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WO 2019/115969 1 PCT/FR2018/053284
CHITINE ET PROCÉDÉ D'OBTENTION DE CHITINE ET/OU CHITOSAN PAR VOIE
CHIMIQUE
La présente invention concerne une chitine, un chitosan ainsi qu'un procédé de
préparation de chitine et/ou chitosan à partir d'insectes.
Selon l'invention, par chitine , on entend un polymère composé
majoritairement d'unités glucosamine et N-acétyl-glucosamine, lesdites unités
pouvant
être optionnellement substituées par des acides aminés et/ou des peptides.
Par composé majoritairement , on entend que ledit polymère comporte entre
55% et 98% en poids, de préférence entre 75 et 90% en poids d'unités
glucosamine et
N-acétyl-glucosamine.
La chitine serait le deuxième polymère le plus synthétisé dans le monde vivant
après la cellulose. En effet, la chitine est synthétisée par de nombreuses
espèces
du monde vivant : elle constitue en partie l'exosquelette des crustacés et des
insectes
et la paroi latérale qui entoure et protège les champignons. Plus
particulièrement,
chez les insectes, la chitine constitue ainsi 3 à 60% de leur exosquelette.
Par chitosan , on entend selon la présente invention les produits de
désacétylation de la chitine. La limite usuelle entre le chitosan et la
chitine est déterminée
par le degré d'acétylation : un composé ayant un degré d'acétylation inférieur
à 50% est
nommé chitosan, au-delà, un composé ayant un degré d'acétylation supérieur à
50% est
nommé chitine.
Les applications de la chitine et/ou du chitosan sont nombreuses: cosmétique
(composition cosmétique), médicale et pharmaceutique (composition
pharmaceutique,
traitement des brûlures, biomatériaux, pansements cornéens, fils
chirurgicaux),
diététique et alimentaire (alimentation humaine notamment en oenologie et
alimentation
animale, plus spécifiquement en aquaculture et aviculture), technique (agent
filtrant,
texturant, floculant ou adsorbant notamment pour la filtration et dépollution
de l'eau), etc.
En effet, la chitine et/ou le chitosan sont des matériaux biocompatibles,
biodégradables
et non toxiques.
Usuellement, la chitine et le chitosan sont obtenus à partir des différentes
espèces synthétisant la chitine, telles que celles citées ci-avant, et
notamment à partir
de crustacés ou d'insectes.
Il est particulièrement avantageux d'obtenir de la chitine et du chitosan à
partir
d'insectes, ces derniers représentant une matière première abondante et
renouvelable.
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L'obtention d'une chitine et/ou d'un chitosan de masse moléculaire élevée est
recherchée dans de nombreuses applications, telles que par exemple en
cosmétique et
en pharmacie.
A titre d'exemple, l'utilisation d'un chitosan de masse moléculaire élevée
permet
de maximiser l'effet antimicrobien, limiter la perte d'eau trans-épidermique
ou encore
l'irritation de la peau.
Pour obtenir un chitosan de masse moléculaire élevée, il est indispensable
d'obtenir, dans un premier temps, une chitine de masse moléculaire élevée.
En effet, le chitosan est obtenu par désacétylation de la chitine. Or, cette
étape
est susceptible de réduire la masse moléculaire de la molécule. Ainsi, plus la
chitine aura
une masse moléculaire élevée, plus le chitosan obtenu à partir de cette
chitine aura une
masse moléculaire élevée.
En outre, les techniques actuelles ne permettent pas d'augmenter la masse
moléculaire de la chitine et/ou du chitosan, lorsque la chitine et/ou le
chitosan obtenu(s)
à l'issue d'un procédé a (ont) une masse moléculaire insuffisante pour
l'application visée.
L'obtention d'une chitine et/ou d'un chitosan présentant, outre une masse
moléculaire élevée, une pureté élevée, est également recherchée, notamment
dans le
cadre des applications mentionnées ci-avant.
L'invention concerne donc une chitine dont la masse moléculaire est supérieure
.. ou égale à 855 kg.m01-1.
Avantageusement, la masse moléculaire de la chitine selon l'invention est
supérieure ou égale à 900 kg.m01-1, de préférence supérieure ou égale à 950
kg.m01-1,
plus préférentiellement supérieure ou égale à 1000 kg.m01-1.
La masse moléculaire est déterminée grâce à la mesure de la viscosité par
chute
de bille.
De préférence, la masse moléculaire est déterminée selon une méthode de
mesure de la viscosité par chute de bille basée sur celle décrite dans la
publication
suivante : Pacheco et al. ; Structural characterization of chitin and
chitosan obtained
by biological and chemical methods ; Biomacromotecules ; 12, 3285-3290, 2011
.
Plus particulièrement, cette méthode est utilisée et décrite dans l'Exemple 1.
Avantageusement, la chitine selon l'invention comporte moins de 1,5% en poids
d'acides aminés sur le poids sec total de chitine.
De préférence, la chitine selon l'invention comporte moins de 1% en poids,
plus
préférentiellement moins de 0,9% en poids, encore plus préférentiellement
moins de
0,8% en poids, et encore plus préférentiellement moins de 0,7% en poids
d'acides
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aminés sur le poids sec total de chitine.
Avantageusement, les acides aminés résiduels présents dans la chitine selon
l'invention sont : Thréonine, Acide glutamique, Alanine, Cystéine, Valine,
Tyrosine,
Histidine, Lysine, Tryptophane ou une combinaison de deux ou plus de ceux-ci.
De
préférence, les acides aminés résiduels présents dans la chitine selon
l'invention
consistent en : Alanine, Cystéine, Valine, Histidine, Lysine, Tryptophane ou
une
combinaison de deux ou plus de ceux-ci, préférentiellement en une combinaison
de tous
ces acides aminés.
La teneur en acides aminés de la chitine selon l'invention est de préférence
déterminée selon la méthode NF EN ISO 13904 pour le tryptophane et NF EN ISO
13903
pour les autres acides aminés.
L'abondance relative, exprimée en pourcentage, peut être calculée en
rapportant
la teneur de chaque acide aminé à la teneur totale en acides aminés.
Dans toute la demande, lorsqu'aucune date n'est précisée pour un règlement,
une norme ou une directive, il s'agit du règlement, de la norme ou de la
directive en
vigueur à la date de dépôt.
Avantageusement, la chitine selon l'invention comporte moins de 3% en poids de
cendres sur le poids sec total de chitine.
La chitine selon l'invention comporte de préférence moins de 2,75% en poids,
plus préférentiellement moins de 2,5% en poids, encore plus préférentiellement
moins
de 2% en poids, de manière encore plus préférentielle moins de 1,8% en poids
de
cendres sur le poids sec total de chitine.
La méthode de détermination de la teneur en cendres est bien connue de
l'homme du métier. De préférence, cette teneur est déterminée selon la norme
NF V18-
101.
Avantageusement, la chitine selon l'invention comporte moins de 1% en poids,
de préférence moins de 0,75% en poids, plus préférentiellement moins de 0,5%
en
poids, encore plus préférentiellement moins de 0,2% en poids de lipides sur le
poids sec
total de chitine.
Encore plus préférentiellement, la chitine selon l'invention ne comporte pas
de
lipides.
Les méthodes de détermination de la teneur en lipides ou matière grasse sont
bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple et de manière préférée,
la
détermination de cette teneur sera effectuée en suivant la méthode du
règlement CE
152/2009.
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La chitine selon l'invention possède ainsi des teneurs faibles en acides
aminés,
lipides et cendres, et présente donc une grande pureté.
En effet, dans le cadre de la présente demande, pour mesurer la pureté, les
teneurs en impuretés connues, à savoir en acides aminés, lipides et cendres,
sont
soustraites à la valeur de pureté absolue (100%) pour obtenir la valeur de la
pureté
estimée par différence. Ainsi, par exemple, un échantillon qui contient 30%
d'acides
aminés, 10% de lipides et 1% de cendres, se voit dès lors attribuer une pureté
par
différence de 100-30-10-1=59%.
Ainsi, la chitine selon l'invention présente avantageusement une pureté par
différence supérieure ou égale à 95%.
De préférence, la chitine selon l'invention a une pureté par différence
supérieure
ou égale à 96%, de préférence supérieure ou égale à 97%.
De préférence, la chitine selon l'invention est une chitine isolée.
Par chitine isolée , on entend une chitine qui a été isolée ou extraite de
son
milieu naturel.
Plus particulièrement, dans le cadre de la présente demande, la chitine est
isolée
ou extraite d'insectes, plus spécifiquement de cuticules d'insectes.
L'invention concerne en outre un chitosan dont la masse moléculaire est
supérieure ou égale à 250 kg.m01-1.
Avantageusement, la masse moléculaire du chitosan selon l'invention est
supérieure ou égale à 300 kg.m01-1, de préférence supérieure ou égale à 325
kg.m01-1,
plus préférentiellement supérieure ou égale à 350 kg.m01-1.
La masse moléculaire est déterminée de la même manière qu'indiquée ci-avant
pour la chitine selon l'invention.
Le chitosan selon l'invention présente également une grande pureté.
En effet, le chitosan selon l'invention présente avantageusement une pureté
par
différence supérieure ou égale à 95%.
De préférence, le chitosan selon l'invention a une pureté par différence
supérieure ou égale à 96%, de préférence supérieure ou égale à 97%.
La pureté par différence, la teneur en acides aminés, la teneur en cendres, et
la
teneur en lipides du chitosan selon l'invention sont mesurées de la même
manière
qu'indiqué ci-avant pour la chitine.
Avantageusement, le chitosan selon l'invention comporte moins de 1,5% en
poids d'acides aminés sur le poids sec total de chitosan.
De préférence, le chitosan selon l'invention comporte moins de 1% en poids,
plus
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préférentiellement moins de 0,8% en poids, encore plus préférentiellement
moins de
0,5% en poids, encore plus préférentiellement moins de 0,4% en poids d'acides
aminés
sur le poids sec total de chitosan.
Avantageusement, les acides aminés résiduels présents dans le chitosan selon
l'invention sont : Thréonine, Lysine et/ou Tryptophane.
Avantageusement, le chitosan selon l'invention comporte moins de 3% en poids
de cendres sur le poids sec total de chitosan.
Le chitosan selon l'invention comporte de préférence moins de 2,75% en poids,
plus préférentiellement moins de 2,5% en poids de cendres sur le poids sec
total de
chitosan.
Avantageusement, le chitosan selon l'invention comporte moins de 1% en poids,
de préférence moins de 0,75% en poids, plus préférentiellement moins de 0,5%
en poids
de lipides sur le poids sec total de chitosan.
De préférence, le chitosan selon l'invention est un chitosan isolé.
Par chitosan isolé , on entend un chitosan qui a été obtenu à partir d'une
chitine isolée ou extraite de son milieu naturel.
Plus particulièrement, dans le cadre de la présente demande, le chitosan est
obtenu à partir d'une chitine isolée ou extraite d'insectes, plus
spécifiquement de
cuticules d'insectes.
L'invention concerne également un procédé d'obtention de chitine et/ou
chitosan,
à partir d'insectes, comprenant les étapes suivantes :
- la séparation des cuticules de la partie molle des insectes, puis
- le traitement basique des cuticules.
Le procédé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon l'invention permet
l'obtention d'une chitine et/ou d'un chitosan de masse moléculaire élevée. En
outre, la
chitine et/ou le chitosan présentent également une pureté, telle qu'une pureté
par
différence, élevée.
Par insectes , on entend des insectes à n'importe quel stade de
développement, tel qu'un stade adulte, larvaire ou un stade de nymphe (stade
intermédiaire). Avantageusement, les insectes mis en oeuvre dans le procédé
selon
l'invention sont à un stade larvaire lorsque les insectes sont des
holométaboles, à un
stade de nymphe (stade intermédiaire) lorsque les insectes sont des
hétérométaboles,
ou le cas échéant à un stade adulte.
Les insectes mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention peuvent être
comestibles.
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Avantageusement, les insectes préférés pour la mise en oeuvre du procédé selon
l'invention sont par exemple les coléoptères, les diptères, les lépidoptères
(tel que par
exemple Galleria mellonella), les isoptères, les orthoptères, les
hyménoptères, les
blattoptères, les hémyptères, les hétéroptères, les éphéméroptères et les
mécoptères,
de préférence, les coléoptères, les diptères, les orthoptères, les
lépidoptères ou leurs
mélanges, encore plus préférentiellement les coléoptères.
Les coléoptères préférentiellement mis en oeuvre dans le procédé selon
l'invention appartiennent aux familles des Tenebrionidae, Melolonthidae,
Dermestidae,
Coccinellidae, Cerambycidae, Carabidae, Buprestidae, Cetoniidae,
Dryophthoridae, ou
leurs mélanges.
Plus préférentiellement, il s'agit des coléoptères suivants : Tenebrio
molitor,
Alphitobius diaperinus, Zopho bas mono, Tenebrio obscurus, Tribolium
castaneum,
Pachnoda marginata et Rhynchophorus ferrugineus, ou leurs mélanges. Encore
plus
préférentiellement, il s'agit de Tenebrio molitor.
Le procédé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon l'invention comprend
une
étape de séparation des cuticules de la partie molle des insectes.
La cuticule est la couche externe (ou exosquelette) sécrétée par l'épiderme
des insectes. Elle est en général formée de trois couches : l'épicuticule,
l'exocuticule et
l'endocuticu le.
Par partie molle , on vise la chair (comportant notamment les muscles et
les
viscères) et le jus (comportant notamment les liquides biologiques, l'eau et
l'hémolymphe) des insectes. En particulier, la partie molle ne consiste pas en
le jus des
insectes.
La séparation des cuticules de la partie molle des insectes peut être
effectuée à
l'aide de tout type de séparateur adapté.
Selon un premier mode de réalisation, la séparation des cuticules de la partie
molle est réalisée à l'aide d'un séparateur à bande.
Selon un second mode de réalisation, la séparation des cuticules de la partie
molle est réalisée à l'aide d'un filtre presse.
Cette étape de séparation des cuticules de la partie molle des insectes est
plus
amplement décrite dans l'étape 2 du procédé détaillé d'obtention de chitine
et/ou
chitosan selon l'invention ci-après.
Cette séparation des cuticules de la partie molle de l'insecte permet
notamment
de séparer la chitine de la partie molle. En effet, les cuticules obtenues à
l'issue de cette
étape de séparation présentent une teneur en chitine élevée de l'ordre de 10 à
30% en
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poids sur le poids total de cuticules, comme indiqué ci-après.
En particulier, l'étape de séparation des cuticules de la partie molle
s'effectue
sans qu'aucune étape préalable de broyage des insectes, notamment sous forme
de
particules, n'ait été effectuée.
Le procédé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon l'invention comprend
avantageusement une étape d'abattage préalable à l'étape de séparation des
cuticules
de la partie molle.
Cette étape d'abattage est plus amplement décrite dans l'étape 1 du procédé
détaillé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon l'invention ci-après.
Avantageusement, suite à l'étape 1 d'abattage, les insectes sont directement
utilisés pour la mise en oeuvre de l'étape 2 de séparation des cuticules de la
partie molle
des insectes, c'est-à-dire que les insectes ne sont soumis à aucun traitement,
tel qu'un
broyage, une congélation ou une déshydratation entre l'étape 1 et l'étape 2.
Le procédé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon l'invention comprend
une
étape de traitement basique des cuticules, suite à l'étape de séparation des
cuticules de
la partie molle des insectes.
Avantageusement, le traitement basique est réalisé à l'aide d'une base forte.
Avantageusement, la base forte est choisie parmi l'hydroxyde de sodium ou
soude, de potassium, et d'ammonium. De préférence, la base forte est
l'hydroxyde de
sodium.
De préférence, la base utilisée pour le traitement basique est sous forme
d'une
solution basique aqueuse.
Dans ce cas, la concentration molaire de la base en solution aqueuse est
avantageusement comprise entre 0,1 et 5 mol.L-1, de préférence comprise entre
0,5 et
2 mol.L-1, encore plus préférentiellement égale à 1 mol.L-1 (par exemple soude
molaire).
On notera que dans le cadre de la présente demande, et sauf stipulation
contraire, les gammes de valeurs indiquées s'entendent bornes incluses.
De préférence, la concentration de la base est ajustée de manière à obtenir un
ratio base en poids sec en g : cuticules en poids sec en g : eau en poids en g
compris
entre 0,4 : 0,45: 10 et 1,4: 0,45 : 30, plus préférentiellement 0,4 : 0,45: 10
et 1,2 : 0,45:
30, encore plus préférentiellement d'environ 0,9 :0,45: 22. Les valeurs plus
préférées
sont notamment celles à mettre en oeuvre lors de l'utilisation d'hydroxyde de
sodium.
Cette étape de traitement basique des cuticules est plus amplement décrite
dans
l'étape 3 du procédé détaillé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon
l'invention ci-
après.
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Avantageusement, l'étape de traitement basique des cuticules est suivie d'une
étape de récupération de la chitine.
Cette étape de récupération de la chitine est plus amplement décrite dans
l'étape
4 du procédé détaillé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon l'invention
ci-après.
Optionnellement, le procédé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon
l'invention comprend en outre une étape de lavage de la chitine.
Cette étape optionnelle de lavage de la chitine est plus amplement décrite
dans
l'étape 5 du procédé détaillé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon
l'invention ci-
après.
Optionnellement, le procédé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon
l'invention comprend en outre une étape de séchage de la chitine.
Cette étape optionnelle de séchage de la chitine est plus amplement décrite
dans
l'étape 6 du procédé détaillé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon
l'invention ci-
après.
La chitine pouvant être commercialisée sous forme de poudre, le procédé
d'obtention de chitine et/ou chitosan selon l'invention peut optionnellement
comprendre
une étape de broyage de la chitine.
Cette étape optionnelle de broyage de la chitine est plus amplement décrite
dans
l'étape 7 du procédé détaillé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon
l'invention ci-
après.
L'étape de broyage peut également être effectuée afin de favoriser la réaction
de
désacétylation, qui permet de préparer du chitosan à partir de chitine.
L'étape de désacétylation, qui vise à transformer la chitine en chitosan,
n'est donc
mise en oeuvre que lorsque le produit souhaité est le chitosan.
Cette étape de désacétylation de la chitine est plus amplement décrite à
l'étape
8 du procédé détaillé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon l'invention
ci-après.
Avantageusement, l'étape de désacétylation de la chitine est suivie d'une
étape
de récupération du chitosan.
Cette étape de récupération du chitosan est plus amplement décrite dans
l'étape
9 du procédé détaillé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon l'invention
ci-après.
Optionnellement, le procédé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon
l'invention comprend en outre une étape de lavage du chitosan.
Cette étape optionnelle de lavage du chitosan est plus amplement décrite dans
l'étape 10 du procédé détaillé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon
l'invention ci-
après.
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Optionnellement, le procédé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon
l'invention comprend en outre une étape de séchage du chitosan.
Cette étape optionnelle de séchage du chitosan est plus amplement décrite à
l'étape 11 du procédé détaillé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon
l'invention ci-
après.
De préférence, les procédés d'obtention de chitine et/ou de chitosan selon
l'invention ne comprennent pas d'étape réalisée à un pH inférieur à 6.
On notera que les étapes 5 à 7, 10 et 11 mentionnées ci-avant, et décrites
plus
amplement dans le procédé détaillé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon
l'invention ci-après, sont optionnelles. Toutefois, le procédé d'obtention de
chitine et/ou
chitosan selon l'invention comprend avantageusement une ou plusieurs de ces
étapes,
de préférence toutes ces étapes.
On notera par ailleurs que les caractéristiques des étapes 1 à 11 du procédé
détaillé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon l'invention, qui sont
décrites ci-après,
ne sont pas limitées à une mise en oeuvre dans ledit procédé détaillé, mais
s'appliquent
à tous les modes de réalisation du procédé d'obtention de chitine et/ou
chitosan selon
l'invention décrits dans la présente demande, indépendamment du nombre
d'étapes
prévu dans ces modes de réalisation.
Ces caractéristiques s'appliquent également à un procédé particulier
d'obtention
de chitine et à un procédé particulier d'obtention de chitosan selon
l'invention, décrits ci-
après.
L'invention vise donc plus particulièrement un procédé particulier d'obtention
de
chitine, à partir d'insectes, comprenant les étapes suivantes :
- l'abattage des insectes,
- la séparation des cuticules de la partie molle des insectes,
- le traitement basique des cuticules,
- la récupération de la chitine.
Ce procédé comprend donc les étapes 1 à 4 du procédé détaillé d'obtention de
chitine et/ou de chitosan ci-après et avantageusement une ou plusieurs des
étapes
optionnelles 5 à 7 de ce procédé détaillé.
L'invention concerne également la chitine susceptible d'être obtenue par le
procédé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon l'invention, ou par le
procédé
particulier d'obtention de chitine selon l'invention.
L'invention vise donc également un procédé particulier d'obtention de
chitosan,
à partir d'insectes, comprenant les étapes suivantes :
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- l'abattage des insectes,
- la séparation des cuticules de la partie molle des insectes,
- le traitement basique des cuticules,
- la récupération de la chitine,
- la désacétylation de la chitine, et
- la récupération du chitosan.
Ce procédé comprend donc les étapes 1 à 4, 8 et 9 du procédé détaillé
d'obtention de chitine et/ou de chitosan ci-après et avantageusement une ou
plusieurs
des étapes optionnelles 5 à 7, 10 et 11 de ce procédé détaillé.
L'invention concerne également le chitosan susceptible d'être obtenu par le
procédé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon l'invention, ou par le
procédé
particulier d'obtention de chitosan selon l'invention.
La chitine et/ou le chitosan selon l'invention ainsi que la chitine et/ou le
chitosan
susceptible(s) d'être obtenu(s) par un procédé selon l'invention peu(ven)t
avantageusement être utilisé(s) dans diverses applications :
- dans des compositions cosmétiques, pharmaceutiques, nutraceutiques ou
diététiques,
- comme biomatériaux pour traiter des brûlures en tant que seconde peau, pour
réaliser des pansements cornéens ou des fils chirurgicaux,
- comme agent filtrant, texturant, floculant et/ou adsorbant notamment pour la
filtration et dépollution de l'eau.
Procédé détaillé d'obtention de chitine et/ou chitosan selon l'invention
= Etape 1 : Abattage des insectes
Cette étape 1 d'abattage peut avantageusement s'effectuer par choc thermique,
tel que par ébouillantage ou par blanchiment. Cette étape 1 permet d'abattre
les insectes
tout en abaissant la charge microbienne (réduction du risque d'altération et
sanitaire) et
en inactivant les enzymes internes des insectes pouvant déclencher une
autolyse, et
ainsi un brunissement rapide de ceux-ci.
Pour l'ébouillantage, les insectes, de préférence des larves, sont ainsi
ébouillantés à l'eau pendant 2 à 20 minutes, préférentiellement, 5 à 15
minutes.
De préférence, l'eau est à une température comprise entre 87 à 100 C,
préférentiellement 92 à 95 C.
La quantité d'eau introduite lors de l'ébouillantage est déterminée de la
façon
suivante : le ratio du volume d'eau en ml sur le poids en g d'insecte est de
préférence
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compris entre 0,3 et 10, plus préférentiellement entre 0,5 et 5, encore plus
préférentiellement entre 0,7 et 3, encore plus préférentiellement de l'ordre
de 1.
Pour le blanchiment, les insectes, de préférence des larves, sont blanchis à
l'eau
ou à la vapeur (buses ou lit de vapeur) à une température comprise entre 80 et
105 C,
de préférence entre 87 et 105 C, plus préférentiellement entre 95 et 100 C,
encore plus
préférentiellement 98 C ou bien à l'eau à une température comprise entre 90 et
100 C,
préférentiellement entre 92 et 95 C (par buses d'aspersion) ou en mode mixte
(eau +
vapeur) à une température comprise entre 80 et 130 C, de préférence entre 90
et 120 C,
plus préférentiellement entre 95 et 105 C, encore plus préférentiellement 98
C. Lorsque
les insectes sont blanchis uniquement à la vapeur, le blanchiment est
avantageusement
réalisé dans des blancheurs à vapeur à circulation forcée ( forced steaming
). Le
temps de séjour dans la chambre de blanchiment est compris entre 5 secondes et
15
minutes, préférentiellement entre 1 et 7 minutes.
Avantageusement, suite à l'étape 1 d'abattage, les insectes sont directement
utilisés pour la mise en oeuvre de l'étape 2 de séparation des cuticules de la
partie molle
des insectes, c'est-à-dire que les insectes ne sont soumis à aucun traitement,
tel qu'un
broyage, une congélation ou une déshydratation entre l'étape 1 et l'étape 2.
Selon un mode de réalisation préféré, les insectes sont des coléoptères et
notamment, Tenebrio molitor.
= Etape 2 : Séparation des cuticules de la partie molle des insectes
L'étape 2 a pour objectif de séparer les cuticules de la partie molle des
insectes.
La séparation des cuticules de la partie molle des insectes peut être
effectuée à
l'aide de tout type de séparateur adapté.
Selon un premier mode de réalisation, la séparation des cuticules de la partie
molle est réalisée à l'aide d'un séparateur à bande.
Par séparateur à bande , on vise un dispositif permettant la séparation de
la
partie solide de la partie molle d'un produit, et qui comporte une bande de
serrage (ou
bande presseuse) et un tambour perforé.
A titre d'exemple, un séparateur à bande peut comprendre une bande de serrage
et un tambour perforé, la bande de serrage entourant au moins une partie du
tambour
perforé.
La bande de serrage permet l'apport et l'application des insectes contre le
tambour perforé de sorte à faire passer, par pression, la partie molle des
insectes à
travers les perforations du tambour, tandis que la partie solide des insectes
(cuticules)
reste à l'extérieur du tambour.
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Les cuticules peuvent ensuite être récupérées à l'aide d'un couteau racleur.
A titre d'exemple, on peut citer les séparateurs à bande provenant de la
société
Baader, tels que les séparateurs à bande 601 à 607 ( soft separator 601 to
607 ), ou
encore les séparateurs à bande SEPAmatic de BFD Corporation (gamme 410 à
4000V).
Avantageusement, le diamètre des perforations du tambour est compris entre 0,5
et 3 mm, de préférence entre 1 et 2 mm.
Concernant la pression, l'homme du métier est à même de déterminer la pression
à exercer permettant la séparation des cuticules de la partie molle des
insectes.
Selon un second mode de réalisation, la séparation des cuticules de la partie
molle est réalisée à l'aide d'un filtre presse.
Un filtre presse est composé de toiles filtrantes, et permet une séparation
selon
le principe de filtration sous pression.
Avantageusement, le filtre presse utilisé dans le procédé d'obtention de
chitine
et/ou chitosan selon l'invention est un filtre presse à bandes.
Un filtre presse à bandes comporte deux bandes de serrage perforées
(également appelées toiles filtrantes ). Les insectes sont placés entre les
deux
bandes de serrage perforées de sorte à faire passer, par pression, la partie
molle des
insectes à travers les perforations des bandes de serrage, tandis que la
partie solide des
insectes restent entre les deux bandes de serrage perforées.
L'homme du métier est à même de déterminer le diamètre des perforations des
bandes de serrage ainsi que la pression à exercer, permettant la séparation
des
cuticules de la partie molle des insectes.
A titre d'exemple, on peut citer le filtre presse à bandes (ou presse à
bandes )
provenant de la société Flottweg, ou encore les filtres presses à bandes de la
société
ATR Créations.
Cette étape de séparation des insectes se distingue d'un pressage classique
pouvant être réalisé par exemple avec une presse mono-vis ou bi-vis en ce
qu'elle
permet une séparation (nette) de la partie molle et des cuticules des insectes
et non une
séparation d'un jus d'une fraction solide.
Avantageusement, la séparation des cuticules de la partie molle des insectes
est
effectuée à l'aide d'un séparateur à bande.
Les cuticules obtenues dans l'étape 2 comportent entre 10 et 30%, de
préférence
entre 15 et 25% en poids de chitine, sur le poids sec total de cuticules.
La détermination du taux de chitine est effectuée par extraction de celle-ci.
A titre
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d'exemple, une méthode de détermination du taux de chitine pouvant être
utilisée est la
méthode ADAC 991.43.
Selon un mode de réalisation préféré, la séparation des cuticules de la partie
molle des coléoptères et notamment de Tenebrio molitor est effectuée à l'aide
d'un
séparateur à bande.
= Etape 3 : Traitement basique des cuticules
Dans l'étape 3, les cuticules récupérées à l'issue de l'étape 2 sont soumises
à un
traitement basique, c'est-à-dire qu'elles sont mises en contact avec une base
(ou agent
basique).
Avantageusement, le traitement basique est réalisé à l'aide d'une base forte.
Avantageusement, la base forte est choisie parmi l'hydroxyde de sodium ou
soude, de potassium, et d'ammonium. De préférence, la base forte est
l'hydroxyde de
sodium ou de potassium, plus préférentiellement l'hydroxyde de sodium.
De préférence, la base utilisée pour le traitement basique est sous forme
d'une
.. solution basique aqueuse.
Dans ce cas, la concentration molaire de la base en solution aqueuse est
avantageusement comprise entre 0,1 et 5 mo11-1, de préférence comprise entre
0,5 et
2 mo11-1, encore plus préférentiellement égale à 1 mo11-1 (par exemple soude
molaire).
De préférence, la concentration de la base est ajustée de manière à obtenir un
.. ratio base en poids sec en g : cuticules en poids sec en g : eau en poids
en g compris
entre 0,4 : 0,45 : 10 et 1,4: 0,45 : 30, plus préférentiellement 0,4 : 0,45 :
10 et 1,2 : 0,45 :
30, encore plus préférentiellement d'environ 0,8 : 0,45: 20. Les valeurs plus
préférées
sont notamment celles à mettre en oeuvre lors de l'utilisation d'hydroxyde de
sodium.
Le traitement basique est avantageusement réalisé pendant une durée comprise
entre 5 et 60 heures, de préférence pendant une durée comprise entre 10 et 60
heures,
plus préférentiellement entre 15 et 55 heures.
La durée du traitement basique pourra avantageusement être adaptée selon les
propriétés de la chitine que l'on souhaite obtenir, telles que sa blancheur.
Par exemple, dans le cas où l'obtention d'une chitine de couleur blanche n'est
pas particulièrement souhaitée, la durée du traitement basique pourra être
inférieure à
30 heures, telle que par exemple 20 heures environ.
A l'inverse, dans le cas où l'obtention d'une chitine de couleur blanche est
souhaitée, et notamment lorsque les insectes sont des coléoptères et des
orthoptères,
la durée du traitement basique sera avantageusement d'au moins 30 heures, de
préférence d'au moins 40 heures, telle que par exemple 48 heures environ.
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Avantageusement, le traitement basique est réalisé à une température comprise
entre 60 et 100 C, de préférence comprise entre 80 et 100 C, plus
préférentiellement
d'environ 90 C.
Pour cela, le milieu réactionnel peut être chauffé, par exemple à l'aide d'un
bain
d'huile, d'un échangeur de chaleur ou d'un système de chauffage à double
enveloppe,
de sorte à atteindre la température souhaitée.
L'étape de traitement basique est avantageusement réalisée sous agitation.
= Etape 4: Récupération de la chitine
L'étape 4 de récupération de la chitine, à partir du milieu réactionnel obtenu
à la
fin de l'étape 3, peut être réalisée par toute méthode de récupération
appropriée. Ces
méthodes sont connues de l'homme du métier.
A titre d'exemple, on peut citer la filtration, la centrifugation et la
décantation.
Avantageusement, la récupération de la chitine est réalisée par filtration.
= Etape (optionnelle) 5 : Lavage de la chitine
La chitine récupérée à l'issue de l'étape 4 est ensuite optionnellement lavée.
L'étape 5 de lavage de la chitine est avantageusement réalisée à l'aide d'eau
du
robinet ou d'eau distillée, de préférence à l'aide d'eau du robinet. De
préférence, cette
eau a une température comprise entre 15 et 60 C.
De préférence, le lavage est réalisé jusqu'à neutralisation du pH.
= Etape (optionnelle) 6 : Séchage de la chitine
La chitine est ensuite optionnellement séchée.
De préférence, l'étape de séchage est réalisée à une température comprise
entre
40 et 105 C, de préférence à environ 60 C.
L'étape de séchage est réalisée pendant une durée comprise entre 10 et 80
heures, de préférence pendant environ 24 heures.
Avantageusement, le séchage est réalisé à l'aide d'une étuve de séchage, telle
que le modèle FED 115 ou FP53 de la société Binder .
Afin de préparer du chitosan à partir de la chitine, les étapes suivantes
peuvent
en outre être réalisées :
= Etape (optionnelle) 7: Broyage de la chitine
La chitine obtenue à l'issue de l'étape 4, 5 ou 6 est ensuite optionnellement
broyée, par exemple dans un broyeur ultracentrifuge à tamis.
La production de chitosan à partir de chitine, par la réaction de
désacétylation,
dépend en grande partie de la taille des particules de chitine. Ainsi, un
broyage très fin
de la chitine avant désacétylation permet d'augmenter significativement les
rendements
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et la vitesse de la réaction de désacétylation, comme cela est illustré dans
le Tableau 1
ci-après :
Broyage 120
Broyage 30 s Broyage 45 s Broyage 60s
s
50% des
< 174 lm < 117 lm < 95
lm < 67 lm
particules
90% des
< 310 lm < 244 lm < 157
lm < 159 lm
particules
DA* 99% 90% 85% 80%
*Mesure du Degré d'Acétylation DA
Tableau 1 : Efficacité de la désacétylation selon le broyage préalable de la
chitine
Les conditions de la désacétylation effectuée dans l'essai rapporté dans
le Tableau 1 sont les suivantes : 4 heures de réaction, 100 C, NaOH en
solution
aqueuse à 30% en volume, dans un ratio chitine estimée : solution de NaOH égal
à 1:20.
Par conséquent, la chitine est préférentiellement broyée à une taille de
particules
inférieure à 300 jim, telle qu'une taille inférieure à 260, ou inférieure à
200 jim, ou encore
inférieure à 160 jim.
= Etape 8: Désacétvlation de la chitine
Cette étape n'est mise en oeuvre que dans le cas où l'obtention de chitosan
est
souhaitée.
La chitine est ensuite placée dans un réacteur où est ajoutée une base.
Avantageusement, la désacétylation de la chitine est réalisée à l'aide d'une
base
forte.
Avantageusement, la base forte est choisie parmi l'hydroxyde de sodium ou
soude, de potassium, et d'ammonium. De préférence, la base forte est
l'hydroxyde de
sodium.
De préférence, la base utilisée pour le traitement basique est sous forme
d'une
solution basique aqueuse, de préférence une solution basique aqueuse
concentrée.
Dans ce cas, la concentration molaire de la base en solution aqueuse est
avantageusement comprise entre 4 et 25 mo11-1, de préférence comprise entre 6
et 22
mo11-1, plus préférentiellement comprise entre 8 et 19 mo11-1, encore plus
préférentiellement comprise entre 10 et 19 mo11-1, de manière encore plus
préférentielle
comprise entre 12,5 et 19 mo11-1.
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De préférence, la concentration de la base est ajustée de manière à obtenir un
ratio base en poids sec en g : chitine en poids sec en g : eau en poids en g
compris entre
18: 1 : 35 et 55: 1 : 55, tel que par exemple compris entre 18: 1 : 35 et 30 :
1 : 55, ou
d'environ 24 : 1 : 45, plus préférentiellement d'environ 38 :1 : 50. Les
valeurs plus
préférées sont notamment celles à mettre en oeuvre lors de l'utilisation
d'hydroxyde de
sodium.
De préférence, la désacétylation est réalisée pendant 1 à 24 heures et
préférentiellement 2 à 18 heures.
Avantageusement, cette désacétylation est réalisée en deux fois, avec une
étape
intermédiaire de neutralisation du pH. Par exemple, la désacétylation pourra
être
réalisée en deux fois deux heures, c'est-à-dire pendant 4 heures, avec une
étape
intermédiaire de neutralisation du pH intermédiaire.
La température de désacétylation se situe avantageusement entre 80 et 150 C,
de préférence entre 90 et 120 C et plus préférentiellement à 100 C.
= Etape 9 : Récupération du chitosan
L'étape 9 de récupération du chitosan, à partir du milieu réactionnel obtenu à
la
fin de l'étape 8, peut être réalisée par toute méthode de récupération
appropriée. Ces
méthodes sont connues de l'homme du métier.
A titre d'exemple, on peut citer la filtration, la centrifugation et la
décantation.
Avantageusement, la récupération du chitosan est réalisée par filtration.
Dans le cas où l'étape 7 de broyage de la chitine est mise en oeuvre, le
chitosan
récupéré est sous forme de poudre.
Le chitosan peut ensuite subir toute opération connue de l'homme du métier
permettant de le fonctionnaliser, notamment par l'ajout de radicaux
(carboxylation,
hydroxylation...).
= Etape (optionnelle) 10 : Lavage
Le chitosan récupéré à l'issue de l'étape 9 est ensuite optionnellement lavé.
L'étape 10 de lavage du chitosan est avantageusement réalisée à l'aide d'eau
du
robinet. De préférence, cette eau aune température comprise entre 15 et 60 C.
De préférence, le lavage est réalisé jusqu'à neutralisation du pH.
= Etape (optionnelle) 11: Séchage
Le chitosan, pouvant être sous forme de poudre, est ensuite optionnellement
séché entre 30 et 80 C, avantageusement entre 50 et 70 C, de préférence à
environ
60 C, pour obtenir du chitosan ou une poudre de chitosan ayant une teneur en
matière
sèche supérieure à 85%, plus particulièrement supérieure à 90%.
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L'étape de séchage est réalisée pendant une durée comprise entre 10 et 80
heures, de préférence pendant environ 24 heures.
Avantageusement, le séchage est réalisé à l'aide d'une étuve de séchage, telle
que le modèle FED 115 ou FP 53 de la société Binder .
L'invention sera mieux comprise au vu des exemples qui suivent, qui sont
donnés
à titre illustratif.
EXEMPLE 1 : Procédé d'obtention de chitine selon l'invention
I. Procédé d'obtention
Des larves de Tenebrio molitor ont été utilisées. A réception des larves, ces
dernières peuvent être stockées à 4 C pendant 0 à 15 jours dans leurs bacs
d'élevage
avant l'abattage sans dégradation majeure. Le poids des larves (âge) utilisées
est variable et par conséquent leur composition peut varier, comme cela est
illustré dans
le Tableau 2 ci-après :
Biomasse
(insectes) mg 23 35 58 80 108 154
Matière sèche 0/0* 34 34 34,2 37,9 39,6 39,5
Cendres 0/0* 1,59 1,52 1,6 1,75 1,67 1,43
Protéines brutes /0* 22,6 22,2 22 23,2 23,1 23,2
Lipides 0/0* 6,62 6,88 7,98 10,3 10,9 11,7
* Les % sont exprimés en poids sec sur le poids humide de larves.
Tableau 2 : Composition biochimique des larves de Tenebrio molitor selon leur
poids.
= Etape 1 : Abattage des insectes
Les larves vivantes (+4 C à + 25 C) sont convoyées en couche d'épaisseur
.. comprise entre 2 et 10 cm, sur un tapis à bande perforé (1 mm) jusqu'à une
chambre de
blanchiment. Les insectes sont ainsi blanchis à la vapeur (buses ou lit de
vapeur) à 98 C
sous ventilation forcée ou bien à l'eau à 92-95 C (buses d'aspersion) ou en
mode mixte
(eau + vapeur). Le temps de séjour dans la chambre de blanchiment est compris
entre
5 secondes et 15 minutes, idéalement 5 minutes.
La température des larves en sortie de blanchiment est comprise entre 75 C et
98 C.
= Etape 2 : Séparation de la partie molle des cuticules des insectes
Les larves, une fois blanchies, sont convoyées jusqu'à la trémie
d'alimentation
d'un séparateur à bande, afin de séparer les cuticules de la partie molle des
larves.
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Avantageusement, la séparation s'effectue immédiatement après l'abattage de
manière à ce que les larves n'aient pas le temps de refroidir à température
ambiante.
Le séparateur à bande utilisé est un séparateur à bande 601 de la société
Baader.
Le diamètre des perforations du tambour est de 1,3 mm.
La partie molle des insectes est récupérée dans une cuve.
Les cuticules sont récupérées à l'aide d'un couteau racleur.
Le pourcentage de matière sèche des cuticules est d'environ 45%.
Le taux d'humidité des cuticules est donc d'environ 55%.
= Etape 3 : Traitement basique des cuticules
Dans un tricol de 2 L muni d'un réfrigérant et d'un agitateur mécanique
(Heidolph RZR1), on place 90,02 0,02 g de cuticules humides obtenues à
l'étape 2
(Matière Sèche = 40,1 0,1 %) et 1,80 0,02 L de solution aqueuse
d'hydroxyde de
sodium de concentration égale à 1 mol.L-1. Le milieu est chauffé avec un bain
d'huile à
une température de 90 2 C pendant 48 heures. Pendant toute la réaction, le
milieu
réactionnel est soumis à une agitation de 280 rpm.
Le ratio base en poids sec en g : cuticules en poids sec en g : eau en poids
en g
est environ égal à 0,9 :0,45 :22.
= Etape 4: Récupération de la chitine
Le milieu réactionnel obtenu à l'issue de l'étape 3 est ensuite filtré (Filtre
SEFAR
MEDIFAB 03-60/42) de sorte à récupérer la chitine.
= Etape (optionnelle) 5 : Lavage de la chitine
La chitine récupérée à l'issue de l'étape 4 est ensuite rincée à l'eau tiède
du
robinet jusqu'à neutralisation du pH.
= Etape (optionnelle) 6 : Séchage de la chitine
La chitine est ensuite séchée pendant 24 heures, à 60 C, dans une étuve de
séchage (Binder , modèle FP53).
On obtient ainsi 6,3 0,2 g de chitine.
Il. Méthodes d'analyse
Mesure de la matière sèche et du taux d'humidité
Le pourcentage de matière sèche et le taux d'humidité sont calculés de la
façon
suivante.
2 g de chitine sont pesés dans des coupelles, introduits dans une étuve de
séchage (Binder0, modèle FED 115) et séchés à 105 C pendant 24 h (ou jusqu'à
séchage complet).
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Le pourcentage de matière sèche est obtenu en faisant le rapport de la masse
sèche de chitine après séchage sur la masse de chitine avant séchage.
Le taux d'humidité est obtenu en ôtant le pourcentage de matière sèche à la
valeur de 100%.
Cette méthode de mesure peut également être utilisée pour mesurer le
pourcentage de matière sèche et le taux d'humidité des cuticules.
Mesure du taux de cendres
Le taux de cendres a été déterminé selon la méthode norme NF V18-101.
Mesure de la teneur en protéines brutes
Le taux de protéines est obtenu par la méthode Dumas, avec le coefficient de
conversion de 6,25, adaptée de la norme NF EN ISO 16634-1.
Mesure de la teneur en lipides ou matières grasses
Le taux de lipides est obtenu par une méthode adaptée du règlement CE
152/2009 ¨ procédé B ¨ SN.
Teneur et abondance relative en acides aminés
La teneur en acides aminés de la chitine selon l'invention est de préférence
déterminée selon la méthode NF EN ISO 13904 ou une méthode adaptée du
règlement
CE 152/2009 du 27-01-2009 ¨ SN (ces deux méthodes étant équivalentes) pour le
tryptophane, et selon la méthode NF EN ISO 13903 ou une méthode issue du
règlement
CE 152/2009 du 27-01-2009 ¨ SN pour les autres acides aminés (ces deux
méthodes
étant équivalentes).
L'abondance relative a été calculée en rapportant la teneur de chaque acide
aminé à la teneur totale en acides aminés.
Teneur totale en acides aminés
La teneur totale en acides aminés a été déterminée en additionnant les valeurs
individuelles obtenues pour chaque acide aminé, y compris le tryptophane.
Pureté par différence
Dans le cas de cette mesure, les teneurs en impuretés connues (acides aminés,
lipides et cendres) ont été soustraites à la valeur de pureté absolue (100%)
pour obtenir
la valeur de la pureté estimée par différence. Ainsi, par exemple, un
échantillon qui
contient 30% d'acides aminés, 10% de lipides et 1% de cendres, se voit dès
lors attribuer
une pureté par différence de 100-30-10-1=59%
Masse moléculaire de la chitine
La méthode de détermination de la masse moléculaire de la chitine repose sur
des mesures de viscosité de solutions diluées de chitine. Les dilutions sont
réalisées
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dans du diméthyleacétamide contenant 5% de chlorure de lithium (DMAc-LiCI 5%).
En
effet, les polymères en solution augmentent la viscosité d'un solvant. La
viscosité du
polymère en solution dépend de sa concentration et de sa masse moléculaire. La
relation
est définie par l'équation de Mark-Houwink-Sakurada :
[n] = KM'
avec [ri]: la viscosité intrinsèque, M : la masse moléculaire, K et a des
constantes
spécifiques d'un système solvant/polymère à une température donnée.
Les valeurs pour la chitine dissoute dans le solvant DMAc-LiCI 5 % à 25 C
sont :
K = 0,24 mL.g-1 et a = 0,69 (Pacheco et al ; 2011).
La viscosité intrinsèque correspond à la viscosité spécifique quand la
concentration du polymère tend vers zéro.
[i]= tim
Pour mesurer la viscosité spécifique de la chitine, cinq solutions de faibles
concentrations sont préparées dans le DMAc-LiCI 5 A. Les temps d'écoulement
du
solvant seul (to) et des solutions (t) des différentes concentrations sont
mesurés par un
micro viscosimètre à chute de bille pour calculer la viscosité relative (17r).
A partir de la
viscosité relative (17r), il est nécessaire de calculer les viscosités
spécifiques (nsp),
réduites (nred) et inhérentes (n'oh) de chaque concentration de chitine.
ln(nr)
17sp = 17r¨ 1; //red = ; //inh = ¨
La viscosité intrinsèque est alors calculée en traçant les courbes
concentration
vs. viscosité réduite (pente positive) et concentration vs. viscosité
inhérente (pente
négative). Chacune de ces courbes est extrapolée à la concentration de zéro.
L'ordonnée à l'origine correspond à la viscosité intrinsèque. Des résultats
similaires sont
attendus des deux courbes. Enfin, pour déterminer la masse moléculaire de la
chitine,
l'équation de Mark-Houwink-Sakurada est appliquée.
Résultats
Les propriétés de la chitine obtenue à l'issue de l'étape 6 sont présentées
dans
le Tableau 3 ci-dessous.
Cendres (g/100 g MS*) 1,71 +/- 0,11
Matières grasses (g/100 g MS*) 0 +/- 0,00
Teneur totale en aa** (g/100 g MS*) 0,68 +/- 0,03
Pureté par différence (%) 97,61 +/- 0,14
Masse moléculaire (kg.m01-1) 1015,5 +/- 98,29
*MS : matière sèche
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**aa : acides aminés
Tableau 3 : Propriétés de la chitine obtenue dans l'Exemple 1
L'abondance relative en acides aminés de la chitine obtenue est présentée dans
le Tableau 4 ci-dessous. Elle est exprimée en %.
Thréonine (Thr) 0,00
Sérine (Ser) 0,00
Proline (Pro) 0,00
Glycine (Glu) 0,00
Acide glutamique (Glu) 0,00
Alanine (Ala) 12,48
Cystéine (Cys) 5,87
Valine (Val) 8,07
Méthionine (Met) 0,00
lsoleucine (11e) 0,00
Acide aspartique (Asp) 0,00
Leucine (Leu) 0,00
Tyrosine (Tyr) 0,00
Phénylalanine (Phe) 0,00
Histidine (His) 44,77
Lysine (Lys) 28,62
Arginine (Arg) 0,00
Tryptophane (Trp) 0,19
Total 100,00
Tableau 4 : Abondance relative en acides aminés de la chitine obtenue dans
l'Exemple
1
5 acides aminés apparaissent particulièrement résistants au procédé, à savoir
l'alanine, la cystéine, la valine, l'histidine et la lysine. L'histidine, la
lysine et l'alanine sont
les 3 acides aminés les plus résistants. Ils représentent en effet plus de 85%
des acides
aminés résiduels.
EXEMPLE 2: Procédé d'obtention de chitosan selon l'invention
Pour préparer le chitosan, on utilise la chitine résultant de l'étape 4, 5 ou
6 de
l'Exemple 1.
= Etape (optionnelle) 7 : Broyage de la chitine
La chitine a été broyée dans un broyeur ultracentrifuge à tamis à une taille
de
250 m.
= Etape 8: Désacétvlation de la chitine
La chitine est ensuite placée dans un réacteur où est ajoutée une solution de
soude concentrée. L'hydroxyde de sodium en solution aqueuse à une teneur de
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50% (soit une concentration d'hydroxyde de sodium en solution aqueuse de 12,5
mol/L)
est ajouté selon un ratio poids en g de chitine broyée / volume en mL
d'hydroxyde de
sodium en solution aqueuse égal à 1 :50. La cuve est ensuite chauffée à une
température de 100 C. La réaction de désacétylation est réalisée pendant 2
fois 2
heures, avec une étape intermédiaire de neutralisation du pH.
= Etape 9 : Récupération du chitosan
Le milieu réactionnel obtenu à l'issue de l'étape 8 est ensuite filtré (Filtre
SEFAR
MEDIFAB 03-60/42) de sorte à récupérer du chitosan.
= Etape (optionnelle) 10 : Lavage
Le chitosan récupéré à l'issue de l'étape 9 est ensuite rincé à l'eau tiède du
robinet jusqu'à neutralisation du pH.
On obtient ainsi du chitosan en poudre.
La masse moléculaire du chitosan obtenu est égale à 350 +/- 26 kg.mo1-1.
La pureté par différence du chitosan obtenu est supérieure à 97%.
= Etape (optionnelle) 11: Séchage
La poudre de chitosan est ensuite séchée à 60 C afin d'obtenir une poudre
ayant
une teneur en matière sèche supérieure à 85%.
EXEMPLE 3 : Procédé d'obtention de chitine comparatif
Ce procédé comparatif ne comprend pas d'étape de séparation de la partie molle
des cuticules des insectes (étape 2 du procédé selon l'invention), mais
comprend une
étape de broyage puis pressage des insectes (étape 2 du procédé comparatif).
I. Matériel et méthodes
= Etape 1 : Abattage des insectes
Cette étape est identique à celle de l'Exemple 1.
= Etape 2 : Broyage puis pressage des insectes
Suite à l'étape 1, 600 g de larves sont introduits dans un bécher contenant
450
mL d'eau, et mixées à l'aide d'un mixeur Thermomix , à vitesse maximale
pendant 30
secondes. Le liquide ainsi obtenu est pressé avec une presse bi-vis de type
Angel dans
les conditions suivantes :
- Vitesse = 82 tr/min;
- W (énergie) = 3 HP (chevaux vapeur) soit 2,68 x 106 J;
- Porosité (approximative) = 0,5 mm dans la première partie et 0,2 mm dans la
dernière partie.
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On obtient ainsi un jus de presse et un gâteau de presse de 133,1 0,1 g
en poids humide.
= Etape 3 : Traitement basique du gâteau de presse
Dans un tricol de 2 L muni d'un réfrigérant et d'un agitateur mécanique
(Heidolph RZR1), on place 90,06 0,05 g de gâteau de presse obtenu à l'étape
2
(Matière Sèche = 48 1 /0) et 1,80 0,02 L de solution aqueuse d'hydroxyde
de sodium
de concentration égale à 1 mol.L-1. Le milieu est chauffé avec un bain d'huile
à une
température de 90 2 C pendant 48 heures. Pendant toute la réaction, le
milieu
réactionnel est soumis à une agitation de 280 rpm.
= Etape 4: Récupération de la chitine
Le milieu réactionnel obtenu à l'issue de l'étape 3 est ensuite filtré (Filtre
SEFAR
MEDIFAB 03-60/42) de sorte à récupérer la chitine.
= Etape 5: Lavage de la chitine
La chitine récupérée à l'issue de l'étape 4 est ensuite rincée à l'eau tiède
du
robinet jusqu'à neutralisation du pH.
= Etape 6 : Séchage de la chitine
La chitine est ensuite séchée pendant 24 heures, à 60 C, dans une étuve de
séchage (Binder , modèle FP53).
On obtient ainsi 8,1 0,7 g de chitine.
Il. Résultats
Les méthodes d'analyse sont identiques à celles décrites à l'Exemple 1.
Les propriétés de la chitine ainsi obtenue sont présentées dans le Tableau 5
ci-
dessous.
Cendres (g/100 g MS*) 1,825
+/- 0,40
Matières grasses (g/100 g MS*) 0 +/- 0,00
Teneur totale en aa** (g/100 g MS*) 1,105
+/- 0,18
Masse moléculaire (kg.m01-1) 799,5 +/- 53,03
*MS : matière sèche
**aa : acides aminés
Tableau 5 : Propriétés de la chitine obtenue dans l'Exemple 3
L'abondance relative en acides aminés de la chitine obtenue est présentée dans
.. le Tableau 6 ci-dessous. Elle est exprimée en /0.
Threonine (Thr) 0,00
Serine (Ser) 0,00
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Proline (Pro) 0,00
Glycine (Glu) 0,00
Acide glutamique (Glu) 0,00
Alanine (Ala) 26,56
Cystéine (Cys) 4,96
Valine (Val) 13,95
Methionine (Met) 0,00
lsoleucine (11e) 0,00
Acide aspartique (Asp) 0,00
Leucine (Leu) 0,00
Tyrosine (Tyr) 0,00
Phénylalanine (Phe) 0,00
Histidine (His) 38,71
Lysine (Lys) 15,30
Arginine (Arg) 0,00
Tryptophane (Trp) 0,52
Total 100,00
Tableau 6 : Abondance relative en acides aminés de la chitine obtenue dans
l'Exemple
3
acides aminés apparaissent particulièrement résistants au procédé, à savoir
l'alanine, la cystéine, la valine, l'histidine et la lysine. L'histidine, la
lysine et l'alanine sont
5 les 3
acides aminés les plus résistants. Les abondances relatives respectives de
l'alanine et de la valine sont nettement supérieures à celles calculées dans
l'Exemple 1.
EXEMPLE 4 : Obtention de chitine selon l'invention à partir de différents
insectes
Différents insectes ont été utilisés dans cet exemple : Tenebrio molitor,
Pachnoda marginata, Zophobas mono et Galleria mellonella.
Les cuticules ont été obtenues à partir du stade larvaire des différents
insectes
selon les étapes 1 et 2 décrites à l'Exemple 1.
Les cuticules subissent alors le traitement basique suivant : dans un tricol
de 2 L
muni d'un réfrigérant et d'un agitateur (Heidolph RZR1), on place rn, g de
cuticules
humides obtenues à l'étape précédente (Matière sèche = n1 /0), et 1,80 0,02
L de
solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (ou d'hydroxyde de potassium) de
concentration égale à 1,0 mol.L-1. Le milieu est chauffé avec un bain d'huile
à une
température de 90 2 C pendant 48 heures (24h pour G. mellonella). Pendant
toute la
réaction, le milieu réactionnel est soumis à une agitation de 300 rpm. On
utilise donc
environ 0,05 L de solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (ou d'hydroxyde de
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potassium) par gramme de matière sèche de résidu solide.
Après ce traitement basique, les étapes 4 à 6 du procédé de l'Exemple 1 sont
alors effectuées (pour P. marginata l'étape 5 est effectuée avec de l'eau
distillée).
Les conditions expérimentales sont résumées dans le Tableau 7, en particulier
le ratio base : cuticules : eau est un ratio en poids sec en g pour la base et
les cuticules,
et en poids en g pour l'eau.
Insecte Base Masse ml ril % matière Masse m'l
Ratio base :
initiale de sèche de cuticules
cuticules :
cuticules (g) sèches (g) eau
T. molitor NaOH 90,03 0,02 40,06 0,00
36,06 0,01 2 : 1 : 50
T. molitor KOH 90,33 0,18 41,23 1,63
37,24 1,44 2,7: 1:48
P. marginata NaOH 110,62 0,58 31,58 1,24
34,93 1,55 2,1 : 1 : 51
Z morio NaOH 75,11 0,07 45,29 1,63 34,02 1,24
2,1 : 1 : 53
G. mellonella NaOH 100,63 0,56 34,44 1,40
34,65 1,40 2,1 : 1 : 52
Tableau 7 : Conditions expérimentales du traitement basique de différents
insectes
Une masse m2 de chitine est finalement recueillie. Le rendement est calculé de
la manière suivante : m2/mY100 et les résultats sont indiqués dans le Tableau
8.
Insecte Masse m2de Rendement
chitine obtenue (0/0)
(g)
T. molitor 6,28 0,19 17,4 0,5
T. molitor 8,12 0,32 21,8 1,3
P. marginata 7,95 0,24 22,8 1,2
Z morio 5,93 0,78 17,4 2,2
G. mellonella 7,05 0,54 20,4 1,5
Tableau 8 : Rendements d'extraction de chitine pour différents insectes
Les chitines sont ensuite analysées selon les méthodes d'analyses indiquées au
point II de l'Exemple 1. Les résultats d'analyses sont présentés dans le
Tableau 9, dans
lequel les teneurs en cendres, lipides et acides aminés correspondent à des
teneurs en
gramme pour 100 g de matière sèche.
Source de Masse Cendres Lipides Acides aminés Pureté par
chitine molaire différence
(3/0)
(kDa)
T. molitor 1015 98 1,71 0,11 0 0,00 0,68 0,03
97,61 0,12
(NaOH)
T. molitor 886 49 2,58 0,04 0,71 0,40 0,32 0,01
96,39 0,40
(KOH)
P. 1932 66 2,56 0,13
0,33 0,25 0,25 0,07 96,86 0,29
marginata
Z morio 865 51 1,57 0,00 0,32 0,01 0,535 0,19
97,575 0,19
G. 1626 107 1,635 0,06 0 0,00 0,18 0,06
98,185 0,19
mellonella
Tableau 9 : Propriétés des chitines obtenues à partir de différents insectes
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir une chitine de masse moléculaire
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élevée, présentant également une pureté élevée, et ce, quel que soit l'insecte
ou le
traitement basique utilisé.
L'abondance relative en acides aminés des chitines obtenues est présentée dans
le Tableau 10 ci-dessous et est exprimée en pourcentages.
T. molitor T. molitor
(NaOH) (KOH) P. marginata Z morio G. mellonella
thréonine 0,000 0,000 31,955 38,261
0,000
sérine 0,000 0,000 0,000 0,000
0,000
proline 0,000 0,000 0,000 0,000
0,000
glycine 0,000 0,000 0,000 0,000
0,000
acide
glutamique 0,000 0,000 0,000 3,733
0,000
alanine 12,476 24,845 0,000 23,330
0,000
cystéine 5,871 0,000 0,000 0,000
0,000
valine 8,073 0,000 0,000 23,330
0,000
méthionine 0,000 0,000 0,000 0,000
0,000
isoleucine 0,000 0,000 0,000 0,000
0,000
acide aspartique 0,000 0,000 0,000 0,000
0,000
leucine 0,000 0,000 0,000 0,000
0,000
tyrosine 0,000 0,000 0,000 11,198
0,000
phénylalanine 0,000 0,000 0,000 0,000
0,000
histidine 44,767 0,000 0,000 0,000
0,000
lysine 28,622 74,534 67,905 0,000
99,174
arginine 0,000 0,000 0,000 0,000
0,000
tryptophane 0,191 0,621 0,140 0,149
0,826
total 100,000 100,000 100,000 100,000
100,000
Tableau 10: Abondance relative en acides aminés des chitines obtenues à partir
de
différents insectes
Les conditions du traitement basique (NaOH ou KOH) ainsi que les insectes
utilisés influent sur la composition en acides aminés de la chitine
résultante.
EXEMPLE 5 : Obtention de chitosan selon l'invention à partir de différents
insectes
= Broyage de la chitine
Chaque chitine obtenue à l'Exemple 4 est broyée finement dans un broyeur
centrifuge (Retsch ZM200) avec une grille de pores 250 iim.
= Désacétvlation de la chitine
Dans un tricol de 2 L muni d'un réfrigérant et d'un agitateur (Heidolph
RZR1),
on place une masse de m3 g de la chitine obtenue après l'étape de broyage, et
un volume
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V1 (V1 = M3*50 mL) de solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (ou d'hydroxyde
de
potassium) de concentration égale à 19 mol.L-1. Le milieu est chauffé avec un
bain
d'huile à une température de 100 2 C pendant 2 heures. Pendant toute la
réaction, le
milieu réactionnel est soumis à une agitation de 300 rpm.
= Récupération du chitosan
Le milieu réactionnel obtenu à l'issue de l'étape de désacétylation est
ensuite
filtré (Filtre SEFAR MEDIFAB 03-60/42) de sorte à récupérer le chitosan.
= Lavage du chitosan
Le chitosan récupéré est ensuite rincé à l'eau tiède du robinet jusqu'à
neutralisation du pH.
Il est ensuite remis en réaction dans un tricol contenant la même quantité de
solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (ou d'hydroxyde de potassium) et les 3
étapes
précédentes (désacétylation, récupération et lavage) sont répétées à
l'identique.
= Séchage du chitosan
Les étapes de désacétylation, récupération et lavage sont donc réalisées deux
fois au total. A l'issue de ces étapes, le chitosan est séché pendant 24
heures, à 60 C,
dans une étuve de séchage (Binder , modèle FP53). On recueille une masse m4 de
chitosan. Le rendement est calculé de la manière suivante : m4/m3*100 et les
résultats
sont résumés dans le Tableau 11. En particulier, le Tableau 11 fait référence
au ratio
base : chitine : eau qui est un ratio en poids sec en g pour la base et la
chitine, et en
poids en g pour l'eau.
Source de Base Masse Volume Ratio Masse m4
Rendement
chitine initiale m3 V1 de base : de chitosan
(0/0)
de chitine base chitine : obtenu (g)
(g) utilisé eau
(mL)
T. molitor NaOH 12,02 0,24 601 12 38: 1 : 50
8,83 0,25 73,4 0,6
(NaOH)
T. molitor KOH 13,73 0,49 686 24 53: 1 : 50
9,17 0,27 66,9 4,3
(KOH)
P. NaOH 16,78 3,51 839 175 38: 1 : 50 11,11 2,52
66,1 1,2
marginata
Z morio NaOH 13,91 0,28 696 14 38: 1 : 50 9,61 0,09
69,1 2,1
G. NaOH 16,80 0,01 840 0 38: 1 : 50 11,19 0,60
66,6 3,6
mellonella
Tableau 11 : Masses de chitine, volume de base et rendement d'obtention de
chitosan en fonction des insectes
Les chitosans sont ensuite analysés selon les méthodes d'analyses indiquées au
point II de l'Exemple 1. Les résultats d'analyses sont présentés dans le
Tableau 12, dans
lequel les teneurs en cendres, lipides et acides aminés correspondent à des
teneurs en
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gramme pour 100 g de matière sèche. Dans ce tableau, la teneur en lipides
mesurée est
à la limite de détection.
Source de Masse Cendres Lipides Acides Pureté par
chitosan molaire aminés différence
(3/0)
(kDa)
T. molitor 379 31 2,305 0,29 0,455 0,01 0,245 0,08 96,995
0,30
(NaOH)
T. molitor 593 9 1,81 0,11 0,245 0,01 0,375 0,01 97,57 0,11
(KOH)
P. 561 74 2,71 0,03 0,385 0,05 0,215 0,01 96,69 0,06
marginata
Z morio 430 11 1,24 0,16 0,53 0,01 0,26 0,06 97,97 0,17
G. 483 29 0,99 0,04 0,665 0,02 0,265 0,01 98,08 0,05
mellonella
Tableau 12 : Propriétés des chitosans obtenus à partir de différents insectes
Le procédé selon l'invention permettant d'obtenir une chitine de masse
moléculaire et pureté élevée, le chitosan résultant présente également ces
caractéristiques, même dans des conditions de désacétylation différentes.
