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Polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en
particulier polypeptide monomérique recombinant présentant une activité
hydrogénase
La présente invention porte sur un polypeptide monomérique
présentant une activité hydrogénase, en particulier sur un polypeptide
monomérique
recombinant présentant une activité hydrogénase, sur une cellule hôte incluant
ce
polypeptide monomérique et sur une cellule hôte incluant un polynucléotide
codant
pour ce polypeptide monomérique. La présente invention porte également sur un
procédé d'obtention d'un polypeptide monomérique présentant une activité
hydrogénase, en particulier sur un procédé d'obtention d'un polypeptide
monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase et sur
l'utilisation
d'un tel polypeptide monomérique, en particulier sur l'utilisation d'un tel
polypeptide
monomérique recombinant.
La disponibilité décroissante de sources d'énergie fossile et la crainte
d'un changement climatique dramatique ont favorisé l'émergence de technologies
propres et renouvelables. L'hydrogène (H2) est considéré comme un vecteur
d'énergie renouvelable prometteur en raison de sa forte teneur en énergie et
de
l'absence de pollution lors de son utilisation dans les piles à combustible.
La
production d'H2 est actuellement réalisée par extraction chimique
d'hydrocarbures
fossiles, électrolyse de l'eau ou pyrolyse de biomasse. Cependant, le manque
de
systèmes de production à la fois non-polluants et commercialement viables est
une
limitation majeure. L'utilisation de méthodes de production biotechnologique
d'H2,
aussi appelé bio-hydrogène, pourrait être une solution. Le nombre de
recherches
sur la production de bio-hydrogène a considérablement augmenté au cours de la
dernière décennie. Cela inclut la production microbienne principalement par le
processus de la fermentation dans les bactéries et de la photosynthèse dans
les
microalgues, mais aussi la génération enzymatique d'hydrogène par électro-
enzymologie >. Toutes ces méthodes reposent sur des enzymes particulières
appelées hydrogénases.
Les hydrogénases sont des métallo-enzymes qui catalysent la réaction
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chimique : 2 H+ + 2e- H2. Cette réaction de production ou de consommation
de
l'hydrogène dépendante de l'enzyme est définie comme l'activité hydrogénase.
La
réaction est réversible et sa direction dépend du potentiel redox des
composants
capables d'interagir avec l'enzyme. En présence d'H2 et d'un accepteur
d'électrons,
une hydrogénase consomme l'hydrogène. En présence d'un donneur d'électrons
de faible potentiel, une hydrogénase utilise des protons comme accepteurs
d'électrons et produit de l'H2. Les hydrogénases sont largement répandues
parmi
les microorganismes car nombre d'entre eux utilisent l'hydrogène comme vecteur
ou source d'énergie. Ces enzymes comptent de nombreux représentants dans le
domaine des bactéries et des archées et sont également présentes dans certains
organismes eucaryotes unicellulaires. Malgré leur diversité à bien des égards
(hôte,
taille, structure quaternaire, donneurs ou accepteurs d'électrons), les
hydrogénases
sont divisées en trois classes phylogénétiquement distinctes : les [Fe]-
hydrogénases, les [FeFe]-hydrogénases et les [NiFe]-hydrogénases. Chaque
classe
est caractérisée par une composition métallique distinctive du site actif.
Physiologiquement, il a été démontré que ces enzymes fonctionnent comme une
valve pour un excès d'électrons.
Le centre catalytique des [Fe]-hydrogénases ne contient aucun centre
FeS ou Ni et a donc été nommé hydrogénase libre de centre fer-soufre ou
[Fe]-
hydrogénases (Shima and Thauer. 2007. A third type of hydrogenase catalyzing
H2
activation. Chem Rec 7:37-46). Les [Fe]-hydrogénases sont limitées à certains
microorganismes méthanogènes (Pilak et al. 2006. The crystal structure of the
apoenzyme of the iron-sulphur cluster-free hydrogenase. J Mol Biol 358:798-
809)
où elles sont essentielles à la croissance lors d'une carence en nickel
(Thauer. 1998.
Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson. 1998 Marjory
Stephenson Prize Lecture. Microbiology 144 :2377-2406). Associé à un cofacteur
spécifique, ces enzymes ont des propriétés catalytiques très différentes des
autres
types d'hydrogénases. En effet, elles ne catalysent pas la réaction réversible
de
production d'H2 (Vignais and Billoud. 2007. Occurrence, classification, and
biological
function of hydrogenases: an overview. Chem Rev 107:4206-4272). Pour cette
raison, ainsi que par leur faible distribution, cette classe d'hydrogénases a
été peu
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étudiée. La grande majorité des hydrogénases connues appartiennent aux deux
autres classes.
Les [FeFe]-hydrogénases sont des enzymes monomériques dont le
centre catalytique est hautement conservé. Il s'agit d'un site de fer bi-
nucléaire lié à
un centre [4Fe-4S] par un pont de cystéine. Les ligands non protéiques, le
cyanure
(ON) et le monoxyde de carbone (CO), sont liés aux atomes de fer du centre bi-
nucléaire. Les atomes de fer partagent également deux ligands soufre (Nicolet
et al.
2000. A novel FeS cluster in Fe-only hydrogenases. Trends Biochem Sci 25:138-
143, Nicolet et al. 2002. Fe-only hydrogenases: structure, function and
evolution. J
lnorg Biochem 91:1-8). Des domaines supplémentaires hébergent plusieurs
centres
FeS et assurent le transfert d'électrons entre la source d'électrons externe
et le site
actif intégré dans ces protéines monomériques. De plus, un canal hydrophobe
relie
la surface au site actif et fournit un accès pour les protons et une sortie
pour les
molécules d'H2. Trois protéines chaperonnes nommées HydE, HydF et HydG sont
connues comme nécessaires à l'assemblage correct des [FeFe]-hydrogénases
(Vignais et al. 2001. Classification and phylogeny of hydrogenases. FEMS
Microbiol
Rev 25:455-501). Ces enzymes sont présentes dans les procaryotes anaérobies
(genres Clostridium ou Desuffovibrio), mais aussi dans quelques eucaryotes
inférieurs tels que les champignons anaérobies ou les microalgues
unicellulaires
.. (genres Chlorelle ou Chlamydomonas) (Vignais and Billoud. 2007. Occurrence,
classification, and biological function of hydrogenases: an overview. Chem Rev
107:4206-4272). Les [FeFe]-hydrogénases favorisent thermodynamiquement la
réoxydation du cofacteur (ferrédoxine ou NADH) et génèrent ainsi de l'H2. Ces
enzymes sont donc généralement impliquées dans l'élimination d'un excès
d'équivalents réducteurs dans la cellule afin d'éviter, par exemple, un arrêt
de la
fermentation. Elles sont également capables d'interagir avec la chaine
photosynthétique d'un groupe restreint de microalgues pour oxyder la chaine
photosynthétique et ainsi activer la fixation du carbone après une incubation
anoxique (Ghysels et al. 2013. Function of the chloroplast hydrogenase in the
microalga Chlamydomonas: the role of hydrogenase and state transitions during
photosynthetic activation in anaerobiosis. PLoS One 8:e64161, Godaux et al.
2015.
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Induction of Photosynthetic Carbon Fixation in Anoxia Relies on Hydrogenase
Activity and Proton-Gradient Regulation-Like1-Mediated Cyclic Electron Flow in
Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol 168:648-658).
Les [NiFe]-hydrogénases forment des hétéro-multimères globulaires
(Volbeda et al. 1995. Crystal structure of the nickel-iron hydrogenase from
Desulfovibrio gigas. Nature 373:580-587). Le site actif bi-métallique [NiFe]
est situé
dans la grande sous-unité où il est coordonné par quatre cystéines et trois
ligands
non protéiques, une molécule de CO et deux ON, liés à l'atome de fer (Happe et
al.
1997. Biological activation of hydrogen. Nature 385:126, Pierik et al. 1999.
Carbon
monoxide and cyanide as intrinsic ligands to iron in the active site of [NiFe]-
hydrogenases. NiFe(CN)200, Biology's way to activate H2. J Biol Chem 274:3331-
3337). Les autres sous-unités de l'hétéro-multimère contiennent plusieurs
centres
FeS médiaux et distaux, qui conduisent les électrons entre le site actif et le
donneur
ou l'accepteur d'électrons physiologique. Le groupe [4Fe-4S] situé à proximité
du
site actif est considéré comme essentiel à l'activité (Albracht. 1994. Nickel
hydrogenases: in search of the active site. Biochim Biophys Acta 1188:167-
204). En
plus des gènes structurels, il existe plusieurs gènes accessoires impliqués
dans la
maturation et l'insertion de Ni, Fe, CO et ON dans le site actif de ces hétéro-
multimères. En effet, la maturation des [NiFe]-hydrogénases suit une voie
complexe
impliquant au moins sept protéines auxiliaires (HypA-F et une endopeptidase)
(Vignais and Billoud. 2007. Occurrence, classification, and biological
function of
hydrogenases: an overview. Chem Rev 107:4206-4272). Une autre caractéristique
du site actif des [NiFe]-hydrogénases est la forte affinité pour l'hydrogène.
Ces
enzymes agissent donc principalement en consommant l'H2 chez le micro-
organisme hôte, même si certaines [NiFe]-hydrogénases présentent une bonne
capacité de production d'hydrogène. Les [NiFe]-hydrogénases sont des enzymes
assez répandues parmi les procaryotes avec de nombreux représentants chez les
bactéries et les archées. La classification des [NiFe]-hydrogénases est basée
sur
les alignements de séquences en acides aminés des différentes sous-unités et
.. divise les [NiFe]-hydrogénases en quatre groupes. Remarquablement, cette
classification est en bon accord avec les groupes dérivés des fonctions
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physiologiques (Vignais and Billoud. 2007. Occurrence, classification, and
biological
function of hydrogenases: an overview. Chem Rev 107:4206-4272).
L'extrême sensibilité des hydrogénases à l'oxygène aussi bien in vitro
que in vivo est un problème lorsqu'on considère ces enzymes pour la production
5 d'hydrogène à un niveau industriel. L'oxygène se lie en tant que ligand
au site actif,
accepte les électrons et est réduit en espèce réactive de l'oxygène (ROS)
piégée
dans l'enzyme. Cela peut entraîner des dommages permanents lorsque le ROS
survit suffisamment longtemps pour attaquer le centre catalytique vulnérable.
Les
[FeFe]-hydrogénases présentent une sensibilité grave à l'02 car l'enzyme est
endommagée de manière irréversible après une exposition à de petites
concentrations d'02 (Ghirardi et al. 1997. Oxygen sensitivity of algal H2-
production.
Appl Biochem Biotechnol 63-65:141-151). Cependant, les [NiFe]-hydrogénases
sont
décrites comme étant plus résistantes que les [FeFe]-hydrogénases aux dommages
causés par l'oxygène. De plus, les [NiFe]-hydrogénases sont inactivées de
manière
réversible par l'02. Certains micro-organismes, tels que Ralstonia sp., ont
même
développé un site actif tolérant à l'oxygène, et sont capables d'oxyder
l'hydrogène
même en présence d'air (Van der Linden et al. 2004. The soluble [NiFe]-
hydrogenase from Ralstonia eutropha contains four cyanides in its active site,
one
of which is responsible for the insensitivity towards oxygen. J Biol lnorg
Chem 9:616-
626). Ces diverses caractéristiques font des [NiFe]-hydrogénases de meilleurs
candidats pour une utilisation technologique industriellement viable.
HoxEFUYH est une [NiFe]-hydrogénase bien caractérisée présente
chez la cyanobactérie Synéchocystis sp. PCC6803. HoxEFUYH est une [NiFe]-
hydrogénase pentamérique et cytoplasmique. HoxY et HoxH forment la partie
hydrogénase tandis que HoxE, HoxF et HoxU constituent la partie en contact
avec le cofacteur redox (Carrieri et al. 2011. The role of the bidirectional
hydrogenase in cyanobacteria. Bioresour Technol 102:8368-8377). HoxH est la
sous-unité responsable de l'activité catalytique, c'est-à-dire la sous-unité
comprenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase. HoxH contient les résidus
conservés pour la liaison des atomes de nickel et de fer. HoxY contient le
groupe
proximal [4Fe-4S] prèRs du centre catalytique NiFe. HoxF et HoxU sont des
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protéines de type fer-soufre responsables de l'interaction in vivo avec le
substrat
(NADH, flavodoxine ou ferrédoxine réduite). HoxFU contiennent les centres FeS
médiaux et distaux transportant les électrons vers HoxYH. La fonction de HoxE
n'est
pas claire, mais il peut s'agir d'une sous-unité d'ancrage dans la membrane.
Une
analyse mutationnelle de la voie de maturation a identifié sept facteurs de
maturation
essentiels, appelés HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW (Hoffmann et
al. 2006. Mutagenesis of hydrogenase accessory genes of Synechocystis sp. PCC
6803. Additional homologues of hypA and hypB are not active in hydrogenase
maturation. FEBS J 273:4516-4527). Un modèle de maturation de HoxEFUYH a été
proposé (Carrieri et al. 2011. The role of the bidirectional hydrogenase in
cyanobacteria. Bioresour Technol 102:8368-8377, Cassier-Chauvat et al. 2014.
Advances in the function and regulation of hydrogenase in the cyanobacterium
Synechocystis P006803. Int J Mol Sci 15:19938-19951). La sous-unité HoxH est
traitée par la protéase spécifique HoxW et le site [Ni-Fe] est ajouté à la
sous-unité
catalytique par le complexe HypABCDEF. Le génome complet de Synéchocystis sp.
P006803 a été séquencé. Les gènes HoxEFUYH ont été identifiés comme étant
regroupés dans un opéron octacistronique, contrairement aux gènes hypABCDEF
dispersés dans le chromosome de Synéchocystis. Le promoteur de l'opéron
hoxEFUYH n'est pas très actif (Dutheil et al. 2012. The AbrB2 autorepressor,
expressed from an atypical promoter, represses the hydrogenase operon to
regulate
hydrogen production in Synechocystis strain P006803. J Bacteriol 194:5423-
5433).
Il est régulé par diverses conditions environnementales, telles que les
disponibilités
en hydrogène, en lumière, en nitrates, en nickel, en oxygène ou en soufre
(Oliveira
and Lindblad. 2009. Transcriptional regulation of the cyanobacterial
bidirectional
Hox-hydrogenase. Dalton Trans 9990-9996). Il est important de noter que les
gènes
hox sont exprimés de manière constitutive en présence d'oxygène (Kiss et al.
2009.
Transcriptional regulation of the bidirectional hydrogenase in the
cyanobacterium
Synechocystis 6803. J Biotechnol 142:31-37), mais que l'enzyme, sensible à
l'oxygène, est par conséquent inactive en conditions aérobies. La fonction
physiologique précise fait encore l'objet de débats, mais HoxEFUYH
fonctionnerait
comme une valve de sécurité qui dissipe l'excès d'électrons en conditions
redox
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défavorables, maintenant ainsi une balance oxydation/réduction adéquate dans
la
cellule pendant la fermentation ou la photosynthèse (Carrieri et al. 2011. The
role of
the bidirectional hydrogenase in cyanobacteria. Bioresour Technol 102:8368-
8377).
Il existe un grand nombre d'études sur HoxEFUYH. De nombreuses
caractéristiques font de cette enzyme un bon candidat pour la production de
bio-
hydrogène. Premièrement, cette [NiFe]-hydrogénase présente un biais en faveur
de
la réduction des protons (McIntosh et al. 2011. The [NiFe]-hydrogenase of the
cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 works bidirectionally with a bias to
H2
production. J Am Chem Soc 133:11308-11319). L'opéron, et par conséquent
l'enzyme, sont faiblement exprimés dans Synéchocystis sp. P006803 en condition
aérobie (Kiss et al. 2009. Transcriptional regulation of the bidirectional
hydrogenase
in the cyanobacterium Synechocystis 6803. J Biotechnol 142:31-37).
L'inactivation
de HoxEFUYH en présence d'oxygène est totale et presque instantanée.
Cependant, HoxEFUYH peut être réactivé rapidement (délais de l'ordre de la
minute) en condition redox (par exemple par réduction avec de l'hydrogène
et/ou
par élimination de l'oxygène) (Appel et al. 2000. The bidirectional
hydrogenase of
Synechocystis sp. PCC 6803 works as an electron valve during photosynthesis.
Arch
Microbiol 173:333-338, Germer et al. 2009. Overexpression, isolation, and
spectroscopic characterization of the bidirectional [NiFe] hydrogenase from
Synechocystis sp. PCC 6803. J Biol Chem 284:36462-36472, McIntosh et al. 2011.
The [NiFe]-hydrogenase of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 works
bidirectionally with a bias to H2 production. J Am Chem Soc 133:11308-11319).
Plusieurs protocoles de purification (Schmitz et al. 2002. HoxE--a subunit
specific
for the pentameric bidirectional hydrogenase complex (HoxEFUYH) of
cyanobacteria. Biochim Biophys Acta 1554:66-74, Germer et al. 2009.
Overexpression, isolation, and spectroscopic characterization of the
bidirectional
[NiFe] hydrogenase from Synechocystis sp. PCC 6803. J Biol Chem 284:36462-
36472) et de mise en uvre en électrochimie (McIntosh et al. 2011. The [NiFe]-
hydrogenase of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 works
bidirectionally with a bias to H2 production. J Am Chem Soc 133:11308-11319)
sont
disponibles. La possibilité de catalyser efficacement la production
d'hydrogène, et
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avec une sensibilité limitée à l'oxygène, a permis à HoxEFUYH d'être identifié
comme un bon candidat.
Un procédé commun et efficace pour produire une grande quantité
d'une protéine d'intérêt est la production recombinante de cette protéine au
sein d'un
hôte hétérologue. Ce processus biotechnologique implique l'introduction et
l'expression de gènes d'intérêts dans le génome de l'organisme hôte afin de
produire
une grande quantité de la protéine d'intérêt, avec un excellent degré de
pureté. Il
existe plusieurs systèmes de production recombinante. Le système procaryote
reste
le système le plus rapide et le plus facile afin de produire une protéine
d'intérêt, le
système eucaryote étant plus lent et plus compliqué à mettre en uvre. Chaque
organisme a ses propres avantages et inconvénients. Il n'existe pas encore de
système d'expression universellement applicable. Il est très difficile de
prédire quel
hôte fonctionnera le mieux pour une protéine particulière ou pour une
utilisation
finale particulière. Escherichia col (E. cou) est l'organisme de référence
pour la
production recombinante. En effet, cette bactérie est très connue du point de
vue de
l'ingénierie génétique et physiologique, avec par exemple : cellule optimisée
(productivité élevée, utilisation de codons, inhibition des protéases
endogènes),
milieu de culture optimisé, temps de doublement court, faible contamination,
disponibilité de nombreux vecteurs commerciaux, mise à l'échelle industrielle,
rendement de production important.
La production et l'ingénierie d'hydrogénases recombinantes, à l'instar
des métalloprotéines en général, ont connu un succès limité. La littérature
fournit
des exemples de [FeFe]-hydrogénases exprimées de manière hétérologue dans E.
coll (King et al. 2006. Functional studies of [FeFe] hydrogenase maturation in
an
Escherichia coli biosynthetic system. J Bacteriol 188:2163-2172, Yacoby et al.
2012.
Optimized expression and purification for high-activity preparations of algal
[FeFe]-
hydrogenase. PLoS One 7:e35886, Kuchenreuther et al. 2009. Tyrosine, cysteine,
and S-adenosyl methionine stimulate in vitro [FeFe] hydrogenase activation.
PLoS
One 4:e7565). Les [FeFe]-hydrogénases sont des enzymes monomériques
nécessitant un nombre limité de facteurs de maturation.
La production hétérologue de [NiFe]-hydrogénases est qualifiée de
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difficile (English et al. 2009. Recombinant and in vitro expression systems
for
hydrogenases: new frontiers in basic and applied studies for biological and
synthetic
H2 production. Dalton Trans 9970-9978).
Premièrement, la difficulté provient de la complexité et de la spécificité
du processus d'assemblage du site actif [NiFe], qui nécessite théoriquement au
moins sept facteurs de maturation pour un assemblage fonctionnel.
Deuxièmement, le repliement correct de chacune des sous-unités de
l'hétéro-multimère est requis, ce qui est particulièrement difficile à
contrôler et à
assurer lors d'une production hétérologue.
Troisièmement, l'assemblage correct de chaque sous-unité dans le
complexe hétéro-multimérique est obligatoire. Un mauvais repliement peut mener
à
un phénomène d'agrégation et donc à une diminution de la quantité d'enzyme
active
(Singh et al. 2015. Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia cou
i using
mild solubilization process. Microb Oeil Fact 14:41). L'obtention d'une
séquence
précise est nécessaire pour obtenir une activité enzymatique, ce qui peut
s'avérer
être difficile à contrôler et à assurer chez un hôte hétérologue.
Tout ceci explique pourquoi les [NiFe]-hydrogénases ne sont pas
toujours actives lorsqu'elles sont produites par recombinaison hétérologue.
Cependant, il existe plusieurs cas dans la littérature où une [NiFe]-
hydrogénase
active a été produite dans E. col (Kim et al. 2011. Production of biohydrogen
by
heterologous expression of oxygen-tolerant Hydrogenovibrio marinus [NiFe]-
hydrogenase in Escherichia cou. J Biotechnol 155:312-319, Maier et al. 2015.
Identification, cloning and heterologous expression of active [NiFe]-
hydrogenase 2
from Citrobacter sp. SG in Escherichia cou. J Biotechnol 199:1-8, Schiffels et
al.
2013. An innovative cloning platform enables large-scale production and
maturation
of an oxygen-tolerant [NiFe]-hydrogenase from Cupriavidus necator in
Escherichia
cou. PLoS One 8:e68812, Weyman et al. 2011. Genetic analysis of the
Alteromonas
macleodii [NiFe]-hydrogenase. FEMS Microbiol Lett 322:180-187).
En particulier, les travaux de Sun et de ces collaborateurs (Sun et al.
2010. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-
hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PLoS One 5:e10526) ont permis
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l'expression de la [NiFe]-hydrogénase de Pyrococcus furiosus en anoxie dans E.
coll par l'intermédiaire de quatre vecteurs d'expression permettant la co-
expression
de 13 gènes hétérologues (quatre gènes de structure et neuf facteurs de
maturation). Plus spécifiquement, les travaux de Sun et al. ont permis
d'obtenir une
5 .. enzyme recombinante tétramérique de type [NiFe]-hydrogénase comprenant
les
quatre sous-unités dénommées PF0891, PF0892, PF0893 et PF0894. Après
purification, cette enzyme recombinante tétramérique s'est révélée être
fonctionnellement similaire à l'enzyme native purifiée à partir de P.
furiosus.
HoxEFUYH étant une protéine procaryote de la cyanobactérie
10 Synéchocystis, le système E. col convient à sa production recombinante.
Cette
production dans E. colla déjà été réalisée avec succès. En ce sens, Maeda et
ses
collègues ont montré une augmentation in vivo de la production d'hydrogène
dans
les cellules de E. coll exprimant, en condition anoxique, l'enzyme HoxEFUYH
cyanobactérienne (Maeda et al. 2007. Inhibition of hydrogen uptake in
Escherichia
coli by expressing the hydrogenase from the cyanobacterium Synechocystis sp.
PCC 6803. BMC Biotechnol 7:25). Une telle production d'hydrogène accrue en
présence de HoxEFUYH est due à l'inhibition de l'activité des hydrogénases
endogènes 1 et 2 consommatrices d'H2 chez E. coli.
Citons également Wells et ses collaborateurs qui ont introduit les
gènes HoxEFUYH et ces facteurs de maturation associés dans E. col' (Wells et
al.
2011. Engineering a non-native hydrogen production pathway into Escherichia
coli
via a cyanobacterial [NiFe] hydrogenase. Metab Eng 13:445-453). Ce travail a
démontré la production d'hydrogène, en anoxie, aussi bien in vivo que in vitro
via
HoxEFUYH dans un hôte nul pour les hydrogénases endogènes. Ils indiquent un
couplage avec des systèmes de transfert d'électrons de l'hôte comme la
fermentation et montrent le potentiel de HoxEFUYH dans l'ingénierie
métabolique
pour améliorer les rendements de production d'hydrogène.
Dans l'état de la technique, il n'y a pas de divulgation d'un polypeptide
monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d'une
.. protéine de type [NiFe]-hydrogénase, en particulier d'un monomère isolé
issu d'un
complexe de type [NiFe]-hydrogénase, présentant à lui seul une activité
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hydrogénase, quand bien même les documents D2 (Hornhardt et al. 1986.
Characterization of a native subunit of the NAD-linked hydrogenase isolated
from a
mutant of Alcaligenes eutrophus H16. Biochimie, Masson, Paris, FR, vol. 68(1),
pages 15-24) et D3 (Przybyla et al. 1992. Structure-function relationships
among the
nickel-containing hydrogenases. FEMS Microbiol Rev 8:109-135) semblent vouloir
le faire croire.
Le document D2 décrit la caractérisation d'une sous-unité native de la
[NiFe]-hydrogénase d'Alcaligenes eutrophus H16. Ce peptide représente la sous-
unité catalytique de la [NiFe]-hydrogénase et est décrit comme totalement
inactif
avec le NAD comme médiateur redox, mais présentant une activité résiduelle
très
faible avec le bleu de méthylène, le ferricyanure et le cytochrome C.
Le document D3 suggère l'existance de monomères de type [NiFe]-
hydrogénase présentant une activité hydrogénase. Comme exemples, le document
D3 mentionne, en citant le document D2, la [NiFe]-hydrogénase d'Alcaligenes
eutrophus, et aussi la [NiFe]-hydrogénase-1 d'Escherishia coll.
Cependant, des études publiées ultérieurement, y compris les études
décrites dans les documents D1 (Massanz et al. 1998. Subforms and in vitro
reconstitution of the NAD-reducing hydrogenase of Alcaligenes eutrophus. J
Bacteriol 180:1023-1029), D4 (Senger et al. 2017. Proteolytic cleavage
orchestrates
cofactor insertion and protein assembly in [NiFe]-hydrogenase biosynthesis. J
Biol
Chem 292:11670-11681) et D5 (Pinske et al. 2011. Efficient electron transfer
from
hydrogen to benzyl viologen by the [NiFe]-hydrogenases of Escherichia coli is
dependent on the coexpression of the iron-sulfur cluster-containing small
subunit.
Arch Microbiol 193:893-903), ont montré que les conclusions des études des
documents D2 et D3 sont erronées.
L'étude décrite dans le document D1 a démontré que la sous-unité
contenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase d'Alcaligenes eutrophus H16
toute
seule ne présentait aucune activité de type hydrogénase, et ce avec plusieurs
médiateurs redox, notamment le benzyl viologène. Le document D1 mentionne que
la plus petite entité de la [NiFe]-hydrogénase d'Alcaligenes eutrophus
susceptible
d'avoir une activité hydrogénase consiste en la large sous-unité contenant le
centre
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[NiFe] et la petite sous-unité avec un minimum d'un centre FeS. De manière
similaire, les études présentées dans les documents D4 et D5 s'opposent à
l'enseignement du document D3 en montrant que la sous-unité catalytique seule
de
l'hydrogénase-1 [NiFe] d'Escherishia col' ne présente aucune activité
hydrogénase
La majorité des travaux réalisés sur ce sujet, y compris les études des
documents D1, D4 et D5 considèrent que le centre [4Fe-4S] situé dans la petite
sous-unité est essentiel et indispensable à l'activité hydrogénase de la
grande sous-
unité des [NiFe]-hydrogénases (Albracht. 1994. Nickel hydrogenases: in search
of
the active site. Biochim Biophys Acta 1188:167-204). En outre, les analyses
structurelles des [NiFe]-hydrogénases ont largement démontré l'absence de
centre
FeS dans la sous-unité catalytique contenant le site actif (Lubitz et al.
2014.
Hydrogenases. Chem Rev 114:4081-4148),
Ainsi, les résultats décrits précédemment dans le document D2 ne
peuvent s'expliquer que par une contamination de la sous-unité catalytique par
la
petite sous-unité, comme en atteste la mise en évidence de centre FeS dans les
préparations permettant la faible activité hydrogénase mesurée.
En conclusion, l'ensemble des travaux réalisés qui constituent l'état de
la technique considèrent que la réduction du nombre de sous-unités n'est ni
favorable à l'activité ni à la stabilité des hydrogénases et que la sous-unité
contenant
le centre NiFe, isolée des complexes multimériques des hydrogénases de type
NiFe,
ne présente pas d'activité hydrogénase à elle seule.
Malheureusement, comme il ressort notamment de l'état de la
technique mentionné ci-dessus, il demeure plusieurs inconvénients freinant
considérablement l'utilisation des [NiFe]-hydrogénases, et notamment
l'utilisation de
HoxEFUYH, pour une bio-production d'hydrogène commercialement rentable.
A ce jour, il existe donc un réel besoin de surmonter les obstacles
freinant l'utilisation des [NiFe]-hydrogénases pour une production d'hydrogène
dès
lors que, comme indiqué plus haut, les [NiFe]-hydrogénases présentent
indéniablement un haut potentiel pour la production d'hydrogène.
Pour résoudre ces problèmes, il est prévu suivant l'invention, un
polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site
actif
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d'une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique
présentant une activité enzymatique, en particulier une activité enzymatique
de type
hydrogénase, plus particulièrement une activité catalytique, plus
particulièrement
encore une activité catalytique de type hydrogénase.
De préférence, selon l'invention, ledit polypeptide monomérique
comprend une seule sous-unité comprenant le site actif d'une protéine de type
[NiFe]-hydrogénase.
De préférence, selon l'invention, ledit polypeptide monomérique est
constitué d'une seule sous-unité comprenant le site actif d'une protéine de
type
[NiFe]-hydrogénase.
De préférence, selon l'invention, ledit polypeptide monomérique
consiste en une seule sous-unité comprenant le site actif d'une protéine de
type
[NiFe]-hydrogénase.
En d'autres termes, préférentiellement, il est prévu selon l'invention, un
polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant
uniquement le site actif d'une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit
polypeptide
monomérique présentant à lui seul une activité enzymatique, en particulier une
activité enzymatique de type hydrogénase, plus particulièrement une activité
catalytique, plus particulièrement encore une activité catalytique de type
hydrogénase.
Dans le cadre de la présente invention, il a été mis en évidence qu'un
tel polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site
actif d'une protéine de type [NiFe]-hydrogénase et présentant une activité
hydrogénase permet de s'affranchir au moins en partie des obstacles freinant
l'utilisation des [NiFe]-hydrogénases pour une production d'hydrogène, ceci
tout en
garantissant une activité hydrogénase d'au moins 0,01 mol H2 . min-1 . mg-1
d'enzyme, de préférence d'au moins 0,05 mol H2. min-1 . mg' d'enzyme.
En effet, dès lors qu'il s'agit selon l'invention d'un polypeptide
monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d'une
protéine de type [NiFe]-hydrogénase, les difficultés rencontrées avec les
[NiFe]-
hydrogénases, notamment pour assurer l'assemblage du site actif, pour assurer
un
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repliement adéquat de chacune des sous-unités impliquées et pour assurer un
assemblage correct de chaque sous-unité dans un complexe hétéro-multimérique,
sont fortement réduites voire éliminées. Ceci permet d'augmenter la
reproductibilité
lors du processus d'obtention de la [NiFe]-hydrogénase puisqu'une seule sous-
unité
est impliquée. En effet, la production d'un seul polypeptide monomérique
simplifie
fortement le processus complexe de repliement en comparaison avec les enzymes
dimérique, tétramérique et pentamérique pour lesquelles un assemblage correct
du
site actif, de chacune des sous-unités et enfin de l'enzyme entière est
particulièrement difficile à contrôler et à garantir, ce qui constitue un
obstacle à leur
utilisation. Selon l'invention, le repliement adéquat d'une seule sous-unité
est
nécessaire et aucun assemblage entre différentes sous-unités n'est requis pour
former un complexe hétéro-multimérique.
Par ailleurs, il a été mis en évidence que le procédé de fabrication d'un
tel polypeptide monomérique selon l'invention peut être totalement réalisé en
condition aérobie (pas de précaution requise par rapport à l'oxygène lors des
étapes
d'expression et de purification), ce qui écarte les problématiques rencontrées
avec
les procédés de fabrication des [NiFe]-hydrogénases dimériques, tétramériques
et
pentamériques recombinantes rencontrées dans l'état de la technique et pour
lesquelles les procédés de fabrication sont réalisés en anoxie. Comme
mentionné
.. plus haut, même si l'accumulation de biomasse est réalisée en présence
d'oxygène,
la phase de production de l'hydrogénase recombinante est quant à elle réalisée
en
anoxie selon les procédés connus de l'état de la technique (Sun et al. 2010.
Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-
hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PLoS One 5:e10526, Wells et
al.
.. 2011. Engineering a non-native hydrogen production pathway into Escherichia
coli
via a cyanobacterial [NiFe] hydrogenase. Metab Eng 13:445-453). L'absence
d'oxygène est également rapportée (boite anoxie, dithionite de sodium dans les
tampons) lors des diverses étapes chromatographiques de la purification. Le
maintien d'un tel niveau d'anoxie aux cours du procédé implique évidemment une
augmentation des coûts liés à la production recombinante, ce qui est
solutionné par
la présente invention.
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De façon avantageuse suivant l'invention, la taille du polypeptide
monomérique selon l'invention est nettement plus faible en comparaison avec
l'hétéro-multimère, une augmentation de l'activité massique de l'enzyme
(nombre
d'entité catalytiquement active par mg de protéine total) étant ainsi obtenue.
5 Une
meilleure intégration et une densification du catalyseur
enzymatique est également réalisable, par exemple, lors d'une mise en uvre
électrochimique du polypeptide monomérique selon l'invention, comme par
exemple
dans une pile à combustible.
En outre, la structure tridimensionnelle d'un polypeptide monomérique
10 selon
l'invention est facilement modélisable notamment pour déterminer les résidus
exposés à la surface de la protéine, par exemple pour faciliter l'orientation
ainsi que
l'adsorption par rapport à une interface, par exemple par rapport à une
électrode de
carbone. Cette caractéristique permet avantageusement, par exemple,
d'améliorer
la stabilité du lien entre l'interface et le catalyseur enzymatique, mais
aussi une
15
optimisation du transfert d'électrons direct entre l'interface et le site
actif. Le
rendement énergétique est dès lors amélioré en l'absence de relais redox
supplémentaires, ce qui limite les pertes énergétiques.
Dans le contexte de la présente invention, il a également été démontré
que le polypeptide monomérique est bien actif et apte à la production par
catalyse
d'H2 (par exemple via le test standard de production in-vitro d'H2 par les
hydrogénases utilisant le méthyl-viologène réduit comme médiateur redox) ainsi
qu'a la consommation par catalyse d'H2 (par exemple via le test standard de
consommation in-vitro d'H2 par les hydrogénases utilisant le benzyl viologène
oxydé
comme médiateur redox), sans présence du centre FeS proximal présent dans la
petite-sous-unité et décrit comme essentiel, ni d'ailleurs d'aucun autres
relais redox.
Ceci est tout à fait surprenant puisqu'une simplification aussi poussée de
l'enzyme
hétéro-multimérique n'a jamais permis la mise en évidence de l'activité
hydrogénase
dans l'état de la technique.
De façon d'autant plus avantageuse, alors que seule une production
d'H2 limitée est actuellement obtenue avec les [NiFe]-hydrogénases
recombinantes
connues (Sun et al. 2010. Heterologous expression and maturation of an NADP-
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dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PLoS One
5:e10526, Schiffels et al. 2013. An innovative cloning platform enables large-
scale
production and maturation of an oxygen-tolerant [NiFe]-hydrogenase from
Cupriavidus necator in Escherichia cou. PLoS One 8:e68812, Maier et al. 2015.
Identification, cloning and heterologous expression of active [NiFe]-
hydrogenase 2
from Citrobacter sp. SG in Escherichia coli. J Biotechnol 199:1-8), il a été
montré
que le polypeptide monomérique selon l'invention présente une activité
hydrogénase au moins équivalente voire même supérieure à celles obtenues avec
les [NiFe]-hydrogénases (recombinantes) connues.
Selon un mode de réalisation suivant l'invention, le polypeptide
monomérique est isolé de son environnement naturel, en particulier isolé d'une
protéine naturelle de type [NiFe]-hydrogénase.
A titre d'exemple, selon l'invention, ledit polypeptide monomérique
peut être issu/isolé d'un procaryote. Les exemples incluent, mais ne sont pas
limité
à un membre du genre Escherichia (comme par exemple Escherichia cou), un
membre du genre Desulfovibrio (comme par exemple Desulfovibrio gigas), un
membre du genre Hydrogenophilus (comme par exemple Hydrogenophilus
thermoluteolus), un membre du genre Desulfomicrobium (comme par exemple
Desulfomicrobium baculatum), Synéchocystis (comme par exemple Synéchocystis
sp. P006803), un membre du genre Phormidium (comme par exemple Phormidium
ambiguum) ou un membre du genre Spirulina (comme par exemple Spirulina
platensis). Par exemple, ledit polypeptide monomérique peut être issu d'une
cellule
ou d'un microbe ou peut être produit in vitro ou in vivo.
Selon un mode de réalisation suivant l'invention, le polypeptide
monomérique est recombinant ou hétérologue.
Avantageusement, selon l'invention, le polypeptide monomérique est
purifié.
Préférentiellement, selon l'invention, le polypeptide monomérique
présente une séquence en acides aminés tronquée ou non présentant au moins
15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus préférentiellement
au
moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité,
plus
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préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement
encore
au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95%
d'identité,
plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par rapport à la
séquence
en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides
aminés
de SEQ ID NO:4.
De façon encore préférée, selon l'invention, le polypeptide
monomérique présente une séquence en acides aminés tronquée ou non présentant
au moins 81% d'identité, au moins 82% d'identité, au moins 83% d'identité, au
moins
84% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 86% d'identité, au moins 87%
d'identité, au moins 88% d'identité, au moins 89% d'identité, au moins 90%
d'identité, au moins 91% d'identité, au moins 92% d'identité, au moins 93%
d'identité, au moins 94% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 96%
d'identité, au moins 97% d'identité, au moins 98% d'identité, au moins 99%
d'identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou
par
rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
Avantageusement, selon l'invention, ledit polypeptide monomérique
est caractérisé en ce que ladite sous-unité comprenant le site actif d'une
protéine de
type [NiFe]-hydrogénase est la sous-unité HoxH de la protéine de type [NiFe]-
hydrogénase HoxEFUYH chez / de Synechocystis sp. P006803.
De préférence, selon l'invention, ledit polypeptide monomérique
présente une activité hydrogénase d'au moins 0,01 mol H2. min-1 . mg'
d'enzyme,
de préférence d'au moins 0,05 mol H2. min-1 . mg-1 d'enzyme,
préférentiellement
d'au moins 10 mol H2. M1. mg-1 d'enzyme.
La présente invention porte également sur une cellule hôte incluant un
polypeptide monomérique selon l'invention, ledit polypeptide monomérique
comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d'une protéine de
type
[NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité
hydrogénase.
Préférentiellement, la présente invention porte sur une cellule hôte
incluant un polypeptide monomérique selon l'invention dont la sous-unité
comprenant le site actif d'une protéine de type [NiFe]-hydrogénase est la sous-
unité
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HoxH de la protéine de type [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH chez / de
Synechocystis sp. P006803.
A titre d'exemple, selon l'invention, la cellule hôte, notamment pour
l'expression dudit polypeptide monomérique, peut-être une cellule bactérienne
hôte
du genre Escherichia (comme par exemple Escherichia cou), du genre Bacillus
(comme par exemple Bacillus subtils), du genre Streptomyces (comme par exemple
Streptomyces coelicolor), du genre Synéchocystis (comme par exemple
Synéchocystis sp. P006803), du genre Synéchococcus (comme par exemple
Synéchococcus WH8102), ou toute autre cellule procaryote, une cellule
eucaryote
par exemple du genre Chlamydomonas (comme par exemple Chlamydomonas
reinhardtii), du genre Saccharomyces (comme par exemple Saccharomyces
cerevisiae), de type Pichia (comme par exemple Pichia pastoris), ou un autre
type
de cellule eucaryotes.
Selon l'invention, ledit polypeptide monomérique inclu dans ladite
cellule hôte peut lui-même mais non indispensablement être issu de
l'expression
d'un gène inclu dans un vecteur d'expression, par exemple dans un plasmide
inséré
dans ladite cellule hôte.
Avantageusement, selon l'invention, ledit polypeptide monomérique
inclu dans ladite cellule hôte a une séquence en acides aminés tronquée ou non
présentant au moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40%
d'identité,
plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus
préférentiellement
encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90%
d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus
préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence
en
acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés
de SEQ ID NO:4.
De préférence, selon l'invention, ladite cellule hôte peut inclure un ou
plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-
hydrogénase, de
préférence un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type
[NiFe]-
3 0 hydrogénase choisi dans, le groupe constitué des facteurs de maturation
HypA,
HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW
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a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au
moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus
préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore
au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80%
d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus
préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement
encore au moins 99% d'identité, respectivement par rapport aux séquences
en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID
NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou
b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant
au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus
préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore
au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80%
d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus
préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement
encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ
ID NO:19, laquelle code pour l'ensemble de ces facteurs de maturation.
Selon l'invention, ledit au moins un facteur de maturation peut être
.. endogène à la cellule hôte et/ou exogène à la cellule hôte.
Avantageusement, pour une cellule hôte selon l'invention, ledit
polypeptide monomérique et/ou ledit au moins un facteur de maturation est/sont
issu(s) de l'expression d'au moins un gène inclu dans un vecteur d'expression,
ledit
vecteur d'expression étant inclu dans ladite cellule hôte.
La présente invention porte également sur une cellule hôte incluant un
polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique selon l'invention
comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d'une protéine de
type
[NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité
hydrogénase.
Préférentiellement, la présente invention porte sur une cellule hôte
incluant un polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique dont la sous-
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unité comprenant le site actif d'une protéine de type [NiFe]-hydrogénase est
la sous-
unité HoxH de la protéine de type [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH chez / de
Synechocystis sp. P006803.
De préférence, selon l'invention, ledit polynucléotide codant pour un
5 polypeptide monomérique présente une séquence nucléotidique ayant au
moins
15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus préférentiellement
au
moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d'identité,
plus
préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus préférentiellement
encore
au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95%
d'identité,
10 plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, respectivement
par rapport
aux séquences, par rapport aux séquences nucléotidiques SEQ ID NO :1 et/ou SEQ
ID NO :3.
A titre d'exemple, selon l'invention, la cellule hôte incluant un
polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique selon l'invention, et
étant
15 utilisée notamment pour l'expression dudit polypeptide monomérique, peut
être une
cellule bactérienne hôte du genre Escherichia (comme par exemple Escherichia
cou), du genre Bacillus (comme par exemple Bacillus subtils), du genre
Streptomyces (comme par exemple Streptomyces coelicolor), une cellule
bactérienne photosynthétique du genre Synéchocystis (comme par exemple
20 Synéchocystis sp. P006803) ou Synéchococcus (comme par exemple
Synéchococcus WH8102) ou toute autre cellule procaryote, une cellule eucaryote
par exemple du genre Chlamydomonas (comme par exemple Chlamydomonas
reinhardtii), du genre Saccharomyces (comme par exemple Saccharomyces
cerevisiae), de type Pichia (comme par exemple Pichia pastoris), ou un autre
type
de cellule eucaryotes.
Selon l'invention, ledit polynucléotide inclu dans ladite cellule hôte peut
lui-même mais non indispensablement être inclu dans un vecteur d'expression,
par
exemple dans un plasmide, inséré dans ladite cellule hôte.
Avantageusement, selon l'invention, ledit polypeptide monomérique
codé par ledit polynucléotide inclu dans ladite cellule hôte a une séquence en
acides
aminés tronquée ou non présentant au moins 20% d'identité, plus
préférentiellement
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au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 60%
d'identité,
plus préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus
préférentiellement
encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 95%
d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par
rapport à la
séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en
acides aminés de SEQ ID NO:4.
De préférence, selon l'invention, ladite cellule hôte incluant un
polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique peut inclure un ou
plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-
hydrogénase, de
préférence un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type
[NiFe]-
hydrogénase choisi dans, le groupe constitué des facteurs de maturation HypA,
HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW
a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au
moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus
préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore
au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80%
d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus
préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement
encore au moins 99% d'identité, respectivement par rapport aux séquences
en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID
NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou
b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant
au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus
préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore
au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80%
d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus
préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement
encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ
ID NO:19, laquelle code pour l'ensemble de ces facteurs de maturation.
Selon l'invention, ledit au moins un facteur de maturation peut être
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endogène à la cellule hôte et/ou exogène à la cellule hôte.
Avantageusement, pour une cellule hôte selon l'invention, ledit
polypeptide monomérique et/ou ledit au moins un facteur de maturation est/sont
issu(s) de l'expression d'au moins un gène inclu dans un vecteur d'expression,
ledit
vecteur d'expression étant inclu dans ladite cellule hôte.
La présente invention porte encore sur un procédé d'obtention, par
exemple dans une cellule hôte (par exemple dans E. cou), d'un polypeptide
monomérique présentant une activité hydrogénase selon l'invention, ledit
procédé
comprenant les étapes suivantes :
= modification d'un vecteur d'expression, par exemple d'un plasmide, en
y incluant un polynucléotide exogène dont au moins une partie code
pour un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité
comprenant le site actif d'une protéine de type [NiFe]-hydrogénase ; et
= incubation dudit vecteur d'expression modifié selon des conditions
d'incubation permettant d'assurer une expression dudit polynucléotide
exogène pour produire un polypeptide monomérique comportant une
seule sous-unité comprenant le site actif d'une protéine de type [NiFe]-
hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité
hydrogénase.
Le procédé selon l'invention permet de réaliser une production de la
seule sous-unité comprenant le site actif d'une protéine de type [NiFe]-
hydrogénase.
L'homme de métier est bien entendu à même de définir les conditions
d'incubation requises et adéquates.
Selon l'invention, lors de l'étape de modicfication génétique d'une
cellule hôte, le polynucléotide peut lui-même mais non indispensablement être
inclu
dans un vecteur d'expression, par exemple dans un plasmide.
Avantageusement, selon l'invention, ladite étape de modification dudit
vecteur d'expression consiste en une inclusion dans ledit vecteur d'expression
dudit
polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour ledit polypeptide
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monomérique dont la séquence en acides aminés tronquée ou non présente au
moins 20% d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus
préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement
encore
au moins 80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90%
d'identité,
plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus
préférentiellement
encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence en acides aminés de
SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
De préférence, selon l'invention, ladite étape de modification dudit
vecteur d'expression peut comprendre l'inclusion dans ledit vecteur
d'expression
d'un ou de plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-
hydrogénase, de préférence d'un ou de plusieurs facteurs de maturation de
ladite
protéine de type [NiFe]-hydrogénase choisi dans, le groupe constitué des
facteurs
de maturation HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW
a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au
moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus
préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore
au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80%
d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus
préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement
encore au moins 99% d'identité, respectivement par rapport aux séquences
en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID
NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou
b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant
au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus
préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore
au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80%
d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus
préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus préférentiellement
encore au moins 99% d'identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ
ID NO:19, laquelle code pour l'ensemble de ces facteurs de maturation.
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Selon l'invention, lors de l'étape de modification dudit vecteur
d'expression, une séquence codant pour un ou plusieurs facteurs de maturation
de
ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase peut elle-même mais non
indispensablement être incluse dans un vecteur d'expression, par exemple dans
un
plasmide.
Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend une étape
subséquente d'isolation et/ou de purification dudit polypeptide monomérique.
En particulier et de préférence, l'invention porte sur un procédé
d'obtention d'un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase
suivant l'invention, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
= une étape de modification génétique, réalisée in-vivo ou in-vitro, d'une
entité comprenant un matériel génétique, par exemple d'une cellule
hôte ou d'un vecteur d'expression, pour obtenir une entité
génétiquement modifiée, par exemple une cellule hôte génétiquement
modifiée ou un vecteur d'expression génétiquement modifié ;
= une étape d'incubation de ladite entité génétiquement modifiée, par
exemple de ladite cellule hôte génétiquement modifiée ou dudit
vecteur d'expression génétiquement, pour obtenir un polypeptide
monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site
actif d'une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide
monomérique présentant une activité hydrogénase.
Préférentiellement, selon l'invention, ladite étape de modification
génétique, réalisée in-vivo ou in-vitro, consiste :
a) en une modification génétique d'une cellule hôte et/ou d'un vecteur
d'expression en y incluant un polynucléotide exogène dont au moins une
partie code pour un polypeptide monomérique comportant une seule sous-
unité comprenant le site actif d'une protéine de type [NiFe]-hydrogénase,
pour obtenir une cellule hôte génétiquement modifiée et/ou un vecteur
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d'expression génétiquement modifié à incuber lors de ladite étape
d'incubation réalisée selon des conditions d'incubation permettant d'assurer
une expression dudit polynucléotide exogène pour produire ledit polypeptide
monomérique ; ou
5
b) en l'induction d'au moins une mutation génétique dans le matériel
génétique d'une cellule hôte pour obtenir une cellule hôte génétiquement
modifiée à incuber lors de ladite étape d'incubation réalisée selon des
conditions d'incubation pour produire ledit polypeptide monomérique.
10 L'homme de métier est bien entendu à même de définir les conditions
d'incubation requises et adéquates.
Par exemple, selon l'invention, ladite induction d'au moins une
mutation génétique est effectuée par recombinaison homologue, méthode bien
connue de l'homme de métier.
15 Avantageusement, selon l'invention, ladite étape de modification
génétique de ladite cellule hôte par inclusion d'un polynucléotide exogène
consiste
en une inclusion dans ladite cellule hôte d'un vecteur d'expression, en
particulier
d'un vecteur d'expression modifié, incluant ledit polynucléotide exogène.
De préférence, selon l'invention, ladite étape de modification génétique
20 de ladite cellule hôte consiste en une inclusion dans ladite cellule
hôte dudit
polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour ledit polypeptide
monomérique dont la séquence en acides aminés tronquée ou non présente au
moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus
préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement encore au
25 moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 80%
d'identité, plus
préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus préférentiellement
encore
au moins 95% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 99%
d'identité,
par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à
la
séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
Avantageusement, selon l'invention, ladite étape de modification
génétique de ladite cellule hôte comprend en outre l'inclusion dans ladite
cellule hôte
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d'au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-
hydrogénase,
ledit au moins un facteur de maturation étant endogène à la cellule hôte et/ou
exogène à la cellule hôte, de préférence l'inclusion d'au moins un facteur de
maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase choisi dans le groupe
constitué des facteurs de maturation HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et
HoxW
a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au
moins 15% d'identité, de préférence au moins 20% d'identité, plus
préférentiellement au moins 40% d'identité, plus préférentiellement
encore au moins 60% d'identité, plus préférentiellement encore au moins
80% d'identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d'identité,
plus préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus
préférentiellement encore au moins 99% d'identité, respectivement par
rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8,
SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID
NO:18 ; ou
b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire
présentant au moins 15% d'identité, de préférence au moins 20%
d'identité, plus préférentiellement au moins 40% d'identité, plus
préférentiellement encore au moins 60% d'identité, plus
préférentiellement encore au moins 80% d'identité, plus
préférentiellement encore au moins 90% d'identité, plus
préférentiellement encore au moins 95% d'identité, plus
préférentiellement encore au moins 99% d'identité, par rapport à la
séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l'ensemble de
ces facteurs de maturation.
De préférence, selon l'invention, ledit au moins un facteur de
maturation est issu de l'expression d'au moins un gène inclu dans un vecteur
d'expression, ledit vecteur d'expression étant inclu dans ladite cellule hôte.
Préférentiellement, le procédé d'obtention d'un polypeptide
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monomérique présentant une activité hydrogénase suivant l'invention donne lieu
à
l'obtention d'un polypeptide monomérique dont la sous-unité comprenant le site
actif
d'une protéine de type [NiFe]-hydrogénase est la sous-unité HoxH de la
protéine de
type [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH chez Synechocystis sp. P006803.
La présente invention porte encore sur une utilisation d'un polypeptide
monomérique suivant l'invention comportant une seule sous-unité comprenant le
site actif d'une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide
monomérique
présentant une activité hydrogénase et étant présent ou non dans une cellule,
pour
produire ou consommer de l'hydrogène par incubation dudit polypeptide
monomérique selon des conditions d'incubation permettant d'assurer une
production ou une consommation d'hydrogène.
La présente invention porte encore sur une utilisation d'un polypeptide
monomérique suivant l'invention ou d'un polypeptide monomérique obtenu selon
le
procédé suivant l'invention comportant une seule sous-unité comprenant le site
actif
d'une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique
présentant une activité hydrogénase et étant présent ou non dans une cellule,
pour
revêtir une surface, en particulier pour revêtir une surface d'un conducteur
électrique, par exemple pour revêtir une surface d'une anode ou d'une cathode.
Définitions
Par le terme polypeptide , il est entendu, au sens de la présente
invention, une chaine unique composée d'un minimum de deux acides aminés liés
entre eux par un lien peptidique entre le groupement carboxylique d'un acide
aminé
et le groupement amine de l'acide aminé suivant. Le terme polypeptide
inclut
également les molécules qui contiennent plus qu'un polypeptide, ceux-ci liés
entre
eux, par exemple par des ponts disulfures, ou des complexes de polypeptides,
ceux-
ciliés entre eux par exemple de manière covalente ou non-covalente, et formant
un
multimère (par exemple un dimère, un trimère, un quadrimère, un pentamère). Un
polypeptide peut aussi contenir des ligands non-protéiques, comme par exemple
le
fer inorganique (Fe), le nickel (Ni), un centre fer-soufre (FeS), ou autre
ligand
organique comme par exemple le monoxyde de carbone (CO), le cyanure (ON) ou
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une flavine. Les termes peptide, polypeptide, enzyme, sous-unité ou protéine
sont
tous inclus dans la définition du polypeptide et ces termes peuvent être
interchangeables. La définition de polypeptide ne tient pas compte de la
longueur dudit polypeptide ni de la façon dont ledit polypeptide est produit.
Par le terme polypeptide recombinant ou polypeptide
hétérologue , il est entendu, au sens de la présente invention, un
polypeptide qui
n'est pas naturellement présent dans l'environnement et/ou qui n'est pas
présent
naturellement dans la cellule hôte utilisée pour sa production, en particulier
dans
une cellule hôte, et dont la production est réalisée par des techniques
recombinantes, par exemple par ajout de matériel génétique dans une cellule
hôte.
Par les termes polypeptide monomérique , il est entendu, au sens
de la présente invention, une chaine unique composée d'un minimum de deux
acides aminés liés entre eux par un lien peptidique entre le groupement
carboxylique
d'un acide aminé et le groupement amine de l'acide aminé suivant. Par
opposition
au terme polypeptide , le terme polypeptide monomérique inclut
seulement
les molécules qui ne contiennent qu'un polypeptide, c'est-à-dire sans
interaction
avec d'autre polypeptide. Par exemple, il ne s'agit en aucun cas d'un
multimère (par
exemple un dimère, un trimère, un quadrimère, un pentamère, ...). Un
polypeptide
monomérique peut aussi contenir des ligands non-protéiques, comme par exemple
le fer inorganique (Fe), le nickel (Ni), les centres fer-soufre (FeS), ou
autre ligand
organique comme par exemple le monoxyde de carbone (CO), le cyanure (ON) ou
une flavine. La définition de polypeptide monomérique ne tient pas compte
de la
longueur dudit polypeptide ni de la façon dont ledit polypeptide est produit.
Par les termes polypeptide monomérique recombinant ou
polypeptide monomérique hétérologue , il est entendu, au sens de la présente
invention, que le polypeptide monomérique n'est pas naturellement présent dans
l'environnement, en particulier dans une cellule hôte, et dont la production
est
réalisée par des techniques recombinante, par exemple par ajout de matériel
génétique dans une cellule hôte.
Par les termes polypeptide monomérique présentant une activité
hydrogénase , il est entendu, au sens de la présente invention, que le
polypeptide
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monomérique est apte à catalyser la réaction réversible H2 4-> 2H+ + 2e-.
Cette
définition de l'activité hydrogénase n'est pas liée aux conditions
expérimentales
mais seulement à la production ou la consommation d'hydrogène par
l'intermédiaire
de l'activité enzymatique de l'hydrogénase.
Par les termes site actif , il est entendu, au sens de la présente
invention, la partie du polypeptide qui, lorsque la structure tertiaire est
formée, est
responsable de l'activité catalytique dudit polypeptide, par exemple de
l'activité
hydrogénase. La partie du polypeptide peut comprendre, par exemple, plusieurs
portions de la séquence en acides aminés et/ou la liaison avec un ou plusieurs
ligands non-protéiques.
Par le terme polynucléotide , il est entendu, au sens de la présente
invention, une chaine unique composée d'un minimum de deux nucléotides liés
entre eux, par exemple par un lien covalent, peu importe qu'il s'agisse de
ribonucléotides ou de désoxynucléotides. Cela inclut donc les ARN et les ADN,
.. simple brin ou double brin. La définition de polynucléotide ne tient
pas compte
de la longueur dudit polynucléotide, ni de la fonction, ni de la forme, ni de
la façon
dont ledit polynucléotide est produit. Un polynucléotide peut être, par
exemple, un
plasmide, une partie d'un plasmide, un gène ou un fragment de gêne.
Par les termes polynucléotide exogène , il est entendu, au sens de
la présente invention, un polynucléotide qui n'est pas normalement présent
dans la
cellule hôte. Par exemple, le polynucléotide exogène peut être une séquence
codante pour un polypeptide qui n'est pas naturellement présent dans la
cellule hôte
ou un plasmide.
Par le terme concaténaire , il est entendu, au sens de la présente
invention, un enchainement de plusieurs séquences afin de n'en former qu'une
seule, par exemple de séquences polynucléotidiques ou de séquences
polypeptidiques.
Par le terme plasmide , il est entendu, au sens de la présente
invention, une molécule d'ADN double brins distinct de l'ADN chromosomique,
exogène, capable de réplication autonome, grâce à sa propre origine de
réplication.
Le plasmide peut comporter également d'autres séquences d'intérêts, comme par
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exemple un gène codant pour un facteur de sélection (résistance à un
antibiotique,
etc), un site de clonage multiple permet l'ajout de polynucléotide, et/ou des
séquences de régulation de la transcription. Les termes plasmide ou
vecteur
d'expression sont interchangeables.
5 Par le
terme cellule hôte , il est entendu, au sens de la présente
invention, une cellule qui a subi une modification. Cette modification peut
par
exemple être l'introduction d'un polynucléotide exogène dans la cellule, par
exemple
par l'intermédiaire d'un plasmide.
Par les termes facteur de maturation , il est entendu, au sens de la
10
présente invention, toute molécule, biologique, ou non, qui participe à la
formation
de la structure d'une autre molécule biologique, par exemple d'une protéine.
Par les termes facteur de maturation endogène , il est entendu, au
sens de la présente invention, toute molécule, biologique, ou non, qui
participe à la
formation de la structure d'une autre molécule biologique, par exemple d'une
15
protéine, et qui est naturellement présent dans la cellule hôte, c'est-à-dire
sans
modification génétique de ladite cellule hôte.
Par les termes facteur de maturation exogène , il est entendu, au
sens de la présente invention, toute molécule, biologique, ou non, qui
participe à la
formation de la structure d'une autre molécule biologique, par exemple d'une
20
protéine, et qui n'est pas naturellement présent dans la cellule hôte, c'est-à-
dire
qu'une modification génétique de ladite cellule hôte est nécessaire pour y
ajouter
ledit facteur de maturation exogène, par exemple par ajout d'un vecteur
d'expression.
Par le terme isolé , il est entendu, au sens de la présente invention,
25 toute
molécule qui a été retirée de son environnement naturel, par exemple qui a
été retirée d'une [NiFe]-hydrogénase naturelle.
Par le terme purifié , il est entendu au sens de la présente invention,
toute molécule qui a été esseulée par l'intermédiaire de techniques
biochimiques.
Cette définition ne tient pas compte de la façon dont est produite la
molécule, par
30
exemple de manière naturel ou par recombinaison, synthétisée chimiquement ou
enzymatiquement, ni des techniques biochimiques mises en uvre pour la
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purification, comme par exemple une chromatographie d'affinité ou un tamis
moléculaire. Par exemple, un polynucléotide, un polypeptide ou l'H2 peuvent
être
purifiés. De manière préférentielle, une substance est purifiée lorsqu'elle
représente
au minimum 60% par rapport aux autres composants qui lui sont associés,
préférentiellement 75% par rapport aux autres composants qui lui sont
associés,
préférentiellement 90% par rapport aux autres composants qui lui sont
associés.
Par le terme homogénéité apparente >, il est entendu, au sens de la
présente invention, toute molécule purifiée représentant minimum 90% par
rapport
aux autres composants qui lui sont associés.
Par le terme identité >, il est entendu, au sein de la présente
invention, une similarité structurelle entre deux polynucléotides ou deux
polypeptides. La similarité structurelle est déterminée par un alignement
entre les
deux séquences, alignement qui optimise le nombre de nucléotides identiques ou
le
nombre d'acides aminés identiques le long de la séquence. Les trous dans une
ou
les deux séquences sont permis afin d'optimiser l'alignement et donc la
similarité
structurelle. Les séquences des nucléotides ou des acides aminés doivent
cependant rester les mêmes.
Par les termes matériel génétique >, il est entendu, au sens de la
présente invention, le génome d'une entité et plus précisément l'ensemble des
acides nucléiques de cette entité, séquences codantes et non-codantes
comprises.
Par les termes mutation génétique >, il est entendu, au sens de la
présente invention, une modification accidentelle ou provoquée du matériel
génétique d'une entité, par exemple d'une cellule hôte ou d'un vecteur
d'expression.
Par les termes entité comprenant un matériel génétique >, il est
entendu, au sens de la présente invention, une entité qui comprend du matériel
génétique selon la définition reprise ci-dessus, par exemple une cellule hôte
ou un
vecteur d'expression tel qu'un plasmide.
Par les termes entité génétiquement modifiée >, il est entendu, au
sens de la présente invention, une entité comprenant du matériel génétique
selon la
définition reprise ci-dessus et qui a subi une modification de son matériel
génétique,
par exemple une mutation génétique ou l'introduction d'un polynucléotide
exogène
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dans la cellule, comme par exemple par l'intermédiaire d'un plasmide.
Par les termes cellule hôte génétiquement modifiée >, il est entendu,
au sens de la présente invention, une cellule hôte selon la définition reprise
ci-
dessus et qui a subi une modification de son matériel génétique, par exemple
une
mutation génétique ou l'introduction d'un polynucléotide exogène dans la
cellule,
comme par exemple par l'intermédiaire d'un plasmide.
Par les termes vecteur d'expression génétiquement modifié >, il est
entendu, au sens de la présente invention, un vecteur d'expression ou un
plasmide
selon la définition reprise ci-dessus et qui a subi une modification de son
matériel
génétique, par exemple l'ajout d'une séquence d'intérêts, comme par exemple un
gène codant pour un polypeptide particulier.
D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention
ressortiront des exemples donnés ci-après, à titre non limitatif et en faisant
référence
aux figures annexées.
La figure 1 illustre la carte du plasmide pET-26b(+) (5360pb).
La figure 2 illustre l'analyse par gel d'agarose de la digestion du vecteur
d'expression pET26b(+) + HoxH par les enzymes de restrictions Ndel et Blpl.
La figure 3 illustre la carte du plasmide pACYCDuet-1 (4008pb).
La figure 4 illustre l'analyse par gel d'agarose de la digestion du vecteur
d'expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW par les enzymes de restrictions
Ncol et HindIII.
La figure 5 illustre l'analyse par gel d'agarose de la digestion du vecteur
d'expression pET26b(+) + HoxH, issus de l'ADN plasmidique d'une colonie d'E.
coi',
par les enzymes de restrictions Ndel et Blp I.
La figure 6 illustre l'analyse par gel d'agarose de la digestion du vecteur
d'expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW, issus de l'ADN plasmidique d'une
colonie d'E. coll, par les enzymes de restrictions Ncol et HindIII.
La figure 7 illustre la méthode de purification de la protéine
recombinante d'intérêt HoxH. NA, échantillon non-absorbé sur la colonne
d'affinité
Ni-NTA. Lavage, échantillon élué avec le tampon de lavage contenant 10mM en
lmidazole. 50mM, échantillon élué à une concentration de 50mM en imidazole.
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100mM, échantillon élue à une concentration de 100mM en imidazole. 150mM,
échantillon élue à une concentration de 150mM en imidazole. 200mM, échantillon
élue à une concentration de 200mM en imidazole. 250mM, échantillon élue à une
concentration de 250mM en imidazole.
La figure 8 illustre l'analyse par SDS-PAGE de la composition
protéique de diverses fractions récoltées lors de la chromatographie
d'affinité.
Charge, surnageant appliqué sur la colonne d'affinité Ni-NTA et issus de la
lyse des
cellules de E. col' recombinante ; NA, échantillon non-absorbé sur la colonne
d'affinité Ni-NTA. Lavage, échantillon élue avec le tampon de lavage contenant
10mM en lmidazole. M, marqueur de poids moléculaire. 50mM, échantillon élue à
une concentration de 50mM en imidazole. 100mM, échantillon élue à une
concentration de 100mM en imidazole. 150mM, échantillon élue à une
concentration
de 150mM en imidazole. 200mM, échantillon élue à une concentration de 200mM
en imidazole. 250mM, échantillon élue à une concentration de 250mM en
imidazole.
La figure 9 illustre l'analyse par immuno-détection (Western blot) de la
présence de HoxH dans diverses fractions récoltées lors de la chromatographie
d'affinité. M, marqueur de poids moléculaire. Charge, surnageant appliqué sur
la
colonne d'affinité Ni-NTA et issus de la lyse des cellules de E. col
recombinante.
NA, échantillon non-absorbé sur la colonne d'affinité Ni-NTA ; 50mM,
échantillon
élué à une concentration de 50mM en imidazole. 200mM, échantillon élue à une
concentration de 200mM en imidazole.
La figure 10 est une représentation schématique de la structure de
HoxEFUYH, la [NiFe]-hydrogénase de Synéchocystis sp. PCC 6803. HoxE, 19KDa
et 1 centre FeS ; HoxF, 57.5KDa, 2 centres FeS et un centre FMN ; HoxU, 26KDa
et 4 centres FeS ; HoxY, 20KDa et un centre FeS ; HoxH, 53KDa et le site
actif.
La figure 11 est une représentation schématique (flèche grisée) du
transfert d'électrons et des interactions attendues avec le NADPH et le methyl-
viologène (MV) chez HoxEFUYH, la [NiFe]-hydrogénase de Synéchocystis sp. PCC
6803.
La figure 12 est une représentation schématique où le point
d'interrogation pose la question de savoir si le site actif de la protéine
recombinante
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HoxH peut accepter ou non les électrons directement du MV et donc produire de
l'hydrogène en l'absence de relais redox additionnels.
La figure 13 illustre la mise en évidence de l'activité hydrogénase par
la production d'hydrogène qui résulte de l'ajout de la protéine recombinante
HoxH à
un réactif contenant du methyl-viologène préalablement réduit par du
dithionite de
sodium en absence d'oxygène. HoxH est capable de prendre les électrons du
méthyl-viologène préalablement réduit pour les combiner avec des protons
(présents dans le tampon) afin de produire de l'hydrogène selon l'équation H2
4-> 2H+
+ 2e-qui représente la réaction catalysée par l'hydrogénase. Le niveau
d'hydrogène
dissout dans le réactif est mesuré en continu à l'aide d'un micro-senseur
(Unisense , Danemark). La flèche montre le moment où l'ajout de la protéine
recombinante HoxH est réalisé, moment concomitant avec l'augmentation du
niveau
d'hydrogène dissout détecté par le micro-senseur.
La figure 14 illustre la mise en évidence de l'activité hydrogénase par
la réduction du benzyl viologène qui résulte de l'ajout de la protéine
recombinante
HoxH à un réactif contenant du benzyl viologène (BV) en présence d'H2. HoxH
est
capable de prendre les électrons de l'hydrogène pour les transférer à un
médiateur
redox, par exemple le benzyl viologène, en même temps que la production de
protons selon l'équation H2 4-> 2H+ + 2e- qui représente la réaction catalysée
par
l'hydrogénase. Le niveau d'hydrogène consommé est équivalent au niveau de
benzyl viologène réduit, niveau que l'on peut mesurer en continu par
spectrophotométrie à une longueur d'onde de 578nm.
La figure 15 illustre la mise en évidence de l'activité hydrogénase par
la production d'hydrogène qui résulte de l'ajout de la protéine recombinante
HoxH,
produite en l'absence des facteurs de maturation HupABCDEFHoxW exogènes à E.
col!, à un réactif contenant du methyl-viologène préalablement réduit par du
dithionite de sodium en absence d'oxygène. HoxH est capable de prendre les
électrons du méthyl-viologène préalablement réduit pour les combiner avec des
protons (présents dans le tampon) afin de produire de l'hydrogène selon
l'équation
H2 4-> 2H+ + 2e-qui représente la réaction catalysée par l'hydrogénase.
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Exemples
1. Construction d'un vecteur d'expression de HoxH
5 1.1. Séquence simple de HoxH
HoxH correspond à la grande sous-unité comprenant le site actif de la
[NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. P006803. Le numéro
d'accession de la protéine dans Genbank est BAA18091.1. Le point isoélectrique
10 théorique de HoxH est de 5,86 pour une masse moléculaire théorique de
52996.53
Daltons. La séquence en nucléotides (1425bp) de HoxH est la suivante et est
nommée SEQ ID NO:1 dans le cadre de la présente invention :
atgtctaaaaccattgttatcgatcccgttacccggattgaaggccatgccaaaatctccattttcctcaacgaccagg
15 ..
gcaacgtagatgatgttcgtttccatgtggtggagtatcggggttttgaaaaattttgcgaaggtcgtcccatgtggga
aatggctggtattaccgcccgtatttgcgg
catttgtccggttagccatctgctctgtgcggctaaaaccggggataag
ttactggcggtgcaaatccctccagccggggaaaaactgcgccgtttaatgaatttagggcaaattacccaatccc
acgccctaagttttttccatctcagcagtcctgattttctgcttggttgggacagtgatcccgctactcgcaatgtgtt
tggt
ttaattgctgctgaccccgatttagctagggcaggtattcggttacggcaatttggccaaacggtaattgaacttttgg
g
20 agctaaaaaaatccactctgcttggtcagtgcccggtggagtccgatcgccgttgtcggaagaaggcagacaatg
gattgtggaccgtttaccagaagcaaaagaaaccgtttatttagccttaaatttgtttaaaaatatgttggaccgcttc
c
aaacagaagtggcagaatttggcaaatttccctccctatttatgggcttagttgggaaaaataatgaatgggaacatt
atggcggctccctgcggtttaccgacagtgaaggcaatattgtcgcggacaatctcagtgaagataattacgctgat
tttattggtgaatcggtggaaaaatggtcctatttaaaatttccctactacaaatctctgggttatcccgatggcattt
atc
25
gggttggtccccttgcccgccttaatgtttgtcatcacattggcaccccggaagcagaccaagaattagaagaatat
cggcaacgggctggaggtgtggccacgtcctctttcttttatcattacgcccgcttggtggaaattcttgcctgtttag
aa
gccatcgaattgttaatggctgaccctg atattttgtccaaaaattgtcgagctaaggcagaaattaattgtaccg
aag
cggtggg agtgag cg
aagcaccccggggtactttattccaccattacaagatagatgaagatggtctaattaagaa
agtgaatttgatcattgccacgggcaacaataacttagccatgaataaaaccgtggcccaaattgccaaacactac
30
attcgcaatcatgatgtgcaagaagggtttttaaaccgggtggaagcgggtattcgttgttatgatccctgccttagtt
gt
tctacccatgcagcgggacaaatgccattgatgatcgatttagttaaccctcagggggaactaattaagtccatcca
gcgggattaa
La séquence en acides aminés (474 aa) de HoxH est la suivante et est
35 nommée SEQ ID NO:2 dans le cadre de la présente invention :
CA 03160285 2022-05-04
WO 2021/094465 PCT/EP2020/081931
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MSKTIVIDPVTRIEGHAKISIFLNDQGNVDDVRFHVVEYRGFEKFCEGRPMWEMA
G ITARICGICPVSHLLCAAKTGDKLLAVQIPPAGEKLRRLMNLGQITQSHALSFFHL
SSPDFLLGWDSDPATRNVFGLIAADPDLARAG I RLRQFGQTVIELLGAKKIHSAWS
VPGGVRSPLSEEGRQW1VDRLPEAKETVYLALNLFKNMLDRFQTEVAEFGKFPSL
FMGLVGKNNEWEHYGGSLRFTDSEGN IVADNLSEDNYADFIGESVEKWSYLKFP
YYKSLGYPDGIYRVGPLARLNVCHHIGTPEADQELEEYRQRAGGVATSSFFYHYA
RLVEILACLEAIELLMADPDILSKNCRAKAEINCTEAVGVSEAPRGTLFHHYKIDED
GLIKKVNLI IATGNNNLAMNKTVAQIAKHYI RN HDVQEGFLNRVEAG I RCYDPCLSC
STHAAGQMPLMIDLVNPQGELIKSIQRD
La figure 1 représente la carte du plasmide pET26b(+) utilisé pour
construire le vecteur d'expression de HoxH par insertion de SEQ ID NO:3 dans
pET26b(+). pET26b(+) est un plasmide de 5360pb possédant une origine de
réplication pour E. coli, un gène de résistance à la kanamycine, un site de
clonage
multiple (MCS) contenant de nombreux sites de restriction, le promoteur T7 et
le
terminateur de transcription T7. Il contient également le géne tact codant
pour un
répresseur de transcription. Cette répression de la transcription peut être
levée par
ajout d'IPTG.
1.2. Séquence optimisée de HoxH
Optionnellement, selon un mode de réalisation suivant l'invention, les
séquences SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO:2 sont optimisées pour l'usage des codons
chez E. coll. En particulier, les sites de restriction Ndel (catatg) et Blpl
(gctnagc) sont
ajoutés respectivement en début et en fin de la séquence de nucléotides pour
le
clonage dans le plasmide pET26b(+) et la séquence caccaccaccaccatcac
(soulignée
ci-dessous) est également ajoutée (séquence codant pour l'étiquette poly-
histidines
proche de l'extrémité N-terminal de la protéine).
La séquence de nucléotides optimisée (1453bp) est la suivante et est
nommée SEQ ID NO:3 dans le cadre de la présente invention :
'IdlE1 le lep N suoRoplsei ep SellIAZUG sel Jed (C:ON al 03s) Hx0H + (+)q9u3d
uo!sseicIxe,p ineloeA np uoRse6p el ep esAleue,1 eiluow ein64 ei
=(+)q9u3d suep g:ON al 03s ep uopesu! Jed HxoH ep uo!sseicIxe,p g E
ineloeA el eirulsuoo inod espn Ise (+)q9u3d ep!Luseld ai
01:101S>11-13 90d NA-101VIld VIOOVVHISOS-10d0
A01:11 OV3Abl Nid 930ACH NU lAHNVIOVAINNVIV-INNNOIVII1NAN>11-190301>IA
H 1-1A-1191:1 dV3 SADAV3ION 13V>IVUONNS-110dOVVITRIV3-10V-113A-HVAHAdd 0 E
SSIVADOVUOUA331300V3d191HHOAN-IblV1d9AblAl OCIdAMSNAAdd>11AS
M>I3 AS3 Old OVANCI3S-INCIVAI N 93 SOldbrISODAH 3M3 NN>I9A-19VIdiSdd>19
d 3 VA310dbl 011/1 N>idi N1V-IAA13>IV3 dibl CIAIMOU 933 SidSbIA99dASMVSH
1>INVOT131A109dOblibl I OVUV-ICHOVVI-19dANUIVdCISCIMOTIACIdSS-HddS1
VHS01109-INIAliblbli>139VddlOAVTINCIOINVVOTIHSAd01901b1V11 OVVI3MVI g
db1930d>13d9b1A3AAHAUACICIANDOCIN-IdISINVH9311:11AdOIAIINHHHHHHSVI
: uopeAui elueseid el ep alpe el suep17:0N al 03s epwwoulse
le ellieMns el Ise eps!LuRclo (ee pet) seu!we seppe ue eouenbes ei
O
o5e5p5eene616o6eoneo6eeeene6p6e61666eo600lee11661
ooe6ne61261olooôle6eo166eo6eo6le000eo6e161o6e610161600le6121161o6oneo66006ee
621616olee6lon16662266eon6le6oeooeeo6oneoeloweeeeo6ne6eoeo611600eeeelee
6leeo661oleeleeoee16600eeo6olene6loleen66eeeeene6101661e6ee6oe6neeeeleloe
oleoel000e16616o6006o6626162116166116eo66e600el6peeneee6eo6eeeeo616olône g i
eeeelol6lonele6loole6eo661261o6pee6neeo662661016loo661oneee611661016oeo6len
eolemno6eo6eloe6o 61161661666o 616062016 1212262e 661oee66eole 6eo6ee660000e
166neleoleol6w6oee61016oeo661o600e661161600elole666126600lelo666loo6eeeeoen
el600meee6lolelo6e66leeeee661616eee6166olenne6eo6leneeoe6ee6o6e6loleele66
o6n6nelee166ee6lope66oeoln6o6loo6e1661661eloeoee6661ee6leeleeeee16611661016 OT
661211161oeol600meeee661nee6eo6116ee6eoe6eoonl6ole661o6leleeeeeelolee6loe
o661olelo166oeee6eeeeo662660061016o1e61161126616eol6o166ee6e2616261o600l6e16
on6166166600616101661eoeeleone6eeeee6o666661o6p6e6nen6eoe6eo1661116eol6
o61016one16600616o6o661ole6600le61066o6ne6p166111616leel6oeoeeo66000e6o6ele
666166661o6lonne6e0006e16e6loleonlomol6peo6leo6o16eoeoene6eol6661olee6126 g
101601606102222261662o 6600600ne6eo616eo661o6peeele6e6600eeeeeo600 616161o6
loleoo6e616600lômee66161nel6oeo66oeole1660066leee666161e600l6o166eeennee
eee6ono661600elee6n6n6oeolno600l6oe6oe6o16oeeo666eooe6oee6lowneo6eneee
eoo6oeoo66ee6oleo6000eol6e000e6oleol6oleooeeeeoeoleooeooeooeooeoo6e5ffleo
LE
I6180/0Z0Zd1/IDd S9171760/IZOZ OM
170-g0-ZZOZ g8Z09T0 VD
CA 03160285 2022-05-04
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Deux fragments d'ADN à environ 5300pb (pET26b(+) linéarisé) et à environ
1500pb
(séquence HoxH excisé du plasmide pET26b(+)) sont mis en évidence. Ceci
confirme la présence de la séquence HoxH d'intérêt dans le vecteur
d'expression
pET26b(+).
2. Construction du vecteur d'expression d'au moins un facteur de
maturation
Au moins les facteurs de maturation suivants sont considérés dans le
cadre de la présente invention : HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW.
HypA est une protéine d'expression/formation de la [NiFe]-
hydrogenase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d'accession
de la protéine dans Genbank est BAA18357.1. Le point isoélectrique théorique
de
HypA est de 4,94 pour une masse moléculaire théorique : 12773,47 Daltons. La
séquence en nucléotides (342bp) de HypA est la suivante et est nommée SEQ ID
NO:5 dans le cadre de la présente invention :
atgcacgaagttagtctgatggagcaaactttggcgatcgccattgcccaggcggaagaccatggagccagcca
aatccatcgtttaaccctgcgggtggggcaacagtctggggtggtggccgatgccctacggtttgcgtttgaagtggt
gcgacaaaataccatggccgccgaggcgagattggaaattgaagaaattcccgttacctgtcgttgccaacactg
ccacgaaaattttcagccagaggattggatttaccgctgtccccactgcgaccagattagccaaacagtaatggat
ggcaaacagttggaactagcatccctagaactgagttga
La séquence en acides aminés (113 aa) de HypA est la suivante et est
nommée SEQ ID NO:6 dans le cadre de la présente invention :
MHEVSLMEQTLAIAIAQAEDHGASQIH RLTLRVGQQSGVVADALRFAFEVVRQNT
MAAEARLEI EEIPVTCRCQHCHENFQPEDWIYRCPHCDQISQTVMDGKQLELASL
ELS
HypB est une protéine d'expression/formation de la [NiFe]-
hydrogènase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d'accession
de la protéine dans Genbank est BAA18312.1. Le point isoélectrique théorique
de
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HyB est de 5,75 pour une masse moléculaire théorique : 31242,97 Daltons. La
séquence en nucléotides (858bp) de HypB est la suivante et est nommée SEQ ID
NO:7 dans le cadre de la présente invention :
atgtgccaaaactgcggttgtagtgcggtgggaaccgttgcccatagccaccatcaccatggcgatggaaattttgc
ccacagccatgatgaccatgaccagcaagaacatcatcaccaccatggcaactacagcaaaagtccaagtcag
cagactgtgaccattgaacccgatcgccagtccattgccattggccaaggcattctcagcaagaatgaccgcctag
cggaaaggaatcggggctatttccaggctaagggcttactggtgatgaatttcctctcttctcccggagccggtaaaa
ctgctctgatcgaaaaaatggtcggcgatcgacaaaaagaccatcccaccgccgtcattgtgggggatttagcca
ccgataacgatgcccaacgtctccgcagtgccggggcgatcgccattcaggtcaccacaggaaatatttgccatct
ggaagcggaaatggtggccaaggcggcccaaaagttagatttagacaatatcgatcaattgatcattgaaaatgtt
ggtaatttggtttgccccaccacctatgatctaggggaagatttacgggtcgtattattttccgtcacagaaggggagg
ataaaccccttaaatatcccgccaccttcaaatcagcccaggttattttagtcaccaaacaggacattgccgccgca
gtggattttgatgcagagctggcttggcaaaacctacggcaagtggccccccaagcccaaatttttgcagtgtctgc
ccgcacggggaaaggattgcagtcctggtatgagtatttggatcaatggcaactccaacactattcgccgttggttg
atccagcattggcctaa
La séquence en acides aminés (285 aa) de HypB est la suivante et est
nommée SEQ ID NO:8 dans le cadre de la présente invention :
MCQNCGCSAVGTVAHSHHHHGDGNFAHSHDDHDQQEHHHHHGNYSKSPSQQ
TVTIEPDRQSIAIGQGILSKNDRLAERNRGYFQAKGLLVMNFLSSPGAGKTALIEK
MVG D RQKDH PTAVI VG DLATDN DAQRLRSAGAIAIQVTTGN ICH LEAEMVAKAAQ
KLDLDN I DQLI IENVGNLVCPTTYDLGEDLRVVLFSVTEGEDKPLKYPATFKSAQVI
LVTKQD IAAAVDFDAELAWQN LRQVAPQAQ I FAVSA RTG KG LQSWYEYLDQWQL
QHYSPLVDPALA
HypC est une protéine d'expression/formation de la [NiFe]-
hydrogenase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. P006803. Le numéro d'accession
de la protéine dans Genbank est BAA18180.1. Le point isoélectrique théorique
de
HypC est de 4,20 pour une masse moléculaire théorique : 7987,42 Daltons. La
séquence en nucléotides (231bp) de HypC est la suivante et est nommée SEQ ID
NO:9 dans le cadre de la présente invention :
CA 03160285 2022-05-04
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atgtgtctagccctacctggccaggttgtcagtttaatgcccaactccgatcccctgttactgacgggaaaggttagct
ttgggggcatcattaaaaccattagccttgcctacgtacccgaggttaaggtgggggattacgtgattgtccatgtgg
gctttg ccattagcattgtggacgaagaggcggcccagg aaactttgatagacttggcagaaatggg agtttaa
5 La séquence en acides aminés (76 aa) de HypC est la suivante et
est
nommée SEQ ID NO:10 dans le cadre de la présente invention :
MCLALPGQVVSLMPNSDPLLLTGKVSFGG Il KTISLAYVPEVKVG DYVIVHVG FAIS I
VDEEAAQETLIDLAEMGV
HypD est une protéine d'expression/formation de la [NiFe]-
hydrogènase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. P006803. Le numéro d'accession
de la protéine dans Genbank est BAA16622.1. Le point isoélectrique théorique
de
HypD est de 6,31 pour une masse moléculaire théorique de 40632,94 Daltons. La
séquence en nucléotides (1125bp) de HypD est la suivante et est nommée SEQ ID
NO:11 dans le cadre de la présente invention :
atgaaatacgttgatgaatatcgggatgcccaggcggtggcccattaccgtcaggcgatcgccagggagataacc
aaaccttggacgctgatggagatttgcggcggccagacccacagcattgtcaaatatggcttggatgctttgttgccg
aagaatttgactctgatccatggtcccggctgtcctgtgtgcgtcactccgatggaattaattgaccaggctttgtggt
ta
gctaagcaaccggagatcattttttgttcctttggcgatatgttgcgggtgcccggcagtggggcggatttgctgagca
ttaaag cccagggcgg cg atgtgcgcattgtctattctcctttgg
attgtttggcgatcgccagggagaatcctaatcg
ggaagtggtatttttcggagtaggttttgaaactacagcccctgccacggccatgactctccaccaagctagggccc
agggaattagcaatttcagtttactttgcgcccatgtattggtgcccccggctatggaggctttattaggcaatcccaa
tt
ccctcgtgcagggctttttggcggcagggcatgtctgtacggtgaccggggaaagggcctatcaacatatcgctga
aaaataccaagtacccattgtcatcactggctttgaacctgtggatattatgcagggcatctttgcctgtgtgcgccaa
ctggagtcgggacaattcacctgcaacaatcaatatcggcgatcggtccaaccccagggcaatgcccatgctcag
aaaattattgaccaagtgtttgagccagtcgatcgccattggcggggtttgggattaattccggccagcggtttgggtt
t
aaggccagcatttgccccctgggatgccgcagttaaattcgccaatttattgcaaaccatggccccaacgatggga
gaaacagtgtgtattagcggggaaattttacagggacaacggaagcccagcgattgtccagcctttggtactatctg
caccccagaacaacccttgggggctcccatggtttcctcggaaggagcctgtgccgcctattaccgttatcgccaac
aattaccggaaccagtgggagcggccagagtttag
La séquence en acides aminés (374 aa) de HypD est la suivante et est
.. nommée SEQ ID NO:12 dans le cadre de la présente invention :
CA 03160285 2022-05-04
WO 2021/094465 PCT/EP2020/081931
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MKYVDEYRDAQAVAHYRQAIAREITKPWTLMEICGGQTHSIVKYGLDALLPKNLTL
I HGPGCPVCVTPM ELIDQALWLAKQPE I I FCSFGDMLRVPGSGADLLSI KAQGGDV
RIVYSPLDCLAIARENPNREVVFFGVGFETTAPATAMTLHQARAQG ISNFSLLCAH
VLVPPAMEALLGNPNSLVQGFLAAGHVCTVTGERAYQHIAEKYQVPIVITG FEPVD
I MQG I FACVRQLESGQFTCNNQYRRSVQPQGNAHAQKI I DQVFEPVD RHWRGLG
LI PASG LG LRPAFAPWDAAVKFAN LLQTMAPTMG ETVCISG El LQGQRKPSDCPA
FGTICTPEQPLGAPMVSSEGACAAYYRYRQQLPEPVGAARV
HypE est une protéine d'expression/formation de la [NiFe]-
hydrogènase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. P006803. Le numéro d'accession
de la protéine dans Genbank est BAA17478.1. Le point isoélectrique théorique
de
HypE est de 4,93 pour une masse moléculaire théorique de 36425,60 Daltons. La
séquence en nucléotides (1038bp) de HypE est la suivante et est nommée SEQ ID
NO:13 dans le cadre de la présente invention :
gtgaacttagtctgtcccgttccccttgatcgttatccccaggtactgttagcccacggcggcggcggtaagttgagcc
aacaattacttaagcaaatttttttaccggcctttggcgcttctgaaacgggtagtcatgatgcggcggtttttactgc
ca
accaaagttctttagctttcaccaccgactcctatgtgatcaatcccctcttttttcctgggggcgatattggttcttt
ggca
..
gtccacggcaccgttaatgacctagccatggccggcgcaacccctcgctatatcagcgttggttttatcctcgaaga
aggattgcccatggagaccctctggcgggtggcccaatccctagggcaagcggcccaaaactgtggggtggaa
attcttaccggtgataccaaagtggtggaccggggtaagggagacggcattttcatcaacaccagcggcattggtt
ccctcgaccatcaacaaactatccatcccaatcaggtacaggtaggcgatcgcctaattttgagcggtgatttggga
cgtcatggcatggccattatggcagtgcgccaaggattagaatttgaaaccaccattgaaagtgattcggccccggt
tcacagagaagtgcaggcattattgtcggcagggatcccaatccattgtctgcgggatttaaccagggggggatta
gccagtgcggttaatgaaattgcccaaacttccggggtaaccatggctttacgagaaacgttaatcccggtggagg
ccgaagtacaagccgcctgtgaactgttgggttttgaccccctctatgtggccaatgagggaagattcctggccattg
tgcccccggaagcagaacagaagaccgtggaaattttgcaaactttccatccccaagctacggcgatcggtaca
gtaacaggcaaaagtgcacaaaccttggggttagtcagtttggaaagttccattggtgccccccggttgctagacat
gatcagtggggagcaattaccccgtatttgttag
La séquence en acides aminés (345 aa) de HypE est la suivante et est
nommée SEQ ID NO:14 dans le cadre de la présente invention :
MNLVCPVPLDRYPQVLLAHGGGGKLSQQLLKQI FLPAFGASETGSHDAAVFTAN
QSSLAFTTDSYVINPLFFPGGDIGSLAVHGTVNDLAMAGATPRYISVGFILEEGLP
ee6opene61126621261opoe6o6n2166oemene622666121626onopolo600po6peo66626
opeo66mopeol6oemeeeepopeopeeple66eoleeen66206eopeele6peopeeeen166612
elepomee61166112226621none61o6lowne6126166nnop00066121161160661no6n266oleo g E
000leleeeneoo6peopeolee166enelneolneoopeoppleolo6nee6262066noe166ep000po
leepeemee6266666661neloe166026612066oelo661opo6612666no6ne16621161600l6e
662661202661202266066121166o6enneleoelelopoleo6poennopol6loo6mo6peoo
peee6p6lelepoleol6eoluene6l000poeme6eo6n6neee66p0000lolome6oelelo6poo6e
elne0006neoo6226226nneeepooploop000lo6lonee6neo6661neopeoo6eol6oeno6e oE
poleepeopepoo6o1e6o6616eopleeeeeleneol662666126o66nelopeeeeeepoloeloo622
poomoene000peoloolo6oen66660006e6o16o6meneoo622666106216eleepool6n6o
one6126616poo16111611260006o1e6leon6olonn660261o6neleepeoen66000pemo6oene
leele6neo6weepo6266661o6enope166162ooplo621661e000pee6peeneeeeeeeloenen
opoleo6woolopleloo6211612216066o162600000peo66200006neleeee66166nneeneeoe g z
peepeeepopeenenenel0000600600eeepoen6nee6116226eloleeleeloopeooeneo6
26616neepol66nolee1661216122166066moopeele6600e6oleopee662ene6peneeeee6
6161062261111261opoo61261611616meoono66166eno66epenelo6olenelepo66016epeem
221262161o6mopeemo62261222062262o6neeepoo66epoe600pe661nno661ope0000
o66161o6olool6loo6leeloope0006leoono6o2621260662oopeo622121226662226161026 oz
ooel6lepoo6o1n662106612oopooel6o1611600p6oenoopl0006226neneoopoelo60000l66o
ône000elopenem0000emolen6006o1e6o6el000e6melope6eopeno6loo600n6nopoo
lelne6000ennel6e6o6lopeeel0006612616216p0000600leloelnopeloenn6222661o600el
16eope6n6006eneeopene611166l00000looeneoe6226opene626266oelnoe6006o1e6o
6622226oe600600eneol6n600plo6266epolopooneelee61666116612261o26661222662 g i
0006n000pleln6m000l6onn6661626622061666226662oo166eopleoo611600peeeen6le
: uoRueAui eluespid el ep alpe el suep gi.:ON
ai os epwwou Ise le eluemns el Ise ddAH ep (dcwou) sepRopionu ue eouenbps
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CA 03160285 2022-05-04
WO 2021/094465 PCT/EP2020/081931
47
La figure 4 montre l'analyse de la digestion du vecteur d'expression
pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW (séquence concaténaire SEQ ID NO:19) par
les enzymes de restrictions Ncol et HindIII. Deux fragments d'ADN à environ
6000pb
et à environ 4000pb sont mis en évidence, comme attendu pour une telle
digestion
enzymatique du vecteur d'expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW. Ceci
confirme la présence de la séquence HypABCDEFHoxW dans le vecteur
d'expression pACYCDuet-1.
3. Introduction des vecteurs d'expressions pET26b(+) + HoxH et
pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW chez E. coll.
Les cellules compétentes BL21 (DE3) d'E. coi/ ont été utilisées pour
l'expression recombinante de la sous-unité HoxH de la [NiFe]-hydrogénase
HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803. Ces cellules sont utilisées en routine
pour la production de protéine recombinante sous le contrôle du promoteur T7.
Les deux vecteurs d'expression pET26b(+) + HoxH et
pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW ont été introduits dans ces cellules par co-
transformation selon la méthode traditionnelle du choc thermique bien connue
de
l'homme de métier. Les transformants présentant la double résistance à la
kanamycine (50 g/m1) et au chloramphénicol (254/m1) ont été conservés sur
milieu
gélosé à 4 C.
4. Vérification de la présence des séquences d'ADN d'intérêts chez E. col!.
Il est possible que certaines colonies possèdent les deux plasmides
permettant la résistance aux marqueurs de sélections utilisés sans pour autant
posséder les séquences d'ADN d'intérêts, à savoir HoxH et HypABCDEFHoxW. Par
conséquent, il est important de vérifier la présence de ces séquences d'ADN
d'intérêts. Une expérience, bien connue de l'homme de métier et consistant en
une
extraction de l'ADN plasmidique de la colonie suivie par une digestion
enzymatique
de cet ADN plasmidique par les enzymes de restrictions utilisés lors de
l'insertion
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des séquences d'ADN d'intérêts dans les plasmides, a été réalisé.
Ainsi, une extraction d'ADN plasmidique, selon un protocole bien
connu de l'homme de métier, a été réalisée sur une colonie présentant la
double
résistance à la kanamycine et au chloramphénicol.
La digestion enzymatique a ensuite été réalisée, selon un protocole
bien connu de l'homme de métier. La digestion du vecteur d'expression
pET26b(+)
+ HoxH par les enzymes de restriction Ndel et Blpl donne deux fragments d'ADN,
respectivement le plasmide pET26b(+) linéarisé à 5300pb et le fragment d'ADN
d'intérêt HoxH à 1500pb (voir figure 5). La digestion du vecteur d'expression
pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW par les enzymes de restriction Ncol et HindlIl
donne deux fragments d'ADN, respectivement le plasmide pACYCDuet-1 linéarisé
à 4000pb et le fragment d'ADN d'intérêt HypABCDEFHoxW à 6500pb (voir la figure
6). Ceci confirme la présence dans la colonie bactérienne de la séquence HoxH
et
HypABCDEFHoxW, respectivement dans les vecteurs d'expression pET26b(+) et
PACYCDuet-1.
5. Production recombinante et purification par chromatographie d'affinité
de HoxH chez E. col!.
Pour obtenir la forme recombinante de la sous-unité HoxH de la [NiFe]-
hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803, une colonie d'E. coi/
contenant les deux vecteurs d'expressions a été utilisée pour ensemencer 4
erlenmeyers d'un volume de 250m1 chacun. Le milieu de culture utilisé est le
milieu
2XYT (16g de tryptone, 10g d'extrait de levure, 5g de NaCI par litre) complété
par
FeAmCi 100 M, NiSO4 50 M, cystéine 50 M, kanamycine 50 g/m1 et
chloramphénicol 25 g/ml. A une densité optique (DO 600nm) de 1.2, 0,2mM IPTG
sont ajoutés à la culture afin d'induire la production recombinante de la sous-
unité
HoxH à 18 C et sous agitation (vitesse d'agitation) de 200rpm. La durée de la
production est de 20h à 18 C. Les cellules sont ensuite récoltées par
centrifugation
(15min à 4500rpm) avant d'entamer le processus de purification.
Une méthode de purification a été mise au point afin de confirmer la
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production de la forme recombinante de la sous-unité HoxH de la [NiFe]-
hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. P006803. Cette méthode (voir
figure 7) permet de purifier HoxH jusqu'à une apparente homogénéité en une
seule
étape de chromatographie d'affinité. La méthode implique une chromatographie
d'affinité avec un métal immobilisé (IMAC). L'agent chélatant est l'acide
nitrilotriacetique (NTA) qui permet la liaison entre la phase immobile et
l'ion
métallique. Le métal immobilisé est le nickel (Ni). Cette chromatographie
permet une
séparation très spécifique de protéines contenant une étiquette poly-
histidines.
Après 20 h de production recombinante de HoxH à 18 C, 1 litre de culture d'E.
coi/
est récolté par centrifugation (15min à 4500rpm). Les cellules sont re-
suspendues
dans 25m1 de tampon de lyse (tampon sodium phosphate 20mM pH 7.5 300mM KCI
+ 2 I benzonase + 5411 MgCl2 1M + 1 pastille composée d'un cocktail
d'inhibiteurs
de protéases sans EDTA) et ensuite lysées par la presse de French. Le
surnageant
(25m1) est récupéré par centrifugation (15min à 15000rpm), filtré (0,45 m) et
appliqué sur la colonne Ni-NTA (1mI) préalablement équilibré dans le tampon de
lavage (tampon sodium phosphate 20mM pH 7.5 300mM KCI + 10mM imidazole).
La colonne est ensuite lavée avec 35m1 de tampon de lavage (tampon sodium
phosphate 20mM pH 7.5 300mM KCI + 10mM imidazole) jusqu'à ce que
l'absorbance à 280nm (représentative de la concentration en protéine) retombe
à
zéro. L'élution est alors réalisée par l'intermédiaire de 5 paliers avec
concentration
croissante en imidazole, respectivement 50mM, 100mM, 150mM, 200mM et
250mM) (voir figure 7).
L'analyse SDS-PAGE des diverses fractions obtenues lors de la
chromatographie montre une bande prédominante proche de 54kDa, ce qui est la
taille attendue pour la sous-unité HoxH, dans les fractions éluées à une
concentration de 100mM, 150mM, 200mM et 250mM en imidazole (voir figure 8).
HoxH montre par ailleurs un excellent degré de pureté puisqu'aucune bande
supplémentaire n'est visualisable dans les fractions éluées à des
concentrations de
150mM, 200mM et 250mM en imidazole. Ceci nous permet de conclure que HoxH
a été purifié jusqu'à une apparente homogénéité en une seule étape de
chromatographie d'affinité.
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Afin de confirmer qu'il s'agit bien de la forme recombinante de la sous-
unité HoxH comprenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH de
Synéchocystis sp. P006803, une immuno-détection à l'aide d'un anticorps anti-
étiquette poly-histidines a été réalisée (voir figure 9). Un marqueur de poids
5 moléculaire contenant une protéine marquée d'une étiquette poly-
histidines a été
ajouté afin de servir de contrôle positif. La protéine recombinante HoxH est
bien
détectée dans la charge, c'est-à-dire le surnageant issu de la lyse des
cellules d'E.
collet appliqué sur la colonne d'affinité Ni-NTA. La protéine recombinante
HoxH est
également présente dans la fraction non-absorbée par la colonne Ni-NTA. Cela
10 indique que la capacité de chargement de la colonne Ni-NTA est dépassée
et qu'une
proportion de la protéine recombinante HoxH n'a pas pu s'y fixer. Aucun signal
n'apparait dans la fraction élution 50mM >. La protéine recombinante HoxH
reste
accrochée à la colonne Ni-NTA à cette faible concentration en imidazole.
Enfin, la
présence de la protéine recombinante HoxH est confirmée par immuno-détection
15 dans la fraction 200mM à la taille attendue, c'est-à-dire proche de 54
kDa. Ceci
confirme de manière non-ambiguë la purification de la protéine recombinante
HoxH
en une seule étape de chromatographie d'affinité. Lorsque la protéine
recombinante
HoxH est mise en évidence par immuno-détection dans une fraction, quelques
bandes de faible intensité apparaissent également à des poids moléculaires
20 inférieurs à 54kDa. Il s'agit vraisemblablement de la protéine
recombinante HoxH
partiellement dégradé à l'extrémité C-terminal. La proportion de protéines
recombinantes HoxH dégradées semble minimum car l'analyse SDS-PAGE ne
montre pas la présence de ces bandes. Pour rappel, l'immuno-détection est une
méthode extrêmement sensible mettant en évidence de très petite quantité de
25 protéine.
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6. Mise en évidence de l'activité hydrogénase chez la protéine
recombinante HoxH
La faculté d'exprimer de manière recombinante les [NiFe]-
hydrogénases permet une large gamme de possibilités dans l'optique de produire
des formes mutantes aux propriétés très différentes de l'enzyme native. La
figure 10
montre la structure de HoxEFUYH, la [NiFe]-hydrogénase de Synéchocystis sp.
PCC 6803. Le NADPH est le cofacteur de HoxEFUYH in vivo chez Synéchocystis
sp. PCC 6803. Le méthyl-viologène (MV) est utilisé comme médiateur redox lors
du
test standard d'activité in vitro des [NiFe]-hydrogénases. La figure 11 est
une
représentation schématique (flèche grisée) du transfert d'électrons et des
interactions attendues entre HoxEFUYH et le NADPH et/ou le MV.
Il est généralement acquis de l'homme de métier que le MV peut
transmettre directement les électrons à un ou plusieurs centres FeS en évitant
le
FMN. Cependant, comme illustré à la figure 12, il n'est pas connu à ce jour si
la
seule sous-unité HoxH, contenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénases
HoxEFUYH
de Synéchocystis sp. PCC 6803, peut accepter les électrons directement du MV
et
donc produire de l'hydrogène en l'absence de relais redox additionnel.
Dans le cadre de la présente invention, pour tester cette possibilité, a
été mis en oeuvre le test standard d'activité in vitro des [NiFe]-hydrogénases
en
présence de la protéine recombinante HoxH et de MV préalablement réduit par le
dithionite de sodium (voir figure 13). HoxH est capable de prendre les
électrons du
méthyl-viologène préalablement réduit pour les combiner avec des protons
présents
dans le tampon afin de produire de l'hydrogène selon l'équation H2
2H+ + 2e- qui
représente la réaction catalysée par l'hydrogénase. Ce test standard
d'activité in
vitro des [NiFe]-hydrogénases, selon un protocole bien connu de l'homme de
métier,
inclut l'utilisation d'une fiole de 2m1 fermée par un septum, étanche à l'air
et dégazé
à l'azote. lml de mélange réactionnel, composé de 100mM de dithionite de
sodium
et 10mM de MV dissout dans du tampon phosphate 10mM pH 6.8 et également
dégazé à l'azote, est ajouté dans la fiole à l'aide d'une seringue. 2004 de
protéines
recombinantes HoxH sont également ajoutés au mélange réactionnel. La
production
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d'hydrogène démarre dès le moment où les protéines recombinantes HoxH sont
ajoutées (moment indiqué par une flèche sur la figure 13). Le contenu en
protéines
a été déterminé par la méthode Bradford (Bradford. 1976. A rapid and sensitive
method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle
of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254). La production d'hydrogène
est
monitorée en continu à l'aide d'un micro-senseur à hydrogène préalablement
calibré
(Unisense, Aarhus, Danemark).
L'activité de la protéine recombinante HoxH peut donc être calculée
puisque la quantité de protéine recombinante HoxH ajoutée (en mg.m1-1) est
connue
tout comme la vitesse de dégagement d'hydrogène ( mol H2.min-1) pour cette
quantité spécifique de protéine recombinante ajouté. Cette activité spécifique
peut,
par exemple, être de 0.1 mol H2.min-1.mg-1d'enzyme.
De façon inattendue et surprenante, le fait que la seule sous-unité
catalytique HoxH contenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH de
Synéchocystis sp. PCC6803 puisse catalyser la réduction des protons, acceptant
les électrons d'un médiateur redox (par exemple, le méthyl-viologène) sans
l'intermédiaire de centres FeS additionnel servant de relais redox, a été mis
en
évidence dans le cadre de la présente invention.
Dans le cadre de la présente invention a également été mis en oeuvre
le test standard d'activité in vitro des [NiFe]-hydrogénases en présence de la
protéine recombinante HoxH, de benzyl viologène et d'hydrogène (voir figure
14).
HoxH est capable de prendre les électrons de l'hydrogène pour les donner au
benzyl
viologène, produisant au passage des protons selon l'équation H2 4-> 2H+ + 2e-
qui
représente la réaction catalysée par l'hydrogénase. Ce test standard
d'activité in
vitro des [NiFe]-hydrogénases, selon un protocole bien connu de l'homme de
métier,
inclut l'utilisation d'une fiole de 2m1 fermée par un septum, étanche à l'air
et saturé
en gaz hydrogène. 2m1 de mélange réactionnel, composé de 40 moles de benzyl
viologène dissout dans du tampon Tris 50mM pH 7.6 et également dégazé à
l'hydrogène, est ajouté dans la fiole à l'aide d'une seringue. L'expérience
est réalisée
à 40 C. 340 g de protéines recombinantes HoxH sont également ajoutés au
mélange réactionnel. La consommation de l'hydrogène et donc la réduction du
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benzyl viologène démarre dès le moment où les protéines recombinantes HoxH
sont
ajoutées. Le contenu en protéines a été déterminé par la méthode Bradford
(Bradford. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal
Biochem
72:248-254). La réduction du benzyl viologène est monitorée par
spectrophotométrie à une longueur d'onde de 578nm. Un coefficient d'extinction
molaire de 8.600 M-1 cm-1 a été pris en compte.
L'activité de la protéine recombinante HoxH peut donc être calculée
puisque la quantité de protéine recombinante HoxH ajoutée (en mg.m1-1) est
connue
tout comme la vitesse de consommation d'hydrogène ( mol H2.min-1), équivalente
à
la vitesse de réduction du benzyl viologène pour cette quantité spécifique de
protéine recombinante ajoutée. Cette activité spécifique peut, par exemple,
être de
0.1 mol H2.min-1 .mg-1 d'enzyme.
De façon inattendue et surprenante, le fait que la seule sous-unité
catalytique HoxH contenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH de
Synéchocystis sp. PCC6803 puisse catalyser l'oxydation de l'hydrogène,
produisant
des protons et donnant les électrons à un médiateur redox (par exemple, le
benzyl
viologène) sans l'intermédiaire de centres FeS additionnel servant de relais
redox,
a été mis en évidence dans le cadre de la présente invention.
En l'absence de l'expression des autres sous-unités du pentamère
HoxEFUYH, les problèmes inhérents à l'état de la technique sont solutionnés au
moins en partie : la protéine recombinante HoxH est capable à elle seule de
catalyser la réduction des protons, acceptant les électrons d'un médiateur
redox (par
exemple le méthyl-viologène) sans l'intermédiaire de centres FeS additionnel
servant de relais redox. La protéine HoxH est également capable à elle seule
de
catalyser l'oxydation de l'H2, réduisant un médiateur redox (par exemple le
benzyl
viologène) sans l'intermédiaire de centre FeS additionnel servant de relais
redox.
Cette caractéristique exceptionnelle démontre le grand avantage de la présente
invention, en particulier la production recombinante d'une seule sous-unité
possédant le site actif d'une [NiFe]-hydrogénase et étant catalytiquement
active.
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7. Production recombinante, purification par chromatographie d'affinité et
mise en évidence de l'activité hydrogénase chez la protéine
recombinante HoxH produite de manière recombinante chez E. coli en
l'absence des facteurs de maturation exogène
De manière semblable à l'exemple 3 ci-dessus, le vecteur d'expression
pET26b(+) + HoxH est introduit chez E. col (cellules compétentes BL21 (DE3))
par
transformation selon la méthode traditionnelle du choc thermique bien connue
de
l'homme de métier, et cela en l'absence du vecteur d'expression pACYCDUET-1 +
HypABCDEFHoxW. Les transformants présentent la résistance à la kanamycine
(50 g/m1).
De manière semblable à l'exemple 4 ci-dessus, la présence de la
séquence d'ADN d'intérêts HoxH a été vérifiée par l'enchainement des
expériences
bien connues de l'homme de métier que sont l'extraction d'ADN plasmidique et
la
digestion enzymatique.
De manière semblable à l'exemple 5 ci-dessus, la protéine HoxH a été
produite de manière recombinante chez E. ce, mais en absence du plasmide
pACYCDUET-1 + HupABCDEFHoxW codant pour les facteurs de maturation
exogènes HupABCDEFHoxW. La protéine HoxH a ensuite été purifiée par
chromatographie d'affinité, de manière semblable à l'exemple 5 ci-dessus.
De manière semblable à l'exemple 6 ci-dessus, l'activité hydrogénase
de la protéine HoxH produite de manière recombinante chez E. col' en l'absence
des facteurs de maturation exogène a été mise en évidence selon le protocole
impliquant le MV et bien connu de l'homme de métier
Ainsi, dans le cadre de la présente invention a été mis en oeuvre le
test standard d'activité in vitro des [NiFe]-hydrogénases en présence de la
protéine
recombinante HoxH et de MV préalablement réduit par le dithionite de sodium
(voir
figure 15). HoxH est capable de prendre les électrons du méthyl-viologène
préalablement réduit pour les combiner avec des protons présents dans le
tampon
afin de produire de l'hydrogène selon l'équation H2 4-> 2H+ + 2e-qui
représente la
réaction catalysée par l'hydrogénase. Ce test standard d'activité in vitro des
[NiFe]-
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hydrogénases, selon un protocole bien connu de l'homme de métier, inclut
l'utilisation d'une fiole de 2m1 fermée par un septum, étanche à l'air et
dégazé à
l'azote. lml de mélange réactionnel, composé de 100mM de dithionite de sodium
et
10mM de MV dissout dans du tampon phosphate 10mM pH 6.8 et également dégazé
5 à
l'azote, est ajouté dans la fiole à l'aide d'une seringue. 750 g de protéines
recombinantes HoxH sont également ajoutés au mélange réactionnel. La
production
d'hydrogène démarre dès le moment où les protéines recombinantes HoxH sont
ajoutées (moment indiqué par une flèche sur la figure 15). Le contenu en
protéines
a été déterminé par la méthode Bradford (Bradford. 1976. A rapid and sensitive
10 method
for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle
of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254). La production d'hydrogène
est
monitorée en continu à l'aide d'un micro-senseur à hydrogène préalablement
calibré
(Unisense, Aarhus, Danemark).
L'activité de la protéine recombinante HoxH peut donc être calculée
15
puisque la quantité de protéine recombinante HoxH ajoutée (en mg.m1-1) est
connue
tout comme la vitesse de dégagement d'hydrogène ( mol H2.min-1) pour cette
quantité spécifique de protéine recombinante ajouté. Cette activité spécifique
peut,
par exemple, être de 0.1 mol H2.min-1 .mg-1 d'enzyme.
A été mis en évidence, dans le cadre de la présente invention, le fait
20 que la
seule sous-unité catalytique HoxH contenant le site actif de la [NiFe]-
hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803 peut catalyser la
réduction des protons, acceptant les électrons d'un médiateur redox (par
exemple,
le méthyl-viologène) sans l'intervention des facteurs de maturation
HupABCDEFHoxW exogènes à E. cou.
25 La
présente invention a été décrite en relation avec des modes de
réalisations spécifiques, qui ont une valeur purement illustrative et ne
doivent pas
être considérés comme limitatifs. D'une manière générale, il apparaîtra
évident pour
l'homme du métier que la présente invention n'est pas limitée aux exemples
illustrés
et/ou décrits ci-dessus.
30
L'usage des verbes comprendre >, inclure >, comporter >, ou
toute autre variante, ainsi que leurs conjugaisons, ne peut en aucune façon
exclure
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la présence d'éléments autres que ceux mentionnés.
L'usage de l'article indéfini un , une , ou de l'article défini le ,
la ou l' , pour introduire un élément n'exclut pas la présence d'une
pluralité
de ces éléments.
