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COMPOSITION COMPRENANT DU DILTIAZEM POUR TRAITER
L'INFECTION VIRALE PAR LES VIRUS SARS-COV-2
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une nouvelle utilisation thérapeutique de
composés
thérapeutiques connus, seuls ou en combinaison avec d'autres agents actifs,
pour traiter
l'infection virale par le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère
SARS-CoV-2,
autrement désignée maladie à coronavirus 2019 (COVID-19).
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les infections respiratoires aigües (IRA) humaines représentent une des causes
principales
de consultations, d'hospitalisations et de décès dans le monde, en étant
notamment la
première cause de mortalité chez les jeunes enfants avec près de 2 millions de
décès par an.
Parmi les agents étiologiques responsables des infections respiratoires
aigües, les virus
occupent une place prépondérante. Ils sont en effet retrouvés dans la majorité
des cas de
pneumonies infantiles et sont un facteur prédisposant des pneumonies
bactériennes chez
l'adulte.
Les coronavirus sont des virus enveloppés, possédant une capside présentant
une symétrie
hélicoïdale. Ils possèdent un génome ARN simple brin, de sens positif, et sont
capables
d'infecter les cellules des oiseaux et des mammifères.
Les infections par les coronavirus peuvent provoquer des pathologies
respiratoires associées
à des symptômes similaires au rhume (provoqué notamment par les virus hCoV et
0043), aux
bronchiolites (provoquées par le virus NL63) voire à des maladies plus graves
telles que le
syndrome respiratoire aigu sévère provoqué par le SARS-CoV (Severe Acute
Respiratory
Syndrome Coronavirus) ayant généré une épidémie en 2003, et le syndrome
respiratoire du
Moyen-Orient dû au MERS-CoV, ayant généré une épidémie en 2012.
Le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2, ou SARS-CoV-2, est le
coronavirus à
l'origine de l'épidémie de coronavirus de 2019-2020, générant la forme de
pneumonie
dénommée maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Cette épidémie a été déclarée
urgence
de santé publique de portée internationale)) par l'Organisation mondiale de la
santé (OMS) le
30 janvier 2020. Le premier patient a été signalé pour la première fois dans
la ville de Wuhan
(province de Hubei, république populaire de Chine). Au 9 mars 2020, 111 321
cas avaient été
confirmés dans le monde, dont 3 892 décès dans 109 pays.
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Apparenté au virus SARS-CoV, le virus SARS-CoV-2 appartient à l'espèce Severe
acute
respiratory syndrome-related coronavirus, dans le genre Betacoronavirus et la
famille
Coronaviridae (Gorbalenya et al., 2020). La morphologie des virions est
typique de celle des
coronavirus, avec notamment le halo de protubérances protéiques ("Spike") qui
leur a donné
leur nom de "virus à couronne".
Son génome, constitué d'un ARN simple-brin de 29 903 nucléotides, a été
séquence pour la
première fois le 5 janvier 2020 par une équipe de l'université Fudan de
Shanghai (Chine). Son
génome est semblable à 79,5 `)/0 avec celui de SARS-CoV et à 96 % avec celui
de coronavirus
de chauves-souris, ce qui laisse supposer que l'origine du virus SARS-CoV-2
est zoonotique
et se trouve chez les chauves-souris (Zhou et al., 2020).
Les symptômes de l'infection par le SARS-CoV-2 ressemblent grossièrement à
ceux de la
grippe saisonnière : ils incluent la fièvre, la fatigue, une toux sèche, un
manque de souffle, des
difficultés à respirer, la pneumonie, une insuffisance rénale, et peut aller
jusqu'au décès du
patient dans les cas sévères (Hui et al., 2020).
Un calcul de la létalité basé sur les chiffres fournis par les différents pays
à l'OMS au sujet des
infections avérées et des décès permet d'estimer le taux de mortalité à
environ 2 % (données
de février 2020). Néanmoins, ce taux de létalité demeure incertain, du fait de
la difficulté à
estimer sur le terrain le nombre de cas avérés et le nombre de décès
attribuables directement
à SARS-CoV-2. Il est en effet à noter que d'après l'OMS, la plupart des
patients décédés
avaient un système immunitaire affaibli dû à d'autres problèmes de santé tels
que
l'hypertension, le diabète ou une maladie cardiovasculaire.
La période d'incubation de SARS-CoV-2 est estimée entre 2 et 14 jours, mais la
période
d'incubation serait plus longue dans certains cas, jusqu'à 24 jours.
Aucun traitement antiviral spécifique, ni vaccin n'est actuellement disponible
pour la prévention
et/ou le traitement de l'infection virale à SARS-CoV-2.
La majorité des traitements reçus actuellement par les patients infectés par
ce virus visent
essentiellement à l'atténuation des symptômes de fièvre, toux et dyspnée, afin
de favoriser
leur guérison spontanée.
Des composés antiviraux, connus pour leurs activités thérapeutiques sur
d'autres types de
virus, sont actuellement testés en essais cliniques de phase 2 et 3. Il s'agit
notamment de
composés inhibiteurs de protéases cellulaires ou virales, et d'analogues de
nucléosides. Ces
différents composés thérapeutiques sont notamment le Remdesivir, le
Galidesivir, le Lopinavir,
le Camostat mésilate et la Chloroquine.
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Remdesivir
Le Remdesivir est un composé antiviral à large spectre, agissant en tant
qu'analogue de
nucléoside, plus particulièrement analogue de l'adenosine. Disponible sous
forme de
lyophilisat, ce composé est administré par voie intraveineuse. Il est
métabolisé en sa forme
active (GS-441524) d'analogue de nucléotide : sa présence induit en erreur la
polymérase
virale et cause une réduction de la synthèse d'ARN viral.
Le Remdesivir a été développé par la société Gilead Science pour le traitement
des infections
par les virus Ebola et Marburg. Il présente également une activité antivirale
contre d'autres
virus à ARN simple brin tels que les virus Nipah, Hendra, Lassa, le virus
respiratoire syncytial
(VRS) et les coronavirus SARS et MERS, en modèles précliniques (Lo et al.,
2017).
En clinique, le Remdesivir a été étudié pour l'instant chez des volontaires
sains et chez des
patients infectés par le virus Ebola. Les traitements prescrits à quelques
patients infectés par
le SARS-CoV-2 n'ont pas fourni d'informations quant à l'inocuité et/ou
l'efficacité dans le
traitement de l'infection au SARS-CoV-2. En outre, compte tenu de l'expérience
clinique
limitée, le profil de toxicité et donc de sécurité de ce composé n'est pas
caractérisé à ce stade.
Le Remdesivir n'a pas encore reçu d'autorisation de mise sur le marché.
Dans ce contexte, Gilead a fourni le Remdesivir à la Chine pour l'évaluer dans
plusieurs essais
cliniques incluant des patients infectés par le SARS-CoV-2 (ayant ou non des
symptômes).
Gilead a annoncé le 26 février 2020 la mise en oeuvre de deux essais cliniques
de phase 3
pour tester ce composé.
Galidesivir
Le Galidesivir (BCX4430) est un analogue de nucléoside, en particulier de
l'adénosine,
développé par la société BioCryst Pharmaceuticals.
Ce composé antiviral a été initialement développé pour être utilisé contre le
virus de l'hépatite
C, puis par la suite contre les filovirus tels que le virus Ebola et le virus
Marburg. Le Galidesivir
protège contre la maladie à virus Ebola et celle à virus Marburg chez les
rongeurs et les singes,
lorsqu'il est administré jusqu'à 48 h après l'exposition au virus. Son
développement pour une
utilisation chez l'homme a été accéléré afin de combler l'absence de
traitements disponibles
pour lutter contre l'épidémie de maladie à virus Ebola en Afrique de l'Ouest.
Ce composé possède une activité antivirale à large spectre contre un ensemble
d'autres
familles de virus à ARN, comme les bunyavirus, les arénavirus, les
paramyxovirus, les
coronavirus et les flavivirus.
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Le Molnupiravir
Le Molnupiravir (également désigné par les abbréviations EIDD-2801 et MK-4482)
est un
composé antiviral qui présente l'avantage d'être sous une forme adaptée pour
une
administration par voie orale.
Ce composé est un pro-médicament qui est métabolisé après ingestion en de la
N4-
hydroxycytidine, dérivé nucléosidique qui inhibe les virus à ARN en
introduisant des erreurs
de réplication de l'ARN par l'ARN polymérase ARN-dépendante virale.
Ce composé a été testé pour son activité anti-influenza. Il présente également
une certaine
activité contre des coronavirus tels que les SARS-CoV, MERS-CoV et SARS-CoV-2,
responsables respectivement des maladies dites SRAS, MERS et COVI D-19.
(Painter et al.,
2021); (Sheahan et al., 2020).
Lopinavir
Le Lopinavir est un inhibiteur de protéase virale, utilisé comme antiviral
contre le virus de
l'immunodéficience humaine (VIN). Il est commercialisé en association avec le
Ritonavir par
les laboratoires Abbott, essentiellement sous la dénomination Kaletra.
Le Lopinavir agit en inhibant la production de protéines et enzymes
fonctionnelles par les
nouveaux virions, ce qui bloque la propagation du virus.
Chez l'Homme, le Lopinavir est rapidement dégradé dans l'organisme par le
système du
cytochrome P450. C'est la raison pour laquelle il n'est administré qu'en
association fixe avec
le Ritonavir. Ce second médicament, qui est également un inhibiteur de
protéase, a pour
fonction d'inhiber les monooxygénases du cytochrome P450, et donc de ralentir
la dégradation
du Lopinavir par ces enzymes. Ceci permet de réduire sensiblement la dose
nécessaire, et
donc le nombre de comprimés devant être absorbés par le patient.
Une étude publiée en 2004 a montré que l'association Lopinavir/Ritonavir
représentait un
"bénéfice clinique substantiel" pour des patients atteints du SARS (Chu et
al., 2004).
En ce qui concerne le traitement du SARS-CoV-2, l'hôpital Jinyintan de Wuhan,
où les
41 premiers patients confirmés de la maladie COVID-19 ont été traités, a
débuté un essai
contrôlé randomisé avec cette combinaison de médicaments anti-VIH.
Camostat mésilate
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Le mésilate de camostat ou Camostat mésilate (FOY-305) est un inhibiteur
synthétique de
protéase de faible poids moléculaire. Il est capable d'inhiber la trypsine, la
prostasine, la
matriptase et la kallikréine plasmatique. Ce composé est utilisé en thérapie
pour traiter
l'inflammation chronique du pancréas. En outre, ce composé atténue la fonction
des canaux
sodium épithéliaux des voies respiratoires, et améliore la clairance
nnucociliaire.
Les comprimés de mésilate de camostat sont approuvés au Japon et distribués
sous la marque
FOIPANO. Ils sont utilisés pour le traitement de la rémission des symptômes
aigus de la
pancréatite chronique et de l'cesophagite par reflux postopératoire.
Le brevet EP 2 435 064 propose de cibler les sérine protéases HAT et TMPRSS2
pour le
traitement des infections virales, notamment par les virus Influenza.
Récemment, il a été montré que le Camostat mésilate inhibe la serine protéase
transmembranaire 2 TMPRSS2 du SARS-CoV-2, enzyme nécessaire à la
multiplication du
virus (Hoffmann et al., 2020).
Chloroquine
La Chloroquine, initialement connue pour son activité antipaludique, possède
une action
antivirale sur le SARS-CoV selon des données obtenues in vitro (Vincent et
al., 2005).
Des études publiées récemment ont décrit une apparente efficacité du phosphate
de
Chloroquine dans le traitement du virus SARS-CoV-2. (Wang et al., 2020; Gao et
al., 2020)
Ainsi, un consensus d'experts chinois recommande désormais d'inclure le
phosphate de
Chloroquine dans le traitement des patients, à raison de 500 mg deux fois par
jour pendant
10 jours pour les patients diagnostiqués comme des cas légers, modérés et
sévères de
maladie, et sans contre-indication à la Chloroquine.
Les données cliniques sont cependant encore limitées.
De nouveaux composés antiviraux sont recherchés activement pour le traitement
et la
prévention contre ce virus émergent SARS-CoV-2.
Parmi les nouveaux composés antiviraux identifiés ces dernières années, on
citera notamment
le Diltiazem, qui est un composé actif qui agit sur la cellule hôte du virus
plutôt que directement
sur le virus, permettant ainsi d'avoir un large spectre d'action et de pouvoir
traiter différentes
infections virales.
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La demande internationale WO 87/07508 décrit l'utilisation du Diltiazem pour
le traitement
d'infections virales liées au cytomégalovirus ou à l'herpès.
La demande internationale WO 2011/066657 décrit l'utilisation du Diltiazem
pour le traitement
ou la prévention d'infections virales telles que l'herpès buccal, l'herpès
génital et le zona.
La demande internationale WO 2016/146836 décrit l'utilisation du Diltiazem
pour traiter les
infections par les virus influenza.
L'article de (Fujioka et al., 2018) enseigne que le Diltiazem, connu pour son
rôle d'agent
inhibiteur du transport des ions Ca2+, a également une action d'inhibiteur de
l'infection
cellulaire par le virus Influenza A.
La demande internationale WO 2019/224489 expose en détails certains des effets
biologiques
du Diltiazem, qui induit l'expression des gènes codant pour les interférons de
type III dans les
cellules de l'épithélium respiratoire et de l'épithélium intestinal. Le
Diltiazem a ainsi été proposé
pour diverses applications thérapeutiques, notamment pour le traitement des
infections
respiratoires virales et bactériennes dans les épithéliums respiratoires et
intestinaux.
De même que le Diltiazem, la Berbérine est un composé actif connu susceptible
de présenter
une activité antivirale.
La Berbérine est un alcaloïde de l'isoquinoléine produit par certains
végétaux, notamment par
l'espèce Berberi, qui est très utilisé dans la pharmacopée asiatique.
Des études menées in vitro et en modèle murin ont montré que la Berbérine agit
sur diverses
voies cellulaires, et posséderait des propriétés antibactérienne,
antifongique, antivirale, anti-
inflammatoire et métaboliques, améliorant l'hyperglycémie, le diabète de type
2, ainsi que les
hyperlipidémies. (Mohan et al., 2017)
La Berbérine est notamment active pour lutter contre l'hypertension artérielle
pulmonaire
(HTAP), une maladie diffuse du remodelage microvasculaire pulmonaire
accompagnée d'une
prolifération maligne de cellules musculaires lisses de l'artère pulmonaire,
qui provoque une
élévation persistante de la pression artérielle pulmonaire conduisant à
l'hypertrophie
ventriculaire droite (HVD).
La Berbérine est aussi dotée d'excellentes propriétés anti-inflammatoires, en
réduisant le
gonflement articulaire, l'infiltration des tissus et leur destruction par des
cellules
inflammatoires. La Berbérine régule la polarisation des macrophages, diminue
la fonction
phagocytaire des macrophages, réduit les taux de cytokines M1 et augmente les
niveaux de
cytokines M2 (IL-10 et facteur de croissance transformant-131 u TGF- 131).
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La Berbérine possède un large spectre antibactérien, notamment contre
l'infection par
Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM). Lorsqu'elle est
appliquée in vitro et
en association avec la méthoxyhydnocarpine, la Berbérine inhibe la croissance
de
Staphylococcus aureus.
La Berbérine présente une activité antivirale sur différents virus, notamment
:
- sur le virus de l'herpès HSV (Song et al. 2014)
- sur les virus influenza (Wu et al. 2011)
- sur le cytomégalovirus (HCMV) : de faibles concentrations (micromolaires)
de Berbérine
inhibent la réplication de différentes souches de HCMV, y compris des isolats
cliniques et des
souches résistantes aux inhibiteurs approuvés de l'ADN polymérase, en
interférant avec
l'activité transactivante de la protéine virale Immediate Early-2 (1E2)
(Luganini et al., 2019)
- sur le virus de l'Hépatite C (VHC) : la Berbérine inhiberait l'entrée du
VHC dans les cellules
(Ting-Chun Hung et al., 2019)
- sur le virus Zika (ZIKV) : la Berbérine et l'émodine se sont révélées
particulièrement efficaces
contre l'entrée et la réplication de plusieurs virus, déclenchant notamment un
effet virucide
puissant sur le ZIKV (Batista et al. 2019).
En ce qui concerne les coronavirus :
- la Berbérine pourrait présenter une action antivirale contre le SARS-CoV
(WO 2013/185126),
bien qu'aucune donnée expérimentale ne soit présentée ; et
- la Berbérine a une action antivirale contre le MERS-CoV (WO 2018/073549).
Dans le cadre de la présente invention, plusieurs composés ont été
sélectionnés et évalués
dans un test cellulaire d'infection virale ainsi que sur un modèle
d'épithélium respiratoire
humain cultivé in vitro à l'interface air/liquide. Certains de ces composés,
seuls ou en
combinaison, ont présenté un effet antiviral sur le coronavirus SARS-CoV-2, de
manière tout
à fait inattendue.
Les composés sélectionnés avaient été décrits préalablement pour d'autres
applications
thérapeutiques. De façon surprenante, il a maintenant été montré que ces
composés, seuls
ou en combinaison, ont une activité antivirale contre le SARS-CoV-2, et
permettent le
traitement et/ou la prévention de l'infection par ce coronavirus.
En particulier, les thérapies de combinaison basées sur l'association d'au
moins deux
composés antiviraux semblent particulièrement efficaces pour le traitement
et/ou la prévention
de l'infection par le coronavirus SARS-CoV-2.
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EXPOSE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un composé choisi parmi le Diltiazem, la
Berbérine et leur
combinaison, pour son utilisation thérapeutique dans le traitement de
l'infection virale par le
virus SARS-CoV-2 (dite maladie COVI D-19).
En particulier, la présente invention concerne le Diltiazem pour son
utilisation thérapeutique
dans la prévention et/ou le traitement de l'infection virale par le virus SARS-
CoV-2, dite
maladie COVID-19.
De plus, la présente invention est relative à une composition pharmaceutique
comprenant,
dans un véhicule pharmaceutique adapté, au moins un composé choisi parmi le
Diltiazem et
la Berbérine, pour son utilisation thérapeutique dans le traitement de
l'infection virale par le
virus SARS-CoV-2 (dite maladie COVI D-19).
La présente invention est aussi relative à une composition pharmaceutique
comprenant du
Diltiazem dans un véhicule pharmaceutique adapté, pour son utilisation
thérapeutique dans la
prévention et/ou le traitement de l'infection virale par le virus SARS-CoV-2.
La présente invention concerne également une composition pour son utilisation
telle que
décrite ci-dessus, comprenant au moins un autre agent actif choisi parmi :
- un analogue de nucléoside ;
- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ;
- un inhibiteur de sérine protéase transmembranaire ;
- de la Chloroquine, et
- tout mélange des composés précités.
Parmi les analogues de nucléoside, les composés préférés sont le Remdesivir,
le Galidesivir,
le Molnupiravir et leurs combinaisons.
Parmi les inhibiteurs de protéase(s) virale(s), le composé préféré est le
Lopinavir, et plus
préférentiellement le Lopinavir associé au Ritonavir.
Parmi les inhibiteurs de sérine protéase transmembranaire, le composé préféré
est le
Camostat mésilate.
La présente invention est également relative à un produit de combinaison
comprenant au
moins un composé choisi parmi le Diltiazem et la Berbérine, et au moins un
autre agent actif
choisi parmi :
- un analogue de nucléoside ;
- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ;
- un inhibiteur de sérine protéase transmembranaire ;
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- de la Chloroquine, et
- tout mélange des composés précités,
pour son utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans la prévention
et/ou le traitement
d'une infection virale par le virus SARS-CoV-2.
La présente invention est également relative à un produit de combinaison
comprenant du
Diltiazem et au moins un autre agent actif choisi parmi :
- un analogue de nucléoside ;
- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ;
- un inhibiteur de sérine protéase transnnembranaire ;
- de la Chloroquine, et
- tout mélange des composés précités,
- pour son utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans la
prévention et/ou le
traitement d'une infection virale par le virus SARS-CoV-2.
Enfin, l'invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant,
dans un
véhicule pharmaceutique adapté, une combinaison de Diltiazem avec du
Remdesivir ; ou une
combinaison de Diltiazem avec du Molnupiravir.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente les effets antiviraux de la Berbérine et du Remdesivir
en monothérapie
sur des cellules Vero E6 en culture infectées par le virus SARS-CoV-2.
Figure lA : chronogramme de l'expérience.
Figure 1B : Courbes d'effet-dose des molécules Berbérine et Remdesivir en
monothérapie et
détermination des IC50 associées à 48 et 72 heures post-infection (hpi). Le
Remdesivir et la
Berbérine présentent un effet antiviral à 48 hpi, avec une I050 déterminée à
0,98 et 17,47 pM,
respectivement. Cet effet antiviral est encore plus prononcé à 72 hpi avec des
I050 inférieures
à 0,72 et 5,60 pM pour le Remdesivir et la Berbérine, respectivement.
La Figure 2 représente les effets antiviraux des combinaisons
Diltiazem/Remdesivir,
Berberine/Remdesivir sur des cellules Vero E6 en culture infectées par le
virus SARS-CoV-2.
Figure 2A: chronogramme de l'expérience.
Figure 2B : Courbes d'effet-dose des combinaisons Diltiazem/Remdesivir et
Berberine/Remdesivir, et détermination des IC50 associées à 48 et/ou 72 heures
post-
infection (hpi). La combinaison d'un traitement par le Remdesivir en présence
d'une
concentration fixe de Diltiazem (11.5 pM), permet d'obtenir une efficacité
antivirale avec une
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IC50 de 0.32 pM, à 48hpi. De manière équivalente, la combinaison d'un
traitement par le
Diltiazem en présence d'une concentration fixe de Remdesivir (2.5 pM), permet
d'avoir une
efficacité antivirale avec une IC50 de 0.55 pM, à 48hpi. Par ailleurs, la
combinaison d'un
traitement par le Remdesivir en présence d'une concentration fixe de Berbérine
(12.5 pM),
permet d'avoir une efficacité antivirale avec une IC50 de 0.65 pM, à 48 hpi. A
un stade plus
avancé de l'infection (72hpi), la combinaison d'un traitement par le
Remdesivir en présence
d'une concentration fixe de Diltiazem (11.5 pM), permet d'obtenir une
efficacité antivirale
avec une I050 de 0.35 pM.
La Figure 3 permet d'illustrer certains des résultats présentés dans les
Figures 1B et 2B de
manière visuelle.
Figure 3A: chronogramme de l'expérience.
Figure 3B : Observation en microscopie photonique de l'effet antiviral du
Remdesivir et du
Diltiazem en monothérapie et en combinaison sur un tapis de cellules Vero E6
en culture, et
infectées par le SARS-CoV-2. Dans les mêmes conditions expérimentales que
précédemment
1.5 (Fig. 2), la combinaison Remdesivir (0.625 pM) et Diltiazem (11.5 pM)
permet de réduire de
manière très visible les effets cytopathiques de l'infection (cellules
arrondies et détachées du
tapis) en comparaison du contrôle non traité, et des traitements en
monothérapie.
Figure 4: chronogramme des expériences de l'exemple 3.
Figure 5. Chronogramme de l'expérience de l'exemple 4. Les cellules A549-ACE2
sont
ensemencées puis infectées avec une souche virale de SARS-CoV-2, avant d'être
traitées 1
h post-infection avec du Diltiazem ou du Remdesivir.
Figure 6. (A) Cellules A549-ACE2 infectées à un taux de MOI de 101; (B)
Cellules A549-ACE2
infectées à un taux de MOI de 10-2
Les cellules ont été non traitées (courbes noires) ou traitées avec du
Remdesivir 5 pM (carrés
gris) ou du Diltiazem 45 pM (triangles gris). Les résultats sont exprimés en
pourcentage de
titre viral mesuré dans le surnageant, par rapport au titre viral mesuré dans
les puits des
cellules non traitées, en fonction du temps post-infection virale.
Figure 7. (A). Mesure de l'IC50 du Diltiazem sur cellules A549-ACE2 infectées
par une souche
virale de SARS-CoV-2. Le titre viral est exprimé en pourcentage de titre viral
mesuré dans le
surnageant, par rapport au titre viral mesuré dans les puits des cellules non
traitées, en
fonction de la concentration de Diltiazem utilisée. (B). Mesure du CC50 du
Diltiazem sur
cellules A549-ACE2 après 72 heures de traitement. La viabilité des cellules
est exprimée en
pourcentage de viabilité mesurée pour les cellules non traitées. Les résultats
sont présentés
en fonction de la concentration de Diltiazem utilisée.
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DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le Diltiazem pour son utilisation thérapeutique
dans la
prévention et/ou le traitement de l'infection virale par le virus SARS-CoV-2,
dite maladie
CO VI D-19.
La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique
comprenant, dans un
véhicule pharmaceutique adapté, au moins un composé choisi parmi le Diltiazem
et la
Berbérine, pour son utilisation thérapeutique dans le traitement de
l'infection virale par le virus
SARS-CoV-2 (COVID-19).
La présente invention est aussi relative à une composition pharmaceutique
comprenant du
Diltiazem dans un véhicule pharmaceutique adapté, pour son utilisation
thérapeutique dans la
prévention et/ou le traitement de l'infection virale par le virus SARS-CoV-2.
Par infection virale par le virus SARS-CoV-2 on désigne le fait qu'un
organisme, humain
ou animal, présente des cellules ayant été infectées par le coronavirus SARS-
CoV-2,
également désigné par l'appellation COVID-19.
Au sens de l'invention, l'expression virus SARS-CoV-2 désigne d'une part
le coronavirus
identifié pour la première fois à Wuhan en Chine, et séquence début 2020 par
une équipe de
l'université Fudan de Shanghai (Zhou et al., 2020) ; et d'autre part, inclut
tous les variants
apparentés à cette première souche virale identifiée, apparus ultérieurement,
et notamment
les souches variantes SARS-CoV-2 suivantes :
i. la souche Wuhan-like utilisée par les inventeurs, décrite dans les
exemples ;
ii. la
souche hCoV-19/France/ARA-104350/2020 (GISAID ID : EPI_ISL_683350) du
lignage B.1 (cette souche possède au moins la mutation D614G dans sa protéine
spike;
elle est considérée aujourd'hui comme la souche sauvage circulante en Europe,
par
comparaison avec les variants cités ci-dessous) ;
iii. une
souche virale dite variant anglais hCoV-19/France/ARA-SC2118/2020 (ID
GISAID EPI_ISL_900512) du lignage B.1.1.7;
iv. une souche sud-africaine (501Y.V2.HVO01) du lignage B.1.3.5.1 et
v. une souche variante brésilienne du lignage B.1.1.28.
Une infection virale est généralement diagnostiquée par un professionnel de
santé, sur la base
de l'observation des symptômes du patient infecté. Des examens biologiques
complémentaires peuvent être nécessaires pour confirmer le diagnostic :
analyses de sang
et/ou des expectorations et/ou du liquide bronchoalvéolaire.
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L'infection peut notamment être établie en effectuant une détection par
biologie moléculaire
et/ou une titration virale à partir de prélèvements respiratoires, ou en
dosant les anticorps
spécifiques du SARS-CoV-2 circulants dans le sang.
La détection chez les individus infectés de ce virus spécifique est réalisée
par des méthodes
de diagnostic classiques, notamment de biologie moléculaire (PCR) qui
permettent d'établir
qu'il s'agit bien de ce virus SARS-CoV-2, bien connues de l'Homme du métier.
Le terme traitement désigne le fait de combattre l'infection par le
coronavirus SARS-CoV-
2 dans un organisme humain ou animal. Grâce à l'administration d'au moins une
composition
selon l'invention, le taux d'infection virale (titre infectieux) dans
l'organisme va diminuer, et de
préférence le virus va disparaitre complètement de l'organisme dans un délai
inférieur à celui
attendu pour une guérison sans traitement.
Le terme traitement désigne aussi le fait d'atténuer les symptômes associés
à l'infection
virale (syndrome respiratoire, défaillance rénale, fièvre, etc...).
Certaines compositions selon l'invention sont également destinées à une
utilisation dans la
prévention d'une infection par le SARS-CoV-2.
Ainsi, la présente invention concerne :
- une composition pharmaceutique comprenant du Diltiazem dans un véhicule
pharmaceutique adapté, pour son utilisation thérapeutique dans le traitement
de
l'infection virale par le virus SARS-CoV-2 ;
- une composition pharmaceutique comprenant de la Berbérine, dans un véhicule
pharmaceutique adapté, pour son utilisation thérapeutique dans le traitement
de
l'infection virale par le virus SARS-CoV-2 ; et
- une composition pharmaceutique comprenant du Diltiazem dans un véhicule
pharmaceutique adapté, pour son utilisation dans la prévention de l'infection
virale par
le virus SARS-CoV-2.
Au sens de l'invention, le terme prévention désigne le fait d'empêcher, ou
du moins de
diminuer la probabilité d'apparition, d'une infection dans un organisme humain
ou animal par
le SARS-CoV-2. Grâce à l'administration d'au moins une composition selon
l'invention, les
cellules humaines ou animales dudit organisme deviennent moins permissives à
l'infection, et
sont ainsi plus à même de ne pas être infectées par ledit coronavirus, ou de
développer des
symptômes moins sévères lors de l'infection par ledit coronavirus.
Les compositions selon l'invention peuvent être de type pharmaceutique,
destinées à être
administrées à un être humain, ou de type vétérinaire, destinées à être
administrés à des
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animaux non humains. Concernant les animaux, il est entendu que les
compositions
vétérinaires pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement
d'une infection par le
coronavirus SARS-CoV-2 sont destinées à être administrées à des animaux
infectés par ce
coronavirus.
Selon l'invention, le terme véhicule pharmaceutique adapté désigne des
véhicules ou des
excipients pharmaceutiques, qui sont des composés ne présentant pas d'action
propre sur
l'infection ici considérée. Ces véhicules ou excipients sont
pharmaceutiquement acceptables,
ce qui signifie qu'ils peuvent être administrés à un individu ou à un animal
sans génération
d'effets délétères significatifs.
L'expression au moins un composé choisi parmi le Diltiazem et la Berbérine
signifie que la
composition pharmaceutique comprend soit du Diltiazem, soit de la Berbérine,
soit une
combinaison des deux.
Selon un premier aspect, la composition pharmaceutique pour son usage selon
l'invention
comprend au moins une quantité efficace de Diltiazem. Cette composition
pharmaceutique est
destinée à un usage thérapeutique et/ou préventif contre l'infection par le
virus SARS-CoV-2.
Selon un second aspect, la composition pharmaceutique pour son usage selon
l'invention
comprend au moins une quantité efficace de Berbérine.
Selon un troisième aspect, la composition pharmaceutique pour son usage selon
l'invention
comprend au moins une quantité efficace de Diltiazem et une quantité efficace
de Berbérine.
Par quantité efficace , on entend au sens de l'invention une quantité de
composé actif
suffisante pour inhiber la prolifération et/ou la réplication du coronavirus,
et/ou le
développement de l'infection virale au sein de l'organisme. Cette inhibition
peut être quantifiée,
par exemple en mesurant le titre viral, comme cela est présenté dans les
exemples de la
présente demande.
Ainsi, selon un aspect particulier de l'invention, la composition
pharmaceutique pour son
utilisation telle que décrite ci-dessus comprend une combinaison de Diltiazem
et Berbérine.
Par combinaison , on entend au sens de l'invention une composition
comprenant au moins
deux composés actifs distincts, les deux composés ayant une action antivirale.
Cette combinaison comprend soit la même quantité en poids de chaque composé
antiviral,
c'est-à-dire une combinaison de 50% de Diltiazem et 50% de Berbérine en poids,
soit des
doses non égales de chaque composé, telles que 90 % de Diltiazem et 10 % de
Berbérine,
80 % de Diltiazem et 20 % de de Berbérine, 70 % de Diltiazem et 301% de
Berbérine, 60 % de
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Diltiazem et 40 % de Berbérine, 40 % de Diltiazem et 60 'Vo de Berbérine, 30 %
de Diltiazem
et 70 A de Berbérine, 20 % de Diltiazem et 80 % de Berbérine, ou bien encore
10 % de
Diltiazem et 90 % de Berbérine, les pourcentages étant exprimés en poids du
composé par
rapport au poids total de la combinaison.
Diltiazem
Le Diltiazem est une molécule membre de la famille des benzothiazépines,
référencée sous
le numéro CAS 42399-41-7.
Au sens de la présente invention, est désignée par Diltiazem la molécule
sous la forme de
l'un de ses énantiomères L-cis ou D-cis, ou d'un mélange racémique des deux,
ou encore un
sel de Diltiazem comme par exemple l'hydrochloride de Diltiazem, dont la
formule chimique
développée est représentée ci-dessous, en formule (I) :
H k.HC1
=
O
s
.e.$)
zs:44:3
Formule I
Le Diltiazem est connu depuis plus de 30 ans et est approuvé, en Europe et aux
Etats-Unis,
par les autorités règlementaires du médicament. Il peut être administré sous
forme
d'hydrochloride de Diltiazem. Cardizem0, Cartia0, Taztia0 et Dilacor0 sont ses
dénominations commerciales les plus courantes.
De nombreuses formulations sont disponibles, en particulier des formulations à
libération
prolongée. Le Diltiazem est disponible sous différentes formes galéniques,
telles que sous
forme de crème pour application topique, sous forme de comprimés ou capsules
pour
administration orale, sous forme de poudre pour préparation de solution
injectable ou sous
forme de préparations pharmaceutiques pour inhalation (VVO 02/094238, US
4,605,552).
La posologie classique chez l'Homme est de 180 à 360 mg/jours, administrés en
capsule ou
comprimés, pour son utilisation thérapeutique en tant qu'inhibiteur des canaux
calciques.
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La propriété physiologique identifiée en premier lieu de ce composé est
l'inhibition des canaux
calciques, et donc l'inhibition des flux de calcium intracellulaires. Le
Diltiazem freine
notamment l'entrée du calcium transmembranaire au niveau de la fibre
musculaire
myocardique et de la fibre musculaire lisse des vaisseaux. Ceci permet de
diminuer la
concentration intracellulaire calcique atteignant les protéines contractiles.
Chez l'homme, l'administration de Diltiazem est indiquée pour son action
vasodilatatrice, dans
le but de réduire le travail cardiaque. Il est ainsi utilisé dans la prise en
charge des désordres
cardiaques et circulatoires tels que les angines de poitrine, l'hypertension
artérielle, les
ischémies myocardiques et la tachycardie.
Le Diltiazem agit également en renversant les effets de l'angiotensine II, du
point de vue rénal
et périphérique. En application topique, le Diltiazem peut être indiqué en cas
de fissures anales
chroniques.
Le brevet EP 1 117 408 décrit l'utilisation de Diltiazem, en tant que composé
inhibiteur des
canaux calciques, pour traiter des pathologies liées à la dégénérescence des
photorécepteurs
de la rétine.
En ce qui concerne l'utilisation du Diltiazem pour le traitement des
infections virales, comme
précédemment évoqué, celle-ci a déjà été décrite dans plusieurs demandes de
brevet. De
plus, un essai clinique est en cours à ce jour (FLUNEXT PHRC #15-0442
ClinicalTrials.gov
Identifier: NCT03212716), dans le but d'obtenir l'autorisation de mise sur le
marché pour cette
nouvelle indication thérapeutique antivirale.
Berbérine
La Berbérine est un alcaloïde naturel que l'on retrouve dans un grand nombre
de végétaux,
en particulier dans l'espèce Berbéri. Son numéro CAS est 633-66-9.
Au sens de la présente invention, est désignée par Berbérine la molécule
sous toutes ses
formes. Sa structure chimique développée est schématisée ci-dessous :
0
6F-f3 0,
Formule II
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Cette molécule est largement utilisée dans la pharmacopée asiatique, pour ses
propriétés
antifongiques, antibactériennes et anti-inflammatoires.
Dans les cellules, la Berbérine se localise notamment dans les mitochondries
où elle inhibe le
complexe I de la chaîne respiratoire, diminuant ainsi la production d'ATP et
l'activation
subséquente de l'AMPK (Adenosine Monophosphate activated Protein Kinase).
Cette enzyme
ubiquitaire joue un rôle dans l'homéostasie énergétique cellulaire.
L'activation de l'AMPK a
principalement pour effet de (i) stimuler l'oxydation des acides gras
hépatiques et la
cétogenèse, (ii) inhiber la synthèse du cholestérol, la lipogenèse et la
synthèse des
triglycérides, (iii) stimuler l'oxydation des acides gras dans les muscles
squelettiques et
l'absorption du glucose par les muscles et (iv) moduler la sécrétion
d'insuline par les cellules
bêta du pancréas.
La biodisponibilité de la Berbérine est faible, mais cela ne présente pas de
difficultés car
l'action systémique de la Berbérine passe pour une part importante via soit la
modification du
microbiote intestinal et de ses métabolites, soit après métabolisation de la
Berbérine par ce
même microbiote.
La demi-vie de la Berbérine est également faible, de l'ordre de 4 heures. Cela
implique que
les doses quotidiennes doivent être idéalement réparties en 3 prises. Pour un
adulte la dose
quotidienne va généralement de 500 mg à 1500 mg.
Combinaison avec un autre agent actif
Il est entendu que la composition pour son utilisation selon l'invention
comprend au moins un
composé choisi parmi le Diltiazem et la Berbérine, et qu'elle peut donc
également comprendre
d'autres composés actifs, en sus du véhicule pharmaceutique adapté.
En effet, le Diltiazem et la Berbérine ou leur mélange, peuvent être employés
en thérapie
seuls, ou en combinaison avec au moins un autre agent actif.
Il peut s'agir de composés permettant d'améliorer l'activité antivirale du
Diltiazem et/ou de la
Berbérine, ou inversement le Diltiazem et la Berbérine peuvent agir en tant
qu'agents
potentialisateurs de ces autres composés actifs.
Ainsi, la présente invention concerne le Diltiazem ou la Berbérine ou leur
combinaison, pour
leur utilisation dans la potentialisation des effets antiviraux d'autres
composés thérapeutiques
utilisés pour traiter et/ou prévenir l'infection virale par le SAS-CoV-2, en
particulier ceux cités
dans la présente demande.
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Ces composés actifs supplémentaires pourront être choisis parmi les classes
pharmaceutiques d'agents cités dans la demande VVO 2015/157223, à savoir parmi
les agents
antibactériens, les agents antiparasitaires, les inhibiteurs de la
neurotransmission, les
inhibiteurs du récepteur aux oestrogènes, les inhibiteurs de synthèse et
réplication de l'ADN,
les inhibiteurs de la maturation des protéines, les inhibiteurs des voies
kinase, les inhibiteurs
du cytosquelette, les inhibiteurs du métabolisme des lipides, les agents anti-
inflammatoires,
les inhibiteurs des canaux ioniques, les inhibiteurs d'apoptose et les
inhibiteurs de cathepsine.
Ainsi, selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, la composition
pharmaceutique pour
son utilisation telle que décrite ci-dessus comprend au moins un autre agent
actif, notamment
un agent antiviral.
Au sens de la présente invention, on entend par les termes agent antiviral
ou composé
antiviral des agents actifs qui agissent sur la charge virale (aussi dénommé
titre infectieux),
en inhibant soit de manière directe soit de manière indirecte la réplication
et/ou la
dissémination d'un virus et notamment, dans le cas présent, du coronavirus
SARS-CoV-2, au
sein d'un organisme infecté.
Selon un aspect particulier de l'invention, la composition pharmaceutique pour
son utilisation
dans la prévention et/ou le traitement d'une infection par le coronavirus SARS-
CoV-2,
comprend, outre du Diltiazem et/ou de la Berbérine, au moins un autre agent
antiviral.
Il est entendu que cet autre agent antiviral sera utilisé aux doses
nécessaires pour présenter
une action antivirale, cette dose étant désignée comme étant efficace , ce
dosage pouvant
être facilement déterminé par l'homme du métier.
Cette combinaison comprend soit la même quantité en poids de chaque composé
antiviral,
c'est-à-dire une combinaison de 50% de Diltiazem et/ou Berbérine et 50% d'un
autre agent
antiviral en poids, soit des doses non égales de chaque composé, telles que 90
% de Diltiazem
et/ou Berbérine - 10 A de l'autre agent antiviral, 80 % - 20 %, 70 A - 30 %,
60 % - 40 %, 40 %
- 60 'Vo, 30 `)/0 - 70 `Vo, 20 % - 80 A, ou bien encore 10 `)/0 de Diltiazem
et/ou Berbérine et 90 `)/0
d'un autre agent antiviral, les pourcentages étant exprimés en poids du
composé par rapport
au poids total de la combinaison.
Par activité antivirale ou action antivirale , on entend soit :
- une action directe sur le virus, notamment l'action d'inhiber le cycle de
réplication du virus ou
sa capacité à infecter et à se reproduire dans des cellules hôtes,
- une action indirecte sur les cellules cibles dudit virus, par la modulation
de l'expression de
certains gènes des cellules cibles. On entend par 'cellules cibles' des
cellules infectées par le
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coronavirus et/ou susceptibles d'être infectées prochainement, de par leur
proximité
immédiate avec des cellules infectées.
Les agents antiviraux sont classifiés en différentes catégories en fonction de
leur mode
d'action. On peut citer notamment :
- les analogues de nucléotides ou de ribonucléosides, qui interfèrent avec ou
stoppent la
synthèse d'ADN ou d'ARN ;
- les inhibiteurs des enzymes impliquées dans la synthèse d'ADN ou d'ARN
(hélicase,
réplicase) ;
- les inhibiteurs de protéase(s) virale(s) ;
- les composés qui inhibent les étapes de maturation du virus au cours de son
cycle de
réplication ;
- les composés qui interfèrent avec la liaison à la membrane cellulaire, ou
à l'entrée des virus
dans des cellules hôtes (Inhibiteurs de fusion ou d'entrée) tels que les
inhibiteurs de sérine
protéase transmembranaire, notamment celles de type 2;
- les agents qui empêchent le virus de s'exprimer au sein de la cellule hôte
après son entrée,
en bloquant son désassemblage au sein de la cellule ;
- les agents qui restreignent la propagation des virus vers d'autres
cellules.
Parmi ces agents antiviraux bien connus de l'Homme du métier, sont en
particulier utilisés
pour lutter contre des virus à ARN : les analogues de nucléoside, les
inhibiteurs de protéase(s)
virale(s), les inhibiteurs d'hélicase, et les inhibiteurs d'entrée cellulaire
du virus dans les
cellules cibles tels que les inhibiteurs de sérine protéase transmembranaire.
Au sens de l'invention, un analogue de nucléoside désigne un composé
utilisé pour
prévenir la réplication virale dans les cellules infectées, comme par exemple
l'aciclovir. Ces
composés ont des structures suffisamment semblables aux nucléosides pour être
intégrés
dans les brins d'ADN viraux en cours de réplication, mais ils agissent comme
agents terminaux
de chaîne et arrêtent l'action de l'ADN polymérase virale.
Un tel composé sera choisi parmi un analogue nucléosidique de la guanosine
(par exemple la
Ribavirine), de l'adénosine (par exemple le Remdesivir ou le Galidesivir), de
la cytidine
(Molnupiravir) ou de la thymidine, ou encore de leurs versions desoxy-.
Au sens de l'invention, un inhibiteur de protéase(s) virale(s) désigne un
composé antiviral
agissant en inhibant l'action d'au moins une protéase virale, protéine qui
permet le clivage et
l'assemblage des protéines virales, processus indispensable à l'obtention de
nouveaux virions
infectieux. Les virions obtenus sont alors incapables d'infecter de nouvelles
cellules. Cette
stratégie thérapeutique est utilisée notamment pour traiter les infections
virales par le VIH
(Virus de l'immunodéficience humaine).
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Au sens de l'invention, un inhibiteur de sérine protéase transmembranaire
désigne un
composé antiviral agissant en inhibant l'entrée du virus dans la cellule,
notamment par son
action au niveau de la sérine protéase transmembranaire 2 désignée par
l'abréviation
TMPRSS2.
Selon une mise en uvre particulière de l'invention, la composition pour son
utilisation telle
que décrite ci-dessus comprend au moins un autre agent actif choisi parmi :
- un analogue de nucléoside ;
- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ;
- un inhibiteur de sérine protéase transmembranaire ;
- de la Chloroquine, et
- tout mélange des composés précités.
Selon une première mise en oeuvre de l'invention, la combinaison comprend du
Diltiazem et
au moins un analogue de nucléoside.
Selon une deuxième mise en oeuvre de l'invention, la combinaison comprend du
Diltiazem et
au moins un inhibiteur de protéase(s) virale(s).
Selon une troisième mise en uvre de l'invention, la combinaison comprend du
Diltiazem et
au moins un inhibiteur de sérine protéine transmembranaire, notamment celle de
type 2.
Selon une quatrième mise en oeuvre de l'invention, la combinaison comprend du
Diltiazem et
de la Chloroquine.
Selon une cinquième mise en oeuvre de l'invention, la combinaison comprend du
Diltiazem et
un mélange d'au moins deux composés choisis parmi :
- un analogue de nucléoside ;
- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ;
- un inhibiteur de sérine protéine transmembranaire, et
- de la Chloroquine.
Selon une sixième mise en uvre de l'invention, la combinaison comprend de la
Berbérine et
au moins un analogue de nucléoside.
Selon une septième mise en uvre de l'invention, la combinaison comprend de la
Berbérine
et au moins un inhibiteur de protéase(s) virale(s).
Selon une huitième mise en uvre de l'invention, la combinaison comprend de la
Berbérine
et au moins un inhibiteur de sérine protéine transmembranaire, notamment celle
de type 2.
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Selon une neuvième mise en oeuvre de l'invention, la combinaison comprend de
la Berbérine
et de la Chloroquine.
Selon une dixième mise en oeuvre de l'invention, la combinaison comprend de la
Berbérine et
un mélange d'au moins deux composés choisis parmi :
- un analogue de nucléoside ;
- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ;
- un inhibiteur de sérine protéine transmembranaire, et
- de la Chloroquine.
Le au moins un analogue de nucléoside pourra notamment être choisi parmi le
groupe
constitué de: le Remdesivir, le Galidesivir, le Molnupiravir et leurs
combinaisons.
Le au moins un inhibiteur de protéase(s) virale(s) pourra être en particulier
le Lopinavir, et de
préférence le Lopinavir associé au Rinotavir.
Le au moins un inhibiteur de sérine protéine transmembranaire, notamment celle
de type 2,
pourra en particulier être le Camostat mésilate.
Selon d'autres mises en oeuvre, la composition pharmaceutique pour son
utilisation selon
l'invention comprend ou consiste en :
- du Diltiazem et du Remdesivir;
- du Diltiazem et du Galidesvir;
- du Diltiazem et du Molnupiravir;
- du Diltiazem et du Lopinavir, de préférence associé au Rinotavir ;
- du Diltiazem et du Camostat mésilate ;
- du Diltiazem et de la Chloroquine, ou bien encore
- du Diltiazem et toutes les combinaisons possibles de Remdesivir,
Galidesvir, Molnupiravir,
Lopinavir, Camostat mésilate et Chloroquine.
Selon d'autres mises en oeuvre, la composition pharmaceutique pour son
utilisation selon
l'invention comprend ou consiste en:
- de la Berbérine et du Remdesivir;
- de la Berbérine et du Galidesvir;
- de la Berbérine et du Molnupiravir;
- de la Berbérine et du Lopinavir, de préférence associé au Rinotavir ;
- de la Berbérine et du Camostat mésilate;
- de la Berbérine et de la Chloroquine, ou bien encore
- de la Berbérine et toutes les combinaisons possibles de Remdesivir,
Galidesvir, Molnupiravir,
Lopinavir, Camostat mésilate et Chloroquine.
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Selon d'autres mises en oeuvre, la composition pharmaceutique pour son
utilisation selon
l'invention comprend ou consiste en :
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Remdesivir;
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Galidesvir ;
- une combinaison de Diltiazem et de Molnupiravir ;
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Lopinavir, de préférence
associé au
Rinotavir ;
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Camostat mésilate ;
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et de la Chloroquine, ou bien
encore
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et toutes les combinaisons
possibles de
Remdesivir, Galidesvir, Molnupiravir, Lopinavir, Camostat mésilate et
Chloroquine.
Ces combinaisons présentent des effets antiviraux synergiques, comme cela est
présenté
dans les exemples.
Par exemple, les résultats présentés dans le tableau 2 permettent de mettre en
évidence le
fait que, à 48 heures post-infection, les effets du Remdesivir sont plus
importants (+68 %) en
présence de Diltiazem, ainsi qu'en présence de Berbérine (+33 M.
Les résultats présentés dans le tableau 3 mettent en évidence que, sur des
modèles
d'épithélium nasal, 48 heures post-infection, les effets du Remdesivir sont
potentialisés par la
présence de Diltiazem (+ 1.3 log de réduction de production virale) ou de
Berbérine (+ 0.89 log
de réduction de production virale).
Selon une autre mise en oeuvre de l'invention, la composition pour son
utilisation thérapeutique
telle que décrite ci-dessus comprend de plus au moins un antibiotique.
Un tel antibiotique sera notamment utile pour prévenir la surinfection
bactérienne à l'infection
virale en cours.
L'antibiotique est choisi parmi les antibiotiques bien connus de l'Homme du
métier, notamment
ceux utilisés lors des infections virales pour éviter la surinfection
bactérienne, et notamment
ceux de la famille des macrolides.
Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention sont adaptées
pour une
administration nasale, orale, sublinguale, par inhalation, sous-cutanée,
intramusculaire,
intraveineuse, transdermique, oculaire ou rectale.
Selon une mise en uvre préférée, la composition pour son utilisation telle
que décrite ci-
dessus est caractérisée en ce qu'elle est sous une forme galénique adaptée
pour une
administration nasale, notamment intranasale, en particulier par inhalation.
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La voie intranasale est une voie d'administration caractérisée en ce que la
composition
pharmaceutique est introduite directement dans la cavité nasale du patient,
par différents
procédés, par exemple : gouttes, spray, ou inhalateur. L'utilisation d'un
dispositif spécifique,
tel qu'un dispositif de pulvérisation muqueux intranasal, est recommandée.
La voie intranasale offre la possibilité d'administrer un médicament de façon
rapide, indolore
et non-invasive avec une efficacité souvent comparable à celle de la voie
intraveineuse. Elle
est particulièrement adaptée en pédiatrie ou pour les personnes âgées, ou dans
les situations
de médecine d'urgence.
Selon une mise en oeuvre, la composition pharmaceutique pour son utilisation
telle que décrite
ci-dessus est administrée par voie intranasale.
Selon une autre mise en oeuvre préférée, la composition pharmaceutique pour
son utilisation
telle que décrite ci-dessus est administrée par inhalation.
L'inhalation désigne l'absorption par les voies respiratoires. C'est en
particulier une méthode
d'absorption de composés à des fins thérapeutiques, de certaines substances
sous forme de
gaz, de micro-gouttelettes ou de poudre en suspension.
L'administration de compositions pharmaceutiques ou vétérinaires par
inhalation, c'est-à-dire
par les voies nasale et/ou buccale, est bien connue de l'Homme du métier.
On distingue deux types d'administration par inhalation :
- l'administration par insufflation lorsque les compositions sont sous la
forme de poudres, et
- l'administration par nébulisation lorsque les compositions sont sous la
forme d'aérosols
(suspensions) ou sous la forme de solutions, par exemple de solutions
aqueuses, mises sous
pression. L'utilisation d'un nébuliseur ou d'un pulvérisateur sera alors
recommandée pour
administrer la composition pharmaceutique ou vétérinaire.
La forme galénique considérée ici est donc choisie parmi : une poudre, une
suspension
aqueuse de gouttelettes ou une solution sous pression.
La présente invention concerne aussi un produit de combinaison comprenant au
moins un
composé choisi parmi le Diltiazem et la Berbérine, et au moins un autre agent
actif choisi
parmi :
- un analogue de nucléoside ;
- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ;
- un inhibiteur de sérine protéase transmembranaire ;
- de la Chloroquine, et
- tout mélange des composés précités,
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pour son utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans la prévention
et/ou le traitement
d'une infection virale par le virus SARS-CoV-2 (COVID-19).
Ce produit de combinaison sera en particulier composé de:
- du Diltiazem et du Remdesivir;
- du Diltiazem et du Galidesvir;
- du Diltiazem et du Molnupiravir ;
- du Diltiazem et du Lopinavir;
- du Diltiazem et du Camostat mésilate ;
- du Diltiazem et de la Chloroquine, ou bien encore
- du Diltiazem et toutes les combinaisons possibles de Remdesivir, Galidesvir,
Molnupiravir,
Lopinavir, Camostat mésilate et Chloroquine.
Selon d'autres mises en uvre, ce produit de combinaison sera en particulier
composé de :
- de la Berbérine et du Remdesivir;
- de la Berbérine et du Galidesvir;
- de la Berbérine et du Molnupiravir ;
- de la Berbérine et du Lopinavir;
- de la Berbérine et du Camostat mésilate;
- de la Berbérine et de la Chloroquine, ou bien encore
- de la Berbérine et toutes les combinaisons possibles de Remdesivir,
Galidesvir,
Monulpriravir, Lopinavir et Chloroquine.
Selon d'autres mises en oeuvre, ce produit de combinaison sera en particulier
composé de :
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Remdesivir;
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Galidesvir;
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Molnupiravir ;
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Lopinavir;
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Camostat mésilate;
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et de la Chloroquine, ou bien
encore
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et toutes les combinaisons
possibles de
Remdesivir, Galidesvir, Molnupiravir, Lopinavir, Camostat mésilate et
Chloroquine.
Selon une mise en uvre selon l'invention, l'un de ces produits de combinaison
tels que
décrits ci-dessus est utilisé de façon simultanée, séparée ou séquentielle,
pour la prévention
d'une infection virale par le virus SARS-CoV-2 (COVID-19).
Selon une autre mise en oeuvre selon l'invention, l'un de ces produits de
combinaison tels que
décrits ci-dessus est utilisé de façon simultanée, séparée ou séquentielle,
pour le traitement
d'une infection virale par le virus SARS-CoV-2 (COVID-19).
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Ce produit de combinaison pourra comprendre d'autres composés actifs, et en
particulier au
moins un antibiotique.
La présente invention concerne également une méthode pour traiter un patient
infecté par un
virus SARS-CoV-2 (atteint de la maladie dite COVID-19) comprenant
l'administration audit
patient d'une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule
pharmaceutique
adapté, au moins un composé choisi parmi le Diltiazem et la Berbérine.
La présente invention concerne également une méthode pour prévenir
l'apparition d'une
infection virale par un virus SARS-CoV-2 (dite maladie COVID-19), chez un
individu
susceptible d'être infecté par ledit virus, comprenant l'administration audit
individu d'une
composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutique adapté,
du
Diltiazem.
La présente invention concerne également une méthode pour traiter un patient
infecté par un
virus SARS-CoV-2 (atteint de la maladie dite COVID-19), comprenant
l'administration audit
patient d'une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule
pharmaceutique
adapté, du Diltiazem.
En particulier, cette méthode pourra comprendre également l'administration
audit patient d'un
autre composé actif, notamment choisi parmi les composés suivants :
- un analogue de nucléoside ;
- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ;
- un inhibiteur de sérine protéase transmembranaire ;
- de la Chloroquine, et
- tout mélange des composés précités.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique
comprenant,
dans un véhicule pharmaceutique adapté, une combinaison de Diltiazem et/ou de
Berbérine,
avec du Remdesivir.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique
comprenant,
dans un véhicule pharmaceutique adapté, une combinaison de Diltiazem avec du
Remdesivir.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique
comprenant,
dans un véhicule pharmaceutique adapté, une combinaison de Diltiazem avec du
Molnupiravir.
Plus précisément, ladite composition pharmaceutique comprend, dans un véhicule
pharmaceutique adapté, une combinaison de Diltiazem, de Berbérine, et de
Remdesivir.
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La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques
comprenant,
dans un véhicule pharmaceutique adapté, les combinaisons suivantes :
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Galidesvir ;
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Lopinavir ;
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Molnupiravir ;
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Camostat mésilate ;
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et de la Chloroquine, ou bien
encore
- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et toutes les combinaisons
possibles de
Remdesivir, Galidesvir, Molnupiravir, Lopinavir, Camostat mésilate et
Chloroquine.
Ces combinaisons pourront être formulées selon tous les ratios possibles de
chaque composé.
En particulier, elles comprendront soit la même quantité en poids de chaque
composé antiviral
(33 A de chaque), soit des doses non égales de chaque composé, les
pourcentages étant
exprimés en poids du composé par rapport au poids total de la combinaison.
Toutes les utilisations thérapeutiques de ces combinaisons sont également
objets de
l'invention.
EXEMPLES
Les exemples 1 à 3 démontrent d'une part l'efficacité d'un traitement au
Diltiazem ou à la
Berberine en monothérapie, et d'autre part l'intérêt d'utiliser ces molécules
en combinaison
avec le Remdesivir pour le traitement des infections à SARS-CoV-2.
D'autres données, non présentées ici, ont été obtenues en utilisant
l'apigénine, un autre
composé présentant une action antivirale sur certaines souches virales,
notamment contre le
MERS-CoV (VVO 2018/073549). Toutefois, cette molécule n'a pas présenté
d'action antivirale
significative contre le coronavi rus SARS-CoV-2.
La charge virale a été quantifiée en RT-qPCR et/ou en TC' D50/m1 dans les
prélèvements de
surnageants d'infection de cellules Vero E6 mais aussi dans des lavages
apicaux et lysats
cellulaires d'épithélium humain reconstitué (HAE MucilAir, Epithelix),
traitées avec du
Diltiazem, de la Berberine, ou du Remdesivir en monothérapie ou en
combinaisons de deux
de ces molécules (Diltiazem-'-Remdesivir, ou Berberine+Remdesivir).
La production virale relative à chacune des concentrations de molécules a été
déterminée et
est représentée par rapport à la production virale issue des cellules ou HAE
infecté(e)s dans
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les mêmes conditions mais non traité(e)s. Les concentrations médianes
inhibitrices (I050) ont
été déterminées pour chaque condition de traitement.
Exemple 1. Matériels et méthodes
Virus utilisé
Le virus utilisé a été isolé à partir d'un échantillon de patient infecté par
le SARS-CoV-2.
La souche du SARS-CoV-2 utilisée dans cette étude a été isolée chez une
patiente de 47 ans,
recrutée dans une cohorte clinique française évaluant les patients atteints de
COVID-19
(NCT04262921). Cette étude a été menée conformément à la déclaration
d'Helsinki et a reçu
l'approbation de la commission d'éthique locale. La souche virale a été
séquencée avec
Illumina MiSeq et déposée dans la base de données GISAID EpiCoVTM sous la
référence
BetaCoV/France/IDF0571/2020 (numéro d'identification EPI_ISL_411218). Pour
référence
voir (Pizzorno et al., 2020).
L'isolement du virus a été réalisé par inoculation de cellules Vero E6 (ATCC
CRL-1586) et
suivi d'apparition d'effets cytopathiques. Après apparition des premiers
effets induits par le
virus, le surnageant d'infection a été récolté et les ARN viraux en ont été
extraits à l'aide du kit
QIAmp Viral RNA (QIAGEN). Les ARN extraits ont ensuite fait l'objet d'un
séquençage Illumina
MiSeq (Zymo-Seq RiboFree), avec une couverture de 500x, et les séquences ont
été
assemblées à l'aide des programmes d'alignement hisat2 et consensus.
La séquence a été ensuite déposée sur la plateforme GISAID EpiCoV (Accession
ID
EPI_ISL_411218) sous le nom BetaCoV/France/IDF0571/2020.
Cette souche virale est phylogénétiquement très proche des souches de SARS-CoV-
2 qui ont
circulé au début de l'épidémie dans la région de Wuhan en Chine au mois de
Janvier/Février 2020. Cette souche est donc représentative des souches de SARS-
CoV-2 à
l'origine des maladies infectieuses dites COVI D-19 actuellement observées
aujourd'hui
dans le monde.
Protocole d'infection en cellules Vero E6
Les cellules Vero E6 (ATCC CRL-1586) ont été cultivées en milieu DMEM 4.5 g/I
de Glucose,
supplémenté en L-Glutamine et Pénicilline/streptomycine et 10 % de sérum de
veau foetal
inactivé, à 37 C 5 % CO2.
Pour réaliser les infections, les cellules ont été rincées deux fois par du
milieu sans sérum et
ont été recouvertes par un volume minimum contenant une dilution de virus,
cette dilution étant
déterminée à partir du titre infectieux (cf chapitre détermination du titre
infectieux), afin
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d'obtenir une multiplicité d'infection (MOI) adéquate. Après une incubation
d'une heure en
présence d'un volume minimum, le milieu a été remplacé par du milieu DMEM 4.5
g/I de
Glucose, supplémenté en L-Glutamine et Pénicilline/streptomycine et 2 A de
sérum de veau
foetal inactivé, et les cellules ont été incubées à nouveau à 37 C 5 % CO2.
Protocole d'infection en épithélium
Pour réaliser des infections nous avons également utilisé un modèle
d'épithélium humain
reconstitué (HAE MucilAir, Epithelix), obtenu à partir de cellules primaires
humaines obtenues
par biopsies nasales, cultivées à l'interface air-liquide avec un milieu de
culture spécifique
dans des inserts Costar Transwell (Corning, NY, USA. Pour les expériences
d'infection, les
pôles apicaux ont été doucement lavés à deux reprises avec du milieu OptiMEM
(Gibco,
ThermoFisher Scientific), puis infectés avec 150 pl de dilution de virus en
milieu OptiMEM, à
une multiplicité d'infection (MOI) de 0.1. Après une heure d'incubation à 37 C
5% CO2, la
suspension virale a été retirée.
Détermination du titre infectieux en cellules Vero E6
La détermination du titre infectieux a été réalisée par une technique de
dilution limite, sur ces
cellules Vero E6 en plaque 96 puits. Un volume de 50 pl de dilutions en série
est déposé dans
des puits en quadruplicats. Les cellules sont ensuite incubées à 37 C 5 % CO2
et la présence
d'effets cytopathiques est ensuite suivie après 3 jours d'infection. La dose
infectieuse en
culture de tissu 50 % (DICT50/ ml), c'est-à-dire le titre viral requis pour
causer une infection
chez 50 % des cellules inoculées, a été calculée en utilisant la technique de
Reed et Muench.
Quantification du génome viral par PCR quantitative
Les sondes et amorces utilisées ont été décrites par la School of Public
Health/University of
Hong Kong (tableau 1).
Une PCR quantitative one-step> a été réalisée à l'aide du kit StepOnePlus
Real Time PCR
System (Applied Biosystems), avec le réactif EXPRESS One-Step Superscript qRT-
PCR
(Invitrogen), dans un volume réactionnel de 20 pl contenant 10 pl de supermix
Express qPCR
(2x), 1 pl de chaque amorce (10 pM), 3.1 pl d'eau, 0.4 pl de Rox dye (25 pM)
et 2 pl d'ARN
viral.
Le programme suivant a été utilisé : 15min à 50 C, suivi de 40 cycles (15s 95
C ; 1 min 60 C).
Tableau 1
Cible: ORF1b-iisp14
SEQ ID NO.
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PCT/FR2021/050406
Oligonucléotide sens (HKU-
ORF1b-nspl4F) 5'-TGGGGYTTTACRGGTAACCT-3'
Oligonucléotide antisens 2
(1--IKU- ORF1b-nspl4R) 5'--AACROGCTTAACAAAGCACTC-3'
3
Sonde (HKU-ORF1b- TAGITGTGATGONATCATGACTAG-
nsp141P) TAMRA-3'
FAM et TAMRA désignent des marqueurs fluorescents.
Exemple 2. Comparaison des IC50 du Diltiazem, de la Berberine, du Remdesivir,
et des
combinaisons Diltiazem+Remdesivir et Berberine+Remdesivir sur le virus SARS-
CoV-2
en modèle cellulaire Vero E6.
Des cellules Vero E6 infectées par le SARS-CoV-2 (M010,1) ont été traitées à
une heure post-
infection par des concentrations croissantes :
- de Diltiazem (2.8 à 45 pM),
- de Berberine (1.6 à 25 pM) et
- de Remdesivir (0.6 à 10 pM)
seules (Fig1) et en combinaison (Fig 2).
Pour chacun des traitements combinés testés, une dose d'une des molécules a
été fixée et
associée avec des concentrations croissantes de l'autre molécule (mêmes gammes
de
concentration que celles utilisées en monothérapie, respectivement) et
inversement. Les titres
infectieux viraux mesurés dans les surnageants de culture des cellules
infectées (prélevés à
48 et 72 heures post-infection) reflètent le niveau de réplication virale dans
les différentes
conditions de traitement.
Le tableau 2 ci-dessous résume les données d'IC50 pour différents traitements
en
monothérapie et/ou en combinaison obtenues en cellules Vero E6 à différents
temps
d'infection par le SARS-CoV-2.
Tableau 2
Conditions expérimentales IC50 (pM)
Remdesivir 0.98 +1- 0.07
Diltiazem > 45
MOI 0.01 ¨ 48hpi
Berbérine 17,47+!- 3.43
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Remdesivir/Diltiazem (11,5 itiM) 0.32 +/- 0.06
Diltiazem/Remdesivir (2.5 pM) 0.55 +/- 0.25
Remdesivir/Berbérine (12.5 pM) 0.65 +/- 0.04
Remdesivir 0.72 +/- 0.03
MOI 0.01 ¨ 72hpi
Diltiazem > 45
Berbérine 5.60 +/- 1.70
Remdesivir/Diltiazem (11,5 pM) 0.35 +/- 1.20
Cette table illustre bien le gain des combinaisons de traitements en termes de
réduction de
l'IC50 de certaines molécules en comparaison des traitements en monothérapie
de ces
molécules.
Ainsi, le Remdesivir combiné à une concentration fixe de Diltiazem (11.5 pM)
permet d'obtenir
une réduction d'environ 68 % de son IC50 (0.32 versus 0.98 pM) à 48hp1, et de
52 c1/0 de son
IC50 (0.35 versus 0.72 pM) à 72hpi.
En parallèle, le Diltiazem combiné à une concentration fixe de Remdésivir
permet d'obtenir
une IC50 de 0.55 pM, alors que son IC50 est supérieure à 45 pM à 48hpi.
Par ailleurs, le Remdesivir combiné à une concentration fixe de Berbérine
(12.5 pM) permet
d'obtenir une réduction d'environ 33% de son IC50 (0.65 versus 0.98 pM) à
48hpi.
Exemple 3. Comparaison des activités antivirales du Diltiazem, de la
Berberine, du
Remdesivir, et des combinaisons Diltiazem+Remdesivir, Berberine+Remdesivir sur
le
virus SARS-CoV-2 en modèle d'infection d'épithélium respiratoire humain
reconstitué.
Des épithéliums respiratoires humains d'origine nasale reconstitués et
cultivés en interface
air/liquide (MucilAir0 HAE, Epithelix) ont été infectés par le SARS-CoV-2
(M010.1). Le milieu
basal a été traité une fois par jour par les molécules suivantes, en
traitement simples ou en
combinaison :
- Diltiazem (45 ou 90 pM),
- Remdesivir (20 ou 40 pM) et
- Berbérine (4 pM)
pour 48 ou 72 heures post-infection.
La figure 4 présente le chronogramme des expériences.
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A différents temps, les épithéliums ont été récoltés et lysés. L'ARN total a
été extrait et les
génomes viraux ont été quantifiés par RT-PCR en normalisant les données à
l'aide de la
quantification du produit d'un gène cellulaire (GAPDH).
Ces données permettent d'évaluer l'effet antiviral des traitements en
monothérapie et en
combinaison par mesure relative de la réplication virale, exprimée en
pourcentage de la
réplication virale dans le control (non traité) ou en -log10 de la production
virale relative.
Tableau 3
Conditions expérimentales Reduction
Reduction
Production virale
Production virale
relative (%)
relative (-log10)
Remdesivir (20 pM)
99,99999555 7,3511976275
Diltiazem (90 pM)
55,12994353 0.348043384
Epithélium
Nasal Berbérine (4 pM)
MOI 0.1 86,3693311 0,865482832
48hpi Remdesivir (20 pM)
99,99999978 8,664459134
Diltiazem (90 pM)
Remdesivir (20 pM)
99,99999945 8,261020351
Berbérine (4 pM)
Remdesivir (20 pM) 99,62026862
2,420523516
Epithélium Remdesivir (40 pM)
99,49931193 2,300432754
Nasal
MOI 0.1 Diltiazem (45 pM)
31,35002452 0,163359614
72hpi
Diltiazem (90 pM)
29,36760102 0,150996043
Remdesivir (20 pM)
99,43372357 2,246971516
Diltiazem (90 pM)
Remdesivir (40 pM)
99,45500851 2,263610278
Diltiazem (45 pM)
Le Tableau 3 présente les effets des traitements au Diltiazem, à la Berberine
et au Remdesivir
en monothérapie et des traitements combinés Diltiazem+Remdesivir,
Berberine+Remdesivir
sur la réplication du virus SARS-CoV-2 en modèle d'épithélium respiratoire
humain (MucilAir0
HAE, Epithelix) d'origine nasal.
Le Tableau 3 récapitule les données d'activités antivirales du Diltiazem, de
la Berbérine, du
Remdesivir, et des combinaisons Diltiazem/Remdesivir, Berbérine/Remdesivir sur
le virus
SARS-CoV-2 en modèle d'infection d'épithélium respiratoire humain reconstitué
d'origine
nasale ou bronchiale.
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Le Remdesivir, en traitement simple présente une efficacité significative à
48hpi en épithélium
d'origine nasal (plus de 7,75 log10 d'abattement de la réplication virale).
La combinaison du Remdesivir avec le Diltiazem ou avec la Berbérine (dans les
mêmes
conditions de concentration qu'en monothérapie) permet d'augmenter
significativement l'effet
antiviral (8,6 et 8,29 log10 d'abattements de la réplication virale pour la
combinaison avec le
Diltiazem et la Berbérine, respectivement).
Les traitements en monothérapie par le Diltiazem ou la Berbérine présentent
aussi des
efficacités antivirales significatives à 48hpi (0,35 et 0,86 log10
d'abattements de la réplication
virale avec le Diltiazem et la Berbérine, respectivement).
L'efficacité du Remdesivir à 72hpi, dans nos conditions expérimentales, bien
que restant très
élevée, est comparativement moins importante qu'à 48hpi en épithélium
d'origine nasale
(2,42 et 2,05 log10 d'abattement à 20 pM et 2,30 et 2,24 log 10 d'abattement à
40 pM).
A 72hpi, les combinaisons Remdesivir/Diltiazem présentent une efficacité en
épithélium
d'origine nasale, mais sans différence importante avec un traitement simple
par le Remdésivir.
Cela pourrait s'expliquer par une efficacité antivirale du Diltiazem limité
dans ces conditions
expérimentales (0,16/0,15 10g10 d'abattement en epithélium nasal.
Exemple 4. Comparaison des activités antivirales du Diltiazem et du
Remdesivir, sur le
virus SARS-CoV-2 en modèle cellulaire A549-ACE2
Les cellules de la lignée cellulaire A549 sont des cellules épithéliales
basales alvéolaires
humaines issues d'adénocarcinome. Cette lignée cellulaire est utilisée comme
modèle pour
l'étude du cancer du poumon, mais également comme cellules cibles des virus
infectieux
ciblant les voies respiratoires. Ces cellules ont été ultérieurement modifiées
pour exprimer le
récepteur ACE2, par lequel le virus SARS-CoV-2 pénètre dans les cellules
hôtes. Cette lignée
cellulaire A549-ACE2 a été obtenue auprès de Creative Biogene (USA).
Contrairement aux cellules Vero, ces cellules A549-ACE2 possèdent une voie de
signalisation
des interférons complète et opérationnelle. Elles sont donc plus adaptées pour
étudier les
effets du Diltiazem qui agit sur ces voies de signalisation.
Le protocole expérimental est le suivant :
- Ensemencement des cellules A549-ACE2,
- 24 heures après, infection des cellules A549-ACE2 avec une souche Wuhan-
like de
SARS-CoV-2 (M0110-1 et 10-2),
- 1 heure post infection (pi), les cellules sont traitées avec du Diltiazem
à 45 u M,
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- Les surnageants sont prélevés à 24 heures, 48 heures, 72 heures et 96
heures après
l'infection pour une quantification virale par RT-PCR.
Les milieux d'incubation utilisés sont les suivants :
= Milieu d'ensemencement : DMEM 1g/L glucose (Glc), 200mM L-Glutamine (L-
Glu), 104
unités Pénicilline/Streptomycine (PIS), 10% Sérum Veau Foetal (SVF)
= Milieu d'infection : DMEM 1g/L Glc, 200mM L-Glu, 104 U P/S, 0% SVF
= Milieu de traitement : DMEM 1g/L Glc, 200mM L-Glu, 104 U P/S, 2% SVF
La figure 5 présente le protocole expérimental : un seul traitement est
réalisé à 1h piõpuis le
surnageant est prélevé à 24, 48, 72 et 96 hpi.
La figure 6 présente les résultats obtenus après traitement des cellules
infectées à deux taux
de multiplicité d'infection différents (A: MOI = 10' ; B : M01=10-2) avec du
Diltiazem (45 pM)
ou du Remdesivir (5 pM).
Les deux composés Remdesivir et Diltiazem permettent d'obtenir, avec un seul
traitement, un
même niveau d'inhibition du titre viral (mesuré par RT-PCR) au cours du temps,
et ce quel que
soit le taux de multiplicité d'infection.
Exemple 5. Détermination de l'IC50 sur SARS-CoV-2 et du CC50 du Diltiazem, en
lignée
A549 ACE2
Le protocole expérimental est le suivant :
- Ensemencement des cellules A549-ACE2,
- 24 heures après, infection des cellules A549-ACE2 avec une souche Wuhan-
like de
SARS-CoV-2 (M0110-1),
- 1 heure post infection (pi), les cellules sont traitées avec du Diltiazem
à différentes
concentrations,
- Les surnageants sont prélevés 72 heures après l'infection pour une
quantification virale
par RT-PCR.
L'IC50 est la concentration inhibitrice médiane c'est-à-dire la quantité de
Diltiazem nécessaire
pour obtenir 50% d'inhibition de la réplication virale de la souche SARS-CoV-2
testée.
Les résultats obtenus sont présentés en figure 7A: l'IC50 du Diltiazem est de
19.7 pM, ce qui
est significatif d'une bonne efficacité inhibitrice in vitro.
En parallèle, la cytotoxicité du Diltiazem sur ces cellules A549-ACE2 a été
vérifiée dans les
mêmes conditions expérimentales. Pour cela, le 0050 (Cytotoxic concentration
50%), qui
correspond la dose nécessaire de Diltiazem pour réduire la viabilité des
cellules de moitié, a
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PCT/FR2021/050406
été mesuré en suivant la viabilité des cellules A549-ACE2 en présence de
différentes
concentrations de Diltiazem. La viabilité a été déterminée par un test MTS
réalisé 72 heures
après le début du traitement.
Le test MTS est une méthode colorimétrique: la méthode est basée sur la
réduction du
composé de tétrazolium MTS par des cellules viables pour générer un produit de
formazan
coloré, permettant la comptabilisation des cellules viables (colorées) et des
cellules mortes.
Les résultats obtenus sont présentés en figure 7B : la viabilité des cellules
est réduite de moitié
avec une concentration de Diltiazem égale à 374 pM, une dose très supérieure à
l'IC50
mesurée précédemment.
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