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DESCRIPTION
Titre : PROCÉDÉ DE PREPARATION DE POLYGLUCOSIDES D'ALKYLE ET
POLYGLUCOSIDES D'ALKYLE OBTENUS SELON LE PROCÉDÉ
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la préparation par voie
enzymatique de
polyglucosides d'alkyle. La présente invention se rapporte également aux
polyglucosides
d'alkyle susceptibles d'être obtenus par ledit procédé.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE
Les surfactants sont utilisés depuis très longtemps dans un grand nombre de
domaines
tels que la pharmaceutique, cosmétique, les produits d'hygiène et d'entretien
ou des
formulations industrielles du fait de leurs propriétés variées : moussantes,
émulsifiantes,
dispersantes, détergentes, etc.
Les surfactants sont structurellement constitués d'une partie hydrophobe et
d'une partie
hydrophile, cette dernière pouvant être chargée positivement ou négativement
ou encore
être non chargée.
Les polyglucosides d'alkyle (en anglais alkyl polyglucosides , abrégé APGs)
sont des
tensioactifs glucolipidiques dont la tête polaire est constituée de résidus
glucosyle et d'une
chaine carbonée plus ou moins longue ayant typiquement 1 à 18 atomes de
carbone.
Les APGs présentent des propriétés de surface intéressantes, une
biodégradabilité et une
innocuité vis à vis de la peau et des muqueuses ce qui leur confère un intérêt
certain pour
de nombreuses applications industrielles.
Les APGs sont synthétisés classiquement via des voies chimiques. Les
procédures les
plus communes de synthèse d'APGs incluent la méthode de Fischer, de Koenig-
Knorr ou
celles de Schmidt.
La méthode de Fischer est la plus simple à mettre en oeuvre et est
classiquement utilisée
industriellement lorsque la sélectivité de synthèse n'est pas un critère
recherché. Selon la
nature du carbohydrate et de l'alcool gras, la réaction de Fischer peut être
conduite en une
ou deux étapes. Le carbohydrate est solubilisé dans un excès d'alcool en
présence d'un
catalyseur acide et à température élevée.
L'obtention d'APGs dont la chaine carbonée est de grande taille nécessite une
étape dans
laquelle un alkyle de petite taille, typiquement butyl-, est échangé avec un
alcool dont la
chaine carbonée est de plus grande taille permettant ainsi de contourner les
problèmes de
solubilité des réactifs.
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La synthèse de Fischer conduit à l'obtention d'un mélange pouvant être
extrêmement
complexe de mono-, di-, tri- et oligoglucosides d'alkyle.
Les unités glucosyle constituant l'APG peuvent être présentes sous la forme
d'anomères
a ou 6, et d'isomères pyranosides et furanosides.
Pour des raisons de cinétiques réactionnelles et d'incompatibilités des
produits de réaction
(faible solubilité des carbohydrates dans les alcools gras), le degré de
polymérisation
moyen de la partie glucidique des APGs commerciaux reste actuellement
inférieur à 2
(Ulvenlund et al., 2016), et est typiquement compris entre 1,3 et 1,6.
Or, pour certaines applications, des APGs dont la partie glucidique est
particulièrement
longue sont requis et demandés par les acteurs industriels.
Au vu de ce qui précède, le développement de voies de synthèse efficaces
permettant
d'accéder à des APGs dont la partie glucidique est particulièrement longue est
un enjeu
majeur.
Ces dernières années, des efforts notables ont été consacrés au développement
de voies
enzymatiques de synthèse d'APGs.
Les enzymes les plus étudiées dans cette optique sont des enzymes appartenant
à la
famille des glycoside hydrolases et plus particulièrement celles de la famille
des 6-
glycosidases. Ces dernières sont des enzymes sans co-facteurs qui hydrolysent
naturellement des liaisons osidiques de type 6 présentes dans les
polysaccharides pour
produire des mono- ou des oligosacharides. In vitro, ces enzymes sont capables
d'utiliser
un donneur de glycosyle et de catalyser le transfert du glycosyle sur
l'hydroxyle libre d'une
molécule acceptrice.
La synthèse des alkyl-polyglucosides catalysée par les 6-glycosidases conserve
en
général une liaison de configuration 6 entre les sucres et la partie alkyle
(on parlera de 6-
alkyl-polyglucosides). Cette synthèse est possible soit par inversion
d'hydrolyse (où le
donneur de glucosyle peut être la cellulose ou des 6-glucanes), soit par
transglycosylation
(où les donneurs de glycosyle sont des polysaccharides naturels ou des
carbohydrates
activés tels que le méthy1-6-D-glucopyranoside, le pNP-6-D- glucopyranoside ou
autres
aryl-glucosides).
D'autres familles d'enzymes ont permis l'obtention d'alkyl-polyglucosides.
Bousquet et al. ont montré la possibilité d'obtenir des a-alkyl-polyglucosides
en utilisant
une a-transglucosylase à partir de maltodextrines sur du butanol (Bousquet et
al., 1998 ;
Bousquet et al., 1999).
Dahiya et collaborateurs ont réussi à produire des 1-0-hexyl-a-D-mono, di- et
tri- a-
glucopyranosides à partir d'hexanol ou d'octanol et de saccharose en utilisant
une souche
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de Microbacterium para oxydans présentant une activité de
transglucosylation
membranaire de type amylo-saccharase (Dahiya et al., 2015).
Ochs et collaborateurs ont produit des pentyl- et octyl-polyxylosides (alkyl-
polyxylosides)
par réaction de transglycosylation entre du pentanol, de l'octanol et des
xylanes catalysée
par différentes xylanases (Ochs et al., 2011 ; Remond et al., 2012).
Dans chaque cas, la différence de nature chimique des réactants (carbohydrates
et alcools
gras) ainsi que le caractère très hydrophile des sucres et, en contraste, très
hydrophobe
des acides gras ne permettent pas l'obtention de concentrations suffisantes
des deux
substrats dans la même phase, ce qui limite grandement les rendements de
production et
les tailles des têtes glycosidiques à quelques unités.
Une voie alternative est d'utiliser des APGs commerciaux présentant une partie
glucidique
de taille modérée (typiquement degré de polymérisation inférieur à 3) et de
rallonger la
partie glucidique par voie enzymatique.
Dans cette optique, les cyclodextrine glucano-transferases (CGTases) ont
largement été
décrites pour leur capacité de production d'APGs de faible DP par réaction de
transglucosylation.
Les CGTases appartiennent aux familles des glycoside hydrolases GH13 et GH57
et sont
spécifiques de la formation de liaisons a-1,4 glucosidiques. Ces enzymes
catalysent quatre
types de réaction à partir d'amidon ou d'amylose : la cyclisation, le
couplage, la
disproportionation et l'hydrolyse. Dans le cas où une molécule non glucidique
porteuse
d'un ou plusieurs résidus glucosyle est introduite dans le milieu, les CGTases
sont
susceptibles d'orienter leur activité vers une réaction de couplage et/ou
disproportionation
sur cet accepteur.
Okada et collaborateurs furent les premiers à utiliser les capacités de
couplage de telles
enzymes pour l'élongation de glycolipides (sucro-esters). Ils ont obtenu
l'addition de 1 à 3
unités glucosyle sur du laurate de saccharose (Okada et al., 2007).
La capacité des CGTases à rallonger des maltosides de butanol, d'octanol et de
dodécanol
a été montrée par Zhao et collaborateurs en 2008 (Zhao et al., 2008).
Les APGs utilisés n'ont pu être rallongés que de 2 à 3 unités glucosyle par la
CGTase de
Bacillus stearothermophilus à partir de dextrines de 10 à 15 unités glucosyle.
Svensson et collaborateurs ont comparé les activités de couplage et de
disproportionation
des CGTases de Bacillus macerans et de Thermoanaerobacter (Toruzyme 3.0L,
Novozymes NS, Danemark) sur du dodécyl-maltoside (012G2, c'est à dire un APG
composé d'un alkyle en 012 et d'une partie glucidique comprenant deux unités
glucosyle)
à partir d'a-cyclodextrines (Svensson et al., 2009). Il a pu être mis en
évidence que les
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différences de spécificités réactionnelles couplage/disproportionation des
deux CGTases,
permettaient la modulation des produits de réaction. Ainsi, des mélanges de
produits
porteurs de 1 à 20 unités glucosyle ont été obtenus avec des profils variant
selon les
CGTases (012G8 et 012G14 pour la CGTase de B. macerans, enzyme peu
disproportionante et une distribution +/- homogène de C12G1 à 012G20 pour la
CGTase
de Thermoanaerobacter, enzyme très disproportionante).
L'obtention des différents produits est contrôlée par la cinétique de réaction
(Svensson et
al., 2011), les réactions de couplage étant plus rapides que celles de
disproportionation.
Ainsi, il a été possible de réguler le profil de produits en APGs rallongés en
contrôlant le
.. débit traversant un réacteur à lit fixe contenant la CGTase de B. macerans
immobilisée sur
Eupergit C: un débit rapide favorise le produit de couplage (012G8) tandis
qu'un débit lent
défavorise le 012G8 et favorise les produits de couplage double ou triple et
les produits de
disproportionation (Cl 2G14, 012G20).
Paul et collaborateurs ont utilisé une glucanotransférase de la famille GH57
pour allonger
du dodécanol maltoside à partir d'amidon. Des APGs porteurs de 24 à 26 unités
glucosyle
(012G24 à 012G26) ont été identifiés par analyse MS (Paul, et al., 2015).
Des glucane-saccharases (GS) des familles GH13 et GH70 peuvent aussi être
utilisées
pour de telles réactions de glucosylation.
A partir de saccharose, les glucane-saccharases catalysent la synthèse de
glucanes
présentant généralement de très hautes masses molaires et des structures
variées en
raison de la présence de différents types de liaisons osidiques (a-1,2, a-1,3,
a-1,4 et/ou a-
1,6) ainsi qu'à leur localisation dans le polymère. Des isomères du saccharose
ainsi que
du glucose sont aussi produits à partir de saccharose mais généralement en
beaucoup
plus faible quantité que le polymère.
Quelques glucane-saccharases des familles GH13 et GH70 ont été utilisées dans
des
réactions d'accepteurs dans le but d'allonger la partie glucidique d'alkyl
monoglucosides à
groupe alkyle courts (1 à 8 atomes de carbone) à partir de saccharose.
Ainsi, les dextrane-saccharases extracellulaires de Leuconostoc mesenteroides
NRRL-
B512F ont permis dès 1966 le transfert de 1 à 4 unités glucosyle sur le 1-0-
méthyl-a-D-
glucoside.
L'alternane saccharase de L. mesenteroides NRRL B-1355 a catalysé le transfert
d'une
seule unité glucosyle sur les 1-0-méthyl-a- et B-D-glucosides (Côté et
ai.,1982).
Plus récemment, Richard et collaborateurs ont étudié l'effet de la longueur de
la chaine
alkyle sur la capacité des dextrane-saccharases à glucosyler les alkyl-
monoglucosides et
.. ont montré que, si des glucane-saccharases de L. mesenteroides B-512F, B-
1299, B-1355
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et B-23192 sont capables de glucolyser le 1-0-butyl-a-glucoside (en ajoutant 1
à 3 unités
glucosyle supplémentaires selon des liaisons a-1,6 glucosidiques), seules les
alternane-
saccharases de L. mesenteroides B-1355 et B-23192 ont allongé le 1-0-octyl-a-
glucoside
(Richard et al., 2003).
Les procédés connus sont donc limités notamment en ce qu'ils ne permettent pas
de
moduler aisément à la fois le nombre et la nature des liaisons reliant les
unités glucosyle
au sein des polyglucosides d'alkyle obtenus.
Par ailleurs, la plupart des procédés connus ne peuvent avoir comme substrat
des
glucosides d'alkyle ayant de longues chaines d'alkyle, typiquement supérieur à
8 atomes
de carbone.
Il existe donc un besoin pour un procédé de préparation de glucosides d'alkyle
permettant
d'accéder à une grande diversité d'architectures moléculaires en utilisant un
substrat
renouvelable et bon marché tel que le saccharose.
En particulier, il existe également un besoin pour un procédé permettant de
moduler à la
fois le nombre d'unités glucosyle au sein de la partie glucidique, mais aussi
la nature des
liaisons osidiques reliant lesdites unités glucosyle, tout en rendant possible
l'obtention de
polyglucosides d'alkyle à longue chaine glucosidique, et ce même si le
glucoside d'alkyle
utilisé comme substrat a un groupe alkyle de grande taille.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
[Fig. 1] La Figure 1 illustre le schéma de la réaction d'élongation
enzymatique de la partie
glucosidique d'un monoglucoside d'alkyle mettant en oeuvre des a-
transglucosylases de la
famille GH70 actives sur le saccharose.
Les Figures [Fig. 2A] 2A et [Fig. 2B] 2B montre les profils d'élongation pour
le substrat
C8G1 obtenus avec les a-transglucosylases de la famille GH70 qui utilisent le
saccharose
comme donneur de glucosyle. [Fig. 2A] La Figure 2A montre les profils obtenus
avec les
glucane saccharases à partir de [C8G1] = 30 mM et de [saccharose] = 585 mM
pour les
glucane-saccharases DSR-M 3.1 (SEQ ID NO: 1), DSR-M 3.5 (SEQ ID NO : 2), DSR-M
3.5
W624A (SEQ ID NO: 3), GS-B (SEQ ID NO: 5), GS-C (SEQ ID NO: 6), GS-D (SEQ ID
NO : 9) et GS-FS 3.1 (SEQ ID NO: 10) et 1170 mM de saccharose pour les enzymes
GS-
A SEQ ID NO :4, GS-D (SEQ ID NO :7), DSR-G (SEQ ID NO :11), DSR-G CD1 (SEQ ID
NO :12). Les glucane saccharases sont utilisées en réaction à 1 U.mL-1. [Fig.
2B] La Figure
2B montre les profils obtenus avec les enzymes de branchement BRS-A (SEQ ID
NO: 17),
BRS-B Al (SEQ ID NO: 18), BRS-C (SEQ ID NO: 19), BRS-D Al (SEQ ID NO : 20),
BRS-
E Al (SEQ ID NO: 21), BRS-F (SEQ ID NO : 22), DSR-G CD2 (SEQ ID NO : 23), GBD-
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CD2 (SEQ ID NO: 16), à partir de [C8G1] = 20 mM et de [saccharose] = 585 mM.
Les
enzymes de branchement sont utilisées en réaction à 1 U.mL-1
[Fig. 3] La Figure 3 compare le profil de la réaction d'élongation du C8G1
catalysée par
GS-C (SEQ ID NO: 6) en présence de 200 g.L-1 de saccharose et de 200 g.L-1 d'a-
cyclodextrines et de la cyclodextrine glucanotransferases (CGTase) de Bacillus
macerans
(enzyme non conforme à l'invention) en présence de 200 g.L-1 d'a-
cyclodextrines (substrat
non conforme à l'invention).
[Fig. 4] La Figure 4 compare les profils de la réaction d'élongation du C8G1
catalysée par
la glucane-saccharase DSR-M 3.1 seule (SEQ ID NO : 1) et catalysées par la
glucane-
saccharase DSR-M 3.1 et les enzymes de branchement BRS-A (SEQ ID NO :17) ou
BRS-
B Al (SEQ ID NO :18) utilisées de manière séquentielle.
[Fig. 5] La Figure 5 montre le profil d'élongation d'alkyle glucosides de
tailles croissantes
obtenu avec la glucane-saccharase DSR-M 3.1 (SEQ ID NO : 1) avec des
concentrations
initiales en saccharose de 200 g.L-1. Encart A: [C8G1]=30mM ; Encart B:
[C10G1]=10mM
; Encart C : Triton CG110 (Dow Chemicals, USA) à 15 g.L-1 ; Encart D :
[C12G1]=5 mM ;
Encart E : [012G2]=10mM, Encart F : [016G2]=5mM.
DESCRIPTION DETAILLÉE DE L'INVENTION
Le but de la présente invention est de pallier les inconvénients de l'art
antérieur et de fournir
un procédé de préparation d'un polyglucoside d'alkyle par catalyse
enzymatique, ledit
procédé étant économique car utilisant du saccharose ou l'un de ses analogues
comme
substrat et permettant d'obtenir une grande diversité de polyglucosides
d'alkyle en termes
de taille et de structure de leur partie glucosidique.
Ainsi, le procédé de l'invention rend possible d'obtenir un polyglucoside
d'alkyle avec un
nombre d'unités glucosyle modulable de 2 à 200 unités glucosyle.
Le procédé permet également de moduler la structure linéaire ou ramifiée de la
partie
glucidique du polyglucoside d'alkyle obtenu, ainsi que la nature des liaisons
osidiques
alpha-1,2 ; alpha-1,3 ; alpha-1,4 ou alpha-1,6 reliant les résidus glucosyle
au sein de la
partie glucidique.
De manière importante, le procédé de l'invention permet de préparer des
polyglucosides
d'alkyle ayant un groupe alkyle de taille importante, par exemple supérieure à
8 atomes de
carbone.
Cette diversité est très avantageuse pour produire de nouveaux polyglucosides
d'alkyle
d'intérêt dans le secteur des détergents et des cosmétiques.
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Un autre but de l'invention est de fournir des alkyle polyglucosides d'une
grande diversité
en termes de taille et de structure de la partie glucosidique, et en
particulier des
polyglucosides d'alkyle dont la taille du groupe alkyle est importante, par
exemple
supérieure à 8 atomes de carbone.
Ces buts sont atteints par l'invention qui va être décrite ci-après.
La présente invention a pour premier objet un procédé de préparation d'un
polyglucoside
d'alkyle de formule (I)
[Glc]m-[Glc]n(-0-R) (I)
dans laquelle :
R représente un groupe alkyle linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé,
comprenant entre 8
et 20 atomes de carbone,
[Glc]m-[Glc]n représente une partie glucidique linéaire ou ramifiée comprenant
n+m unités
glucosyle,
n+m étant compris entre 3 et 200;
ledit procédé comprenant au moins une étape i) d'élongation de la chaine
glucosidique
d'un glucoside d'alkyle de formule (II)
[Glc]n(-0-R) (Il)
dans laquelle :
R est tel que défini dans la formule (I),
[Glc]n représente une partie glucidique comprenant n unités glucosyle
n étant compris entre 1 et 15.
ladite étape comprenant la mise en contact dudit glucoside d'alkyle de formule
(II) avec au
moins une a-transglucosylase de la famille GH70 en présence de saccharose ou
d'un
analogue de saccharose.
Grâce au procédé conforme à l'invention, il est maintenant possible de
préparer
une grande diversité de polyglucosides d'alkyle.
De manière importante, le procédé permet de contrôler la taille, la structure
ramifiée
ou non et la nature des liaisons osidiques au sein de la partie glucidique du
polyglucoside
d'alkyle obtenu, et ce même lorsque le groupe alkyle du glucoside d'alkyle
utilisé comme
substrat est de grande taille.
Les a-transglucosylases de la famille GH70 sont des enzymes hydrosolubles
catalysant naturellement des substances hydrophiles, et dont l'activité est a
priori fortement
limitée en présence de matière grasse.
Les inventeurs ont découvert que, de manière surprenante, des
a-transglucosylases de la famille GH70 sont capables d'accepter comme substrat
un
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glucosyle d'alkyle en 08-020, c'est-à-dire un composé peu soluble comprenant
une partie
hydrophobe défavorable à l'action de ce type d'enzyme, et de catalyser
efficacement
l'élongation de sa partie glucidique.
Partie glucidique
Selon l'invention, l'expression partie glucidique , désigne un polymère
linéaire
ou ramifié constitué d'unités glucosyle liées entre elles par des liaisons
osidiques.
Selon l'invention, les termes liaison glycosidique ou liaison
glucosidique ou
liaison osidique peuvent être utilisés indifféremment et désignent le lien
covalent qui lie
un glucosyle à un autre glucosyle adjacent.
La partie glucidique [Glc]m-[Glc]n du polyglucoside d'alkyle de formule (I)
comprend
deux fractions glucidiques [Glc]m et [Glc]n
La fraction glucidique [Glc]n correspond aux n unités glucosyle de la partie
glucidique du glucoside d'alkyle de formule (II) utilisé comme substrat dans
le procédé de
l'invention.
La fraction glucidique [Glc]m correspond aux m unités glucosyle ajoutées sur
la
partie glucidique [Glc]n du glucoside d'alkyle de formule (II) lors de l'étape
d'élongation
glucosidique du procédé de l'invention.
n+m, c'est-à-dire le nombre d'unités glucosyle dans la partie glucidique
[Glc]m-[Glc]n
du polyglucoside d'alkyle de formule (I) est avantageusement compris entre 3
et 150, de
préférence entre 3 et 100, de préférence encore entre 3 et 30, de préférence
encore entre
3 et 25. De manière préférée, n+m est compris entre 5 et 50, et peut notamment
être
compris entre 5 et 40, notamment encore entre 5 et 30, en particulier entre 5
et 25.
Avantageusement, n+m est compris entre 7 et 200, de préférence entre 8 et 200,
de
préférence entre 9 et 200, de préférence entre 10 et 200.
m, c'est-à-dire le nombre d'unités glucosyle dans la fraction glucidique
[Glc]m de la
partie glucidique [Glc]m-[Glc]n du polyglucoside d'alkyle de formule (I), ou
autrement dit le
nombre d'unités glucosyle ajoutés sur la partie glucidique [Glc]n du glucoside
d'alkyle de
formule (II) lors de la mise en oeuvre du procédé de l'invention, est
avantageusement
supérieur à 3. De manière préférée, m est compris entre 3 et 150, de
préférence compris
entre 3 et 100, de préférence encore compris entre 3 et 30.
n, c'est-à-dire le nombre d'unités glucosyle dans la fraction glucidique
[Glc]n de la partie
glucidique [Glc]m-[Glc]n du polyglucoside d'alkyle de formule (I), ou
autrement dit le nombre
d'unités glucosyle de la partie glucidique [Glc]n du glucoside d'alkyle de
formule (II), est
avantageusement compris entre 1 et 8, de préférence entre 1 et 5, de
préférence encore
entre 1 et 3. De manière préférée, n est égal à 1 ou 2.
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Type de liaisons
Selon l'invention, l'expression liaison a désigne un lien covalent qui lie
l'atome
de carbone 1 d'une unité glucosyle dans sa configuration a ; et l'expression
liaison 13)>
désigne un lien covalent qui lie l'atome de carbone 1 d'une unité glucosyle
dans sa
configuration 13.
Au sein de la fraction glucidique [Glc]n du polyglucoside d'alkyle de formule
(I) ou
de la partie glucidique [Glc]n glucoside d'alkyle de formule (II), l'unité
glucosyle adjacente
au groupe alkyle est liée au groupe alkyl par une liaison a ou par une liaison
13, de
préférence par une liaison 13.
En d'autres termes, dans le polyglucoside d'alkyle de formule (I) et le
glucoside
d'alkyle de formule (II), l'unité glucosyle adjacente au groupe alkyle est en
configuration a
ou 13, de préférence en configuration 13.
Les autres unités glucosyle de la fraction glucidique [Glc]n du polyglucoside
d'alkyle
de formule (I) ou de la partie glucidique [Glc]n glucoside d'alkyle de formule
(II) sont liés
.. entres elles par des liaisons glucosidiques a et/ou 13, de préférence par
des liaisons
glucosidiques a.
Les m unités glucosyles adjacentes au sein de [Glc]m sont liés entres elles
par des
liaisons glucosidiques a.
Dans le présent document, le terme liaison a-1,3 désigne le lien covalent
qui lie
l'atome de carbone 1 d'une unité glucosyle dans sa configuration a et le
carbone 3 d'une
autre unité glucosyle adjacente. Le terme liaison a-1,2 désigne le lien
covalent qui lie
l'atome de carbone 1 d'une unité glucosyle dans sa configuration a et le
carbone 2 d'une
autre unité glucosyle adjacente. Le terme liaison alpha-1,6 désigne le
lien covalent qui
lie l'atome de carbone 1 d'une unité glucosyle dans sa configuration alpha et
le carbone 6
d'une autre unité glucosyle adjacente.
Les unités alpha-glucosyle sont de préférence des unités alpha-D-glucosyle.
L'analyse des liaisons glycosidiques d'un polyglucoside d'alkyl peut être
réalisée
grâce à n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier.
Par exemple, les liaisons glucosidiques peuvent être analysées par résonance
magnétique nucléaire (RMN).
L'étape i) peut être conduite avec un glucoside d'alkyle de formule (II)
essentiellement constitué de molécules de monoglucoside d'alkyle, de molécules
de
diglucloside d'alkyle, ou d'un mélange de celles-ci, ledit mélange présentant
avantageusement un degré de polymérisation moyen compris entre 1 et 2, de
préférence
compris entre 1,3 et 1,6.
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Le mélange est essentiellement constitué de molécules de monoglucoside
d'alkyle
et de molécules de diglucloside d'alkyle, c'est-à-dire qu'il est constitué
d'au moins 90% en
poids de molécules de monoglucoside d'alkyle et de diglucloside d'alkyle, de
préférence
d'au moins 95% en poids de molécules de monoglucoside d'alkyle et de
diglucloside
d'alkyle, de préférence encore d'au moins 97% en poids de molécules de
monoglucoside
d'alkyle et de diglucloside d'alkyle.
Le reste peut avantageusement être constitué de molécules de d'oligoglucosides
d'alkyle, i.e. de glucosides d'alkyle dont le glucoside comprend de 3 à 8
unités glucosyle,
de préférence 3 à 5 unités glucosyle.
Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d'alkyle de formule (I) est
constitué
essentiellement d'un mélange de molécules de polyglucosides d'alkyle de
formule (I), ledit
mélange présentant avantageusement un degré de polymérisation moyen compris
entre 3
et 25, de préférence compris entre 5 et 25, de préférence compris entre 6 et
25, de
préférence entre 7 et 25, de préférence encore entre 8 et 25.
Le mélange est essentiellement constitué de molécules de polyglucoside
d'alkyle
de formule (I), c'est-à-dire qu'il est de préférence constitué d'au moins 90%
en poids
desdites molécules de polyglucosides d'alkyle, de préférence d'au moins 95% en
poids
desdites molécules de polyglucosides d'alkyle, de préférence encore d'au moins
97% en
poids desdites molécules de polyglucosides d'alkyle.
Dans la présente invention, le degré de polymérisation moyen rend compte
de
la distribution moyenne du nombre d'unités glucosyle par molécule de
polyglucoside
d'alkyle de formule (I) ou de glucoside d'alkyle de formule (II) au sein d'un
mélange de
molécules de polyglucoside d'alkyle de formule (I) ou d'un mélange de
molécules de
glucoside d'alkyle de formule (II).
Dans l'invention, ce degré de polymérisation moyen est déterminé à partir de
mesures réalisées par résonance magnétique nucléaire (RMN).
Pour un mélange de molécules de polyglucoside d'alkyle de formule (I), le
degré de
polymérisation moyen est déterminé en calculant le ratio (masse molaire
moyenne du
mélange de molécules polyglucoside d'alkyle de formule (I) - masse molaire de
la chaine
alkyle correspondante) : (masse molaire d'une unité glucosyle).
Pour un mélange de molécules de glucoside d'alkyle de formule (II), le degré
de
polymérisation moyen est déterminé en calculant le ratio (masse molaire
moyenne du
mélange de molécules de glucoside d'alkyle de formule (II) - masse molaire de
la chaine
alkyle correspondante) : (masse molaire d'une unité glucosyle).
Groupe alkyle
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De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que des a-
transglucosylases
de la famille GH70 permettent de glucosyler efficacement des glucosides
d'alkyle de
formule (II) ayant un groupe alkyle de taille importante.
Le groupe alkyl comprend de préférence au moins 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
16,
17, 18 ou 19 atomes de carbone et au plus 20 atomes de carbone.
Dans un mode de réalisation, le groupe alkyle R comprend avantageusement entre
8 et 16 atomes de carbone, de préférence encore comprend 8 et 12 atomes de
carbone.
Dans un mode de réalisation, le groupe alkyle R comprend entre 9 et 20 atomes
de
carbone, de préférence comprend entre 9 et 16 atomes de carbone, de préférence
encore
comprend entre 9 et 12 atomes de carbone.
Dans un mode de réalisation, le groupe alkyle R comprend entre 10 et 20 atomes
de carbone, de préférence comprend entre 10 et 16 atomes de carbone, de
préférence
encore comprend entre 10 et 12 atomes de carbone.
Dans un mode de réalisation, le groupe alkyle R comprend entre 13 et 20 atomes
de carbone, de préférence comprend entre 16 et 20 atomes de carbone.
Plus particulièrement, les inventeurs ont montré que des a-transglucosylases
de la
famille GH70 sont capables de catalyser l'élongation de la partie glucosidique
d'un
glucoside d'alkyle de formule (II) présentant un groupe alkyle R comprenant
entre 8 et 20
atomes de carbone, c'est-à-dire un substrat accepteur présentant un pôle alkyl
beaucoup
plus hydrophobe que des glucosides d'alkyl présentant un groupe alkyl tel
qu'un groupe
méthyle, éthyle, propyle ou butyle.
Autrement dit, le procédé de l'invention est particulièrement avantageux en ce
qu'il
permet d'obtenir un polyglucoside d'alkyle de formule (I) ayant un groupe
alkyle R compris
entre 8 et 20 atomes de carbone et une partie glucidique [Glc]m-[Glc]n ayant
un n+m tel
que défini ci-dessus.
Dans un mode de réalisation, R représente un groupe alkyle comprenant de 8 à
12
atomes de carbone, et n+m est compris entre 7 et 200, de préférence entre 8 et
200, de
préférence entre 9 et 200, de préférence encore entre 10 et 200. Dans ce mode
de
réalisation, n+m peut avantageusement être compris entre 7 et 50, de
préférence entre 8
et 50, de préférence entre 9 et 50, et de préférence encore entre 10 et 50.
Dans un mode de réalisation, R représente un groupe alkyle comprenant de 12 à
20 atomes de carbone, et n+m est compris entre 3 et 200, de préférence entre 4
et 200,
de préférence entre 5 et 200, et de préférence encore entre 10 et 200. Dans ce
mode de
réalisation, n+m peut avantageusement être compris entre 3 et 50, de
préférence entre 4
et 50, de préférence entre 5 et 50, et de préférence encore entre 10 et 50.
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Dans un mode de réalisation, lorsque R représente un groupe alkyle comprenant
de 8 à 12 atomes de carbone, n+m est compris entre 7 et 200, de préférence
entre 8 et
200, de préférence entre 9 et 200, de préférence encore entre 10 et 200 et
peut notamment
être compris entre 7 et 50, de préférence entre 8 et 50, de préférence entre 9
et 50, et de
préférence encore entre 10 et 50 ; et lorsque R représente un groupe alkyle
comprenant
de 12 à 20 atomes de carbone, n+m est compris entre 3 et 200, de préférence
entre 4 et
200, de préférence entre 5 et 200, et de préférence encore entre 10 et 200 et
peut
notamment être compris entre 3 et 50, de préférence entre 4 et 50, de
préférence entre 5
et 50, et de préférence encore entre 10 et 50.
a-transglucosylase
Selon l'invention, le terme a-transglucosylase désigne une enzyme capable
de
polymériser des unités glucosyle selon des liaisons a, en catalysant le
transfert d'une unité
glucosyle depuis un sucre donneur de glucosyle vers un composé accepteur.
Selon l'invention, l'expression de la famille GH70 , relatif à l'a-
transglucosylase,
signifie que l'a-transglucosylase selon l'invention appartient à la famille 70
des glycoside-
hydrolases selon la classification CAZy (viNAP,Lcazy.org). CAZy, de l'anglais
Carbohydrate-Active enZYmes (abrégé CAZy ), est une base de données bio-
informatique de classification des enzymes actives sur les sucres i.e.
capables de catalyser
leur dissociation ou leur synthèse selon des homologies de séquences ou de
structure, en
particulier de leurs modules catalytiques et de liaison aux glucides. Dans la
classification
CAZy, le groupe des glycoside-hydrolases (GH) compte 167 familles composées
d'enzymes actives sur les sucres capables de catalyser des réactions
d'hydrolyse de
liaisons glycosidique ou de transglucosylation.
Les a-transglucosylases de la famille GH70 sont typiquement produites de façon
naturelles par des bactéries lactiques des genres Streptococcus, Leuconostoc
(abrégé
L. ), Weisella ou Lactobacillus (abrégé Lb. ).
Les a-transglucosylases de la famille GH70 selon l'invention sont actives sur
le
saccharose, ce qui signifie que les a-transglucosylases selon l'invention
utilisent
spécifiquement le saccharose ou un de ses analogues comme donneur de
glucosyle.
Les analogues de saccharose peuvent notamment être choisis dans le groupe
comprenant le fluorure d'a D-glucopyranosyle (en anglais a-D-Glucopyranosyl
fluoride
), le 013-D-galactopyranosyl-(1-4)13-D-fructofuranosyl-a-D-glucopyranoside (en
anglais
Lactulosucrose ), le p-nitrophenyl a-D-glucopyranoside, le a-D-glucopyranosyl
a-L-
sorbofuranoside et leurs mélanges.
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Selon un mode de réalisation, l'a-transglucosylase de la famille GH70 est
sélectionnée parmi l'une des a-transglucosylases décrites ci-dessous.
L'enzyme DSR-M 3,1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 1 est un fragment
allant de l'acide aminé à la position 42 à l'acide aminé à la position 1433 de
la séquence
d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme DSR-M (issue de la souche L.
citreum
NRRL B-1299) ayant pour référence GenBank CDX668951.1.
L'enzyme DSR-M .8.5 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2 est un fragment
allant de l'acide aminé à la position 421 à l'acide aminé à la position 1315
de la séquence
d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme DSR-M (issue de la souche L.
citreum
NRRL B-1299) ayant pour référence GenBank CDX668951.1.
L'enzyme DSR-M .8.5 W624A de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3 est un
mutant en position 624 du fragment de séquence d'acides aminés SEQ ID NO :2.
L'enzyme GS-A de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4 correspond à la
séquence d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche
Lb. kunkeei
MP2 ayant pour référence GenBank ALJ31412.
L'enzyme GS-B de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5 correspond à la
séquence d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche
Lb.
animalis DSM 20602 ayant pour référence GenBank KRM57462.1.
L'enzyme GS-C de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6 correspond à la
séquence d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche
Lb.
Apodemi ayant pour référence GenBank WP_056957205.
L'enzyme GS-D de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 7 correspond à la
séquence d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche
Lb.
animalis DSM 20602 ayant pour référence GenBank KRM57463.
L'enzyme GS-E de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 8 correspond à la
séquence d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche
Lb.
capillatus DSM 19910 ayant pour référence GenBank KRL03580.
L'enzyme GS-F Al de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 9 est un fragment
allant de l'acide aminé à la position 166 à l'acide aminé à la position 1874
de la séquence
d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche L. fallax
KCTC 3537
ayant pour référence GenBank WP_010006777.1.
L'enzyme GS-FS de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 10 correspond à la
séquence d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la
Streptococcus
salivarus HSISS4 ayant pour référence GenBank ALR80278.
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L'enzyme DSR-G de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 11 correspond à la
séquence d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la Lb.
kunkeei DSM
12361 ayant pour référence GenBank KRK22577.1.
L'enzyme DSR-G CD1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 12 est un
fragment allant de l'acide aminé à la position 1 à l'acide aminé à la position
1407 de la
séquence d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche
Lb. kunkeei
DSM 12361 ayant pour référence GenBank KRK22577.
L'enzyme ASR Al de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 13 est un fragment
allant de l'acide aminé à la position 1 à l'acide aminé à la position 1425 de
la séquence
d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche L.
mesenteroides
NRRL B-1355 ayant pour référence GenBank 0AB65910.2.
L'enzyme GTF-SI de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14 correspond à la
séquence d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche
Streptococcus mutans ayant pour référence GenBank BAA26114.1.
L'enzyme GTF-J de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 15 correspond à la
séquence d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche
Streptococcus mutans ayant pour référence GenBank AAA26896.1.
L'enzyme GBDCD2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 16 est un fragment
allant de l'acide aminé à la position 1758 à l'acide aminé à la position 2862
de la séquence
d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche L. citreum
NRRL B-
1299 ayant pour référence GenBank 0DX66820.1.
L'enzyme BRS-A de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 17 correspond à la
séquence d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche L.
citreum
NRRL B-1299 ayant pour référence GenBank 0DX66896.1.
L'enzyme BRS-B Al de séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 18 est un fragment
allant de l'acide aminé à la position 39 à l'acide aminé à la position 1313 de
la séquence
d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche L. citreum
NRRL B-
742 ayant pour référence GenBank 0DX65123.1.
L'enzyme BRS-C de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 19 correspond à la
séquence d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche L.
fallax
KCTC 3537 ayant pour référence GenBank ZP_08312597.1.
L'enzyme BRS-D Al de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 20 est un fragment
allant de l'acide aminé à la position 88 à l'acide aminé à la position 1453 de
la séquence
d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche Lb. kunkei
EFB6
ayant pour référence GenBank WP_051592287.
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L'enzyme BRS-E 3,1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 21 est un fragment
allant de l'acide aminé à la position 32 à l'acide aminé à la position 1264 de
la séquence
d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche L.
mesenteroides
KFRI-MG ayant pour référence GenBank AHF19404.1.
L'enzyme BRS-F de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 22 correspond à la
séquence d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche
Fructobacillus tropaeoli ayant pour référence GenBank GAP05007.1.
L'enzyme DSR-G CD2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 23 est un
fragment allant de l'acide aminé à la position 928 à l'acide aminé à la
position 2621 de la
.. séquence d'acides aminés de la forme sauvage de l'enzyme issue de la souche
Lb. kunkeei
DSM 12361 ayant pour référence GenBank KRK22577.1.
Les a-transglucosylases de la famille GH70 selon l'invention peuvent être
obtenues
selon des méthodes connues de l'homme du métier, notamment par la méthode
consistant
à cultiver une cellule exprimant naturellement l'a-transglucosylase ou une
cellule hôte
comprenant un transgène codant pour l'a-transglucosylase et exprimant ladite a-
transglucosylase, et à extraire ladite a-transglucosylase à partir de ces
cellules ou du milieu
de culture dans lequel l'a-transglucosylase a été sécrétée.
Des souches de bactéries recombinantes, par exemple des souches de bacillus
subtillis ou de lactobacillus, sécrétant lesdites a-transglucosylases de la
famille GH70
peuvent être utilisées.
On peut également obtenir les a-transglucosylases de la famille GH70 par
l'intermédiaire de systèmes d'expression acellulaire (en anglais cell free
protein
expression systems).
Dans le procédé de l'invention, l'a-transglucosylase de la famille GH70 est de
préférence une glucane-saccharase de la famille GH70, une saccharase de
branchement
de la famille GH70, ou un mélange de celles-ci.
Dans le présent document, l'expression glucane-saccharase de la famille GH70
parfois abrégée GS se réfère à une a-transglucosylase de la famille GH70
capable
de catalyser la synthèse d'a-glucanes i.e. de polysaccharides composés
exclusivement
d'unités glucosyle liées entre elles par des liaisons alpha. Parmi les glucane-
saccharases,
on peut citer les dextrane-saccharases (parfois abrégé DSR), qui synthétisent
des
dextranes, i.e. des glucanes dont les résidus de la chaine principale sont
liés
majoritairement en alpha-1,6 ; les reuterane-saccharases, qui synthétisent des
reuteranes,
i.e. des glucanes dont les résidus de la chaine principale sont liés en alpha-
1,4 et alpha-
1,6 ; les mutanes-saccharases, qui synthétisent des mutanes, i.e. des glucanes
dont les
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résidus de la chaine principale sont liés majoritairement en alpha-1,3 ; des
alternanes-
saccharase, i.e. des glucanes dont les résidus de la chaine principale sont
liés
alternativement en alpha-1,3 et alpha-1,6. De préférence, l' a-
transglucosylase de la famille
GH70 n'est pas une alternane-saccharase.
Dans le présent document, les termes saccharase de branchement de la famille
GH70 (en anglais branching sucrase , parfois abrégé BRS) ou a-
transglucosylase
de la famille GH70 à activité de branchement ou enzyme de branchement de
la famille
GH70 sont utilisées indifféremment et se réfèrent à une a-transglucosylase
de la famille
GH70 capable de catalyser l'ajout d'unités glucosyle dans la chaine principale
d'un glucane
de type dextrane pré-existant formant des branchements (ou autrement dit des
ramifications). La nature de la liaison de branchement (liaisons alpha-1,2;
alpha-1,3;
alpha-1,4 ou alpha-1,6) et la longueur des chaines d'unités glucosyle
constituant les
branchements varient selon la spécificité de la saccharase de branchement
considérée.
De manière préférée, les saccharases de branchement de la famille GH70 selon
l'invention catalysent des ramifications comprenant de préférence 1 à 3 unités
glucosyle,
de préférence 1 ou 2 unités glucosyle selon des liaisons alpha-1,2 et/ou des
liaisons alpha-
1,3.
Ainsi, dans un mode de réalisation, la partie glucidique du polyglucoside
d'alkyle de
formule (I) se présente sous la forme d'une chaine linéaire comprenant des
ramifications
comportant de 1 à 3 unités glucosyle, de préférence 1 ou 2 unités glucosyle,
lesdites
ramifications étant liées à la chaine linéaire selon des liaisons alpha-1,2
et/ou des liaisons
alpha-1,3.
Les inventeurs ont démontré que, de manière surprenante, certaines a-
transglucosylases de la famille GH70 sont aptes à transférer des unités
glucosyle sur la
partie glucidique d'un glucoside d'alkyle de formule (II) tel que décrit ci-
avant via un
mécanisme d'élongation glucosidique.
Selon un mode de réalisation, l'a-transglucosylase de la famille GH70 est une
glucane-
saccharase de la famille GH70.
Lorsque l'a-transglucosylase de la famille GH70 est une glucane-saccharase de
la
famille GH70, on obtient avantageusement un polyglucoside d'alkyle dont la
partie
glucidique comprend au moins 50%, de préférence 60%, de préférence encore 80%
de
liaisons choisies dans le groupe comprenant des liaisons alpha-1,6 et des
liaisons alpha-
1,3, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1,4.
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En outre, les glucane-saccharases de la famille GH70 selon l'invention rendent
possible l'obtention d'un polyglucoside d'alkyle ayant une longue chaine
glucosidique, avec
n+m tel que défini ci-dessus.
La glucane-saccharase de la famille GH70 de l'invention a de préférence pour
séquence d'acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant SEQ ID
NO
: 1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3,, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6,
SEQ
ID NO :7, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID
NO
: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 et SEQ ID NO: 15.
Les inventeurs ont pour la première fois montré que les glucane-saccharases de
la
famille GH70 de l'invention sont capables de rallonger des glucosides d'alkyle
de formule
(Il) de plus de 3 unités glucosyle à partir de saccharose.
Avantageusement, lorsque la glucane-saccharase de la famille GH70 selon
l'invention a pour séquence d'acides aminés une séquence choisie dans le
groupe
comprenant SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO:
6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO: 12, on obtient un polyglucoside
d'alkyle
de formule (I) dont la partie glucidique comprend au moins 80% de liaisons
alpha-1,6, le
reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1,3.
Avantageusement, lorsque la glucane-saccharase de la famille GH70 selon
l'invention a pour séquence d'acides aminés une séquence choisie dans le
groupe
comprenant SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO:
6, et SEQ ID NO : 12, on obtient un polyglucoside d'alkyle de formule (I) dont
la partie
glucidique comprend au moins 90%, de préférence au moins 95% de liaisons alpha-
1,6, le
reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1,3.
Avantageusement, lorsque la glucane-saccharase de la famille GH70 selon
l'invention a pour séquence d'acides aminés une séquence choisie dans le
groupe
comprenant SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 14, et SEQ ID NO : 15 on obtient un
polyglucoside d'alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au
moins 90% de
liaisons alpha-1,3, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons
alpha-1,6.
Avantageusement, lorsque la glucane-saccharase de la famille GH70 selon
l'invention a pour séquence d'acides aminés une séquence choisie dans le
groupe
comprenant SEQ ID NO : 8 et SEQ ID NO :9, on obtient un polyglucoside d'alkyle
de
formule (I) dont le la partie glucidique comprend au moins 70% de liaisons
alpha-1,6, le
reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1,3.
Avantageusement, lorsque la glucane-saccharase de la famille GH70 selon
l'invention a pour séquence d'acides aminés une séquence choisie dans le
groupe
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comprenant SEQ ID NO : 4 on obtient un polyglucoside d'alkyle de formule (I)
dont la partie
glucidique comprend au moins 50% de liaisons alpha-1,6, le reste des liaisons
étant
avantageusement des liaisons alpha-1,4.
Selon un autre mode de réalisation, l'a-transglucosylase de la famille GH70
selon
l'invention est une saccharase de branchement GH70.
Lorsque l'a-transglucosylase de la famille GH70 est une saccharase de
branchement, on obtient avantageusement un polyglucoside d'alkyle de formule
(I) dont la
partie glucidique comprend au moins 50%, de préférence 60%, de préférence
encore 80%
de liaisons dans le groupe comprenant alpha-1,2, alpha-1,3 et leurs mélanges ;
le reste
des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1,6.
La saccharase de branchement de la famille GH70 selon l'invention a de
préférence
pour séquence d'acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant
SEQ
ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID
NO :21, SEQ ID NO :22, et SEQ ID NO :23.
Avantageusement, lorsque la saccharase de branchement de la famille GH70 a
pour séquence d'acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant
SEQ
ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 20, et SEQ ID NO : 22 on obtient un
polyglucoside d'alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au
moins 80% de
liaisons alpha-1,2, de préférence 100% de liaisons alpha-1,2.
Avantageusement, lorsque la saccharase de branchement GH70 a pour séquence
d'acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant SEQ ID NO : 18,
SEQ
ID NO : 19, et SEQ ID NO : 23 on obtient un polyglucoside d'alkyle de formule
(I) dont la
partie glucidique comprend au moins 80%, de préférence 90%, de préférence
encore 95%,
de préférence encore 98%, de liaisons alpha-1,3, de préférence encore 100% de
liaisons
alpha-1,3.
Avantageusement, lorsque la saccharase de branchement GH70 a pour séquence
d'acides aminés une séquence choisie dans le groupe comprenant SEQ ID NO : 21
on
obtient un polyglucoside d'alkyle de formule (I) dont la partie glucidique
comprend au moins
60% de liaisons alpha-1,2, le reste des liaisons étant avantageusement des
liaisons alpha-
1,6.
Mise en oeuvre du procédé
L'étape i) peut être conduite en mettant en contact simultanément ou
successivement le
glucoside d'alkyle de formule (II) avec plusieurs a-transglucosylases de la
famille GH70.
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Dans un mode de réalisation, l'étape i) comprend une sous-étape io) de mise en
contact
du glucoside d'alkyle de formule (Il) avec un mélange d'une ou plusieurs
glucane-
saccharase(s) GH70 et d'une ou plusieurs enzyme(s) de branchement GH70.
Dans cette sous-étape io), on utilise de préférence un ratio (glucane-
saccharase) :
(saccharase de branchement), exprimé en unité d'activité enzymatique, compris
entre 0,01
et 10, les activités de chacune des enzymes utilisées variant avantageusement
entre 0,2
et 2 U.m1-1.
Sans vouloir être liés par une théorie particulière, les inventeurs pensent
que la
mise en contact d'un glucoside d'alkyle de formule (Il) avec un mélange de
glucane-
saccharase(s) et de saccharase(s) de branchement selon l'invention lors de
l'étape io)
favorise l'amorçage de la réaction d'élongation.
Dans un mode de réalisation, l'étape i) comprend une étape il) de mise en
contact
du glucoside d'alkyle de formule (Il) avec une ou plusieurs glucane-
saccharase(s) de la
famille GH70.
Sans vouloir être liés par une théorie, les inventeurs pensent que ce mode de
réalisation permet dans un premier temps de favoriser l'élongation de la
partie glucidique
sous forme d'une longue chaine linéaire.
Dans un mode de réalisation, l'étape i) comprend la mise en contact du
glucoside
d'alkyle de formule (Il) avec une ou plusieurs glucane-saccharase(s) de la
famille GH70
puis une étape i2) de mise en contact du glucoside d'alkyle obtenu à l'issue
de l'étape ii)
avec une ou plusieurs saccharase(s) de branchement de la famille GH70.
Sans vouloir être liés par une théorie, les inventeurs pensent que ce mode de
réalisation permet dans un premier temps de favoriser l'élongation de la
partie glucidique
sous forme d'une longue chaine linéaire, puis dans un second temps de
favoriser
l'élongation de la partie glucidique sous forme de ramifications.
Ce mode de réalisation a également pour avantage d'augmenter la diversité de
structures chimiques obtenues.
L'utilisation de saccharases de branchement de la famille GH70 selon
l'invention
permet en effet de contrôler le nombre de branchements introduits, en fonction
des
conditions réactionnelles, de sorte à obtenir un polyglucoside d'alkyle de
formule (1) dont
la partie glucidique comprend au moins 50% de liaisons alpha-1,6, le reste des
liaisons
glucosidique étant des liaisons alpha-1,3 et/ou des liaisons alpha-1,2, la
somme des
pourcentages de liaisons alpha-1,6, des pourcentages de liaisons alpha-1,3 et
de
pourcentages de liaisons alpha-1,2 étant égale à 100%.
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On peut par exemple obtenir un polyglucoside d'alkyle de formule (I) dont la
partie
glucidique comprend au moins 60% de liaisons alpha-1,6, au moins 2% de
liaisons alpha-
1,3 et au moins 2% de liaisons alpha-1,6, de préférence entre 2% et 35% de
liaisons alpha-
1,3 et au moins 1% de liaisons alpha-1,2, de préférence entre 2% et 35% de
liaisons alpha-
1,2, la somme des pourcentages de liaisons alpha-1,6, des pourcentages de
liaisons alpha-
1,3 et de pourcentages de liaisons alpha-1,2 étant égale à 100%.
Dans un mode de réalisation particulier, l'étape i) est effectuée en solution
à un pH
contrôlé, en particulier par l'emploi d'une solution tampon.
L'étape i) est avantageusement conduite à une valeur de pH comprise entre 5 et
8.
L'étape i) est avantageusement conduite avec une concentration initiale de
saccharose ou d'un analogue de saccharose comprise entre 20 et 660 g.L-1.
L'étape i) est de préférence réalisée avec un rapport molaire polyglucoside
d'alkyle
de formule (II) : saccharose ou analogue de saccharose compris entre 0,001 et
10, de
préférence entre 0,001 et 5, de préférence 0,001 et 0,3, de préférence entre
0,002 et 0,006.
De manière importante, les inventeurs ont montré que l'élongation de la chaine
peut
être modulée en fonction du rapport molaire polyglucoside d'alkyle de formule
(II) :
saccharose ou analogue de saccharose. Sans vouloir être liés par une théorie
particulière,
les inventeurs considèrent que plus le rapport molaire polyglucosides d'alkyle
de formule
(Il) : saccharose ou analogue de saccharose est grand, moins le saccharose est
disponible
pour être donneur et donc moins l'accepteur est rallongé.
De manière avantageuse, l'étape i) est réalisée avec un rapport molaire
polyglucosides d'alkyle de formule (II) : saccharose ou analogue de saccharose
compris
entre 0,05 et 5.L'étape i) est de préférence mise en oeuvre à une température
comprise
entre 10 C et 80 C.
De préférence, l'étape i) est conduite avec l'a-transglucosylase de la famille
GH70
sous forme solide, en solution, en suspension, ou immobilisée.
Le procédé peut comprendre en outre avantageusement une étape ii) de
purification du polyglucoside d'alkyle de formule (I) obtenu à l'issue de
l'étape i).
Polyglucosides d'alkyle susceptibles d'être obtenus selon le procédé de
l'invention
Le polyglucoside d'alkyle de formule (I) obtenu par la mise en oeuvre du
procédé
tel que défini selon le premier objet de l'invention, en particulier à l'issue
de l'étape i)
constitue un deuxième objet de l'invention.
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L'invention a donc pour deuxième objet un polyglucoside d'alkyle susceptible
d'être
obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de
l'invention, ledit
polyglucoside d'alkyle étant caractérisé en ce qu'il est de formule (I) :
[Glc]m-[Glc]n(-0-R) (I)
dans laquelle :
R représente un groupe alkyle linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé,
comprenant entre 8
et 20 atomes de carbone,
[Glc]m-[Glc]n représente une partie glucidique linéaire ou ramifiée comprenant
n+m unités
glucosyle,
.. n+m étant compris entre 3 et 200.
Le polyglucoside d'alkyle de formule (I) susceptible d'être obtenu par la mise
en
oeuvre du procédé conforme au premier objet de l'invention peut présenter une
grande
diversité structurale, notamment au niveau de sa partie glucidique, en
particulier en termes
de taille, de structure (ramifiée ou non) et de nature des liaisons osidiques.
Ainsi, le polyglucoside d'alkyle de formule (I) du deuxième objet de
l'invention est
tel que défini de manière détaillée dans le premier objet de l'invention, en
particulier, le
nombre d'atomes de carbone du groupe alkyle R, le nombre n+m d'unités
glucosyle au
sein de la partie glucidique [Glc]m-[Glc]n , ainsi que la nature des liaison
au sein des
fractions de la partie glucidique [Glc]m-[Glc]n et celle de la liaison entre
le groupe alkyle R
et la fraction glucidique [Glc]n sont tels que précédemment mentionnés.
Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d'alkyle de formule (I)
susceptible
d'être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de
l'invention,
est un polyglucoside d'alkyle de formule (I) dans lequel R représente un
groupe alkyle
comprenant de 8 à 12 atomes de carbone et dans lequel le nombre n+m est
compris entre
7 et 200, de préférence entre 8 et 200, de préférence entre 9 et 200, de
préférence encore
entre 10 et 200. Dans ce mode de réalisation, n+m peut notamment être compris
entre 7
et 50, de préférence entre 8 et 50, de préférence entre 9 et 50, et de
préférence encore
entre 10 et 50.
Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d'alkyle de formule (I)
susceptible
d'être obtenu par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de
l'invention,
est un polyglucoside d'alkyle de formule (I) dans lequel R représente un
groupe alkyle
comprenant de 12 à 20 atomes de carbone et dans lequel n+m est compris entre 3
et 200,
de préférence entre 4 et 200, de préférence entre 5 et 200, et de préférence
encore entre
10 et 200. Dans ce mode de réalisation, n+m peut notamment être compris entre
3 et 50,
de préférence entre 4 et 50, de préférence entre Set 50, et de préférence
encore entre 10
et 50.
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Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d'alkyle de formule (I)
susceptible
d'être obtenu par du procédé conforme au premier objet de l'invention est un
polyglucoside
d'alkyle de formule (I) dans lequel :
- lorsque R représente un groupe alkyle comprenant de 8 à 12 atomes de
carbone, n+m
est compris entre 7 et 200, de préférence entre 8 et 200, de préférence entre
9 et 200,
de préférence encore entre 10 et 200 et n+m peut notamment être compris entre
7 et
50, de préférence entre 8 et 50, de préférence entre 9 et 50, et de préférence
encore
entre 10 et 50 ; et
- lorsque R représente un groupe alkyle comprenant de 12 à 20 atomes de
carbone, n+m
est compris entre 3 et 200, de préférence entre 4 et 200, de préférence entre
5 et 200,
et de préférence encore entre 10 et 200 et peut notamment être compris entre 3
et 50,
de préférence entre 4 et 50, de préférence entre 5 et 50, et de préférence
encore entre
10 et 50.
Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d'alkyle susceptible d'être
obtenu
par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l'invention est
un
polyglucoside d'alkyle de formule (I) constitué essentiellement d'un mélange
de molécules
de polyglucoside d'alkyle de formule (I), ledit mélange présentant un degré de
polymérisation moyen compris entre 3 et 25, de préférence compris entre 5 et
25, de
préférence compris entre 6 et 25, de préférence entre 7 et 25, de préférence
encore entre
8 et 25. Ce mélange est essentiellement constitué de molécules de
polyglucoside d'alkyle
de formule (I), c'est-à-dire qu'il est constitué d'au moins 90% en poids
desdits
polyglucosides d'alkyle, de préférence d'au moins 95% en poids desdits
polyglucosides
d'alkyle, de préférence encore d'au moins 97% en poids desdits polyglucosides
d'alkyle.
Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d'alkyle susceptible d'être
obtenu
par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l'invention est
un
polyglucoside d'alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au
moins 50%, de
préférence 60%, de préférence encore 80% de liaisons alpha-1,6 ou de liaisons
alpha-1,3,
le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1,4 et/ou de
liaison alpha-
1,2.
Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d'alkyle susceptible d'être
obtenu
par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l'invention est
un
polyglucoside d'alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au
moins 50%, de
préférence au moins 70% de liaisons alpha-1,6, le reste des liaisons étant
avantageusement des liaisons alpha-1,3.
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Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d'alkyle susceptible d'être
obtenu
par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l'invention est
un
polyglucoside d'alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au
moins 60% de
liaisons alpha-1,6, au moins 2% de liaisons alpha-1,3 et au moins 2% de
liaisons alpha-
1,6, de préférence entre 2% et 35% de liaisons alpha-1,3 et au moins 1% de
liaisons alpha-
1,2, de préférence entre 2% et 35% de liaisons alpha-1,2, la somme des
pourcentages de
liaisons alpha-1,6, des pourcentages de liaisons alpha-1,3 et de pourcentages
de liaisons
alpha-1,2 étant égale à 100%.
Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d'alkyle susceptible d'être
obtenu
par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l'invention est
un
polyglucoside d'alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au
moins 90% de
liaisons alpha-1,3, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons
alpha-1,6.
Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d'alkyle susceptible d'être
obtenu
par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l'invention est
un
polyglucoside d'alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au
moins 50% de
liaisons alpha-1,6, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons
alpha-1,4.
Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d'alkyle susceptible d'être
obtenu
par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l'invention est
un
polyglucoside d'alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au
moins 70% de
liaisons alpha-1,6, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons
alpha-1,3.
Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d'alkyle susceptible d'être
obtenu
par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l'invention est
un
polyglucoside d'alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au
moins 80% de
liaisons alpha-1,2, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons
alpha-1,3.
Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d'alkyle susceptible d'être
obtenu
par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l'invention est
un
polyglucoside d'alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au
moins 80%, de
préférence 90%, de préférence encore 95%, de préférence encore 98%, de
liaisons alpha-
1,3, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1,2.
Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d'alkyle susceptible d'être
obtenu
par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l'invention est
un
polyglucoside d'alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au
moins 80%, de
préférence 90%, de préférence encore 95%, de préférence encore 98%, de
liaisons alpha-
1,3, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons alpha-1,2.
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Dans un mode de réalisation, le polyglucoside d'alkyle susceptible d'être
obtenu
par la mise en oeuvre du procédé conforme au premier objet de l'invention est
un
polyglucoside d'alkyle de formule (I) dont la partie glucidique comprend au
moins 60% de
liaisons alpha-1,2, le reste des liaisons étant avantageusement des liaisons
alpha-1,6.
Utilisation du polyglucoside d'alkyle susceptible d'être obtenu par le procédé
de l'invention
L'invention a pour troisième objet l'utilisation d'un polyglucoside d'alkyle
susceptible
d'être obtenu selon le procédé conforme à l'invention ou tel que défini dans
le deuxième
objet de l'invention, à titre de surfactant.
Utilisation des a-transglucosylases selon l'invention pour l'élongation
glucosidique d'un
glucoside d'alkyle.
L'invention a pour quatrième objet l'utilisation d'une a-transglucosylase de
la famille GH70
telle que définie au premier objet de l'invention, en particulier d'une
glucane-saccharase
de la famille GH70 ou d'une saccharase de branchement de la famille GH70 telle
que
définie au premier objet de l'invention, pour l'élongation glucosidique d'un
glucoside
d'alkyle, en particulier d'un glucoside d'alkyle de formule (II) tel que
défini au premier objet
de l'invention.
La présente invention est illustrée par les exemples de réalisation suivants,
auxquels elle
n'est cependant pas limitée.
EXEMPLES
Exemple 1: Enzymes, organismes d'origine et spécificité
Les enzymes utilisées sont listées dans le Tableau 1.
La séquence SEQ ID NO :3 correspond au mutant de l'enzyme DSR-M 3.5 sur la
position
624 où le tryptophane sauvage est remplacé par une alanine.
Tableau 1: a-transglucosylases GH70 et spécificités de liaisons lors de la
synthèse du
polymère naturel. P :polymerase i.e. glucane-saccharase GH70 ; B : saccharase
de
branchement GH70 ( Branching sucrase en anglais) ; Bif : Bifonctionnelle
(enzyme
ayant deux domaines catalytiques) ; nd= non déterminé.
[Table 1]
Nom Spécificité réactionnelle
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SEQ ID
NO: B/P a-1.2 a-1.3 a-1.6 a-1.4
1 DSR-M Al P - - 100% -
2 DSR-M A5 P - - 100% -
3 DSR-M A5 -
P - - 100%
W624A
4 GS-A P 56% 44%
GS-B P 100%
6 GS-C P 100%
7 GS-D P
8 GS-E P 20% 80%
9 GS-F Al P - 18% 82% -
GS-FS P - 100% - -
11 DSR-G Bif - 37% 63% -
12 DSR-G CD1 P - - 100% -
13 ASR Al P - 55% 45% -
14 GTF-SI P - 100% - -
GTF-J P - 95% 5% -
16 GBD-CD2 B 100% - - -
17 BRS-A B 100% - -
18 BRS-B Al B - 100% - -
19 BRS-C B - 100% - -
BRS-D A1 B 100% - - -
21 BRS-E Al B 100% - - -
22 BRS-F B 100% - - -
23 DSR-G CD2 B - 100% - -
Exemple 2 : Expression hétérologue des enzymes chez Escherichia coui
Les gènes codant pour les enzymes citées ci-dessus sont clonés dans des
vecteurs
permettant l'expression recombinante chez E. cou, sous le contrôle de
promoteurs pBad
5 ou pET.
Les enzymes recombinantes sont produites à partir des cellules d'E. cou/ BL21
DE3 Al ou
BL21 DE3 Star transformées avec le plasmide contenant le gène des enzymes
ciblées
(voir Tableau 2).
[Table 2]
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SEQ Enzyme Plasmide Conditions du milieu
Tampon d'activité
ID ZYM5052 modifié
NO:
Gly Glu Inducteur
1 DSR-M Acetate 50mM
Al pET55 1% 0% 0,1% ci-Lac pH=5,75
2 Acetate 50mM
DSR-M A5
pET55 1% 0% 0,1% ci-Lac pH=5,75
3 DSR-M A5 Acetate 50mM
W624A pET55 1% 0% 0,1% ci-Lac pH=5,75
4 Acetate 50mM
GS-A 0,5% 0,05%
pET21 a 0,2% ci-Lac pH=5,75
pET21 a Acetate 50mM
GS-B 0,5% 0,05%
0,2% ci-Lac pH=5,75
6 pET21 a Acetate 50mM
GS-C 0,5% 0,05%
0,2% ci-Lac pH=5,75
7 pET21 a Acetate 50mM
GS-D 0,5% 0,05%
0,2% ci-Lac pH=5,75
8 pET21 a Acetate 50mM
GS-E 0,5% 0,05%
0,2% ci-Lac pH=5,75
9 pET53 1% 0% 1% ci-Lac Acetate 50mM
GS-F Al
pH=5,75
pET21 a Acetate 50mM
GS-FS 0,5% 0,05%
0,2% ci-Lac pH=5,75
11 DSR-G pET53 1% 0% 1% ci-Lac Acetate 50mM
pH=5,75
12 DSR-G pET53 1% 0% 1% ci-Lac Acetate 50mM
CD1 pH=5,75
13 0,01%
ASR A1 pBAD49 0,5% 0,05% Acetate 50mM pH=5,2
L-Ara
14 Phosphate 10mM
GTF-SI
pET21a(+) 1% 0% 1% ci-Lac pH=6,5
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15 Phosphate
10mM
GTF-J
pET21a(+) 1% 0% 1% a-Lac pH=6,5
16 Acetate
50mM
GBD-CD2 pET53 1,5% 0,05% 1% a-Lac
pH=5.75
17 0,01% L- Acetate
50mM
BRS-A pBAD49 0,5% 0,05% Ara pH=5,75
18 Acetate
50mM
BRS-B 3,1 pET55 1% 0% 0,1% a-Lac pH=5,75
19 Acetate
50mM
BRS-C pET55 1% 0% 0,1% a-Lac pH=5,75
20 Acetate
50mM
BRS-D 3.1 pET53 1% 0% 1% a-Lac pH=5,75
21 Acetate
50mM
BRS-E 3,1 pET60 1% 0% 0,1% a-Lac pH=5,75
22 pET2I a Acetate
50mM
BRS-F 0,5% 0,05%
0,2% a-Lac pH=5,75
23 DSR-G pET53 1% 0% 1% a-Lac Acetate
50mM
CD2 pH=5,75
Tableau 2 : plasmides des enzymes utilisées et systèmes d'expression adaptés
aux
différentes enzymes. (Gly : Glycérol ; Glu: Glucose ; a-Lac : a-Lactose ; L-
Ara : L-
Arabinose)
Trois cents microlitres du mélange de transformation permettent d'ensemencer
un volume
de 30 mL de préculture en milieu LB (abrégé de l'anglais Lysogeny Broth ),
supplémenté
avec 100 pg.mL-1 d'ampicilline. Chaque préculture est incubée à 37 C pendant
10 heures
sous une agitation de 150 rpm. Des cultures d'1 L en milieu ZYM5052 modifié
dont les
caractéristiques sont présentées dans le Tableau 2 sont ensemencées à une
densité
optique (DO) D0A=600. initiale de 0,05 à partir de la préculture de la veille,
puis mises à
incuber 26 heures à 21 C et à 150 rpm.
En fin de fermentation, les milieux de culture sont centrifugés pendant 15 min
à 6500 rpm
et à une température de 4 C. Les culots cellulaires sont concentrés à une DO
de 80 dans
du tampon d'activité (voir Tableau 2). Les cellules sont ensuite cassées aux
ultrasons
selon le protocole suivant : 5 cycles de 20 secondes à 30% de la puissance
maximale de
la sonde, à froid (bain de glace), espacés de 4 minutes de repos dans la
glace. Les
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surnageants de sonication contenant les enzymes d'intérêt solubles sont
ensuite récupérés
après 30 minutes de centrifugation (10000 rpm, 10 C) et conservés à 4 C.
Exemple 3 : Détermination de l'activité enzymatique par dosage des sucres
réducteurs au DNS.
L'activité enzymatique des glucane-saccharases et des saccharases de
branchement est
déterminée en mesurant la vitesse initiale de production des sucres réducteurs
à l'aide de
la méthode à l'acide dinitrosalicilique (DNS) (Miller, 1959).
Une unité enzymatique représente la quantité d'enzyme qui libère une pmole de
fructose
par minute, à 30 C, pour une concentration initiale de saccharose de 100 g.L'
dans les
conditions de tampon d'activité adéquate.
Au cours d'une cinétique dl mL de volume, 100 pL de milieu réactionnel sont
prélevés et
la réaction est stoppée par ajout d'un volume équivalent de DNS. Les
échantillons sont
ensuite chauffés 5 min à 95 C, refroidis dans la glace, dilués au demi dans
de l'eau, et
l'absorbance est lue à 540 nm. Une gamme étalon de 0 à 2 g.L' de fructose
permet d'établir
le lien entre la valeur d'absorbance et la concentration en sucres réducteurs.
Réactions d'accepteur
Les réactions d'accepteurs sont réalisées dans un volume compris entre 1 mL et
15 mL et
pour une concentration finale en saccharose comprise entre 146 et 730 mM. Les
concentrations en alkylpoly-glucosides sont dépendantes de leur solubilité et
varient entre :
20 et 50 mM pour l'octyl-monoglucoside,
10 et 30 mM pour le décyl-monoglucoside,
1 et 5 mM pour le dodécyl-monoglucoside,
10 et 20 mM pour le dodecyl diglucoside.
Dans le cas du triton CG110 (mélange commercial d'APGs en C8 et C10), la
réaction a été
réalisée en présence de 2 mg à 10 mg de Triton CG110 par mL de réaction.
La réaction est initiée par l'addition d'un volume de lysat cellulaire
suffisant pour obtenir
une activité enzymatique en réaction de 1 U.ml_'. Les réactions sont incubées
à 37 C et
agitées à 800 rpm. Au bout de 24h, les enzymes sont dénaturées à 95 C pendant
5 min.
Les réactions sont conservées à -18 C avant analyse des produits de la
réaction par
chromatographie liquide haute performance (CLHP).
Purification des produits de réaction
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Une étape de prépurification des hydroxy-lipides glucosylés issus de l'acide
11-hydroxy-
undécanoïque est réalisée par flash chromatographie grâce à un système
REVELERIS
X2 Flash Chromatography System (GRACE, USA) équipé d'une colonne 018 de 80 g.
Les
produits de glucosylation sont séparés des sucres libres résiduels dans les
conditions
suivantes :
-débit de 60 ml.min-1 , détection ELSD
-0,5 volumes de colonne (VO) à 100% H20
-gradient passant de 0% H20 ultra-pure à 50% acétonitrile en 8,5 volumes de
colonne (VO)
-1 VO à 50% acétonitrile
-retour à 100% H20 ultra pure en 0,2 VO
-équilibration à 100% H20 ultra pure pendant 1,5 VO
Les fractions contenant les produits de réactions élués entre 4 et 10 VO sont
collectées,
partiellement évaporés à l'évaporateur rotatif puis lyophilisés. Les
échantillons sont stockés
à température ambiante et à l'abri de l'humidité.
Techniques analytiques
Pour l'analyse en CLHP, les milieux réactionnels sont dilués au demi dans de
l'éthanol
absolu. Cette dilution permet entre autres l'élimination des potentiels
polymères de haute
masse molaire par précipitation.
La séparation des accepteurs lipidiques et de leurs formes glucosylées est
effectuée par
chromatographie en phase inverse avec une colonne Synergi TM Fusion-RP
(porosité de 80
A, granulométrie de 4 pm, greffage 018 avec terminaison polaire, Phenomenex,
USA).
Cette colonne est maintenue à 30 C sur un système CLHP Thermo U3000 couplé à
un
détecteur Corona CAD Véo (Charged Aerosol Detector) (Thermo Scientific, USA).
La
température de nébulisation est fixée à 50 C et le filtre réglé à 3,2
secondes.
La phase mobile est composée d'un mélange eau ultrapure (solvant A) /
acétonitrile de
qualité CLHP (solvant B) tous deux contenant 0,05% (v/v) d'acide formique.
L'élution est
réalisée à un débit de 1 mL.min-1 selon le gradient suivant :
- Entre 0 min et 5 min, une première phase d'élution avec 0% (v/v) de la voie
B permet
l'élimination des sucres simples résiduels (fructose, glucose, leucrose,
saccharose
résiduels ou éventuels oligosaccharides courts) ;
- Une seconde phase de gradient allant de 0% est réalisée à 100% de la voie
B pendant
25 minutes permet de séparer les différents composés lipidiques glucosylés ;
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- Une dernière phase de 5 minutes à 100% de la voie B permet la
régénération de la
colonne.
Analyse par RMN
La caractérisation des produits de glucosylation des différents APG est
réalisée par RMN.
Les produits sont dilués dans D20 et en présence de triméthylsilylpropanoate
de sodium
deutéré (TSP-d4) utilisé comme référence interne. Les spectres 1H ont été
enregistrés sur
un équipement Bruker Avance 500MHz à 298K avec une sonde 5 mm z-gradient TBI.
Les
données ont été acquises et traitées avec le logiciel TopSpin 3.
Exemple 4: Synthèse d'alkyle glucosides
4.1. Protocole général
26 a-transglucosylases de la famille GH70 ont été testées pour leur aptitude à
rallonger
des alkyl-glycosides de structures et de tailles différentes :
- Octyl-P-D-glucoside, 08G1
- Decyl- p -D-Glucoside, 010G1,
- Dodecyl- p -D-Glucoside, 012G1
- Dodécyl- p -D-maltoside, 012G2,
- Hexadecyl maltoside, 016G2
- Triton CG110 (DuPont, USA), mélange contenant majoritairement du 08G1, du
010G1 et
minoritairement des APGs de degré de polymérisation supérieur.
Les enzymes testées sont répertoriées dans le Tableau 3. Elles ont toutes été
produites
sous forme recombinante et exprimées chez Escherichia coll.
Les extraits enzymatiques obtenus par fermentation sont utilisés bruts après
cassage des
cellules et centrifugation des débris cellulaires .
Les réactions d'accepteurs mettant en jeu des GSs ont été réalisées dans un
volume de 1
à 10 mL à des concentrations variables en APG dépendantes de leur solubilité
dans l'eau
(entre 5mM pour 012G1 et 30 mM pour C8G1) et des concentrations de saccharose
variant
entre 146 mM (50 g.L-1) et 1316 mM (450 g.L-1).
Toutes les réactions ont été réalisées en présence dl U.mL-1 d'enzyme, d'un
tampon
Acétate Na 50mM pH=5,75, incubées à 37 C et sous une agitation de 800 rpm. Au
bout
de 24 heures les enzymes sont dénaturées par incubation à 95 C pendant 5
minutes. En
vue de leurs analyses par CLHP-CAD, les milieux réactionnels sont dilués au
1/2 dans de
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l'éthanol et centrifugés 5 min à 11 000 g afin d'éliminer les glucanes co-
produits de réaction
et les protéines floculées.
La séparation des différents produits de réaction est effectuée par
chromatographie en
phase inverse avec une colonne SynergiTM Fusion-RP 250 mm x 2 mm (porosité :
80 A,
.. granulométrie : 4 pm, Phenomenex, USA). Cette colonne est maintenue à 30 C
sur un
système CLHP Thermo Ultimate 3000 équipé d'un détecteur Corona Véo. La phase
mobile
est composée d'un mélange eau ultrapure (solvant A) / acétonitrile de qualité
LC-MS
(solvant B) contenant chacun 0,05% (v/v) d'acide formique. La séparation est
assurée en
35 min par un gradient linéaire, en solvant B, défini comme suit : 0 min, 0%
(v/v) ; 5 min,
0% ; 35 min, 100`)/0.
4.2. Résultats
Les résultats obtenus lors de la glucosylation du C8G1 par les a-
transglucosylases de la
famille GH70 utilisatrice de saccharose sont présentés dans les [Fig. 2A]
Figures 2A et
[Fig. 2B] 2B.
Les [Fig. 2A] Figures 2A et [Fig. 2B] 2B montre les profils d'élongation du
substrat C8G1
obtenus avec les a-transglucosylases de la famille GH70 qui utilisent le
saccharose comme
substrat.,
[Fig. 2A] La Figure 2A montre les profils obtenus avec les glucane saccharases
dans le
Chromatogramme A: réactions avec [C8G1] = 30 mM, [saccharose] = 585 mM pour
les
glucane-saccharases DSR-M 3,1 (SEQ ID NO: 1), DSR-M 3.5 (SEQ ID NO : 2), DSR-M
3.5
W624A (SEQ ID NO: 3), GS-B (SEQ ID NO: 5), GS-C (SEQ ID NO: 6), GS-D (SEQ ID
NO : 9) et GS-FS 3,1 (SEQ ID NO : 10) et 1170 mM de saccharose pour les
enzymes GS-
A SEQ ID NO :4, GS-D (SEQ ID NO :7), DSR-G (SEQ ID NO :11), DSR-G CD1 (SEQ ID
NO :12). La [Fig. 2B] Figure 2B montre les profils obtenus avec les
saccharases de
branchement BRS-A (SEQ ID NO : 17), BRS-B Al (SEQ ID NO : 18), BRS-C (SEQ ID
NO:
19), BRS-D Al (SEQ ID NO :20), BRS-E Al (SEQ ID NO :21), BRS-F (SEQ ID NO
:22),
DSR-G CD2 (SEQ ID NO: 23), GBD-CD2 (SEQ ID NO: 16) illustrés dans le
chromatogramme B, à partir de [C8G1] = 20 mM et de [saccharose] = 585 mM.
L'ensemble des enzymes testées a permis l'élongation de l'APG substrat.
On observe que les profils de produits obtenus sont différents selon la classe
d'enzymes
utilisées (glucane saccharases GH70 et/ou saccharases de branchement GH70).
Les enzymes de branchement [Fig. 2B] (Figure 2B) permettent l'ajout de 1 à 7
unités
glucosyle sur le C8G1 selon les enzymes considérées, avec des taux de
conversion variant
de 20% à 60% dans les conditions testées.
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Avec les glucane-saccharases [Fig. 2A] (Figure 2A), les tailles des APG
obtenus sont
beaucoup plus étendues, les produits portant un nombre important d'unités
glucosyle.
A titre de comparaison, [Fig. 3] la Figure 3 présente les profils d'élongation
de 08G1 obtenu
avec i) la glucane-saccharase GS-C (SEQ ID NO :6) en présence de saccharose et
d'a-
cyclodextrines, et ii) la CGTase de Bacillus macerans (non conforme à
l'invention) en
présence d'a-cyclodextrines dans des conditions similaires aux travaux de
Svenson et
collaborateurs (Svenson et al., 2009). Les profils montrent clairement le
caractère
polymérique de la tête glucosidique synthétisée par la glucane-saccharase DSR-
M Al
(SEQ ID NO :1) (et l'ensemble des glucane saccharases testées), en contraste
avec le
profil oligomérique des APG obtenus avec la CGTase.
Saccharases de branchement
Par ailleurs, les APG produits par les glucane-saccharases peuvent eux-mêmes
être
utilisés en tant que substrats par les saccharases de branchement.
Ces dernières permettent alors de décorer les têtes glucidiques par des
unités
glucosyle liées en a-1,2 ou a-1,3.
Ceci est illustré par [Fig. 4] la Figure 4 où l'on observe une modification du
profil de produits
obtenus avec la glucane-saccharase DSR-M Al (SEQ ID NO :1) seule par rapport
au profil
de produits obtenus avec les enzymes de branchement BRS-A (SEQ ID NO :17) et
BRS-
B Al (SEQ ID NO :18) utilisées dans une seconde étape après ajout de
saccharose
supplémentaire.
Les APG produits par l'ensemble des enzymes de type polymérase ont été
purifiés et
caractérisés par RMN 1H, enregistrés sur un équipement Bruker Avance 500MHz à
298K
avec une sonde 5 mm z-gradient TBI. Les données ont été acquises et traitées
grâce au
logiciel TopSpin3. Le pourcentage de chaque liaison est calculé grâce aux
intensités
relatives des protons anomériques des unités glucosyle engagées dans une
liaison avec
l'APG par intégration de l'aire des pics. Le DP moyen est déterminé par la
somme de
l'intensité relative de ces mêmes protons anomériques en prenant le proton H1
du premier
sucre lié à la chaine alkyle en conformation beta (O = 4,5 ppm) comme
référence.
Les résultats obtenus présentés en Tableau 3 montrent la possibilité de
moduler le DP
moyen par le choix des concentrations initiales en substrats et le ratio
molaire
(saccharose/APG) et l'enzyme utilisée.
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Tableau 3 : caractéristiques structurales des APG à très longues têtes
glucidiques.
Conditions de synthèse [C8G1] = 30 mM, [saccharose] = 585 mM pour les enzymes
SEQ
ID 1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :9,
SEQ ID
NO :10 et 1170 mM pour les enzymes SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :7, SEQ ID NO :11,
SEQ
ID NO :12.
[Table 3]
SEQ ID pourcentage liaison
Enzyme(s) DPmoy
NO a-1,2 a-1,3 a-1,4 a-1,6
1 DSR-M A1, 100% 10,04
[sacch]=200g/L
1 DSR-M A1, 4% 96% 11,35
[sacch]=400g/L
2 DSR-M A5 100% 8,81
3 DSR-M A5 W624A 100% 9,35
4 GS-A 43% 57% 5,59
5 GS-B 1% 99% 17,89
6 GS-C 100% Nd
7 GS-D 31% 69% 3,97
9 GS-F A1 12% 88% 9,65
GS-FS 100% 2,24
11 DSR-G 29% 71% 12,52
12 DSR-G CD1 5% 95% 20,22
1+17 DSR-M Al+ BRS-A 20% 3% 77% 11,05
1+18 DSR-M Al + BRS-B Al 2% 32% 66% 12,48
[Fig. 5] La Figure 5 montre les profils d'élongation obtenus avec l'enzyme DSR-
M A1 (SEQ
10 ID NO :1) avec des substrats de géométries différentes en termes de
taille de chaine alkyle
(C8 à C16) et de tête glucidique (mono, diglucoside ou oligoglucosides).
La glucane saccharase a permis l'élongation de l'ensemble de ces accepteurs.
Les résultats montrent également l'influence de la taille des accepteurs. Plus
la chaine
alkyle est longue (i.e. moins sa solubilité est grande) moins la glucosylation
est efficace
dans les conditions réactionnelles testées.
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Cet effet est contrebalancé par l'augmentation de la taille de la tête
glucosidique (différence
de glucosylation de C12G1 et de C12G2). Cela montre l'importance de la
maitrise des
conditions de synthèse pour une élongation efficace des APG à chaine alkyle
longue.
Exemple 5 : Contrôle du profil d'élongation
5.1. Etude de l'influence du rapport molaire glucoside d'alkyle accepteur :
saccharose sur
le profil d'élongation
5.1.1 Matériel et méthodes
Dans une première série d'expériences, on étudie l'influence du rapport
molaire glucoside
d'alkyle accepteur (i.e. glucoside d'alkyle de formule (II)) : saccharose ou
analogue de
saccharose sur le profil d'élongation du glucoside d'alkyle accepteur C8G1 ou
C12G2 par
l'enzyme DSR-M 3.1 (SEQ ID NO: 1).
Dans cette première série d'expérience, les concentrations en C8G1 ou C12G2
sont fixées
à 10 g/L (respectivement 34,3 mM et 19,6 mM) et la concentration en saccharose
est
modulée entre 233,4 g/L (684 mM) et 2,3 g/L (6,8 mM) de telle manière que le
ratio molaire
glucosides d'alkyle accepteur : saccharose soit de 0,05; de 0,1 ; de 0,25; de
0,5; de 1 ;
de 2 ; ou bien de 5.
Témoin : les réactions témoin représentent les mélanges de C8G1 ou C12G2 à une
concentration de 10 g/L et de 233.4g/L de saccharose sans ajout d'enzyme
5.1.2. Résultats
Les résultats de cette première série d'expériences sont présentés en Figure 6
et
confirment la possibilité de moduler le profil d'élongation en fonction du
rapport molaire
glucoside d'alkyle accepteur : saccharose entre 0.05 et 5.
[Fig. 6] La Figure 6 montre les profils d'élongation obtenus avec l'enzyme DSR-
M 3.1
(SEQ ID NO: 1) avec des ratios molaires décroissants entre C8G1 et Saccharose
(Figure 6A) et entre C12G2 et saccharose (Figure 6B). Les résultats montrent
l'effet du
ratio glucoside d'alkyl accepteur : saccharose sur l'élongation du glucoside
d'alkyl
accepteur : plus le rapport molaire est élevé, moins le glucoside d'alkyle
accepteur est
rallongé. Les résultats montrent donc que le DP moyen du polyglucoside
d'alkyle obtenu
est inversement proportionnel au rapport molaire glucoside d'alkyl accepteur :
saccharose.
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Par ailleurs, la Figure 6A montre que pour le 08G1, le profil d'élongation
varie
significativement pour des rapports molaires compris entre 0,05 et 2, tandis
que les
rapports molaires supérieurs à 2 ont peu d'influence sur le profil
d'élongation/
La Figure 6B montre que pour le 012G2, le profil d'élongation varie
significativement pour
des rapports molaires compris entre 0,05 et 5.
5.2. Etude de l'influence du ratio d'activité glucane-saccharase: saccharase
de
branchement sur le profil d'élongation
5.2.1. Matériel et méthodes
Dans une deuxième série d'expériences, on étudie l'influence du ratio
d'activité glucane-
saccharase: saccharase de branchement sur le profil d'élongation du glucoside
d'alkyle
accepteur 08G1
Dans cette seconde série d'expérience, la glucane-saccharase est DSR-M
(SEQ ID NO: 1) et la saccharase de branchement BRS-A (SEQ ID NO: 18) ou BRS-B
Al
(SEQ ID NO : 19). La concentration de 08G1 est fixée à 10 g/L et la
concentration de
saccharose à 100g/L. Les quantités de DSR-M Al et de BRS-A ou de BSR-B sont
modulés
de sorte que les ratio DSR-M 1 : BRS-A et DSR-M 1 : BRS-B Al exprimé en unité
d'activité enzymatique soit de de 0,1 ; de 0,25 ; de 0,5 ; de 1 ; de 2 ; de 5
ou bien de 10,
en respectant une activité totale (DSR-M Al + BRS-A ou BRS-B Ai) de 1 U/mL.
Témoin : les réactions témoin représentent le mélange de C8G1 à une
concentration de
10 g/L et de 100 g/L de saccharose sans ajout d'enzyme
5.2.2. Résultats
Les résultats de cette seconde série d'expériences sont présntés en Figure 7
et confirment
la possibilité de moduler le profil d'élongation en fonction du ratio
d'activité enzyme
d'élongation : enzyme de branchement.
[Fig. 7] La Figure 7 montre les profils d'élongation obtenus avec l'enzyme DSR-
M
(SEQ ID NO: 1) en co-catalyse avec l'enzyme de branchement BRS-A (SEQ ID NO:
18)
(Figure 7A) ou avec l'enzyme de branchement BRS-B Al (SEQ ID NO: 19) (Figure
7B).
Les résultats montrent l'effet du ratio d'activité glucane-saccharase :
saccharase de
branchement : plus ce ratio d'activité est élevé, plus le glucoside d'alkyle
accepteur est
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rallongé. Les résultats montrent donc que le DP moyen du polyglucoside
d'alkyle obtenu
est proportionnel au ratio d'activité glucane-saccharase : saccharase de
branchement.
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