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WO 2019/175426
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Bioélectrode nanostructurée pour l'oxydation du glucose à partir de
composés aromatiques électrogénérés
Domaine de l'invention
La présente invention porte sur une bioélectrode nanostructurée à partir de
composés aromatiques électrogénérés ainsi que sur l'utilisation de ces
composés
aromatiques électrogénérés comme médiateur particulièrement approprié pour le
transfert d'électrons entre une enzyme de catalyse de l'oxydation du glucose
telle
que la Flavine Adénine Dinucléotide ¨ Glucose DésHydrogénase (FAD-GDH) et
une électrode.
Art antérieur
Le développement des biopiles (biofuel cells) utilisant des enzymes est
largement décrit dans la littérature (Cf. US2002/0025469 et EP2375481A1). Ces
piles à combustibles enzymatiques utilisent des biocatalyseurs, appelés
enzymes,
permettant d'effectuer une réaction d'oxydation d'un combustible (H2, alcools,
glucose, ...) à l'anode et la réduction d'un oxydant (majoritairement 02) à la
cathode.
L'avantage de l'utilisation des enzymes pour la production d'énergie est leur
grande sélectivité vis-à-vis du substrat. L'enzyme FAD-GDH présente les
propriétés
d'oxyder le glucose en acide gluconique. Cette enzyme possède un site actif à
l'intérieur de sa structure : un transfert électronique direct est donc
impossible et il
est nécessaire d'utiliser un médiateur redox afin de transférer les électrons
de
l'enzyme à l'électrode. Plusieurs approches sont décrites pour
l'immobilisation du
médiateur redox au sein de l'électrode comme l'encapsulation, la
polymérisation, le
greffage covalent. Ces études présentent généralement l'immobilisation du
médiateur dans un état d'ores et déjà actif.
Barathi et al. (Barathi, P; Senthil Kumar, A. Electrochemical Conversion of
Unreactive Pyrene to Highly Redox Active 1,2-Quinone Derivatives on a Carbon
Nanotube-Modified Gold Electrode Surface and lts Selective Hydrogen Peroxide
Sensing. Langmuir 2013, 29 (34), 10617-10623) décrit une méthode de
dégradation du pyrène en un dérivé de quinone actif. Le composé est déposé
sous
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forme de pyrène inactif sur l'électrode puis activé (oxydé) par électrochimie.
Barathi
et al. décrit également l'utilisation d'une telle électrode sur laquelle est
également
déposé un cytochrome C et du cuivre (Cu2 ). Cette électrode est utilisée en
tant
que cathode pour la réduction de l'eau oxygénée.
Les médiateurs redox doivent répondre à plusieurs critères. Le transfert
électronique doit être rapide afin de ne pas limiter le processus catalytique.
Le
médiateur redox doit être peu, ou ne doit pas, être relargué en solution. Pour
cela,
les molécules employées dans cette étude sont des molécules aromatiques car
elles présentent des très bonnes interactions vis-à-vis des nanotubes de
carbone.
Les molécules sont physisorbées par interactions de type Tr-Tr. Le potentiel
redox
de la sonde doit être supérieur au potentiel redox du site actif de l'enzyme
mais
assez proche (>50mV) afin d'obtenir une force électromotrice élevée (f.e.m =
potentiel de la cathode - potentiel de l'anode) dans les biopiles.
Description de l'invention
La présente invention porte sur l'identification et l'utilisation d'un
médiateur
redox particulièrement adapté à la fabrication d'une bioanode pour biopile
enzymatique, en particulier une biopile enzymatique comprenant une FAD-GDH.
Ce médiateur présente une bien meilleure stabilité au cours de temps par
rapport
aux médiateurs redox utilisés classiquement telle que la 1,4 naphtoquinone.
Ainsi un aspect de l'invention est une bioélectrode comprenant un matériau
conducteur à la surface duquel sont déposés des nanotubes de carbone, un
médiateur redox à base de pyrène, ou d'un de ses dérivés, oxydé in-situ et une
enzyme apte à catalyser l'oxydation du glucose. Il est à noter que le terme
glucose
utilisé ici se rapporte en particulier à l'énantiomère D-(+)-glucose
(dextrose) qui se
trouve naturellement présent dans les organismes vivants.
L'électrode selon l'invention est de préférence de type multicouches et
comprend avantageusement une couche de nanotubes de carbone, une couche de
pyrène oxydé in-situ et une couche d'enzyme apte à catalyser l'oxydation du
glucose. Les couches peuvent être déposées successivement sur un matériau
conducteur, qui peut constituer le support de ces couches ou être lui-même
déposé
sur un support inerte.
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Le matériau conducteur peut être du carbone vitreux, du graphite pyrolytique
(en
particulier du HOPG Highly Ordered Pyrolytic Graphite ) de l'or, du
platine et/ou
de l'oxyde d'indium et d'étain. De préférence le matériau est du carbone
vitreux ou
du graphite pyrolytique.
L'utilisation de nanotubes de carbone permet l'augmentation de la surface
spécifique de l'électrode (porosité) et la formation d'un réseau 3D
nanostructuré et
permet également d'assurer la conductivité au sein du matériau avec son
système
u conjugué qui permet une forte interaction non-covalente avec les oligo-
cycles
aromatiques. Le ratio surface spécifique/nombre de molécule redox est
relativement élevé et permet l'absence de passivation lors de l'étape
d'électrosynthèse. En effet il est classiquement admis que l'électro
polymérisation
de molécule organique sur des électrodes induit une passivation se traduisant
par
une diminution de la vitesse de transfert électronique. Les électrodes
poreuses à
base de nanotubes de carbone (ONT) sont réalisées en utilisant des CNTs multi-
paroi commerciaux, de préférence non fonctionnalisés. Plusieurs méthodes de
fabrication sont adaptées, et permettent de former, entre autres, soit des
feuilles
(buckypapers), soit des pastilles, soit des dépôts sur le matériau conducteur
support. Le matériau conducteur sur lequel les nanotubes de carbone sont
déposés
peut également faire partie d'une électrode microporeuse à diffusion de gaz
comprenant une couche GDL (GDL =Gas Diffusion Layer), couche qui comprend
généralement des fibres de carbone.
Les nanotubes de carbone sont des fullerènes composés d'un ou plusieurs
feuillets d'atomes de carbone enroulés sur eux-mêmes formant un tube. Le tube
peut être fermé ou non à ses extrémités par une demi-sphère. Les nanotubes de
carbone simple-feuillet (SWNT ou SWCNT, pour Single-Walled (Carbon)
Nanotubes) et/ou multi-feuillets (MWNT ou MWCNT, pour Multi-Walled (Carbon)
Nanotubes) peuvent être utilisés, bien que ces derniers soient préférés.
La combinaison du matériau conducteur et des nanotubes de carbone, qui
peuvent avantageusement être déposés sur ledit matériau sous forme d'une
couche, permet d'obtenir un support poreux apte à recevoir l'enzyme et son
médiateur particulier (le pyrène oxydé in-situ).
Le pyrène, ainsi que ses dérivés, lorsque oxydés in situ forment des
médiateurs particulièrement efficaces notamment de l'enzyme FAD-GDH. En
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particulier, le terme dérivé du pyrène désigne une molécule comprise dans
le
groupe constitué par le pyrène où au moins un atome d'hydrogène présent sur la
structure carbonée polycyclique aromatique du pyrène est substitué par au
moins
un groupement alkyle en 02-022, et en particulier par un groupement alkyle en
02-
04, tel que l'éthyle, le propyle ou le butyle. Il est également avantageux
d'éviter
d'utiliser les dérivés du pyrène comprenant des groupes amines ou hydroxyles,
ou
encore des atomes d'halogène.
Le pyrène, ou un de ses dérivés, oxydé in-situ, est un composé organique
provenant de pyrène ou d'un de ses dérivés, qui a été déposé sur l'électrode.
Une
fois déposé sur la surface de l'électrode, l'oxydation du pyrène ou de son
dérivé,
peut être effectuée soit par voltampérométrie cyclique, soit par
chronoampérométrie. Les composés formés sont un ou plusieurs type(s)
d'oxyde(s)
quinoïque(s) électroactif(s). Le pyrène, ou un de ses dérivés, oxydé in-situ
agit
comme médiateur redox de l'enzyme qui fait partie de la bioélectrode selon
l'invention.
Le médiateur obtenu in-situ peut notamment être obtenu par
chronoampérométrie et comprendre l'application à du pyrène, ou à un de ses
dérivés, déposé in-situ sur la surface de l'électrode, d'un potentiel de 1V à
ladite
électrode pendant un temps donné, de préférence allant de 10 secondes à 3
minutes, avantageusement allant de 30 secondes à 3 min.
Alternativement ou en combinaison, le pyrène, ou un de ses dérivés, oxydé in-
situ peut être obtenu par voltampérométrie cyclique et comprend l'application
à du
pyrène, ou à un de ses dérivés, déposé in-situ sur la surface de l'électrode
d'un
potentiel variant de manière cyclique de -0.4V à 1V. De préférence le nombre
de
cycles appliqués lors de cette étape varie de 3 à 20.
L'application d'un tel signal engendre la formation de liaisons cétones sur le
composé aromatique. Le mécanisme de formation n'est pas complétement résolu
et donc la nature exacte du composé formé diffère selon les différents travaux
de la
littérature notamment sur le nombre de fonctions cétones crées. Cependant
l'ensemble des travaux est en accord sur la nature quinoïque des produits de
la
réaction.
L'enzyme apte à catalyser l'oxydation du glucose est de préférence une
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glucose DésHydrogénase (GDH) catalysant la réaction :
D-glucose + accepteur ¨> D-glucono-1,5-lactone + accepteur réduit.
L'accepteur, ou co-facteur, est généralement une coenzyme de type NAD /NADP
ou flavine, comme la FAD (Flavine Adénine Dinucléotide), ou la FMN (Flavine
5 mononucléotide) qui est lié à la GDH. Une glucose déshydrogénase
particulièrement préférée est la Flavine Adénine Dinucléotide ¨ Glucose
DesHydrogénase (FAD-GDH) (EC 1.1.5.9). Le terme FAD-GDH s'étend aux
protéines natives et à leurs dérivés, mutants et/ou équivalents fonctionnels.
Ce
terme s'étend en particulier aux protéines qui ne diffèrent pas de manière
substantielle au niveau de la structure et/ou de l'activité enzymatique. Ainsi
on peut
utiliser pour l'électrode selon l'invention, en association avec un cofacteur,
une
protéine enzymatique GDH présentant une séquence d'acides aminées possédant
au moins 75%, de préférence 95%, et encore plus préférentiellement 99%
d'identité
avec la ou les séquences GDH telles que répertoriées dans les banques de
données (par exemple SWISS PROT). Une FAD-GDH d'aspergillus sp. est
particulièrement préférée et efficace mais d'autres FAD-GDH provenant de
Glomerella cingulata (GcGDH), ou une forme recombinante exprimée dans Pichia
pastoris (rGcGDH), pourraient également être utilisées.
Il est également possible de réaliser une électrode selon l'invention en
utilisant
une enzyme oxydo-réductase (EC 1.1.3.4) de type glucose oxydase (GOx, GOD)
qui catalyse l'oxydation du glucose en peroxyde d'hydrogène et en D-glucono-5-
lactone. Cette enzyme qui est une enzyme de référence pour les piles à glucose
est également liée à un co-facteur comme le FAD (Flavine Adénine
Dinucléotide).
Une glucose oxydase particulièrement préférée est la Flavine Adénine
Dinucléotide
¨ Glucose oxydase (FAD-GOx). Ce terme s'étend aux protéines natives et à leurs
dérivés, mutants et/ou équivalents fonctionnels. Le terme FAD-GOx s'étend en
particulier aux protéines qui ne diffèrent pas de manière substantielle au
niveau de
la structure et/ou de l'activité enzymatique. Ainsi on peut utiliser pour
l'électrode
selon l'invention, en association avec un co-facteur, une protéine enzymatique
GOx
présentant une séquence d'acides aminées possédant au moins 75%, de
préférence 95%, et encore plus préférentiellement 99% d'identité avec la ou
les
séquences GOx telles que répertoriées dans les banques de données (par exemple
SWISS PROT). Une FAD-GOx extraite d'aspergillus figer est particulièrement
préférée.
La FAD-GDH présente une activité plus élevée que la glucose oxydase et donc
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un courant catalytique plus élevé. Ceci est d'un grand intérêt afin
d'augmenter les
puissances générées dans les biopiles enzymatiques. Il est à noter que
contrairement à la Glucose Oxydase, l'enzyme FAD-GDH ne produit pas de
peroxyde d'hydrogène. Le peroxyde d'hydrogène en raison de ses propriétés
oxydantes peut présenter des inconvénients pour la stabilité des biopiles
(membrane, stabilité des enzymes à la cathode,...).
Un autre aspect de l'invention porte sur un procédé de fabrication d'une
bioélectrode apte à l'oxydation du glucose, ladite méthode comprenant :
a) une étape d'oxydation de pyrène, ou d'un de ses dérivés, ledit pyrène ou
ledit dérivé étant préalablement déposé sur la surface d'un matériau
conducteur,
matériau conducteur à la surface duquel sont également déposés des nanotubes
de carbone, et
b) une étape, de préférence subséquente à l'étape a), de dépôt d'une enzyme
apte à catalyser l'oxydation du glucose à la surface de ladite électrode.
Les caractéristiques structurelles de la bioélectrode selon le procédé de
l'invention
sont avantageusement telles que décrites précédemment.
Selon un aspect préféré du procédé selon l'invention, les nanotubes sont
déposés
sur le matériau conducteur par une étape dite de dropcasting.
Selon cette méthode, une solution, ou dispersion, homogène d'un produit est
déposée sur un support, puis une étape d'évaporation du solvant est effectuée
ce qui
permet le dépôt d'une couche mince dudit produit sur ledit support.
Généralement le
solvant est un solvant organique excepté pour l'enzyme.
Ainsi pour le dépôt de nanotubes de carbone, le solvant choisi peut être du N-
Méthy1-2 Pyrrolidone (NMP). La concentration de la solution/dispersion de
nanotubes
peut varier de 1 à 10 mg.mL-1, de préférence aux environs de 5 mg.mL-1. Selon
un
aspect du procédé l'électrode de matériau conducteur est orientée
verticalement lors du
dépôt des nanotubes.
Selon un autre aspect préféré de l'invention l'étape d'oxydation du pyrène est
effectuée par chronoampérométrie et peut comprendre l'application d'un
potentiel de
1V à ladite surface pendant un temps donné, de préférence allant de 10
secondes à 3
minutes, avantageusement de 30 secondes à 3 min.
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Alternativement ou en combinaison, l'étape d'oxydation du pyrène est effectuée
par voltampérométrie cyclique et peut comprendre l'application d'un potentiel
variant de
manière cyclique de -0.4V à 1V à la surface de l'électrode. De préférence le
nombre de
cycles appliqués varie de 3 à 20 pour une vitesse de balayage de 100mV.s-1.
La solution électrolytique pouvant être utilisée pour l'étape de
chronoampérométrie et/ou de voltampérométrie cyclique peut être une solution
tampon,
par exemple au phosphate. Le pH de la solution électrolytique est généralement
de 6,5
à 7,5, de préférence aux alentours de 7, ceci du fait d'une activité
enzymatique
optimale aux alentours de 7.
Selon un aspect préféré du procédé selon l'invention, le pyrène est déposé sur
une
surface de l'électrode comprenant des nanotubes de carbone également en
utilisant
une étape de dropcasting. Dans ce cas le solvant est avantageusement le
dichlorométhane. La concentration de la solution peut être choisie de 5 à 15
mM, en
particulier aux environs de 10 mM.
Selon un aspect préféré du procédé selon l'invention l'enzyme utilisée est une
Flavine Adénine Dinucléotide ¨ glucose déshydrogénase ou une Flavine Adénine
Dinucléotide ¨ glucose oxydase, telle que décrite précédemment.
Selon un autre aspect préféré du procédé selon l'invention, l'étape de dépôt
de
l'enzyme à la surface de la bioélectrode est également effectuée en utilisant
une étape
de dropcasting. Dans ce cas, le solvant est avantageusement une solution
aqueuse, de
préférence tamponnée à pH 7, La concentration de la solution peut-être de 1 à
10
mg.mL-1, de préférence de 5 mg.mL-1. Le dépôt et/ou l'évaporation du solvant
peut
avantageusement se faire à pression atmosphérique et température ambiante. Le
temps de séchage est généralement choisi de 2h à 4h.
Bien évidement l'invention porte également sur une bioélectrode obtenue
directement par le procédé selon l'invention tel que décrit précédemment ainsi
que
dans les exemples de mise en oeuvre ci-dessous. L'invention porte également
sur les
applications et utilisations d'une telle électrode dans diverses technologies.
Par
exemple l'invention porte également sur l'utilisation d'une bioélectrode selon
l'invention
en tant que bioanode apte à la fabrication d'une biopile. Une telle biopile
est
avantageusement une biopile enzymatique à combustible. Une telle biopile
comprend
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en association avec au moins une électrode selon l'invention une biocathode.
Cette
biocathode peut par exemple comprendre une enzyme permettant de réduire
l'oxygène,
par exemple à base de bilirubine oxydase ou de Laccase. Elle peut comprendre
comme
matériau conducteur un matériau de type tel que décrit précédemment et
avantageusement des nanotubes de carbone modifiés par une protoporphyrine
permettant un transfert électronique direct avec la bilirubine oxydase. Dans
le cas où
l'enzyme est la Laccase, ces nanotubes de carbone sont avantageusement
modifiés
avec un groupement hydrophobe comme l'adamantane, l'anthracène ou le pyrène.
Un
transfert électronique médié peut également être obtenu à partir de MWCNT et
la
molécule ABTS pour les deux enzymes.
Une autre utilisation de l'électrode selon l'invention porte sur son
utilisation dans un
biocapteur à glucose.
Enfin, l'invention porte également sur l'utilisation d'un dérivé du pyrène tel
que
décrit ci-dessus, à la place de ou en combinaison avec le pyrène. Le dérivé du
pyrène substitué peut être également oxydé in situ en utilisant les étapes
décrites
ci-dessus et les électrodes et piles et biocapteur à glucose, ainsi que leurs
procédés de fabrication sont également un objet de l'invention.
Un mode de réalisation de l'invention donné à titre d'exemple non limitatif et
qui
inclus des Figures annexées sur lesquelles :
- Figure 1 : (A) Voltampérogrammes d'une électrode de carbone
vitreux/MWCNT/pyrène avant (noir) et après chronoampérométrie de 1V vs.
Ag/AgCI pendant 30 secondes (tampon phosphate 0,2M pH = 7)
(B) Réponse électrochimique de l'électrosynthèse d'une électrode de carbone
vitreux/MWCNT/pyrène (noir = 1' cycle / gris = cycle de 2 à 6)
- Figure 2: (A) Voltampérogrammes d'une électrode de carbones
vitreux/MWCNT/pyrèneRedox différentes vitesses de balayage (tampon
phosphate 0,2 M pH = 7).
(B) Représente les intensités des pics anodiques et cathodiques d'une
électrode
de carbone vitreux/MWCNT/pyrèneRedox en fonction de la vitesse de balayage.
- Figure 3: (A) Voltampérogrammes d'une électrode de carbone
vitreux/MWCNT/pyrèneRedox à différents pH (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8)
(B) Représentation de l'évolution du potentiel standard en fonction du pH
d'une
électrode de carbone vitreux/MWCNT/pyrèneRedox
- Figure 4: (A) Réponse électrochimique de
l'électrode modifiée
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MWCNT/pyrèneRedox/FAD-GDH en l'absence (courbe noire) et en présence de
200 mM glucose (courbe grise)
(B) Chronoampérométrie à 0,2 V vs. Ag/AgCI de l'électrode modifiée
MWCNT/pyrèneRedox/FAD-GDH lors d'injection de glucose (1, 2, 5, 10, 20, 50,
100, 200 mM glucose) (cf. insert) Représentation de l'évolution du courant
catalytique en fonction de la concentration en glucose obtenue lors de
chronoampérométrie à 0,2 V vs. Ag/AgCI
- Figure 5: (A) Réponse électrochimique de l'électrosynthèse d'une électrode
de
carbone vitreux/MWCNT/anthracène
(B) Réponse électrochimique de l'électrosynthèse d'une électrode de carbone
vitreux/MWCNT/perylène
- Figure 6: Réponse électrochimique de l'électrode
modifiée
MWCNT/phénanthèneRedox/FAD-GDH en l'absence (courbe noire) et en
présence de 200 mM glucose (gris).
- Figure 7 : comparaison du pyrènedione avec le 1,4 naphtoquinone par CV en
termes de l'efficacité et la stabilité du transfert d'électrons (courants
catalytiques,
A et C) et en termes de la stabilité de l'activité redox après 100 cycles
(courant
non catalytique, B et D).
Réalisation d'une bioélectrode selon l'invention
Une électrode de carbone vitreux de 0,071 cm2 commerciale (vendue par Bio-
Logic,
France) est modifiée par l'ajout de nanotubes de carbone (suspension à 5 mg.mL-
1 en
nanotubes de carbone).
Cette suspension est réalisée par addition de 10 mg de nanotubes de carbone
multi-
paroi non fonctionnalisés (MWCNT NanocylTM, 97%) dans 2 mL de NMP (N-Méthy1-2-
pyrrolidone). La dispersion est placée sous agitation ultrasonique pendant 2h.
20 1.11_ de
cette suspension de MWCNT préalablement agitée sont ensuite déposés sur la
surface
de l'électrode de carbone vitreux.
L'électrode est alors placée sous vide dans un dessiccateur. L'électrode est
alors
retirée du dessiccateur lorsque le solvant est évaporé et que les nanotubes de
carbone
sont secs (en moyenne quelques heures, généralement de 3h à 5h).
Fonctionnalisation des électrodes via dropcasting par du pyrène
Après fonctionnalisation de l'électrode par les nanotubes de carbone, celle-ci
est
modifiée par l'adjonction de 20 1.11_ d'une solution concentrée à 10 mM de
pyrène
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dissous dans le dichlorométhane (conc. 5 mg/mL). Le solvant est ensuite
évaporé à
pression atmosphérique (env.100 kPa) et température ambiante (env. 250 ).
Electrosynthèse de l'électrode par chronoampérométrie et voltampérométrie
5 cyclique
L'électrode modifiée par le pyrène est placée dans une solution électrolytique
(tampon phosphate 0.2 M Na2HPO4 et 0.2M NaH2PO4 de pH 7) préalablement dégazée
sous Argon. L'électrode est alors soumise par chronoampérométrie à un courant
de 1V
10 en utilisant comme contre électrode une électrode de platine et une
électrode de
référence de type Ag/AgCI pendant 30 secondes. L'électrode est alors rincée à
l'eau
distillée afin de retirer toutes traces d'électrolyte support ou de molécules
organiques.
Il convient de noter que l'activation du pyrène a également été effectuée par
des
balayages successifs par voltampérométrie cyclique allant de -0.4V à 1V vs.
Ag/AgCl.
Le nombre de cycles variant de 3 à 20 et l'électrode est ensuite rincée à
l'eau distillée
afin de retirer toutes traces d'électrolyte support ou de molécules
organiques. Les
résultats présentés ci-dessous ont été effectués en général en utilisant
l'électrode
obtenue par chronoampérométrie mais des résultats similaires ont été obtenus
par
voltampérométrie cyclique (par exemple Figure 1 (droite)) et ces deux
électrodes sont
considérées comme étant de structures et de performances quasi-identiques.
Fonctionnalisation de l'électrode via dropcasting du biocomposé
La FAD-GDH utilisée dans cet exemple est une FAD-GDH d'aspergillus sp.
(SEKISUI DIAGNOSTICS, Lexington, MA, No. Catalogue GLDE - 70 - 1192) qui
présente les caractéristiques suivantes :
Aspect : poudre jaune lyophilisée.
Activité : > 900 U/mg poudre 37 C.
Solubilité : se dissout aisément dans l'eau à une concentration de : 10mg/mL.
Une unité d'activité : quantité d'enzyme qui va convertir une micromole de
glucose
par minute à 37 C.
Poids moléculaire (Gel Filtration) 130KD.
Poids moléculaire (SDS Page) : bande diffuse à 97 kD indicative d'une protéine
glycosylée.
Point isoélectrique : 4,4.
Valeur Km : 5.10-2 M (D-Glucose).
Cette enzyme est spécifique. D'autres sucres que le D-Glucose ont été testés à
une
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concentration de 30 mM. Le 2-Déoxy-D-Glucose présente seulement 25% d'activité
comparé à celle du D-Glucose.
Le D-Xylose présente 11%, le D-Galactose 0,7%, le D-Mannose 0,4%, le D-
Trehalose 0,2% et le D-Fructose 0,1%, d'activité comparé à celle du D-Glucose.
Le L-
Glucose, le D- Mannitol, le D-Lactose, le D-Sorbitol, le D-Ribose, le D-
Maltose et le D-
Sucrose présentent chacun moins de 0,1% d'activité comparée à celle du D-
Glucose.
Préalablement une solution à 5 mg.mL-1 de FAD-GDH est préparée dans une
solution tampon (tampon phosphate 0.2 M Na2HPO4 et 0.2 NaH2PO4 pH 7) et
stockée à
-20 C. Avant chaque dépôt, la solution est retirée du congélateur et
décongelée. 20 !IL
de cette solution sont déposés par dropcasting sur l'électrode modifiée. Le
solvant est
ensuite évaporé à pression atmosphérique (env. 100 kPa) et température
ambiante
(env. 25 C).
Caractérisation de la bioélectrode
La bioanode obtenue est utilisée dans une cellule électrolytique standard
(avec une
contre électrode de platine et une électrode de référence de type Ag/AgCI)
pour
constituer une cellule lorsque positionnée dans un milieu concentré en
glucose. Cette
cellule est étudiée ci-dessous présente les caractéristiques suivantes :
Caractérisation électrochimique
1. Electrosynthèse
La Figure 1 (gauche) représente la réponse électrochimique d'une électrode de
carbone vitreux recouverte de nanotubes de carbone et de pyrène. La courbe
noire
représente la réponse électrochimique de l'électrode, seul un courant
capacitif est
observé correspondant à la contribution des nanotubes de carbone. La courbe
grise a
été enregistrée après avoir imposé un potentiel de 1V pendant 30 secondes. Un
signal
faradique est observé à un potentiel de -0,036 V vs. Ag/AgCl. L'application
d'un
potentiel de 1V induit donc la synthèse d'une nouvelle espèce présentant des
propriétés redox.
L'expérience précédente a été réalisée en imposant un potentiel pendant un
temps
donné. Il est également possible d'électrogénérer la sonde redox par balayages
successifs. Les différents cycles électrochimiques sont représentés sur la
Figure 1
(droite). La courbe noire représente le premier cycle de balayage et les
courbes en
grise représentent les cycles suivants. On remarque lors du premier cycle
l'absence de
signal redox à -0,05V au cycle aller. Le pic redox apparait au cycle retour.
Ce
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comportement est similaire aux réactions d'électropolymérisation.
Ici il ne s'agit pas de la formation d'un polymère redox mais
d'électrosynthèse d'un
système électroactif. A des potentiels proches de 1V une oxydation du composé
se
produit formant des liaisons cétones sur les composés aromatiques qui
deviennent
alors électroactifs (schéma 1). Les molécules formées contiennent des
fonctions
quinones leur conférant des propriétés redox.
CV or CA
010 sile
1.101
=
Schéma 1 : Mécanisme supposé lors de l'oxydation du pyrène
2. Caractérisation du signal redox
La réponse électrochimique de l'électrode redox électro générée est
caractéristique
d'une espèce immobilisée à une électrode i.e. .8.E proche de OmV (10 mV à
2mV.s-1) et
intensité du pic d'oxydation et de réduction proportionnelle à la vitesse de
balayage
(Figure 2).
La nature de ce produit a également été étudiée en faisant varier le pH de la
solution
électrolytique (Figure 3). La variation du pH engendre une modulation du
potentiel
redox. La pente est de -0,056 soit proche de la valeur théorique -0,059 ceci
indique qu'il
s'agit d'un système redox mettant en jeu l'échange du même nombre de protons
que
d'électrons. Il est fort probable qu'il s'agisse d'un échange de 2 électrons
et de 2
protons comme de nombreuses sondes redox aromatiques (naphtoquinone,
anthraquinone,...). On peut donc supposer que l'électrosynthèse engendre la
formation
de fonctions cétones sur les noyaux aromatiques. Dans le cas de cette
électrode qui
est fonctionnalisée par un motif pyrène, le produit formé supposé est le 1,6
pyrènedione
ou le 1,4 pyrènedione. Le couple redox électrogénérée est donc
pyrènedione/dihydroxypyrène avec un échange à 2 électrons et 2 protons.
Cependant
la littérature (ex. P. Barathi, A. Senthil Kumar, Langmuir, 29 (2013) 10617-
10623,
suscité) diffère sur la nature exacte du composé formé et il n'est pas
forcement
possible de conclure sur le nombre de fonctions cétones formé.
Etude des propriétés catalytiques des bioélectrodes
La Figure 4 représente la réponse électrochimique de la bioanode décrite ci-
dessus
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(MWCNT/pyrèneRedox/ FAD-GDH) en l'absence et en présence de glucose. La courbe
noire en l'absence de glucose présente uniquement la réponse électrochimique
réversible de la sonde redox immobilisée. A l'inverse en présence d'une
solution
aqueuse de 200 mM de glucose, une vague d'oxydation est observée et
caractéristique
d'une activité catalytique. Le courant catalytique se produit au niveau du
potentiel de la
sonde redox. Ceci montre que la sonde redox électrogénérée permet d'assurer un
transfert électronique médié entre l'électrode et l'enzyme FAD-GDH. La Figure
de droite
montre l'évolution du courant lors d'ajout de quantités croissantes de
glucose. Le
courant maximal de catalyse de l'ordre de 1,3 mA (6,5 mA.cm-2) est atteint
pour des
concentrations en glucose de 200 mM. Ceci est également observé par l'insert
de la
Figure de droite (4B) présentant l'évolution du courant en fonction de la
concentration
qui atteint un plateau pour des concentrations de 200 mM. La constante de
Michaelis-
Menten apparente du système est de 39,8 mM.
Etudes comparatives d'autres composants polyaromatiques activés.
De manière à établir les propriétés surprenantes de l'électrode enzymatique
selon
l'invention, plusieurs études comparatives ont été réalisées en utilisant
d'autres
matériaux de base que le pyrène. Les bioanodes ont été réalisées de la même
manière et selon les mêmes étapes, que pour l'électrode au pyrène activé
décrit ci-
dessus. La méthode d'activation choisie a été la voltampérométrie cyclique
(figure 5A
et 5B) et la chronoampérométrie (figure 6) qui engendre les mêmes
comportements. La
seule modification a été la nature du composé polycyclique.
Ainsi La Figure 5 (gauche) montre la réponse électrochimique du dérivé oxygéné
d'anthracène après l'activation par voltampérométrie cyclique. La signature
correspond
exactement à celle d'anthraquinone, un produit commercial. La Figure à droite
montre
l'électrosynthèse d'un dérivé de perylène sous les mêmes conditions. Il s'agit
très
probablement d'un perylènequinone mais de tels dérivés ne sont pas
commercialisés
ce qui ne permet pas de déterminer la structure exacte. Le potentiel de ces
deux
composants (-0.5 V pour l'anthraquinone et --0.2 pour le perylènequinone) ne
permet
pas un transfert d'électron avec la FAD-GDH.
La figure 6 montre la réponse électrochimique du dérivé oxygéné de
phénanthrène
après l'activation par voltampérométrie cyclique.
Celui-ci montre un transfert
d'électrons après électro-oxydation. La signature correspond exactement à
celle de
phénanthraquinone, un produit commercial. Le courant catalytique reste
néanmoins
faible (quelques dizaines de A) comparé au pyrène électro-oxydé (plusieurs
centaines
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de A).
La figure 7 montre la comparaison d'une électrode au pyrènedione (selon
l'invention)
avec une électrode au 1,4 naphtoquinone par voltampérométrie cyclique en
termes de
l'efficacité et la stabilité du transfert d'électrons. Dans le cadre de la
réalisation de
biopiles il est nécessaire d'éviter le relargage du médiateur redox en
solution ce qui
induit une diminution des performances au cours du temps ainsi qu'une possible
pollution dans le cas de l'implantation de biopiles dans des organismes
vivants. Après
100 cycles de voltamétrie cyclique de l'électrode en présence de 200mM de
glucose, le
courant catalytique diminue de 60% pour le dérivé pyrènedione tandis qu'il
diminue de
plus de 93% dans le cas de l'électrode fonctionnalisée par le motif 1,4
naphtoquinone
(Figure 2 A et C). Une diminution de 47% et 77% du signal faradique non
catalytique
est observée respectivement pour le pyrènedione et le 1,4 napthoquinone
(Figure 2 B
et D).
Dans le cas du motif pyrène celui-ci présente certains avantages pour une
utilisation
dans les bioanodes en tant que médiateur redox pour la FAD-GDH. Le produit est
facilement électrosynthétisé et présente un transfert électronique rapide. Le
potentiel
redox du couple pyrène-quinone' pyrène-dihydroquinone a un potentiel proche du
potentiel redox du site actif de l'enzyme. En présence de l'enzyme FAD-GDH et
de
glucose, un courant de catalyse est observé (Figure 7A). Dans notre exemple,
les
courants catalytiques maximaux obtenus pour une électrode MWCNT/ pyrène-
quinone
IFAD-GDH sont de 1,4 mA. Cette vague catalytique apparait à des potentiels
proches
du potentiel redox de la FAD- GDH et permet donc d'obtenir des potentiels de
circuit
ouvert (OCV) élevé dans le cas de l'intégration de cette bioanode dans un
dispositif de
type biopile. L'OCV est un paramètre crucial pour obtenir des dispositifs
délivrant des
puissances élevées.
