continu.
Vingt-quatre heures avant implantation des pompes osmotiques comme décrit à la
figure
8, les mêmes animaux ont reçu une injection sous cutanée unique en bolus de
0.05 mg/kg de
siAR-1 formulé en solution saline (NaCl 154 mM) et la concentration a été
mesurée au cours
du temps. Le trait continu indique la moyenne des valeurs reportées dans la
figure 8. On
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observe que la concentration sérique de siRNA augmente rapidement après
l'injection en
bolus puis que le siRNA est rapidement éliminé, indétectable dès la 3ème
heure.
Figure 10 : L'administration systémique continue par voie sous cutanée d'un
siRNA
formulé en solution saline inhibe l'expression de sa cible dans les tissus
plus efficacement
qu'avec une administration en bolus.
Des pompes osmotiques délivrant une dose de siRNA siTSP1-1 de 0.12mg/kg/jour
formulé en solution saline (NaCl 154mM) ont été implantées en sous cutané
pendant 1
semaine chez des souris (groupe "continu", barres noires). Un autre groupe de
souris a reçu
chaque jour pendant 7 jours une injection sous cutanée en bolus de siRNA TSP1-
1 à la dose
de 0.12mg/kg formulé en solution saline (groupe "bolus", barres grises) (n=5
souris par
groupe). En fin de traitement, dans chaque groupe, le siRNA siTSP1-1 a été
quantifiés dans
différents tissus (panneau A) et l'ARNm codant la TSP1 mesuré dans la prostate
(panneau B).
Dans le panneau A, pour chaque organe, les concentrations moyennes de siTSP1-1
mesurées
dans le groupe "bolus" ont été rapportées à la moyenne de celles mesurées dans
le groupe
"continu" considérées comme ayant la valeur 1. Panneau B : L'expression de
l'ARNm codant
la TSP1 mesurée par RT-qPCR dans les différents organes et dans les groupes
"continu"
(barres grises) ou bolus (barres noires) a été rapportée à celle mesurée dans
les organes d'un
groupe de souris traitées par la solution de NaCl 154m1IV1 ne contenant pas le
siRNA (groupe
"véhicule", barres blanches).
Figure 11 : Effet de l'administration de siRNA en bolus ou en continu sur la
croissance
tumorale. Des souris Nude ont été greffées avec des cellules prostatiques C4-
2. Une fois la
prise tumorale constatée, les souris ont été traitées par le siRNA siAR-1.
Panneau A: Mesure au cours du temps du volume des tumeurs (moyenne SEM, n=
10
animaux par groupe) chez les souris ayant reçu le siAR-1 formulé en solution
saline (NaCl
154 mM) et administré par voie sous cutanée quotidiennement à la dose de
0.12mg/kg/jour
(symboles noirs, traits discontinus) ou de lmg/kg (symboles noirs, traits
continus). Un groupe
contrôle (symboles blancs) a reçu une injection quotidienne du véhicule (NaCl
154mM).
Panneau B : Des pompes osmotiques implantables Alzet ont été remplies soit
avec une
solution saline (groupe véhicule, 154mM NaCl, losanges blancs), soit avec le
siRNA siAR-1
formulé en solution saline (154 mM NaCl). La concentration du siRNA a été
ajustée en
fonction du débit de la pompe pour délivrer une dose quotidienne de 0.02
mg/kg/jour
(losanges gris clair), 0.2 mg/kg/jour (losanges gris foncés) ou 2 mg/kg/jour
(losanges noirs).
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Les pompes ont été implantées en sous cutané chez les animaux et les tumeurs
mesurées au
cours du temps (moyenne SEM, n= 8 animaux par groupe).
Figure 12 : Inhibition des métastases osseuses de cancers de la prostate par
administration systémique continue de siAR-1.
Panneau de gauche : Niveau d'expression de l'ARNm de AR humain, dans le tibia
de
souris nude porteuses de tumeurs prostatiques humaines 22RV1 chez des souris
traitées par le
véhicule (NaCl 154 mM, barre noire) ou par le siAR-1 dilué dans ce véhicule
(barre grise) et
administré par voie sous cutanée de façon continue pendant 3 semaines (moyenne
SEM,
n=7 valeurs rapportées à la valeur de la moyenne du groupe NaCl).
Panneau de droite : Charge métastatique dans l'os, mesurée par l'expression de
l'ARNm
de l'HPRT humain dans les deux groupes d'animaux. Chaque barre représente la
charge
métastatique osseuse dans une souris. "0" indique que l'ARNm de l'HPRT n'a pas
été détecté
chez cet animal.
Figure 13 : Immunodétection du récepteur des androgènes dans la prostate de
souris
traités par siAR-1 par administration sous cutanée continue pendant 1 mois. De
gauche à
droite les photos sont représentatives des prostates de groupes de souris
(n=10) traitées par le
véhicule (NaCl 154 mM), ou siAR-1 aux doses de 0.2 mg/kg/jour, 2 mg/kg/jour,
10
mg/kg/jour.
Figure 14 : Immunodétection du récepteur des androgènes dans la prostate de
rats traités
par siAR-1 par administration sous cutanée continue pendant 2 semaines. Les
photos sont
représentatives des prostates de rats traitées par le véhicule (NaCl 154 mM)
"cont", ou siAR-1
aux doses de 0.1 mg/kg/jour ou 0.9 mg/kg/jour.
Figure 15 : Quantification de siAR-1 dans différents organes de singes ayant
reçu une
administration continue sous cutanée de ce siRNA pendant un mois à la dose de
5 mg/kg/jour
(n=4 animaux). La concentration de siAR-1 dans les organes a été rapportée à
la
concentration mesurée dans le sérum.
Figure 16 : Quantification du PSA (Prostate Specific Antigen) dans le sérum de
singes
Cynomolgus (n=6 par groupe) avant traitement, ou après traitement pendant 1
mois par
administration sous cutanée continue d'une solution saline (NaCl 154mM) ou de
siAR-1 dans
solution saline à la dose de 5 mg/kg/jour. Ordonnée : PSA sanguin en pg/ml. La
limite de
détection du test ELISA (LLOQ ou lower limit of quantification) indiquée par
un trait
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pointillé, est de 120 pg/ml. Les valeurs inférieures à cette valeur sont
arbitrairement indiquées
comme 119 pg/ml.
Figure 17 : Immunodétection de la TSP1 et des vaisseaux sanguins (marquage
CD31)
dans des tumeurs de glioblastome U87 implantées dans le cerveau de souris nude
traitées
pendant 15 jours par administration intracérébrale continue, de siTSP1-1 (noté
siRNA TSP1)
ou d'un siRNA contrôle (siRNA-cont), le cathéther délivrant le siRNA étant
implanté à
distance de la tumeur.
Figure 18 : Analyse par électrophorèse en gel d'acrylamide de l'intégrité d'un
siRNA
incubé dans différentes conditions. Pistes 1, 5, et 7 : siTSP1-1 en solution
aqueuse; Piste 2 :
mélange (1:1, poids:poids) de siTSP1-1 et de LDL oxydés; Piste 3 : mélange
(1:10,
poids:poids) de siTSP1-1 et de LDL oxydés ; Piste 4 : mélange (1:1,
poids:poids) de siTSP1-1
et d'hexaréline ; Piste 6 : siTSP1-1 dans une solution aqueuse ajustée à pH 6
contenant 0.1
mM de ZnC12; Piste 8 : siTSP1-1 en tampon citrate 10 mM pH 6 ; Piste 9-11:
siTSP1-1 en
tampon citrate 10 mM pH 6 additionné de 1 mM de ZnC12 incubé à 37 C pendant 10
minutes
(piste 9), lheure (piste 10) ou 6h (piste 11). M : marqueur de poids
moléculaire (25 pb DNA
ladder Invitrogen).
Figure 19 : Concentration de siTSP1-1 dans le sérum et la prostate après
administration
de ce siRNA par voie sous cutanée en bolus ; Effet de la formulation.
Des groupes de souris adultes ont reçu une administration en bolus par voie
sous cutanée
du siRNA siTSP-1 à la dose de 0.12 mg/kg formulé soit dans une solution
contenant 154 mM
de NaCl (groupe contrôle barres grises), soit dans une solution aqueuse
contenant 0.165 mM
de ZnC12 (barres noires). La concentration de siRNA mesurée dans le sérum et
la prostate de
ces différents groupes de souris a été mesurée 20 minutes après injection et
rapportée à la
valeur du groupe contrôle considérée comme 1.
Figure 20 : Concentration du siAR-1 dans le sérum et différents organes en
fonction de la
formulation du siRNA administré.
Concentration de siAR1 dans le sérum ou les tissus de souris ayant été
injectés par voie
sous cutanée avec le siRNA siAR-1 formulé dans l'une des solutions suivantes :
NaC1154mM
(NaCl, groupe contrôle) ; tampon citrate 10mM pH 6 (Cit) ; tampon citrate 10mM
pH 6
additionné de 0.1mM de MnC12 (Cit/Mn), ou de 0.1 mM de MgCl2 (Cit/Mg), ou de
0.1 mM
de ZnC12 (Cit/Zn), ou de 0.1mM de ZnC12 et de 0.1 mM de MnC12 (Cit/ZnMn), ou
de 0.1mM
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de ZnC12 et de 0.1mM de MnC12 et de 0.1mM de MgCl2 (Cit/ZnMnMg), ou de 10 mM
de
ZnC12 (Cit/Zn10) ou de 0.05 mM de spermidine (Cit/Sperm).
Panneau A : valeurs mesurées dans le sérum d'animaux mâles ayant reçu le
traitement
indiqué.
Panneau B : valeurs mesurées dans la prostate (barres gris foncé) ou la rate
(barres gris
clair) d'animaux mâles ayant reçu le traitement indiqué.
Panneau C : valeurs mesurées dans la rate d'animaux femelles ayant reçu le
traitement
indiqué.
Figure 21: Un mélange des 3 siRNA suivants : siAR-1, siTSP1-1 et siLuc a été
préparé
soit en solution saline (NaCl 154mM), soit en tampon citrate 10mM pH 6
contenant 7.5 mM
de MgCl2 et administré par voie sous-cutanée continue pendant 3 jours à des
souris porteuses
de tumeurs 4T1, chaque siRNA étant délivré à raison de 2mg/kg/jour. Le siRNA a
été dosé
dans le sérum et différents organes, y compris les tumeurs 4T1. Les
concentrations de chaque
siRNA, mesurées dans le sérum, les organes (panneau A) et les tumeurs (panneau
B), ont été
rapportées à celle mesurée pour le siRNA considéré dans le sérum des souris du
groupe
contrôle (NaCl 154mM). Barres noires : siAR-1, barres gris foncé, siTSP1-1,
barres gris clair
: siLuc.
Figure 22 : Le siRNA siRNA siAR-1, à la dose de 0.12 mg/kg, formulé dans une
solution
de 154 mM de NaCl (groupe contrôle, noté NaCl) ou dans un tampon citrate 10 mM
pH 6
additionné soit de (siRNA:hexaréline, 1:0,2 poids:poids) Cit/Hexarelin), soit
de LDL oxydés
(siRNA:LDL oxydés, 1:1: poids:poids) (Cit/LDL) a été administré par voie sous
cutanée à
des groupes de souris adultes. La concentration du siRNA mesurée dans le sérum
(panneau
A), dans la prostate (panneau B, barres gris foncé) ou la rate (panneau B,
barres gris clair) de
ces différents groupes de souris a été mesurée 20 minutes après injection et
rapportée à celle
du groupe contrôle (NaCl).
Figure 23 : La concentration dans le sérum, les tissus et tumeurs d'un siRNA
administré
de façon systémique et continue par voie sous cutanée est augmentée lorsqu'il
est formulé
dans un tampon citrate contenant des LDL oxydés. Des pompes osmotiques ont été
implantées en sous cutanée sur des souris porteuses de tumeur 22RV1 afin de
délivrer de
façon systémique et continue pendant 3 jours 2mg/kg/jour de siAR-1 et 0.2
mg/kg/jour de
LDL oxydés, formulés soit dans du NaCl 154mM soit dans un tampon citrate 10mM
à pH 6.
Les concentrations de siAR-1 dans le sérum, les organes et les tumeurs
mesurées après
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injection de la composition en tampn citrate ont été rapportées à celles
mesurées après
injection de la composition en NaCl.
EXEMPLES
Exemple 1: Matériel et Méthodes
1. Quantification de siRNA par une méthode de RT-PCR quantitative
modifiée
Pour quantifier un siRNA dans les échantillons biologiques, les inventeurs ont
développé
une méthode de réverse transcription suivie d'une PCR quantitative (RT-qPCR).
Pour chaque
siRNA, une amorce tige-boucle spécifique, présentant 8 nucléotides débordants
est
synthétisée, les 8 nucléotides étant complémentaires des 8 nucléotides de
l'extrémité 3' du
brin guide (antisens) du siRNA. Après une étape de reverse transcription, le
produit obtenu est
amplifié par PCR à l'aide de deux amorces, l'une s'hybridant avec la région
correspondant à
la boucle de l'amorce de reverse transcription. Les 12 nucléotides en 3' de la
seconde amorce
ayant une séquence ADN correspondant aux 12 nucléotides de l'extrémité 5' du
cDNA
nouvellement synthétisé après reverse transcription du brin guide du siRNA. La
détection de
l'amplification est réalisée de façon continue par la dégradation d'une sonde
fluorescente
Taqman ou par incorporation de SybrGreen.
Une gamme de siRNA double brins, de 103 à 109 copies dans la réaction de RT,
diluées
dans de l'eau est réalisée et traitée en même temps que les échantillons par
RT-qPCR. La
Figure 1 représente schématiquement la méthode de RT-qPCR et un exemple de
gamme
montrant la relation entre le nombre de copies présentes dans la réaction et
le CT (cycle
threshold ou seuil d'amplification) obtenu.
Les échantillons biologiques dans lesquels les siRNA sont quantifiés sont de
différentes
origines :
- Des ARN totaux extraits à partir de fragments de tissus de poids connu
supposés
contenir le siRNA. Ces ARN sont extraits par des méthodes conventionnelles
telles que par la
méthode au phénol-chloroforme (extraction au trizol). Après extraction, ils
sont dilués dans de
l'eau ;
- Du sérum. Dans ce cas, un volume connu de sérum est dilué dans de l'eau
contenant un
inhibiteur de RNAse au 1/1000 ou davantage dilué si la concentration de siRNA
est très
élevée.
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Les valeurs des CT obtenus pour chaque échantillon sont comparées à celles
obtenues
pour la gamme. Ceci permet de calculer le nombre de copies de siRNA présent
dans
l'échantillon dosé. Les valeurs sont alors rapportées d'abord à la quantité
d'ARN total réverse
transcrit, puis au poids de tissu dont les ARN ont été extraits ou au volume
de sérum, et les
résultats finaux sont exprimés en moles/L (M) en considérant que la densité de
tous les tissus
est de 1g/cm3.
2. Lignées cellulaires
Les lignées cellulaires utilisées dans les exemples sont des lignées
cellulaires issues de
tumeurs de prostate chez l'homme, résistantes à la castration et exprimant le
récepteur des
androgènes (lignées C4-2 et 22RV1), de tumeurs mammaires de souris (4T1), ou
de
glioblastome humain U87.
3. Greffe de cellules tumorales chez les souris
Les tumeurs sont obtenues par injection sous cutanée de cellules tumorales
dans le flanc
de souris Nude (tumeurs 22RV1, C4-2) ou de souris BalB/C (tumeurs 4T1). Seuls
les
animaux sur lesquels la prise tumorale est constatée sont inclus dans l'étude
et randomisés
pour recevoir le traitement ou le traitement contrôle. Les injections de siRNA
en bolus sont
effectuées à raison de 1 fois par jour, 5 jours par semaine. Dans d'autres
expériences, les
cellules U87 ont été implantées dans le parenchyme cérébral de souris Nude par
injection
stéréotaxique.
Tous les siRNA sont dilués dans de l'eau contenant 154m1M de NaCl ou dans le
tampon
indiqué. Lorsqu'elles sont utilisées, les pompes osmotiques (par exemple
pompes Alzet) sont
implantées en sous cutané sur le dos des souris, du côté opposé à la tumeur si
la souris en
porte une. Dans le cas des tumeurs U87 implantées en orthotopique, la pompe
osmotique est
implantée sous la peau et un cathéter placé à la sortie de la pompe est relié
à un dispositif fixé
sur la boite cranienne par un ciment et délivrant le composé dans le cerveau,
à distance de la
tumeur implantée précédemment.
Le volume des tumeurs sous cutanées est estimé en mesurant à l'aide d'un pied
à coulisse
le plus grand (D) et le plus petit (d) diamètre des tumeurs. Le volume est
calculé par la
formule V= Dxdxdx0.5.
En fin d'expérience, les animaux sont sacrifiés, le sérum, les tumeurs et
différents tissus
sont disséqués, les ARN extraits et les siRNA présents dans ces ARN sont
quantifiés.
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Tous les protocoles expérimentaux utilisés ont été validés par les comités
d'éthique et
autorités réglementaires françaises. Ils sont mis en oeuvre de façon à limiter
le nombre
d'animaux utilisés et à éviter toute souffrance inutile.
4. siRNA utilisés
Les siRNA utilisés dans les exemples sont ceux du Tableau 1.
Dans certaines expériences un siRNA ne s'hybridant avec aucun ARNm connu
(siRNA
Contrôle) a été utilisé. La séquence de ce siRNA est :
SEQ ID NO 55: 5'UAGCAAUGACGAAUGCGUA[dT][dT]
SEQ ID NO 56: 5'UACGCAUUCGUCAUUGCUA[dT][dT]
Un siRNA ciblant la luciférase, gène qui n'existe pas chez les mammifères, a
également
été utilisé. La séquence de ce siRNA est:
SEQ ID NO 57: 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGA[dT][dT]
SEQ ID NO 58: 5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAG[dT][dT]
5. Préparation des pompes osmotiques
Les siRNA sont dilués en solution saline (eau pour injection additionnée de
154mM de
NaCl) ou dans le tampon indiqué à la concentration nécessaire pour atteindre
l'administration
de la quantité désirée sur une période de 24h. Cette concentration est
calculée en tenant
compte du volume horaire délivré par la pompe, comme indiqué par le fabricant
(Alzet). La
pompe est remplie stérilement et implantée sous la peau des animaux traités
(souris, rats,
singes). Le cathéther placé en sortie de la pompe libère son contenu soit sous
la peau, soit
dans une autre localisation afin d'obtenir une administration intrathécale ou
intracérébrale. Les
pompes sont maintenues en place, de quelques jours et jusqu'à 4 semaines
suivant le protocole
indiqué.
Une étude préalable a montré que des solutions stériles de siRNA sont stables
pendant au
moins 4 semaines à 37 C.
Exemple 2 : Absence d'inhibition de la croissance tumorale par des siRNA
injectés par
voie intraveineuse en bolus.
Des souris nude mâles de 9 semaines ont été xénogreffées en sous cutané sur le
flanc avec
des cellules 22RV1. Après constation de la prise tumorale et randomisation,
les souris ont
reçu une injection intraveineuse quotidienne de siRNA contrôle ou de siAR-1 à
la dose de
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0.12 mg/kg pendant 13 jours. Le volume tumoral a été mesuré quotidiennement.
Les résultats
sont présentés dans la Figure 2. On constate que l'injection IV du siAR-1 est
sans effet sur la
croissance des tumeurs.
Exemple 3 : Il n'est pas nécessaire que le siRNA cible un ARNm exprimé dans
l'organisme pour qu'il se distribue. Un siRNA dirigé contre la luciferase de
luciole siLuc, à la
dose de 2mg/kg/jour, formulé dans une solution de NaCl 154mM a été administré
à des souris
par voie sous cutanée continue pendant 3 jours à l'aide de pompes osmotiques
implantées. La
quantification du siRNA siLuc dans le serum et différents organes présentée
dans la figure 3
montre qu'il s'y distribue efficacement de façon systémique alors même qu'il
n'y a pas
d'ARNm cible de ce siRNA dans ces tissus.
Exemple 4 : Identification de siRNA inhibant FoxP3 et se distribuant dans les
tissus in
vivo.
1. Inhibition de l'expression du facteur de transcription FoxP3 dans les
cellules C4-2.
Des cellules C4-2 ont été transfectées par un siRNA contrôle ou par les siRNA
siFoxP3-1
ou siFoxP3-2. 48h après transfection, les cellules ont été lysées, les ARN
extraits et
l'expression de FoxP3 mesurée par RT-qPCR. Les valeurs sont normalisées par
l'expression
de l'ARN codant pour la cyclophiline-A (méthode delta delta CT). Les résultats
sont présentés
dans la Figure 4 qui montre que les deux siRNA FoxP3-1 et FoxP3-2 inhibent
l'expression de
FoxP3.
2. Le siRNA siFoxP3-2 se distribue dans le sérum et différents organes
et inhibe
l'expression de FoxP3.
Des souris (4 par groupe) ont recu quotidiennement pendant 4 jours consécutifs
par voie
.. sous cutanée soit 0.12 mg/kg du siRNA siFoxP3-2 formulé dans du tampon
citrate à pH 6
contenant 10mM de MgCl2, soit seulement ce tampon (groupe contrôle). La figure
5 montre
que le siFoxP3-2 se distribue de façon systémique dans le sérum et dans
différents organes et
la Figure 6 montre que dans les testicules, le siFoxP3-2 inhibe fortement
l'expression de
l'ARNm codant FoxP3 par rapport au groupe contrôle.
Administré en absence d'agent de vectorisation, le siRNA siFoxP3-2 est donc
capable de
se distribuer in vivo de façon systémique et d'inhiber l'expression de son
gène cible.
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Exemple 5 : L'administration simultanée de 3 siRNAs permet leur distribution
systémique dans le sérum et différents organes. Les siRNA siAR-1, siTSP1-1 et
siLuc ont été
dilués dans un tampon citrate 10mM à pH 6 contenant 10mM de MgCl2. Le mélange
a été
administré par voie sous cutanée à des souris de telle sorte que les souris
recoivent une dose
de 0.12mg/kg de chacun des 3 siRNA. Les souris ont été sacrifiées 10 minutes
après injection
et chaque siRNA a été dosé séparément dans le sérum et différents tissus. On
observe que les
3 siRNA sont présents dans le sérum et dans les différents organes testés
(Figure 7).
L'administration d'un cocktail de plusieurs siRNAs permet donc leur
distribution systémique
simultanée dans différents tissus.
Exemple 6 : Administration d'un siRNA formulé en solution saline par voie sous
cutanée
continue. Dans cet exemple, les siRNAs sont formulés en solution saline (NaCl
154 mM).
1. La concentration sérique d'un siRNA administré de façon continue reste
sensiblement constante.
Des pompes osmotiques délivrant une dose de siRNA siAR-1 de 0.05mg/kg/jour
formulé
en solution de NaCl 154mM ont été implantées en sous cutané pendant 4 semaines
chez des
singes Cynomolgus. La concentration sérique du siRNA a été mesurée chaque
semaine
pendant toute la durée du traitement. On observe que la concentration sérique
varie de moins
de 20% par rapport à la première mesure (considérée comme ayant la valeur 1)
(Figure 8).
Vingt-quatre heures avant implantation des pompes osmotiques, les animaux ont
reçu une
injection sous cutanée unique en bolus de 0.05 mg/kg de siAR-1 formulé en
solution saline
(NaCl 154 mM) et la concentration a été mesurée au cours du temps. Par
comparaison avec
l'administration systémique continue, l'injection par voie sous cutanée en
bolus de la dose de
0.05 mg/kg aboutit à une élimination rapide (Figure 9) qui, si elle est
répétée dans le temps,
par exemple quotidiennement, aboutit à un effet de pics et de vallées qui est
évité par
l'administration continue.
2. L'administration par voie sous cutanée continue est plus efficace que la
voie sous
cutanée en bolus pour inhiber l'expression du gène cible du siRNA.
Des souris ont reçu une injection sous cutanée quotidienne pendant 4 jours du
siRNA
siTSP1-1 à la dose de 0.12 mg/kg/jour, formulé en solution saline (NaCl
154mM), ou le
même siRNA formulé dans la même solution mais administré de façon continue
pendant 4
jours par une pompe osmotique, à la dose de 0.2 mg/kg/jour. On observe que le
siRNA
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siTSP1-1 se distribue dans plusieurs organes à des niveaux comparables après
administration
par voie sous cutanée de façon continue ou en bolus (Figure 10A).
L'administration du
siTSP1-1 produit une meilleure inhibition dans les tissus de l'expression de
l'ARNm de la
TSP1, lorsque le siRNA est administré en continu que lorsqu'il est administré
en bolus
(Figure 10B).
3. L'administration par voie sous cutanée continue est plus efficace que la
voie sous
cutanée en bolus pour inhiber la croissance tumorale
Des cellules C4-2 ont été greffées chez des souris. Une fois la prise tumorale
constatée,
les souris ont été traitées par administration du siRNA siAR-1 formulé en
solution saline
(NaCl 154mM) à différentes doses ou par le véhicule. Le siRNA a été administré
par voie
sous cutanée, soit de façon discontinue, par une injection quotidienne, soit
de façon continue,
par implantation d'une pompe osmotique pendant 1 mois. On observe que la
croissance de
tumeurs C4-2 chez des souris n'est pas inhibée par l'administration par voie
sous cutanée en
bolus du siRNA siAR-1 à la dose de 0.12 mg/kg/jour ou même de 1 mg/kg/jour
répétée
quotidiennement (Figure 11A), alors qu'elle est inhibée lorsque le même siRNA
est
administré par voie sous cutanée de façon continue par implantation d'une
pompe osmotique,
délivrant la dose de 0.2 mg/kg/jour. L'inhibition n'est pas améliorée en
augmentant la dose
administrée d'un facteur 10 (2 mg/kg/jour) (Figure 11B). L'administration
systémique d'un
même siRNA est donc plus efficace pour inhiber la croissance tumorale lorsque
ce siRNA est
administré de façon continue que de façon discontinue.
4. Inhibition de metastases osseuses d'une tumeur
Des cellules 22RV1 ont été implantées chez des souris Nude. Une fois la prise
tumorale
constatée, des pompes Alzet administrant 0.2 mg/kg/jour du siRNA siAR-1 fomulé
dans une
solution saline (NaC1154mM), ou le véhicule seul ont été implantées pendant 3
semaines. En
fin de traitement, les os (tibia) ont été récupérés pour y quantifier le siAR-
1, et les ARNm
d'origine humaine codant pour le récepteur des androgènes et l'HPRT.
L'administration du siRNA siAR-1 par voie sous cutanée continue à des souris
porteuses
de tumeurs prostatiques humaines 22RV1 permet d'inhiber l'expression du
récepteur des
androgènes dans les os des souris (Figure 12 panneau de gauche). Cette
inhibition
s'accompagne d'une diminution du nombre de souris développant spontanément des
métastases osseuses de ces tumeurs et d'une diminution de la taille de ces
tumeurs, évaluée
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par le niveau d'expression d'un ARNm humain (HRPT) dans les os (Figure 12
panneau de
droite).
L'administration systémique continue d'un siRNA permet donc de le délivrer
dans les
métastases d'un cancer se développant dans l'os, d'inhiber l'expression du
gène cible du
siRNA dans l'os et de limiter l'implantation et/ou le développement des
métastases.
5. Inhibition de l'expression du récepteur des androgènes dans la prostate
de souris et
de rats
Des pompes osmotiques délivrant le siRNA siAR-1 formulé en solution saline
(NaCl
154m1IV1) ont été implantées en sous cutané chez souris pendant 1 mois ou chez
des rats
pendant 2 semaines. Cette administration, à des souris à une dose supérieure
ou égale à 0.2
mg/kg (Figure 13) ou à des rats à une dose supérieure ou égale à 0.1 mg/kg
(Figure 14)
inhibe efficacement l'expression protéique du récepteur des androgènes dans la
prostate de ces
animaux.
6. Distribution d'un siRNA dans les tissus chez le singe
Des singes mâles adultes ont reçu pendant 4 semaines une injection sous-
cutanée continue
de siAR-1 formulé en solution saline (NaC1154mM) à la dose de 5 mg/kg/jour, à
l'aide d'une
pompe osmotique. Les animaux ont été sacrifiés et siAR-1 quantifié dans
différents organes.
Les résultats sont présentés à la Figure 15. Il est constaté que le siRNA siAR-
1 se
distribue efficacement de façon systémique dans les différents organes
analysés.
7. Inhibition de la production de PSA chez des singes
L'antigène Spécifique de la Prostate ou PSA est détecté dans le sérum de
singes mâles
matures, même en l'absence de pathologie prostatique. L'administration par
voie sous cutanée
continue du siRNA siAR-1 pendant 4 semaines à la dose de 5mg/kg/jour conduit à
une
diminution de l'expression du PSA dans le sérum des animaux, sous le seuil de
détection du
test ELISA utilisé pour le dosage (Figure 16). L'administration par voie sous
cutanée
continue d'un siRNA chez les singes permet donc de le distribuer de façon
systémique dans de
nombreux organes où il exerce son effet inhibiteur de l'expression génique.
Exemple 7 : Inhibition de l'expression de la TSP1 dans un glioblastome par
administration intracérébrale continue de siRNA formulés en solution saline
(NaC1154mM).
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Des souris nude femelles ont été greffées en orthotopique avec des cellules de
glioblastome U87. Les animaux ont été implantés avec une pompe osmotique
placée en sous
cutané dans le dos, la sortie de la pompe étant reliée à un cathéther
délivrant dans le cerveau,
à distance de la tumeur, un siRNA contrôle ou le siRNA siTSP1-1 contenu dans
la pompe, à
raison de 2mg/kg de poids de cerveau/jour. Après 8 jours, les souris ont été
sacrifiées, et
l'expression de la TSP1 détectée par immunofluorescence sur coupes des
cerveaux. Les
résultats sont présentés dans la Figure 17.
On observe une forte diminution de l'expression de la TSP1 chez les animaux
traités par
rapport aux contrôles. La TSP1 est une protéine qui inhibe la formation des
vaisseaux
sanguins (angiogenèse). On observe chez les animaux traités une augmentation
de la densité
des vaisseaux sanguins détectés sur une coupe adjacente par immunomarquage de
l'antigène
CD31.
L'administration intracérébrale continue d'un siRNA permet donc d'inhiber
efficacement
l'expression du gène cible du siRNA dans une tumeur se développant dans cet
organe et d'y
produire les effets biologiques attendus.
Exemple 8: Un tampon acide évite la dégradation d'un siRNA en présence de
cations.
1.
Un siRNA est dégradé en présence de ZnCl2 dans une solution aqueuse dont le
pH a
été ajusté à 6. Un tampon citrate à pH 6 préserve le siRNA.
La dégradation du siRNA siTSP1-1 a été mesurée après formulation de ce siRNA
dans
différentes conditions. L'intégrité du siRNA siTSP1-1, a été vérifiée par
dépôt sur un gel
d'acrylamide d'une quantité équivalente à 300 ng de siRNA à partir d'une
solution de siRNA
ayant subi les traitements suivants :
- mélange (1:1, poids:poids) de siTSP1-1 et d'hexaréline ;
- mélange (1:1 ou 1:10, poids:poids dans de l'eau) de siTSP1-1 et de LDL
oxydés ;
incubation 4h à 37 C.
- incubation 1 heure à température ambiante de siTSP1-1 dans une solution
aqueuse de
0.164 mM de ZnC12
- incubation 10 minutes, lheure ou 6heures à 37 C de siTSP1-1 dans une
solution de 1
mM de ZnC12 dans un tampon 10mM Citrate à pH 6.
On constate sur la Figure 18 que le siRNA est dégradé lorsqu'il est incubé
dans une
solution aqueuse de ZnC12. Cette dégradation ne se produit pas dans un tampon
citrate à pH 6
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contenant jusqu'à 6 fois plus de ZnC12. Aucune dégradation du siRNA n'est
constatée lorsqu'il
est mélangé dans de l'eau avec des LDL oxydés ou de l'hexareline.
La présence d'un tampon à pH acide permet donc de maintenir l'intégrité d'un
siRNA en
présence de cations.
2. La formulation d'un siRNA dans une solution aqueuse contenant du ZnCl2
réduit
sa concentration dans le sérum et sa distribution dans les tissus.
Le siRNA siTSP1-1 formulé soit dans du NaCl 154m1IVl, soit dans de l'eau
contenant
0.165 mM de ZnC12 et administré par voie sous cutané à des souris à la dose de
0.12 mg/kg.
La concentration du siRNA mesurée dans le sérum et les tissus est réduite
lorsque le siRNA
est formulé dans une solution aqueuse contenant des cations par rapport aux
résultats obtenus
lorsque le même siRNA est administré à la même dose et de la même façon mais
formulé en
solution saline (154 mM NaCl) (Figure 19).
Exemple 9 : Formulations améliorant la biodistribution d'un siRNA in vivo
1. La concentration dans le sérum et les tissus d'un siRNA administré de
façon
systémique est augmentée lorsqu'il est formulé dans un tampon citrate et plus
encore dans
un tampon citrate contenant différents cations.
Le siRNA siAR-1 à la dose de 0.12 mg/kg, formulé dans différentes solutions a
été
administré par voie sous cutanée à des souris. La concentration de siAR-1
mesurée dans le
sérum ou organes de ces différents groupes de souris a été mesurée 20 minutes
après injection
et comparée à celle du groupe contrôle, consitué d'animaux ayant reçu le siRNA
dilué dans
une solution aqueuse contenant 154 mM de NaCl (noté NaCl).
En comparaison avec une formulation dans une solution saline (NaCl 154 mM), la
formulation du siRNA siAR-1 dans un tampon Citrate 10mM pH 6 augmente la
concentration
de ce siRNA dans le sérum (Figure 20A). Cette concentration est encore
augmentée dans le
sérum et les tissus lorsque le tampon citrate 10mM pH 6 est additionné de
ZnC12, MnC12,
MgCl2, ou d'une combinaison de ces sels (Figure 20B).
2. Dans le sérum les tissus et tumeur, la concentration d'un siRNA
administré de façon
systémique et continue est augmentée lorsqu'il est formulé dans un tampon
citrate
contenant des cations.
Un mélange de 3 siRNA, siAR-1, siTSP1-1 et siLuc, a été administré par voie
sous
cutanée continue pendant 3 jours à des souris porteuses de tumeurs mammaires
murines 4T1 à
CA 03041624 2019-04-24
WO 2018/078225 54
PCT/FR2017/052214
l'aide d'une pompe osmotique implantée en sous cutané. Chaque siRNA a été
administré à la
dose de 2mg/kg/jour. Le mélange a été formulé soit dans une solution de NaCl
154mM soit
dans un tampon Citrate 10mM pH 6 contenant 10mM de MgCl2. Après 3 jours, la
concentration de chaque siRNA dans le sérum, les tumeurs et différents organes
a été mesurée
et les valeurs mesurées lorsque le siRNA avait été formulé en tampon citrate-
MgCl2 a été
rapporté aux valeurs mesurées avec administration du siRNA formulé en solution
saline
(NaCl 154mM) dans le même tissu. Les résultats reportés dans les figures 21A
et 21B
montrent que la formulation des siRNA dans le tampon citrate-MgCl2 augmente
d'un facteur
allant jusqu'à plus de 250 leur distribution systémique dans les tissus par
rapport à leur
formulation en solution saline.
Exemple 10: Ciblage d'un siRNA par ajout d'un ligand de CD36
Des souris ont reçu une injection sous cutanée de siAR-1 à la dose de
0.12mg/kg formulé
soit en solution saline (NaCl 154mM) soit en tampon citrate 10mM pH 6
contenant de
l'hexaréline, (rapport siRNA:Hexaréline ; poids/poids; 1:0,2), soit en tampon
citrate 10mM
pH6 contenant des LDL oxydés (rapport siRNA:LDL oxydés ; poids:poids ; 1:1).
La
concentration de siAR-1 a été mesurée et rapportée à la concentration mesurée
lorsque le
siRNA était formulé en solution saline (NaCl 154m1IV1) dans le même tissu. Les
résultats
observés dans le sérum sont reportés dans la figure 22A, dans la prostate et
la rate dans la
figure 22B. Ils montrent que l'ajout d'hexaréline ou de LDL oxydés augmentent
la
concentration du siRNA dans le sérum ou les tissus.
Dans une autre expérience, des pompes osmotiques ont été implantées chez des
souris
porteuses de tumeurs 22RV1, les pompes délivrant pendant 3 jours de façon
continue
2mg/kg/jour de siAR-1 formulé en solution saline (NaC1154mM), ou 2mg/kg/jour
de siAR-1
et 0.2 mg/kg/jour de LDL oxydés formulés en tampon citrate 10mM pH 6. Dans ce
dernier
cas, le siRNA et les LDL oxydés ont été simplement mélangés dans le tampon
citrate, sans
manipulation additionnelle. Les concentrations du siAR-1 formulé en tampon
citrate
contenant des LDL oxydés mesurées dans le sérum, les tissus ou les tumeurs ont
été rapportée
à la valeur mesurée dans le même tissu lorsque le siRNA était formulé en
solution saline
(NaCl 154mM). On constate sur la figure 23 que la présence de LDL oxydés
augmente la
concentration du siAR-1 dans le sérum les tissus et les tumeurs.
