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WO 2020/053362 PCT/EP2019/074424
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Procédé de culture d'un microorganisme d'intérêt et installation associée
Domaine de l'invention
La présente invention s'applique au domaine de la culture de
biomasse microbienne en autotrophie et hétérotrophie.
Plus particulièrement, la présente invention vise un procédé de culture
d'au moins un microorganisme d'intérêt, en hétérotrophie ou mixotrophie, et
une installation de culture notamment adapté pour la mise en oeuvre dudit
procédé de culture.
Etat de l'art
L'hétérotrophie est la nécessité pour un organisme vivant de se nourrir
de constituants organiques préexistants. La notion d'hétérotrophie s'oppose à
celle d'autotrophie qui est le mode de nutrition des organismes vivants qui
peuvent se nourrir uniquement d'aliments inorganiques en présence d'une
source d'énergie externe, par exemple la lumière (photoautotrophie).
La mixotrophie quant à elle, est le mode de nutrition d'organismes
vivants caractérisé par le fait qu'ils sont capables de se nourrir soit par
autotrophie soit par hétérotrophie soit par les deux modes trophiques
simultanément ou encore par une photosynthèse bactérienne primitive.
Lorsque l'on souhaite produire ou mettre en oeuvre une souche pure,
les procédés hétérotrophiques ou mixotrophiques en milieu ouvert ne sont
aujourd'hui pas appliqués. En effet, le milieu ouvert implique généralement la
survenue de contaminations des cultures par divers microorganismes
contaminants qui affectent le rendement en matière du procédé de culture du
fait de la consommation par le ou les microorganismes contaminants, des
nutriments destinés aux microorganismes d'intérêt. Ces microorganismes
contaminants affectent également la qualité attendue du produit final
(biomasse
de microorganismes d'intérêt) du simple fait de leur présence significative.
Ce risque de contamination est aujourd'hui maîtrisé grâce au
confinement des procédés et à la stérilisation des équipements. Cependant, les
coûts d'investissement et d'opération de ces procédés de culture pour qu'ils
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soient réalisés dans des conditions aseptiques sont importants et ont une
incidence directe sur le coût de production des microorganismes d'intérêt
considérés ou de leurs métabolites.
Il parait donc avantageux de trouver une solution permettant la
production de microorganismes d'intérêt avec un rendement acceptable au
niveau industriel, en milieu de culture ouvert ou fermé, sans avoir à se
soucier
des conditions de stérilisation dudit milieu et des équipements de culture.
Exposé de l'invention
A cet effet, selon un premier aspect, la présente invention vise un
procédé de culture d'au moins un microorganisme d'intérêt, en hétérotrophie
ou mixotrophie, dans un milieu de culture aqueux, des microorganismes
contaminants se développant naturellement dans ledit milieu de culture,
caractérisé en ce qu'il comprend :
- une étape de prélèvement d'une portion du milieu de culture
comprenant le microorganisme d'intérêt et des microorganismes
contaminants ;
- une étape de séparation physique du microorganisme d'intérêt et
des microorganismes contaminants au sein de ladite portion de
milieu de culture ;
- une étape de lyse des microorganismes contaminants ainsi
séparés de sorte à produire un lysat ;
- une étape de réintroduction dudit lysat dans le milieu de culture.
On entend par milieu de culture un milieu comportant des nutriments
permettant le développement du microorganisme d'intérêt et des
microorganismes contaminants.
On entend par portion , un volume prélevé par unité de temps, par
exemple par jour ou par heure. Ainsi, on peut considérer le terme portion
comme un débit quotidien ou horaire, c'est-à-dire un volume prélevé
respectivement par jour ou par heure, dans le milieu de culture. Ce volume est
de préférence, par jour, supérieur ou égal à une fois le volume du milieu de
culture et, de manière préférable, supérieur ou égal à trois fois le volume du
milieu de culture. Encore de préférence, la portion prélevée correspond à un
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volume prélevé par heure supérieur ou égal à 1 /24ème du volume total du
milieu
de culture.
Ce volume prélevé quotidiennement permet de maintenir une quantité
de microorganisme d'intérêt et de microorganismes contaminants compatible
avec un fonctionnement correct du procédé objet de la présente invention.
Ce procédé de culture a pour avantage de permettre la culture en
milieu ouvert ou fermé de microorganismes d'intérêt sans affecter le rendement
en microorganisme d'intérêt car, les contaminants étant normalement gênants
pour la culture en milieu ouvert, sont utiles au développement du ou des
microorganismes d'intérêt selon le procédé objet de la présente invention. En
effet, le lysat de microorganismes contaminant représente un apport nutritif
assimilable pour le microorganisme d'intérêt, notamment en carbone
organique. La culture en milieu ouvert étant permise par ce procédé de
culture,
les coûts d'investissement et d'opération dudit procédé sont avantageusement
minimisés du fait que des conditions aseptiques ne sont pas nécessaires.
Suivant des modes de mise en oeuvre préférés, l'invention répond en
outre aux caractéristiques suivantes, réalisées séparément ou en chacune de
leurs combinaisons techniquement opérantes.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier, l'étape de séparation
physique comporte une étape de filtration ou séparation gravitaire de sorte à
obtenir de façon séparée le microorganisme d'intérêt d'une part et les
microorganismes contaminants d'autre part.
Selon un mode de mise en oeuvre particulier, le microorganisme
d'intérêt séparé par l'étape de séparation est réintroduit dans le milieu de
culture, seul ou en mélange avec le lysat.
Selon un mode de mise en oeuvre particulier, le milieu de culture
aqueux est initialement dépourvu de carbone organique.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier dans lequel le procédé de
culture est en mixotrophie, et dans lequel le milieu de culture aqueux est
initialement dépourvu de carbone organique, le microorganisme d'intérêt est
laissé en culture autotrophe pendant un temps t avant l'étape de prélèvement.
De préférence, le temps t est choisi de sorte à obtenir une
concentration en microorganisme d'intérêt dans le milieu de culture comprise
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entre 5.105 cellules par millilitre et 1.107 cellules par millilitre. En
outre, la
culture en autotrophie pendant le temps t permet avantageusement de valider
l'état physiologique correct du microorganisme d'intérêt et d'établir des
données de référence quant à ses performances de croissance.
Un passage du mode autotrophie au mode mixotrophie est réalisé par
le mélange du lysat de microorganismes contaminants avec le microorganisme
d'intérêt, ledit lysat fournissant notamment un apport nutritif en carbone
organique au microorganisme d'intérêt. Le mode hétérotrophie est d'autant
plus renforcé par une étape d'apport de carbone organique, fournit par une
autre source que le lysat de microorganismes contaminants, dans milieu de
culture.
A cet effet, selon un mode de mise en oeuvre particulier, le procédé
comporte une étape d'apport de carbone organique dans le milieu de culture.
Cet apport de carbone organique peut être réalisé directement dans le milieu
de culture, dans le lysat, au microorganisme d'intérêt séparé par la
séparation
physique, dans le mélange lysat/microorganisme d'intérêt séparé, ou dans une
combinaison d'au moins deux de ces derniers.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier, le procédé de culture
comprend une étape de concentration des microorganismes contaminants
séparés par l'étape de séparation physique. L'étape de concentration des
microorganismes contaminants est avantageuse en ce qu'elle permet une lyse
d'un plus grand nombre de microorganismes contaminants lors de l'étape de
lyse.
Selon un exemple de mise en oeuvre particulier, l'étape de
concentration comporte une étape de filtration ou séparation gravitaire de
sorte
à obtenir de façon séparée les microorganismes contaminants
concentrés d'une part et du milieu de culture dépourvu de microorganismes
contaminants d'autre part. Cela a pour avantage de permettre le recyclage du
milieu de culture dépourvu de microorganismes contaminants. De plus cela a
notamment pour avantage de réduire les coûts de la lyse du fait d'une
diminution du volume de microorganismes contaminants à lyser suite à la
concentration.
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Dans un mode de mise en oeuvre particulier, le milieu de culture
comporte plusieurs microorganismes d'intérêt différents, ledit procédé
comportant en amont de l'étape de séparation physique, une étape préalable
d'isolement d'un seul type de microorganismes d'intérêt choisi ou d'un
5
ensemble de microorganismes d'intérêts différents choisis au sein de ladite
portion prélevée, de sorte que lorsque cette portion fait l'objet de la
séparation
physique elle ne comprend que ledit seul type de microorganismes d'intérêt
choisi ou ledit ensemble de microorganismes d'intérêts différents choisis.
Selon un mode de mise en oeuvre particulier, le procédé de culture
comprend un cycle répété de ses étapes. Dans un exemple de mise en oeuvre,
le procédé comporte un cycle répété d'au moins les étapes de prélèvement, de
séparation physique, de lyse et de réintroduction. De préférence ledit cycle
répété comporte également l'étape de concentration, et/ou l'étape d'apport de
carbone organique.
Du fait de ce mélange de modes trophiques au sein d'un procédé de
culture cyclique, on peut qualifier le procédé objet de la présente invention
de
procédé de culture d'au moins un microorganisme d'intérêt en cyclotrophie.
Selon un exemple de mise en oeuvre préféré, ledit au moins un
microorganisme d'intérêt est la cyanobactérie Aphanizomenon flos-aquae
(AFA).
Selon un deuxième aspect, la présente invention vise une installation
de culture d'au moins un microorganisme d'intérêt, en hétérotrophie ou
mixotrophie, comportant :
- au moins un compartiment de culture ouvert ou fermé configuré
pour recevoir un milieu de culture aqueux, ledit au moins un
microorganisme d'intérêt et des microorganismes contaminants ;
- au moins un appareil de séparation configuré pour effectuer au
moins une séparation physique du microorganisme d'intérêt et des
microorganismes contaminants au sein d'une portion du milieu de
culture ;
- un dispositif de lyse configuré pour effectuer une lyse des
microorganismes contaminants séparés par la séparation physique
de sorte à produire un lysat ;
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- des moyens de transports configurés pour au moins :
o prélever une portion du milieu de culture comprenant le
microorganisme d'intérêt et des microorganismes
contaminants ;
o réintroduire ledit lysat dans le compartiment de culture.
Les avantages, buts et caractéristiques particuliers de l'installation
objet de la présente invention étant similaires à ceux du procédé objet de la
présente invention, ils ne sont pas rappelés ici.
Suivant des modes de réalisation préférés, l'invention répond en outre
aux caractéristiques suivantes, mises en oeuvre séparément ou en chacune de
leurs combinaisons techniquement opérantes.
Dans un mode de réalisation particulier, les moyens de transports sont
en outre configurés pour unifier le lysat avec le microorganisme d'intérêt
isolé
par la séparation physique, de sorte à former un mélange, et réintroduire
ledit
mélange dans le compartiment de culture.
Dans un mode de réalisation particulier, les moyens de transports sont
en outre configurés pour apporter du carbone organique au milieu de culture
directement dans le compartiment de culture, dans le lysat, dans le mélange
lysat/microorganisme d'intérêt séparé ou au microorganisme d'intérêt séparé
par la séparation physique. Cet apport de carbone organique provient d'une
autre source que le lysat de microorganismes contaminants.
Dans un mode de réalisation particulier, l'installation de culture
comporte au moins un système de concentration configuré pour concentrer les
microorganismes contaminants isolés par la séparation physique.
Dans un mode de réalisation particulier, les moyens de transport
comportent des moyens :
- de générer un premier flux de milieu de culture comprenant le
microorganisme d'intérêt et des microorganismes contaminants, du
compartiment de culture vers l'appareil de séparation ;
- de générer un deuxième flux du microorganisme d'intérêt sortant
de l'appareil de séparation ;
- de générer un troisième flux de microorganismes contaminants de
l'appareil de séparation vers le système de concentration ;
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- de générer un quatrième flux de microorganismes contaminants
concentrés du système de concentration vers le dispositif de lyse ;
- de générer un cinquième flux de milieu de culture dépourvu de
microorganismes contaminants du système de concentration vers
le compartiment de culture ;
- de générer un sixième flux de lysat du dispositif de lyse vers le
compartiment de culture ;
- de générer un septième flux de carbone organique sortant d'un
réservoir de carbone organique ;
- d'unifier le deuxième flux, le sixième flux et le septième flux de
sorte à former un huitième flux unique courant vers le
compartiment de culture.
Dans un mode de réalisation particulier, l'installation de culture
comporte un dispositif de purge de microorganismes contaminants. De
préférence il s'agit d'un dispositif de purge de microorganismes contaminants
concentrés.
Dans un mode de réalisation particulier, l'installation de culture
comporte un dispositif de purge de milieu de culture dépourvu de
microorganismes contaminants et de microorganisme d'intérêt.
Dans un mode de réalisation particulier, l'installation de culture
comporte un dispositif de récolte du microorganisme d'intérêt.
Présentation des figures
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante,
donnée à titre d'exemple nullement limitatif, et faite en se référant aux
figures
qui représentent :
- Figure 1 : illustre les étapes comprises par le procédé de culture
objet de la présente invention selon des modes de mise en oeuvre.
- Figure 2 : illustre une installation de culture objet de la présente
invention selon un mode de réalisation.
- Figure 3 : graphe de l'évolution de la concentration massique en
Aphanizomenon flos-aquae (AFA) dans le temps au sein d'un
milieu de culture selon la mise en oeuvre du procédé objet de la
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présente invention en autotrophie ou en mixotrophie avec
réintroduction de différentes concentrations en lysat.
Description détaillée de l'invention
On note dès à présent que les figures ne sont pas à l'échelle.
De manière plus générale, la portée de la présente invention ne se
limite pas aux modes de mise en oeuvre et de réalisation décrits ci-dessus à
titre d'exemples non limitatifs, mais s'étend au contraire à toutes les
modifications à la portée de l'homme de l'art. Chaque caractéristique d'un
mode de réalisation peut être mise en oeuvre isolément ou combinée à toute
autre caractéristique de tout autre mode de réalisation de manière
avantageuse.
La figure 1 illustre un procédé 20 de culture d'au moins un
microorganisme d'intérêt, en hétérotrophie ou mixotrophie, dans un milieu de
culture aqueux, des microorganismes contaminants se développant
naturellement dans ledit milieu de culture, selon un mode particulier de mise
en
oeuvre. Le procédé comporte une étape 21 de prélèvement d'une portion du
milieu de culture comprenant le microorganisme d'intérêt et des
microorganismes contaminants. De préférence, le procédé 20 est réalisé en
mixotrophie, le milieu de culture aqueux étant initialement dépourvu de
carbone
organique et le microorganisme d'intérêt est laissé en culture autotrophe
pendant un temps t avant l'étape 21.
Le procédé 20 comporte une étape 22 de séparation physique du
microorganisme d'intérêt et des microorganismes contaminants au sein de la
portion du milieu de culture.
La réalisation de l'étape 22 de séparation physique peut être basée
sur une différence morphologique ou phénotypique entre les microorganismes
d'intérêt et les microorganismes contaminants. Par exemple, il peut s'agir
d'une
différence de taille, de forme, de propriétés de surface, de densité, de
propension à l'agrégation ou à la floculation.
Selon un exemple de mise en oeuvre l'étape 22 de séparation
physique comporte une étape de filtration ou séparation gravitaire de sorte à
obtenir de façon séparée les microorganismes contaminants concentrés d'une
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part et du milieu nutritif d'autre part. Un exemple de filtration utilisée
dans un
mode de mise en oeuvre préféré est la filtration tangentielle ou encore la
filtration frontale. La filtration peut être effectuée à l'aide d'une
membrane.
Le procédé 20 comporte en outre une étape 23 facultative de
concentration des microorganismes contaminants isolés dans l'étape 22.
L'étape 23 facultative de concentration des microorganismes
contaminants peut se baser sur une caractéristique morphologique ou
phénotypique des microorganismes contaminants. Par exemple, il peut s'agir
de leur taille, de leur forme, de leurs propriétés de surface, de leur
densité, de
leur propension à s'agréger ou à floculer.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré l'étape 23 de concentration
comporte une étape de filtration ou séparation gravitaire de sorte à obtenir
de
façon séparée les microorganismes contaminants concentrés d'une part et du
milieu de culture dépourvu de microorganismes contaminants d'autre part.
Comme pour la séparation physique, dans un mode de mise en oeuvre
particulier, un exemple de filtration utilisée est la filtration tangentielle
ou encore
la filtration frontale, et la filtration peut notamment être effectuée à
l'aide d'une
membrane.
Le procédé 20 comporte une étape 24 de lyse des microorganismes
contaminants séparés par la séparation physique de sorte à produire un lysat.
Ce lysat représente avantageusement des nutriments assimilables par le
microorganisme d'intérêt, notamment du carbone organique. Dans un mode de
mise en oeuvre particulier, l'étape 24 de lyse peut comprendre une lyse
chimique et/ou une lyse thermique et/ou une lyse mécanique, des
microorganismes contaminants.
Le procédé 20 comporte également une étape 25 de réintroduction
dudit lysat dans le milieu de culture.
Selon un exemple de réalisation préféré, l'étape 25 est réalisée de
sorte que le lysat est réintroduit dans le milieu de culture en mélange avec
le
microorganisme d'intérêt isolé par l'étape 22 de séparation physique.
Enfin, le procédé 20 comporte une étape 26 facultative d'apport de
carbone organique au milieu de culture. Ce carbone organique provient d'une
source autre que le lysat de microorganismes contaminants. En effet, cet
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apport de carbone organique de l'étape 26 est un apport supplémentaire à
l'apport de nutriments (dont du carbone organique) présents dans le lysat de
microorganismes contaminants.
De préférence, l'étape 26 d'apport de carbone organique dans le
5 milieu de culture se fait par introduction dudit carbone organique dans
le
mélange lysat et microorganisme d'intérêt, dans le lysat seul, dans le
microorganisme d'intérêt isolé par l'étape 22 de séparation physique ou dans
le
milieu de culture aqueux directement.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré, le procédé comporte un
10 cycle répété des étapes 21 à 26, les étapes 23 et 26 restants
facultatives.
Selon un exemple de mise en oeuvre dans lequel le procédé de culture
est en hétérotrophie, l'étape 26 d'apport de carbone organique est introduite
dans un cycle Cl des étapes 21 à 25, après la mise en oeuvre d'au moins un
cycle Cl, créant ainsi un cycle C2 des étapes 21 à 26 qui est par la suite
répété autant de fois que nécessaire.
Selon un exemple de mise en oeuvre dans lequel le procédé 20 de
culture est en mixotrophie, avec le milieu de culture aqueux initialement
dépourvu de carbone organique et le microorganisme d'intérêt laissé en culture
autotrophe pendant un temps t avant l'étape 21, l'étape 26 d'apport de carbone
organique est introduite dès la mise en oeuvre du premier cycle des étapes 21
à 25, avant l'étape de prélèvement 21, faisant ainsi commencer le procédé 20
par le cycle C2, ladite étape 26 étant réalisée par apport de carbone
organique
directement dans le milieu de culture aqueux au moins dans le premier cycle
C2.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier le procédé 20 de culture
comprend une étape (non représentée sur les figures) de clarification du lysat
obtenue par l'étape 24 de lyse, une concentration et/ou un ajustement du pH
du lysat, avant l'étape 25 de réintroduction.
La figure 2 illustre une installation 27 de culture d'au moins un
microorganisme d'intérêt 28 en hétérotrophie ou mixotrophie. L'installation
n'a
avantageusement pas besoin d'être en condition aseptisée, ni préalablement,
ni durant son utilisation pour la culture.
L'installation 27 comporte un compartiment 29 de culture ouvert ou
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fermé configuré pour recevoir un milieu de culture 30 aqueux, ledit au moins
un
microorganisme d'intérêt 28 et des microorganismes contaminants 32.
L'installation 27 comporte en outre au moins un appareil de séparation
33 configuré pour effectuer au moins une séparation physique du
microorganisme d'intérêt 28 et des microorganismes contaminants 32 au sein
d'une portion du milieu de culture 30.
L'installation 27 comporte un dispositif de lyse 34 configuré pour
effectuer une lyse des microorganismes contaminants 32 séparés de sorte à
produire un lysat 35.
Selon un mode de réalisation particulier, l'installation comporte en
outre au moins un système de concentration 36 configuré pour concentrer les
microorganismes contaminants 32 séparés avant leur lyse.
L'installation 27 comporte des moyens de transports configurés
pour au moins :
o prélever une portion du milieu de culture 30 comprenant le
microorganisme d'intérêt 28 et des microorganismes
contaminants 32;
o réintroduire le lysat 35 dans le compartiment 29 de culture.
De préférence, les moyens de transport sont en outre configurés
pour unifier le lysat 35 avec le microorganisme d'intérêt 28 séparé, de sorte
à
former un mélange et réintroduire ledit mélange dans le compartiment 29 de
culture.
De préférence, les moyens de transport sont configurés pour apporter
du carbone organique au milieu de culture 30 directement dans le
compartiment 29 de culture ou au lysat 35 ou au microorganisme d'intérêt 28
séparé par la séparation physique ou au mélange de lysat 35 et
microorganisme d'intérêt 28 ou dans une combinaison d'au moins deux de ces
derniers.
Selon un mode de réalisation préféré, les moyens de transport
comportent des moyens :
- de générer un premier flux 37 de milieu de culture 30 comprenant
le microorganisme d'intérêt 28 et des microorganismes
contaminants 32, du compartiment 29 de culture vers l'appareil de
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séparation 33 ;
- de générer un deuxième flux 38 du microorganisme d'intérêt 28
sortant de l'appareil de séparation 33 ;
- de générer un troisième flux 39 de microorganismes contaminants
32 de l'appareil de séparation 33 vers le système de
concentration 36 ;
- de générer un quatrième flux 40 de microorganismes contaminants
32 concentrés du système de concentration 36 vers le dispositif de
lyse 34;
- de générer un cinquième flux 41 de milieu de culture 30 dépourvu
de microorganismes contaminants, du système de concentration
36 vers le compartiment 29 de culture ;
- de générer un sixième flux 42 de lysat 35 du dispositif de lyse 34
vers le compartiment de culture 29 ;
- de générer un septième flux 43 de carbone organique ;
- d'unifier le deuxième flux 38, le sixième flux 42 et le septième flux
43 de sorte à former un huitième flux 44 unique courant vers le
compartiment 29 de culture.
Selon un exemple particulier de réalisation, l'installation 27 comprend
un réservoir de carbone organique 45. Le septième flux 43 est de préférence
généré de sorte qu'il sort du réservoir 45.
Le cinquième flux 41 est de préférence dépourvu de microorganismes
d'intérêt.
Selon un mode de réalisation particulier les moyens de générer les
différents flux comportent au moins un moteur et/ou une pompe (non illustrés
sur les figures).
Dans un mode de réalisation particulier, l'installation 27 comporte un
premier dispositif de purge 46 de microorganismes contaminants 32, un
deuxième dispositif de purge 47 de milieu de culture 30 dépourvu de
microorganismes d'intérêt et de microorganismes contaminants et un dispositif
de récolte 48 du microorganisme d'intérêt 28.
Le procédé 20 de culture d'au moins un microorganisme d'intérêt 28,
en hétérotrophie ou mixotrophie, est détaillé ci-dessous selon un mode de mise
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en oeuvre dans lequel est notamment utilisée une installation 27 objet de la
présente invention selon un de ses modes de réalisation :
Il est préalablement introduit dans le compartiment 29 de culture, un
milieu de culture 30 aqueux et du microorganisme d'intérêt 28. Le
microorganisme d'intérêt 28 est de préférence laissé en culture autotrophe
pendant un temps t.
Du carbone organique est alors introduit directement dans le
compartiment 29 de culture selon l'étape 26, via le septième flux 43 de
carbone
organique sortant du réservoir 45. La culture passe alors en mixotrophie et
des
microorganismes contaminants 32 se développent dans le milieu de culture 30
avec le microorganisme d'intérêt 28.
Dans l'étape 21, le prélèvement d'une portion du milieu de culture 30
comprenant le microorganisme d'intérêt 28 et des microorganismes
contaminants 32 est réalisé par génération du premier flux 37 de milieu de
culture 30 du compartiment 29 vers l'appareil de séparation 33.
Dans l'appareil de séparation 33 est opérée l'étape 22 de séparation
physique du microorganisme d'intérêt 28 et des microorganismes
contaminants 32 au sein de la portion du milieu de culture 30 prélevée. De
préférence, cette étape 22 est réalisée par filtration tangentielle
membranaire.
Après l'étape 22 de séparation physique, le deuxième flux 38 de
microorganisme d'intérêt 28 sortant de l'appareil de séparation 33 est généré,
ainsi que le troisième flux 39 de microorganismes contaminants 32 de
l'appareil
de séparation 33 vers le système de concentration 36.
Dans le système de concentration 36 a lieu l'étape 23 facultative de
concentration des microorganismes contaminants 32 séparés par l'étape 22.
De préférence, cette étape 23 est réalisée par filtration tangentielle
membranaire. On peut considérer cette étape 23 comme une deuxième
séparation physique permettant de séparer d'une part les microorganismes
contaminants 32 de façon concentrés et d'autre part du milieu de culture 30
dépourvu de microorganismes contaminants 32 et de microorganisme d'intérêt
28.
Après cette étape 23, le quatrième flux 40 de microorganismes
contaminants 32 concentrés est généré du système de concentration 36 vers le
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dispositif de lyse 34, et le cinquième flux 41 de milieu de culture 30
dépourvu
de microorganismes contaminants 32 et de microorganisme d'intérêt 28, est
généré du système de concentration 36 vers le compartiment 29 de culture.
Dans le dispositif de lyse 34 a ensuite lieu l'étape 24 de lyse des
microorganismes contaminants 32 séparés et concentrés, de sorte à produire
le lysat 35.
Le troisième flux 39 est directement dirigé vers le dispositif de lyse 34
dans un mode de mise en oeuvre où l'étape 23 de concentration n'a pas lieu.
Dans un tel mode de mise en oeuvre particulier, l'étape de lyse 24 est
réalisée
sur les microorganismes contaminants 32 séparés provenant directement de
l'appareil de séparation 33 via le troisième flux 39.
Ensuite, dans l'étape 25 de réintroduction, le lysat 35 est réintroduit
dans le milieu de culture 30 au sein du compartiment de culture 29 par
génération du sixième flux 42 de lysat 35. De préférence, le deuxième flux 38
de microorganismes d'intérêt 28 et le sixième flux 42 de lysat 35 sont unifiés
de
sorte à former un mélange courant vers le compartiment 29.
Ce cycle C2 du procédé de culture peut être répété plusieurs fois.
Après le premier cycle C2, dans les étapes 26 de chaque cycle C2
suivant, le septième flux 43 de carbone organique sortant du réservoir 45 qui
est généré est de préférence unifié avec le deuxième flux 38 et le sixième
flux
42 de sorte à former le huitième flux 44 unique de mélange courant vers le
compartiment 29 dans lequel il est réintroduit.
Exemple appliqué à la culture d'Aphanizomenon flos-aquae (A FA) en
mixotrophie en milieu ouvert
Microorganismes utilisés
Le microorganisme d'intérêt 28 utilisé dans cette étude est une souche
d'Aphanizomenon flos-aquae (AFA) isolée. L'AFA est une cyanobactérie
d'intérêt industriel et commercial.
Des microorganismes contaminants 32 modèles sont constitués par un
mélange de 5 souches de bacilles ayant des caractéristiques morphologiques
et phénotypiques différentes. Ce mélange se présente sous la forme d'une
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solution bactérienne vivante, concentrée et présentée en formulation liquide.
La
solution commercialisée sous la référence BactilitTM par la société CG
PACKAGING peut être par exemple utilisée.
Afin de simplifier le procédé, les microorganismes contaminants 32
5 sont initialement introduits dans la culture de cyanobactérie à raison
d'une
cellule du microorganisme d'intérêt 28 pour une cellule de microorganisme
contaminant 32. Par ailleurs, il faut noter qu'un filament est considéré comme
une cellule de cyanobactérie, quelle que soit sa taille.
10 Milieux de culture
Le milieu de culture utilisé est un milieu BG11 (composition détaillée
fournie en tableaux A à D), natif pour la culture en autotrophie, ou, additivé
de
lactosérum en poudre à une concentration finale de 4,5 g.L-1 pour la culture
en
mixotrophie.
Produit Concentration
g/L
Na2MgEDTA 0.1
Ferric Ammonium
Citrate 0.6
Acide citrique, H20 0.6
CaCl2, 2H20 3.6
Eau osmosée, stérilisation 20
minutes à 121 C ou filtration
(conservation à 4 C)
15 Tableau A : composition de la solution stock 1
Concentration
Produit
g/L
MgSO4, 7H20 7.5
Eau osmosée, stérilisation 20
minutes à 121 C ou filtration
(conservation à 4 C)
Tableau B : composition de la solution stock 2
Concentration
Produit
g/L
K2HPO4 0.6
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Eau osmosée, stérilisation 20
minutes à 121 C ou filtration
(conservation à 4 C)
Tableau C : composition de la solution stock 3
Concentration
Produit
g/L ou mL/L
Solution stock 1(mL) 10
Solution stock 2 (mL) 10
Solution stock 3 (mL) 10
Na2CO3 (g) 0.02
NaNO3 (g) 1.5
Eau osmosée, pH ajusté à 9,
stérilisation 20 minutes à 121 C
Tableau D : composition de la solution de milieu nutritif BG11
Conditions opératoires des cultures
La culture d'AFA est réalisée dans un local climatisé dont la
température est régulée à 25 1 C. Le compartiment 29 de culture en verre
borosilicaté (volume total = 250mL, volume de culture = 200mL, hauteur utile =
70mm, diamètre utile = 60mm) est équipé d'une agitation par pale (mobile
d'agitation de type hélice marine, diamètre du mobile = 30mm, vitesse
d'agitation = 60rpm).
L'apport lumineux est assuré par un panneau de diodes
électroluminescentes (irradiance du rayonnement photosynthétiquement actif
mesurée à la paroi externe du réacteur = 200 mol.s-1.m-2).
Le taux d'inoculation des cultures a été fixé à 5.105 et 1.106
cellules.mL-1.
Opérations unitaires et conditions opératoires pour la séparation
physique du microorganisme d'intérêt des microorganismes contaminants et
pour la concentration des microorganismes contaminants
Concernant la séparation physique entre l'Aphanizomenon Flos-Aquae
et les microorganismes contaminants modèles (diverses souches de bacilles
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en mélange), la méthode utilisée consiste en une première filtration
tangentielle
avec membrane.
La concentration des microorganismes contaminants modèles fait
appel à une deuxième séparation physique entre lesdits microorganismes
contaminants et du milieu de culture BG11 réalisée par une deuxième filtration
tangentielle avec membrane.
La première filtration fait appel à une membrane ayant une porosité de
5 m. Il est possible, pour la première filtration tangentielle, d'utiliser
une
membrane ayant une porosité comprise entre 0,65 lm et 20 lm, et de manière
préférable comprise entre 1,2 lm et 20 lm, de préférence comprise entre 3 lm
et 20 lm, et encore de préférence comprise entre 5 lm et 20 m.
La seconde filtration fait appel à une membrane ayant une porosité de
0,2 m. Il est possible, pour la seconde filtration tangentielle, de définir
un seuil
de porosité inférieur à 511m, et de manière préférable inférieur à 3 lm, et de
manière préférable inférieur à 1,2 lm, et de manière préférable inférieur à
0,65
lm, et de manière préférable inférieur à 0,2 m.
Concernant le débit de perméation à appliquer pour la première
filtration tangentielle (c'est-à-dire le débit de prélèvement d'une portion du
milieu de culture), il est de préférence choisi un débit quotidien supérieur
ou
égal à une fois le volume de l'installation 27 de culture, et de manière
préférable supérieur ou égal à trois fois le volume de l'installation 27 de
culture.
Concernant les vitesses tangentielles à appliquer dans la première
filtration tangentielle, il est préférable d'appliquer des vitesses
inférieures ou
égales à 2,1 m.51, et de manière préférable inférieures ou égales à 0,7 m.s-1.
Opérations unitaires et conditions opératoires pour la lyse des
microorganismes contaminants
Concernant la lyse des microorganismes contaminants, il est utilisé
une lyse alcaline à chaud. Un volume de soude 5N a été ajoutée à la solution
de microorganismes contaminants concentrés afin d'atteindre une
concentration finale de 0,1N. Cette solution a ensuite été maintenue à 70 C
pendant 10 minutes avant d'être refroidie.
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Résultats obtenus
Avant l'étape 21 de prélèvement du procédé de culture, le
microorganisme d'intérêt est laissé en culture autotrophe dans le milieu de
culture 30 pendant un temps t afin de valider l'état physiologique correct de
la
souche et d'établir des données de référence quant aux performances de
croissance. Après le temps t, le procédé est lancé de façon cyclique répétée
selon le cycle C2 avec l'étape 26 d'apport de carbone organique et l'étape 23
de concentration.
En autotrophie, une observation rapide permet de mettre en évidence
que la souche croit avec une première phase, jusqu'à 100h, correspondant à
croissance exponentielle puis, une seconde phase de croissance linéaire, entre
100h et 600h. Enfin, une phase de ralentissement s'observe après 600h. Ces
tendances sont classiquement retrouvées dans le cas de croissance non
balancée, c'est-à-dire dans le cas où un facteur environnemental devient
limitant. Il peut s'agir de facteur nutritionnel (substrat, produit du
métabolisme)
ou de facteurs physico-chimiques. Dans le cas présent, il est raisonnable
d'émettre l'hypothèse que l'énergie lumineuse puisse devenir limitante au-delà
d'une certaine densité cellulaire (phénomène d'ombrage).
En appliquant une régression linéaire, il est possible de déterminer
une équation représentative de la vitesse de croissance, à savoir : y = 0,002x
+
0,4453.
Il est également possible d'évaluer la productivité volumique de la
souche grâce aux mesures de concentrations massiques en microorganisme
d'intérêt.
La concentration cellulaire dans les cultures est estimée par mesure
de l'absorbance d'un échantillon liquide. La mesure de l'absorbance du milieu
est réalisée à 600 nm par l'intermédiaire d'un spectrophotomètre. Cette
absorbance (ou densité optique) est considérée comme étant en relation
linéaire avec la concentration (loi de Beer-Lambert, Abs = E.I.C) pour des
valeurs comprises entre 0,1 et 0,4 unité. Des dilutions sont effectuées de
manière à se situer dans ce domaine de validité.
La concentration cellulaire massique est également mesurée par
mesure des matières en suspension (MES). La concentration en matières en
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suspension ([MES]) est estimée par pesée de la masse sèche d'un volume
connu de suspension cellulaire. Celui-ci est filtré sur une membrane de
diamètre de pores de 0,45 lm (0=4,7 cm) préalablement séchée à 60 C et 200
mm Hg pendant 24 heures et pesée. Après filtration, la membrane et le dépôt
cellulaire sont séchés dans les mêmes conditions puis pesés. La différence de
masse ramenée au volume permet d'obtenir la concentration en matières en
suspension dans la suspension filtrée.
La croissance microbienne est évaluée en termes de temps de
doublement (ou temps de génération, tg) et de productivité volumique (rx).
Les paramètres de croissance autotrophe de la souche d'AFA
sont une concentration de matière en suspension maximale ([MES]max) de 0,75
g.L-1 et une productivité volumique maximale (rx max) de 26.10-3 g.-Li j-i.
Lorsque l'on met en oeuvre le procédé objet de la présente invention
en mixotrophie, c'est-à-dire lorsqu'on engage le premier cycle C2 en
commençant par l'étape 26 d'apport de carbone organique au milieu de culture,
un gain de productivité est observé malgré la consommation d'une partie du
carbone organique fourni par les microorganismes contaminants. En effet,
l'ajout de lysat de microorganismes contaminants à la culture permet
d'apporter
du carbone organique hautement assimilable et donc, de recycler une partie du
carbone organique initial consommé par les microorganismes contaminants.
Calcul du gain de rendement en productivité pour une culture d'AFA
avec le procédé de culture en mixotrophie
La concentration massique d'AFA a été relevée dans le temps (toutes
les heures pendant 150h) dans un milieu de culture BG11 natif (autotrophie :
Témoin). En parallèle, la concentration massique d'AFA a été relevée dans le
temps dans des milieux de cultures BG11 durant des essais de mise en oeuvre
du procédé de culture objet de la présente invention réalisé en mixotrophie,
l'étape de réintroduction du lysat dans le milieu de culture étant réalisée
avec
des concentrations en lysat différentes (0,1g/L ou 1g/L ou 5g/L) suivant les
essais.
L'évolution de la concentration massique d'AFA dans le temps est
visible sur le graphe en figure 3.
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Ces résultats indiquent qu'un ajout de lysat permet d'augmenter la
productivité et la concentration maximale en AFA dans les cultures. Cet effet
est d'autant plus marqué que les concentrations en lysat sont importantes pour
des valeurs comprises entre 0,1 et 5 g/L.
5 Une analyse stoechiométrique montre que l'ajout de 5g/L de lysat
(correspondant à 165 mg de carbone organique par litre) permet d'augmenter
le titre maximal en AFA de 111 mg d'AFA par litre. Ceci correspondant à un
rendement de production hétérotrophe de microorganisme d'intérêt de 0,6
gramme d'AFA par gramme de carbone organique fournit par le lysat.
10 Une analyse cinétique montre que l'ajout de 5g/L de lysat permet
d'augmenter, jusqu'à 29h de culture, la productivité en AFA de 26,4 mg d'AFA
par litre par heure à 91,2 mg d'AFA par litre par heure, soit +340%.
