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DESCRIPTION
MICROCOMPARTIMENTS CELLULAIRES COMPRENANT DES CELLULES HUMAINES EN
COURS DE DIFFERENCIATION CARDIAQUE, TISSUS OBTENUS A PARTIR DE CES
MICROCOMPARTIMENTS ET UTILISATIONS
Domaine technique
L'invention concerne le traitement des maladies cardiaques, notamment de
cardiopathies
ischémiques, par l'utilisation de tissus cardiaques spécifiques obtenus à
partir de
microcompartiments cellulaires particuliers comprenant des cellules humaines
exprimant des
gènes exprimés au cours de la différenciation cardiaque.
Art antérieur
Selon l'Organisation Mondiale de la Santé, les maladies cardiovasculaires, et
en particulier les
cardiopathies ischémiques (qui conduisent généralement à des infarctus du
myocarde), sont
la principale cause de décès dans le monde (Thomas, H. et al. Global Atlas of
Cardiovascular
Disease 2000-2016: The Path to Prevention and Control. Glob. Heurt 13, 143-163
(2018)).
Actuellement, il n'existe aucune solution satisfaisante pour prévenir ou
traiter les
conséquences des ischémies cardiaques et en particulier pour traiter les
nécroses du muscle
cardiaque responsables d'insuffisances cardiaques et de risques d'arrêts du
coeur.
Récemment, des recherches ont été menées sur l'utilisation de cardiomyocytes
dérivés de
cellules souches pluripotentes humaines, les hPSC-CM, qui comprennent à la
fois des cellules
souches embryonnaires humaines et des cellules souches pluripotentes induites,
pour
régénérer les tissus cardiaques perdus ou endommagés afin d'éviter ou de
traiter
l'insuffisance cardiaque associée (Desgres, M. & Menasché, P. Clinical
Translation of
Pluripotent Stem Cell Therapies: Challenges and Considerations. Ce!! Stem Ce!!
25, 594-606
(2019) ; Bertero, A. & Murry, C. E. Hallmarks of cardiac regeneration. Nat.
Rev. Cardiol. 15,
579-580 (2018) ; Jiang, B., Yan, L., Shamul, J. G., Hakun, M. & He, X. Stem
Cell Therapy of
Myocardial lnfarction: A Pronnising Opportunity in Bioengineering. Adv. Ther.
3, 1900182
(2020) ; Liew, L. C., Ho, B. X. & Soh, B. S. Mending a broken heart: Current
strategies and
limitations of cell-based therapy. Stem Ce!! Res. Ther. 11, 1-15 (2020)).
Ces cardiomyocytes peuvent être utilisés pour d'autres applications notamment
comme
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stimulateurs cardiaques biologiques pour le traitement du dysfonctionnement du
noeud
sinusal (Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H. & Keller, G. M.
Human Pluripotent Stem
Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct
Mesoderm
Populations. Ce!! Stem Ce!! 21, 179-194.e4 (2017)), ou pour traiter les
cardiopathies
congénitales, telles que les anomalies septales (Devalla, H. D. & Passier, R.
Cardiac
differentiation of pluripotent stem cells and implications for modeling the
heart in health and
disease. Sci. Trans!. Med. 10, 1-14 (2018)) ou encore pour la modélisation de
maladies, ou
pour tester des médicaments et candidats médicaments (Tzatzalos, E., Abilez,
O. J., Shukla, P.
& Wu, J. C. Engineered heart tissues and induced pluripotent stem cells: Macro-
and
microstructures for disease modeling, drug screening, and translational
studies. Adv. Drug
Delly. Rev. 96, 234-244 (2016)).
On estime que la quantité de cellules nécessaire pour régénérer les tissus
cardiaques
endommagés d'un patient après un infarctus du myocarde est d'environ 1
milliard (Laflamme,
M. A. & Murry, C. E. Heart regeneration. Nature 473, 326-335 (2011)) ce qui
rend l'utilisation
de cardiomyocytes dérivés d'hPSC-CM en thérapie cellulaire cardiaque
actuellement
impossible à une échelle clinique adaptée. En effet, la production à l'échelle
industrielle de
tissus cardiaques est complexe car il faut réaliser un compromis entre
conditions de culture
suffisamment douces pour la survie et le bon fonctionnement des tissus et
contraintes de
cultures à grands volumes qui immanquablement exposent les cellules à des
stress non
physiologiques (typiquement le stress hydrodynamique dans le cadre de la
culture liquide en
bioréacteurs). Les procédés de production de cardiomyocytes à partir d'hPSC
présentent en
particulier les problèmes suivants :
- Une mauvaise formation des agrégats d'hPSC dans les cultures en
suspension avant la
différenciation en cardiomyocytes : en effet la formation initiale des
agrégats d'hPSC et
l'homogénéité sont cruciales pour la reproduction cellulaire et donc pour la
qualité du tissu
cardiaque obtenu après différenciation ;
- Une perte importante de cellules due à la sensibilité des hPSC à la
contrainte de cisaillement
et aux impacts lors de la culture en bioréacteur (Lam, A. T. L. et al.
Conjoint propagation and
differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes in a defined
microcarrier
spinner culture. Stem Ce!! Res. Ther. 5, 1-15 (2014)) ;
- L'impossibilité de combiner une amplification à grande échelle des hPSC
et une
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différenciation cardiaque (Le, M. N. T. & Hasegawa, K. Expansion culture of
human pluripotent
stem cells and production of cardiomyocytes. Bioengineering 6, (2019)).
Les solutions connues pour limiter ces inconvénients lors de la
différenciation cardiaque en
suspension dans un bioréacteur nécessitent :
- soit l'utilisation de micro-supports, ainsi que l'arrêt temporaire de
l'agitation (Ting, S., Chen,
A., Reuveny, S. & Oh, S. An intermittent rocking platform for integrated
expansion and
differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes in suspended
microcarrier
cultures. Stem Ce!! Res. 13,202-213 (2014))
- soit l'utilisation de lignées cellulaires moins sensibles au cisaillement
lors de la différenciation
cardiaque (Laco, F. et al. Selection of human induced pluripotent stem cells
lines optimization
of cardiomyocytes differentiation in an integrated suspension microcarrier
bioreactor. Stem
Ce!! Res. Ther. 11,1-16 (2020)).
Ces solutions ne sont toutefois pas optimales. En particulier :
- les micro-supports laissent encore les cellules exposées à des
contraintes mécaniques et qui
peuvent être difficiles à retirer,
- l'arrêt de l'agitation ne permettent pas une diffusion uniforme des
nutriments et produits
nécessaires à la différenciation, et
- la limitation à une unique lignée cellulaire de départ est extrêmement
contraignante et
limitative.
On sait également que la perte de cellules au cours de la différenciation en
cardiomyocytes
peut également être réduite en effectuant une culture directement dans de
l'hydrogel en vrac
(Kerscher, P. et al. Direct Production of Human Cardiac Tissues by Pluripotent
Stem Cell
Encapsulation in Gelatin Methacryloyl. ACS Biomater. Sci. Eng. 3,1499-1509
(2017) ; Li, Q. et
al. Scalable and physiologically relevant microenvironments for human
pluripotent stem cell
expansion and differentiation. Biofabrication 10, (2018)), mais ces méthodes
ne sont pas
compatibles avec la culture en bioréacteur classique. Pour rendre la méthode
compatible avec
des bioréacteurs utilisés dans l'industrie, des essais ont été réalisés en
encapsulant les cellules
dans l'hydrogel, mais ces essais ont été limités aux cellules souches de
souris (Agarwal, R et
al. A Biomimetic Core-Shell Platform for Miniaturized 3D Cell and Tissue
Engineering. Part.
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Part. Syst. Charact. 32, 809-816 (2015), Chang, S. et al. Emulsion-based
Encapsulation of
Pluripotent Stem Cells in Hydrogel Microspheres for Cardiac Differentiation.
Biotechnol. Prog.
btpr.2986 (2020) doi:10.1002/btpr.2986 ; Zhao, S. et al. Bioengineering of
injectable
encapsulated aggregates of pluripotent stem cells for therapy of myocardial
infarction. Nat.
Commun. 7, 1-12 (2016)).
Enfin, on sait que la rétention cellulaire après délivrance dans le coeur des
cardiomyocytes est
très mauvaise (Hou, D. et al. Radiolabeled cell distribution after
intrannyocardial, intracoronary,
and interstitial retrograde coronary venous delivery: Implications for current
clinical trials.
Circulation 112, 150-156 (2005)) ce qui limite l'efficacité de la thérapie
cellulaire cardiaque.
De plus, lors de la greffe de cardiomyocytes tels qu'obtenus actuellement,
pour régénérer des
tissus cardiaques, il existe un risque important d'induire une arythmie au
patient ce qui limite
là encore l'utilisation de la thérapie cellulaire pour le traitement des
pathologies cardiaques.
En effet, à ce jour, l'un des défis scientifiques les plus cruciaux à
surmonter afin d'assurer la
sécurité des cellules cardiaques dérivées de cellules souches pour les
applications
thérapeutiques liées aux maladies cardiaques est l'élimination de l'arythmie
induite lors de la
greffe (Menasché, R Cardiac cell therapy: Current status, challenges and
perspectives.
Archives of Cardiovascular Diseases 113, 285-292 (2020) ; Kadota, S., Tanaka,
Y. & Shiba, Y.
Heart regeneration using pluripotent stem cells. Journal of Cardiology (2020)
doi:10.1016/j.jjcc.2020.03.013 ; Chen, K., Huang, Y., Singh, R. & Wang, Z. Z.
Arrhythmogenic
risks of stem cell replacement therapy for cardiovascular diseases. Journal of
Cellular
Physiology (2020) doi:10.1002/jcp.29554). Bien que généralement transitoires,
des arythmies
ont été observées à la fois chez des porcins (Romagnuolo, R. et al. Human
Embryonic Stem
Cell-Derived Cardiomyocytes Regenerate the Infarcted Pig Heart but Induce
Ventricular
Tachyarrhythmias. Stem Cell Reports 12, 967-981 (2019)) et des primates non
humains
(Ichimura, H. et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived
cardiomyocytes regenerates
primate hearts. Nature 538, 388-391 (2016) ; Liu, Y.-W. et al. Human embryonic
stem cell-
derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human
primates. Nature
biotechnology 36, 597-605 (2018) ; Chong, J. J. H. et al. Human embryonic-stem-
cell-derived
cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature 510, 273-277
(2014)), grands
modèles animaux de régénération après un infarctus du myocarde.
Il existe donc un besoin important pour une solution permettant la production
à grande
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échelle de cardiomyocytes de qualité, pour répondre à une demande
indispensable de
thérapie cellulaire cardiaque, mais aussi en recherche et développement de
molécules-
médicament pour juger de leur efficacité et de leur toxicité en phases
précliniques, avant
d'exposer des patients à ces traitements.
L'objectif de l'invention est par conséquent de répondre à l'ensemble de ces
besoins et de
pallier les inconvénients et limites de l'art antérieur.
Résumé de l'invention
Pour répondre à cet objectif, l'invention propose de passer par un
intermédiaire
développemental clé pour obtenir des tissus compactés de cellules cardiaques
humaines avec
des caractéristiques particulières et en quantité importante, adaptés à des
utilisations en
thérapie cellulaire.
A cet effet, l'invention a pour objet un microcompartiment cellulaire en trois
dimensions (3D)
comprenant successivement, organisées autour d'au moins une lumière :
- au moins une couche interne de cellules humaines en cours de
différenciation cellulaire en
cellules cardiaques, exprimant au moins un gène choisi parmi PDGFRa, MESP-1,
NKX2-5,
GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 et TBX5, ladite couche interne ayant une épaisseur
variable ;
- au moins une couche intermédiaire de solution aqueuse isotonique, et
- au moins une couche externe en hydrogel.
Au sein du microcompartiment, la couche interne de cellules humaines et la ou
les lumière(s)
forment ensemble un objet cellulaire en trois dimensions. Si on mesure la plus
petite et la plus
grande épaisseur de la couche interne de cellules le long d'un segment passant
par le centre
géométrique de cet objet cellulaire, le ratio entre la plus grande épaisseur
et la plus petite
épaisseur est supérieur ou égale à 2. Les épaisseurs de couche interne sont
mesurées le long
du segment passant par le centre géométrique de l'objet cellulaire :
- a. entre :
* l'interface de la couche interne et de la couche intermédiaire, et
* l'interface de la couche interne et d'une lumière,
et/ou
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- b. entre :
* l'interface de la couche interne et d'une lumière, et
* l'interface de la couche interne et d'une autre lumière.
L'invention a par conséquent pour objet spécifique un microcompartiment
cellulaire
comprenant successivement, organisées autour d'au moins une lumière :
- au moins une couche interne de cellules humaines en cours de
différenciation cellulaire en
cellules cardiaques, exprimant au moins un gène choisi parmi PDGFRa, MESP-1,
NKX2-5,
GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 et TBX5, ladite couche interne ayant une épaisseur
variable, le
ratio entre la plus grande épaisseur et la plus petite épaisseur de la couche
interne étant
supérieur ou égal à 2, la plus petite épaisseur et la plus grande épaisseur de
la couche interne
étant la plus petite et la plus grande des épaisseurs de couche interne
mesurées le long d'un
segment passant par le centre géométrique de l'objet cellulaire formé par la
couche interne
et la ou les lumière(s), entre l'interface de la couche interne et de la
couche intermédiaire et
l'interface de la couche interne et d'une lumière, et/ou entre l'interface de
la couche interne
et d'une lumière et l'interface de la couche interne et d'une autre lumière,
- au moins une couche intermédiaire de solution aqueuse isotonique, et
- au moins une couche externe en hydrogel.
Le microcompartiment selon l'invention comprend donc des cellules en cours de
différenciation cellulaire, l'expression des gènes PDGFRa / MESP1 / NKX2-5 /
GATA4 / MEF2C
/TBX20 / ISL1 / TBX5 étant associée à des stades intermédiaires de la
différenciation cardiaque.
Une telle configuration (une ou plusieurs lumières autour desquelles sont
organisées
successivement une couche de cellules humaines en cours de différenciation
cardiaque avec
des caractéristiques d'épaisseurs spécifiques, une couche de solution aqueuse
isotonique et
au moins une couche en hydrogel) est inédite. En effet, il existe plusieurs
protocoles connus
pour différencier les hPSC en cardiomyocytes qui reposent partiellement ou
totalement sur la
modulation de la voie WNT (Wingless et Int-1) (Dunn, K. K. & Palecek, S. R
Engineering scalable
manufacturing of high-quality stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac
tissue repair. Front.
Med. 5, (2018)). Au cours de la différenciation cardiaque dirigée de hPSC, les
cellules subissent
des changements morphologiques lors de leur transition vers le mésoderme, le
mésoderme
cardiaque, les progéniteurs cardiaques et finalement vers les myocytes
cardiaques. En culture
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2D d'hPSC, ces changements sont connus pour être associés à des morphologies
distinctes
(Palpant, N. J. et al. Generating high-purity cardiac and endothelial
derivatives from patterned
mesoderm using human pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 12, 15-31 (2017)).
Ces
changements morphologiques n'ont pas été bien décrits dans un système de
culture 3D et la
topologie de l'objet de l'invention n'a jamais été obtenue et décrite. Or, de
façon avantageuse,
elle permet d'obtenir ensuite des tissus compactés en grand nombre et
présentant des
caractéristiques permettant leur utilisation pour régénérer des tissus
cardiaques
endommagés.
La présence d'une couche externe d'hydrogel et d'une couche intermédiaire de
solution
aqueuse isotonique permet une distribution uniforme des cellules entre les
microcompartiments. Ainsi, l'homogénéité entre les microcompartiments est
grandement
améliorée par l'encapsulation préalable des hPSC permettant un rendement et
une qualité
accrue par rapport aux méthodes existantes. Par ailleurs cette couche
d'hydrogel permet
d'éviter les fusions de microcompartiments qui sont une source majeure de
variabilité
défavorable pour l'homogénéité phénotypique et la survie des cellules
cardiaques produites
en bioréacteur.
De plus, la modulation de la voie WNT utilisée dans la différenciation
cardiaque est associée
à la dégradation de la I3-caténine (Lam, A. T. L. et al. Conjoint propagation
and differentiation
of human embryonic stem cells to cardiomyocytes in a defined microcarrier
spinner culture.
Stem Ce!! Res. Ther. 5, 1-15 (2014)), une molécule qui joue un rôle dans les
complexes
d'adhérence cellule-cellule (Brembeck, F. H., Rosàrio, M. & Birchmeier, W.
Balancing cell
adhesion and Wnt signaling, the key role of p - c a te n n Curr. Opin. Genet.
Dey. 16, 51-59
(2006)). Avantageusement, la topologie du microcompartiment selon l'invention
permet de
protéger les cellules en cours de différenciation cardiaque et ce malgré la
fragilité de
l'adhérence cellule-cellule induite par la modulation de la voie WNT.
Les microcompartiments selon l'invention peuvent être utilisés pour obtenir
des tissus
compactés de cellules humaines cardiaques différenciées spécifiques.
L'invention a donc
aussi pour objet l'utilisation d'un microcompartiment cellulaire selon
l'invention, pour obtenir
un tissu de cellules cardiaques exprimant la troponine C cardiaque et
préférentiellement
également l'alpha-actinine.
L'invention a donc également pour objet des tissus cardiaques compactés. En
particulier,
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l'invention a pour objet un tissu compacté de cellules humaines cardiaques
exprimant la
troponine cardiaque C (c'est-à-dire des cellules humaines exprimant le gène de
la troponine C
cardiaque, l'alias du gène correspondant étant TNNC1), obtenu à partir d'au
moins un
microcompartiment cellulaire tel que précédemment décrit, par un procédé
comprenant la
compaction de la couche interne de cellules humaines par disparition totale ou
partielle de la
ou des lumière(s). Préférentiellement le tissu compacté de cellules humaines
cardiaques selon
l'invention présente un taux de cellules exprimant la troponine C cardiaque
d'au moins 50%
en nombre par rapport au nombre total de cellules constituant le tissu
compacté, encore plus
préférentiellement d'au moins 60%, d'au moins 70%, d'au moins 75%, d'au moins
80%, et ce
taux peut être supérieur à 90%. Préférentiellement, le tissu compacté de
cellules humaines
cardiaques selon l'invention présente un taux de cellules exprimant l'alpha-
actinine d'au
moins 50% en nombre par rapport au nombre total de cellules constituant le
tissu compacté,
encore plus préférentiellement d'au moins 60%, d'au moins 70%, d'au moins 75%,
d'au moins
80%, et ce taux peut être supérieur à 90%. Préférentiellement, le tissu
compacté de cellules
humaines cardiaques selon l'invention présente un taux de cellules exprimant
la troponine C
et l'alpha-actinine d'au moins 50% en nombre par rapport au nombre total de
cellules
constituant le tissu compacté, encore plus préférentiellement d'au moins 60%,
d'au moins
70%, d'au moins 75%, d'au moins 80%, et ce taux peut être supérieur à 90%.
Dans l'art antérieur il a été décrit dans Jing Donghui et al. Cardiac cell
generation from
encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems ,
Ce!!
Transplantation, col. 19, no 11, 1 novembre 2010, pages 1397-1492, des tissus
cardiaques
obtenus par l'encapsulation d'ESC de souris ou humaines dans des billes
d'alginate enduites
de poly-lysine, puis dissolution du noyau par incubation dans une solution de
citrate de
sodium. Cette solution, démontrée à partir de cellules souches embryonnaires,
n'est pas
satisfaisante, la pureté du tissu obtenu, et en particulier le taux de
cellules exprimant la
troponine C cardiaque est inférieur à 20% ce qui n'est pas suffisant pour
envisager une
utilisation en thérapie. Or avec un trop grand nombre d'impuretés cellulaires
dans les tissus,
ceux-ci présentent un risque pour le patient en introduisant des cellules non
désirées dans le
muscle cardiaque, au risque de perturber son bon fonctionnement, notamment en
perturbant
sa conductivité électrique et/ou sa capacité de contraction. De plus,
l'utilisation de poly-lysine
aux concentrations décrites dans cet article présente un risque de toxicité
pour les cellules.
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De même dans Koivisto Janne T. et al. Mechanically Biomimetic Gelatin-Gellan
Gum
Hydrogels for 3D Culture of Beating Human Cardiocytes , Applied Materials &
Interfaces, vol.
11, n 23, 12 juin 2019, pages 20589-20602, il est décrit l'encapsulation de
cellules au sein d'un
hydrogel sans espace disponible pour l'organisation des cellules, a fortiori
après prolifération
cellulaire qui mécaniquement met sous pression l'hydrogel. Il n'y a pas
d'encapsulation dans
des microcompartiments et cela ne conduit pas à une fréquence contractile
adaptée, ni à un
taux de cellules exprimant la troponine C cardiaque suffisant pour une
utilisation en thérapie.
Les tissus cardiaques selon l'invention, obtenu par un procédé spécifique et
différent de ceux
de l'art antérieur, permet d'obtenir des tissus cardiaques avec un taux de
cellules exprimant
la troponine C cardiaque et/ou l'alpha-actinine d'au moins 50%, et
préférentiellement d'au
moins 75%. En effet, la configuration selon l'invention en cours de
différenciation permet la
transmission de signaux auto/paracrine au sein d'un lumen protégé ce qui
permet aux cellules
de s'autoorganiser d'une façon biomimétique de la structuration in vivo. Cette
structuration
est extrêmement fragile et nécessite à la fois une protection mécanique et de
la place
disponible contrairement à ce qui est décrit dans Koivisto Janne T. et al.
Selon l'invention,
cette configuration ne peut pas se mettre en place ni en système confiné, ni
en système non-
protégé. En effet la différenciation cardiaque est notoirement peu
reproductible in vitro en
systèmes classiques (3D comme
2D,
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213671118301504) ce qui
traduit une
maitrise incomplète de l'environnement cellulaire. De façon non évidente et
surprenant,
l'invention propose une structuration maîtrisée de l'environnement sous forme
d'une auto-
organisation protégée, qui permet une moins grande sensibilité aux petites
variations du
système de culture et donc une plus grande reproductibilité.
Les tissus cardiaques selon l'invention peuvent être utilisés pour régénérer
des tissus
cardiaques ischémiés. Aussi, l'invention vise lesdits tissus pour leur
utilisation dans la
prévention et/ou le traitement de pathologies, notamment de pathologies
cardiaques.
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description
détaillée de l'invention et
des exemples qui vont suivre.
Brève description des figures
- la Figure la est une représentation schématique d'une vue en coupe d'un
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microcompartiment cellulaire 10 selon l'invention, correspondant à la photo
représentée sur
la figure lb, avec une couche externe d'hydrogel 12, une couche de solution
aqueuse
isotonique 14, une couche de cellules humaines en cours de différenciation
cardiaque 16 avec
une plus grande épaisseur t2 et une plus petite épaisseur tl, et une lumière
interne 18.
- la Figure lb est une image de microscopie à contraste de phase d'un
microcompartiment
selon l'invention prise à un grossissement 4x qui correspond au diagramme
schématique de
la Figure la.
- la Figure 2a est une représentation schématique d'une vue en coupe d'un
microcompartiment cellulaire 10 selon l'invention, correspondant à la photo
représentée sur
la figure 2b, avec une couche externe d'hydrogel 12, une couche de solution
aqueuse
isotonique 14, une couche de cellules humaines en cours de différenciation
cardiaque 16 avec
une plus grande épaisseur t2 et une plus petite épaisseur tl, et deux lumières
internes 18-1
et 18-2, S1 représentant l'épaisseur de la couche de de solution aqueuse
isotonique 14.
- la Figure 2b est une image de microscopie à contraste de phase d'un
microcompartiment
selon l'invention prise à un grossissement 4x qui correspond au diagramme
schématique de
la Figure 2a.
- la Figure 2c est une image de microscopie à contraste de phase de
plusieurs
microcompartiments selon l'invention, prise à un grossissement 4x, chaque
microcompartiment avec différentes morphologies.
- la Figure 3a est une représentation schématique d'une vue en coupe d'un
microcompartiment cellulaire 10 selon l'invention, correspondant à la
photographie
représentée sur la figure 3b, avec une couche externe d'hydrogel 12, une
couche de solution
aqueuse isotonique 14, une couche de cellules humaines en cours de
différenciation
cardiaque 16 avec une plus grande épaisseur t2 et une plus petite épaisseur
tl, et deux
lumières internes 18-1 et 18-1, si_ représentant l'épaisseur de la couche de
de solution
aqueuse isotonique 14.
- la Figure 3b est une image de microscopie à contraste de phase d'un
microcompartiment
selon l'invention prise à un grossissement 4x qui correspond au diagramme
schématique de
la Figure 3a.
- la Figure 4a est une représentation schématique d'une vue en coupe d'un
tissu compacté
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selon l'invention, correspondant à la photo représentée sur la figure 4b, avec
une couche
externe d'hydrogel 12, une couche de solution aqueuse isotonique 14, un tissu
compacté de
cellules cardiaques différenciées 20.
la Figure 4b est une image de microscopie à contraste de phase d'un tissu
compacté selon
l'invention dans un microcompartiment, prise à un grossissement 4x qui
correspond au
diagramme schématique de la Figure 4a.
- la Figure 4c représente des images de microscopie à contraste de phase
prises à un
grossissement 4x de tissus compactés selon l'invention dans des
microcompartiments.
- la Figure 5 comprend :
- un graphique qui représente la fréquence de battement de tissus et/ou
cellules obtenue à
partir d'une série d'images de microscopie à contraste de phase (à une
fréquence d'au moins
30 images par seconde) sur un microscope de table standard avec un
grossissement 4x, et
- des images de microscopie à contraste de phase prises à un grossissement
4x montrant les
cellules souches encapsulées ou libres au début de la différenciation (les
plus externes), et les
tissus compactés selon l'invention environ 2 semaines après le début de la
différenciation (Ai:
Agrégats de cellules souches sans capsule ; A2 : Tissus cardiaques compactés
dérivés de ces
agrégats ; Bl: Tissus cardiaques compactés dans des capsules; B2:
microcompartiments
contenant des cellules cardiaques en cours de différenciation ; B3 : cellules
souches
encapsulées).
- la Figure 6 comprend :
- un graphique qui représente la fréquence de battement de tissus et/ou
cellules obtenue à
partir d'une série d'images de microscopie à contraste de phase (à une
fréquence d'au moins
images par seconde) sur un microscope de table standard avec un grossissement
4x, et
- des images de microscopie à contraste de phase prises à un grossissement
4x. L'image de
25 gauche montre les tissus cardiaques compactés différenciés dans la
capsule à partir d'hiPSC
encapsulées. L'image de droite montre les cellules obtenues par dissociation
de tissus
cardiaques compactés selon l'invention.
- la Figure 7 comprend des images de microscopie à contraste de phase prise
grossissement
4x. Les trois images de la ligne du haut (a, b et c) sont des images de
cellules encapsulées. Les
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trois images de la ligne du base (d, e et f) sont des images de cellules non
encapsulées. Les
images de la colonne de gauche (a et d) représentent des cellules souches
induites en début
de différenciation en cellules cardiaques. Les images de la colonne du milieu
(b et e)
représentent des cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en
cellules
cardiaques, 3 à 7 jours après l'initiation de la différenciation. Les images
de la colonne de
droite (c et f) représentent des tissus cardiaques différenciés.
- La Figure 8 est un graphique qui représente le pourcentage de cellules dans
les tissus
(obtenus tels qu'à la Figure 7c et 7f) exprimant la troponine C cardiaque : à
gauche tissus selon
l'invention encapsulés (image 7c), à droite tissus non encapsulés (image 7f).
- La Figure 9 est un graphique qui représente le taux d'amplification
cellulaire entre le début
de la différenciation (obtenus tels qu'à la Figure 7a et 7d) dans les tissus :
à gauche selon
l'invention encapsulés, à droite non encapsulés.
Description détaillée de l'invention
Définitions
Par alginate au sens de l'invention, on entend des polysaccharides
linéaires formés à partir
de P-D-mannuronate et a-L-guluronate, des sels et des dérivés de ceux-ci.
Par capsule en hydrogel au sens de l'invention, on entend une structure
tridimensionnelle
formée à partir d'une matrice de chaînes polymères, gonflée par un liquide et
préférentiellement de l'eau.
Par cellule exprimant un gène au sens de l'invention, on entend une
cellule qui contient
au moins 5 fois plus de copies de l'ARN transcrit à partir de la séquence
d'ADN du gène
concerné en comparaison d'une cellule pluripotente, préférentiellement 10 fois
plus de copies,
préférentiellement 20 fois plus de copies, préférentiellement 100 fois plus de
copies.
Par cellules humaines au sens de l'invention on entend des cellules humaines
ou des
cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées. Même lorsque
cela
n'est pas précisé, les cellules, les cellules souches, les cellules
progénitrices et les tissus selon
l'invention sont constitués ou sont obtenus à partir de cellules humaines ou à
partir de cellules
de mammifères non humains immunologiquement humanisées.
Par cellule progénitrice au sens de l'invention, on entend une cellule
souche déjà engagée
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dans la différenciation cellulaire en cellules cardiaque mais pas encore
différenciée.
Par cellule souche embryonnaire au sens de l'invention on entend une
cellule souche
pluripotente de cellule dérivée de la masse cellulaire interne du blastocyste.
La pluripotence
des cellules souches embryonnaires peut être évaluée par la présence de
marqueurs tels que
les facteurs de transcription OCT4, NANOG et SOX2 et des marqueurs de surface
comme
SSEA3/4, Tra-1-60 et Tra-1-81. Les cellules souches embryonnaires utilisées
dans le cadre de
l'invention sont obtenues sans destruction de l'embryon dont elles sont
issues, par exemple à
l'aide de la technique décrite dans Chang et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2))
: 113-117).
Eventuellement les cellules souches embryonnaires d'êtres humains peuvent être
exclues.
Par cellule souche pluripotente ou cellule pluripotente au sens de
l'invention, on
entend une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans
l'organisme
d'origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant
que tel. Les
cellules souches pluripotentes humaines peuvent être appelées hPSC dans la
présente
demaine. Il peut s'agir en particulier de cellules souches pluripotentes
induites (iPSC ou hiPSC
pour les cellules souches pluripotentes induites humaines), de cellules
souches
embryonnaires ou de cellules MUSE (pour Multilineage-differentiating Stress
Enduring ).
Par< cellule souche pluripotente induite au sens de l'invention on entend
une cellule souche
pluripotente induite à la pluripotence par reprogrammation génétique de
cellules somatiques
différenciées. Ces cellules sont notamment positives pour les marqueurs de
pluripotence,
comme la coloration à la phosphatase alcaline et l'expression des protéines
NANOG, SOX2,
OCT4 et SSEA3/4. Des exemples de procédés permettant l'obtention de cellules
souches
pluripotentes induites sont décrits dans les articles Yu et al. (Science 2007,
318 (5858) : 1917-
1920), Takahashi et al (Cell, 207, 131(5) : 861-872) et Nakagawa et al (Nat
Biotechnol, 2008,
26(1) : 101-106).
Par cellules cardiaques différenciées au sens de l'invention on entend des
cellules qui
présentent le phénotype d'un cardiomyocyte, c'est-à-dire exprimant des
marqueurs
spécifiques tels que TNNC1 (gène de la troponine C cardiaque) et ACTN2 (gène
de l'alpha
actinine) et capables de se contracter spontanément en réponse à un signal
calcique
intracellulaire de façon spontanée (dans le cas de cellules cardiaques
immatures) ou suite à
une stimulation électrique ou chimique capable de déclencher ledit signal
calcique.
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Par cellules différenciées au sens de l'invention on entend des cellules
qui présentent un
phénotype particulier, par opposition à des cellules souches pluripotentes qui
ne sont pas
différenciées.
Par diamètre de Feret d'un tissu cardiaque compacté selon l'invention ou
d'un
microcompartiment selon l'invention, on entend la distance d comprise
entre deux
tangentes audit tissu compacté ou audit microcompartiment, ces deux tangentes
étant
parallèles, de telle sorte que l'ensemble de la projection dudit tissu
compacté ou dudit
microcompartiment soit compris entre ces deux tangentes parallèles.
Par épaisseur variable de la couche interne de cellules humaines en cours
de
différenciation cellulaire, on entend au sens de l'invention le fait que la
couche interne dans
un même microcompartiment, n'a pas la même épaisseur partout.
Par implantation ou greffe dans le coeur au sens de l'invention, on
entend l'action de
déposer au niveau du coeur à un endroit particulier au moins un tissu compacté
selon
l'invention. L'implantation peut être réalisée par tout moyen notamment par
injection.
Par microcompartiment ou capsule au sens de l'invention, on entend une
structure
tridimensionnelle partiellement ou totalement close, contenant au moins une
cellule.
Par milieu de culture convectif au sens de l'invention on entend un milieu
de culture animé
par des mouvements internes.
Par plus grande dimension d'un tissu cardiaque compacté selon l'invention
ou d'un
microcompartiment selon l'invention au sens de l'invention, on entend la
valeur du plus grand
diamètre de Feret dudit tissu compacté ou dudit microcompartiment.
Par plus petite dimension d'un tissu cardiaque compacté selon l'invention
ou d'un
microcompartiment selon l'invention au sens de l'invention, on entend la
valeur du plus petit
diamètre de Feret dudit tissu compacté ou dudit microcompartiment.
Par tissu ou tissu biologique au sens de l'invention, on entend le sens
commun de tissu
en biologie c'est-à-dire le niveau d'organisation intermédiaire entre la
cellule et l'organe. Un
tissu est un ensemble de cellules semblables et de même origine (le plus
souvent issus d'un
lignage cellulaire commun, bien qu'elles puissent trouver leur origine par
association de
lignages cellulaires distincts)., regroupées en amas, réseau ou faisceau
(fibre). Un tissu forme
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un ensemble fonctionnel, c'est-à-dire que ses cellules concourent à une même
fonction. Les
tissus biologiques se régénèrent régulièrement et sont assemblés entre eux
pour former des
organes.
Par tissu compacté ou tissu cardiaque compacté ou tissu compacté de
cellules
cardiaques au sens de l'invention, on entend une unité de tissu comprenant au
moins un
tissu cardiaque constitué au moins par des cellules cardiaques différenciées.
Le tissu est au
moins partiellement compacté c'est-à-dire qu'il est composé principalement de
cellules, en
particulier son volume est composé de plus de 50% de cellules,
préférentiellement 75% de
cellules, préférentiellement 90% de cellules. Le tissu peut être totalement
compacté c'est à
dire que les lumières ne sont plus détectables et/ou qu'il n'y a aucune
lumière. Les tissus
compactés selon l'invention peuvent être appelés des microtissus.
Par< lumière ou lumen au sens de l'invention, on entend un volume de
solution aqueuse
topologiquement entouré de cellules. Préférentiellement son contenu n'est pas
en équilibre
diffusif avec le volume de liquide convectif présent à l'extérieur du
microcompartiment.
Microcompartiments cellulaires
L'invention a donc pour objet un microcompartiment cellulaire comprenant
successivement,
organisées autour d'au moins une lumière :
- au moins une couche interne de cellules humaines en cours de
différenciation cellulaire en
cellules cardiaques, exprimant au moins un gène choisi parmi PDGFRa, MESP-1,
NKX2-5,
GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 et TBX5 (dite couche interne ),
- au moins une couche intermédiaire de solution aqueuse isotonique (dite
couche
intermédiaire ), et
- au moins une couche externe en hydrogel (dite couche externe ).
Le microcompartiment selon l'invention est une structure tridimensionnelle
comprenant donc
au moins une couche interne de cellules. Ces cellules sont des cellules
humaines, vivantes, en
cours de différenciation cellulaire en cellules cardiaques. Cette couche de
cellules est
organisée en trois dimensions dans le microcompartiment.
Les cellules humaines en cours de différenciation cardiaques présentes dans le
microcompartiment sont des cellules exprimant au moins un gène choisi parmi
PDGFRa,
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MESP-1, NKX2-5, GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 et TBX5. Ces gènes sont spécifiques
des cellules
cardiaques en cours de différenciation. Préférentiellement les cellules
humaines en cours de
différenciation cardiaques présentes dans le microcompartiment expriment au
moins deux de
ces gènes. Selon une variante, les cellules humaines en cours de
différenciation cardiaques
présentes dans le microcompartiment expriment tous ces gènes.
La couche interne de cellules humaines en cours de différenciation cellulaire
en cellules
cardiaques, a une épaisseur variable. Au sein du microcompartiment, la couche
interne de
cellules humaines et la ou les lumière(s) forment ensemble un objet cellulaire
en trois
dimensions. Si on mesure la plus petite et la plus grande épaisseur de la
couche interne de
cellules le long d'un segment passant par le centre géométrique de cet objet
cellulaire
(représenté 22 sur les figures la, 2a et 3a), le ratio entre la plus grande
épaisseur et la plus
petite épaisseur est supérieur ou égale à 2, préférentiellement supérieur ou
égale à 5. Les
épaisseurs de couche interne sont mesurées le long du segment passant par le
centre
géométrique de l'objet cellulaire :
- a. entre :
* l'interface de la couche interne et de la couche intermédiaire, et
* l'interface de la couche interne et d'une lumière,
et/ou
- b. entre :
* l'interface de la couche interne et d'une lumière, et
* l'interface de la couche interne et d'une autre lumière.
Les figures 1, 2 et 3 représentent des exemples de microcompartiments
cellulaires 10 selon
l'invention, avec une couche externe d'hydrogel 12, une couche de solution
aqueuse
isotonique 14, une ou plusieurs lumière(s) interne(s) 18, 18-1, 18-2, une
couche de cellules
humaines en cours de différenciation cardiaque 16 avec une plus grande
épaisseur t2 et une
plus petite épaisseur tl (les épaisseurs étant mesurées le long d'un segment
22 passant par
le centre géométrique de cet objet cellulaire formé par la couche 16 et la ou
les lumières 18,
18-1, 18-2) , le ratio t2/t1 étant bien supérieur à 2.
Sur la figure 1, il n'y a qu'une lumière 18 et par conséquent les épaisseurs
de couche interne
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sont mesurées le long d'un segment 22 passant par le centre géométrique de
l'objet cellulaire
formé par la couche 16 et la lumière 18, entre l'interface de la couche
interne et de la couche
intermédiaire et l'interface de la couche interne et de la lumière 18.
Sur les figures 2 et 3, il y a deux lumières 18-1 et 18-2 et par conséquent
les épaisseurs de
couche interne sont mesurées le long d'un segment 22 passant par le centre
géométrique de
l'objet cellulaire formé par la couche 16 et les lumières 181- 18-2 :
- entre l'interface de la couche interne et de la couche intermédiaire et
l'interface de la couche
interne et de la lumière 18-1, et
- entre l'interface de la couche interne et de la couche intermédiaire et
l'interface de la couche
lo interne et de la lumière 18-2, et
- entre l'interface de la couche interne et de la lumière 18-1 et
l'interface de la couche interne
et de la lumière 18-2.
Le nombre de cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en
cellules cardiaques
de la couche interne est préférentiellement compris entre 1 et 100 000
cellules, encore plus
préférentiellement entre 50 et 50 000 cellules, et notamment entre 500 et 25
000 cellules.
Les cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en cellules
cardiaques de la couche
interne ont préférentiellement été obtenues à partir de cellules souches
pluripotentes, en
particulier de cellules souches pluripotentes humaines, ou éventuellement à
partir de cellules
humaines non pluripotentes dont le profil transcriptionnel a été modifié
artificiellement pour
rejoindre celui de progéniteurs cardiaques ou de cellules cardiaques,
typiquement par
expression forcée de facteurs de transcriptions spécifiques du phénotype
cellulaire cible.
Préférentiellement, les cellules humaines de la couche interne ont été
obtenues à partir de
cellules souches pluripotentes humaines après mise en contact avec une
solution capable
d'initier la différenciation desdites cellules souches.
La couche intermédiaire de solution aqueuse isotonique contient
préférentiellement des
séquences peptidiques ou peptidomimétiques capables de se lier aux intégrines.
Par solution
aqueuse isotonique on entend une solution aqueuse présentant une osmolarité
comprise
entre 200 et 400 mOsm/L. Cette couche est située entre la couche interne de
cellules et la
couche externe en hydrogel.
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La couche intermédiaire peut être constituée d'éléments qui ont été ajoutés
lors de la
fabrication du microcompartiment et/ou d'éléments ajoutés dans le
microcompartiment
et/ou d'éléments sécrétés ou induits par les autres constituants du
microcompartiment.
La couche intermédiaire peut notamment comprendre ou être constituée par une
matrice
extracellulaire et/ou un milieu de culture. Si elle comprend de la matrice
extracellulaire, il peut
s'agir de matrice extracellulaire sécrétée par des cellules de la couche
interne et/ou par de la
matrice extracellulaire ajoutée au moment de la préparation/fabrication du
microcompartiment.
La couche intermédiaire comprend préférentiellement un mélange de protéines et
de
composés extracellulaires nécessaires à la culture des cellules en cours de
différenciation
cardiaque. Préférentiellement, la couche intermédiaire comprend des protéines
structurelles,
telles que du collagène, des laminines, de l'entactine, de la vitronectine,
ainsi que des facteurs
de croissance, tels que du TGF-béta et/ou de l'EGF. Selon une variante, la
couche intermédiaire
peut consister en ou comprendre du Matrigel et/ou de la Geltrex et/ou une
matrice type
hydrogel d'origine végétale comme des alginates modifiés ou d'origine
synthétique ou de
copolymère de poly(N-isopropylacrylamide) et de poly(ethylene glycol) (PNIPAAm-
PEG) type
Mebiol .
Selon une variante, la couche intermédiaire peut former un gel.
Au niveau de la surface de la couche intermédiaire en contact avec la couche
interne de
cellules humaines en cours de différenciation, la couche intermédiaire peut
éventuellement
contenir une ou plusieurs cellules.
L'épaisseur de la couche intermédiaire (représentée s1 sur les figures 1 et 2)
est
préférentiellement comprise entre 30 nm et 300 11m, encore plus
préférentiellement entre 30
nm et 50 p.m.
La présence de la couche intermédiaire favorise la structuration selon
l'invention des éléments
dans le microcompartiment.
Le microcompartiment et la couche interne de cellules au sein du
microcompartiment selon
l'invention sont creux. Le microcompartiment selon l'invention comprend en
effet toujours au
moins une lumière interne ou lumen qui constitue la partie creuse du
microcompartiment. La
lumière contient un liquide, notamment un milieu de culture (tel que par
exemple qu'un
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milieu basal RPMI avec un supplément en B27) et/ou un liquide sécrété par les
cellules de la
couche interne. Avantageusement la présence de cette partie creuse permet aux
cellules de
disposer d'un petit volume diffusif dont elles peuvent contrôler la
composition, favorisant une
communication cellulaire dite autocrine/paracrine qui est à son tour favorable
à la
différenciation cardiaque.
Selon un mode de réalisation, tel que représenté sur les figures 2 et 3, le
microcompartiment
selon l'invention peut comprendre plusieurs lumières, au moins deux lumières.
Cette situation
présente le même avantage vis-à-vis des signaux autocrine et paracrine que la
présence d'une
seule lumière et augmente la capacité des cellules de contrôler la composition
de la solution
aqueuse de la lumière car le ratio cellule par volume/cellules est alors
géométriquement plus
faible. Par ailleurs la stabilisation d'une telle configuration démontre la
protection mécanique
offerte par le microcompartiment.
La ou les lumière(s) représente(nt) préférentiellement entre 10% et 90% du
volume du
microcompartiment selon l'invention.
Le microcompartiment comprend une couche externe en hydrogel.
Préférentiellement
l'hydrogel utilisé est biocompatible, c'est-à-dire qu'il n'est pas toxique
pour les cellules. La
couche d'hydrogel doit permettre la diffusion d'oxygène et de nutriment pour
alimenter les
cellules contenues dans le microcompartiment et permettre leur survie. Selon
un mode de
réalisation, la couche externe d'hydrogel comprend au moins de l'alginate.
Elle peut être
constituée exclusivement d'alginate. L'alginate peut être en particulier un
alginate de sodium,
composé à 80% d'a-L-guluronate et 20% de 13-D-mannuronate, avec une masse
moléculaire
moyenne de 100 à 400 kDa et une concentration totale comprise entre 0,5 et 5%
en masse.
La couche d'hydrogel permet de protéger les cellules du milieu extérieur, de
limiter la
prolifération incontrôlée des cellules, et leur différenciation contrôlée en
cellules en cours de
différenciation cardiaques puis en cellules cardiaques, au moins en
cardiomyocytes.
La couche externe est close ou partiellement close. Le microcompartiment est
donc clos ou
partiellement clos. Préférentiellement le microcompartiment est clos.
Le microcompartiment selon l'invention peut se présenter sous toute forme en
trois
dimensions, c'est-à-dire qu'il peut avoir la forme de tout objet de l'espace.
Préférentiellement
le microcompartiment selon l'invention se présente sous une forme sphérique ou
allongée. Il
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peut en particulier se présenter sous la forme d'un sphéroïde creux, d'un
ovoïde creux, d'un
cylindre creux ou d'une sphère creuse.
C'est la couche externe du microcompartiment, c'est-à-dire la couche
d'hydrogel, qui confère
sa taille et sa forme au microcompartiment selon l'invention.
Préférentiellement le diamètre
la plus petite dimension du microcompartiment selon l'invention est comprise
entre 10 p.m et
1 mm, préférentiellement entre 100 m et 700 m. Elle peut être comprise entre
10 'lm et
600 m, notamment entre 10p.m et 500 m. Cette plus petite dimension est
importante pour
la survie du tissu cardiaque en trois dimensions qui sera obtenu à partir du
microcompartiment selon l'invention, en particulier pour favoriser la survie
des cellules
cardiaques au sein du tissu cardiaque et optimiser la réorganisation ainsi que
la vascularisation
du tissu cardiaque après implantation dans le coeur.
Sa plus grande dimension est préférentiellement supérieure à 1011m, plus
préférentiellement
comprise entre 10p.m et 1m, encore plus préférentiellement entre 10p.m et
50cm. Selon un
mode de réalisation la plus grande dimension est compatible avec la taille de
l'organe et est
donc inférieure à 30 cm (entre 10 m et 30cm).
Le microcompartiment selon l'invention est particulièrement utile pour obtenir
un tissu
cardiaque compacté en trois dimensions, constitué de cellules cardiaques
humaines
différenciées.
Le microcompartiment selon l'invention peut être éventuellement congelé pour
être stocké.
Il devra ensuite être décongelé pour poursuivre la maturation des cellules
cardiaques et
obtenir un tissu cardiaque compacté en trois dimensions.
L'invention a également pour objet plusieurs microcompartiments ensemble.
Aussi l'invention
vise aussi une série de microcompartiments cellulaires tels que décrits
précédemment
comprenant au moins deux microcompartiments cellulaires selon l'invention.
Préférentiellement la série de microcompartiments selon l'invention est dans
un milieu de
culture, en particulier dans un milieu de culture au moins partiellement
convectif. Selon un
mode de réalisation particulièrement adapté, l'invention a pour objet une
série de
microcompartiments cellulaires tels que décrits précédemment dans une enceinte
close, telle
qu'un bioréacteur, préférentiellement dans un milieu de culture dans une
enceinte close, telle
qu'un bioréacteur.
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Procédé d'obtention d'un microcompartiment selon l'invention
L'invention vise également un procédé de préparation d'un microcompartiment
selon
l'invention.
En particulier le procédé consiste à réaliser des microcompartiments
cellulaires comprenant
une capsule d'hydrogel entourant :
- des cellules souches ou des cellules progénitrices capables de se
différencier en cellules
cardiaques, au moins en cardiomyocytes, ou
- des cellules différenciées destinées à subir dans la capsule une
reprogrammation dans la
capsule de façon à ce qu'elles deviennent des cellules souches pluripotentes
induites capables
de se différencier en cellules cardiaques, au moins en cardiomyocytes.
Le procédé de préparation d'un microcompartiment selon l'invention, peut
comprendre au
moins la mise en oeuvre des étapes qui consistent à :
- produire un microcompartiment cellulaire comprenant, à l'intérieur d'une
capsule en
hydrogel :
* des éléments de solution aqueuse isotonique, préférentiellement de la
matrice
extracellulaire, sécrétés par les cellules ou apportés par l'opérateur,
préférentiellement au
moins une partie de la solution aqueuse isotonique étant apportée en plus de
la matrice
extracellulaire naturellement sécrétée par les cellules,
* des cellules aptes à se différencier en cellules cardiaques,
- induire la différenciation cellulaire au sein du microcompartiment
cellulaire, de manière à
obtenir au moins une couche creuse en trois dimensions de cellules humaines en
cours de
différenciation cellulaire en cellules cardiaques, exprimant au moins un gène
choisi parmi
PDGFRa, MESP-1, NKX2-5, GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 et TBX5, et éventuellement
d'autres
cellules.
Avantageusement, l'encapsulation totale ou partielle dans l'hydrogel et
l'apport de matrice
extracellulaire combinés, est un moyen adapté pour permettre la
différenciation de cellules
pluripotentes humaines vers le muscle cardiaque en cumulant plusieurs
avantages,
notamment :
i) favoriser une distribution homogène des cellules du lot au
sein des
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microcompartiments,
ii) protection mécanique face aux stress hydrodynamique infligé par le
bioréacteur et
limitation des fusions non désirées de microcompartiments,
iii) organisation d'un microenvironnement conservant localement les
éléments de
matrice extracellulaire favorisant une bonne survie et une bonne organisation
cellulaire,
iv) maintien d'un lumen favorisant les voies autocrines et paracrines
pendant la
différenciation.
Tout procédé de production de microcompartiments cellulaires contenant à
l'intérieur d'une
capsule d'hydrogel au moins des cellules humaines en cours de différenciation
cardiaque et
une solution aqueuse isotonique et éventuellement l'ajout d'autres cellules,
par exemple de
soutien peut être utilisé. Une méthode adaptée est notamment décrite dans la
demande
W02018/096277. Préférentiellement l'encapsulation est réalisée par co-
injection de trois
solutions :
- une solution d'hydrogel,
- une solution intermédiaire isotonique telle que par exemple une solution
de sorbitol,
- une solution comprenant les cellules à encapsuler, du milieu de culture
et optionnellement
mais préférentiellement de la matrice extracellulaire,
de manière concentrique via un injecteur microfluidique qui permet de former
un jet en
sortie d'injecteur constitué du mélange des trois solutions, ledit jet se
fractionnant en
gouttes, lesdites gouttes étant collectées dans un bain de calcium qui
rigidifie la solution
d'hydrogel pour former la couche externe de chaque microcompartiment, la
partie interne
de chaque goutte étant constituée par la solution comprenant les cellules
encapsulées, du
milieu de culture et la matrice extracellulaire.
Selon un mode de réalisation l'encapsulation est réalisée avec un dispositif
capable de générer
des capsules d'hydrogel à l'aide d'une puce microfluidique. Par exemple le
dispositif peut
comprendre des pousses seringues pour plusieurs solutions injectées de manière
concentrique grâce à un injecteur microfluidique qui permet de former un jet
qui se fractionne
en gouttes collectées ensuite dans un bain de calcium. Selon un mode de
réalisation
particulièrement adapté, trois solutions sont chargées sur trois pousse-
seringues :
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- une solution d'hydrogel, par exemple d'alginate,
- une solution intermédiaire isotonique telle que par exemple une solution
de sorbitol,
- la solution issue de l'étape b) comprenant des iPSC, du milieu de culture
et éventuellement
mais préférentiellement de la matrice extracellulaire.
Les trois solutions sont co-injectées (injectées simultanément) de manière
concentrique grâce
à un injecteur microfluidique ou puce microfluidique qui permet de former un
jet qui se
fractionne en gouttes dont la couche extérieure est la solution d'hydrogel et
le c ur de la
solution comprenant les cellules à encapsuler ; Ces gouttes sont collectées
dans un bain de
calcium qui rigidifie la solution d'alginate pour former la coque.
[001] Pour améliorer la mono-dispersité des microcompartiments cellulaires, la
solution
d'hydrogel est chargée avec un courant continu. Un anneau à la masse est
disposé après la
pointe dans le plan perpendiculaire à l'axe du jet sortant de l'injecteur
microfluidique (puce
de coextrusion) pour générer le champ électrique.
Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de production d'un
microcompartiment
cellulaire du procédé de préparation selon l'invention, comprend les étapes
consistant à :
- incuber des cellules souches pluripotentes dans un milieu de culture,
préférentiellement un
milieu de culture contenant les facteurs de croissance FGF2 et TGFp ou des
molécules
reproduisant son action sur la cellule, un inhibiteur de la voie Rho kinase ou
une molécule
reproduisant son action sur la cellule, notamment en limitant la mort
cellulaire.
- éventuellement mélanger les cellules souches pluripotentes avec une solution
aqueuse
isotonique, préférentiellement une matrice extracellulaire,
- encapsuler le mélange dans une couche d'hydrogel.
Les cellules encapsulées pour la préparation de microcompartiments selon
l'invention sont
préférentiellement choisies parmi :
- des cellules aptes à se différencier au moins en cellules cardiaques, ces
cellules étant :
* soit des cellules souches capables de se différencier en cellules
cardiaques, au moins en
cardiomyocytes, préférentiellement des cellules souches embryonnaires ou des
cellules
souches pluripotentes induites, très préférentiellement des cellules souches
pluripotentes
induites, et/ou,
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* soit des cellules progénitrices capables, de se différencier en cellules
cardiaques, au moins
en cardiomyocytes,
- et/ou des cellules différenciées capables de subir une reprogrammation de
façon à ce
qu'elles deviennent des cellules souches pluripotentes induites capables de se
différencier en
cellules cardiaques, au moins en cardiomyocytes.
Les cellules encapsulées peuvent être immuno-compatibles avec la personne
destinée à
recevoir les cellules cardiaques différenciées obtenues à partir du
microcompartiment selon
l'invention, pour éviter tout risque de rejet. Dans un mode de réalisation,
les cellules
encapsulées ont été préalablement prélevées chez la personne dans laquelle les
tissus
cardiaques compactés obtenus à partir des microcompartiments selon l'invention
seront
implantés.
La différenciation en cellules en cours de différenciation cardiaque contenues
dans le
microcompartiment selon l'invention, peut être réalisée par tout procédé
adapté. Il peut
notamment s'agir d'une méthode connue comme un des protocoles répertoriés dans
(Dunn,
KK & Palecek, 5P Engineering fabrication évolutive de cardiomyocytes dérivés
de cellules
souches de haute qualité pour la réparation des tissus cardiaques. Front. Med.
5, (2018)).
Le protocole qui est actuellement l'un des plus courants est décrit en détail
dans (Burridge, P.
W. et al. Génération chimiquement définie de cardiomyocytes humains. Nat.
Methods 11,
855-860 (2014)).
Dans un mode de réalisation particulier, l'étape d'induction de la
différenciation cellulaire du
procédé selon l'invention, comprend une étape consistant à introduire des
capsules contenant
des cellules souches humaines aptes à être différenciées en cellules
cardiaques humaines,
dans un milieu de culture contenant un activateur de voie WNT (tel que
CHIR99021) pendant
12 h à 72 h, plus préférentiellement 12 à 48 heures.
En suivant, le procédé peut comprendre une étape qui consiste à incuber les
microcompartiments dans un milieu de culture contenant un inhibiteur de la
voie WNT.
Préférentiellement, cette étape est réalisée entre 0 et trois jours après la
fin de l'étape
d'induction de la différenciation (ajout de l'activateur de la voie WNT),
préférentiellement
entre 12 et 72 heures, notamment entre 24 et 48h. Selon un mode de réalisation
préféré,
cette étape consiste à incuber les capsules dans un milieu de culture
contenant un inhibiteur
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de la voie WNT, préférentiellement pendant 12 heures à 48 heures, notamment
entre 24 à
48h.
Un mode de réalisation particulier est le suivant :
(a) incuber des cellules souches pluripotentes humaines contenant des capsules
dans un
milieu de culture contenant un activateur de voie WNT pendant 12 h à 72 h;
(b) 0 à 48 heures après l'étape (a) incuber les capsules dans un milieu de
culture contenant un
inhibiteur de voie WNT pendant 12 heures à 48 heures;
Préférentiellement, le milieu de culture est RPMI avec supplément B27 sans
insuline (pendant
les 7 premiers jours de différenciation) et avec insuline (à partir du jour de
différenciation 7).
Préférentiellement les microcompartiments selon l'invention, contenant des
cellules en cours
de différenciation cardiaques, sont obtenus entre 2 à 7 jours après le début
de l'induction de
la différenciation, préférentiellement entre 3 et 7 jours après le début de
l'induction de la
différenciation, encore plus préférentiellement entre 4 et 6 jours après le
début de la
différenciation. Préférentiellement, le microcompartiment selon l'invention
apparaît au
moment de l'ajout de l'inhibiteur de la voie WNT ou après.
La lumière est générée au moment de la formation de la couche de cellules
humaines en cours
de différenciation cardiaque en 3 dimensions, par les cellules qui se
multiplient et se
développent. La lumière peut contenir un liquide et en particulier le milieu
de culture utilisé
pour la mise en oeuvre du procédé.
Selon un mode de réalisation, les cellules souches de départ s'organisent en
une couche de
cellules souches en trois dimensions autour d'une lumière dans le
microcompartiment, puis
au cours de la différenciation cette lumière disparaît, et une seconde lumière
apparaît pour
former le microcompartiment selon l'invention.
Le procédé est préférentiellement mis en oeuvre dans une enceinte close, telle
qu'un
bioréacteur, avec une série de microcompartiments, encore plus
préférentiellement dans un
milieu de culture adapté et au moins partiellement convectif.
Le procédé selon l'invention, peut optionnellement également comprendre :
- une étape qui consiste à dissocier le microcompartiment ou la série de
microcompartiments
pour obtenir une suspension de cellules ou une suspension d'amas de cellules ;
l'élimination
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de la capsule peut être réalisée notamment par hydrolyse, dissolution, perçage
et/ou rupture
par tout moyen biocompatible, c'est-à-dire non toxique pour les cellules. Par
exemple,
l'élimination peut être réalisée en utilisant un tampon phosphate salin, un
chélateur d'ions
divalents, une enzyme comme l'alginate lyase si l'hydrogel comprend de
l'alginate et/ou la
microdissection laser, et
- une étape de ré-encapsulation de tout ou partie des cellules ou amas de
cellules dans une
capsule d'hydrogel.
La réencapsulation est un moyen adapté pour :
i) optimiser la standardisation de la taille et l'homogénéité des tissus
cardiaques
compactés qui seront obtenus ensuite,
ii) ii) permettre une augmentation de l'amplification cellulaire obtenue
depuis
l'étape pluripotente, et donc un rendement plus élevé.
A tout moment, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape
consistant à vérifier
le phénotype des cellules contenues dans le microcompartiment. Cette
vérification peut être
réalisée en identifiant l'expression par au moins une partie des cellules
contenues dans le
microcompartiment, d'au moins un des gènes suivants PDGFRa, MESP-1, NKX2-5,
GATA4,
MEF2C, TBX20, ISL1 et TBX5.
Le procédé selon l'invention peut comprendre une étape de congélation des
microcompartiments selon l'invention avant leur utilisation pour poursuivre
une
différenciation en cellules cardiaques différenciées et obtenir des tissus
cardiaques compactés.
La congélation est préférentiellement réalisée à une température comprise
entre -190 C et -
80 C. La décongélation peut être réalisée dans un bain d'eau tiède (37 degrés
préférentiellement) pour que les cellules décongèlent assez rapidement.
Les
microcompartiments selon l'invention avant leur utilisation pour poursuivre
une
différenciation en cellules cardiaques différenciées et obtenir des tissus
cardiaques compactés,
peuvent être maintenus à plus de 4 C pendant une durée limitée avant leur
utilisation,
préférentiellement entre 4 C et 38 C.
Les microcompartiment selon l'invention peuvent également être utilisés pour
poursuivre une
différenciation en cellules cardiaques différenciées et obtenir des tissus
cardiaques compactés,
directement après mise en oeuvre du procédé selon l'invention, sans stockage
et sans
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congélation.
Procédé d'obtention d'un tissu cardiaque compacté
Après l'obtention d'un microcompartiment selon l'invention contenant des
cellules humaines
en cours différenciation, le procédé peut se poursuivre pour obtenir un objet
en trois
dimensions sous forme d'un tissu compacté.
L'objet compacté apparaît généralement entre 2 et 10 jours après l'ajout de
l'inhibiteur de la
voie WNT, notamment entre 5 et 7 jours. En effet, l'ajout de l'inhibiteur est
préliminaire à la
compaction des cellules qui continuent de se différencier en cellules
cardiaques.
Ainsi l'objet compacté apparaît généralement entre 7 et 14 jours après
l'initiation de la
différenciation.
A la fin de la compaction tout ou partie des lumières ont disparu
partiellement ou totalement
(ont été éliminées partiellement ou totalement par le phénomène de compaction)
et les
cellules comprennent au moins en partie des cellules humaines cardiaques
différenciées,
préférentiellement au moins des cardiomyocytes.
Le procédé selon l'invention peut comprendre une étape d'amplification des
cellules
cardiaques dans le microcompartiment, et optionnellement une ou plusieurs ré-
encapsulation.
Le tissu cardiaque compacté obtenu peut être maintenu dans la capsule
d'hydrogel.
Préférentiellement elle est toujours entourée d'une solution aqueuse
isotonique,
préférentiellement une matrice extracellulaire. Une capsule contenant un tissu
cardiaque
compacté en trois dimensions et une couche de solution aqueuse isotonique est
représenté
sur les figures 4.
Le tissu compacté est préférentiellement stocké dans une capsule avant
utilisation. Pour son
stockage, la capsule contenant le tissu cardiaque compacté peut être congelée
avant
élimination de la couche d'hydrogel de la capsule. Le procédé selon
l'invention peut
comprendre une étape de congélation des capsules contenant les tissus
cardiaques
compactés selon l'invention avant leur utilisation. La congélation est
préférentiellement
réalisée à une température comprise entre -190 C et -80 C. Les capsules
contenant les tissus
cardiaques compactés selon l'invention avant leur utilisation comme greffon
dans le coeur,
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peuvent être décongelées dans un bain d'eau tiède (37 degrés
préférentiellement) pour que
les cellules du tissu décongèlent assez rapidement. Les tissus cardiaques
compactés selon
l'invention, peuvent être maintenus à plus de 4 C pendant une durée limitée
avant leur
utilisation, préférentiellement entre 4 C et 38 C
Après obtention du tissu cardiaque compacté, à tout moment avant
l'implantation dans le
coeur, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape consistant à
vérifier le
phénotype des cellules contenues dans la capsule. Cette vérification peut être
réalisée en
identifiant l'expression de la troponine C cardiaque par les cellules
cardiaques formant le tissu
compacté.
Préférentiellement, avant utilisation, la couche d'hydrogel de la capsule
contenant le tissu
cardiaque compacté selon l'invention est éliminée. L'élimination de la capsule
peut être
réalisée notamment par hydrolyse, dissolution, perçage et/ou rupture par tout
moyen
biocompatible, c'est-à-dire non toxique pour les cellules. Par exemple,
l'élimination peut être
réalisée en utilisant un tampon phosphate salin, un chélateur d'ions
divalents, une enzyme
comme l'alginate lyase si l'hydrogel comprend de l'alginate et/ou la
microdissection laser.
L'élimination de l'hydrogel est préférentiellement totale, le tissu cardiaque
compacté selon
l'invention est dépourvu d'hydrogel lorsqu'il est utilisé comme greffon,
implanté dans un
coeur.
Tissu cardiaque compacté en trois dimensions
L'invention a également pour objet le tissu cardiaque obtenu selon le procédé
tel que décrit
précédemment. L'invention a par conséquent pour objet un tissu compacté de
cellules
humaines cardiaques exprimant la troponine C cardiaque et préférentiellement
l'alpha-
actinine, obtenu à partir d'au moins un microcompartiment cellulaire selon
l'invention.
En particulier, l'invention a pour objet un tissu compacté de cellules
humaines cardiaques
exprimant la troponine C cardiaque, obtenu à partir d'au moins un
microcompartiment
cellulaire selon l'invention, par un procédé comprenant la compaction
(compaction dite
compaction secondaire) de la couche de cellules humaines par disparition
totale ou partielle
de la ou des lumière(s) dudit microcompartiment. Préférentiellement, le tissu
compacté de
cellules humaines cardiaques est obtenu par un procédé tel que décrit
précédemment.
Le tissu selon l'invention est donc un tissu humain comprenant au moins des
cellules
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cardiaques différenciées exprimant la troponine C cardiaque et
préférentiellement l'alpha-
actinine. Le tissu compacté selon l'invention peut également contenir d'autres
types
cellulaires.
Avantageusement, le tissu cardiaque selon l'invention présente un taux de
cellules exprimant
la troponine C cardiaque d'au moins 50% en nombre par rapport au nombre total
de cellules
constituant le tissu compacté, encore plus préférentiellement d'au moins 60%,
d'au moins
70%, d'au moins 75%, d'au moins 80%, d'au moins 90%. Ce taux important de
cellules
exprimant la troponine C cardiaque est avantageux pour envisager des
utilisations des tissus
cardiaques selon l'invention en thérapie cellulaire.
Préférentiellement, le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon
l'invention
présente un taux de cellules exprimant l'alpha-actinine d'au moins 50% en
nombre par rapport
au nombre total de cellules constituant le tissu compacté, encore plus
préférentiellement d'au
moins 60%, d'au moins 70%, d'au moins 75%, d'au moins 80%, et ce taux peut
être supérieur
à 90%. Ce taux important de cellules exprimant l'alpha-actinine est avantageux
pour envisager
des utilisations des tissus cardiaques selon l'invention en thérapie
cellulaire.
Préférentiellement, le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon
l'invention
présente un taux de cellules exprimant la troponine C et l'alpha-actinine d'au
moins 50% en
nombre par rapport au nombre total de cellules constituant le tissu compacté,
encore plus
préférentiellement d'au moins 60%, d'au moins 70%, d'au moins 75%, d'au moins
80%, et ce
taux peut être supérieur à 90%. Ce taux important de cellules exprimant à la
fois la troponine
C et l'alpha-actinine est avantageux pour envisager des utilisations des
tissus cardiaques selon
l'invention en thérapie cellulaire.
Préférentiellement, ce tissu compacté est contractile et présente une
fréquence de
contraction spontanée inférieure à 4 Hz, préférentiellement inférieure à 2 Hz,
encore plus
préférentiellement inférieure à 1,7Hz, en particulier inférieure à 1 Hz, et
notamment
inférieure à 0,5Hz et pouvant être inférieure à 0,25 Hz. Cette fréquence de
contraction du tissu
est basse ce qui présente un grand avantage pour son implantation dans le
coeur. En effet une
telle fréquence permet d'éviter une arythmie au moment de la greffe du tissu
compacté selon
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l'invention dans le coeur à traiter.
La fréquence cardiaque moyenne d'un adulte humain se situe entre 60 et 100
battements par
minute (1 à 1,7 Hz). La faible fréquence de contraction des tissus compactés
cardiaques selon
l'invention réduit le risque d'arythmie lors d'une greffe des tissus ou de
cellules obtenues à
partir de ces tissus. Selon un mode de réalisation, avec une fréquence de
battement
spontanée du tissu selon l'invention inférieure à la fréquence cardiaque du
patient (receveur),
ce risque d'arythmie est encore diminué.
La réduction de la fréquence des battements spontanés est associée à la
maturité des
cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines, l'environnement de
culture 3D
améliorant la maturation des cardiomyocytes. Selon l'invention l'encapsulation
permet
encore de réduire la fréquence contractile du tissu cardiaque compacté. La
figure 5 montre
que pour une population cellulaire de départ donnée, les cardiomyocytes
différenciés au sein
d'un microcompartiment / capsule (à partir de cellules souches pluripotentes
humaines
encapsulée) ont un rythme de battement spontané plus lent que les
cardiomyocytes
différenciés avec le même protocole (et du même lot initial de cellules
souches pluripotentes
humaines) mais en culture en suspension libre. Ainsi, la différenciation en
cardiomyocytes à
partir de cellules souches encapsulées diminue la fréquence contractile
spontanée.
Les cellules souches pluripotentes humaines sécrètent des molécules de
signalisation au cours
du processus de différenciation cardiaque, qui génèrent un microenvironnement
paracrine
spécifique nécessaire au succès de la différenciation (Kempf, H. et al. Bulk
cell density and
Wnt/TGFbeta signalling regulate mesendodermal patterning of human pluripotent
stem cells.
Nature Communications 7, (2016)). La présence de la capsule aide à augmenter
et à maintenir
une concentration locale de ces facteurs paracrines, ce qui améliore le
phénotype de
différenciation, entraînant la réduction de la fréquence de battement
spontané.
Le tissu compacté cardiaque selon l'invention peut rester contractile
spontanément pendant
plusieurs mois. Ainsi le produit est stable dans le temps.
Selon une variante, la différenciation cardiaque au sein du microcompartiment
peut-être mise
en oeuvre et/ou combinée avec d'autres techniques, telles que la stimulation
électrique et les
interventions métaboliques ou hormonales. La combinaison avec de telles
techniques
peuvent permettre de réduire encore la fréquence des battements spontanés du
tissu
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cardiaque compacté selon l'invention avant la greffe.
Le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'invention peut être
encapsulé
totalement ou partiellement dans une couche externe d'hydrogel. La capsule
d'hydrogel peut
être celle d'origine du microcompartiment de cellules humaines en cours de
différenciation
cardiaque, ou il peut s'agir d'une nouvelle couche d'hydrogel s'il y a eu
élimination de la
couche d'hydrogel initiale, puis réencapsulation à tout stade du procédé.
L'encapsulation du tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon
l'invention permet
de protéger le tissu, de maintenir la fréquence de contraction spontanée
inférieure à 4Hz,
préférentiellement inférieure à 2 Hz, encore plus préférentiellement
inférieure à 1 Hz, et
notamment inférieure à 0,5Hz. Elle peut être inférieure à 0,25 Hz. Le
mécanisme selon lequel
la fréquence de contraction est limitée peut être lié à la structuration en 3D
via i) la mise en
continuité électrique des cytoplasmes des cellules cardiaques, ii) et/ou la
limitation de la
quantité de calcium disponible par cellule dans l'espace intercellulaire des
tissus compactés
iii) et/ou la résistance mécanique liées à la continuité mécanique des
éléments de
cytosquelette des cellules cardiaques. L'encapsulation du tissu compacté
cardiaque selon
l'invention permet également de contrôler la taille du tissu compacté ce qui
améliore la
rétention, l'intégration et la survie cellulaire lorsqu'il est injecté dans le
coeur, notamment en
comparaison aux injections de cellules uniques, ce qui augmente l'efficacité
de la thérapie
cellulaire cardiaque avec les tissus compactés selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, le tissu compacté de cellules humaines
cardiaques selon
l'invention n'est pas encapsulé dans une couche externe en hydrogel. En
particulier, la capsule
est préférentiellement éliminée avant utilisation afin de permettre aux
cellules du tissu
compacté de s'implanter au niveau du coeur après une greffe.
Le tissu compacté de cellules cardiaques humaines selon l'invention est
préférentiellement
entouré totalement ou partiellement d'une couche de solution aqueuse
isotonique, telle
qu'une matrice extracellulaire. Cette couche de solution aqueuse isotonique
est située entre
le tissu compacté de cellules cardiaques humaines et la couche d'hydrogel
lorsque le tissu
compacté cardiaque est encapsulé.
Le tissu compacté cardiaque selon l'invention est en trois dimensions. Il a
préférentiellement
une forme sphérique ou allongée. Selon un mode de réalisation préféré, le
tissu compacté de
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cellules humaines cardiaques a la forme d'un sphéroïde, d'un ovoïde, d'un
cylindre ou d'une
sphère.
Un exemple de tissu compacté selon l'invention est représenté sur les figures
4. Dans cet
exemple le tissu compacté selon l'invention est entouré d'une couche de
solution aqueuse
isotonique et d'une couche externe d'hydrogel.
De façon préférée, il présente un diamètre ou une plus petite dimension
comprise entre 10
'lm et 1 mm, préférentiellement comprise entre 100 um et 700 m. Cette plus
petite
dimension est importante pour sa survie, en particulier pour favoriser la
survie des cellules
cardiaques au sein du tissu cardiaque et optimiser la réorganisation ainsi que
la vascularisation
du tissu cardiaque après implantation dans le coeur.
Sa plus grande dimension est préférentiellement supérieure à 10 m, plus
préférentiellement
comprise entre 10p.m et 1m, encore plus préférentiellement entre 10 m et 50cm.
Selon un
mode de réalisation la plus grande dimension est compatible avec la taille de
l'organe et est
donc inférieure à 30 cm (entre 1011m et 30cm).
L'encapsulation d'un nombre contrôlé de cellules souches et/ou la ré-
encapsulation, permet
de contrôler la taille et la forme désirée des tissus cardiaques obtenus.
Ainsi, la taille des tissus
cardiaques selon l'invention peut varier en fonction de l'utilisation
thérapeutique envisagée.
Le tissu compacté de cellules cardiaques humaines selon l'invention peut être
congelé, pour
favoriser son stockage.
Avantageusement, l'invention permet la production d'un nombre important de
tissus
cardiaques humains de qualité en protégeant les unités tissulaires tout au
long de leur
production par différenciation de cellules pluripotentes en cellules
cardiaques.
Les figures 7, 8 et 9 montrent que pour une population cellulaire de départ
donnée, les tissus
obtenus au sein d'un microcompartiment / capsule en passant par une phase en
cours de
différenciation avec la présence d'au moins une lumière, puis une compaction
secondaire,
présente un taux de cellules exprimant la troponine C beaucoup plus important,
en
comparaison avec des tissus différenciés avec le même protocole (et du même
lot initial de
cellules souches pluripotentes humaines) mais en culture en suspension libre.
Ainsi, la
différenciation en cardiomyocytes dans des microcompartiment et/ou par un
procédé
comprenant une compaction secondaire permet d'augmenter la qualité des tissus
cardiaques
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et donc améliore leur possibilité d'utilisation en thérapie cellulaire.
Le tissu compacté de cellules cardiaques selon l'invention peut être dissocié
en cellules. La
dissociation peut être réalisée selon des méthodes classiques connues de
l'homme du métier
notamment à l'aide d'une solution enzymatique permettant de séparer les
cellules. Les
enzymes utilisées peuvent par exemple être choisies parmi la trypsine, la
collagénase,
l'accutase et leurs mélanges. Les cellules dissociées sont préférentiellement
utilisées en
suspension ou intégrées dans un gel comme par exemple un gel de collagène ou
dans un patch.
Utilisations du tissu compacté de cellules cardiaques humaines selon
l'invention
Le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'invention peut être
utilisé en tant
lo que tel ou bien pour produire une suspension de cellules cardiaques.
En effet, le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'invention
est
particulièrement utile pour la production d'une suspension de cellules
(cellules greffons)
implantables dans le coeur d'un être humain en particulier pour le traitement
de pathologies
cardiaques. La forme, la taille et la constitution du tissu compacté selon
l'invention favorisent
une différenciation homogène avec un rendement amélioré des cellules
cardiaques au sein
du tissu compacté selon l'invention, qui peut être secondairement dissocié
avant implantation
dans le coeur.
Le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'invention est
également
particulièrement utile pour son utilisation en tant que tel comme greffon
implantable dans le
coeur d'un être humain en particulier pour le traitement de pathologies
cardiaques. La forme,
la taille et la constitution du tissu compacté selon l'invention permettent la
survie des cellules
cardiaques au sein du tissu compacté selon l'invention, avant implantation et
la réussite de
l'implantation, de la réorganisation et de la vascularisation du greffon une
fois implanté dans
le coeur.
Un autre objet de l'invention est donc le tissu compacté de cellules
cardiaques humaines pour
son utilisation, en tant que tel ou après dissociation sous forme d'une
suspension de cellules,
en thérapie, notamment en thérapie cellulaire, comme médicament, en
particulier son
utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie cardiaque,
notamment
chez un patient en ayant besoin, et préférentiellement dans le traitement
et/ou la prévention
d'une maladie ischémique cardiaque.
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Bien que les cellules dissociées obtenues à partir des tissus selon
l'invention puissent être
utilisées, elles présentent une fréquence de contraction spontanée plus élevée
que les tissus
cardiaques compactés. La vitesse de battement spontanée lente des
cardiomyocytes
différenciés au sein de la capsule n'est pas maintenue lorsque les cellules
sont dissociées et
cultivées dans des conditions 2D (figure 6).
Par traitement on entend un traitement préventif, curatif ou symptomatique,
c'est-à-dire tout
acte destiné à améliorer la vue d'une personne de façon temporaire ou
définitive, et
préférentiellement également à éradiquer la maladie et/ou arrêter ou retarder
la progression
de la maladie et/ou favoriser la régression de la maladie.
En effet les tissus compactés de cellules humaines cardiaques selon
l'invention peuvent être
utilisés pour le traitement de maladies cardiaques chez l'homme, en
particulier de maladies
ayant entrainer une ischémie d'au moins une partie du coeur, comme un
infarctus par exemple,
pour remplacer des zones lésées.
Le traitement consiste à implanter, à greffer les tissus compactés selon
l'invention ou les
cellules obtenues par leur dissociation dans le c ur, au niveau des
ventricules du coeurs, en
particulier le ventricule gauche, ou de les intégrer à un patch positionné sur
lesdits ventricules,
idéalement entre le péricarde viscéral et le tissu musculaire du ventricule,
ou ce qu'il en reste
en situation pathologique. Un dispositif d'implantation chirurgical adapté à
une implantation
dans le coeur est très préférentiellement utilisé. Il peut s'agir notamment
d'aiguilles, de
canules ou autre dispositif permettant de déposer les tissus compactés selon
l'invention ou
les cellules obtenues par dissociation des tissus compactés selon l'invention,
dans le coeur
comme par exemple ceux utilisés pour l'implantation de stents dans les artères
ou de micro
implants chirurgicaux.
Selon un exemple de mode de réalisation, l'implantation peut être réalisée par
injection
myocardique directe, notamment par sternotomie ou avec un dispositif à base de
cathéter :
les tissus compactés cardiaques selon l'invention ou les cellules obtenues à
partir de ces tissus
(avec ou sans l'ajout d'autres types de cellules) sont injectés dans la paroi
médiane du
ventricule gauche du patient à un ou plusieurs endroits.
Selon un autre exemple de mode de réalisation, l'implantation peut être
réalisée à l'aide d'un
patch épicardique. Les tissus compactés cardiaques selon l'invention ou les
cellules obtenues
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à partir de ces tissus (avec ou sans l'ajout d'autres types de cellules) sont
utilisés dans la
formation de patchs. Ces patchs peuvent ensuite être placés sur la surface
épicardique du
ventricule gauche du patient, soit par sternotomie ou par une intervention
chirurgicale
impliquant une incision et une injection du patch dans la cavité thoracique.
Dans un mode de réalisation, lors d'une même implantation, entre 1 et 1000000
unités de
tissu compacté selon l'invention sont implantées.
Dans un mode de réalisation, lors d'une même implantation, entre 104 et 1010
cellules
obtenues par dissociation d'unités de tissu compacté selon l'invention sont
implantées.
Si nécessaire, il est possible de réaliser plusieurs implantations simultanées
ou successives
dans différentes zones du coeur, en particulier dans le cas où plusieurs zones
séparées sont
touchées ou si la zone sur laquelle il faut réaliser la greffe, est trop
étendue pour ne réaliser
une greffe qu'à un endroit.
De même, sur une même zone, si une seule greffe ne suffit pas, plusieurs
implantations
peuvent être de nouveau réalisées sur la même zone, dans un laps de temps plus
ou moins
important.
L'implantation de tissus cardiaques compactés selon l'invention permet aux
patients atteints
de maladies cardiaques, et en particulier de maladies ischémiques cardiaques
d'améliorer
cliniquement la fonction cardiaque, notamment :
- d'augmenter les performances contractiles des cellules du coeur (qui peut
être mesurée par
exemple par la fraction d'éjection du ventricule gauche) et/ou
- d'augmenter l'épaisseur de la paroi ventriculaire.
Ainsi, avantageusement, l'invention permet d'améliorer la santé globale et la
qualité de vie du
patient, tout en limitant le risque d'arythmies induites par la greffe.
Selon un autre aspect, les tissus compactés selon l'invention peuvent être
utiles comme
modèle de tissu cardiaque en particulier :
- pour tester des médicaments et candidats médicaments pour leur efficacité
sur des
pathologies cardiaques et/ou leur effet sur le coeur, et/ou
- pour tester la toxicité cardiaque de substances, composés, compositions
ou médicaments.
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Ainsi l'invention a également pour objet ces utilisations.
L'invention est à présent illustrée par des exemples.
Exemples
Plusieurs exemples de microcompartiments selon l'invention sont présentés sur
les figures 1
S à 3, et des exemples de tissus compactés sont présentés sur les figures
4.
Exemple 1
L'image de la figure lb une image de microscopie à contraste de phase d'un
microcompartiment selon l'invention prise à un grossissement 4x. Elle a été
prise 5 jours après
le début de la différenciation (8 jours après l'encapsulation initiale des
cellules souches). Les
étapes utilisées pour obtenir le microcompartiment représenté sur cette figure
sont les
suivantes :
1. Les cellules souches pluripotentes induites par l'homme ont été encapsulées
dans un
hydrogel d'alginate (sans ajout de matrice extracellulaire au moment de
l'encapsulation).
2. Les cellules souches encapsulées ont été cultivées dans des milieux de
culture de cellules
souches (mTeSR1) pendant 3 jours.
3. Le 3ème jour, le milieu de culture a été changé du milieu de cellules
souches à un milieu de
différenciation cardiaque contenant une molécule activant le WNT (CHIR99021).
Le milieu est
un milieu RPMI avec supplément B27 sans insuline avec CHIR99021 Ceci est
considéré comme
le jour de différenciation 0.
4. Le 2ème jour de différenciation, le milieu a été changé pour un milieu de
différenciation
cardiaque sans molécule activant le WNT. Le milieu est un milieu RPMI avec
supplément B27
sans insuline
5. Le 3ème jour de différenciation, le milieu a été changé pour un milieu de
différenciation
cardiaque contenant une molécule qui inhibe la voie WNT (WNT-059 ou IWR1). Le
milieu est
un milieu RPMI avec supplément B27 sans insuline avec WNT-059 ou IWR1.
6. Le Sème jour de différenciation, la photo de la figures lb a été prise par
microscopie à
contraste de phase d'un microcompartiment selon l'invention prise à un
grossissement 4x.
Exemple 2
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Les images des figures 2b et 2c sont des images de microscopie à contraste de
phase d'un
microcompartiment selon l'invention prise à un grossissement 4x. Elles ont été
prises 5 jours
après le début de la différenciation (11 jours après l'encapsulation initiale
des cellules
souches). Les étapes utilisées pour obtenir le microcompartiment représenté
sur ces figures
sont les suivantes :
1. Les cellules souches pluripotentes induites par l'homme ont été encapsulées
dans un
hydrogel d'alginate (avec ajout de matrice extracellulaire au moment de
l'encapsulation).
2. Les cellules souches encapsulées ont été cultivées dans des milieux de
culture de cellules
souches (mTeSR1) pendant 6 jours.
3. Le 6ème jour, le milieu de culture a été changé du milieu de cellules
souches à un milieu de
différenciation cardiaque contenant une molécule activant le WNT (CHIR99021).
Le milieu est
un milieu RPMI avec supplément B27 sans insuline avec CHIR99021 Ceci est
considéré comme
le jour de différenciation 0.
4. Le 2ème jour de différenciation, le milieu a été changé pour un milieu de
différenciation
cardiaque sans molécule activant le WNT. Le milieu est un milieu RPMI avec
supplément 627
sans insuline.
5. Le 3ème jour de différenciation, le milieu a été changé pour un milieu de
différenciation
cardiaque contenant une molécule qui inhibe la voie WNT (WNT-059 ou IWR1). Le
milieu est
un milieu RPMI avec supplément B27 sans insuline avec WNT-059 ou IWR1.
6. Le 5ème jour de différenciation, les photos des figures 2b et 2c ont été
prises par
microscopie à contraste de phase d'un microcompartiment selon l'invention
prise à un
grossissement 4x.
Exemple 3
L'image de la figure 3b est une image de microscopie à contraste de phase d'un
microcompartiment selon l'invention prise à un grossissement 4x. Elle a été
prise 5 jours après
le début de la différenciation (11 jours après l'encapsulation initiale des
cellules souches). Les
étapes utilisées pour obtenir le microcompartiment représenté sur ces figures
sont les mêmes
que cellules pour obtenir les figures 2b et 2c. La différence réside dans un
nombre de cellules
souches encapsulées plus important.
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Exemple 4
La figure 4b et 4c sont des images de microscopie à contraste de phase prises
à un
grossissement 4x de tissus compactés selon l'invention dans des
microcompartiments. Les
tissus compactés ont été obtenus par poursuite de la différenciation au-delà
du jour 5 (déjà
décrit sur les figures 1, 2 et 3) :
1. Le 7ème jour de différenciation, le milieu de culture a été remplacé par un
milieu RPMI avec
supplément B27 avec insuline
2. Le milieu a été changé tous les 2-3 jours jusqu'au moment de l'imagerie.
Les images présentées sur les figures 4 concernent des tissus compactés 14
jours après le
début de la différenciation.
Essais comparatifs : rythme de battement spontané
La figure 5 montre que pour une population cellulaire de départ donnée, les
cardiomyocytes
différenciés au sein de la capsule (à partir de hiPSC encapsulé) ont un rythme
de battement
spontané plus lent que les cardiomyocytes différenciés avec le même protocole
(et à partir du
même lot initial de hiPSC) mais en suspension libre culture. La fréquence de
battement (en
Hz) a été obtenue à partir d'une série d'images de microscopie à contraste de
phase (à une
fréquence d'au moins 30 images par seconde) sur un microscope de table
standard avec un
grossissement 4x. Les images sont des images de microscopie à contraste de
phase prises à
un grossissement 4x montrant les cellules souches encapsulées ou libres au
début de la
différenciation (les plus externes), et les tissus compactés finaux environ 2
semaines après le
début de la différenciation (les plus internes). Dans le cas du processus de
différenciation
encapsulé, une étape intermédiaire avec un microcompartiment selon l'invention
est
présentée au jour de différenciation 5.
La figure 6 montre que la vitesse lente de battement spontané des
cardiomyocytes
différenciés dans la capsule est légèrement augmentée après le retrait de la
capsule, et très
augmentée après que les cellules aient été dissociées et mises en culture 2D.
Ainsi, les tissus
cardiaques compactés ont une fréquence de battement plus lente que celle des
cellules
isolées obtenues par dissociation desdits tissus. La fréquence de battement
(en Hz) a été
obtenue à partir d'une série d'images de microscopie à contraste de phase (à
une fréquence
d'au moins 30 images par seconde) sur un microscope de table standard avec un
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grossissement 4x. La fréquence de battement pour les tissus cardiaques
compactés selon
l'invention encapsulés et puis décapsulés a été prise environ 3 semaines après
le début de la
différenciation. Environ 3 semaines après la différenciation, une sous-
population de tissus
compactés selon l'invention a été dissociée et mis dans des conditions de
culture 2D pendant
1 semaine avant d'enregistrer la fréquence de battement. Les images sont des
images de
microscopie à contraste de phase prises à un grossissement 4x. L'image de
gauche montre les
tissus cardiaques compactés différenciés dans la capsule à partir d'hiPSC
encapsulées. L'image
de droite montre les cellules obtenues à partir d'un sous-ensemble des tissus
cardiaques
compactés encapsulés initiaux après avoir été mis dans des conditions de
culture 2D.
Essais comparatifs : topologie, amplification cellulaire et nombre de cellules
exprimant la
troponine C
Des essais comparatifs avec le même procédé de différenciation dans les mêmes
conditions
expérimentales ont été réalisés pour comparer la différenciation en cellules
cardiaques et les
tissus obtenus en 3 dimensions avec ou sans encapsulation.
Toutes les cultures ont été réalisées à partir des mêmes cellules initiales
prélevées dans une
culture 2D. Des agrégats obtenus en 3D sont cultivés (sans ajout de matrice)
avec ou sans
capsules dans une culture en suspension agitée (sous agitation à 55 rpm). La
même densité
cellulaire est utilisée au départ (e6 cellules/mL de milieu) au jour 0 de la
différenciation
(images a) et e)). Le même protocole de différenciation est appliqué dans les
deux conditions
(avec et sans capsule).
La Figure 7 présente des images de microscopie à contraste de phase prise
grossissement 4x.
Les trois images de la ligne du haut (a, b et c) sont des images de cellules
encapsulées selon
l'invention.
Les trois images de la ligne du base (d, e et f) sont des images de cellules
non encapsulées.
Les images de la colonne de gauche (a et d) représentent des cellules souches
induites en
début de différenciation en cellules cardiaques.
Les images de la colonne du milieu (b et e) représentent des cellules humaines
en cours de
différenciation cellulaire en cellules cardiaques, 3 à 7 jours après
l'initiation de la
différenciation.
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Les images de la colonne de droite (c et f) représentent des tissus cardiaques
différenciés.
On constate que la topologie est différente avec et sans encapsulation selon
l'invention. Sans
encapsulation il n'y a pas de lumen en cours de différenciation, et le tissu
cardiaque obtenu
en fin de différenciation a une forme très différente.
Sur la Figure 8 on constate que le pourcentage de cellules dans les tissus
(obtenus tels qu'à la
Figure 7c et 7f) exprimant la troponine C cardiaque est supérieur à 90% dans
les conditions
de l'invention alors qu'il est de 40% pour les tissus cardiaques obtenus dans
les mêmes
conditions mais sans encapsulation.
Sur la Figure 9 on constate que le taux d'amplification cellulaire entre le
début de la
différenciation est supérieur à 2 dans les conditions de l'invention alors
qu'il est inférieur à
0,5 pour les tissus cardiaques obtenus dans les mêmes conditions mais sans
encapsulation.
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