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WO 2021/083907
PCT/EP2020/080199
1
Description
DISPOSITIF CONTENANT DES BILLES DE VERRE FONCTIONNALISEES AVEC DU
POLYETHYLENEIMINE, ET LEUR
UTILISATION POUR CAPTER LES MICRO-ORGANISMES
La présente invention concerne un dispositif contenant des billes de verre
fonctionnalisées, et son
utilisation dans la captation de micro-organismes pour la mise en oeuvre d'un
procédé d'élimination de
micro-organismes ou de diagnostic.
La captation de micro-organismes présente un intérêt fondamental dans de
nombreux types
d'industrie, tels que les industries pharmaceutique, cosmétique, vétérinaire
ou alimentaire. Elle peut
notamment être utilisée pour des applications qui se découpent en deux grands
domaines :
- L'élimination de micro-organismes de solutions potentiellement
contaminées,
- L'analyse sous la forme d'un diagnostic, notamment dans le cadre d'un
diagnostic clinique,
permettant d'évaluer la qualité microbiologique d'une solution.
Pour éliminer des micro-organismes présents au sein de solutions
potentiellement contaminées, les
techniques utilisées font généralement appel au traitement thermique (Magali,
WAGNER, Anne
Gaëlle MELLOUET, et François ZUBER. 2016. "Traitement thermique en continu de
produits
pompables." "Agroalimentaire." Techniques de l'Ingénieur, 10 Septembre 2016)
et/ou à la filtration
membranaire (Christel, CAUSSERAND, Claire ALBASI, et Hélène ROUX DE BALMANN.
2017.
"Filtration membranaire (0I, NF, UF, MF) - Applications en traitement des
eaux." "Technologies de
l'eau." Techniques de l'Ingénieur, 10 Août 2017). L'inconvénient majeur du
traitement thermique
provient du fait que la température est susceptible d'engendrer des
modifications irréversibles du
produit en agissant directement sur ses constituants. Également, au niveau
microbiologique, le
traitement thermique correspond à une réduction de la charge en
microorganismes et il est par exemple
susceptible de réactiver des spores bactériennes. Concernant la filtration
membranaire, le colmatage de
la membrane est le principal problème pouvant être rencontré. Ce dernier peut
être dû à la
concentration en micro-organismes dans le produit autant qu'à la nature du
produit et en particulier
aux particules solides présentes en son sein.
L'analyse microbiologique, nécessite l'utilisation de techniques précises pour
lesquelles le temps
d'obtention du résultat le plus court possible est recherché. En effet, plus
les résultats d'analyse sont
obtenus rapidement, plus il est possible d'engager des actions correctives en
cas de résultats non
satisfaisants ou non acceptables. En particulier, dans le domaine médical, il
est nécessaire de prévoir et
diagnostiquer le risque infectieux : plus le diagnostic est rapide et précis,
plus la prise en charge des
malades est efficace et le risque de transmission minimisé.
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Cependant, pour mettre en évidence la présence de microorganismes, il est
nécessaire de réaliser des
prélèvements suffisamment importants afin de s'assurer de récupérer une
quantité minimale de
microorganismes. Il faut ensuite augmenter leur concentration, les isoler et
les identifier.
Une étape clé pour la plupart de ces méthodes de détection/quantification de
microorganismes dans les
échantillons liquides ou rendus liquides, est leur capacité à dépasser la
limite de détection de la
technique d'évaluation mise en oeuvre. Ceci est particulièrement difficile
pour les échantillons
faiblement concentrés en microorganismes d'intérêt. Une étape d'enrichissement
ou de concentration
apparait souvent nécessaire pour ce type d'échantillon, ladite étape
d'enrichissement pouvant
éventuellement être mise en oeuvre directement dans le conditionnement dans
lequel se trouve
l'échantillon. Il s'agit dans ce cas, d'une étape d'enrichissement directement
dans le produit.
L'étape d'enrichissement nécessite d'utiliser des milieux de culture,
sélectifs ou non, qui ont pour but
de promouvoir la croissance des microorganismes cibles dans les échantillons
biologiques ou
environnementaux, tout en limitant la croissance des flores non cibles. Ainsi,
la population cible, qui
est souvent présente à des niveaux bas par rapport à la flore annexe présente
dans les aliments, est
amplifiée. Ces étapes d'enrichissement en amont de l'analyse permettent
d'accroitre le nombre de
microorganismes d'intérêt dans l'échantillon mais condamnent à la fois la
possibilité d'une analyse
rapide mais également la possibilité de quantifier la population initiale de
microorganismes d'intérêt.
L'autre possibilité consiste à passer par une étape de concentration des
microorganismes à partir de
l'échantillon liquide ou rendu liquide.
Une des techniques les plus utilisées pour la concentration de micro-
organismes à partir d'échantillons
est l'utilisation d'un ou plusieurs filtres membranes de porosité variable à
travers lequel le milieu
liquide est filtré. Les microorganismes contenus dans l'échantillon sont
arrêtés par la membrane et
donc concentrés. Une telle technique est généralement mise en oeuvre pour
l'analyse microbiologique
d'eau de process, d'eau potable, de boisson, ou de produit pharmaceutique.
Bien que simple d'utilisation, cette méthode de filtration sur membrane reste
limitée par des facteurs
provoquant le colmatage du filtre membrane tels que la turbidité élevée, ou la
présence de particules
dans l'échantillon. D'autres facteurs liés à la nature du filtre et à son mode
de stérilisation peuvent
aussi influer sur le résultat de l'analyse microbiologique pouvant gravement
altérer la viabilité, la
précision et la sensibilité de la méthode et conduire à des résultats erronés
et faiblement
reproductibles. Nous pouvons citer à titre d'exemple non exhaustif,
l'inhibition de la croissance
microbienne, une propagation anormale des colonies, l'existence de zones non
mouillantes, la fragilité
du filtre, un défaut de planéité du filtre, un faible taux de récupération. En
outre, la nécessité de
concentrer de grandes quantités d'échantillon afin de compenser les variations
spatiales et temporelles
de l'occurrence des microorganismes, augmente la probabilité de colmatage du
filtre membrane.
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D'autres méthodes permettent également de concentrer les micro-organismes et
de les séparer des
éléments constitutifs de l'échantillon.
Par exemple, les méthodes d'immunocapture ou d'immunoconcentration sont
largement utilisées dans
de nombreuses applications. Elles mettent très souvent en oeuvre des supports
fonctionnalisés avec des
anticorps et permettent de capturer spécifiquement ou non les microorganismes
contenus dans
l'échantillon. Ces méthodes sont largement utilisées pour l'analyse
microbiologique de fluides
humains ou d'échantillons alimentaires, et peuvent être mises en oeuvre sur
les échantillons bruts,
enrichis, ou dans des milieux de cultures spécifiques (pré-enrichissement et
enrichissement).
De nouvelles méthodes permettent également la capture semi-spécifique de
microorganismes à l'aide
de surfaces cellulaires fonctionnalisées. Elles mettent en oeuvre des dérivés
de lectines ou d'hydrates
de carbone, des peptides et des composés mimant les peptides et sont
appliquées à la capture à large
spectre et / ou de liaison spécifique des micro-organismes dans l'échantillon.
.. En outre, les peptides antimicrobiens liés à des composés non solubles ont
été utilisés pour tuer,
immobiliser et détecter des microorganismes.
L'un des buts de l'invention est de fournir un dispositif comprenant les
billes de verre fonctionnalisées
pour une utilisation dans la captation de micro-organismes.
Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de préparation des
billes de verre
fonctionnalisées.
Un autre but de l'invention est de fournir un procédé efficace de captation de
micro-organismes pour
une utilisation en élimination de micro-organismes ou en diagnostic.
Un premier objet de la présente invention est un dispositif comprenant un
récipient creux contenant
des billes de verre, fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la
surface des billes de verre.
En particulier, la présente invention concerne un dispositif comprenant un
récipient creux contenant
des billes de verre non poreuses, fonctionnalisées par du polyéthylèneimine
adsorbé à la surface des
billes de verre.
La présente invention concerne un dispositif comprenant un récipient creux
contenant des billes de
verre, fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la surface des
billes de verre, les billes de
verre étant notamment constituées de verre de type sodocalcique ou
borosilicate, dans lequel la masse
moléculaire du polyéthylèneimine adsorbé est comprise de 0,6 à 2000 kDa.
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Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un
dispositif comprenant un
récipient creux contenant des billes de verre, fonctionnalisées par du
polyéthylèneimine directement
adsorbé à la surface des billes de verre, en particulier sans agent de
couplage entre ledit
polyéthylèneimine et la surface des billes de verre, de préférence par des
interactions électrostatiques,
lesdites billes de verre étant notamment constituées de verre de type
sodocalcique ou borosilicate, dans
lequel la masse moléculaire du polyéthylèneimine adsorbé est comprise de 0,6 à
2000 kDa.
Au sens de la présente invention, on entend par récipient un objet destiné
à recevoir les billes de
verre.
Au sens de la présente invention, on entend par récipient creux un récipient
tel que défini ci-
dessus, comprenant un espace concave, ou une cavité, pouvant accueillir les
billes de verre.
Au sens de la présente invention on entend par billes de verre des
éléments de forme sphérique ou
ovoïde composés de verre.
Au sens de la présente invention, on entend par billes de verre non poreuses
des billes de verre
lisses et dépourvues de pores. A titre d'exemple, les billes type Poravor0, ou
les billes de gel de silice
sont considérées comme poreuses.
Les billes de verres utilisables dans la présente invention ont notamment une
densité comprise de 2 à 3
kg/1, en particulier comprise de 2.3 à 2.7 kg/1, notamment d'environ 2,48
kg/l.
Au sens de la présente invention on entend par polyéthylèneimine un
polymère sous forme linéaire
ou ramifié composé de motifs éthylène diamine. Il s'agit d'un polymère
hydrosoluble dont plusieurs
produits de poids moléculaire différents sont commercialement disponibles. Le
polyéthylèneimine
peut être synthétisé à partir de l'Aziridine par une polymérisation par
ouverture de cycle, conduisant à
un polyéthylèneimine ramifié.
77.
PE ar=
PE !Uléaire
Structure du polyéthylèneimine ramifié et linéaire
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Au sens de la présente invention on entend par adsorbé à la surface des
billes de verre le fait que le
polyéthylèneimine soit lié de façon non-covalente à la surface des billes de
verre sans pour autant
modifier la structure du verre. Le procédé d'adsorption fait intervenir des
interactions électrostatiques
5 type van de Waals entre le polymère cationique présentant des charges
positives et la surface de verre
anionique présentant des charges négatives.
L'adsorption de polymère cationique sur une surface de verre non poreuse par
des interactions
électrostatiques est connue. Ce phénomène est notamment mis en oeuvre pour
adsorber des
microorganismes sur des plaques de verre pour une observation par microscopie
optique, où un
polymère cationique, tel que la polylysine, est ajouté dans le milieu comme
liant entre les
microorganismes et la plaque de verre.
Les inventeurs ont constaté de façon inattendue dans le cas de billes de verre
fonctionnalisées par
adsorption du polyéthylèneimine, une stabilité surprenante de l'interaction
entre le polyéthylèneimine
et la bille de verre. Les billes de verre ainsi fonctionnalisées permettent la
captation de
microorganismes dans leur état, mort ou vivant, dans un milieu de façon
quantitative et permettent
sous élution le relargage de la totalité des microorganismes retenus à la
surface des billes de verres
fonctionnalisées par le polyéthylèneimine en conservant l'état, mort ou
vivant, des microorganismes.
L'adsorption présente de nombreux avantages par rapport à un greffage par
liaison covalente
également connu. L'adsorption ne nécessite pas de modification chimique
préalable de la surface de
verre afin d'y introduire des groupements fonctionnels, tels que les
siloxanes, pouvant réagir avec le
polymère. De plus, l'adsorption met en jeu de faibles interactions rendant le
processus réversible. Les
billes de verre, ainsi que le polymère peuvent alors potentiellement être
recyclés par désorption.
Contrairement à un greffage covalent, l'adsorption peut s'effectuer dans un
matériel ou appareil non
spécifique.
Ainsi, l'invention constitue un moyen de captation/élimination de micro-
organismes dans un produit.
Puis, dans un objectif de diagnostic, de proposer un moyen d'élution
permettant le relargage de la
totalité des microorganismes retenus sur la colonne et garantissant la
viabilité cellulaire. Ceci permet
d'apporter une quantification précise des microorganismes vivants contenus
dans l'échantillon
analysé.
Les surfaces traitées par du polyéthylèneimine trouvent de nombreuses
applications parmi lesquelles
l'adhésion et l'étalement de diverses lignées cellulaires, la différenciation
cellulaire et l'excroissance de
neurites, l'adhésion des lignées de cellules transfectées et la survie de
neurones primaires dans la
culture.
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Le dispositif de la présente Invention peut être utilisé en statique ou en
flux. Le mode statique permet
d'augmenter le temps de contact entre les billes de verre fonctionnalisées par
du polyéthylènemine et
le liquide contaminé et donc de maximiser la probabilité de rencontre entre
les billes et les
microorganismes. Cette probabilité de rencontre peut être encore améliorée en
procédant à une
agitation manuelle ou mécanique.
L'inconvénient de cette technique concerne les grands volumes de solution à
analyser ou à
débactériser (100 mL, 250 mL) puisqu'ils nécessitent une quantité importante
de billes, et par
conséquent un coût plus élevé.
La méthode en flux, permet de passer de grands volumes de liquide dans un
espace réduit pour forcer,
en quelque sorte, les microorganismes à rencontrer le polyéthylèneimine
adsorbé à la surface des billes
(la quantité de billes utilisées pouvant-être de 1g). Ainsi, si l'on souhaite
obtenir un coût réduit par
analyse, on peut utiliser la méthode statique pour de petits volumes et la
méthode en flux pour de
grand volume.
L'invention présente de nombreux avantages par rapport aux techniques de l'art
antérieur. Elle permet
tout d'abord d'éviter l'utilisation du traitement thermique pour éliminer les
micro-organismes de
solutions potentiellement contaminées et ainsi de préserver toutes les
qualités originelles du produit
sans engendrer de modifications sur ses constituants. L'invention permet
également d'éviter d'utiliser
.. la filtration membranaire et ses inconvénients liés entre autres au
colmatage. Ainsi, l'invention permet
d'éliminer les microorganismes contenus dans des échantillons liquides ou
rendus liquides de volume
important, échantillons pouvant être de natures différentes et posséder par
exemple une turbidité
élevée ou des particules ou des sédiments en son sein.
En ce qui concerne l'analyse microbiologique, la présente invention concerne
notamment un procédé
pour capturer et concentrer au moins un microorganisme susceptible d'être
présent dans un échantillon
en vue de le détecter, le quantifier ou d'en évaluer la viabilité. Cette
invention permet ainsi de
s'affranchir d'une étape d'enrichissement, et par conséquent de réduire
considérablement le temps
d'analyse mais également de quantifier la population cible initiale.
.. Le microorganisme peut être une bactérie, un Fungi (par exemple une levure
ou une moisissure) ou un
virus. Ce procédé est particulièrement applicable aux microorganismes contenus
dans les milieux
complexes. Ces milieux correspondant à des échantillons biologiques peuvent
être d'origine humaine,
alimentaire, cosmétique, vétérinaire ou pharmaceutique.
L'un des avantages de la présente invention réside dans le fait que le produit
ne subit aucune
modification au contact des billes de verre fonctionnalisées et que celle-ci
permet également de
s'affranchir des problèmes de colmatage.
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Un autre avantage de la présente invention est la possibilité d'utiliser le
dispositif de captation de
micro-organismes en flux continu, sans étapes d'enrichissement et ce même si
la quantité de
microorganismes est faible.
Il est ainsi possible d'intégrer ce dispositif à une unité industrielle de
production sur laquelle une étape
d'élimination de micro-organismes serait nécessaire, et ce sans interrompre la
chaine de production.
Par conséquent, cette invention permet un gain de temps considérable par
rapport aux méthodes
impliquant une étape d'enrichissement.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un
dispositif tel que décrit ci-
dessus, comprenant un récipient creux contenant des billes de verre non
poreuses, exclusivement
fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes de
verre.
Selon ce mode de réalisation particulier, les billes de verre sont
exclusivement fonctionnalisées par du
polyéthylèneimine. L'expression exclusivement désigne le fait que le
polyéthylèneimine est le seul
polymère présent sur les billes de verre. Un système multicouche avec la
présence d'un autre polymère
ne fait pas partie de ce mode de réalisation.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un dispositif tel que
décrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre sont constituées de verre de
type sodocalcique ou
.. borosilicate.
Le type de verre utilisé pour la présente invention, notamment le verre
sodocalcique, présente un
avantage en termes de coût qui est peu élevé.
Au sens de la présente invention, on entend par verre de type sodocalcique ,
un verre à base de
silice (5i02), de calcium et de sodium.
Au sens de la présente invention, on entend par verre de type borosilicaté
, un verre à base de silice
(5i02), et de trioxyde de bore (B203).
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un dispositif tel que
décrit ci-dessus, comprenant un récipient creux contenant des billes de verre
non poreuses,
fonctionnalisées par du polyéthylèneimine adsorbé à la surface des billes de
verre, les billes de verre
étant notamment constituées de verre de type sodocalcique ou borosilicate.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un dispositif tel que
décrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre sont constituées de verre de
type sodocalcique ou
borosilicate non modifié au préalable.
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Dans ce mode de réalisation, les billes de verre n'ont pas subi un traitement
chimique, hors nettoyage,
modifiant la structure du verre, dont par exemple un traitement par de
l'aluminate de sodium, avant
adsorption du polyéthylèneimine.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un dispositif tel que
décrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre ont un diamètre d'environ 20
à environ 1000 iam,
notamment d'environ 20 à 30 lm, d'environ 30 à 40 lm, d'environ 40 à 50 lm,
d'environ 50 à 75
lm, d'environ 75 à 100 iam, d'environ 100 à 200 iam, d'environ 200 à 300 iam,
d'environ 300 à 400
lm, d'environ 400 à 500 lm, d'environ 500 à 600 lm, d'environ 600 à 700 lm,
d'environ 700 à 800
.in, d'environ 800 à 900 lm, d'environ 900 à 1000 lm.
Si la taille des billes de verre est inférieure à 20 pm, les billes passent à
travers le fritté sensé les
retenir. En revanche, pour des billes de taille supérieure à 1000 pm, les taux
de captation obtenus sont
faibles.
La diminution de la taille des billes, combinée à un nombre de billes plus
important permet d'avoir
une surface de contact plus élevée par rapport à des billes plus grandes en
nombre moins important.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un dispositif tel que
décrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre ont une masse d'environ 10
ng à environ 2 mg
notamment d'environ 10 à 50 ng, d'environ 50 à 100 ng, d'environ 100 à 200 ng,
d'environ 200 à 500
ng, d'environ 500 ng à 1 lag, d'environ 1 à 5 lag, d'environ 5 à 10 lag,
d'environ 10 à 20 lag, d'environ
20 à 50 lag, d'environ 50 à 100 lag, d'environ 100 à 200 lag, d'environ 200 à
500 lag, d'environ 500 lag
à 1 mg, d'environ 1 à 1,5 mg, d'environ 1,5 à 2 mg.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un dispositif tel que
décrit ci-dessus, dans lequel :
= les billes de verre ont un diamètre d'environ 20 à environ 1000 lm,
notamment d'environ 20 à
lm, d'environ 30 à 40 lm, d'environ 40 à 50 lm, d'environ 50 à 75 lm,
d'environ 75 à
100 lm, d'environ 100 à 200 lm, d'environ 200 à 300 lm, d'environ 300 à 400
lm,
30
d'environ 400 à 500 lm, d'environ 500 à 600 lm, d'environ 600 à 700 iam,
d'environ 700 à
800 lm, d'environ 800 à 900 lm, d'environ 900 à 1000 lm, et/ou
= les billes de verre ont une masse unitaire d'environ 10 ng à environ 2
mg, notamment
d'environ 10 à 50 ng, d'environ 50 à 100 ng, d'environ 100 à 200 ng, d'environ
200 à 500 ng,
d'environ 500 ng à 1 lag, d'environ 1 à 5 lag, d'environ 5 à 10 lag, d'environ
10 à 20 lag,
d'environ 20 à 50 lag, d'environ 50 à 100 lag, d'environ 100 à 200 lag,
d'environ 200 à 500 lag,
d'environ 500 lag à 1 mg, d'environ 1 à 1,5 mg, d'environ 1,5 à 2 mg.
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Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un dispositif dans lequel
la masse moléculaire du polyéthylèneimine adsorbé est comprise de 0,6 à 2000
kDa, notamment
d'environ 0,6 à 1,3 kDa, d'environ 1,3 à 10 kDa, d'environ 10 à 25 kDa,
d'environ 25 à 100 kDa,
d'environ 100 à 250 kDa, d'environ 250 à 500 kDa, 500 à 1000 kDa, d'environ
1000 à 1500 kDa,
d'environ 1000 à 2000 kDa.
Par masse moléculaire on entend la masse moléculaire en masse (Mw).
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un dispositif dans lequel
le polyéthylèneimine adsorbé est linéaire ou ramifié, notamment ramifié.
Au sens de la présente invention, on entend par ramifié un polymère dans
lequel l'enchainement
des motifs monomères présente des ramifications.
Au sens de la présente invention, on entend par linéaire un polymère dans
lequel l'enchainement
des motifs monomères se fait de façon linéaire.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un dispositif tel que
décrit ci-dessus, dans lequel la masse totale des billes de verre est
d'environ 10 mg à environ 1 kg,
notamment d'environ 10 à 50 mg, d'environ 50 à 100 mg, d'environ 100 à 200 mg,
d'environ 200 à
500 mg, d'environ 500 mg à 1 g, d'environ 1 à 2 g, d'environ 2 à 5 g,
d'environ 5 à 10 g, d'environ 10
à 50 g, d'environ 50 à 100 g, d'environ 100 à 200 g, d'environ 200 à 500 g,
d'environ 500 g à 1 kg.
L'une des premières applications du procédé est l'élimination de micro-
organismes : grâce à la
captation, l'échantillon est déplété des microorganismes initialement
présents.
Une seconde application envisagée est le diagnostic : la captation est alors
utilisée comme un moyen
pour concentrer les microorganismes en vue d'un diagnostic. Ce dernier peut
être qualitatif, de type
présence/absence, ou quantitatif. Il peut être spécifique ou non du type de
microorganisme, et
différencier ou non les cellules vivantes des cellules mortes. L'analyse des
microorganismes captés
peut se faire directement après captation sur billes. Ces tests peuvent être
par exemple basés sur la
détection de la cellule entière ou de la détection/quantification d'un de ses
constituants (ADN, ARN,
ATP, enzymes et leurs activités ou plus largement les protéines...). Pour ce
faire, il est possible
d'éluer les microorganismes captés sur les billes, éventuellement suivi d'une
étape de lyse, ou alors,
d'effectuer la lyse sur les microorganismes toujours captés sur les billes,
puis d'éluer les constituants
libérés des cellules. Ensuite, une multitude de techniques sont utilisables,
parmi lesquelles la
cytométrie en flux ou en phase solide, la colorimétrie, la spectroscopie, la
microscopie, l'ATPmétrie
(ATP : Adénosine triphosphate), la PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction
en chaîne par
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polymérase), la RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ou
réaction en chaîne par
polymérase après transcription inverse), l'amplification isothermale ou encore
la détection
immunologique.
5 Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention
concerne un dispositif tel que
décrit ci-dessus, dans lequel le récipient creux est sous forme d'un tube,
d'un flacon d'un bécher ou
d'un pot.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un dispositif tel que
10 décrit ci-dessus, dans lequel le récipient creux est sous forme de
colonne comprenant de façon
optionnelle un fritté.
Au sens de la présente invention, lorsque la colonne comprend un fritté, la
colonne et le fritté peuvent
être deux éléments d'un même ensemble, ou deux éléments séparés pouvant être
assemblés.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un dispositif tel que
décrit ci-dessus, dans lequel la colonne a un volume d'environ 0,5 mL à
environ 2 L, notamment
d'environ 0,1 à 1 mL, d'environ 1 à 2 ml, d'environ 2 à 5 mL, d'environ 5 à 10
mL, d'environ 10 à 50
mL, d'environ 50 à 100 mL, d'environ 100 à 200 mL, d'environ 200 à 500 mL,
d'environ 500 mL à 1
L, d'environ 1 L à 2 L, et le fritté a une porosité inférieure à la taille des
billes de verre utilisées.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un dispositif tel que
décrit ci-dessus, dans lequel le récipient creux est sous forme d'un tube,
d'un flacon d'un bécher ou
d'un pot, ledit récipient creux étant notamment sous forme de colonne
comprenant de façon
optionnelle un fritté, ladite colonne ayant notamment un d'environ 0,5 mL à
environ 2 L et le fritté
ayant notamment une porosité inférieure à la taille des billes de verre
utilisées.
La taille de la colonne est choisie en fonction de la masse totale des billes,
ainsi que les quantités des
solutions utilisées (solutions de polyéthylèneimine, solutions de captation et
solutions d'élution). Une
quantité plus importante de billes nécessite une colonne de taille plus
élevée, que l'Homme du Métier
peut choisir.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un dispositif tel que
décrit ci-dessus, dans lequel les billes de verre ont un diamètre d'environ 20
à environ 1000 lm, et une
masse d'environ 10 ng à environ 2 mg, dans lequel le verre est de type
sodocalcique ou borosilicate,
fonctionnalisé par du polyéthylèneimine adsorbée à sa surface, dans lequel le
polyéthylèneimine à une
masse moléculaire comprise de 0,6 et 2000 kDa, dans lequel le
polyéthylèneimine est ramifié ou
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linéaire, dans lequel le contenant est sous forme d'un tube, d'un flacon, d'un
bécher, d'un pot ou d'une
colonne comprenant de façon optionnelle un fritté, dans lequel la colonne a un
volume comprise de 0,5
ml à 2 L, et le fritté a une porosité inférieure à la taille des billes de
verre utilisées et dans lequel le
poids total des billes est compris de 10 mg à 1 kg.
Un second objet de l'invention est un procédé de préparation d'une bille de
verre utilisée dans le
dispositif tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de mise en contact
du polyéthylèneimine avec
une bille de verre pour obtenir une bille de verre non poreuse fonctionnalisée
par du
polyéthylèneimine adsorbé à sa surface.
L'adsorption consiste à mettre en contact une solution aqueuse de
polyéthylèneimine à une
concentration comprise de 0,1% à 5% (pourcentages massiques) avec la surface
de la bille de verre
pendant une durée moyenne de 5 à 10 minutes, notamment d'une dizaine de
minutes. Un rinçage par
de l'eau permet néanmoins d'éliminer le polyéthylèneimine excédentaire, de
diminuer la mortalité
induite et d'améliorer une éventuelle élution des microorganismes.
Un séchage est ensuite réalisé à l'air libre ou accéléré à l'aide d'un système
de chambre sous vide, ou
par lyophilisation. Le temps de séchage peut ainsi être réduit à une dizaine
de minutes.
A l'issue de ces différentes étapes, les billes sont fonctionnalisées et
prêtes à l'emploi.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé de
préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-
dessus, comprenant une
étape de mise en contact d'une solution de polyéthylèneimine avec une bille de
verre pour une durée
de 1 minute à 24 heures, notamment de 1 à 5 minutes, de 5 à 10 minutes, de 10
à 15 minutes, de 15 à
20 minutes, de 20 à 25 minutes, de 25 à 30 minutes, de 30 minutes à 1 heure,
de 1 à 2 heures, de 2 à 5
heures, de 5 à 10 heures, de 10 à 24 heures, de préférence de 10 minutes à 24
heures, pour obtenir une
bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine adsorbé.
Lorsque le temps de contact est inférieur à 1 minute, la fonctionnalisation
des billes de verre n'est pas
toujours adéquate. Le temps de contact augmente en fonction de la masse totale
des billes à
fonctionnaliser. A titre d'exemple, pour la fonctionnalisation de 300 mg de
billes, un temps de
fonctionnalisation de 5 minutes peut suffire, tandis-que pour la
fonctionnalisation de 1 g de billes, un
temps de contact de 10 minutes et préconisé.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé de
préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-
dessus, dans lequel la
solution de polyéthylèneimine est à une concentration de 0,1 et 5%, notamment
de 0,1 à 0,5%, de 0,5 à
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1%, de 1 à 2%, de 2 à 3%, de 3 à 4%, de 4 à 5% pour obtenir une bille de verre
fonctionnalisée par du
polyéthylèneimine.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé de
préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-
dessus, dans lequel le
volume de la solution de polyéthylèneimine utilisé est compris de 4 1.1.1 à
environ 0,5 L, notamment
d'environ 4 à 25 1.1.1, d'environ 25 à 50 1.1.1, d'environ 50 à 100 1.1.1,
d'environ 100 à 250 1.1.1, d'environ
250 à 500 1.1.1, d'environ 5000 à 1 ml, d'environ 1 à 2,5 ml, d'environ 2,5 à
5 ml, d'environ 5 à 25 ml,
d'environ 25 à 50 ml, d'environ 50 à 100 ml, d'environ 100 à 250 ml, d'environ
250 ml à 0,5 L, pour
obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé de
préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-
dessus, comprenant une
étape de mise en contact du polyéthylèneimine avec une bille de verre,
notamment pour une durée de 1
minute à 24 heures, dans lequel la solution de polyéthylèneimine est notamment
à une concentration
entre 0,10 et 5%, et dans lequel le volume de la solution de polyéthylèneimine
utilisé est notamment
compris de 4 à 0,5 L, pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du
polyéthylèneimine.
La concentration et le volume de la solution de polyéthylèneimine à utiliser
sont dépendants de la
surface totale des billes à fonctionnaliser. Il est possible de calculer
ladite surface à partir de de la
masse totale, la taille et la densité des billes utilisées.
= La surface par bille peut être calculée avec la formule 47rr2 (r étant le
rayon de la bille)
= Le volume par bille peut être calculé avec la formule (4/3)7rr3 (r étant
le rayon de la bille)
= Le volume total des billes peut être calculé en divisant la masse totale des
billes par la densité
= Le nombre de billes peut être calculé en divisant le volume total des
billes par le volume par
bille
= Enfin, la surface totale des billes est obtenue par la multiplication de
la surface par bille et le
nombre de billes
Une surface totale plus élevée nécessite l'utilisation d'une quantité plus
importante de
polyéthylèneimine. Cette quantité plus importante peut être apportée par
l'utilisation d'un volume de
solution plus important, l'utilisation d'une solution plus concentrée, ou une
combinaison des deux.
A titre d'exemple, il est possible d'utiliser 0.5 ml d'une solution à 0.16 %
de polyéthylèneimine afin
de fonctionnaliser 1 g de billes de 105-150 !_tm (exemple 12). Dans ce cas, la
surface totale des billes
est d'environ 188 cm2(lesdites billes ayant une densité des billes de 2.50
g/cm3).
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En revanche, 1 g de billes de 30-50 !,tm ont une surface calculée plus
importante (600 cm2). Dans ces
conditions, en utilisant également une concentration en polyéthylèneiminde de
0.16%, environ 3,2 fois
plus de solution (600/188) est nécessaire afin d'effectuer la
fonctionnalisation dans les mêmes
conditions que précédemment.
Il est également possible d'utiliser 0.5 ml d'une solution 3,2 fois plus
concentrée, ou de modifier la
concentration et le volume en appliquant une règle de trois.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé de
préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-
dessus, comprenant une
étape de séchage pour une durée de 1 minute à 12 heures, notamment de 1 à 5
minutes, de 5 à 10
minutes, de 10 à 15 minutes, de 15 à 20 minutes, de 20 à 25 minutes, de 25 à
30 minutes, de 30
minutes à 1 heure, de 1 à 2 heures, de 2 à 5 heures, de 5 à 12 heures, pour
obtenir une bille de verre
fonctionnalisée par du polyéthylèneimine.
Selon un autre mode de réalisation encore plus particulier, la présente
invention concerne un procédé
de préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit
ci-dessus, comprenant une
étape de séchage pour une durée d'environ 10 minutes, pour obtenir une bille
de verre fonctionnalisée
par du polyéthylèneimine adsorbé.
.. Le temps de séchage d'environ 10 min correspond à la durée de l'étape de
séchage lorsque ce dernier
est accéléré à l'aide d'un système de chambre sous vide avec la dépression
réglée sur son maximum
(-900 mbar au manomètre avant ouverture de la vanne).
Lorsque le séchage est réalisé à l'air libre, le temps de séchage est plus
long et peut atteindre environ
12 heures.
Au sens de la présente invention, on entend par séchage une méthode de
séchage à l'air libre ou
accéléré à l'aide d'un système de chambre sous vide, ou par lyophilisation.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé de
préparation tel que décrit ci-dessus, dans lequel l'étape de séchage est
effectuée à l'air libre ou
accélérée par flux d'air, notamment à une température allant de la température
ambiante à 90 C,
notamment de la température ambiante à 80 C, de température ambiante à 60 C,
de température
ambiante à 30 C, de 30 C à 40 C, de 40 C à 50 C et de 50 C à 60 C, ou de 60
C à 90 C, pour
obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine.
.. Au sens de la présente invention, on entend par température ambiante ,
une température allant
d'environ 20 C à environ 25 C.
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Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé de
préparation tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de rinçage avec une
solution aqueuse,
notamment de l'eau, préalable à l'étape de séchage, pour éliminer le
polyéthylèneimine non adsorbée
lors de l'étape de mise en contact.
Au sens de la présente invention, on entend par solution aqueuse une phase
liquide contenant de
l'eau. Des exemples de solution aqueuses pouvant être utilisées sont l'eau,
des solutions aqueuses de
NaCl 1M ou de Tris 50 mM.
L'objectif pendant le rinçage peut être de diminuer le pH à l'aide d'une
solution acide afin de
maximiser les charges positives à la surface du polyéthylèneimine; il est
possible dans ce cas
d'utiliser des acides tels que l'acide citrique ou l'acide acétique.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé de
préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-
dessus, comprenant les
étapes suivantes :
- une étape de mise en contact d'une solution de polyéthylèneimine avec une
bille de verre
notamment pour une durée de 1 minute à 24 heures, dans lequel la solution de
polyéthylèneimine est notamment à une concentration entre 0,10 et 5%, et dans
lequel le
volume de la solution de polyéthylèneimine utilisé est notamment compris de 4
.il à 0,5 L,
pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine;
une étape de séchage pour une durée de 1 minute à 12 heures, en particulier
une durée d'environ
10 minutes, dans lequel l'étape de séchage est effectuée à l'air libre ou
accélérée par flux d'air,
notamment à une température allant de la température ambiante à 90 C
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé de
préparation tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de séchage d'une
durée de 1 minute à 12
heures, en particulier une durée d'environ 10 minutes, à température ambiante.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé de
préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-
dessus, comprenant les
étapes suivantes :
- une étape de mise en contact d'une solution de polyéthylèneimine avec une
bille de verre
notamment pour une durée de 1 minute à 24 heures, dans lequel la solution de
polyéthylèneimine est notamment à une concentration entre 0,10 et 5%, et dans
lequel le
volume de la solution de polyéthylèneimine utilisé est notamment compris de 4
.il à 0,5 L,
pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine;
- une étape de rinçage avec une solution aqueuse, notamment de l'eau, pour
éliminer le
polyéthylèneimine non adsorbée lors de l'étape de mise en contact ;
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- une étape de séchage pour une durée de 1 minute à 12 heures, en
particulier une durée
d'environ 10 minutes, dans lequel l'étape de séchage est effectuée à l'air
libre ou accélérée par
flux d'air, notamment à une température allant de la température ambiante à 90
C.
5
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé de
préparation tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de séchage d'une
durée de 1 minute à 12
heures, en particulier une durée d'environ 10 minutes, à température ambiante.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé de
10
préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-
dessus, comprenant les
étapes suivantes :
- une étape de rinçage et de séchage des billes de verres avec de l'eau ;
- une étape de mise en contact d'une solution de polyéthylèneimine avec une
bille de verre
notamment pour une durée de 1 minute à 24 heures, dans lequel la solution de
15
polyéthylèneimine est notamment à une concentration entre 0,10 et 5%, et dans
lequel le
volume de la solution de polyéthylèneimine utilisé est notamment compris de 4
.il à 0,5 L,
pour obtenir une bille de verre fonctionnalisée par du polyéthylèneimine;
- une étape de rinçage avec une solution aqueuse, notamment de l'eau, pour
éliminer le
polyéthylèneimine non adsorbée lors de l'étape de mise en contact ;
- une étape de séchage pour une durée de 1 minute à 12 heures, en particulier
une durée
d'environ 10 minutes, dans lequel l'étape de séchage est effectuée à l'air
libre ou accélérée par
flux d'air, notamment à une température allant de la température ambiante à 90
C.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé de
préparation tel que décrit ci-dessus, comprenant une étape de séchage d'une
durée de 1 minute à 12
heures, en particulier une durée d'environ 10 minutes, à température ambiante.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé de
préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-
dessus, dans lequel ladite
solution de polyéthylèneimine est exempte de borate.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé de
préparation d'une bille de verre utilisée dans le dispositif tel que décrit ci-
dessus, dans lequel un agent
de réticulation du polyéthylèneimine n'est pas introduit.
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Un troisième objet de l'invention est l'utilisation d'un dispositif tel que
décrit ci-dessus, pour la
captation de micro-organismes en vue d'un diagnostic.
Au sens de la présente invention, on entend par micro-organismes des
organismes microscopiques
vivants ou morts. Des exemples de micro-organismes pouvant être captés sont
les bactéries, les
levures, les champignons, les virus, les archées, les micro-algues, et
certains parasites microscopiques.
Au sens de la présente invention, on entend par diagnostic la détection
des micro-organismes
captés.
Des exemples de techniques de diagnostic pouvant être utilisées sont notamment
la cytométrie en flux
ou en phase solide, la colorimétrie, la spectroscopie, la microscopie,
l'ATPmétrie (ATP : Adénosine
triphosphate), la PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par
polymérase), la RT-PCR
(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ou réaction en chaîne par
polymérase après
transcription inverse), l'amplification isothermale, ou la détection
immunologique.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
une utilisation telle que
décrite ci-dessus, pour la captation de micro-organismes en vue de
l'élimination ou de la diminution
de la charge de micro-organismes d'échantillons liquides ou visqueux
susceptibles de contenir lesdits
micro-organismes.
Au sens de la présente invention, on entend par élimination ou de la
diminution de la charge de
micro-organismes l'action de diminuer la quantité de micro-organismes
présents dans un
échantillon.
Un autre objet de l'invention est un procédé de captation de micro-organismes
comprenant une étape
de mise en contact d'un échantillon liquide ou visqueux contenant les dits
micro-organismes, avec un
dispositif tel que décrit ci-dessus, dans des conditions permettant de créer
une interaction entre les dits
micro-organismes et les billes de verre, et d'obtenir les dits micro-
organismes captés sur les billes de
verre.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé tel que décrit
ci-dessus, dans lequel l'étape de mise en contact d'un échantillon liquide ou
visqueux contenant les
dits micro-organismes est réalisée en un seul passage dans le dispositif selon
l'invention et n'est pas
effectuée de façon itérative.
Un seul passage dans le dispositif selon l'invention permet de capter
quantitativement l'ensemble des
-- microorganismes présents dans ledit échantillon liquide ou visqueux. Par
exemple, il n'est pas
nécessaire de faire de multiples passages de l'échantillon liquide ou visqueux
dans une colonne
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contenant les billes de verre fonctionnalisées pour capter ou concentrer les
microorganismes dans la
colonne.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé tel que décrit
ci-dessus, dans lequel la proportion de micro-organismes provenant de
l'échantillon et captés sur les
billes de verre est comprise de 0,001% à 100% en vue de la débactérisation
dudit échantillon.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé tel que décrit
ci-dessus, comportant une étape supplémentaire d'élution des micro-organismes
précédemment captés
dans des conditions permettant la séparation des susdits micro-organismes
captés des susdites billes de
verre et la récupération des dits micro-organismes.
L'élution avec une solution chimique est réalisée à température ambiante.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé tel que décrit
ci-dessus, dans lequel lors de l'étape d'élution la proportion des micro-
organismes séparés des billes
de verre sur lesquelles les susdits micro-organismes avaient été précédemment
captés, puis récupérés
est comprise de 0,001% à 100%.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé tel que décrit
ci-dessus, dans lequel la récupération des micro-organismes est effectuée en
vue d'un diagnostic.
Ce diagnostic peut être qualitatif, de type présence/absence, ou quantitatif.
Il peut être spécifique ou
non du type de microorganisme, et différencier ou non les cellules vivantes
des cellules mortes.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé tel que décrit
précédemment, comprenant :
- une étape de mise en contact, de préférence non itérative, d'un
échantillon liquide ou visqueux
contenant les dits micro-organismes, avec des billes de verre contenues dans
le dispositif
décrit ci-dessus, dans des conditions permettant de créer une interaction
entre les dits micro-
organismes et les billes de verre, et d'obtenir les dits micro-organismes
captés sur les billes de
verre,
- une étape supplémentaire d'élution des micro-organismes précédemment
captés dans des
conditions permettant la séparation des susdits micro-organismes captés des
susdites billes de
verre et la récupération des dits micro-organismes.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé tel que décrit
ci-dessus, dans lequel l'étape d'élution est réalisée en utilisant une
solution de type chimique.
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Au sens de la présente invention, les solutions d'élution de type chimique
pouvant être utilisées sont
par exemples : NaCl 1M, Tris 50mM pH 7,5, Tris 50mM pH 9,5, sodium
hexametaphosphate 0,01% à
0,1% EDTA 0,1 à 10%, bicarbonate de soude 1%, citrate de sodium 10%, acide
acétique 0,1 à 10%,
méthanol 0,1 à 10%, pluronic F-127 0,01 à 0,1% (poloxamère 407, copolymère non-
ioniques à trois
.. blocs : Poly(éthylène glycol)-block-poly(propylène glycol)-block-
poly(éthylène glycol)).
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé tel que décrit
ci-dessus, dans lequel la mise en contact de l'échantillon avec les billes de
verre ou le dispositif a lieu
de façon statique ou en flux.
Au sens de la présente invention, on entend par de façon statique , le fait
que la mise en contact
entre l'échantillon et les billes de verre a lieu dans un récipient sans qu'il
y ait un mouvement continu
de l'échantillon et que l'échantillon ne soit renouvelé au cours de la mise en
contact. La mise en
contact de façon statique nécessite qu'à la fin du temps de contact
l'échantillon soit séparé des billes
de verre. Cette étape peut par exemple se réaliser par aspiration du liquide à
travers un fritté ou par
prélèvement du liquide.
Lorsque le procédé de captation est réalisé en statique, l'étape de mise en
contact de l'échantillon
contenant les micro-organismes avec des billes de verre est réalisée sur une
durée de 5 à 15 minutes
avant que l'aspiration ne soit déclenchée et réalisée à l'aide de la chambre à
vide.
Au sens de la présente invention, on entend par en flux , le fait que la
mise en contact entre
l'échantillon et les billes de verre ait lieu dans un récipient permettant de
faire s'écouler de façon
continue l'échantillon entre les billes de verre.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé tel que décrit
ci-dessus, dans lequel les micro-organismes sont choisis parmi les bactéries,
et les Fungi, notamment
les levures et les champignons.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé tel que décrit
ci-dessus, dans lequel les Fungi appartiennent aux genres Absidia, Alternaria,
Aspergillus,
Aureobasidium, Botrytis, Brettanomyces, Byssochlamys, Candida, Chaetomium,
Cladosporium,
Colle totrichum, Cryptococcus, Debaryomyces, Emericella, Epicoccum,
Eupenicillium, Eurotium,
Fusarium, Galactomyces, Geotrichum, Gliocladium, Hanseniaspora, Humicola,
Hyphopichia,
Kluyveromyces, Lichtheimia, Lodderomyces, Meyerozyma, Monascus, Mucor,
Mycocladus,
Neosartorya, Nigrospora, Paecilomyces, Penicillium, Pestalotia, Phoma,
Phytophthora, Pichia,
Pythium, Rhizoctonia, Rhizopus, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycopsis,
Schizosaccharomyces, Sclerotinia, Scopulariopsis, Serpula, Stemphylium
Talaromyces, Thielaviopsis,
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Torulaspora, Tri choderma, Tri chosporon, Trichothetium, Ulocladium,
Verticillium, Wallemia,
Wickerhamomyces, Xylaria, Zygosaccharomyces.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé tel que décrit
ci-dessus, dans lequel les bactéries sont des bactéries Gram + ou Gram ¨.
Les bactéries Gram + sont mises en évidence par la technique de coloration de
Gram. Après
coloration, lesdites bactéries apparaissent en couleur mauve lors d'une
analyse microscopique. En
revanche, les bactéries Gram ¨ ne sont pas colorées en mauve à l'issue du test
de coloration de Gram.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé tel que décrit
ci-dessus, dans lequel les bactéries appartiennent aux genres Acetobacter,
Achromobacter,
Acidovorax, Acinetobacter, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Alcaligenes,
Alicyclobacillus,
Aquaspirillum, Asaia, Bacillus, Bifidobacterium sp., Borde tella,
Brachybacterium, Brevibacillus,
Brevibacterium, Brevundimonas, Burkholderia, Buttiauxella, Campylobacter,
Carnobacterium,
Cellulomona, Citrobacter, Clavibacter Clos tridium, Corynebacterium,
Cronobacte, Cupriavidu,
Curtobacterium, Elizabethkingia, Enteractinococcus, Enterobacter,
Enterococcus, Escheri chia,
Flacklamia, Flavobacterium, Geobacillus, Glutamicibacte, Halobacillus,
Klebsiella, Kocuria,
Lactobacillus, Lactococcus, Leclercia, Lelliottia, Leuconos toc,
Lysinibacillus, Macrococcus,
Methylobacteriu, Microbacterium spp. (CDC A-5), Micrococcus, Moraxell,
Mycobacterium,
Nesterenkonia, Oceanobacillus sp, Ochrobactrum, Paenibacillus, Pandorae, Pan
toea, Paracoccus,
Pas teurell, Pediococcus, Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Ralstonia,
Rhizobium,
Roseomona, Rothia, Salmonella, Sanguibacter, Serratia, Shewanella,
Sphingomonas,
Sporolactobacillus, Sporosarcina, Staphylococcus, Stenotrophomonas,
Streptococcus, Streptomyces,
Thermoanaerobacterium, Variovorax, Virgibacillus
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un procédé tel que décrit
ci-dessus, dans lequel l'échantillon liquide ou visqueux est choisi parmi :
- un échantillon biologique, humain ou vétérinaire, tel que l'urine, le
sang, le liquide synovial,
la lymphe, le liquide lacrymal, les sécrétions, les muqueuses,
- un échantillon pharmaceutique, tel que les solutions injectables, les
sirops, les vaccins, les
collyres, les gels ophtalmiques,
- un échantillon cosmétique, tel que les démaquillants, produits pour le
nettoyage de la peau,
déodorants, produits destinés au rasage, autobronzants, crèmes de protection
solaire,
dissolvants, shampoings, après-shampoings,
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- un échantillon alimentaire, tel que les boissons, notamment l'eau (plate,
pétillante et/ou
aromatisée), le lait, les jus de fruits, tel que le jus d'orange, les sodas,
les boissons alcoolisées,
les boissons à base de thé, les viandes, les plats cuisinés, les produits
laitiers, les ovoproduits,
- Un échantillon d'eaux de process, tel qu'un échantillon issu des boucles
de nettoyage, de l'eau
5 de production,
- Un échantillon de type environnemental, tel que des échantillons marins,
ou pluviaux.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique , un
échantillon provenant
d'un liquide corporel ou d'un tissu d'un corps humain ou animal.
10 Des exemples d'échantillons biologiques pouvant être utilisées sont
l'urine, le sang, le liquide
synovial, la lymphe, le liquide lacrymal, les sécrétions, les muqueuses.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon pharmaceutique ,
un échantillon
provenant d'un produit pharmaceutique contenant des substances chimiques,
naturelles ou
15 synthétiques à usage humain ou vétérinaire.
Des exemples d'échantillons pharmaceutiques pouvant être utilisés sont les
solutions injectables, les
sirops, les vaccins, les collyres, les gels ophtalmiques, les solutions
nasales, les compléments de
vaccination rendus liquide, les poudres rendues liquide.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon cosmétique , un
échantillon provenant
d'un produit cosmétique contenant une substance ou un mélange destiné à être
mise en contact avec
les diverses parties superficielles du corps humain, en vue, exclusivement ou
principalement, de les
nettoyer, de les parfumer, d'en modifier l'aspect, de les protéger, de les
maintenir en bon état ou de
corriger les odeurs corporelles.
Des exemples d'échantillons cosmétiques pouvant être utilisés sont les
démaquillants, produits pour le
nettoyage de la peau, déodorants, produits destinés au rasage, autobronzants,
crèmes de protection
solaire, dissolvants, shampoings, après-shampoings, lotions démaquillantes,
crèmes, émulsions,
savons, agents de nettoyage.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon alimentaire , un
échantillon provenant
d'un produit alimentaire pouvant servir de nourriture ou de boisson à un être
humain ou animal.
Des exemples d'échantillons alimentaires pouvant être utilisés sont les
boissons, notamment l'eau
(plate, pétillante et/ou aromatisée), le lait, les jus de fruits, les sodas,
les boissons alcoolisées, les
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boissons à base de thé, les viandes, les plats cuisinés, les produits
laitiers, les ovoproduits, la
charcuterie, les poissons, les oeufs, les soupes, les concentrés de fruits.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon d'eaux de process
, un échantillon
provenant d'une usine de production, notamment un échantillon d'eau entrant
dans un procédé de
production. Des exemples d'échantillons d'eaux de process pouvant être
utilisés sont des échantillons
issu des boucles de nettoyage, de l'eau de production, une tour de lavage, une
tour aéroréfrigérante.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon de type
environnemental , un
échantillon provenant de l'environnement. Des exemples d'échantillons de type
environnementaux
sont pouvant être utilisés sont des échantillons de sols, d'eau, notamment
d'eau de mer, rivière, fleuve.
Un autre objet de l'invention est un kit comprenant des billes de verre, du
polyéthylèneimine et un
dispositif sous forme de colonne et des solutions d'élution de type chimique.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un kit comprenant des
billes de verre, du polyéthylèneimine et un dispositif sous forme de colonne
et des solutions d'élution
de type chimique, pour la captation de micro-organismes en vue d'un
diagnostic, ou en vue de
l'élimination ou de la diminution de la charge de micro-organismes
d'échantillons liquides ou
visqueux susceptibles de contenir lesdits micro-organismes.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne
un kit comprenant des
billes de verre, du polyéthylèneimine et un dispositif sous forme de colonne
pour son utilisation pour
mettre en oeuvre le dispositif selon l'invention et des solutions d'élution de
type chimique, pour la
captation de micro-organismes en vue d'un diagnostic, ou en vue de
l'élimination ou de la diminution
de la charge de micro-organismes d'échantillons liquides ou visqueux
susceptibles de contenir lesdits
micro-organismes.
Description des figures
[Fig 1A] Figure lA : Principe général de fonctionnement de
captation/élimination des
microorganismes en mode flux
La Figure lA représente le principe général de fonctionnement de la
captation/élimination des
microorganismes en mode flux.
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1 représente l'ajout de la solution potentiellement contaminée ; 2 représente
la colonne ; 3 représente
les billes de verre fonctionnalisées à l'aide de polyéthylèneimine ; 4
représente le fritté ; 5 représente
la solution dépourvue de ses microorganismes à la sortie de la colonne ; 6
représente un grossissement
des microorganismes immobilisés au contact des billes fonctionnalisées.
[Fig 1B] Figure 1B : Principe général de fonctionnement de l'élution en mode
flux
1 représente l'ajout de la solution d'élution; 2 représente la solution
d'élution à la sortie de la colonne
contenant les microorganismes précédemment immobilisés.
[Fig 2A] Figure 2A: Principe général de fonctionnement de
captation/élimination des
microorganismes en mode statique
La Figure 2A représente le principe général de fonctionnement de la
captation/élimination des
microorganismes en mode statique.
1 représente l'ajout de la solution potentiellement contaminée ; 2 représente
le contenant ; 3 représente
la solution potentiellement contaminée mise en contact avec les billes de
verre ; 4 représente les billes
de verre fonctionnalisées à l'aide de polyéthylèneimine ; 5 représente un
grossissement des
microorganismes immobilisés au contact des billes fonctionnalisées ; 6
représente la récupération ou
l'élimination de la solution dépourvue de ses microorganismes.
[Fig 2B] Figure 2B : Principe général de fonctionnement de l'élution en mode
statique
1 représente l'ajout de la solution d'élution; 2 représente le prélèvement de
la solution d'élution
pourvue des microorganismes élués.
EXEMPLES
Exemple 1 Protocole générale d'adsorption du polyéthylèneimine sur les
billes de verre
lg de billes de verre de diamètre 105-150 !,tm (réf. 15927, Polysciences
Europe GmbH, Germany) sont
pesées directement dans des colonnes de filtration 2,4 mL en polypropylène
munies d'un fritté en
PEHD de porosité 45-90 lm (réf. 208-3049-03S, Evergreen Scientific, USA).
L'ensemble est placé
sur une plaque adaptée pour pouvoir placer 24 colonnes simultanément
(NucleoVac Adapter Plate,
réf.740694, Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany) qui s'intègre à une chambre
à vide
NucleoVac96 (réf. 740681, Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany). Le tout est
relié à une
pompe à vide KNF type N816.1.2KN.45.18 (KNF Neuberger SAS, France). Une
solution de
polyéthylèneimine ramifié (1,3 kDa, réf. 482595 Sigma-Aldrich) à 0,166% dans
de l'eau désionisée
biologique (Réf. W4502, Sigma-Aldrich, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) est
additionnée à
chaque colonne. Le mélange est homogénéisé pendant 10 minutes à l'aide d'une
pointe à filtre de 10
1, suivi d'un rinçage par de l'eau de biologie moléculaire (1 m1). Pour chaque
aspiration, la pompe à
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vide est réglée sur 700 mbar de dépression. Après rinçage, les colonnes sont
fonctionnalisées et prêtes
à l'emploi.
Exemple 2 : Préparation des souches
Les souches de microorganismes ont été décongelées à l'aide d'une cryobille
dans un milieu liquide
ou solide approprié avant d'être placées à une température permettant leur
croissance pendant le temps
nécessaire à leur croissance. Les souches ont subi deux repiquages minimums à
2% dans un milieu
liquide approprié ou par transfert sur milieu solide avant d'être utilisées
pour les essais.
Exemple 3 : Préparation des suspensions de travail
Les suspensions filles ont été réalisées dans de l'eau supplémentée ou non de
NaCl à 0,85% par
dilutions successives (habituellement au dixième). A partir des suspensions
filles réalisées, des
matrices liquides (jus de fruits, sodas, eaux plates, gazeuses, aromatisées ou
pas) ont été inoculées afin
de contenir des microorganismes pour les essais. Pour ce faire, la dernière
dilution a été réalisée dans
la matrice à tester.
Exemple 4 : Protocole général de captation en statique
Un faible volume (de 500 jiL à 1 mL) de solution contenant une quantité donnée
de microorganismes
(de 20 à ¨107 unités) a été introduit dans une colonne contenant lg de billes
de verre fonctionnalisées
par du polyéthylèneimine. Un temps de contact de 5 à 15 min a été appliqué
avant que l'aspiration ne
soit déclenchée et réalisée à l'aide de la chambre à vide, la dépression de la
pompe étant fixée sur 50
mbar.
Exemple 5 : Protocole général de captation en flux
Un volume donné (de 500 jiL à 100 mL) de solution contenant une quantité
donnée de
microorganismes (de 20 à ¨107 unités) a été filtré à travers une colonne
contenant lg de billes de verre
fonctionnalisées par du polyéthylèneimine. L'aspiration a été déclenchée avant
l'introduction de la
solution et a été réalisée à l'aide de la chambre à vide, la dépression de la
pompe a été fixée sur 50
mbar.
Exemple 6 : Protocole général d'élution chimique
Après passage de l'échantillon d'intérêt au travers de la colonne, une
solution d'élution a été introduite
afin de procéder au décrochage des microorganismes. La quantité de solution
d'élution a été variable
mais a été au minimum de 500 jiL afin de recouvrir toutes les billes présentes
dans la colonne. La
solution a été de nature chimique.
Toutes les solutions chimiques (NaCl 1M, Tris 50mM pH 7,5, Tris 50mM pH 9,5,
sodium
hexametaphosphate 0,01% à 0,1 EDTA 0,1 à 10%, bicarbonate de soude 1%, sodium
citrate 10%,
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acide acétique 0,1 à 10%, méthanol 0,1 à 10%, pluronic F-127 0,01 à 0,1%) ont
été préparées à l'aide
d'eau désionisée puis filtrée sur filtre 0,2 um. Les pourcentages cités
précédemment correspondent à
un rapport poids/volume d'eau (g/100 mL). L'aspiration a été déclenchée avant
introduction de la
solution ou après un temps de contact plus ou moins important (5 minutes
minimum testées). La
filtration a été réalisée à l'aide de la chambre à vide, la dépression de la
pompe étant fixée sur 700
mbar.
Exemple 7 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution
L'évaluation du taux de captation ou d'élution a pu être réalisée de façons
différentes en fonction de la
quantité de microorganismes présents et du volume de solution à analyser.
Il a par exemple été possible d'évaluer le nombre de microorganismes présents
dans une solution
donnée à l'aide (1) de la cytométrie en flux, (2) de la filtration sur
membrane déposée sur milieu
gélosé, (3) par observation au microscope ou encore (4) de l'étalement sur
boite de Petri.
Exemple 7-1: Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par cytométrie en
flux
La cytométrie en flux a nécessité une concentration en microorganisme
relativement importante pour
obtenir un résultat fiable (-105 UFC/mL). Les résultats en termes de taux de
captation et d'élution ont
été obtenus comme décrits ci-après. Les perméats obtenus après captation ont
été analysés au
cytomètre pour évaluer le nombre de microorganismes non captés. Il a ainsi été
possible de déduire le
nombre de microorganismes captés sur la colonne étant donné que la quantité de
microorganismes
préalablement introduits dans la colonne est connue (dénombrement réalisé au
cytomètre). Pour
l'élution, le nombre de microorganismes élués a directement été mesuré à
l'aide du cytomètre. A noter
qu'il a été possible de marquer les microorganismes ce qui a permis à la fois
de mieux discriminer les
microorganismes du bruit de fond et en même temps de décrire leur état
physiologique (vivants ou
morts) à un instant donné.
Exemple 7-2 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par filtration
sur membrane déposée sur
milieu gélosé
La filtration sur membrane a permis, elle, de concentrer les microorganismes.
Il a ensuite été possible
de déposer cette membrane sur un milieu favorable à leur croissance à une
température donnée et
pendant un temps défini. Les filtrations indépendantes des perméats et des
éluats ont permis ainsi de
calculer les taux de captation et d'élution de la même manière que pour la
cytométrie en flux. Pour
cela, il a été nécessaire de compter les colonies sur la membrane après le
temps d'incubation.
Exemple 7-3 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par filtration
sur membrane pour
observation au microscope
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La filtration sur membrane a permis de concentrer les microorganismes et de
les observer après
marquage directement au microscope. De la même manière que précédemment, il a
ensuite été
nécessaire de compter les microorganismes présents sur la membrane à l'aide
d'un microscope. Pour
rappel, les marqueurs permettent de décrire l'état physiologique des
microorganismes (vivants ou
5 morts) à un instant donné ce que ne permet pas la croissance sur membrane
en boite de Petri (Exemple
7-2) ou l'étalement sur milieu gélosé (Exemple 7-4) pour lesquels seuls les
microorganismes viables et
cultivables sont observables, et ce, au minimum 24 heures après le dépôt.
Exemple 7-4 : Evaluation du taux de captation et/ou d'élution par filtration
sur membrane pour de
10 l'étalement sur boite de Petri
Une autre méthode consiste en l'étalement de tout ou une partie des perméats
et des éluats sur un
milieu gélosé (en boite de Petri) favorable à la croissance des
microorganismes. Cette méthode a
nécessité un temps d'incubation variable à une température donnée. De la même
manière que
précédemment, il a ensuite été nécessaire de compter les microorganismes
présents sur la boite afin
15 d'en déduire les taux de captation et d'élution, le nombre de
microorganismes introduits étant connu
grâce à la même méthode d'étalement.
Exemple 8 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
20 300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 um ont été réparties dans
des colonnes de 0,8 mL munies
d'un fritté de 20 um. 142,8 uL d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine
(ramifié, 25 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min
a été respecté entre les
billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide
d'un système de chambre à
vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne
a été réalisé à l'aide
25 de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe
a ensuite été réglée sur
700 mbar de dépression pour un séchage pendant 5 minutes. Après cette étape,
les billes de verre
fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes
Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d'Escherichia cou
CIP 54.8 a été
réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85%
NaCl et étalements sur
milieux gélosés en boite de Petri, ainsi qu'en cytométrie. 500 uL de
suspension à la concentration
souhaitée ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé
en flux à l'aide du système
de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 uL de
suspension ayant traversé la
colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé par
dilutions successives au
dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements sur milieux
gélosés en boite de Petri,
ainsi que par cytométrie.
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- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes
Le Tableau 1 présente le nombre d'Unités Formant Colonie (UFC) introduites et
le taux de captation
correspondant, évalué par étalement sur milieux gélosés en boite de Petri.
Colonne T_TC introduites Pourcentage de captation
Moyenne
9.82x1
2 9.32x1 71.99'µ
3 9.rx116.:
Tableau 1 Résultats de la captation de microorganismes
Le Tableau 2 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le
taux de captation
correspondant, évalué par cytométrie.
Colonne 1:FC introduites Pourcentage de captation Moenne
1 1.4;5x1r: 91.27'
2 1.4Cx1C.-
3 1.4.:5.x1C 71.53'
Tableau 2 Résultats de la captation de microorganismes
Exemple 9:
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 um ont été réparties dans des
colonnes de 0,8 mL munies
d'un fritté de 20 um. 142,8 uL d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine
(ramifié, 1,3 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutées dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min
a été respecté entre
les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre
à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la
colonne a été réalisé à l'aide
de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a
ensuite été réglée sur
700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les
billes de verre
fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes
Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d'Escherichia cou
CIP 54.8 a été
réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85%
NaCl et étalements sur
milieux gélosés en boite de Petri, ainsi qu'en cytométrie. 500 uL de
suspension à la concentration
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souhaitée ont été ajoutés par colonne et le procédé de captation a été réalisé
en flux à l'aide du système
de chambre à vide. La dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 p.1_, de
suspension ayant traversé la
colonne ont été collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé par
dilutions successives au
dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements sur milieux
gélosés en boite de Petri,
ainsi que par cytométrie.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes
Le Tableau 3 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le
taux de captation
correspondant, évalué par étalement sur milieux gélosés en boite de Petri.
Colonne T_TC introduites Pourcentage de captation
Moyenne
1 55.71' à
2. 91.5j"0 93.2700
:952,x106
4 9....54x 1 C 93.54's
5: 9.j4x1Cre 93.5%
Tableau 3 Résultats de la captation de microorganismes
Le Tableau 4 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le
taux de captation
correspondant, évalué par cytométrie.
Colonne T_TC introduites :Pourcentage de captation
:Nloyenne
1.25x1C-
:2 :14 5x. 1::.92.5% 94.370
53.54' à
1.25x.1C 94.04" à
5 1.:5x103 S3.:31% 94.:D2 0
1.25x105
Tableau 4 Résultats de la captation de microorganismes
Exemple 10:
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- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 !,tm ont été réparties dans des
colonnes de 0,8 mL munies
d'un fritté de 20 p.m. 142,8 !,t.L d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine
(ramifié, 1,3 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min
a été respecté entre les
billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide
d'un système de chambre à
vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne
a été réalisé à l'aide
de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a
ensuite été réglée sur
700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les
billes de verre
fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes
Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d'Escherichia cou
C1P 54.8 a été
réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85%
NaCl et étalements sur
milieux gélosés en boite de Petri. 500 !,t.L de suspension à la concentration
souhaitée ont été ajoutés
par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du
système de chambre à vide. La
dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 !,t.L de suspension ayant
traversé la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement est réalisé par dilutions
successives au dixième dans de
l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de
Petri.
- Protocole d'élution des micro-organismes
2 élutions successives au NaCl 1M de 500 !,t.L chacune ont été réalisées par
colonne. Les deux élutions
ont été réalisées en respectant un temps de contact de 5 min à température
ambiante. L'aspiration a été
réalisée à 50 mbar de dépression. Les deux éluats ont été collectés dans des
tubes différents à l'aide du
système de chambre à vide. Les 500 !,t.L d'éluat ayant traversé la colonne ont
été collectés dans un tube
puis un dénombrement a été réalisé par dilutions successives au dixième dans
de l'eau physiologique
0,85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite de Petri.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes
Le Tableau 5 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le
taux de captation
correspondant, évalué par étalement sur milieux gélosés en boite de Petri.
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Colonne "[TC introduites Pourcentage de captation
loyenne
1 9.5.CS1CT
2 9.5Cx1C:i 89.04" 28.1:5.
3 9.1..Cx1C14
Tableau 5 Résultats de la captation de microorganismes
- Efficacité de l'élution
Le Tableau 6 présente le taux d'élution correspondant à chaque colonne.
Colonne Pourcentage cumulé
cl'éltition Moyenne
33.2790
3 93.7Sc!fo.
Tableau 6 Résultats de l'élution de microorganismes
Le rendement global est donc de 77,98%.
Exemple 11:
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 !,tm ont été réparties dans des
colonnes de 0,8 mL munies
d'un fritté de 20 lm. 142,8 .1_, d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine
(ramifié, 1,3 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min
a été respecté entre les
billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide
d'un système de chambre à
vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne
a été réalisé à l'aide
de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a
ensuite été réglée sur
700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les
billes de verre
fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes
Dans un premier temps, un dénombrement de la suspension mère d'Escherichia cou
C1P 54.8 a été
réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique 0,85%
NaCl et étalements sur
milieux gélosés en boite de Petri. 500 !,t.L de suspension à la concentration
souhaitée ont été ajoutés
par colonne et l'aspiration a été réalisée après un temps de contact de 5 min
de la solution avec les
billes contenues dans la colonne. L'aspiration a été réalisée à l'aide du
système de chambre à vide. La
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dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 !,t.L de suspension ayant
traversé la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement a été réalisé par dilutions
successives au dixième dans
de l'eau physiologique 0,85% NaCl et étalements sur milieux gélosés en boite
de Petri.
5 - Protocole d'élution des micro-organismes
Une élution au NaCl 1M de 500 !,t.L a été réalisée par colonne. L'élution a
été réalisée en respectant un
temps de contact de 5 min à température ambiante. L'aspiration a été réalisée
à 50 mbar de dépression.
Les 500 !,t.L d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube
puis un dénombrement a
été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique
0,85% NaCl et étalements
10 sur milieux gélosés en boite de Petri.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes
Le Tableau 7 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le
taux de captation
correspondant, évalué par étalement sur milieux gélosés en boite de Petri.
Colonne 1LT-C introduites Pourcentage de captation
Moyenne
1 27x:1::-
2. 96.95%
3 1.2.7x101
Tableau 7 Résultats de la captation de microorganismes
- Efficacité de l'élution
Le Tableau 8 présente le taux d'élution correspondant à chaque colonne.
Colonne Pourcentage cumulé cl'élution Moyenne
1 73.94 O
2 o S1.53 ô
:3 84A4%:
Tableau 8 Résultats de l'élution de microorganismes
Le rendement global est donc de 78,83%.
Exemple 12 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
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956 mg de billes de verre de diamètre 105-150 p.m ont été réparties dans des
colonnes de 0,8 mL
munies d'un fritté de 20 lm. 455,1 i.t.L d'une solution aqueuse de
polyéthylèneimine (ramifié, 1,3 kDa)
à 0,16% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact
de 5 min a été respecté
entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de
chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de
la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même
dépression.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes
Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre de la suspension mère
d'Escherichia cou CIP
54.8 a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau
physiologique 0,85% NaCl ou du
Tris 50 mM pH 7,5. 500 i.t.L de suspension à la concentration souhaitée ont
été ajoutés par colonne et
le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à
vide. La dépression a été
réglée sur 50 mbar. Les 500 pi de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube
puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au
dixième dans de l'eau
physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Protocole d'élution des micro-organismes
Trois élutions successives à l'aide de 500 pi de solution d'élution (Tris 50
mM pH 9,5, NaCl 1M) ont
été réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant
systématiquement un temps de
contact de 5 min à température ambiante. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar
de dépression. Les 500
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un
dénombrement au
cytomètre est réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau
physiologique 0,85% NaCl ou
du Tris 50 mM pH 7,5
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes
Le Tableau 9 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le
taux de captation
correspondant, évalué par cytométrie.
Colonne 1TC introduites Pourcentage de captation Moyenne
1.72x1:
.2 1.72x1C'
3 1.72x1rr S3.35%
Tableau 9 Résultats de la captation de microorganismes
- Efficacité de l'élution
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Le Tableau 10 présente la colonne et le taux d'élution correspondant évalué
par cytométrie.
C o loin] e Pourcentage cumulé crelution Moyenne
91.S=2)0
2 91t.5S 0
3 S-1.110c
Tableau 10 Résultats de l'élution de microorganismes
Le rendement global est donc de 75,24%.
Exemple 13 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 p.m ont été réparties dans des
colonnes de 0,8 mL munies
d'un fritté de 20 m. 142,8 pi d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine
(ramifié, 1,3 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min
a été respecté entre les
billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide
d'un système de chambre à
vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne
a été réalisé à l'aide
de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a
ensuite été réglée sur
700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les
billes de verre
fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes
Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre des suspensions mères de
Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa ATCC 13388 et Salmonella enterica subsp.
enterica serovar
Enteritidis ATCC 13076 a été réalisé par dilutions successives au dixième dans
de l'eau physiologique
0,85% NaCl du Tris 50 mM pH 7,5. 500 pi de suspension à la concentration
souhaitée ont été ajoutés
par colonne et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du
système de chambre à vide. La
dépression a été réglée sur 50 mbar. Les 500 pi de suspension ayant traversé
la colonne ont été
collectés dans un tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par
dilutions successives au
dixième dans de l'eau physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes
Le Tableau 11 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le
taux de captation
correspondant, évalué par cytométrie.
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Espèce Colonne ETC introduites Pourcentage de captation
Moyenne
1 5.19x1 Cr' 98,19%
Staphylacaccus aureus 2 5.19xIO 99.18%
98.48%
3 519x106 98.06%
4 1.46x10 94.15%
Pseudomona,5 aeniginasa
1.46x10- 90.029 89.08%
ATCC 13388
6 1.46x107 83.08%
7 1.07x101
ct 94.56?.'3
.S-idoireUct subsp.
emerica serovar Enteritidis 8 1.07x107 94.74%
94.16%
ATCC 13076
9 1.07x107 93.09%
Tableau 11 Résultats de la captation de microorganismes
Exemple 14 :
5 - Protocole de fonctionnalisation des
billes de verre
300 mg de billes de verre de diamètre 30-50 p.m ont été réparties dans des
colonnes de 0,8 mL munies
d'un fritté de 20 m. 142,8 pi d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine
(ramifié, 1,3 kDa) à 0,5%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 5 min
a été respecté entre les
billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à l'aide
d'un système de chambre à
vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la colonne
a été réalisé à l'aide
de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. La pompe a
ensuite été réglée sur
700 mbar de dépression pour séchage durant 5 min. Après cette étape, les
billes de verre
fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes
Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre des suspensions mères
d'Escherichia cou CIP
54.8 a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau
physiologique 0,85% NaCl du
Tris 50 mM pH 7,5. 500 pi de suspension à la concentration souhaitée ont été
ajoutés par colonne et
le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à
vide. La dépression a été
réglée sur 50 mbar. Les 500 pi de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube
puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au
dixième dans de l'eau
physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Efficacité de la captation/élimination des micro-organismes
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Le Tableau 12 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le
taux de captation
correspondant, évalué par cytométrie.
Colonne UFC introduites Pourcentage de captation
Moyenne
1 1.33x10'. 99.40 -0
2.: 1.33x101. 100.00'
99. Ci9 ..0
:133É.103'.
4 1.33x1:7:1 99.97c',
5. L3xiO5 99.490.0
99.550o
..133x105 99.21Po
7 1.33x10- 98.84'0
1_33x1e .98.15 -0
9.S.i=OQ:0
133k107 97
Tableau 12 Résultats de la captation de microorganismes
Exemple 15 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
1 g de billes de verre de diamètre 105-150 um ont été réparties dans des
colonnes de 0,8 mL munies
d'un fritté de 20 um. 500 uL d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine
(ramifié 1,3 kDa) à 0,166%
(m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de 10 min
a été respecté entre
les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de chambre
à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de la
colonne a été réalisé à l'aide
de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même dépression. Après cette
étape, les billes de verre
fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes
Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre des suspensions mères des
microorganismes
utilisés a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau
physiologique 0,85% NaCl ou
du Tris 50 mM pH 7,5. 500 uL de suspension à la concentration souhaitée ont
été ajoutés par colonne
et le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de
chambre à vide. La dépression a
été réglée sur 50 mbar. Les 500 uL de suspension ayant traversé la colonne ont
été collectés dans un
tube puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives
au dixième dans de
l'eau physiologique 0,85% NaCl du Tris 50 mM pH 7,5.
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- Protocole d'élution des micro-organismes
Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 pi) de sodium
hexametaphosphate 0,1% ont été
réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant
systématiquement un temps de
contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de
chaque élution. Les 3,5
5 mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar
de dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un
dénombrement au cytomètre a
été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique
0,85% NaCl ou du Tris 50
mM pH 7,5.
10 - Efficacité du couple captation/élution des micro-organismes
Le Tableau 13 présente le rendement global de la captation/élution de
microorganismes.
Souches Rendement
global
subsp etufert serovar Choleraesuis CEP 55A33
Protes mirabilis CIP A235 94.5.59.µ
Bacilids cereits ATCC 10876 71.32%
Bacflhis tJ .. gie ATCC 10792 86.03%
EteïobacterckcwaeNCTC 13406 75_88%
^ taro coccei
s faecim ATCC 27270 81.32%
Poteu.alli'abîf ATCC 12453 82.19%
Salmohelia ettm.f.ca subsp entoila! serovarEnteritidis ATCC 13076
Tableau 13 Résultats de la captation/élution de microorganismes
15 Exemple 16:
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
1 g de billes de verre de diamètre 105-150 p.m ont été réparties dans des
colonnes de 0,8 mL munies
d'un fritté de 20 m. 500 pi d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine
(ramifié, 1,3 kDa) à
0,166% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de
10 min a été respecté
20 entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été
éliminée à l'aide d'un système de
chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de
la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même
dépression. Après cette étape, les
billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à
l'emploi.
25 - Protocole de captation/élimination des micro-organismes
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Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre des suspensions mères des
microorganismes
utilisés a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau
physiologique 0,85% NaCl du
Tris 50 mM pH 7,5. 500 pi de suspension à la concentration souhaitée ont été
ajoutés par colonne et
le procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à
vide. La dépression a été
réglée sur 50 mbar. Les 500 pi de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube
puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au
dixième dans de l'eau
physiologique 0,85% NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Protocole d'élution des micro-organismes
Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 pi) de sodium
hexametaphosphate 0,01% ont été
réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant
systématiquement un temps de
contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de
chaque élution. Les 3,5
mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de
dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un
dénombrement au cytomètre a
été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique
0,85% NaCl ou du Tris 50
mM pH 7,5.
- Efficacité du couple captation/élution des micro-organismes
Souches Rendement
global
POtÉ infrah*5 CIP A235 91.7t5o
Pseudamona 5 aeruginosa ATCC 133 S 3 78.86%
Salmonella re'ica subsp.ente'lect serovarEntelitidis ATCC 13076 72.79%
Myerazyma çqi;.1h nondii ATCC 6260 93.08%
Hansen(' %-oo.cf g t&eoJi ATCC 32857 78.63%
Striphylococcus epidernie5 ATCC 49134 91.42%
Staphyloccecu 5 aui.et 95.18%
Sainionella niterica 5 i sp. enterica o.o var holeresiis CIP 55.133 85.89%
Proteus mirabilis CIP A235 90.76%
Serratia marcescens CIP 58.14 85.15%
Escherichia CIP 54.8 92.15%
8aci!'s pumis ATCC 14884 99.32%
'ID taro acier cloaca NCTC 13406 93.95%
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Tableau 14 Résultats de la captation/élution de microorganismes
Exemple 17 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
1 g de billes de verre de diamètre 105-150 p.m ont été réparties dans des
colonnes de 0,8 mL munies
d'un fritté de 20 m. 500 !JI d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine
(ramifié, 1,3 kDa) à
0,166% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de
10 min a été respecté
entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de
chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de
la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même
dépression. Après cette étape, les
billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à
l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes
Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre des suspensions mères
d'Escherichia cou CIP
54.8 a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau
physiologique 0,85% NaCl ou du
Tris 50 mM pH 7,5. 500 pi d'une boisson à base de thé (Nestea goût pêche)
contenant une
concentration souhaitée en microorganismes ont été ajoutés par colonne et le
procédé de captation a
été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à vide. La dépression a été
réglée sur 50 mbar. Les
500 !JI de suspension ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube
puis un dénombrement
au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau
physiologique 0,85%
NaCl ou du Tris 50 mM pH 7,5.
- Protocole d'élution des micro-organismes
Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 pi) de sodium
hexametaphosphate 0,01% ont été
réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant
systématiquement un temps de
contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de
chaque élution. Les 3,5
mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de
dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un
dénombrement au cytomètre a
été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique
0,85% NaCl ou du Tris 50
mM pH 7,5.
- Efficacité de la capatation
Le Tableau 15 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le
taux de captation
correspondant, évalué par cytométrie
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Colonne UFC introduites Pourcentage de captation Moyenne
53.41.7"'
2 1 Tx1CS5.77% 96.4.7.;
'3: 1.57X1C?
Tableau 15 Résultats de la captation de microorganismes
- Efficacité de l'élution
Le Tableau 16 présente la colonne et le taux d'élution correspondant évalué
par cytométrie.
Colonne Pourcentage d'élution Moyenne
'2:: FS.14?-.;
92.42P0
Tableau 16 Résultats de l'élution de microorganismes
Le rendement global est donc de 88,2%
Exemple 18 :
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
1 g de billes de verre de diamètre 105-150 m ont été réparties dans des
colonnes de 2,4 mL munies
d'un fritté de 45-90 m. 500 L d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine
(ramifié, 1,3 kDa) à
0,166% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de
10 min a été respecté
entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de
chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de
la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même
dépression. Après cette étape, les
billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à
l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes
Dans un premier temps, un dénombrement au cytomètre de la suspension mère de
Serratia marcescens
CIP 58.14 a été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau
physiologique 0,85% NaCl
via la cytométrie. 8 mL de suspension à la concentration souhaitée ont été
ajoutés par colonne et le
procédé de captation a été réalisé en flux à l'aide du système de chambre à
vide. La dépression a été
réglée sur 50 mbar. Les 8 mL de suspension ayant traversé la colonne ont été
collectés dans un tube
puis un dénombrement au cytomètre a été réalisé par dilutions successives au
dixième dans de l'eau
physiologique 0,85% NaCl.
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- Protocole d'élution des micro-organismes
Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 pi) de sodium
hexametaphosphate 0,01% ont été
réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant
systématiquement un temps de
contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de
chaque élution. Les 3,5
mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de
dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un
dénombrement au cytomètre a
été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique
0,85% NaCl.
- Efficacité de la captation
Le Tableau 17 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le
taux de captation
correspondant, évalué par cytométrie
Colonne 1L-FC introduites Pourcentage
de captation 7%loyenne
1 1.05x1C- L'.53.1c
8:.'% 83.57 ù
3 1 .03x107 S3.71 iy
Tableau 17 Résultats de la captation de microorganismes
- Efficacité de l'élution
Le Tableau 18 présente la colonne et le taux d'élution correspondant évalué
par cytométrie.
Colonne Pourcentage cumulé d'élution Moyenne
1
2
3
Tableau 18 Résultats de l'élution de microorganismes
Le rendement global est donc de 83,57%.
Exemple 19 : Application sur les levures
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
1 g de billes de verre de diamètre 105-150 !,tm ont été réparties dans des
colonnes de 2,4 mL munies
d'un fritté de 45-90 iam. 500 iaL d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine
(ramifié, 1,3 kDa) à
0,166% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de
10 min a été respecté
entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de
CA 03150552 2022-02-08
WO 2021/083907 PCT/EP2020/080199
chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de
la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même
dépression. Après cette étape, les
billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à
l'emploi.
5 - Protocole de captation/élimination des micro-organismes
Les suspensions mères de Candida albicans (ATCC 14053), Candida parapsilosis
(ATCC 22019) et
Saccharomyces cerevisiae (ATCC 18824) sont diluées au 10ème dans de l'eau
physiologique 0.85%
NaCl puis dénombrées par cytométrie en flux. 500 p.L de suspension à la
concentration souhaitée ont
10 été ajoutés par colonne et aspirés en flux à travers la colonne grâce au
système de chambre à vide (50
mbar) et de pompe. Un dénombrement des perméats a été réalisé par cytométrie.
- Protocole d'élution des micro-organismes
Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 p.L) de sodium
hexametaphosphate 0,01% ont été
15 réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant
systématiquement un temps de
contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de
chaque élution. Les 3,5
mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de
dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un
dénombrement au cytomètre a
été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique
0,85% NaCl.
- Efficacité de la captation
Le Tableau 19 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le
taux de captation
correspondant pour chaque souche, évalué par cytométrie.
to ri ne EFC introduites Pourcentage de captation
3.23E-1-25
7 E-C,5
(ii=3-: 3.52 E¨C= oc
Tableau 19 Résultats de la captation
- Efficacité de l'élution
Le Tableau 20 présente la colonne et le taux d'élution correspondant évalué
par cytométrie.
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Colonne Pourcentage d'élution
2.S o
;,..a=3) 6.7..;
Tableau 20 Résultats de l'élution
Exemple 20 : Application sur les champignons
- Protocole de fonctionnalisation des billes de verre
1 g de billes de verre de diamètre 105-150 !,tm ont été réparties dans des
colonnes de 2,4 mL munies
d'un fritté de 45-90 iam. 500 iaL d'une solution aqueuse de polyéthylèneimine
(ramifié, 1,3 kDa) à
0,166% (m/v) ont été ajoutés dans chacune des colonnes. Un temps de contact de
10 min a été respecté
entre les billes et le polyéthylèneimine. La solution a ensuite été éliminée à
l'aide d'un système de
chambre à vide et d'une pompe réglée sur 50 mbar de dépression. Un rinçage de
la colonne a été
réalisé à l'aide de 1 mL d'eau de biologie moléculaire avec la même
dépression. Après cette étape, les
billes de verre fonctionnalisées par du polyéthylèneimine ont été prêtes à
l'emploi.
- Protocole de captation/élimination des micro-organismes
Les suspensions mères de Fusarium oxysporum (UBOCC-A-112042) et Mucor
racemosus (ATCC
42647) sont diluées au 10ème dans de l'eau physiologique 0.85% NaCl puis
dénombrées par cytométrie
en flux. 500 !,t.L de suspension à la concentration souhaitée ont été ajoutés
par colonne et aspirés en
flux à travers la colonne grâce au système de chambre à vide (50 mbar) et de
pompe. Un
dénombrement des perméats a été réalisé par cytométrie.
- Protocole d'élution des micro-organismes
Trois élutions successives à l'aide de 4 mL (8x500 pi) de sodium
hexametaphosphate 0,01% ont été
réalisées par colonne. Les élutions ont été réalisées en respectant
systématiquement un temps de
contact de 5 min à température ambiante pour les 500 premiers microlitres de
chaque élution. Les 3,5
mL restants ont été passés en flux. L'aspiration a été réalisée à 50 mbar de
dépression. Les 4 mL
d'éluat ayant traversé la colonne ont été collectés dans un tube puis un
dénombrement au cytomètre a
été réalisé par dilutions successives au dixième dans de l'eau physiologique
0,85% NaCl.
- Efficacité de la captation
CA 03150552 2022-02-08
WO 2021/083907 PCT/EP2020/080199
42
Le Tableau 21 présente le nombre d'Unités Formant Colonie introduites et le
taux de captation
correspondant pour chaque souche, évalué par cytométrie.
Colonne UFC introduites Pourcentage de captation
(II=3) 5.1 E¨ii:=5 76. oc=
11=3L
Tableau 21 Résultats de la captation
- Efficacité de l'élution
Le Tableau 22 présente la colonne et le taux d'élution correspondant évalué
par cytométrie.
Colonne Pourcentage (relation
(y,=3 µ: õ _________________________
- = -
1,11=33. S
Tableau 22 Résultats de l'élution
