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Utilisation d'un amphidinol pour son activité fongicide et/ou bactéricide sur
les champignons, les
oomycètes et/ou bactéries pathogènes des plantes et semences de culture
L'invention concerne le domaine des antifongiques et anti-bactéricides des
semences.
Après la seconde guerre mondiale et afin de faire face à l'accroissement
mondial de la
population, l'avènement de la révolution verte a été mis en place en
faisant appel aux programmes
modernes de sélection variétale, à l'irrigation, aux engrais et aux pesticides
de synthèse afin de
contrôler la fertilité des sols et les organismes pathogènes. Ces différents
éléments ont ainsi permis
de quasiment tripler la production alimentaire mondiale en l'espace d'une
quarantaine d'années.
Aujourd'hui, le défi de l'agriculture est de nourrir 9 milliards d'individus à
l'horizon 2050 et de
continuer à accroître la production par unité de surface tout en tenant compte
des ressources de plus
en plus limitées et des contraintes croissantes. Par exemple, les pertes
potentielles, dues aux stress
biotiques et en l'absence de méthodes de protection des cultures,
s'élèveraient à plus de la moitié de
la production des céréales. Les produits phytosanitaires conventionnels font
donc partie intégrante de
la protection des cultures dans le monde afin de limiter les pertes.
Cependant, ces produits chimiques
ont un fort impact négatif sur la santé humaine et l'environnement incitant à
utiliser d'autre moyen
de lutte contre les maladies infectieuses tels que le bio-contrôle (ensemble
des méthodes de
protection des végétaux par l'utilisation de mécanisme naturel). L'objet de ce
brevet vise à exploiter
les algues unicellulaires, issues du phytoplancton, comme source de nouvelles
molécules naturelles
capables d'agir en tant que pesticide biologique en affectant directement
la survie des
phytopathogènes infectant des cultures d'importances agronomiques majeures,
tels que le blé et la
vigne.
Les fusa rioses
En Europe, plusieurs maladies sur blé (Triticum aestivum) sont responsables de
pertes de
rendement ou encore d'une dégradation de la qualité sanitaire des grains. Une
des plus importantes
est la septoriose (Septoria spp.). La fusariose est associée à un complexe
d'espèces regroupant deux
genres de champignons phytopathogènes, Fusarium et Microdochium (/). Ces deux
genres englobent
environ 19 espèces capables d'induire la fusariose de l'épi de blé. Les
espèces les plus fréquentes en
Europe sont F. graminearum, F. culmorum, F. avenaceum, F. poae, M. nivale et
M. majus. Le genre
Fusarium appartient à la division des Ascomycètes et à la famille des
Nectriacées. Le genre
Microdochium appartient à la famille des Tuberculariacées et regroupe deux
espèces, M. nivale et
M. majus, provoquant les mêmes symptômes sur épi et sur feuilles que les
Fusaria. Plusieurs espèces
de fusarium, dont Fusarium graminearum est le plus représenté, peuvent se
retrouver ensemble à
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l'échelle de la région, de la parcelle ou sur un même épi formant ainsi le
complexe fusarien. La sévérité,
l'incidence et la prévalence de chaque espèce varient selon la localisation
géographique, les variations
climatiques ainsi que les pratiques culturales. La présence sur un même épi de
plusieurs de ces espèces
est susceptible de modifier leur équilibre et leur dynamique de production de
toxines.
La fusariose du blé peut dévaster une culture quelques semaines avant la
récolte. Elle peut
être associée à la fois à de fortes pertes de rendement (avortement et faible
poids des grains), une
réduction de leur qualité germinative ou encore une diminution de leur qualité
par la présence de
toxines dans les grains. En effet, les champignons du genre Fusarium, mais pas
du genre
Michrodochium, sont capables de produire des métabolites secondaires toxiques,
les mycotoxines,
dont la présence augmente l'incidence de la maladie sur les productions
agricoles et constitue un
problème majeur économique et de santé publique. Les principaux moyens de
lutte contre la fusariose
regroupent les pratiques culturales, la résistance variétale et la lutte
chimique. A l'heure actuelle, peu
de variétés de blé sont résistantes à la fusariose. Cependant, il existe des
variétés tolérantes possédant
des niveaux de résistance partiels limitant les pertes de rendement et
l'accumulation des toxines dans
les récoltes. Une fois la culture installée, le recours à la lutte chimique
est possible mais d'une efficacité
limitée. La diversité des agents pathogènes ainsi que leur sensibilité
différente aux matières actives
complexifient cette lutte. Par exemple, les champignons du genre Fusarium sont
sensibles aux triazoles
alors que les champignons du genre Microdochium sont sensibles aux
strobilurines.
Les septorioses
La septoriose est une maladie du blé responsable d'importantes pertes de
rendement et qui
provoque le plus de pertes économiques dans le monde, notamment dans les
régions tempérées
humides. Deux principales formes de septorioses peuvent être distinguées : La
septoriose des épis
(Phaeosphaeria nodorum) et la septoriose foliaire (Mycosphaerella
graminicola). En France, la
septoriose des épis est surtout présente dans les zones continentales alors
que celle des feuilles l'est
principalement dans le nord-ouest et sur les bordures maritimes où le
champignon trouve des
conditions climatiques favorables à son développement. Les symptômes provoqués
par M. graminicola
apparaissent successivement sous forme de chloroses, taches de couleur vert
clair, avant d'évoluer en
taches brunâtres appelées nécroses. Ces nécroses finissent par se fondre les
unes dans les autres
(coalescence). Ensuite, apparaissent sur ces nécroses les pycnides,
fructifications noires à peine visibles
à l'oeil nu. La nuisibilité de la septoriose en termes de pertes de
photosynthèse, croissance ou
rendement a été étudiée par plusieurs équipes de recherche. Une nuisibilité
qualitative exprimant
l'impact de la maladie sur la teneur en protéines des grains récoltés peut
ainsi être établie.
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M. graminicola est un champignon hémibiotrophe établissant une première phase
biotrophe
où l'infection se déroule sur des tissus vivants puis survient la phase
nécrotrophe pendant laquelle le
champignon exprime des toxines produisant la mort des tissus colonisés. En
fonction des conditions
environnementales, la reproduction de M. graminicola est de nature sexuée
(production d'ascospores)
ou asexuée (production de pycnidiospores). Les ascospores, disséminées par le
vent sur de longues
distances participent notamment à la survie du champignon en l'absence de
plante hôte et est
considéré comme la source principale d'inoculum primaire pour initier la
maladie. Les pycnidiospores,
quant à eux, sont en majorité produites durant la phase épidémique de la
maladie au cours de plusieurs
cycles infectieux successifs. Ces spores sont dispersées sur de courtes
distances par l'action de
l'éclaboussement des gouttes de pluie. La baisse des rendements potentiels est
d'autant plus
importante que les dernières feuilles sous l'épi impliquées dans le
remplissage des grains sont
sévèrement touchées par la maladie. Les pertes de rendement imputable à la
septoriose ont été
évaluées à 1-2 t.ha-1 en moyenne, avec des cas allant jusqu'à 3-3,5 tha-1, ce
qui représente une
diminution de 40 % des rendements.
Les méthodes de lutte pour contrôler M. graminicola sont basées sur
l'utilisation de fongicide
et de cultivars résistants. Cependant, ces dernières années ont vu une perte
importante de l'efficacité
des fongicides due à une forte sélection des agents pathogènes avec, par
exemple, une résistance à la
famille des strobilurines ainsi qu'une perte récente de l'efficacité des
triazoles en champ.
Les maladies de la vigne
De nos jours, la vigne est cultivée dans le monde entier jouant un rôle
central dans l'économie
de nombreux pays. Elle est consommée en raisin de table et en jus, mais son
exploitation principale
repose sur l'industrie du vin. L'Union Européenne est le plus grand producteur
de vin au monde et le
plus grand exportateur mondial de produits viti - vinicoles. Le secteur
rapporte ainsi à l'économie de
l'Union Européenne environ 15 milliards d'euros par an (www. ceev.be). En
2010, le vignoble français
couvrait près de 865 000 ha, soit près de 3 % des terres arables et permet à
la France d'être le premier
producteur mondial de vin avec 51,1 millions d'hectolitres. La vigne doit
faire face à de nombreuses
attaques d'agents pathogènes dont les maladies cryptogamiques. Celles-ci sont
appelées maladie du
bois lorsqu'elles touchent les parties lignifiées de la plante, c'est le cas
notamment de l'esca, du black
dead arm ou de l'eutypiose. Les champignons qui infectent les baies et les
parties herbacées de la vigne
(feuilles, tiges...) induisent les maladies cryptogamiques du feuillage
dont font partie la pourriture
grise, le black rot, le mildiou et l'oïdium.
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L'esca
Si le mildiou, l'oïdium et la pourriture grise représentent les trois
principales maladies
cryptogamiques affectant les vignobles à travers le monde, les maladies du
bois causées par des agents
fongiques deviennent des facteurs limitant de la production de raisins. Les
viticulteurs sont
actuellement confrontés à deux problèmes majeurs concernant ces maladies du
bois : l'absence de
méthodes de lutte et une méconnaissance profonde des différents facteurs
biotiques et abiotiques.
Les espèces de champignon les plus répandues à travers le monde pour la
maladie de l'esca
sont les ascomycètes Diplodia seriata, Diplodia mutila, Neofusicoccum parvum
et Neofusicoccum
luteum. En France, les espèces les plus isolées sont Diplodia seriata et
Botryosphaeria dothidea. De
nombreux autres champignons dont certains pathogènes sont fréquemment isolés
des nécroses du
bois de plantes atteintes d'esca. C'est le cas d'Eutypa tata, agent
responsable de l'Eutypiose. Cette
maladie se présente sous deux formes : la forme lente et la forme
apoplectique. Les symptômes
foliaires sont caractéristiques de la forme lente même s'ils peuvent être
présents chez la forme
apoplectique. La forme lente se caractérise par des colorations foliaires
spécifiques : tâches
internervaires jaunâtres sur cépages blancs et bordées de rouges sur cépages
noirs, les nervures
restantes vertes. Ces tâches évoluent progressivement vers un brunissement et
un dessèchement. Les
symptômes foliaires de la forme lente peuvent être visibles une année sur un
cep et disparaître l'année
suivante. La forme apoplectique est caractérisée par un dessèchement rapide
des organes aériens,
rameaux, feuilles et grappes d'une partie ou de la totalité du cep de vigne.
Ce symptôme se manifeste
généralement lorsque les étés sont chauds, entrainant la mort des ceps en
quelques jours seulement
sans symptômes annonciateurs. La variété des sources d'inoculum et le
développement très lent et
non visible des champignons dans le bois de vigne rendent très compliquée la
mise en oeuvre des
méthodes de lutte. De plus, l'évolution de la réglementation des produits
phytosanitaires à l'échelle
européenne a conduit à l'interdiction de produits chimiques à base d'arsénite
de sodium à cause des
effets cancérogènes sur l'homme et de la forte toxicité de ces produits sur
l'environnement. De
nombreuses recherches sont menées à travers le monde pour tester de nouvelles
molécules utilisables
en pépinière ou au vignoble.
La pourriture grise
La pourriture grise est une maladie cryptogamique causée par un champignon
ascomycète
appelé Botrytis cinerea. Il appartient à la classe des Leotiomycetes, à
l'ordre des Helotiales et la famille
des Sclerotiniaceae. B. cinerea est un champignon nécrotrophe capable de
coloniser les tissus végétaux
sains, déjà infectés, ainsi que les tissus morts (saprophytisme). Sur feuille,
les symptômes apparaissent
sous forme de tâches brunes avec un feutrage grisâtre sur la face inférieure
(fructifications du
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champignon) qui ont tendance à s'accroître et à envahir tout le limbe. Les
grappes peuvent être
touchées avant la floraison et se dessécher. Elles sont surtout sensibles au
stade de la véraison où il y
a développement d'une coloration brune des baies des cépages blancs et
l'apparition d'un épais
feutrage gris. Les conidies sont disséminées par le vent et pénètrent dans les
organes herbacés de
5 façon directe ou par le biais de blessures. C'est pourquoi l'éclatement
des baies dû au mildiou favorise
les infections par B. cinerea. Cette maladie entraîne non seulement des pertes
de rendement pouvant
aller jusqu'à 40 % (Viniflhor, données 2006) mais elle altère également les
qualités organoleptiques
des vins. Néanmoins, Botrytis cinerea est également responsable de la
pourriture noble nécessaire
à l'obtention de certains vins liquoreux.
Le mildiou
Les deux maladies qui touchent le plus sévèrement les vignobles à l'heure
actuelle sont le
mildiou et l'oïdium. L'agent responsable du mildiou, l'oomycète Plasmospora
viticola appartenant à
l'ordre péronosporale, est un parasite obligatoire ; pour le maintenir en vie
et le multiplier, il est
obligatoire de le propager sur des feuilles de vigne en survie. P. viticola
s'attaque à tous les tissus
herbacés de la vigne ainsi qu'aux grappes. Il provoque des défoliations, le
brunissement et
l'assèchement des baies et des tiges. En l'absence de traitement et dans des
conditions climatiques
favorables, le mildiou de la vigne peut dévaster jusqu'à 75% de la récolte de
la saison.
Le cycle de vie de P. viticola comprend une phase sexuée et une phase asexuée.
La phase
asexuée conduit à la production de spores nécessaires aux infections
secondaires et à la dispersion de
l'agent pathogène sur une courte distance, tandis que la phase sexuée produit
des oospores
quiescentes et résistantes au froid permettant le passage de l'hiver et les
infections primaires. La
première preuve macroscopique de la présence de mildiou dans un vignoble est
l'apparition de tâches
jaune pâle et irrégulières (tâches d'huile) grossissant sur la face supérieure
ou adaxiale, des feuilles.
A mesure que la colonisation interne du mycélium avance, le développement de
coussins blancs
cotonneux sur la face inférieure en correspondance avec les tâches d'huile
devient plus important.
Dans les infections avancées ces symptômes sont accompagnés de tissus morts
bruns. La lutte contre
le mildiou s'organise principalement par des mesures préventives par des
pulvérisations de fongicides.
S'il est possible de stopper une attaque, les dégâts, une fois occasionnés sur
les inflorescences et les
grappes, sont irrémédiables.
L'oïdium
L'oïdium de la vigne (Erysiphe necator) est un ascomycète biotrophe
obligatoire appartenant
à l'ordre des Erysiphales. Le champignon colonise la surface de tous les
organes verts de la vigne,
notamment la face supérieure des feuilles, et se propage sur les baies. Une
phase sexuée qui est
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caractérisée par la production de cléistothèces contenant des ascospores peut
alterner avec une phase
asexuée conduisant à la formation de conidiophores portant des conidies.
Durant la phase hivernale
de repos de la vigne, le champignon survit sous forme d'hyphes dans les
bourgeons dormants ou de
cléistothèces à la surface de la plante. Les spores contenues dans les
cléistothèces seront libérées au
printemps pour germer à la surface des bourgeons et des jeunes feuilles. Un
hyphe primaire se
développe ensuite sur la surface de la feuille, puis un réseau mycélien de
plus en plus complexe et
ramifié tapisse la surface foliaire. Par la suite, des conidiophores se
différencient à partir du mycélium
constituant le début de l'étape de sporulation et coloniseront d'autres tissus
verts de la plante donnant
lieu aux infections secondaires.
La présence du mycélium et des conidiophores portant les conidies à la surface
des tissus
infectés de l'hôte donne une apparence poudreuse de couleur blanche grisâtre.
Le feutrage blanc se
développe sur les boutons floraux qui se dessèchent. Seules les jeunes baies
ayant un taux de sucre
<8 % sont sensibles à l'oïdium. Toutes les surfaces foliaires peuvent être
sensibles à l'infection et ce,
quelque soit leur âge. Les jeunes feuilles infectées prennent d'abord une
coloration vert foncé puis les
feuilles se déforment et deviennent rabougries. La surface supérieure des
feuilles peut présenter des
tâches de teinte plus claire et chlorotique ressemblant aux tâches d'huile du
mildiou. A l'heure actuelle,
le principal moyen de lutte contre les maladies qui touchent le plus
sévèrement les vignobles est
l'utilisation de pesticides et fongicides en grande quantité. La pression
sanitaire est donc
particulièrement forte en viticulture.
Les traitements fongicides destinés à lutter principalement contre le mildiou
et l'oïdium sont
appliqués selon un calendrier précis pour prévenir les dommages dus à
l'apparition d'une maladie.
L'Union Européenne (UE) emploie environ 68 000 tonnes de fongicides par an
pour contrôler les
maladies de la vigne, ce qui représente 65 % des fongicides utilisés dans
l'agriculture alors que
seulement 3,3 % de la surface agricole utile de l'UE est occupée par la vigne
(Eurostat, 2007). Afin de
limiter la forte pression des produits chimiques sur l'environnement et la
santé, il est nécessaire
d'isoler des molécules d'origine naturelle qui joueront un rôle de protection
des cultures contre les
maladies infectieuses afin de remplacer à terme les produits phytosanitaires
chimiques utilisés jusqu'à
présent.
La tavelure du pommier
La tavelure est avec la moniliose et l'oïdium une des principales affections
fongiques du
pommier (genre Malus). Elle est causée par un champignon ascomycète nommé
Venturia inaequelis,
dont il existe plusieurs milliers de souches, causant des lésions noires ou
brunes à la surface des
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feuilles, des bourgeons ou des fruits et parfois même sur le bois. Les fruits
et la partie inférieure des
feuilles y sont spécialement sensibles.
Le champignon hiverne sur les feuilles qui tombent des arbres infectés, sous
la forme de
périthèces. Au printemps, au moment de l'éclosion des bourgeons, les
périthèces se remplissent
d'ascospores. Les ascospores sont éjectées dans l'air du verger lors des
journées humides et atteignent
les arbres grâce aux déplacements d'air. Cette décharge d'ascospores commence
au débourrement et
se poursuit pendant 6 à 10 semaines, le plus souvent jusqu'à la fin juin.
Lorsque les ascospores
atteignent le feuillage et que les feuilles sont mouillées pendant un certain
temps, ils germent et
pénètrent les feuilles : il y a alors infection primaire. Selon les conditions
d'humidité et de température,
l'infection fongique devient visible en une à trois semaines sur les
différentes parties de l'arbre. Des
taches olive foncé ou brunes d'environ 5 mm apparaissent sur les feuilles et
peuvent éventuellement
couvrir toute la feuille. Les fleurs infectées peuvent tomber. L'infection des
fruits se reconnaît d'abord
par des taches grises au niveau de la tige.
Suite à l'infection primaire et pour le reste de l'été, le champignon se
développe et engendre
des conidies qui sont une autre forme de structure reproductrice. Lorsque les
conidies s'échappent, il
y a infection secondaire. Les conidies peuvent infecter n'importe quelle
partie de l'arbre et celles
produites en fin d'été peuvent même se développer sur les fruits entreposés.
La pluie forte se charge
de disperser les conidies.
La maladie tue rarement son hôte mais peut réduire significativement (jusqu'à
100 %) la
qualité et la production des fruits en l'absence de traitement par fongicide.
Après les moyens
préventifs qui consistent à ramasser les feuilles tombées lors de l'automne,
la stratégie de lutte impose
d'agir efficacement au printemps afin d'éviter que les spores relâchées
n'infectent ou ne puissent se
développer sur les arbres. La méthode traditionnelle de protection consistait
à commencer
l'application de fongicide dès le débourrement et de répéter les traitements
tous les sept jours environ
jusqu'à la fin juin afin de protéger les nouvelles pousses. Les vergers de
pommier sont les plus traités
en fongicides et en insecticides avec une moyenne de 28,8 traitements
fongicides par an, dont 19 sont
dédiés à la tavelure (données INRA).
Les micro-algues
Les molécules d'origine naturelle ayant un nouveau mécanisme d'action et
capable de
contourner les résistances développées par les agents pathogènes ont un
devenir majeur pour
l'élaboration de nouveaux produits phytosanitaires respectueux de
l'environnement. Les océans
représentent une variété considérable d'organismes (bactéries, microalgues,
algues, animaux
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vertébrés et invertébrés) qui sont une source de nouvelles molécules
bioactives et qui sont encore peu
exploités (2). Par exemple, les micro-organismes marins accumulent des
métabolites secondaires
bioactifs dont leur structure unique n'est pas retrouvée chez les organismes
terrestres. Ces
métabolites représentent donc potentiellement de nouvelles molécules
d'intérêt. Certaines
substances issues d'organismes marins ont été décrits comme possédant une
activité antifongique ou
une activité de substance naturelle de défense, mais la recherche de ces
molécules est encore très peu
développée (3).
Les micro-algues sont des organismes unicellulaires jouant un rôle clé dans
les écosystèmes
aquatiques. Produisant du matériel organique, ils jouent un rôle écologique
important car ils
représentent la base de la chaine alimentaire du milieu marin. Cependant, leur
incroyable capacité à
coloniser l'ensemble des océans du globe suggère qu'elles ont probablement
développé des stratégies
de lutte efficaces contre les agents pathogènes via notamment la production de
pesticides naturels.
Par exemple, l'abondante prolifération dans les régions côtières des micro-
algues produisant des
biotoxines est responsable de la formation des bloom toxiques d'algue (HABs :
Harmful algal blooms)
ayant une conséquence importante sur la cascade trophique.
Parmi les micro-algues, les dinoflagellés, appartenant à l'ordre des
Gymnodiniales et à la
famille des Gymnodiniacées sont présents dans les eaux marines tempérées et
tropicales vivant sous
forme libres ou en symbiose avec les invertébrés (par exemple, les coraux).
Les dinoflagellés
synthétisent un nombre important de métabolites secondaires de type
polycétides (composés ayant
une activité biologique ou pharmacologique pouvant être toxique afin de
conférer un avantage pour
la survie) dont plusieurs ont été caractérisés dont ceux responsables des HAB
(4). Par exemple, l'espèce
modèle des dinoflagellés, Amphidinium carterae, produit une profusion de
différents composés
bioactifs dont plusieurs ont le devenir d'être développés en tant qu'agents
thérapeutiques (5). Les
polycétides produits par les espèces d'Amphidinium sont extrêmement diverses
en structure et
forment trois catégories : les macrolides, les polycétides lineaires et les
polycétides à longue chaine.
Par exemple, les amphidinols sont des polyhydroxy-polyenes (ploycétides à
longue chaine) qui
présentent une forte activité anti-fongique et hémolytique. Ils augmentent
ainsi la perméabilité
membranaire en s'associant avec les lipides membranaires (6). Parmi les
différentes souches
d'Amphidinium, des composées similaires aux amphidinols ayant une longue
chaîne polyhydroxy ont
été isolés tels que les lingshuiols, karatungiols, carteraol E, luteophanols,
colopsinols, et
amphezonol A (5).
Afin de limiter la forte pression des produits chimiques sur l'environnement
et la santé, il est
nécessaire d'isoler des molécules d'origine naturelle qui joueront un rôle de
protection des cultures
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contre les maladies infectieuses afin de remplacer à terme les produits
phytosanitaires chimiques
utilisés jusqu'à présent. Ces pesticides biologiques pourraient ainsi
affecter directement la survie
des phytopathogènes des cultures d'importances agronomiques majeures, tels que
le blé et la vigne.
De façon surprenante, les inventeurs ont identifié qu'une des molécules
responsables de
l'effet fongicide d'un extrait cellulaire d'Amphidinium carterae sur de
nombreux champignons
pathogènes des plantes est l'amphidinol 18.
RESUME DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention concerne l'utilisation de la molécule de
formule (I) suivante :
OH OH OH OH
R1)1+- / .
OH HO OH
OH
HO 7
HO,µ ' OH R22?- ===.,, ===,... =-=...... - 0
Ill H
HO OH
dans laquelle :
= R1 est choisi dans le groupe constitué de:
OR3 OH 0 OH OH
HO
OH OH ,
OH OH OH
y
0
i_i0
HO HO
HO
OH ,
OH
R30 n m
OH OH OH OH OH OH ,
OH
,zz2:
HO /
OR3 OH
,
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OH
R30
OH OH OH , et
R4
/ - - -
HO
OR3 OH OH OH OH .
,
où:
- R3 représente H ou SO3Na,
5 - R4 représente H ou OH,
- représente une liaison simple ou une liaison double,
- n est est égal à 0 ou 1 et
- m est égal à 0 ou 1; et
= R2 est choisi dans le groupe constitué de:
HO-)Ç-
10 ,,_
-?- et OH
pour son activité fongicide et/ou bactéricide sur les champignons, les
oomycètes et/ou bactéries
pathogènes des plantes et semences de culture.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de lutte contre les
champignons, les
oomycètes et/ou les bactéries pathogènes des plantes et semences de culture
comprenant
l'application sur les plantes de culture et/ou l'enrobage desdites semences de
la molécule de
formule (I).
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1. Fractionnement de l'extrait D sur colonne C18 en phase inversée et
test d'activité
des différentes fractions de l'extrait D obtenues par HPLC
A. Test in vitro d'inhibition de croissance de F. graminearum de l'extrait D à
5 g/L obtenu après
extraction au méthanol
B. Chromatogramme liquide obtenu après injection de l'extrait D. Les
échantillons ont été
assemblées suivant les pointillés afin de constituer 5 fractions, notées F1 à
F5.
C. Test in vitro d'inhibition de croissance de F. graminearum des fractions F1
à F5 à une
concentration de 5 g/L
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D. Test in vitro d'inhibition de croissance de F. graminearum de la fraction
F1 à une
concentration de 0,5 g/L, 0,75 g/L, 1 g/L, 1,5 g/L, 2,5 g/L et de 5 g/L
- : témoin négatif : les spores sont incubées en présence du tampon seul
Figure 2. Fractionnement de la fraction F1 sur colonne C18 en phase inversée
et test
d'activité des différentes fractions obtenues par HPLC
A. Chromatogramme liquide obtenu après injection de la fraction F1. Les
échantillons ont été
assemblées suivant les pointillées afin de constituer 5 fractions, notées F1-1
à F1-5.
B. Test in vitro d'inhibition de croissance de F. graminearum des fractions F1
à F5 à une
concentration de 5 g/L
C. Test in vitro d'inhibition de croissance de F. graminearum de la fraction
F1-2 à des
concentrations allant de 0,0005 g/L à 1 g/L
- : témoin négatif : les spores sont incubées en présence du tampon seul
Figure 3. Analyse de la fraction F1-2 par spectrométrie de masse.
A. Spectre de masse acquis en ionisation electrospray en mode positif sur la
molécule d'intérêt
collectée F1-2
B. Spectre de masse en tandem de l'ion 1381,8276Da détecté en A. Les pics
entourés sont en
adéquation avec ceux retrouvés dans l'AM18 caractérisé par Nuzzo et al., 2014
(7)
Figure 4. Analyse de la fraction F1-2 par RMN.
A. Spectre RMN 1-11 (solvant Me0D4) obtenu pour la molécule de la fraction F1-
2 issue de
l'extrait D
B. Spectre RMN '3C DEPT135 (solvant Me0D4) obtenu pour la molécule de la
fraction F1-2 issue
.. de l'extrait D
Figure 5. Formule développée de la molécule Amphidinol 18, issue de la
fraction F1-2 de
l'extrait D
Toutes les corrélations COSY et TOCSY entre chacun des protons sont
représentées en gras
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DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention concerne l'utilisation de la molécule de
formule (I) suivante :
OH OH OH OH
R1)'?- / '
OH HO OH
OH
HQ 7
HO" OH
Ill H
HO OH
dans laquelle :
= R1 est choisi dans le groupe constitué de:
OR3 OH 0 OH OH
HO
OH OH ,
OH OH OH
0
i_i0
HO HO
HO
OH ,
OH
R30 n m
OH OH OH OH OH OH ,
OH
HO
OR3 OH
,
OH
R30
OH OH OH , et
R4
HO
OR3 OH OH OH OH .
,
où:
- R3 représente H ou SO3Na,
- R4 représente H ou OH,
- représente une liaison simple ou une liaison double,
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- n est est égal à 0 ou let
- m est égal à 0 ou 1; et
= R2 est choisi dans le groupe constitué de:
;2Ç et OH
pour son activité fongicide et/ou bactéricide sur les champignons, les
oomycètes et/ou bactéries
pathogènes des plantes et semences de culture.
De préférence, R1 est:
0 R3 OH 0 OH OH
HO
OH OH
où R3 représente H ou SO3Na.
De préférence, R2 est :
De préférence, la molécule de formule (1) est l'amphidinol 18 ou l'amphidinol
19:
OH OH 0 OH 9H OH OH OH OH
OH
HO
OH C5H OH OH
OH
OHHC) OH L'OH
0
OH OH
Amphidinol 18
OSO3Na OH 0 OH OH OH OH OH OH
OH
HO
OH OH OH 6H 0
OH
OHI-P OH OH
0
H OH
Amphidinol 19
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La molécule de formule (I) est un amphidinol.
La molécule de formule (I) peut être synthétique ou extraite de cellules d'une
ou plusieurs
microalgues du genre Amphidinium.
Les Amphidinium
Des Amphidinium appropriés sont choisis dans le groupe constitué de
Amphidinium
achromaticum, Amphidinium aculeatum, Amphidinium acutissimum, Amphidinium
acutum,
Amphidinium alinii, Amphidinium aloxalocium, Amphidinium amphidinioides,
Amphidinium
asymmetricum, Amphidinium aureum, Amphidinium belauense, Amphidinium
bidentatum,
Amphidinium bipes, Amphidinium boekhoutensis, Amphidinium boggayum,
Amphidinium
caerulescens, Amphidinium carbunculus, Amphidinium carterae, Amphidinium
celestinum,
Amphidinium chattonii, Amphidinium coeruleum, Amphidinium conradii,
Amphidinium con us,
Amphidinium coprosum, Amphidinium corallinum, Amphidinium corpulentum,
Amphidinium crassum,
Amphidinium cristatum, Amphidinium cucurbita, Amphidinium cucurbitella,
Amphidinium
cupulatisquama, Amphidinium curvatum, Amphidinium cyan eoturbo, Amphidinium
dent atum,
Amphidinium discoidale, Amphidinium dubium, Amphidinium eilatiensis,
Amphidinium emarginatum,
Amphidinium fastigium, Amphidinium filum Bahm, Amphidinium flagellons,
Amphidinium flexum,
Amphidinium galbanum, Amphidinium gibbosum, Amphidinium glaucovirescens,
Amphidinium
glaucum, Amphidinium globosum, Amphidinium hadai, Amphidinium herdmanii,
Amphidinium
incoloratum, Amphidinium inflatum, Amphidinium kesselitzii, Amphidinium
kesslitzii, Amphidinium
klebsii, Amphidinium lacunarum, Amphidinium lanceolatum, Amphidinium lefevrei,
Amphidinium
lilloense, Amphidinium tissue, Amphidinium longum, Amphidinium luteum,
Amphidinium
machapungarum, Amphidinium macrocephalum, Amphidinium mammillatum, Amphidinium
manannini, Amphidinium mananninii, Amphidinium massartii, Amphidinium
mootonorum,
Amphidinium mucicola, Amphidinium nasutum, Amphidinium obliquum, Amphidinium
obrae,
Amphidinium oceanicum, Amphidinium oculatum, Amphidinium operculatum,
Amphidinium
operculatum var. steinii, Amphidinium omithocephalum, Amphidinium ovoideum,
Amphidinium ovum,
Amphidinium pacificum, Amphidinium pelagicum, Amphidinium phthartum,
Amphidinium
psammophila, Amphidinium psittacus, Amphidinium purpureum, Amphidinium
pusillum, Amphidinium
rhynchocephalum, Amphidinium roseolum, Amphidinium ruttneri, Amphidinium
salinum, Amphidinium
schilleri, Amphidinium schroederi, Amphidinium scissum, Amphidinium
sphagnicola, Amphidinium
sphenoides, Amphidinium steinii, Amphidinium stellatum, Amphidinium stigmatum,
Amphidinium
sulcatum, Amphidinium tortum, Amphidinium trochodinioides, Amphidinium
trochodinoides,
Amphidinium trullo, Amphidinium truncatum, Amphidinium turbo, Amphidinium
vernal, Amphidinium
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vigrense, Amphidinium vitreum, Amphidinium vittatum, Amphidinium wigrense,
Amphidinium
yoorugurrum, Amphidinium yuroogurrum.
De préférence, la molécule de formule (I) est extraite de Amphidinium
carterae. Il existe
plusieurs souches d'Amphidinium carterae en collection comme les souches CCMP
124, 1314, 3177
5 (CCMP = Culture Collection of Marine Phytoplankton), AC 208, 792 (AC
=Algobank Cean), BEA 01198
(BEA= Banco Espariol de Algas).
Avantageusement, la souche d'Amphidinium carterae utilisée selon l'invention
est CCMP 1314,
AC208 ou AC792.
10 Extraction
Ledit extrait peut être préparé par toute méthode d'extraction cellulaire
connue de l'homme
du métier, solide-liquide ou liquide-liquide, par exemple une extraction en
solvant inorganique ou
organique, lequel peut être choisi dans le groupe constitué de l'eau, des
solutions aqueuses, des
solvants hydrocarbonés (les aliphatiques, les aromatiques), des solvants
oxygénés (alcools, cétones,
15 acides, esters et éthers), des solvants halogénés (dichlorométhane,
cholorforme) et des mélanges en
toute proportion miscibles de ces solvants.
Avantageusement, on priviligiera comme solvant l'eau ou les solvants oxygénés,
de préférence
les alcools, de manière particulièrement préférée les alcools en Cl à C4 comme
le méthanol ou
l'éthanol.
De manière particulièrement préférée, on priviligiera les alcools en Cl à C4.
De préférence, ledit extrait est une fraction hydrosoluble.
Concentration
De préférence, la molécule de formule (I) est utilisée en une quantité
comprise entre 0,1 et
5 mg/mL, de préférence comprise entre 0,5 et 3 mg/mL, de manière
particulièrement préférée
comprise entre 0,75 et 1 mg/mL.
Mode d'action
Cette activité fongicide sur les champignons et/ou les oomycètes pathogènes
des plantes et
semences de culture peut en particulier s'exercer par inhibition de la
germination des spores ou par
inhibition de la croissance du champignon et/ou des oomycètes.
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L'activité s'exerce par une activité lytique des parois et membranes
cellulaires qui aboutit à la
lyse cellulaire.
Plantes de culture
Lesdites plantes de culture sont en particulier choisies dans le groupe
constitué des céréales
comme le blé, maïs, orge, riz, soja, des fruits et légumes comme pomme de
terre, carotte, pommiers,
pêchers, abricotiers, tomates, radis, haricots, de la vigne et des plantes
d'ornement.
Lesdites plantes de culture sont en particulier choisies dans le groupe
constitué des genres
Abelmoschus, Acacia, Achras, Agave, Agrostis, Aleurites, Allium, Anacardium,
Ananas, Annona, Apium,
Arachis, Areca, Armoracia, Arracacia, Artocarpus, Asparagus, Aspidosperma,
Avena, Bertholletia, Beta,
Boehmeria, Borassus, Brassica, Cajanus, Camellia, Cannabis, Capsicum, Carica,
Carthamus, Carum,
Carya, Castanea, Ceiba, Ceratonia, Chenopodium, Chrysanthemum, Cicer,
Cichorium, Cinchona,
Cinnamomum, Citrullus, Citrus, Cocos, Coffea, Cola, Colocasia, Corchorus,
Corylus, Crotalaria, Cucumis,
Cucurbita, Cydonia, Cymbopogon, Cynara, Dactylis, Daucus, Dioscorea,
Diospyros, Echinochloa, Elaeis,
Elettaria, Eleusine, Eragrostis, Eriobotrya, Eugenia, Fagopyrum, Ficus,
Foeniculum, Fragaria, Furcraea,
Glycine, Glycyrrhiza, Gossypium, Guizotia, Helianthus, Hevea, Hibiscus,
Hordeum, Humulus, Ilex,
Indigofera, Ipomoea, Jasminum, Jugions, Lactuca, Lagenaria, Lavandula,
Lawsonia, Lens, Lepidium,
Lespedeza, Linum, Litchi, Lolium, Lopmoea, Lotus, Lupinus, Lycopersicon,
Lygeum, Macadamia, Malus,
Mangifera, Manihot, Maranta, Medicago, Mentha, Mespilus, Metroxylon, Moringa,
Musa, Myristica,
Nicotiana, Olea, Onobrychis, Oryza, Panicum, Papaver, Pastinaca, Pelargonium,
Pennisetum, Persea,
Phaseolus, Phleum, Phoenix, Phormium, Pimpinella, Piper, Pistacia, Pisum,
Prunus, Psidium, Punica,
Pyrus, Raphanus Rheum, Ribes, Ricin us, Rose, Rubus, Saccharum, Scorzonera,
Secale Sechium,
Sesamum, Setaria, Solanum, Sorghum, Spin acia, Theobroma, Tragopogon,
Trifolium, Trigonella,
Triticum, Urena, Vaccinium, Valerianella, Vanilla, Vicia, Vigna, Vitellaria,
Vitis, Xanthosoma, Zea,
.. Zingiber.
Pathogènes
Lesdits champignons pathogènes des plantes et semences de culture sont des
ascomycètes ou
des basidiomycètes, de préférence des ascomycètes.
Lesdits champignons pathogènes des plantes et semences de culture sont des
champignons
pathogènes des plantes et semences de culture des genres :
Acrocalymma, Acrocalymma medicaginis,
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Fusarium, Fusarium affine, Fusarium arthrosporioides, Fusarium crookwellense,
Fusarium culmorum,
Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme, Fusarium incamatum, Fusarium
solani, Fusarium
langsethiae, Fusarium mangiferae, Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, Fusarium
oxysporum f.sp.
asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. batatas, Fusarium oxysporum f.sp. betae,
Fusarium oxysporum
f.sp. cannabis, Fusarium oxysporum f.sp. carthami, Fusarium oxysporum f.sp.
cattleyae, Fusarium
oxysporum f.sp. ciceris, Fusarium oxysporum f.sp. coffea, Fusarium oxysporum
f.sp. cubense, Fusarium
oxysporum f.sp. cyclaminis, Fusarium oxysporum f.sp. dianthi, Fusarium
oxysporum f.sp. lentis,
Fusarium oxysporum f.sp. uni, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium
oxysporum f.sp.
medicaginis, Fusarium oxysporum f.sp. pis!, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-
lycopersici, Fusarium
oxysporum f.sp. spinacia, Fusarium oxysporum, Fusarium pallidoroseum, Fusarium
patch, Fusarium
proliferatum, Fusarium redolens, Fusarium sacchari, Fusarium solani, Fusarium
subglutinans, Fusarium
sulphureum, Fusarium tricinctum, Fusarium wilt,
Botrytis, Botrytis allii, Botrytis anthophila, Botrytis cinerea, Botrytis
fabae, Botrytis narcissicola,
Alternaria, Alternaria alternata, Alternaria brassicae, Alternaria
brassicicola, Alternaria carthami,
Alternaria cinerariae, Alternaria douci, Alternaria dianthi, Alternaria
dianthicola, Alternaria
euphorbiicola, Alternaria helianthi, Alternaria helianthicola, Alternaria
japonica, Alternaria
leucanthemi, Alternaria limicola, Alternaria linicola, Alternaria padwickii,
Alternaria panax, Alternaria
radicina, Alternaria raphani, Alternaria saponariae, Alternaria senecionis,
Alternaria solani, Alternaria
tenuissima, Alternaria triticina, Alternaria zinniae,
Erisyphe, Erisyphe necator, Erysiphe betae, Erysiphe brunneopunctata, Erysiphe
cichoracearum,
Erysiphe cruciferarum, Erysiphe graminis f. sp. Avenae, Erysiphe graminis
f.sp. tritici, Erysiphe heraclei,
Erysiphe pisi,
Claviceps, Claviceps fusiformis, Claviceps purpurea, Claviceps sorghi,
Claviceps zizaniae,
Gaeumannomyces, Gaeumannomyces graminis,
Leptosphaeria, Leptosphaeria nodorum, Leptosphaeria acuta, Leptosphaeria
cannabina,
Leptosphaeria coniothyrium, Leptosphaeria libanotis, Leptosphaeria
lindquistii, Leptosphaeria
maculons, Leptosphaeria musarum, Leptosphaeria pratensis, Leptosphaeria
sacchari, Leptosphaeria
woroninii,
Microdochium, Microdochium spp. Microdochium bolleyi, Microdochium dimerum,
Microdochium
.. pan attonianum, Microdochium phragmitis,
Mycosphaerella, Mycosphaerella arachidis, Mycosphaerella areola,
Mycosphaerella berkeleyi,
Mycosphaerella bolleana, Mycosphaerella brassicicola, Mycosphaerella caricae,
Mycosphaerella
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caryigena, Mycosphaerella cerasella, Mycosphaerella coffeicola, Mycosphaerella
confusa,
Mycosphaerella cruenta, Mycosphaerella dendroides, Mycosphaerella eumusae,
Mycosphaerella
gossypina, Mycosphaerella graminicola, Mycosphaerella hennin gsii,
Mycosphaerella horii,
Mycosphaerella juglandis, Mycosphaerella lagemformis, Mycosphaerella linicola,
Mycosphaerella
louisianae, Mycosphaerella musae, Mycosphaerella musicola, Mycosphaerella
palmicola,
Mycosphaerella pin odes, Mycosphaerella pistaciarum, Mycosphaerella pistacina,
Mycosphaerella
platamfolia, Mycosphaerella polymorpha, Mycosphaerella pomi, Mycosphaerella
punctiformis,
Mycosphaerella pyri,
Oculimacula, Oculimacula acuformis, Oculimacula yallundae,
Blumeria, Blumeria graminis,
Pyrenophora, Pyrenophora avenae, Pyrenophora chaetomioides, Pyrenophora
graminea, Pyrenophora
seminiperda, Pyrenophora teres, Pyrenophora teres f. maculata, Pyrenophora
teres f. teres,
Pyrenophora tritici-repentis,
Ramularia, Ramularia collo-cygni, Ramularia beticola, Ramularia coryli,
Ramularia cyclaminicola,
Ramularia macrospora, Ramularia menthicola, Ramularia necator, Ramularia
primulae, Ramularia
spinaciae, Ramularia subtilis, Ramularia tenella, Ramularia vallisumbrosae,
Rhynchosporium, Rhynchosporium secalis,
Cochliobolus, Cochliobolus, Cochliobolus carbonum, Cochliobolus cymbopogonis,
Cochliobolus
hawaiiensis, Cochliobolus heterostrophus, Cochliobolus lunatus, Cochliobolus
miyabeanus,
Cochliobolus ravenelii, Cochliobolus sativus, Cochliobolus setariae,
Cochliobolus spicifer, Cochliobolus
stenospilus, Cochliobolus tuberculatus, Cochliobolus victoriae,
Microdochium, Microdochium oryzae,
Pyricularia, Pyricularia oryzae,
Sarocladium, Sarociadium oryzae,
Ustilaginoides, Ustilaginoides virens,
Cercospora, Cercospora, Cercospora apii, Cercospora apii f.sp. clerodendri,
Cercospora apiicola,
Cercospora arachidicola, Cercospora asparagi, Cercospora atrofiliformis,
Cercospora beticola,
Cercospora brachypus, Cercospora brassicicola, Cercospora brunkii, Cercospora
cannabis, Cercospora
cantuariensis, Cercospora capsici, Cercospora carotae, Cercospora corylina,
Cercospora fuchsiae,
Cercospora fusca, Cercospora fusimaculans, Cercospora gerberae, Cercospora
haistedii, Cercospora
handelii, Cercospora hayi, Cercospora hydrangeae, Cercospora kikuchii,
Cercospora lentis, Cercospora
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liquidambaris, Cercospora longipes, Cercospora longissima, Cercospora
mamoonis, Cercospora
mangiferae, Cercospora medicaginis, Cercospora melon genae, Cercospora minuta,
Cercospora
nicotianae, Cercospora odontoglossi, Cercospora papa yae, Cercospora
penniseti, Cercospora pisa-
sativae, Cercospora platanicola, Cercospora puderii, Cercospora pulcherrima,
Cercospora rhapidicola,
Cercospora rosicola, Cercospora sojina, Cercospora solani, Cercospora solani-
tuberosi, Cercospora
sorghi, Cercospora theae, Cercospora tuberculans, Cercospora vexons,
Cercospora vicosae, Cercospora
zeae-maydis, Cercospora zebrina, Cercospora zonata,
Corynespora, Corynespora cassiicola,
Phakospora, Phakospora pachyrhizi, Phakopsora gossypii, Colletotrichum,
Colletotrichum acutatum,
Colletotrichum arachidis, Colletotrichum capsici, Colletotrichum cereale,
Colletotrichum coffeanum,
Colletotrichum crassipes, Colletotrichum dematium, Colletotrichum dematium f.
spin aciae,
Colletotrichum derridis, Colletotrichum destructivum, Colletotrichum
gloeosporioides, Colletotrichum
glycines, Colletotrichum gossypii, Colletotrichum graminicola, Colletotrichum
higginsianum,
Colletotrichum kahawae, Colletotrichum lindemuthianum, Colletotrichum lin!,
Colletotrichum
mangenotii, Colletotrichum musae, Colletotrichum nigrum, Colletotrichum
orbiculare, Colletotrichum
pis!, Colletotrichum sublineolum, Colletotrichum trichellum, Colletotrichum
trifolii, Colletotrichum
truncatum,
Pythium spp,
Diplodia, Diplodia allocellula, Diplodia laelio-cattleyae, Diplodia manihoti,
Diplodia paraphysaria,
Diplodia seriata, Diplodia theae-sinensis,
Monilia, Monilinia azaleae, Monilinia fructicola, Monilinia fructigena,
Monilinia laxa, Monilinia
oxycocci,
Pezzicula, Pezzicula alba, Pezzicula malicorticis,
Zymoseptoria, Zymoseptoria tritici
Phytophthora, Phytophthora infestons
Guignardia, Guignardia bidwelli, Guignardia camelliae, Guignardia fulvida,
Guignardia mangiferae,
Guignardia musae, Guignardia philo prina,
Plasmopara, Plasmopara viticola,
Puccinia, Puccinia angustata, Puccinia arachidis, Puccinia aristidae, Puccinia
asparagi, Puccinia
cacabata, Puccinia campanulae, Puccinia carthami, Puccinia coronata, Puccinia
dioicae, Puccinia
erianthi, Puccinia extensicola, Puccinia helianthi, Puccinia hordei, Puccinia
jaceae, Puccinia kuehnii,
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Puccinia malvacearum, Puccinia mariae-wilsoniae, Puccinia melanocephala,
Puccinia menthae,
Puccinia oxalidis, Puccinia pelargonii-zonalis, Puccinia pittieriana, Puccinia
poarum, Puccinia purpurea,
Puccinia recondita, Puccinia schedonnardii, Puccinia sessilis, Puccinia
striiformis, Puccinia striiformis,
Puccinia subnitens, Puccinia substriata, Puccinia verruca, Puccinia xanthii,
5 Rhizoctonia, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia oryzae, Rhizoctonia
cerealis, Rhizoctonia leguminicola,
Rhizoctonia rubi,
Sclerotinia, Sclerotinia borealis, Sclerotinia bulborum, Sclerotinia min or,
Sclerotinia ricini, Sclerotinia
sclerotiorum, Sclerotinia spermophila, Sclerotinia trifoliorum,
Septoria, Septoria ampelina, Septoria azaleae, Septoria bataticola, Septoria
campanulae, Septoria
10 cannabis, Septoria cucurbitacearum, Septoria darrowii, Septoria dianthi,
Septoria eumusae, Septoria
glycines, Septoria helianthi, Septoria humuli, Septoria hydrangeae, Septoria
lactucae, Septoria
lycopersici, Septoria lycopersici, Septoria menthae, Septoria passerinii,
Septoria pisi, Septoria
rhododendri, Septoria secalis, Septoria selenophomoides,
Venturia, Venturia inaequalis. Venturia carpophila,
15 Acrodontium, Acrodontium simplex,
Acrophialophora, Acrophialophora fusispora,
Acrosporium, Acrosporium tin gitaninum,
Aecidium, Aecidium aechmantherae, Aecidium amaryllidis, Aecidium breyniae,
Aecidium
campanulastri, Aecidium cannabis, Aecidium cantensis, Aecidium caspicum,
Aecidium foeniculi,
20 Aecidium narcissi,
Ahmadiago,
Albonectria, Albonectria rigidiuscula,
Allodus, Allodus podophylli,
Amphobotrys, Amphobotrys ricini,
Anguillosporella, Anguillosporella vermiformis,
Anthostomella, Anthostomella pullulons,
Antrodia, Antrodia albida, Antrodia serialiformis, Antrodia serialis,
Apiospora, Apiospora monta gnei,
Appendiculella,
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Armillaria Armillaria heimii, Armillaria sinapina, Armillaria socialis,
Armillaria tabescens,
Arthrocladiella,
Arthuriomyces, Arthuriomyces peckianus,
Ascochyta, Ascochyta asparagina, Ascochyta bohemica, Ascochyta caricae,
Ascochyta doronici,
Ascochyta fabae f.sp. lentis, Ascochyta graminea, Ascochyta horde!, Ascochyta
humuli, Ascochyta pis!,
Ascochyta prasadii, Ascochyta sorghi, Ascochyta spinaciae, Ascochyta tarda,
Ascochyta tritici,
Ascospora, Ascospora ruborum,
Aspergillus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus fischerianus, Aspergillus
figer,
Asperisporium, Asperisporium caricae,
Asteridiella,
Asteroma, Asteroma caryae,
Athelia, Athelia arachnoidea, Athelia rolfsii,
Aurantiporus, Aurantiporus fissilis,
Aureobasidium, Aureobasidium pullulons,
Bambusiomyces,
Banana freckle,
Bayoud disease,
Ben iowskia, Beniowskia sphaeroidea,
Bionectria, Bionectria ochroleuca,
Bipolaris, Bipolaris cactivora, Bipolaris cookei, Bipolaris incurvata,
Bipolaris sacchari,
Biscogniauxia, Biscogniauxia capnodes, Biscogniauxia marginata,
Bjerkandera, Bjerkandera adusta,
Black sigatoka,
Blakeslea, Blakeslea trispora,
Botryodiplodia, Botryodiplodia oncidii, Botryodiplodia ulmicola,
Botryosphaeria, Botryosphaeria coco gena, Botryosphaeria dot hidea,
Botryosphaeria marconi!,
Botryosphaeria obtusa, Botryosphaeria rhodina, Botryosphaeria ri bis,
Botryosphaeria stevensii,
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Botryosporium, Botryosporium puichrum,
Botryotinia, Botryotinia fuckeliana, Botryotinia polyblastis,
Boxwood blight,
Brachybasidiaceae,
Brasiliomyces, Brasiliomyces malachrae,
Briosia, Briosia ampelophaga,
Brown ring patch,
Buckeye rot of tomato,
Bulbomicrosphaera,
.. Cadophora, Cadophora malorum,
Caespitotheca,
Calonectria, Calonectria ilicicola, Calonectria indusiata, Calonectria
kyotensis, Calonectria pyrochroa,
Calonectria quinqueseptata,
Camarotella, Camarotella acrocomiae, Camarotella costaricensis,
Canna rust,
Capitorostrum, Capitorostrum cocoes,
Capnodium, Capnodium footii, Capnodium mangiferum, Capnodium ramosum,
Capnodium theae,
Cephalosporium, Cephalosporium gramineum,
Ceratobasidium, Ceratobasidium cereale, Ceratobasidium comigerum,
Ceratobasidium noxium,
Ceratobasidium ramicola, Ceratobasidium setariae, Ceratobasidium steyensii,
Ceratocystis, Ceratocystis adiposa, Ceratocystis coerulescens, Ceratocystis
fimbriata, Ceratocystis
moniliformis, Ceratocystis obionga, Ceratocystis obpyriformis, Ceratocystis
paradoxa, Ceratocystis
pilifera, Ceratocystis pluriannulata, Ceratocystis polyconidia, Ceratocystis
tanganyicensis, Ceratocystis
zombamontana,
Ceratorhiza, Ceratorhiza hydrophila,
Ceratospermopsis,
Cercosepto ria, Cercoseptoria ocellata,
Cercosporella, Cercosporella rubi,
CA 03066485 2019-12-05
WO 2018/224675
PCT/EP2018/065224
23
Ceriporia, Ceriporia spissa, Ceriporia xylostromatoides,
Cerrena, Cerrena unicolor,
Ceuthospora, Ceuthospora lauri,
Choanephora, Choanephora cucurbitarum, Choanephora infundibulifera,
Chrysanthemum, Chrysanthemum white rust,
Chrysomyxa, Chrysomyxa cassandrae,
Chrysomyxa, Chrysomyxa himalensis, Chrysomyxa ledi, Chrysomyxa ledi var.
rhododendri, Chrysomyxa
ledicola, Chrysomyxa nagodhii, Chrysomyxa neoglandulosi, Chrysomyxa piperiana,
Chrysomyxa
pirolata, Chrysomyxa pyrolae, Chrysomyxa reticulata, Chrysomyxa roanensis,
Chrysomyxa succinea,
Cladosporium, Cladosporium arthropodii, Cladosporium cladosporioides,
Cladosporium
cladosporioides f.sp. pisicola, Cladosporium cucumerinum, Cladosporium
herbarum, Cladosporium
musae, Cladosporium oncobae,
Climacodon, Climacodon pulcherrimus, Climacodon septentrion ails,
Clitocybe, Clitocybe parasitica,
.. Clonostachys rosea f. rosea,
Clypeoporthe, Clypeoporthe iliau,
Coleosporium, Coleosporium helianthi, Coleosporium ipomoeae, Coleosporium
madiae, Coleosporium
pacificum, Coleosporium tussilaginis,
Conidiosporomyces,
Coniella, Coniella castaneicola, Coniella diplodiella, Coniella fragariae,
Coniothecium, Coniothecium chomatosporum,
Coniothyrium, Coniothyrium celtidis-australis, Coniothyrium henriquesii,
Coniothyrium rosarum,
Coniothyrium wemsdorffiae,
Coprinopsis, Coprinopsis psychromorbida,
Cordana, Cordana johnstonii, Cordana musae, Coriolopsis floccosa,
Corn grey leaf spot,
Corticium, Corticium invisum, Corticium penicillatum, Corticium theae,
Coryneopsis, Coryneopsis rubi,
CA 03066485 2019-12-05
WO 2018/224675
PCT/EP2018/065224
24
Coryneum, Coryneum rhododendri,
Covered smut,
Crinipellis, Crinipellis sarmentosa,
Cronartium, Cronartium ribicola,
Cryphonectriaceae,
Cryptobasidiaceae,
Cryptocline, Cryptocline cyclaminis,
Cryptomeliola,
Cryptosporella, Cryptosporella umbrina,
Cryptosporiopsis, Cryptosporiopsis tarraconensis,
Cryptosporium, Cryptosporium minimum,
Curvularia, Curvularia lunata, Curvularia caricae-papayae, Curvularia
penniseti, Curvularia
senegalensis, Curvularia trifolii,
Cyclaneusma needie cast,
Cylindrocarpon, Cylindrocarpon ianthothele var. ianthothele, Cylindrocarpon
magnusianum,
Cylindrocarpon musae,
Cylindrocladiella, Cylindrociadiella camelliae, Cylindrociadiella parva,
Cylindrocladium, Cylindrociadium clavatum, Cylindrociadium lanceolatum,
Cylindrociadium
peruvianum, Cylindrociadium pteridis,
Cylindrosporium, Cylindrosporium cannabinum, Cylindrosporium juglandis,
Cylindrosporium rubi,
Cymadothea, Cymadothea trifolii,
Cytospora, Cytospora palmarum, Cytospora personata, Cytospora sacchari,
Cytospora sacculus,
Cytospora terebinthi,
Cytospori na, Cytosporina ludibunda,
Dactuliophora, Dactuliophora elongata,
Davidiella, Davidiella dianthi, Davidiella tassiana,
Deightoniella, Deightoniella papuana, Deightoniella torulosa,
Dendrophora, Dendrophora marconii, Dendrophora erumpens,
CA 03066485 2019-12-05
WO 2018/224675
PCT/EP2018/065224
Denticularia, Denticularia mangiferae,
Dermea pseudotsugae,
Diaporthaceae,
Diaporthe, Diaporthe arctii, Diaporthe dulcamarae, Diaporthe eres, Diaporthe
helianthi, Diaporthe
5 lagunensis, Diaporthe lokoyae, Diaporthe melonis, Diaporthe orthoceras,
Diaporthe pemiciosa,
Diaporthe phaseolorum, Diaporthe phaseolorum var. caulivora, Diaporthe
phaseolorum var.
phaseolorum, Diaporthe phaseolorum var. soja, Diaporthe rudis, Dia porthe tan
akae, Diaporthe toxica,
Dicarpella, Dicarpella dryina,
Didymella, Didymella applanata, Didymella bryoniae, Didymella fabae, Didymella
lycopersici
10 Didymosphaeria, Didymosphaeria arachidicola, Didymosphaeria taiwanensis,
Dilophospora, Dilophospora alopecuri,
Dimeriella, Dimeriella sacchari,
Diplocarpon, Diplocarpon mespili, Diplocarpon rosae,
Discosia, Discosia artocreas,
15 Discostroma, Discostroma corticola,
Distocercospora, Distocercospora livistonae,
Dothiorella, Dothiorella brevicollis, Dothiorella dominicana, Dothiorella
dulcispinae, Dothiorella
gregaria,
Drechslera, Drechslera avenacea, Drechslera campanulata, Drechslera
dematioidea, Drechslera
20 gigantea, Drechslera glycines, Drechslera musae-sapientium, Drechslera
teres f. maculata, Drechslera
wirreganensis,
Eballistra, Eballistra lineata, Eballistra oryzae,
Eballistraceae,
Echinodontium, Echinodontium ryvardenii, Echinodontium tinctorium,
25 Ectendomeliola,
Elsinoê, Elsinoé ampelina, Elsinoé batatas, Elsinoé brasiliensis, Elsinoé
leucospila, Elsinoé randii, Elsinoé
rosarum, Elsinoé sacchari, Elsinoé theae, Elsinoé veneta,
Endomeliola,
CA 03066485 2019-12-05
WO 2018/224675
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26
Endothia, Endothia radicalis,
Endothiella, Endothiella gyrosa,
Entorrhizomycetes,
Entyloma, Entyloma ageratinae, Entyloma dahliae, Entyloma ellisii,
Epicoccum, Epicoccum nigrum,
Eremothecium, Eremothecium coryli, Eremothecium gossypii,
Erysiph ales,
Exobasidiaceae, Exobasidium burtii, Exobasidium reticulatum, Exobasidium
vaccinii var. japonicum,
Exobasidium vaccinii-uliginosi, Exobasidium vexans,xxophiala alcalophila,
Exophiala, Exophiala angulospora, Exophiala attenuata, Exophiala calicioides,
Exophiala castellanii,
Exophiala dermatitidis, Exophiala dopicola, Exophiala exophialae, Exophiala
heteromorpha, Exophiala
hongkongensis, Exophiala jeanselmei, Exophiala lecanii-comi, Exophiala
mansonii, Exophiala
mesophila, Exophiala moniliae, Exophiala negronii, Exophiala phaeomuriformis,
Exophiala pisciphila,
Exophiala psychrophila, Exophiala salmonis, Exophiala spinifera,
Fomes, Fomes lamaênsis,
Fomitopsis, Fomitopsis rosea,
Fusicladium Fusicladium pisicola,
Fusicoccum, Fusicoccum aesculi, Fusicoccum amygdali, Fusicoccum quercus,
Galactomyces, Galactomyces candidum,
Ganoderma, Ganoderma brownii, Ganoderma lobatum, Ganoderma megaloma, Ganoderma
meredithiae, Ganoderma orbiforme, Ganoderma philippii, Ganoderma sessile,
Ganoderma tomatum,
Ganoderma zonatum,
Geastrumia, Geastrumia polystigmatis,
Georgefischeriaceae,
Georgefischeriales,
Geosmithia, Geosmithia pallida,
Geotrichum, Geotrichum candidum, Geotrichum klebahnii,
CA 03066485 2019-12-05
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Gibberella, Gibberella acuminata, Gibberella avenacea, Gibberella baccata,
Gibberella cyanogena,
Gibberella fujikuroi, Gibberella intricans, Gibberella pulicaris, Gibberella
stilboides, Gibberella tricincta,
Gibberella xylarioides, Gibberella zeae,
Gibellina, Gibellina cerealis,
Gilbertella, Gilbertella persicaria,
Gjaerumiaceae,
Gliocladiopsis, Gliocladiopsis tenuis,
Gliocladium, Gliocladium vermoeseni,
Gloeocercospora, Gloeocercospora sorghi,
Gloeocystidiellum, Gloeocystidiellum porosum,
Gloeophyllum, Gloeophyllum mexicanum, Gloeophyllum trabeum,
Gloeoporus, Gloeoporus dichrous,
Gloeosporium, Gloeosporium cattleyae, Gloeosporium theae-sinensis,
Glomerella, Glomerella cingulata, Glomerella graminicola, Glomerella
tucumanensis,
Gnomonia, Gnomonia caryae, Gnomonia comari, Gnomonia dispora, Gnomonia iliau,
Gnomonia rubi,
Golovinomyces, Golovinomyces cichoracearum,
Graphiola phoenicis,
Graphiolaceae,
Graphium, Graphium rigidum, Graphium rubrum,
Graphyllium, Graphyllium pentamerum,
Grovesinia, Grovesinia pyramidalis,
Gymnoconia, Gymnoconia nitens,
Gymnopus, Gymnopus dryophilus,
Gymnosporangium, Gymnosporangium kemianum, Gymnosporangium libocedri,
Gymnosporangium
nelsonii, Gymnosporangium yamadae,
Haematonectria, Haematonectria haematococca,
Hansenula, Hansenula subpelliculosa,
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Hapalosphaeria, Hapalosphaeria deformans,
Haplobasidion, Haplobasidion musae,
Helicobasidium, Helicobasidium compactum, Helicobasidium longisporum,
Helicobasidium purpureum,
Helicoma, Helicoma muelleri,
Helminthosporium, Helminthosporium cookei, Helminthosporium solani,
Hendersonia, Hendersonia creberrima, Hendersonia theicola,
Hericium, Hericium coralloides,
Heterobasidion, Heterobasidion irregulare, Heterobasidion occidentale,
Hexagonia, Hexagonia hydnoides,
Hymenula, Hymenula affinis,
Hyphodermella, Hyphodermella corrugata,
Hyphodontia, Hyphodontia aspera, Hyphodontia sambuci,
Hypoxylon, Hypoxylon tinctor,
Inonotus, lnonotus arizonicus, lnonotus cuticularis, lnonotus dryophilus,
lnonotus hispidus, lnonotus
ludovicianus,
Irpex, lrpex destruens, lrpex lacteus,
Kabatiella, Kabatiella caulivora,
Karnal bunt,
Koa wilt,
Kretzschmaria, Kretzschmaria zonata,
Kuehneola, Kuehneola uredinis,
Kutilakesa, Kutilakesa pironii,
Laetiporus, Laetiporus ailaoshanensis, Laetiporus baudonii, Laetiporus cari
bensis, Laetiporus
comfericola, Laetiporus cremeiporus, Laetiporus gilbertsonii, Laetiporus
huroniensis, Laetiporus
montanus, Laetiporus portentosus, Laetiporus zonatus,
Laxitextum, Laxitextum bicolor,
Leandria, Leandria momordicae,
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WO 2018/224675
PCT/EP2018/065224
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Lentinus, Lentinus tigrinus,
Lenzites, Lenzites betulina, Lenzites elegans,
Leohumicola, Leohumicola atra, Leohumicola incrustata, Leohumicola levissima,
Leptodontidium, Leptodontidium elatius,
Leptographium, Leptographium microsporum,
Leptosphaerulina, Leptosphaerulina crassiasca, Leptosphaerulina trifolii,
Leptothyrium, Leptothyrium nervisedum,
Leptotrochila, Leptotrochila medicaginis,
Leucocytospora, Leucocytospora leucostoma,
Leucostoma, Leucostoma auerswaldii, Leucostoma canker, Leucostoma kunzei,
Leucostoma persoonii,
Leveillula, Leveillula compositarum, Leveillula leguminosarum, Leveillula
taurica,
Limacinula, Limacinula tenuis,
Linochora, Linochora graminis,
Loose smut,
Lopharia, Lopharia crossa,
Lophodermium, Lophodermium aucupariae, Lophodermium schweinitzii,
Macrophoma, Macrophoma mangiferae, Macrophoma theicola,
Macrosporium, Macrosporium cocos,
Magnaporthe, Magnaporthe grisea, Magnaporthe salvinii,
Magnaporthiopsis,
Mamianiella, Mamianiella coryli,
Marasmiellus, Marasmiellus cocophilus, Marasmiellus stenophyllus,
Marasmius, Marasmius crinis-equi, Marasmius sacchari, Marasmius semiustus,
Marasmius
stenophyllus, Marasmius tenuissimus,
Massarina, Massarina walkeri,
Mauginiella, Mauginiella scaettae,
Melampsora, Melampsora lini, Melampsora occidentalis,
CA 03066485 2019-12-05
WO 2018/224675
PCT/EP2018/065224
Melanconis, Melanconis carthusiana,
Melanconium, Melanconium juglandinum,
Meliola, Meliola mangiferae, Meliola zangii,
Meruliopsis, Meruliopsis ambigua,
5 Microascus, Microascus brevicaulis,
Microbotryum, Microbotryum silenes-dioicae, Microbotryum violaceum,
Microsphaera, Microsphaera coryli, Microsphaera diffusa, Microsphaera ellisii,
Microsphaera
euphorbiae, Microsphaera hommae, Microsphaera penicillata, Microsphaera
vaccinii, Microsphaera
verruculosa,
10 Microstroma, Microstroma juglandis,
Moesziomyces, Moesziomyces bullatus,
Mon iliophthora, Moniliophthora roreri,
Monilochaetes, Monilochaetes infuscans,
Monochaetia, Monochaetia coryli, Monochaetia mati,
15 Monographella, Monographella albescens, Monographella cucumerina,
Monographella nivalis,
Monosporascus, Monosporascus cannonballus, Monosporascus eutypoides,
Monostichella, Monostichella coryli,
Mucor, Mucor circinelloides, Mucor hiemalis, Mucor mucedo, Mucor paronychius,
Mucor piriformis,
Mucor racemosus,
20 Mycena, Mycena citricolor,
Mycocentrospora, Mycocentrospora acerina,
Mycoleptodiscus, Mycoleptodiscus terrestris,
Didymella, Didymella rabiei,
Mycosphaerella, Mycosphaerella recutita, Mycosphaerella rosicola,
Mycosphaerella rubi,
25 Mycosphaerella stigmina-platani, Mycosphaerella striatiformans,
Mycovellosiella, Mycovellosiella concors,
Passalora, Passalora fulva,
Mycovellosiella, Mycovellosiella koepkei, Mycovellosiella vaginae,
CA 03066485 2019-12-05
WO 2018/224675
PCT/EP2018/065224
31
Myriogenospora, Myriogenospora aciculispora,
Myrothecium, Myrothecium roridum, Myrothecium verrucaria,
Naevala, Naevala perexigua,
Naohidemyces, Naohidemyces vaccinii,
Nectria, Nectria cinnabarina, Nectria ditissima, Nectria foliicola, Nectria
mammoidea, Nectria
mauritiicola, Nectria peziza, Nectria pseudotrichia, Nectria radicicola,
Nectria ramulariae,
Nectriella, Nectriella pironii,
Nemania, Nemania diffusa, Nemania serpens,
Neocosmospora, Neocosmospora vasinfecta,
Neodeightonia, Neodeightonia phoenicum,
Neoerysiphe, Neoerysiphe galeopsidis,
Neofabraea, Neofabraea perenn ans,
Neofusicoccum, Neofusicoccum mangiferae,
Oidiopsis, Oidiopsis gossypii,
Oidium, Oidium arachidis, Oidium caricae-papayae, Oidium indicum, Oidium
mangiferae, Oidium
manihotis,
Olpidium, Olpidium brassicae,
Omphalia, Omphalia tralucida,
Ophiobolus, Ophiobolus anguillides, Ophiobolus cannabinus,
Ophioirenina,
Ovulinia, Ovulinia azaleae,
Oxyporus, Oxyporus corticola,
Ozonium, Ozonium texanum,
Peltaster, Peltaster fructicola,
Penicillium, Penicillium expansum, Penicillium funiculosum,
Peniophora,
Periconia, Periconia circinata,
CA 03066485 2019-12-05
WO 2018/224675
PCT/EP2018/065224
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Periconiella, Periconiella cocoes,
Peridermium, Peridermium californicum,
Pestalosphaeria, Pestalosphaeria concentrica,
Pestalotia, Pestalotia longiseta, Pestalotia rhododendri,
Pestalotiopsis, Pestalotiopsis adusta, Pestalotiopsis arachidis,
Pestalotiopsis disseminata,
Pestalotiopsis guepini, Pestalotiopsis leprogena, Pestalotiopsis longiseta,
Pestalotiopsis mangiferae,
Pestalotiopsis paimarum, Pestalotiopsis sydowiana, Pestalotiopsis theae,
Peyronellaea, Peyronellaea curtisii,
Phacidiopycnis, Phacidiopycnis padwickii,
Phaeochoropsis, Phaeochoropsis mucosa,
Phaeocytostroma, Phaeocytostroma iliau, Phaeocytostroma sacchari,
Phaeoisariopsis, Phaeoisariopsis bataticola,
Phaeoramularia, Phaeoramularia heterospora, Phaeoramularia indica,
Phaeoramularia manihotis,
Phaeoseptoria, Phaeoseptoria musae,
Phaeosphaerella, Phaeosphaerella mangiferae, Phaeosphaerella theae,
Phaeosphaeria, Phaeosphaeria avenaria, Phaeosphaeria herpotrichoides,
Phaeosphaeria
microscopica, Phaeosphaeria nodorum,
Phaeosphaeriopsis, Phaeosphaeriopsis obtusispora,
Phaeotrichoconis, Phaeotrichoconis crotalariae,
Phialophora, Phialophora asteris, Phialophora cinerescens, Phialophora
gregata, Phialophora
tracheiphila,
Phoma, Ph orna clematidina, Phoma costaricensis, Phoma cucurbitacearum, Phoma
destructiva, Phoma
draconis, Phoma exigua, Phoma exigua, Ph orna exigua var. foveata, Phoma
exigua, Phoma glomerata,
Ph orna glycinicola, Ph orna herbarum, Ph orna insidiosa, Ph orna medicaginis,
Ph orna microspora, Ph orna
narcissi, Phoma nebulosa, Phoma oncidii-sphacelati, Ph orna pin odella, Phoma
scierotioides, Phoma
strasseri,
Phomopsis, Phomopsis asparagi, Phomopsis asparagicola, Phomopsis cannabina,
Phomopsis coffeae,
Phomopsis ganjae, Phomopsis javanica, Phomopsis longicolia, Phomopsis
mangiferae, Phomopsis
prunorum, Phomopsis scierotioides, Phomopsis theae,
CA 03066485 2019-12-05
WO 2018/224675
PCT/EP2018/065224
33
Phragmidium, Phragmidium mucronatum, Phragmidium rosae-pimpinellifoliae,
Phragmidium rubi-
idaei, Phragmidium violaceum,
Phyllachora, Phyllachora banksiae, Phyllachora cannabis, Phyllachora graminis,
Phyllachora
gratissima, Phyllachora musicola, Phyllachora pomigena, Phyllachora sacchari,
Phyllactinia,
Phyllosticta, Phyllosticta alliariaefoliae Phyllosticta arachidis-hypogaeae,
Phyllosticta bat atas,
Phyllosticta capitalensis, Phyllosticta carpogena, Phyllosticta coffeicola,
Phyllosticta concentrica,
Phyllosticta coryli, Phyllosticta cucurbitacearum, Phyllosticta cyclaminella,
Phyllosticta erratica,
Phyllosticta hawaiiensis, Phyllosticta lentisci, Phyllosticta manihotis,
Phyllosticta micropuncta,
Phyllosticta mortonii, Phyllosticta nicotianae, Phyllosticta palmetto,
Phyllosticta penicillariae,
Phyllosticta perseae, Phyllosticta pseudocapsici, Phyllosticta sojaecola,
Phyllosticta theae, Phyllosticta
theicola,
Phymatotrichopsis, Phymatotrichopsis omnivora,
Physalospora, Physalospora disrupta, Physalospora perseae,
Physoderma, Physoderma alfalfae, Physoderma leproides, Physoderma trifolii,
Physopella, Physopella ampelopsidis,
Pileolaria, Pileolaria terebinthi,
Piricaudiopsis, Piricaudiopsis punicae, Piricaudiopsis rhaphidophorae,
Piricaudiopsis rosae,
Plenodomus, Plenodomus destruens, Plenodomus meliloti,
Pleosphaerulina, Pleosphaerulina sojicola,
Pleospora, Pleospora alfalfae, Pleospora betae, Pleospora herbarum, Pleospora
lycopersici, Pleospora
tarda, Pleospora theae,
Pleuroceras,
Podosphaera, Podosphaera fuliginea, Podosphaera fusca, Podosphaera
leucotricha, Podosphaera
macularis, Podosphaera pann osa,
Polyscytalum, Polyscytalum pustulans,
Poria, Poria hypobrunnea,
Postia, Postia tephroleuca,
Powdery mildew,
CA 03066485 2019-12-05
WO 2018/224675
PCT/EP2018/065224
34
Pseudocercospora, Pseudocercospora arecacearum, Pseudocercospora cannabina,
Pseudocercospora
fuligena, Pseudocercosporella herpotrichoides, Pseudocercospora gunnerae,
Pseudocercospora
pan doreae, Pseudocercospora puderi, Pseudocercospora rhapisicola,
Pseudocercospora theae,
Pseudocercospora vitis, Pseudocercosporella capsellae,
Pseudocochliobol us, Pseudocochliobolus eragrostidis,
Pseudoepicoccum, Pseudoepicoccum cocos,
Pseudopeziza, Pseudopeziza jonesii, Pseudopeziza medicaginis, Pseudopeziza
trifolii,
Pseudoseptoria, Pseudoseptoria don acis,
Pucciniaceae,
Pucciniastrum, Pucciniastrum americanum, Pucciniastrum arcticum, Pucciniastrum
epilobii,
Pucciniastrum hydrangeae,
Pycnostysanus, Pycnostysanus azaleae,
Pyrenochaeta, Pyrenochaeta lycopersici, Pyrenochaeta terrest ris,
Pyrenopeziza, Pyrenopeziza brassicae,
Ramichloridium, Ramichloridium musae,
Ramulispora, Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola,
Rhinocladium, Rhinociadium corticola,
Rhizophydium, Rhizophydium graminis,
Rhizopus, Rhizopus arrhizus, Rhizopus circin ans, Rhizopus microsporus,
Rhizopus oryzae,
Rhytisma, Rhytisma punctatum, Rhytisma vitis,
Rigidoporus, Rigidoporus vinctus,
Rosellinia, Rosellinia arcuata, Rosellinia bunodes, Rosellinia necatrix,
Rosellinia pepo,
Saccharicola, Saccharicola taiwanensis,
Schiffnerula, Schiffnerula cannabis,
Schizophyllum, Schizophylium commune,
Schizopora, Schizopora flavipora,
Schizothyrium, Schizothyrium pomi,
Sclerophthora, Scierophthora macrospora,
CA 03066485 2019-12-05
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PCT/EP2018/065224
Sclerotium, Sclerotium cinnamomi, Sclerotium delphinii,
Scytinostroma, Scytinostroma galactinum,
Seimatosporium, Seimatosporium mariae, Seimatosporium rhododendri,
Selenophoma, Selenophoma linicola,
5 Septobasidium, Septobasidium bogoriense, Septobasidium euryae-groffii,
Septobasidium
gaoligongense, Septobasidium pilosum, Septobasidium polygoni, Septobasidium
pseudopedicellatum,
Septobasidium theae,
Septocyta, Septocyta ruborum,
Serpula, Serpula lacrymans,
10 Setosphaeria, Setosphaeria rostrata, Setosphaeria turcica,
Spencermartinsia, Spencermartinsia pretoriensis,
Sphaceloma, Sphaceloma arachidis, Sphaceloma menthae, Sphaceloma perseae,
Sphaceloma
poinsettiae, Sphaceloma sacchari, Sphaceloma theae,
Sphacelotheca, Sphacelotheca reiliana, Sphaerotheca castagnei,
15 Sphaerulina, Sphaerulina oryzina, Sphaerulina rehmiana, Sphaerulina
rubi,
Sphenospora, Sphenospora kevorkianii,
Spilocaea, Spilocaea oleaginea,
Sporisorium, Sporisorium cruentum, Sporisorium ehrenbergii, Sporisorium
scitamineum, Sporisorium
sorghi,
20 Sporonema, Sporonema phacidioides,
Stagonospora, Stagonospora avenae, Stagonospora meliloti, Stagonospora
recedens, Stagonospora
sacchari, Stagonospora tainanensis,
Stagonosporopsis,
Stegocintractia, Stegocintractia junci,
25 Stemphylium, Stemphylium alfalfae, Stemphylium bolickii, Stemphylium
cannabinum, Stemphylium
globuliferum, Stemphylium lycopersici, Stemphylium sarcimforme, Stemphylium
solani, Stemphylium
vesicarium,
Stenella, Stenella anthuriicola,
CA 03066485 2019-12-05
WO 2018/224675
PCT/EP2018/065224
36
Stigmatomycosis,
Stigmina, Stigmina carpophila, Stigmina palmivora, Stigmina platani-racemosae,
Stromatinia, Stromatinia cepivora,
Sydowiella, Sydowiella depressula,
Sydowiellaceae,
Synchytrium, Synchytrium endobioticum,
Tapesia, Tapesia acuformis, Tapesia yallundae,
Taphrina, Taphrina coryli, Taphrina potentillae,
Thanatephorus, Thanatephorus cucumeris,
Thecaphora, Thecaphora solani,
Thielaviopsis, Thielaviopsis basicola, Thielaviopsis ceramica,
Thyrostroma, Thyrostroma compactum,
Tiarosporella, Tiarosporella urbis-rosarum,
Tilletia, Tilletia barclayana, Tilletia caries, Tilletia controversa, Tilletia
laevis, Tilletia tritici, Tilletia
walkeri,
Tilletiariaceae,
Togniniaceae,
Tranzschelia, Tranzschelia pruni-spinosae,
Trichoderma, Trichoderma koningii, Trichoderma paucisporum, Trichoderma
songyi, Trichoderma
theobromicola, Trichoderma viride,
Tubercularia, Tubercularia lateritia,
Tunstallia, Tunstallia aculeata,
Typhula, Typhula blight, Typhula idahoensis, Typhula incamata, Typhula
ishikariensis, Typhula
variabilis,
Ulocladium, Ulocladium consortiale,
Uncinula,
Uredo, Uredo behnickiana, Uredo kriegeriana, Uredo musae, Uredo nigropuncta,
Uredo rangelii,
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PCT/EP2018/065224
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Urocystis, Urocystis agropyri, Urocystis brassicae, Urocystis occulta,
Uromyces, Uromyces apiosporus, Uromyces appendiculatus, Uromyces beticola,
Uromyces ciceris-
arietini, Uromyces dianthi, Uromyces euphorbiae, Uromyces graminis, Uromyces
inconspicuus,
Uromyces lineolatus, Uromyces musae, Uromyces oblon gus, Uromyces pisi-sativi,
Uromyces
proëminens, Uromyces medicaginis, Uromyces trifolii-repentis, Uromyces viciae-
fabae,
Urophlyctis, Urophlyctis leproides, Urophlyctis trifolii,
Ustilaginales,
Ustilago, Ustilago avenae, Ustilago esculenta, Ustilago hordei, Ustilago
maydis, Ustilago nigra,
Ustilago nuda, Ustilago scitaminea, Ustilago tritici,
Vankya, Vankya ornithogali,
Velvet blight,
Veronaea, Veronaea musae,
Verticillium, Verticillium albo-atrum, Verticillium alfalfae, Verticillium
dahliae, Verticillium isaacii,
Verticillium klebahnii, Verticillium longisporum, Verticillium nonalfalfae,
Verticillium theobromae,
Verticillium wilt, Verticillium zaregamsianum,
Waitea, Waitea circinata,
Westea,
Wheat leaf rust,
Wheat mildew,
Wuestneiopsis, Wuestneiopsis georgiana,
Xeromphalina, Xeromphalina fraxinophila,
Zopfia, Zopfia rhizophila,
Zygosaccharomyces, Zygosaccharomyces bailli, Zygosaccharomyces florentinus,
Zythiostroma.
De préférence, les couples champignons, oomycètes ou bactéries vs. plantes de
culture visés par
l'invention sont les suivants :
Blé (Triticum sativum)
Claviceps purpurea, Erysiphe graminis, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum,
Fusarium
graminearum, Fusarium langsethiae, Fusarium poae, Fusarium pseudograminearum,
CA 03066485 2019-12-05
WO 2018/224675
PCT/EP2018/065224
38
Gaeumannomyces graminis, Leptosphaeria nodorum, Microdochium spp.,
Mycosphaerella
graminicola, Oculimacula acuformis, Oculimacula yallundae, Puccinia recôndita,
Puccinia striiformis,
Pyrenophora tritici-repentis, Rhizoctonia cerealis, Microdochium et
Zymoseptoria tritici
Mais (Zea mays)
Fusarium graminearum, Fusarium proliferatum, Fusarium subglutinans, Fusarium
verticillioides
Orge (Hordeum vulgare)
Blumeria graminis, Fusarium spp, Pyrenophora teres, Ramularia collo-cygni,
Rhynchosporium secalis
Riz (Oryza sativa)
Cochliobolus miyabeanus, Fusarium Kikuroi; Magnaporthe oryzae, Microdochium
oryzae, Pyricularia
oryzae, Rhizoctonia oryzae, Rhizoctonia solani, Sarocladium oryzae,
Ustilaginoides virens
Pomme de terre (Solanum tuberosum)
Alternia altemata, Alternaria solani, Phytophtora infestons, Rhizoctonia
solani
Vigne (Vinis vitifera)
Botrytis cinerea, Erysiphe necator, Plasmopara viticola, Guignardia bidwelli,
Erisyphe necator,
Diplodia seriata
Soja (Glycine max)
Cercopora kikuchii, Collet otrichum dematium, Corynespora cassiicola ,
Fusarium graminearum,
Pythium spp., Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum , Septoria glycines
Pommier (Malus domestica)
Monilia fructigena, Monilia laxa , Pezzicula alba, Pezzicula malicorticis,
Venturia inaequalis
Tomate (Lycopersicon esculentum)
Phytophtora infestons
Haricot (Phaseolus vulgaris)
Uromyces appendiculatus
Radis (Raphanus sativus)
Altemaria brassicae
Tous les Fruits et légumes
Botrytis cinerea
CA 03066485 2019-12-05
WO 2018/224675
PCT/EP2018/065224
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Fraisier (Fragaria sp)
Colletotrichum acutatum
Carotte (Daucus carota)
Aternaria alternata, Alternaria douci, Alternaria radicina
Pêche (Prunus persica) et abricot (Prunus armeniaca)
Monilia fructicola, Monilia fructigena, Monilia laxa
De manière particulièrement préférée, les couples champignons ou bactéries vs.
plantes de culture
visés par l'invention sont les suivants :
Blé : Fusarium graminearum, Microdochium et Zymoseptoria tritici
Vigne: Botrytis cinérea, Erysiphe necator, Plasmopara vif-kola, Guignardia
bidwelli, Erisyphe necator,
Diplodia seriata
Pomme de terre : Altemia alternata, Alternaria solani, Phytophtora infestons,
Rhizoctonia solani
Tomate : Phytophtora infestons
Procédé de lutte
L'invention concerne également un procédé de lutte contre les champignons, les
oomycètes
et/ou les bactéries pathogènes des plantes et semences de culture comprenant
l'application sur les
plantes de culture de la molécule de formule (I) :
OH OH OH OH
R1)1+- / .
OH 0-1-1 0 OH
OH
HO,µ 7
HO ' OH '''OH
R22?- ===.,, ===,... =-=...... - 0
Ill H
HO OH
dans laquelle :
= R1 est choisi dans le groupe constitué de:
0 R3 OH 0 OH OH
HO
OH OH ,
CA 03066485 2019-12-05
WO 2018/224675 PCT/EP2018/065224
OH OH OH
Y
0 .
i_i0
HO HO
HO
OH ,
OH
R30 n m
OH OH OH OH OH OH ,
OH
HO
OR3 OH
,
OH
R30
OH OH OH , et
R4
/ - - -
5 OR3 OH OH OH OH .
,
où :
- R3 représente H ou SO3Na,
- R4 représente H ou OH,
- représente une liaison simple ou une liaison double,
10 - n est est égal à 0 ou 1 et
- m est égal à 0 ou 1; et
= R2 est choisi dans le groupe constitué de:
HO-)Ç-
et OH
15 De préférence, RI. est:
OR3 OH 0 OH OH
HO
OH OH
OU R3 représente H ou SO3Na.
-........-zõ..õ...., \:
De préférence, R2 est :'T
CA 03066485 2019-12-05
WO 2018/224675
PCT/EP2018/065224
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Cette lutte peut être curative ou préventive, de préférence curative.
L'application sur les plantes de culture peut être réalisée par tout moyen
connu de l'homme
du métier permettant d'atteindre les parties de plantes touchées par le
champignon et/ou la bactérie.
La molécule de formule (I) est appliquée à une dose comprise entre entre 0,1
et 5 mg/mL, de
préférence comprise entre 0,5 et 3 mg/mL, de manière particulièrement préférée
comprise entre
0,75 et 1 mg/mL.
L'enrobage des semences peut être réalisé par toute technique connue de
l'homme du métier
qui permet de maintenir l'actif en contact avec la semence.
Par exemple, l'enrobage peut être réalisé par poudrage ou par pulvérisation.
Par exemple, l'enrobage peut comprendre des formulants et des adjuvants.
Les formulants ont pour objectif de rendre possible l'application et la tenue
de la ou des
substances actives sur le grain, en proportion égale et constante pendant tout
le procédé d'application
du produit et ceci à des doses très faibles.
Les formulants comprennent : des solvants organiques ou de l'eau, des
dispersants, des
émulgateurs, des tensioactifs ou des mouillants, des colorants...
Les tensio-actifs et les émulgateurs ont la propriété de réunir et de
maintenir ensemble de
façon stable deux liquides incompatibles.
Différents adjuvants peuvent être appliqués sur la semence. Les pelliculants
correspondent à
l'application d'un film microporeux à la surface de la semence. Ils ne
modifient ni la forme ni la taille
de la semence. Ils améliorent la couverture et l'homogénéité du traitement.
Lors de l'utilisation des
semences par l'agriculteur, ils améliorent le confort de l'utilisateur au
moment du semis en supprimant
les poussières et en facilitant l'écoulement des semences dans le semoir. Ils
améliorent l'action de la
ou des substances actives en condition de culture. Les enrobants modifient la
forme, la taille et le poids
de la semence. Ils améliorent la précision du semis.
Les procédés de lutte contre les champignons et/ou bactéries pathogènes des
plantes et
semences de culture de traitement selon l'invention sont particulièrement
appropriés contre une
Fusariose, de préférence une Fusariose citée dans le Tableau 1.
Nom de la maladie Agent pathogène code OEPP
fusariose basale de l'asperge Fusarium culmorum FUSACU
fusariose basale du haricot Fusarium solani f. sp. phaseoli FUSASH
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WO 2018/224675 PCT/EP2018/065224
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Nom de la maladie Agent pathogène code OEPP
fusariose basale du pois Fusarium solani f.
sp. pisi FUSASI
fusariose de la betterave Fusarium oxysporum
f. sp. betae FUSABE
fusariose de la pomme de
Fusarium coeruleum FUSASC
terre
fusariose de la reine-
Fusarium oxysporum f. sp. conglutinons FUSACO
marguerite
fusariose de la tige du mais Gibberella fujikuroi
GIBBFU
fusariose de la tige du maïs Fusarium culmorum
FUSACU
fusariose de la tige du maïs Gibberella zeae
GIBBZE
fusariose de la vanille Fusarium oxysporum f. sp. vanillae FUSAVN
fusariose de l'ananas Gibberella fujikuroi var. subglutinans GIBBFS
fusariose de l'épi du maïs Fusarium poae
FUSAPO
fusariose de l'épi du maïs Fusarium tricinctum
FUSATI
fusariose de l'oeillet Fusarium oxysporum f. sp. dianthi FUSADI
fusariose des broméliacées Fusarium oxysporum
f. sp. aechmeae FUSAAE
fusariose des bulbes Fusarium oxysporum f. sp. gladioli FUSAGL
fusariose des céréales Fusarium culmorum FUSACU
fusariose des céréales Gibberella rosea FUSARO
fusariose des céréales Gibberella avenacea GIBBAV
fusariose des céréales Gibberella intricans GIBBIN
fusariose des céréales Monographella nivalis MONGNI
fusariose des épis Gibberella zeae GIBBZE
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Nom de la maladie Agent pathogène code OEPP
fusariose des racines de
Fusarium oxysporum f. sp. asparagi FUSAAS
l'asperge
fusariose des racines des
Fusarium oxysporum f. sp. opuntiarum FUSAOP
cactées
fusariose des racines et du
Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici FUSARL
collet de la tomate
fusariose des racines et du
Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum FUSACC
collet du concombre
fusariose du blé Gibberella fujiku roi GIBBFU
fusariose du cacaoyer Albonectria rigidiuscula CALORI
fusariose du caféier Gibberella stilboides GIBBST
fusariose du carthame Fusarium oxysporum f. sp. carthami FUSACA
fusariose du cognassier Gibberella baccata GIBBBA
fusariose du collet des
Fusarium solani f. sp. cucurbitae FUSASU
cucurbitacées
fusariose du cotonnier Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum FUSAVA
fusariose du gerbéra Fusarium oxysporum f. sp. gerberae FUSAGE
fusariose du glaïeul Fusarium oxysporum f. sp. gladioli FUSAGL
fusariose du lin Fusarium oxysporum f. sp. uni FUSALI
fusariose du maïs Gibberella acuminata GIBBAC
fusariose du maïs Gibberella fujikuroi var. subglutinans GIBBFS
fusariose du maïs Gibberella zeae GIBBZE
fusariose du palmier à huile Fusarium
oxysporum f. sp. elaeidis FUSAEL
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44
Nom de la maladie Agent pathogène code OEPP
fusariose du soja Fusarium oxysporum f. sp. glycines FUSAGY
fusariose du soja Fusarium oxysporum f. sp. tracheiphilum FUSATR
fusariose du tubercule de la
Gibberella cyanogena GIBBCN
pomme de terre
fusariose moniliforme Gibberella fujiku roi GIBBFU
fusariose nivale Monographella nivalis MONGNI
fusariose roseum Gibberella rosea FUSARO
fusariose vasculaire Fusarium oxysporum FUSAOX
fusariose vasculaire de la
Fusarium oxysporum f. sp. lentis FUSALE
lentille
fusariose vasculaire de la
Fusarium oxysporum f. sp. niveum FUSANV
pastèque
fusariose vasculaire de la
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici FUSALY
tomate
fusariose vasculaire de la
Fusarium oxysporum f. sp. tulipae FUSATU
tulipe
fusariose vasculaire des
Fusarium oxysporum f. sp. conglutinons FUSACO
crucifères
fusariose vasculaire du caféier Gibberella xylarioides GIBBXY
fusariose vasculaire du chou Fusarium
oxysporum f. sp. conglutinons FUSACO
fusariose vasculaire du
Fusarium oxysporum f. sp. chrysanthemi FUSACH
chrysanthème
fusariose vasculaire du
Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum FUSACC
concombre
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Nom de la maladie Agent pathogène code OEPP
fusariose vasculaire du
Fusarium oxysporum var. aurantiacum FUSAAU
cyclamen
fusariose vasculaire du fraisier Fusarium oxysporum f. sp. fragariae FUSAFR
fusariose vasculaire du haricot Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli FUSAPH
fusariose vasculaire du melon Fusarium oxysporum f. sp. melonis FUSAME
fusariose vasculaire du pois Fusarium oxysporum f. sp. pisi FUSAPI
fusariose vasculaire du pois
Gibberella baccata GIBBBA
chiche
fusariose vasculaire du pois-
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris FUSACI
chiche
fusariose vasculaire du radis Fusarium
oxysporum f. sp. raphani FUSARA
Tableau 1 : récapitulatif des fusarioses
Les procédés de lutte contre les champignons, les oomycètes et/ou les
bactéries pathogènes
des plantes et semences de culture de traitement selon l'invention sont
particulièrement appropriés
5 pour les couples champignons ou bactéries vs. plantes de culture suivants
:
Blé : Fusarium graminearum, Microdochium nivale et Zymoseptoria tritici
Vigne : Botrytis cinerea, Plasmopara viticola, Guignardia bidwelli, Erisyphe
necator, Diplodia
seriata
Pommier : Venturia inaequalis
10 Bananier : Fusarium oxysporum et Mycosphaerella Kiensis
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EXEMPLES
MATERIEL & METHODES
Exemple 1 : Culture des micro-algues
La micro-algue Amphidinium carterae, souche AC208, provient de Algobank (Caen)
et les
micro-algues Prymnesium parvum, souche RCC 1436, et Phaeodactylum tricornutum,
souche
CCMP 632, proviennent de la banque de micro-organismes marins de Roscoff (RCC
: Roscoff Culture
Collection). Ces micro-algues sont cultivées dans de l'eau de mer artificielle
L1
(https://ncma.bigelow.org/algal-recipes) à 19 C avec un cycle jour/nuit de
12H/12H. L'intensité
lumineuse utilisée est de 100 1.1E. La biomasse est récupérée en fin de phase
exponentielle de
croissance par centrifugation (15 min à 3000 RPM). Le culot cellulaire obtenu
est congelé puis soumis
à la lyophilisation en utilisant un lyophilisateur de laboratoire (Alpha 1-2
LDplus, labconco) afin de
conserver de manière stable la matière active sur une longue durée. Après
lyophilisation, la matière
sèche est pesée.
Exemple 2 : Préparation de l'extrait
Afin d'extraire la matière active de la matière sèche de l'exemple 1, 20 mg de
matière sèche
sont resuspendus dans 1 mL d'eau distillée à 100 C. Après incubation pendant
2 minutes à
température ambiante (20-25 C) l'extrait est conservé dans la glace puis
centrifugé 5 min à
10 000 RPM à température ambiante. Le surnageant contenant la matière active
est congelé dans de
l'azote liquide afin de conserver ses propriétés anti-fongiques sur longue
durée.
Exemple 3 : Test de germination de Fusarium graminearum
Les spores de Fusarium graminearum sont cultivées dans le milieu appauvri
Mung bean .
Les spores sont séparées du mycélium par filtration sur du miracloth
(Calbiochem), centrifugées puis
resuspendues à 1,6.106 spores/mL. Environ 16 000 spores sont incubées en
présence de la solution
contrôle ou de l'extrait d'A. carterae à différentes concentrations. Après une
incubation de 10 min à
température ambiante, les spores sont disposées sur une lamelle pour un
dénombrement de la
germination après 6H ou sur une boite de pétri pour une observation de la
croissance du mycélium
après 72H.
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ESSAIS
Exemple 4: Fractionnement de l'extrait D par HPLC et test d'activité anti-
fongique des
différentes fractions obtenues.
Afin de tenter de caractériser quelles sont les molécules présentes dans
l'extrait d'A. carterae
qui sont responsables de l'activité antifongique, la stratégie de
fractionnement par bioguidage a été
retenue : l'extrait d'A. carterae est fractionné sur une colonne HPLC et des
tests d'activité biocide
contre les spores de F. graminearum sont effectués pour chaque fraction afin
de déterminer quelle
fraction contient la ou les molécule(s) responsable(s) de l'activité anti-
fongique.
200 mg de cellules lyophilisées sont solubilisés dans 1mL de méthanol. Après
centrifugation de
10 min à 4400 rpm, le surnageant est récupéré puis la phase liquide alcoolique
totale récupérée est
filtrée sur papier, la solution est ensuite évaporée à l'évaporateur rotatif à
froid pour collecter 48,5 mg
de produit extrait. Un test d'activité est réalisé sur les spores de F.
graminearum afin de confirmer
l'activité de l'extrait d'A. carterae (Figure 1A).
L'extrait étant actif, les expériences de fractionnement en mode semi-
préparatif ont été
réalisées sur une colonne C18 en phase inversée par un chromatographe en phase
liquide haute
performance Thermo Scientific Ultimate 3000 selon le protocole suivant :
L'extrait d'A. carterae a été dissous à 5 g/L dans le méthanol. Les conditions
suivantes ont été
appliquées pour l'extrait :
Débit : 2,5mL/min.
Colonne : C18 en phase inverse : L = 250 mm; D.I. = 10mm ; D.P. = 5um.
Volume injecté : 150 L.
Température d'injection : 24 C.
Longueur d'onde de détection : 280 nm.
Programme de gradient décrit dans le Tableau 7 ci-dessous.
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Tableau 2. Programme du gradient de solvant optimal en mode semi-préparatif.
Solvant A: Eau milliQ + 0,1% acide formique ; Solvant B : Méthanol.
Temps (min) Solvant A (%) Solvant B (%)
0 50 50
25 0 100
40 0 100
43 50 50
48 50 50
Le chromatogramme obtenu dans ces conditions est présenté dans la figure 1B.
Cinq fractions,
F1 à F5, ont été constituées, tel que décrit dans la figure 1B, afin que
chaque pic majoritaire
corresponde à une fraction. Des tests d'activités sur la croissance de F.
graminearum ont été effectués
avec 5 mg/mi de chaque fraction. Les résultats indiquent que seule la fraction
F1 possède encore
l'activité biocide (figure 1C), une CMI de 0,75 mg/mi a pu être déterminée
pour cette fraction
(figure 1D).
La fraction F1 a été soumise à un nouveau fractionnement selon le protocole
suivant :
L'extrait F1 a été dissous à 5 g/L dans le méthanol. Les conditions
suivantes ont été appliquées
pour l'extrait D:
- Débit : 2,5mL/min.
- Colonne : C18 en phase inverse : L = 250mm ; D.I. = 10mm ; D.P. = 5 m.
- Volume injecté : 150 L.
- Température d'injection : 24 C.
- Longueur d'onde de détection : 280 nm.
- Programme de gradient décrit dans le Tableau 8 ci-dessous
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Tableau 3. Programme du gradient de solvant optimal en mode semi-préparatif.
Solvant A : Eau
milliQ + 0,1% acide formique ; Solvant B : Méthanol.
Temps (min) Solvant A (%) Solvant B (%)
0 30 70
15 85
15 85
0 100
0 100
32 30 70
30 70
Le chromatogramme obtenu dans ces conditions est présenté dans la figure 2A.
Cinq fractions,
F1-1 à F1-5, ont été constituées, tel que décrit dans la figure 2A, le pic
majoritaire correspondant à la
5 fraction F1-2. Des tests d'activités sur la croissance de F. graminearum
ont été effectués avec 5 mg/mi
de chaque fraction. Les résultats indiquent que seule les fractions F1-2 et F1-
3 possèdent l'activité
biocide (figure 2B), une CMI de 0,75 mg/mi a pu être déterminée pour la
fraction F1-2 (figure 2C).
Exemple 5 : Analyse de la fraction F1-2 par spectrométrie de masse.
Afin de mieux caractériser la molécule présente dans la fraction F1-2, une
analyse par
10 spectrométrie de masse a été effectuée selon
les conditions suivantes :
Les expériences ont été réalisées en mode infusion sur un spectromètre QStar
Elite (Applied
Biosystems).
Mode d'ionisation : Electrospray ([SI) en mode positif
Tension de l'aiguille electrospray : 4500 V à température ambiante
15 Conditions d'injection : 20 uL d'échantillon dissous dans le méthanol,
sous un débit de
méthanol de 400 uL/min
Gamme balayée : 100 à 2000 Daltons
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La Figure 3A montre le spectre de masse acquis en ionisation electrospray en
mode positif sur
la molécule d'intérêt collectée F1-2.
La masse exacte déterminée est de 1381,8276 Daltons. Il correspond à un adduit
sodium formé
lors de l'ionisation ([M+Na]). Après avoir retranché la masse du sodium de 23
Daltons, la masse du pic
5 moléculaire du composé est de 1358,8 Da.
Une analyse approfondie de la masse exacte permet de déterminer une ou
plusieurs formules
brutes liées à cette masse, avec une erreur de 5ppm. Après avoir écarté les
propositions irréalistes, la
formule brute retenue est C7111122024.
Une analyse approfondie par Spectrométrie de masse en tandem a été réalisée
sur ce pic à
10 1381,8276 Da. Le spectre de masse est présenté sur la Figure 3B.
Plusieurs pics (pics entourés ¨
Figure 3B) sont similaires aux pics issus de la fragmentation de l'amphidinol
18 (7).
Exemple 6 : Analyse de la fraction F1-2 par Résonance Magnétique Nucléaire
(RMN)
Afin de déterminer la structure de la molécule ayant un poids moléculaire de
1358,8 Da, une
analyse par RMN a été effectuée selon le mode opératoire suivant :
15 Les échantillons correspondant au pic F1-2 ont été collectés puis ont
été entièrement dissous
dans environ 3501.11_ de méthanol deutéré (Me0D4).
Les expériences ont été réalisées sur un spectromètre Bruker Avance 14,1T
équipé d'une
sonde multinoyaux. Des spectres proton et carbone à une et deux dimensions ont
été acquis en
utilisant des séquences d'impulsion disponibles depuis la bibliothèque de
séquences Bruker.
20 Les conditions d'acquisition sont les suivantes :
- 1H : Nombre de scans : 512; Impulsion : 81i5; Acquisition : 5,0s ;
Relaxation : 1,0s
- 13C DEPT135 : Nombre de scans : 44666; Impulsion : 12ps ; Acquisition :
1,0s ; Relaxation : 3,0s
- HSQC : Nombre de scans : 64; 512 incréments
- HMBC : Nombre de scans : 48; 512 incréments
25 - COSY : Nombre de scans : 56; 256 incréments
- TOCSY : Nombre de scans : 48; 256 incréments
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La séquence '3C DEPT135 est une expérience qui permet de trier les carbones en
fonction du
nombre de protons directement liés : CH3 et CH>0 et CH2<0.
La séquence COSY (COrrelation SpectroscopY) est une expérience 2D
homonucléaire qui
permet d'identifier des protons en interaction scalaire espacés de 2 ou 3
liaisons.
La séquence TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY) est une expérience 2D
homonucléaire qui
permet d'identifier des protons en interaction scalaire espacés de 3 liaisons
et plus.
La séquence HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) est une expérience
2D
hétéronucléaire qui met en évidence les interactions directes entre un carbone
et le ou les proton(s)
directement lié(s).
La séquence HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) est une expérience
2D
hétéronucléaire qui met en évidence les corrélations entre protons et carbones
séparés par 2 ou
3 liaisons de distance.
Les spectres 1D ont été traités par une transformée de Fourier. Les spectres
ont été traités par
une transformée de Fourier dans les deux dimensions.
D'après les résultats obtenus, le spectre 'H acquis, représenté dans la Figure
4A, met en
évidence une série de pics répartie sur une large fenêtre spectrale comprise
entre 1 et 6ppm. Cela
confirme que le composé recherché contient des protons aliphatiques et
oléfiniques. Ces
déplacements suggèrent également la présence d'hétéroatomes tels que
l'oxygène.
Le spectre '3C DEPT135 (Figure 4B) met en évidence une série de pics sur la
fenêtre spectrale
comprise entre 13 et 211ppm. Les séquences 2D HMBC et HSQC permettent de
mettre en évidence
l'enchainement des carbones entre eux. Les séquences 2D COSY et TOCSY
permettent de confirmer
l'enchainement de la structure à partir des déplacements des protons et de
leurs corrélations.
Le nombre d'insaturations et de cycles observé est cohérent avec celui calculé
pour la molécule
sur la base de sa formule brute (=11) :
N, = (2% + 2 -H + nN ¨
Avec : nc : le nombre d'atomes de carbone, nFi : le nombre d'atomes
d'hydrogène, nN : le
nombre d'atomes d'azote, nx : le nombre d'atomes d'halogène.
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Les 11 insaturations sont réparties selon :
- 1 fonction cétone
- 8 doubles liaisons dont 2 en bouts de chaine
- 2 cycles
Les séquences COSY et TOCSY ont permis de reconstruire tout le squelette
carboné de la
structure. Ces corrélations sont indiquées par des liaisons en gras sur la
Figure 5. Ces résultats
démontrent que la structure secondaire de la molécule correspond à celle de
l'Amphidinol 18.
L'ensemble de l'interprétation a pu être confirmée en confrontant les
résultats obtenus lors de cette
étude à ceux relevés dans la littérature (7).
En conclusion, l'ensemble des résultats obtenus par Résonance Magnétique
Nucléaire et
Spectrométrie de Masse confirme que la molécule présente dans la fraction F1-
2, obtenue après
fractionnement de l'extrait D, et qui présente l'activité antifongique contre
F. graminearum est la
molécule d'Amphidinol 18 dont les données chimiques spécifiques sont les
suivantes :
- Formule brute : C71H122024
- Masse molaire : 1358,83 g.mor
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