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Système de culture cellulaire en bioréacteur
L'invention concerne les systèmes de culture de cellules en bioréacteur. Le
système selon
l'invention peut être utilisé pour la production de cellules d'intérêt,
d'ensembles cellulaires
(organoïdes, tissus) et/ou la production de molécules d'intérêt, ou
d'assemblages moléculaires
complexes (composants de matrices extracellulaires, organites cellulaires,
anticorps, vaccins,
exosomes, viroïdes), ou autres matériels d'intérêt provenant des cellules ou
produits par les
cellules cultivées dans de tels systèmes.
Les systèmes de culture de cellules en bioréacteur revêtent un intérêt
grandissant pour
l'industrie pharmaceutique entre autres. En effet, les cellules eucaryotes
sont de plus en plus
utilisées en tant qu'outil thérapeutique, notamment en thérapie cellulaire et
tissulaire, et en tant
qu'outil de bioproduction de molécules d'intérêt, depuis des fractions
protéiques (insuline,
anticorps, etc.), en passant par les complexes de protéines, lipides et sucres
issus des cellules
ou les organites cellulaires, les vésicules extracellulaires et les exosomes,
jusqu'aux dérivés
viraux (pour la production de vaccins notamment). Les systèmes de culture de
cellules en
bioréacteur permettent de cultiver en masse ces cellules et de répondre ainsi
aux besoins en
cellules et/ou molécules d'intérêt à l'échelle industrielle.
Actuellement, il existe trois grandes classes de méthodes de culture de
cellules en bioréacteur:
- Les méthodes permettant la culture par lots ( batch ), dans lesquelles
les cellules sont
ensemencées dans un volume fixe de milieu de culture. Après un temps de
culture adéquat
pour permettre une croissance suffisante, les molécules et/ou cellules sont
récoltées. Le
problème majeur de ces méthodes est que les nutriments présents dans le milieu
s'épuisent
au cours du temps, et que les métabolites toxiques s'accumulent ;
- Les méthodes permettant la culture en lots nourris ( fed batch ), dans
lesquelles du milieu
de culture est rajouté au fur et à mesure pour nourrir les cellules tout en
gardant une densité
cellulaire acceptable. Le problème principal de ces systèmes est que les
déchets du
métabolisme ne sont pas retirés et s'accumulent dans le bioréacteur, ce qui
finit par affecter
le rendement ;
- Les méthodes permettant la culture en perfusion, dans lesquelles le
milieu de culture est
changé en continu, afin de nourrir les cellules et d'éliminer les déchets. De
tels systèmes
permettent un plus haut rendement mais le changement rapide et continu du
milieu de
culture nécessite de retenir les cellules sans les endommager (stress
mécanique généré par
le flux).
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Dans l'état de l'art, ces méthodes de bioproduction de masse ne sont pas ou
peu applicables aux
cellules fragiles ou aux assemblages cellulaires fragiles. En effet, en
suspension, en agrégat ou
sur des micro-carriers, les cellules et les assemblages cellulaires sont
directement exposés dans
le milieu de culture aux contraintes mécaniques (choc, stress de cisaillement,
pression, etc.).
Lorsque les volumes deviennent importants, les forces mécaniques utilisées
pour brasser ou
faire circuler le milieu peuvent détruire les cellules ou les assemblages
cellulaires notamment
par le stress de cisaillement appliqué par les flux de liquide ou l'impact
avec les éléments
mobiles qui brassent le milieu.
Résumé de l'invention
En travaillant sur ces problématiques de culture cellulaire en bioréacteur,
les inventeurs ont
découvert qu'il est possible de ménager un espace de culture au sein de
microcompartiments
délimités par une couche externe en hydrogel pour cultiver un grand nombre de
cellules au sein
d'un bioréacteur. La niche cellulaire d'intérêt est ainsi entourée d'une coque
d'hydrogel laissant
avantageusement infiltrer les nutriments et exfiltrer les protéines et
métabolites mais conservant
les éléments dont la taille dépasse 150KDa (matrice extracellulaire, exosomes,
particules
virales, cellules). En outre, les cellules étant protégées des contraintes
pouvant exister au sein
du réacteur par la coque d'hydrogel, le flux au travers du bioréacteur peut
être aussi fort que la
coque d'hydrogel peut le soutenir. En outre, la coque d'hydrogel des
microcompartiments
cellulaires, contrairement aux systèmes de culture existants, préserve les
cellules des contraintes
mécaniques liées aux collisions et prévient les fusions des éléments
multicellulaires (agrégats,
micro-carriers) qui existent lors de la culture en suspension liquide, et qui
causent des
problèmes de reproductibilité en faisant varier les conditions locales
ressenties par les cellules
(distance de diffusion au milieu, contraintes mécaniques). Les
microcompartiments sont en
suspension dans le bioréacteur, ce qui permet un accès au milieu de culture et
une diffusion
dans les microcompartiments homogènes, ainsi qu'une bonne convection. De plus,
la niche
cellulaire étant protégée par la coque d'hydrogel, il est possible de cultiver
les types cellulaires
les plus fragiles dans les conditions de rendement optimal avec une mort
cellulaire faible et un
phénotype bien contrôlé. Contrairement au simple sphéroïde enchâssé dans un
gel, la cavité
dans la capsule laisse la place aux cellules de se multiplier et/ou de s'auto-
organiser sur de la
matrice extra-cellulaire. Avantageusement, chaque microcompartiment comprend
une unique
niche cellulaire. Autrement dit, une coque d'hydrogel donnée entoure une seule
niche cellulaire.
La couche externe des microcompartiments étant en hydrogel, elle peut
facilement être dissoute
pour récupérer les cellules à l'issue de la production. Ces microcompartiments
étant en 3D, ils
permettent avantageusement une amplification cellulaire dans le
microcompartiment d'un
facteur pouvant aller jusqu'à 100.000.
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L'invention a donc pour objet un système de culture cellulaire en bioréacteur
comprenant une
enceinte close contenant une pluralité de microcompartiments cellulaires, dans
lequel les
microcompartiments comprennent chacun une couche externe en hydrogel ménageant
une
cavité contenant un ensemble de cellules autoorganisées et de la matrice
extracellulaire ou un
substitut de matrice extra-cellulaire.
Selon l'invention, une couche externe en hydrogel entoure un ensemble de
cellules. La couche
en hydrogel forme une capsule creuse, ménageant une cavité contenant
l'ensemble de cellules.
Avantageusement, la capsule d'hydrogel contient un unique ensemble de
cellules.
Selon l'invention, la pluralité de microcompartiments cellulaires est en
suspension dans
l'enceinte du bioréacteur. Plus particulièrement, les microcompartiments
flottent dans le milieu
de culture contenu dans l'enceinte du bioréacteur.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel système de culture
cellulaire en
bioréacteur, comprenant une enceinte close, pour la production et/ou
amplification de cellules
d'intérêt. L'amplification est avantageusement d'un facteur 2 à 100.000 entre
chaque passage.
Ce facteur d'amplification correspond au nombre de cellules vivantes récolté à
l'issue de
l'amplification, divisé par le nombre de cellules vivantes ensemencé.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel système de culture
cellulaire en
bioréacteur pour la production de molécules d'intérêt et/ou d'assemblages
moléculaires
complexes, tels que des composants de matrices extracellulaires, organites
cellulaires,
anticorps, vaccins, exosomes, viroïdes, etc., lesdites molécules et/ou
assemblages étant excrétés
par les cellules des microcompartiments hors desdits microcompartiments jusque
dans le milieu
de culture, ou inversement accumulés à l'intérieur du microcompartiment pour
une récolte
ultérieure.
L'invention a aussi pour objet un procédé de production d'organoïdes ou de
cellules d'intérêt
comprenant les étapes selon lesquelles :
- on introduit une pluralité de microcompartiments cellulaires dans un
bioréacteur, comprenant
une enceinte close, lesdits microcompartiments comprenant chacun une couche
externe en
hydrogel encapsulant des cellules et de la matrice extracellulaire ou un
substitut de matrice
extra-cellulaire ;
- on cultive les microcompartiments dans des conditions permettant la
multiplication des
cellules à l'intérieur des microcompartiments, et/ou l'auto organisation des
cellules en
organoïdes ;
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- on récupère les microcompartiments cellulaires ;
- et optionnellement, on hydrolyse la couche d'hydrogel pour récupérer les
organoïdes ou les
cellules d'intérêt.
L'invention a aussi pour objet un procédé de production de cellules
différenciées à partir de
cellules multipotentes, pluripotentes ou totipotentes comprenant les étapes
selon lesquelles :
- on introduit une pluralité de microcompartiments cellulaires dans un
bioréacteur, lesdits
microcompartiments comprenant chacun une couche externe en hydrogel
encapsulant des
cellules multipotentes, pluripotentes ou totipotentes et de la matrice
extracellulaire ou un
substitut de matrice extra-cellulaire ;
- on cultive les microcompartiments dans des conditions permettant la
multiplication des
cellules à l'intérieur des microcompartiments, et/ou la différenciation dans
un ou des types
cellulaires d'intérêt ;
- on récupère les microcompartiments cellulaires ;
- et optionnellement, on hydrolyse la couche d'hydrogel pour récupérer le
ou les types
cellulaires d'intérêt.
Description détaillée
Les inventeurs ont découvert qu'il est possible et particulièrement avantageux
de cultiver des
cellules au sein d'un réacteur comprenant une enceinte close, en maintenant
les cellules à
l'intérieur d'une capsule externe en hydrogel réticulé. Plus précisément, les
inventeurs ont mis
au point des microcompartiments cellulaires comprenant chacun une couche
externe en
hydrogel encapsulant un ensemble de cellules autoorganisées et de la matrice
extracellulaire ou
un substitut de matrice extra-cellulaire. Selon l'invention, les
microcompartiments cellulaires
sont en suspension dans le bioréacteur.
Selon l'invention, on entend par cellules autoorganisées un ensemble de
cellules positionnées
de manière particulière les unes par rapport aux autres pour créer des
interactions et
communications cellulaires et former une microstructure tridimensionnelle
d'intérêt. Chaque
microcompartiment comprend ainsi une couche externe d'hydrogel, ou capsule
d'hydrogel,
renfermant un ensemble de cellules autoorganisées. Les cellules peuvent se
multiplier,
s'organiser et/ou se différencier au sein de la capsule d'hydrogel.
Dans un mode de réalisation, la capsule d'hydrogel renferme un unique ensemble
de cellules
autoorganisées. Par unique, on entend que la capsule ne contient qu'un groupe
de cellules, qui
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peut être plus ou moins cohésif Notamment, un ensemble de cellules unique
s'entend d'une
structure cellulaire tridimensionnelle dans laquelle chaque cellule dudit
ensemble est en contact
avec physique avec au moins une autre cellule dudit ensemble.
Selon l'invention, il est possible d'encapsuler toutes sortes de cellules
eucaryotes, et plus
particulièrement des cellules de mammifères. Notamment, les cellules sont
choisies parmi les
cellules différenciées, les progéniteurs, les cellules souches, les cellules
multipotentes, les
cellules pluripotentes, les cellules totipotentes, les cellules génétiquement
modifiées, et leurs
mélanges etc. Dans un mode de réalisation, les cellules encapsulées sont des
cellules souches
pluripotentes, choisies notamment parmi les cellules souches embryonnaires
et/ou les cellules
induites à la pluripotence (IPS). Dans un mode de réalisation, les cellules
encapsulées sont des
cellules souches embryonnaires, notamment des cellules souches embryonnaires
pluripotentes.
Dans un mode de réalisation, les cellules encapsulées sont des cellules
souches embryonnaires,
à l'exclusion des cellules souches embryonnaires humaines ayant nécessité la
destruction d'un
embryon humain. Dans un autre mode de réalisation, les cellules encapsulées
sont des cellules
souches embryonnaires humaines issues d'embryons humains surnuméraires conçus
dans le
cadre d'une procréation médicalement assistée ne faisant plus l'objet d'un
projet parental, dans
le respect des lois bioéthiques en vigueur au moment et dans le pays de
prélèvement desdites
cellules souches embryonnaires. Dans un autre mode de réalisation, les
cellules encapsulées
sont des cellules induites à la pluripotence (IPS), et notamment des cellules
humaines induites
à la pluripotence (hIPS). Dans un autre mode de réalisation, les cellules
encapsulées sont des
cellules souches embryonnaires et des cellules induites à la pluripotence.
Dans un mode de
réalisation, les cellules encapsulées comprennent un mélange de cellules
souches
embryonnaires et de cellules induites à la pluripotence.
Dans le contexte de l'invention, la couche externe d'hydrogel , ou coque
d'hydrogel ,
désigne une structure tridimensionnelle formée à partir d'une matrice de
chaînes de polymères
gonflée par un liquide, et préférentiellement de l'eau. Une telle couche
externe d'hydrogel est
obtenue par réticulation d'une solution d'hydrogel. Avantageusement, le ou les
polymères de
la solution d'hydrogel sont des polymères réticulables lorsque soumis à un
stimulus, tel qu'une
température, un pH, des ions, etc. Avantageusement, la solution d'hydrogel
utilisée est
biocompatible, en ce sens qu'elle n'est pas toxique pour les cellules. La
couche d'hydrogel
permet avantageusement la diffusion de gaz dissous (et notamment d'oxygène
et/ou de dioxyde
de carbone), de nutriments, et de déchets métaboliques pour permettre la
survie, la prolifération,
la différenciation, la maturation des cellules et/ou la production de
molécules ou d'assemblages
moléculaires d'intérêt et/ou la récapitulation de comportements cellulaires
d'intérêt. Les
polymères de la solution d'hydrogel peuvent être d'origine naturelle ou
synthétique. Par
exemple, la solution d'hydrogel contient un ou plusieurs polymères parmi les
polymères à base
de sulfonate, tel que le polystyrène sulfonate de sodium, les polymères à base
d'acrylate, tel
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que le polyacrylate de sodium, le polyéthylène glycol diacrylate, le composé
gélatine
méthacrylate, les polysaccharides, et notamment les polysaccharides d'origine
bactérienne, tels
que la gomme gellane, ou d'origine végétale, tels que la pectine ou
l'alginate. Dans un mode
de réalisation, la solution d'hydrogel comprend au moins de l'alginate.
Préférentiellement, la
.. solution d'hydrogel ne comprend que de l'alginate. Dans le contexte de
l'invention, on entend
par alginate des polysaccharides linéaires formés à partir de 13-D-
mannuronate (M) et a-L-
guluronate (G), des sels et dérivés de ceux-ci. Avantageusement, l'alginate
est un alginate de
sodium, composé à plus de 80% de G et moins de 20% de M, avec une masse
moléculaire
moyenne de 100 à 400 kDa (par exemple : PRONOVAO SLG100) et une concentration
totale
comprise entre 0.5% et 5% en masse volumique (poids/volume).
Selon l'invention, le microcompartiment cellulaire est clos. C'est la couche
externe en hydrogel
qui confère sa taille et sa forme au microcompartiment cellulaire. Le
microcompartiment peut
avoir n'importe quelle forme compatible avec l'encapsulation de cellules.
Préférentiellement, la couche de matrice extracellulaire forme un gel. La
couche de matrice
extracellulaire comprend un mélange de protéines et de composés
extracellulaires nécessaires
à la culture cellulaire, par exemple de cellules pluripotentes.
Préférentiellement, la matrice
extracellulaire comprend des protéines structurelles, telles que de la
laminine 521, 511 ou 421,
de l'entactine, de la vitronectine, des laminines, du collagène, ainsi que des
facteurs de
croissance, tels que du TGF-béta et/ou de l'EGF. Dans un mode de réalisation,
la couche de
matrice extracellulaire consiste en, ou contient du Matrigel0 et/ou de la
Geltrex0.
Selon l'invention, le microcompartiment peut contenir, à la place de la
matrice extracellulaire,
un substitut de matrice extra-cellulaire. Un substitut de matrice
extracellulaire s'entend d'un
composé capable de favoriser l'attachement et/ou la survie des cellules en
interagissant avec
les protéines de membranes et/ou les voies de transduction du signal
extracellulaire. Par
.. exemple, un tel substitut comprend les polymères biologiques et leurs
fragments notamment les
protéines (laminines, vitronectines, fibronectines et collagènes), les
glycosaminoglycanes non
sulfatés (acide hyaluronique) ou sulfatés (chondroïtine sulfate, dermatane
sulfate, kératane
sulfate, héparane sulfate), et polymères synthétiques contenant des motifs
issus des polymères
biologiques ou reproduisant leurs propriétés (motif RGD) et les petites
molécules mimant
l'attachement à un substrat (inhibiteurs de Rho-A kinase tel que Y-27632 ou
thiazovivin).
Toute méthode de production de microcompartiments cellulaires contenant à
l'intérieur d'une
capsule d'hydrogel de la matrice extracellulaire et des cellules peut être
utilisée pour la mise en
oeuvre du procédé de préparation selon l'invention. Notamment, il est possible
de préparer des
microcompartiments en adaptant la méthode et le dispositif micro fluidique
décrits dans
Alessandri et al., 2016 ( A 3D printed microfluidic device for production of
functionalized
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hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem
Cells
(hNSC) , Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604).
Avantageusement, les dimensions du microcompartiment cellulaire sont
contrôlées. Dans un
mode de réalisation, le microcompartiment cellulaire selon l'invention a une
forme sphérique.
Préférentiellement, le diamètre d'un tel microcompartiment est compris entre
10 ium et 1 mm,
plus préférentiellement entre 50 ium et 500 ium, encore plus
préférentiellement inférieur à 500
ium, de manière préférée inférieur à 400 m. Dans un autre mode de
réalisation, le
microcompartiment cellulaire selon l'invention a une forme allongée.
Notamment, le
microcompartiment peut avoir une forme ovoïde ou tubulaire. Avantageusement,
la plus petite
dimension d'un tel microcompartiment ovoïde ou tubulaire est comprise entre 10
ium et 1 mm,
plus préférentiellement entre 50 ium et 500 ium, encore plus
préférentiellement inférieure à 500
ium, de manière préférée inférieure à 400 m. Par plus petite dimension ,
on entend le double
de la distance minimale entre un point situé sur la surface externe de la
couche en hydrogel et
le centre du microcompartiment.
Dans un mode de réalisation particulier, l'épaisseur de la couche externe en
hydrogel représente
5 à 40% du rayon du microcompartiment. L'épaisseur de la couche de matrice
extracellulaire
représente 5 à 80 % du rayon du microcompartiment et est avantageusement
accrochée sur la
face interne de la coque en hydrogel. Cette couche de matrice peut combler
l'espace entre les
cellules et la coque en hydrogel. Dans le contexte de l'invention,
l'épaisseur d'une couche
est la dimension de ladite couche s'étendant radialement par rapport au centre
du
microcompartiment.
Dans un mode de réalisation de l'invention, le bioréacteur comprend des
microcompartiments
dans lesquels les cellules sont autoorganisées en cyste.
Dans le contexte de l'invention, on désigne par cyste au moins une couche de
cellules
pluripotentes ou totipotentes organisées autour d'une lumière centrale. Selon
l'invention, un tel
microcompartiment comprend donc successivement, autour d'une lumière centrale,
ladite
couche de cellules pluripotentes, une couche de matrice extracellulaire, ou
d'un substitut de
matrice extra-cellulaire, et la couche externe en hydrogel. La lumière est
générée, au moment
de la formation du cyste, par les cellules qui se multiplient et se
développent en couches sur la
couche de matrice extracellulaire. Avantageusement, la lumière contient un
liquide et plus
particulièrement du milieu de culture.
Selon l'invention, un cyste contient avantageusement une ou plusieurs couches
de cellules
souches pluripotentes d'un mammifère, humain ou non humain. Une cellule souche
pluripotente, ou cellule pluripotente, s'entend d'une cellule qui a la
capacité de former tous les
tissus présents dans l'organisme d'origine entier, sans pour autant pouvoir
former un organisme
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entier en tant que tel. Notamment, un cyste peut contenir des cellules souches
embryonnaires
(ESC), des cellules souches induites à la pluripotence (IPS), ou des cellules
MUSE
( Multilineage-differentiating Stress Enduring ) que l'on trouve dans la
peau et la moelle
osseuse des mammifères adultes.
Avantageusement, l'épaisseur de la couche externe en hydrogel représente 5 à
40% du rayon
du microcompartiment, l'épaisseur de la couche de matrice extracellulaire
représente 5 à 80 %
du rayon du microcompartiment et l'épaisseur de la couche de cellule
pluripotentes représente
environ 10% du rayon du microcompartiment. La couche de cellules pluripotente
est en contact
au moins en un point avec la couche de matrice extra cellulaire, un espace
rempli par du milieu
de culture peut être présent entre la couche de matrice et le cyste. La
lumière représente alors
de 5 à 30% du rayon du microcompartiment. Dans un exemple particulier, le
microcompartiment cellulaire a une forme sphérique de rayon égal à 100um. La
couche en
hydrogel a une épaisseur de 5um à 40um. La couche de matrice extracellulaire a
une épaisseur
de 5um à environ 80um. La couche de cellules pluripotentes aune épaisseur de
10 à 30 ium, la
.. lumière ayant un rayon de 5 à 30 ium, environ.
Selon un exemple de réalisation de l'invention, il est possible de cultiver en
bioréacteur par
exemple de 150mL de tels microcompartiments, dans lesquels les cellules
forment des cystes,
selon les étapes ci-dessous :
(a) incuber de 600.000 à 2 millions de cellules souches pluripotentes de
mammifère dans un
milieu de culture contenant un inhibiteur des voies RHO/ROCK ;
(b) mélanger ces cellules souches pluripotentes issues de l'étape (a) avec une
matrice
extracellulaire ;
(c) encapsuler le mélange de l'étape (b) dans une couche d'hydrogel ;
(d) cultiver les capsules obtenues à l'étape (c) dans un milieu de culture
contenant un inhibiteur
des voies RHO/ROCK ;
(e) rincer les capsules issues de l'étape (d), de manière à éliminer
l'inhibiteur des voies
RHO/ROCK ;
(f) cultiver dans un mode de production de type fed-batch les capsules issues
de l'étape (e)
pendant 3 à 20 jours, préférentiellement 5 à 10 jours, en diluant le volume de
milieu d'un facteur
deux chaque jour avec un milieu de culture de cellules pluripotentes tel que
le MTESR1
(Stemcell technologies) dépourvu d'inhibiteur des voies RHO/ROCK, et
optionnellement
récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
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L'homme du métier saura adapter le nombre de cellules et le volume du
bioréacteur en fonction
des besoins.
L'étape (a) d'incubation et l'étape (d) de culture dans un milieu contenant un
ou plusieurs
inhibiteurs des voies RHO/ROCK ( Rho-associated protein kinase ), tels que
du thiazovivin
(( ;Nf=OS) et/ou Y-27632 (Ci4H2iN30) permettent de promouvoir la survie des
cellules
souches pluripotentes, et l'adhérence des cellules à la matrice
extracellulaire au moment de la
formation de la couche externe d'hydrogel autour de ladite matrice
extracellulaire. Il est
toutefois souhaitable que ces étapes soient limitées dans le temps, afin que
les inhibiteurs des
voies RHO/ROCK n'empêchent pas la formation des cystes.
Ainsi, préférentiellement, l'incubation de l'étape (a) est conduite pendant un
temps compris
entre quelques minutes et quelques heures, préférentiellement entre 2 minutes
et 2 heures, plus
préférentiellement entre 10 minutes et 1 heure.
De même, préférentiellement, l'étape (d) de culture est conduite pendant un
temps compris
entre 2 et 48 heures, préférentiellement pendant un temps compris entre 6 et
24 heures, plus
préférentiellement pendant un temps compris entre 12 et 18 heures.
L'étape (e) est nécessaire pour garantir l'élimination de toute trace
d'inhibiteurs des voies
RHO/ROCK. L'étape (e) est par exemple réalisée par rinçage, et
préférentiellement par
plusieurs rinçages, dans des milieux de cultures successifs exempts
d'inhibiteurs des voies
RHO/ROCK.
Avantageusement, l'étape (f) est conduite pendant un temps suffisant pour
obtenir un
microcompartiment cellulaire dans lequel les couches de matrice
extracellulaire et de cellules
pluripotentes présentent une épaisseur cumulée égale à 50 à 100% de
l'épaisseur de la couche
externe en hydrogel. Tout milieu de culture adapté à la culture de cellules
souches pluripotentes
peut être utilisé.
Dans un mode de mise en oeuvre, le procédé selon l'invention comprend une
étape intermédiaire
(a') consistant à dissocier les cellules souches pluripotentes issues de
l'étape (a) avant l'étape
(b), préférentiellement au moyen d'un réactif exempt d'enzyme.
Avantageusement, ledit réactif
est inhibé ou rincé avant l'étape d'encapsulation, notamment par rinçage
successif dans un
milieu spécifique pour cellules pluripotentes. Par exemple, le réactif utilisé
est le ReLeSRO.
Bien entendu, il est également possible d'utiliser de la trypsine ou un
réactif contenant une
enzyme, mais le taux de survie des cellules pluripotentes à l'issue de cette
étape peut alors être
moindre comparativement à l'utilisation d'un réactif exempt d'enzyme.
Alternativement, de tels microcompartiments peuvent être obtenus selon les
étapes ci-dessous :
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(A) mélanger des cellules différenciées de mammifères avec une matrice
extracellulaire et des
agents de reprogrammation cellulaire ;
(B) encapsuler le mélange de l'étape (A) dans une couche d'hydrogel ;
(C) cultiver les capsules issues de l'étape (B) pendant au moins 3 jours, et
optionnellement
récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
Par exemple, les cellules différenciées utilisées sont des fibroblastes, des
cellules mononucléées
sanguines périphériques, des cellules épithéliales et plus généralement des
cellules issues de
biopsie liquides ou solides de tissus humain.
L'homme du métier sait procéder à la reprogrammation d'une cellule
différenciée en une cellule
souche en réactivant l'expression des gènes associés au stade embryonnaire au
moyen de
facteurs spécifiques. A titre d'exemples, on peut citer les méthodes décrites
dans Takahashi et
al., 2006 ( Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and
adult fibroblast
cultures by defined factors Cell, 2006 Vol 126, pages 663-676) et dans la
demande
internationale W02010/105311 ayant pour titre Production of reprogrammed
pluripotent
cells .
Les agents de reprogrammation sont avantageusement co-encapsulés avec les
cellules
différenciées, de manière à concentrer le produit et à favoriser le contact
avec l'ensemble des
cellules.
Les agents de reprogrammation permettent d'imposer aux cellules une succession
de
changements phénotypiques jusqu'au stade pluripotent. Avantageusement, l'étape
(A) de
reprogrammation est réalisée en utilisant des milieux de cultures spécifiques,
favorisant ces
changements phénotypiques. Par exemple, les cellules sont mis en culture dans
un premier
milieu comprenant 10% de sérum humain, ou bovin, dans un milieu minimum
essentiel de
Eagle (DMEM) supplémenté avec un inhibiteur des récepteurs sérine/thréonine
protéine kinase
(tel que le produit SB-431542 (C22H16N403)), un ou plusieurs inhibiteurs des
voies RHO/ROCK
( Rho-associated protein kinase ), tels que du thiazovivin et/ou Y-27632,
des facteurs de
croissance des fibroblastes, tel que du FGF-2, de l'acide ascorbique et des
antibiotiques, tels
que le Trichostatin A (C17H22N203). Puis le milieu de culture est remplacé par
du milieu
favorisant la multiplication des cellules pluripotentes, tel que le milieu
mTeSR01.
De tels cystes peuvent ensuite être forcés dans une voie de différentiation
d'intérêt, de manière
à obtenir des microcompartiments contenant un ou plusieurs types cellulaires
d'intérêt,
notamment pour la production de molécules d'intérêt, ou la production
d'organoïdes d'intérêt.
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Dans un mode de réalisation, le bioréacteur comprend des microcompartiments
comprenant des
cellules autoorganisées en organoïdes.
Dans le contexte de l'invention, on désigne par organoïde une structure
multicellulaire
organisée en trois dimensions de manière à reproduire la microstructure d'au
moins une partie
d'un organe. Selon l'invention, un tel microcompartiment comprend donc une
structure
multicellulaire en 3 dimensions, entourée de matrice extracellulaire, le tout
étant encapsulé dans
la couche externe en hydrogel.
Selon l'invention, les organoïdes peuvent être obtenus en encapsulant des
cellules pluripotentes
ou progéniteurs qui sont ensuite différenciées à l'intérieur de la capsule
d'hydrogel, ou en
encapsulant directement des cellules différenciées ou des cellules matures.
Dans un mode de réalisation, les microcompartiments cellulaires introduits
dans le bioréacteur
contiennent des cellules pluripotentes. Une étape de différenciation
cellulaire en au moins un
type cellulaire d'intérêt est alors réalisée à l'intérieur du bioréacteur, et
optionnellement une
étape de multiplication desdites cellules différenciées dans les
microcompartiments.
Dans un mode de réalisation, les microcompartiments cellulaires introduits
dans le bioréacteur
contiennent des cellules déjà différenciées ou des progéniteurs. Une étape de
multiplication
et/ou de maturation desdites cellules différenciées dans les
microcompartiments est alors
réalisée à l'intérieur du bioréacteur.
Avantageusement, les microcompartiments introduits dans le bioréacteur ont une
densité
cellulaire initiale inférieure à 10% d'occupation du volume interne des
microcompartiments,
préférentiellement inférieure à 1%, encore plus préférentiellement inférieure
à 0.1%.
Avantageusement, les microcompartiments récupérés à l'issue de l'étape de
culture dans le
bioréacteur ont une densité cellulaire supérieure à 10% d'occupation du volume
interne des
microcompartiments.
Selon l'invention, les cellules contenues dans les capsules d'hydrogel sont
soumises au flux de
milieu contenu dans le bioréacteur et qui passe à travers la couche
d'hydrogel.
Avantageusement, le ratio volume convectif à l'extérieur des
microcompartiments sur volume
diffusif à l'intérieur des microcompartiments est compris entre 1 et 10.000,
préférentiellement
entre 1 et 1000, plus préférentiellement entre 1 et 100.
Selon l'invention, le volume convectif désigne le volume de milieu de culture
à l'intérieur de
l'enceinte du réacteur, entre les microcompartiments. Les microcompartiments
étant en
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suspension dans le bioréacteur, le volume convectif représente ainsi le milieu
circulant entre les
microcompartiments. A l'inverse, le volume diffusif désigne le volume de
milieu de culture
diffusant à l'intérieur des microcompartiments, c'est-à-dire dans le ou les
espaces/les vides
ménagés autour/entre/par les cellules une fois autoorganisées.
Ainsi, dans le cas d'un microcompartiment contenant un cyste, le volume
diffusif est
principalement constitué par la lumière centrale et au début de la croissance
dudit cyste, de
l'espace entre la paroi de la capsule et le cyste. Dans le cas d'un
microcompartiment contenant
un organoïde, le volume diffusif est principalement constitué des espaces
ménagés au sein de
la structure multicellulaire en 3 dimensions.
Les microcompartiments selon l'invention sont avantageusement caractérisés par
la présence
au sein de la capsule d'hydrogel d'une ou plusieurs lumières, ou un ou
plusieurs espaces,
dépourvu(e)s de cellules et permettant justement la multiplication ou l'auto-
organisation des
cellules à l'intérieur du microcompartiment. L'homme du métier saura récolter
les cellules au
moment le plus adéquat pour son procédé d'amplification ou de différenciation
correspondant
à un certain niveau de saturation de l'espace optimal dans ce cadre.
Dans un mode de réalisation, les microcompartiments occupent entre 0,01% et
74% du volume
de l'enceinte du bioréacteur.
L'utilisation de microcompartiments cellulaires permet de cultiver les
cellules dans n'importe
quel type de bioréacteur, muni d'une enceinte close, et notamment dans un
bioréacteur en mode
d'alimentation par batch , en mode d'alimentation par fed batch ou en
mode
d'alimentation continu (perfusion). L'utilisation de ces microcompartiments
est
particulièrement avantageuse dans le cas de culture en mode d'alimentation
continu. En effet,
les cellules étant protégées par la coque d'hydrogel, il est possible de les
soumettre à des flux
continus, sans risque de les fragiliser.
Dans un mode de réalisation, le bioréacteur comprend une enceinte pouvant être
fermée
hermétiquement. Cela permet de contrôler l'atmosphère à l'intérieur du
bioréacteur, et par
exemple de cultiver les microcompartiments sous atmosphère inerte.
Le système de culture cellulaire selon l'invention peut comporter une enceinte
ayant un volume
compris entre 1 mL et 10 000L, préférentiellement entre 5 mL et 10.000 L,
entre 10 mL et
10.000 L, entre 100 mL et 10.000 L, entre 200 mL et 10.000 L, entre 500 mL et
10.000 L. Dans
un mode de réalisation, l'enceinte a un volume d'au moins 1 mL. Dans un mode
de réalisation,
l'enceinte a un volume d'au moins 10 mL. Dans un mode de réalisation,
l'enceinte a un volume
d'au moins 100 mL. Dans un mode de réalisation, l'enceinte a un volume d'au
moins 500 mL.
Dans un mode de réalisation, l'enceinte a un volume d'au moins 1 L. Dans un
mode de
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réalisation, l'enceinte a un volume d'au moins 10 L. Dans un mode de
réalisation, l'enceinte a
un volume de 100 L, ou plus. Avantageusement, tout bioréacteur comprenant une
enceinte
close, et apte à produire à l'échelle industrielle des cellules, organoïdes,
molécules et/ou
assemblages molécules complexes peut être utilisé.
D'une manière générale, l'utilisation d'une enceinte close permet un contrôle
fin de
l'environnement de culture, sans risque de perturbation par l'environnement
extérieur. Il est par
ailleurs aisé d'obtenir des produits stériles. Cela permet également un
meilleur rendement
volumétrique.
Dans un mode de réalisation, les microcompartiments comprennent entre 10% et
98% en
volume de cellules à la récolte, soit entre 100 et 1.000.000 de cellules
suivant le diamètre du
compartiment concerné et la taille des cellules produites, ce qui peut être
calculé en réalisant le
rapport entre le nombre total de cellules produites (tel que mesuré par
l'homme de l'art ave une
cellule de Malassez ou un compteur de cellules automatisé) et le nombre de
capsules obtenu
(tel que mesuré par l'homme de l'art en caractérisant le volume de capsules
par comptage
manuel sous un microscope optique ou par une analyse d'image automatisée).
Bien entendu, il
est possible de commencer la culture cellulaire avec des microcompartiments
comprenant un
nombre plus restreint de cellules au départ, et notamment entre 1 et 1.000
cellules, soit 0.01%
et 10% en volume occupé par les cellules au sein du microcompartiment suivant
le diamètre du
compartiment concerné et la taille des cellules produites. Plus généralement,
les
.. microcompartiments selon l'invention comprennent entre 0,01% et 98% en
volume de cellules.
Les cellules peuvent ensuite se multiplier à l'intérieur du microcompartiment
et
s'autoorganiser, notamment en organoïdes.
Dans un mode de réalisation, les cellules d'un microcompartiment sont toutes
du même type
cellulaire. Selon l'invention, on considère que les cellules d'un même
microcompartiment sont
toutes du même type cellulaire si au moins 50%, préférentiellement 70%, plus
préférentiellement 90%, encore plus préférentiellement 98% ou plus des
cellules dudit
microcompartiments ont le même phénotype, suivant les connaissances de l'homme
de l'art
permettant de caractériser ce type cellulaire. Dans un autre mode de
réalisation, les cellules
d'un microcompartiment sont d'aux moins deux types cellulaires différents.
Avantageusement,
entre 20 et 100% des cellules d'un compartiment présentent un même phénotype.
Selon l'invention, il est possible de cultiver au sein d'un même bioréacteur
des
microcompartiments comprenant tous les mêmes types cellulaires, ou inversement
présentant
des types cellulaires différents. Par exemple, le bioréacteur peut contenir
deux types de
microcompartiments, contenant chacun un type cellulaire particulier.
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Le système de culture selon l'invention est particulièrement avantageux pour
la production
et/ou l'amplification de cellules d'intérêt. En effet, l'organisation des
cellules au sein de la
capsule d'hydrogel, avec la matrice extracellulaire, permet leur
multiplication d'un facteur 2 à
100.000 entre chaque passage.
Par passage, on entend la manipulation des cellules pour ajouter de l'espace
ou de la surface de
culture afin de continuer l'amplification ou de lancer la différenciation ou
l'auto-organisation
en organoïdes. Cette opération peut nécessiter dans l'exemple des micro-
carriers de recharger
le bioréacteur avec de nouveaux micro-carriers. Pour la culture standard à
deux dimensions de
cellules souches pluripotentes, adhérentes, cette opération consiste à
détacher les cellules de
l'ancien support de culture afin de réensemencer un nouveau support de culture
avec plus de
surface, pour l'homme de l'art cette opération peut entraîner la perte de 50%
des cellules. Pour
la culture en microcompartiments selon l'invention, cela correspond à la
dissociation des
microcompartiments, la dissociation des ensemble cellulaires autoorganisés ou
à leur dispersion
en ensembles cellulaires suffisamment petits pour être encapsulés à nouveau
dans de nouveaux
microcompartiments.
L'invention a notamment pour objet l'utilisation d'un tel système de culture
cellulaire en
bioréacteur pour la production de masse de cellules pluripotentes.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel système de culture
cellulaire en
bioréacteur pour la production de progéniteurs unipotents ou multipotents à
partir de cellules
pluripotentes.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel système de culture
cellulaire en
bioréacteur pour la production de cellules terminalement différenciées (c'est-
à-dire
correspondant à une ou des fonctions spécifiques) à partir de cellules
pluripotentes et/ou de
progéniteurs unipotents ou multipotents et/ou de combinatoires de ces
progéniteurs.
L'invention a notamment pour objet un procédé de production d'organoïdes ou de
cellules
d'intérêt comprenant les étapes selon lesquelles :
- on introduit une pluralité de microcompartiments cellulaires dans un
bioréacteur comprenant
une enceinte close, lesdits microcompartiments comprenant chacun une couche
externe en
hydrogel encapsulant des cellules et de la matrice extracellulaire ou un
substitut de matrice
extra-cellulaire ;
- on cultive les microcompartiments dans des conditions permettant la
multiplication des
cellules à l'intérieur des microcompartiments, et/ou l'auto-organisation des
cellules en
organoïdes ;
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- on récupère les microcompartiments cellulaires
- et optionnellement, on hydrolyse la couche d'hydrogel pour récupérer les
organoïdes ou les
cellules d'intérêt.
L'homme du métier est à même d'adapter les conditions de culture au type
cellulaire des
microcompartiments, afin de favoriser leur multiplication et/ou auto-
organisation.
Dans un mode de réalisation, les microcompartiments cellulaires introduits
contiennent des
cellules pluripotentes, ledit procédé comprenant, à l'intérieur du
bioréacteur, une étape de
différenciation cellulaire en au moins un type cellulaire d'intérêt et une
étape de multiplication
desdites cellules différenciées dans les microcompartiments. Par exemple, la
production
d'organoïdes d'endoderme primitif pour l'étude de la différenciation en tissus
endodermiques
humains peut être réalisée selon le protocole suivant :
- A partir de l'étape f) d'obtention de microcompartiments, décrite ci-
dessus, à 2-3 jour de
culture :
- Mise en culture en bioréacteur clos de 150mL dans un milieu STEMdiffrm
Pancreatic stage
1 du STEMdiffrm Pancreatic Progenitor Kit commercialisé par STEMCELL
technologies
pendant 3 à 6 jours.
- Utilisation de l'endoderme primitif obtenu pour des études
développementales.
Dans un autre mode de réalisation, les microcompartiments cellulaires
introduits contiennent
des cellules déjà différenciées ou des progéniteurs, ledit procédé comprenant,
à l'intérieur du
bioréacteur, une étape de multiplication desdites cellules différenciées dans
les
microcompartiments.
Lors de l'étape de multiplication et/ ou de maturation, les cellules vont
avantageusement
s'autoorganiser en un organoïde spécifique, selon une organisation propre
audit type cellulaire.
Dans un mode de réalisation concernant l'amplification, les microcompartiments
introduits
dans le bioréacteur ont une densité cellulaire inférieure à 10% d'occupation
du volume interne
des microcompartiments, préférentiellement 1% encore plus préférentiellement
0.1%. Les
cellules vont ensuite se multiplier à l'intérieur des microcompartiments, lors
de l'étape de
culture.
Dans un mode de réalisation concernant la différenciation et/ou la maturation
sans
amplification, les microcompartiments introduits dans le bioréacteur ont une
densité cellulaire
supérieure à 1% d'occupation du volume interne des microcompartiments. Les
cellules vont
ensuite se différencier et/ou maturer et/ou s'autoorganiser à l'intérieur des
microcompartiments,
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lors de l'étape de culture. Par exemple, un premier type de production
d'organoïdes neuraux
pour la greffe de neurones dans le cadre de la thérapie cellulaire de la
maladie de Parkinson a
été réalisée selon le protocole suivant :
- Décongélation de 5 millions de progéniteurs dopaminergiques tels que ceux
commercialisés
par Cellular Dynamics international (iCe110 DopaNeurons),
- Encapsulation de progéniteurs neuraux pré-différenciés selon le protocole
décrit dans
Alessandri et Al. 2016.
- Mise en culture en bioréacteur clos de 150mL dans le milieu de culture
fourni par Cellular
Dynamics.
- Maturation et structuration des organoïdes neuraux dopaminergiques pendant
deux
semaines au sein du bioréacteur.
- Préparation de la greffe par dissociation de la capsule d'hydrogel à
l'aide de deux rinçages
de trente secondes dans 1 mL de ReLeSRO (Stemcell technologies) puis
resuspension dans
une solution de 11% en masse de dextran 70KDa dans le milieu de culture des
neurones,
distribution dans une canule en verre fabriquée par nos soins.
- Greffe dans un animal modèle de la maladie de Parkinson.
Dans un mode de réalisation combinant amplification et
différenciation/maturation, les
microcompartiments introduits dans le bioréacteur ont avantageusement une
densité cellulaire
inférieure à 10% d'occupation du volume interne des microcompartiments,
préférentiellement
1% encore plus préférentiellement 0.1%. Les cellules vont ensuite se
multiplier à l'intérieur des
microcompartiments, lors de l'étape de culture puis lors de l'étape de
différenciation. Les
cellules vont ensuite s'autoorganiser à l'intérieur des microcompartiments,
lors d'une seconde
étape de culture qui peut être déclenchée par un changement de la nature du
milieu nutritif ou
d'un déclencheur physique (température, illumination). Par exemple, un second
type de
production d'organoïdes neuraux pour la greffe de neurones dans le cadre de la
thérapie
cellulaire de la maladie de Parkinson a été réalisé selon le protocole suivant
:
- A partir de l'étape f) d'obtention de microcompartiments décrite ci-
dessus à 2-3 jour de
culture :
- Mise en culture en bioréacteur clos de 150mL dans un milieu d'induction
neurale contenant
des inhibiteurs des voies de signalisation BMP2 (Dorsomorphin 2 ILLM ou LDN
193189 0.5
ILLM) et TGFbeta (+SB 431542 10 LM), 24(S),25-epoxycholesterol 10 ILLM sur
base
neurobasal/DMEM-F12 complémenté N2 et B27 pendant 1 à 2 jours.
- Mise en culture en bioréacteur clos de 150mL dans un milieu de
régionalisation neurale
contenant des inhibiteurs des voies de signalisation BMP2 (Dorsomorphin 2 ILLM
ou LDN
193189 0.5 ILLM) et TGFbeta (+SB 431542 10 LM), deux activateurs de la voie
SHH (SHH
200 ng/mL ; Purmorphamine 1 itM) et du FGF8 (100 ng/ml), un inhibiteur de la
voie WNT
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Chir99021 3 LM), 24(S),25-epoxycholesterol 10 ILLM sur base neurobasal/DMEM-
F12
complémenté N2 et B27 pendant 6 jours.
- Mise en culture en bioréacteur clos de 150mL dans un second milieu de
régionalisation
neurale contenant un inhibiteur de la voie de signalisation BMP2 (Dorsomorphin
2 ILLM ou
LDN 193189 0.5 LM), un inhibiteur de la voie WNT Chir99021 3 LM), 24(S),25-
epoxycholesterol 10uM sur base neurobasal/DMEM-F12 complémenté N2 et B27
pendant
1 jours.
- Mise en culture en bioréacteur clos de 150mL dans un milieu de maturation
et structuration
des organoïdes neuraux dopaminergiques pendant deux semaines au sein du
bioréacteur
contenant AMP cyclique (500 M) + acide ascorbique (200 M) + GDNF (20ng/mL) +
BDNF (20ng/mL) + FGF-20 (5ng/mL) + TGFbeta (lng/mL) + trichostatine (10nM) +
Compound E (1 M).
- Préparation de la greffe par dissociation de la capsule d'hydrogel à
l'aide de deux rinçages
de trente secondes dans 1 mL de ReLeSRO (Stemcell technologies) puis
resuspension dans
une solution de 11% en masse de dextran 70KDa dans le milieu de culture des
neurones,
distribution dans une canule en verre fabriquée par nos soins.
- Greffe dans un animal modèle de la maladie de Parkinson.
Dans un autre mode de réalisation combinant amplification et
différenciation/maturation, les
microcompartiments introduits dans le bioréacteur ont avantageusement une
densité cellulaire
inférieure à 10% d'occupation du volume interne des microcompartiments,
préférentiellement
1% encore plus préférentiellement 0.1%. Les cellules vont ensuite se
multiplier à l'intérieur des
microcompartiments. Les cellules sont alors récupérées par dissolution de la
capsule, puis
soumise à une seconde étape d'encapsulation suivie de l'étape de
différenciation, les cellules
vont ensuite s'autoorganiser à l'intérieur des microcompartiments, lors d'une
seconde étape de
culture qui peut être déclenchée par un changement de la nature du milieu
nutritif ou d'un
déclencheur physique (température, illumination). Par exemple, la production
d'organoïdes de
pancréas humain pour la greffe de tissus pancréatiques humains a été réalisée
selon le protocole
suivant :
- A partir de l'étape f) d'obtention de microcompartiments décrite ci-
dessus à 2-3 jours de
culture :
- Mise en culture en bioréacteur clos de 150mL dans un milieu STEMdiffrm
Pancreatic stage
1 complémenté par le complément lA et le complément 1B du STEMdiffrm
Pancreatic
Progenitor Kit commercialisé par STEMCELL technologies pendant 1 jours.
- Mise en culture en bioréacteur clos de 150mL dans un milieu STEMdiffrm
Pancreatic stage
1 complémenté par le complément 1B du STEMdiffrm Pancreatic Progenitor Kit
commercialisé par STEMCELL technologies pendant 1 jours.
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- Mise en culture en bioréacteur clos de 150mL dans un milieu STEMdiffTm
Pancreatic stage
2-4 complémenté par le complément 2A et le complément 2B du STEMdiffTm
Pancreatic
Progenitor Kit commercialisé par STEMCELL technologies pendant 1 jours.
- Mise en culture en bioréacteur clos de 150mL dans un milieu STEMdiffTm
Pancreatic stage
2-4 complémenté par le complément 2A et le complément 2B du STEMdiffTm
Pancreatic
Progenitor Kit commercialisé par STEMCELL technologies pendant 2 jours.
- Mise en culture en bioréacteur clos de 150mL dans un milieu STEMdiffTm
Pancreatic stage
2-4 complémenté par le complément 3 du STEMdiffTm Pancreatic Progenitor Kit
commercialisé par STEMCELL technologies pendant 3 jours.
- Mise en culture en bioréacteur clos de 150mL dans un milieu STEMdiffTm
Pancreatic stage
2-4 complémenté par le complément 3 du STEMdiffTm Pancreatic Progenitor Kit
commercialisé par STEMCELL technologies pendant 5 jours.
- Préparation de la greffe par dissociation de la capsule d'hydrogel à
l'aide de deux rinçages
de trente secondes dans lmL de ReLeSRO (Stemcell technologies) puis
resuspension dans
une solution de 11% en masse de dextran 70KDa dans le milieu précédent,
distribution dans
une canule en verre fabriquée par nos soins.
- Greffe dans un animal modèle du diabète de type 1.
Avantageusement, les microcompartiments récupérés à l'issue de l'étape de
culture dans le
bioréacteur ont une densité cellulaire supérieure à 10% d'occupation du volume
interne des
microcompartiments, préférentiellement supérieure à 50%, et pouvant aller dans
le cas des
organoïdes jusqu'à 98% d'occupation.
Le système de culture selon l'invention est également particulièrement
intéressant pour la
production de molécules d'intérêt et/ou d'assemblages moléculaires complexes,
lesdits
molécules et/ou d'assemblages moléculaires complexes étant excrétés par les
cellules des
microcompartiments hors desdits microcompartiments jusque dans le milieu de
culture, ou
inversement accumulées à l'intérieur du microcompartiment pour une récolte
ultérieure. Cette
méthode de production permet notamment de limiter les étapes de filtration des
éléments
cellulaires en les concentrant à l'intérieur des microcompartiments. Cette
méthode permet grâce
à la séparation dans le bioréacteur du volume convectif et du volume diffusif
par la capsule une
ségrégation facilitée du milieu contenant les éléments dissous des éléments
non solubles ou
d'une taille supérieure à la maille de l'hydrogel de la capsule (typiquement
150 à 250 KDa pour
l'alginate).
Selon l'invention, les microcompartiments sont alors avantageusement utilisés
dans un réacteur
en mode d'alimentation continu. Comme exposé ci-dessus, la présence de la
coque d'hydrogel
protectrice permet de perfuser le milieu de culture avec un débit sans risque
d'endommager les
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cellules. Il est notamment possible de perfuser l'intérieur du réacteur en
milieu de culture avec
un débit compris entre 0,001 et 100 volumes de cellules contenues dans le
bioréacteur par jour.
