Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
WO 2022/096831 PCT/FR2021/051946
1
Matière première pour la nutrition animale comprenant un complexe organo-
minéral contenant du phosphate alimentaire et une substance humique
DOMAINE TECHNIQUE
[0001] L'invention concerne une nouvelle matière première contenant du
phosphate
destiné à l'alimentation animale. Cette nouvelle matière première associe du
phosphate
alimentaire à un composé organique sous la forme d'un complexe organo-minéral,
qui
permet d'augmenter la digestibilité du phosphore inorganique dans la ration
des animaux
d'élevage, et qui présente des effets bénéfiques sur certains effecteurs
biologiques.
ART ANTERIEUR
[0002] Le phosphore (P) est un élément chimique indispensable à
la vie sur terre. Il
participe en effet au bon fonctionnement du métabolisme de nombreux
organismes, faune
et flore tels que les êtres-humains, les animaux, les micro-organismes ou les
plantes, en
intervenant dans les processus énergétiques (production d'adénosine
triphosphate, ATP),
dans la synthèse osseuse et dentaire, dans la composition de l'acide
désoxyribonucléique
(ADN) et ribonucléique (ARN), dans la composition des membranes cellulaires
(phospholipides, ...) et dans la régulation de l'acidité sanguine. De fait,
l'utilisation mondiale
de phosphates minéraux, source de P, a été multipliée par 15 depuis 1950 et la
demande
devrait s'accroitre de 50 à 100 % d'ici 2050 du fait de l'accroissement de la
population
mondiale. Toutefois, les sources de P minéral (roche phosphatée) ne sont pas
renouvelables
et leur stock est voué à disparaitre à terme. Il est donc nécessaire de
trouver des solutions
alternatives ou tout du moins d'augmenter l'efficience du phosphate naturel
utilisé.
[0003] Le P est donc un élément indispensable à la bonne santé
des animaux et à la
productivité des élevages. Il est nécessaire d'ajouter à la ration alimentaire
des animaux
d'élevage un apport en phosphore minéral afin d'améliorer la prise de poids
des animaux, la
production de lait, la minéralisation des os et la fertilité.
[0004] Concernant la nutrition animale, chez les volailles et
les porcs une approche
globale est souvent privilégiée, dans laquelle le besoin est défini comme
étant l'apport
permettant de maximiser les performances et/ou la minéralisation osseuse.
Cependant, dans
le cas des animaux monogastriques l'amélioration de la digestibilité du
phosphore de la
ration peut passer par l'utilisation de sources de phosphore minéral plus
digestibles ou
consiste à rendre disponible le phosphore phytique (phytates) de la ration. En
effet, les
animaux monogastriques ne produisant pas de phytase, l'enzyme nécessaire à
l'hydrolyse
des phytates, cette forme de phosphore majoritaire dans les céréales et les
tourteaux est
très mal digérée chez ces animaux, comme chez l'Homme. Ceci passe par la
valorisation des
phytases naturelles contenues dans certaines céréales et co-produits issus de
leur
transformation pour l'alimentation humaine, et surtout par l'incorporation de
phytases
d'origine microbienne dans la ration qui constitue aujourd'hui une pratique
courante en
alimentation animale.
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831 PCT/FR2021/051946
2
[0005] Contrairement aux monogastriques il a longtemps été
convenu qu'il y avait
peu à attendre chez les ruminants de l'utilisation de phytase microbienne, les
bactéries du
rumen en produisant naturellement. Le P est l'un des minéraux essentiels aux
ruminants qui
intervient dans de nombreux métabolismes. Les bactéries du rumen ont des
besoins en P de
2.0 à 2.5 fois supérieur à celui du besoin d'entretien de l'animal. Ce besoin
est partiellement
assuré par les apports alimentaires mais les apports issus du recyclage
salivaire fournissent
une forme de P très disponible dont l'utilisation est privilégiée par les
microorganismes du
rumen. Le P joue un rôle indispensable pour les bactéries notamment pour leur
structure ou
la synthèse d'ATP.
[0006] Malgré l'importance du P au niveau du rumen (source salivaire), il
est absorbé
par l'animal dans le duodénum, le jéjunum et le gros intestin. Dans
l'alimentation d'un
troupeau laitier, le P servira à la croissance des os, au métabolisme
énergétique et à la
production de lait des animaux.
[0007] Une carence en P alimentaire peut perturber la production
de lait, la
consommation d'aliments et le rendement de l'animal et entrainer un état
d'acidose latente
qui malgré les apports alimentaires n'est pas résolu tant que la salivation
n'est pas
suffisante. La solubilité de la source n'est pas un facteur déterminant pour
gérer ce trouble.
Dans le cas d'une carence, le système des ruminants ira puiser dans leurs
réserves en P, à
savoir le P stocké dans les tissus ou dans les os. Ce type de carence à court
terme en début
de lactation n'est pas un problème s'il est corrigé rapidement avant le début
de la 2ème phase
de lactation, comme dans le cas du métabolisme du calcium (Ca).
[0008] Plus précisément, les besoins alimentaires de l'animal en
lactation sont
importants lors de la 2ème phase de lactation car c'est le moment où l'animal
reconstitue ses
réserves. L'absorption du P montre peu d'interaction avec les autres minéraux
mais le ratio
Ca/P a son importance. Il est normal entre 1 et 8 (et jusqu'à 16) mais un
excès de Ca peut
augmenter les effets de la carence en P.
[0009] A l'inverse, si l'apport est excessif par rapport au
besoin, le P se retrouvera à
termes dans les déjections. Des recherches ont donc été effectuées afin de
déterminer de
manière plus précise les besoins en P, dans le but d'assurer la santé et la
productivité des
vaches, tout en réduisant au minimum l'excrétion de ce nutriment dans les
déjections. Les
excès de P sont excrétés par voie fécale ou urinaire quand le recyclage
salivaire sature ce
qui correspond à une concentration sanguine de 2.5-3mm01/L.
[0010] Sur la base des connaissances de l'utilisation digestive
et métabolique du P, il
est possible de déterminer le bilan en P chez les différentes espèces
d'élevage, à savoir les
quantités consommées, digérées, absorbées, excrétées ou déposées dans les
tissus.
Cependant, les niveaux d'efficacité de rétention du phosphore, relativement à
l'ingéré, sont
très variables entre les espèces. L'efficacité la plus élevée est obtenue chez
le poulet
standard (62 h), suivi du porc, du poulet label rouge et de la vache laitière
(respectivement
41, 38 et 29%), les poules pondeuses et les vaches allaitantes présentant les
valeurs les
plus faibles (respectivement 21 et 15 %).
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831 PCT/FR2021/051946
3
[0011] Au cours de la digestion, la remontée du pH dans le
tractus digestif des
animaux monogastriques entraine la recomplexation des molécules ionisées de
charge
opposée initialement solubilisées dans l'estomac. Ces recomplexations
moléculaires, en
particulier entre les ions calcium et les ions phosphate diminuent
l'absorption de ces derniers
dans l'organisme. Ce phénomène de recomplexation a donc pour conséquence une
diminution de la digestibilité des nutriments et en particulier de celle des
minéraux. De plus,
le rejet dans l'environnement du P inorganique qui n'a pas été absorbé par les
animaux
représente une perte économique pour les éleveurs, et pourraient bientôt être
limités dans
le cadre du respect environnemental.
[0012] Par conséquent, il est nécessaire d'améliorer la biodisponibilité du
P
inorganique apporté dans la ration des animaux.
[0013] Il est également néfaste pour la qualité de la digestion
de surdoser le Ca. Afin
d'en limiter les effets négatifs précédemment cités dans le tractus digestif
et sur la santé des
animaux, il est donc primordial de limiter sa dose dans l'aliment.
[0014] Par ailleurs, le calcium a une action inhibitrice sur l'activité des
phytases. Les
fabricants d'aliments pour monogastriques ont donc tendance à surdoser les
phytases pour
obtenir une meilleure digestibilité globale de la ration et donc maximiser les
performances
zootechniques.
[0015] La matière première de l'invention contient un phosphate
alimentaire et une
substance humique, telle qu'un acide humique, un acide fulvique ou des
humâtes.
[0016] Les substances humiques sont couramment utilisées pour
améliorer la
digestibilité de la ration. L'art antérieur a déjà décrit des aliments ou des
matières premières
alimentaires contenant des substances humiques et du phosphate de calcium,
comme par
exemple la demande de brevet CN109198275, qui propose une matière première
pour
améliorer l'équilibre nutritionnel des carpes et favoriser leur croissance.
Cependant, dans
cette matière première, le phosphate de calcium n'est pas complexé avec la
substance
humique, dans la mesure où ils n'ont pas été mis à réagir ensemble. Les deux
composés
sont simplement mélangés à sec et broyés, si bien que le complexe ne peut pas
se former.
Par ailleurs, la demande de brevet CN109198275 ne traite pas de la
problématique de
biodisponibilité du phosphore chez l'animal.
[0017] Le besoin subsiste par conséquent d'améliorer les
performances
zootechniques des animaux d'élevage en augmentant notamment la digestibilité
du
phosphore inorganique présent dans la ration.
DESCRIPTION GENERALE DE L'INVENTION
[0018] L'invention résout ces problématiques et répond à ces besoins en
proposant
une matière première alimentaire pour la nutrition animale comprenant un
complexe
organo-minéral contenant du phosphate alimentaire et une substance humique,
ladite
substance humique engageant des liaisons physico-chimiques avec des atomes,
tels que par
exemple des atomes de calcium, et/ou avec les atomes de phosphore du phosphate
alimentaire.
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
4
[0019] Les inventeurs ont en effet trouvé de manière surprenante
que le complexe
humâtes-phosphate confère une amélioration des effets du phosphate par rapport
aux
résultats enregistrés, lorsque ce dernier est utilisé seul. Ces effets
concernent notamment
les performances zootechniques, la digestibilité du phosphore dans la ration
et la régulation
de certains effecteurs biologiques.
[0020] Les inventeurs ont en effet montré que les propriétés
nutritionnelles du
phosphore d'origine minérale peuvent être améliorées en le complexant avec une
substance
humique.
[0021] Les procédés consistant à administrer des substances
humiques et du
phosphate séparément décrits dans l'art antérieur comme matières premières
alimentaires
et à les ajouter à sec dans la ration sans les avoir au préalable fait réagir
l'un avec l'autre,
ne permettent pas d'obtenir ces effets.
[0022] Sans être lié par aucune théorie, les inventeurs pensent
que, dans le cas du
phosphate de calcium, la complexation du calcium avec la substance humique le
rend au
moins partiellement indisponible dans le tractus digestif et permet ainsi
d'augmenter à la
fois l'efficacité de la digestion du phosphore et l'efficacité d'activité des
phytases. La matière
première de l'invention permet ainsi de diminuer la dose de phosphate
nécessaire et/ou la
dose nécessaire de phytases dans les aliments.
[0023] La présente invention découle des avantages surprenants
mis en évidence
par les inventeurs de l'effet de la complexation par les substances humiques
des ions
calcium et/ou phosphates sur la biodisponibilité du phosphore lors de la
digestion chez un
animal monogastrique. La digestibilité du phosphore inorganique est en effet
améliorée en
utilisant un complexe entre du P minéral et une molécule organique à base de
substance
humique, notamment des humâtes ou des acides humiques. Ceci entraîne notamment
une
meilleure digestibilité de la ration (et du phosphore en particulier) pour
toutes les espèces,
une meilleure minéralisation osseuse (pour les poulets et les poules par
exemple ce qui
réduit les boiteries en élevage et retarde la réforme des pondeuses) et une
meilleure qualité
de la coquille des oeufs (pour les poules) ce qui réduit le taux de
déclassement des oeufs et
augmente le taux d'éclosion et la viabilité des poussins. Au-delà de ces
bénéfices
nutritionnels, la matière première de l'invention apporte également des
bénéfices pour les
éleveurs, puisqu'il permet une économie d'ingrédients et une augmentation de
la
productivité. Le fait de lier le calcium avec une substance humique limite de
nombreuses
réactions de ce cation avec les autres éléments présents dans le tube
digestif. Ces réactions
sont en effet souvent sources de pertes de performances. La matière première
de l'invention
amène donc une meilleure efficacité de la ration, et réduit ainsi les rejets
de phosphore dans
l'environnement.
[0024] Plus précisément, la matière première alimentaire permet
un maintien des
performances zootechniques s'il est incorporé à une dose permettant
d'atteindre 80% des
besoins habituels en phosphore.
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831 PCT/FR2021/051946
[0025] La matière première de l'invention permet en outre de
lutter contre les
mycotoxines car il est capable d'en adsorber à différents pH au cours de la
digestion.
[0026] Plus précisément, dans le tractus digestif, le complexe
organo-minéral est
capable d'adsorber une partie des aflatoxines et d'autres mycotoxines
présentent
5 initialement dans la ration.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
[0027] La matière première alimentaire pour la nutrition animale
peut comprendre
un complexe organo-minéral à base de phosphate alimentaire et d'une substance
humique,
ladite substance humique pouvant engager des liaisons physico-chimiques avec
des atomes
de phosphore du phosphate alimentaire. Le complexe organo-minéral peut
alternativement
comprendre une matrice de phosphate dans laquelle est dispersée la substance
humique, de
préférence en une teneur massique allant de 0.5% à 15%.
[0028] Dans un mode de réalisation particulier, le complexe
organo-minéral est une
matrice de phosphate de calcium comprenant de 0.5% à 15% en masse, de
préférence de
1.0 à 2.5% en masse d'humâtes par rapport à la masse de phosphate de calcium
et
d'humâtes.
[0029] Dans le complexe organo-minéral, la substance humique
peut engager des
liaisons chimiques avec une partie ou avec la totalité des atomes de phosphore
du
phosphate alimentaire : le phosphore peut être complexé avec la substance
humique. La
complexation du phosphore avec la substance humique dans le complexe organo-
minéral
pourra être mise en évidence par toute méthode connue de l'homme du métier,
notamment
par diffraction de rayons X (DRX) ou résonance magnétique nucléaire au
phosphore 31
(RMN31P).
[0030] Le phosphate alimentaire peut être anhydre ou hydraté. Il
peut être choisi
parmi un phosphate calcique, un phosphate magnésien, un phosphate monosodique
(MSP),
un phosphate calco-sodique et un de leurs mélanges. Dans la matière première
de
l'invention, le phosphate alimentaire peut être choisi parmi le phosphate
monocalcique
(MCP), le phosphate bicalcique (DCP), le phosphate monobicalcique (MDCP), le
phosphate
tricalcique (TCP) et leurs mélanges. Le phosphate peut être également sous la
forme de
phosphate tri magnésien.
[0031] Dans un mode de réalisation particulier, le phosphate
alimentaire contient ou
est constitué de phosphate de calcium. La substance humique est de préférence
un humâte.
[0032] Lorsque le phosphate alimentaire est un phosphate de
calcium par exemple,
les molécules de la substance humique peuvent engager des liaisons chimiques
avec les
atomes de calcium et/ou avec les atomes de phosphore contenus dans le
phosphate de
calcium. La complexation des atomes de calcium peut être mise en évidence par
les mêmes
méthodes que celles utilisées pour détecter la complexation du phosphore.
[0033] On entend par liaison physico-chimique, une liaison de
nature ionique,
hydrogène, Van der VValls ou covalente.
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
6
[0034] Le complexe organo-minéral peut être obtenu à partir
d'une source de
calcium, d'une source de phosphore et d'une substance humique. La substance
humique
peut être complexée avec le calcium et/ou avec le phosphore.
[0035] Le phosphate alimentaire de la matière première de
l'invention peut contenir
outre du phosphate de calcium, un phosphate de magnésium, un phosphate de
sodium
et/ou un phosphate mixte de sodium et de calcium.
[0036] Dans le mode de réalisation particulier de l'invention
selon lequel le
phosphate alimentaire contient du phosphate de calcium, la substance humique
intervient
en premier lieu en se complexant avec les cations de calcium. L'intérêt de la
complexation
est notamment d'augmenter la biodisponibilité du phosphore en rendant le
calcium
indisponible. La substance humique intervient en second lieu dans les
réactions
métaboliques ayant lieu dans le tractus digestif en restant complexée au moins
en partie
avec le calcium après passage dans l'estomac. La fraction libre de la
substance humique a la
possibilité de se complexer d'elle-même avec les autres cations présents dans
le tube
digestif, notamment le calcium libre ionisé.
[0037] Le phosphate alimentaire peut contenir ou être constitué
d'un phosphate
sodique, d'un phosphate calco-sodique ou d'un phosphate magnésien, et la
substance
humique peut engager des liaisons chimiques entre les molécules qu'elle
contient, et les
atomes de sodium ou de magnésium respectivement.
[0038] On entend par substance humique au sens de la présente
invention, une
molécule ou un ensemble de molécules d'origine naturelle conformes à la
définition de
l'International Humic Substance Society (IHSS), selon laquelle les substances
humiques sont
des mélanges complexes et hétérogènes de matériaux polydispersés formés dans
les sols,
les sédiments et les eaux naturelles par des réactions biochimiques et
chimiques lors d'un
processus de décomposition et de transformation de restes végétaux et
microbiens, lequel
processus porte le nom d'humification. Participent à l'humification de
nombreux composés
tels que la lignine des plantes et ses produits de transformation, les
polysaccharides, la
mélanine, la cutine, les protéines, les lipides, les acides nucléiques et les
résidus de
carbonisation.
[0039] Les principales molécules présentes dans les substances
humiques
comprennent les acides humiques (AH) de couleur brun foncé ou gris-noir, les
acides
fulviques (AF) de couleur jaune clair ou brun jaune, et l'humine de couleur
noire. Plus la
couleur de la substance humique va vers le noir, plus le poids moléculaire des
molécules
qu'elle contient augmente, plus le contenu en carbone augmente, plus le
contenu en
oxygène diminue et plus l'échange d'acidité diminue.
[0040] La substance humique qui entre dans la composition du
complexe organo-
minéral peut comprendre au moins une molécule choisie parmi les acides
humiques et les
acides fulviques.
[0041] La substance humique peut être notamment choisie parmi
les substances
humiques solubles dans l'eau dotées de fonctions carboxylate et phénolates que
l'on
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831 PCT/FR2021/051946
7
nommera humâtes dans la présente description. On pourra citer les humâtes de
sodium et
les humâtes de potassium.
[0042] Selon un mode de réalisation de l'invention, la substance
humique est choisie
parmi les humâtes de sodium, ayant une capacité d'échange ionique plus élevée,
l'ion
sodium étant plus facilement échangeable dans le tractus digestif de l'animal
en
comparaison avec un calcium - divalent ou l'ion potassium.
[0043] La substance humique peut être préparée par traitement de
substances
humiques naturellement sous forme acide, avec une quantité appropriée d'une
base forte,
tel que l'hydroxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium, pour obtenir
deshumâtes . Par
exemple, le produit de départ sous forme d'acides humiques naturellement
présent dans un
sol pourra être utilisé pour fabriquer des humâtes. On pourra se procurer les
humâtes sous
la forme d'une solution aqueuse, ou sous forme sèche que l'on pourra ensuite
dissoudre
dans de l'eau.
[0044] Une dispersion aqueuse de substances humiques peut
comprendre une
quantité non négligeable de matières insolubles. C'est le cas, par exemple,
lorsque la
composition liquide de substances humiques est préparée à partir d'une matière
brute
mélangée à de l'eau. Dans ce cas particulier, on peut isoler la fraction
soluble en la séparant
de la fraction insoluble, par exemple par décantation, filtration ou par
centrifugation.
[0045] La substance humique peut être obtenue à partir de
substances humiques
naturelles. Il peut par exemple s'agir d'une matière brute contenant des
substances
humiques, par exemple de la tourbe, de la léonardite, du lignite, de la
houille ou de
l'anthracite. Ainsi, la substance humique peut être une composition liquide de
tourbe, de
léonardite, de lignite, de houille ou d'anthracite. Dans un mode de
réalisation particulier de
l'invention, la substance humique est extraite de la léonardite.
[0046] La tourbe est une matière organique fossile formée par
accumulation sur de
longues périodes de temps de matière organique morte, essentiellement des
végétaux, dans
un milieu saturé en eau. La tourbe forme la majeure partie des sols des
tourbières. La
tourbe peut être plus ou moins riche en substances humiques selon le degré de
décomposition. Le degré de décomposition de la tourbe est classé selon
l'échelle de Von
Post qui va de H1 (Tourbe la moins décomposée) à H10 (tourbe la plus
décomposée). La
tourbe humus, c'est-à-dire une tourbe classée de H6 à H10 selon l'échelle de
Von Post, est
la tourbe préférée pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention car
elle est plus riche
en substances humiques que la tourbe classée de H1 à H5 selon l'échelle de Von
Post.
[0047] La léonardite est une roche qui peut contenir plus de 90%
en poids de
substances humiques. Cette roche a subi une dégradation plus poussée que la
tourbe, mais
moins poussée que la houille.
[0048] Le lignite est une roche sédimentaire composée de restes
fossiles de plantes.
C'est une roche intermédiaire entre la tourbe et la houille.
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831 PCT/FR2021/051946
8
[0049] La houille est une roche carbonée sédimentaire
correspondant à une qualité
spécifique de charbon, intermédiaire entre le lignite et l'anthracite. De
couleur noirâtre, elle
provient de la carbonisation d'organismes végétaux.
[0050] L'anthracite est une roche sédimentaire d'origine
organique. C'est une variété
de charbon grise, noirâtre et brillante extraite des mines.
[0051] La substance humique peut également être obtenue à partir
de substances
humiques synthétiques. Les substances humiques synthétiques peuvent par
exemple
résulter d'un processus de synthèse ou de la transformation de substances
humiques
naturelles, notamment par hémisynthèse.
[0052] La substance humique peut également être extraite de matières
organiques
(tourbe, léonardite, lignite, houille, anthracite, sols riches en substances
humiques,
composts de déchets végétaux, etc.) à l'aide d'un agent alcalin tel que
l'hydroxyde de
sodium (NaOH) ou l'hydroxyde de potassium (KOH) et éventuellement soumises à
une
purification. Les substances humiques peuvent notamment être extraites et/ou
purifiées par
des procédés bien connus de l'Homme du métier. La substance humique peut être
un
humâte de potassium ou, préférentiellement, un humâte de sodium.
[0053] La substance humique englobe les compositions liquides
d'un sel de
substances humiques. Parmi les sels préférés, on peut notamment citer les sels
d'ammonium, les sels sodiques, les sels potassiques. De préférence, on utilise
un sel sodique
de substances humiques, tel que les humâtes de sodium ou le sel sodique de
substances
humiques en raison de sa grande capacité d'échange ionique. Des sels de
substances
humiques sont vendus dans le commerce. On peut par exemple citer le sel
potassique de
substances humiques commercialisé par la société Humatex sous la marque Dralig
(CAS
68514-28-3). Le produit Dralig est préparé à partir de substances humiques
extraites de
l'oxyhumolite naturel tchèque à grand contenu de substances humiques. On peut
également
citer l'humâte de sodium (numéro CAS 68131-04-4) disponible dans le commerce
sous la
référence Nut MordanC) fabriquée par la société Hunnatex. L'homme du métier
n'aura
aucune difficulté à préparer un sel de substances humiques.
[0054] La pureté en molécules humiques de la substance humique
peut également
varier, par exemple en fonction de la source utilisée. Bien entendu, la tourbe
est
généralement moins pure en substances humiques que la léonardite ou qu'une
poudre
commerciale de substances humiques. Dans un mode de réalisation particulier,
la substance
humique comprend au moins 50% en masse sèche de molécules humiques.
[0055] La présente demande décrit par ailleurs une matière
première alimentaire qui
comprend du phosphate calcique et une substance humique. Le phosphate calcique
peut
être un phosphate monocalcique ou un phosphate dicalcique. La teneur en
substance
humique peut varier de 0.5% à 10% en masse, de préférence de 1.0% à 2.5%, et
de
préférence encore de 1.25% à 1.75% en masse, par rapport à la masse de la
matière
première, et la matière première peut comprendre de 90% à 99.5% en masse de
phosphate
calcique.
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831 PCT/FR2021/051946
9
[0056] L'invention concerne également un procédé de fabrication
de la matière
première alimentaire décrite précédemment, ledit procédé comprenant une étape
de
préparation d'une dispersion aqueuse ou d'une solution aqueuse contenant la
substance
humique, suivie d'une étape de mélange de cette dispersion ou de cette
solution avec une
source de phosphore. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de
fabrication
comprend une étape de mélange de la substance humique avec une source de
calcium, de
magnésium ou de sodium.
[0057] La complexation de la substance humique avec des atomes
de phosphore, et
éventuellement avec des atomes de calcium, de magnésium ou de sodium, et la
création de
liaisons chimiques entre la substance humique et les atomes de phosphore peut
être
obtenue grâce à la présence de la substance humique dans un mélange
réactionnel
contenant la source de phosphore et la source de calcium, de magnésium ou de
sodium.
Des liaisons chimiques peuvent se créer par insertion de la substance humique
au moment
de la réaction entre une source de phosphore et une source de calcium, de
magnésium ou
de sodium. Dans un mode de réalisation particulier, les liaisons chimiques du
complexe
organo-minéral sont créées par insertion d'humâtes au moment de la réaction
entre une
source de phosphore et une source de calcium.
[0058] La matière première alimentaire décrite précédemment est
susceptible d'être
obtenue par préparation d'une dispersion aqueuse ou d'une solution aqueuse
contenant une
substance humique, une source de phosphore, et éventuellement une source de
calcium, de
magnésium ou de sodium. Par exemple, la matière première alimentaire de
l'invention est
obtenue par préparation d'une dispersion aqueuse ou d'une solution aqueuse
contenant la
substance humique, suivie du mélange de cette dispersion ou de cette solution
avec la
source de phosphore et avec la source de calcium, de magnésium ou de sodium.
[0059] La dispersion aqueuse ou la solution aqueuse de substance humique a
de
préférence un pH basique, par exemple un pH allant de 8.0 à 12.0, de 8.0 à
11.0 ou de 10.0
à 12Ø On peut mettre en présence de l'acide phosphorique en contact avec une
substance
humique en solution aqueuse ayant un pH allant de 10.0 à 12.0, par exemple
allant de 10.5
à 11.5 aux incertitudes de mesure prêt.
[0060] Selon un mode de réalisation particulier, la matière première
alimentaire de
l'invention est susceptible d'être obtenue ou est obtenue par un procédé de
préparation
comprenant une étape de mélange d'une source de phosphore, par exemple l'acide
phosphorique, d'une source de calcium, par exemple un oxyde ou un hydroxyde de
calcium,
et d'une substance humique en solution ou en dispersion dans l'eau ayant un pH
allant de
8.0 à 12.0, par exemple une solution de substance humique. Une solution de
substance
humique qui peut être avantageusement utilisée est une solution d'humâte ayant
un pH
allant de 10.0 à 12.0, par exemple une solution d'humâte de sodium. On préfère
utiliser une
substance humique soluble dans l'eau pour préparer la matière première
alimentaire de
l'invention. On préfère également utiliser une source de phosphore soluble
dans l'eau,
comme de l'acide phosphorique, non dilué dans l'eau ou dilué dans l'eau. Le
mélange de la
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
solution de substance humique et de la source de phosphore soluble dans l'eau
est de
préférence réalisé à une température
[0061] Le mélange de la dispersion aqueuse ou de la solution
aqueuse contenant la
substance humique avec la source de phosphore, et éventuellement avec la
source
5 comprenant du calcium, du magnésium ou du sodium, peut être réalisé à une
température
allant de 40 C à 80 C, de 45 C à 80 C, de 50 C à 80 C, ou de préférence de 60
C à 80 C.
La température peut aller de 45 C à 55 C.
[0062] Un procédé de fabrication de la matière première
alimentaire peut
comprendre une étape de purification , d'extraction ou de traitement d'une
substance
10 humique prélevée à l'état naturel pour obtenir des humâtes qui pourront
ensuite être
solubilisés dans l'eau.
[0063] Dans un mode de réalisation particulier, on mélange la
substance humique en
solution dans l'eau avec une source de phosphore et une source de calcium. Le
ratio
massique entre la source de phosphore et la source de calcium est de
préférence choisi de
telle sorte à fabriquer un composé de phosphate alimentaire choisi dans le
groupe constitué
par du phosphate monocalcique (MCP), du phosphate bicalcique (DCP), du
phosphate
monobicalcique (MDCP), du phosphate tricalcique (TCP) ou un de leurs mélanges,
la matrice
du phosphate alimentaire comprenant une substance humique, de préférence des
humâtes
en une teneur allant de 0.5% à 15% en masse par rapport au composé de
phosphate
alimentaire. Par exemple, on choisit de l'acide phosphorique à 54% P205 et du
carbonate de
calcium dans un ratio massique allant de 1.1 à 1.2, de préférence égal à
environ 1.3 pour
fabriquer un phosphate bicalcique (DCP) dont la matrice contient une substance
humique.
Un autre exemple consiste à choisir de l'acide phosphorique à 54% P205 et du
carbonate de
calcium dans un ratio massique allant de 2.4 à 2.6, de préférence égal à
environ 2.5 pour
fabriquer un phosphate monocalcique (MCP) dont la matrice contient une
substance
humique. Dans ces deux exemples, on peut choisir la concentration d'une
solution aqueuse
d'humâtes de manière à obtenir un composé de phosphate de calcium alimentaire
comprenant de 1.0% à 2.5% en masse de substance humique par rapport à la masse
dudit
composé. Dans un premier mode de réalisation, on prépare une solution de
substance
humique et une solution d'acide phosphorique, on verse la solution de
substance humique
dans la solution d'acide phosphorique, puis on ajoute à ce mélange un oxyde
calcium,
chacune de ces étapes étant de préférence réalisée à une température allant de
40 C à
60 C et sous agitation. Dans un deuxième mode de réalisation, on verse de
l'acide
phosphorique non dilué dans l'eau, et une solution de substance humique sur un
oxyde de
calcium, un hydroxyde de calcium ou du carbonate de calcium.
[0064] La source de calcium qui peut être utilisée pour préparer
la matière première
de l'invention peut être du carbonate de calcium (CaCO3) ou de la chaux vive
(CaO) voire de
la chaux éteinte (Ca(OH)2). La source de phosphore peut être l'acide
phosphorique. La
source de calcium, de magnésium ou de sodium, et l'acide phosphorique
réagissent avec la
substance humique placée en solution ou en dispersion aqueuse.
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
11
[0065] La matière première de la présente invention peut être
fabriquée par diverses
méthodes selon la façon dont la substance humique est mélangée à la source de
calcium, de
magnésium ou de sodium, et à la source de phosphore. Par exemple, la substance
humique
peut être introduite simultanément mais séparément des autres matières
premières,
introduite dans un prémélange avec la source de calcium, de magnésium ou de
sodium,
mélangée à la source de phosphore avant dissolution dans l'eau, être
introduite dans la
source de phosphore une fois avoir été dissoute dans l'eau, ou introduite dans
l'eau.
[0066] Selon un mode de réalisation particulier, la substance
humique est un
mélange humâtes qui est dissout dans l'eau pour obtenir une solution aqueuse
d'humâtes,
laquelle solution est ensuite mélangée sous agitation à de l'acide
phosphorique. La
dispersion obtenue peut être mélangée à du carbonate de calcium. Le titre en
P205 de
l'acide phosphorique peut aller de 52% à 60%. La concentration en humâtes dans
la
solution aqueuse d'humâtes peut aller de 50 g/L à 250 g/L d'eau. Dans la
dispersion
aqueuse contenant les humâtes et l'acide phosphorique, l'acide phosphorique
est de
préférence dilué entre 40% et 55% de P205.
[0067] La substance humique représente par exemple entre 0,1% en
masse et 10%
en masse de la masse d'un mélange constitué i) d'une source de calcium, de
magnésium ou
de sodium, ii) de la source de phosphore et iii) de la substance humique.
Lorsque la
substance humique est à base d'humâtes, la dose d'humâtes dans la matière
première de
l'invention peut être comprise entre 1.0% et 10.0%, de préférence entre 1.0%
et 5.0%,
plus préférentiellement entre 1.0% et 3.0% en masse, et encore plus
préférentiellement
entre 1.0% et 2.5%, par exemple égal à 1.5% en masse, de la masse dudit
mélange.
[0068] Le procédé selon l'invention peut comprendre une ou
plusieurs étapes
additionnelles, par exemple une ou plusieurs étapes de granulation ou de
séchage.
[0069] La présente demande décrit une matière première destinée à
l'alimentation
animale susceptible d'être obtenue par préparation d'un mélange
essentiellement constitué
d'eau, d'une substance humique, d'une source de phosphore minérale, et
éventuellement
d'une source de calcium minérale.
[0070] Par essentiellement constitué on entend un mélange
comprend plus de
95% en masse, de préférence plus de 98% en masse, et de préférence encore plus
de 99%
en masse, et plus préférentiellement plus de 99,5% en masse, d'eau, d'une
substance
humique, d'une source de phosphore et d'une source de calcium. Par exemple, la
matière
première alimentaire est susceptible d'être obtenue, ou est obtenue, par
préparation d'un
mélange essentiellement constitué d'eau, d'humâte, d'acide phosphorique, et
éventuellement de carbonate de calcium.
Le mélange peut être obtenu à partir d'une dispersion aqueuse ou d'une
solution aqueuse
constituée d'eau et d'une substance humique, que l'on met à réagir avec une
source de
phosphore, et éventuellement avec une source de calcium. La substance humique
est de
préférence un acide humique ou un humâte, de préférence un humâte de sodium.
La source
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
12
de phosphore est de préférence l'acide phosphorique. La source de calcium est
de
préférence du carbonate de calcium, de l'oxyde de calcium ou de l'hydroxyde de
calcium.
[0071] La présente demande décrit également un additif
alimentaire pour la nutrition
animale et un aliment pour animaux comprenant un humâte de calcium et une
source de
phosphore, par exemple un phosphate. Chacune des caractéristiques qui ont été
décrites
précédemment en rapport avec l'aliment de l'invention et le procédé de
préparation de cet
aliment peut s'appliquer indépendamment l'une de l'autre à cet additif
alimentaire et à cet
aliment pour animaux.
[0072] Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation
d'une matière première
telle que décrite précédemment pour améliorer la biodisponibilité d'un
phosphore minéral
chez un animal d'élevage monogastrique. L'invention est un moyen d'apport de
minéraux et
de phosphore inorganique notamment pour les monogastriques, mais également
pour les
ruminants.
[0073] L'invention concerne également un procédé de nutrition
d'un animal
d'élevage comprenant une étape d'incorporation dans la ration de l'animal de
la matière
première décrite précédemment, cette matière première étant éventuellement
issue d'une
fabrication préalable conformément au procédé décrit précédemment.
[0074] L'invention concerne encore un procédé de fabrication
d'un prémélange ou
d'un aliment complet pour animal d'élevage. La matière première de l'invention
est destinée
à être utilisée dans des prémélanges ou des aliments complets à destination
des prémixeurs
ou des fabricants d'aliments pour animaux d'élevage.
[0075] La matière première peut être utilisée pour les volailles
(poulets de chair
standard ou label, poules pondeuses, dindes, pintades, canards et autres),
mais aussi pour
les porcins, bovins, ovins, caprins, lapins, et l'aquaculture.
DESCRIPTION DES FIGURES
[0076] La Figure 1 représente le diffractogramme à rayons X d'un
produit de
référence contenant du phosphate monocalcique dépourvu de substance humique
(MCPHO).
[0077] La Figure 2 représente le diffractogramme à rayons X d'un
produit de
l'invention contenant 1.5% d'humâtes (MCPH15).
[0078] La Figure 3 compare les deux diffractogrammes des Figures 1 et 2
précédentes.
[0079] La Figure 4 montre les spectres RMN31P d'un produit de
référence contenant
du phosphate monocalcique dépourvu de substance humique (MCPHO), et celui du
produit
d'invention contenant 1.5% d'humâtes (MCPH15).
[0080] La Figure 5 représente le spectre RMN31P d'un produit de référence
contenant
du phosphate monocalcique dépourvu de substance humique (MCPHO).
[0081] La Figure 6 représente le spectre RMN31P du produit de
l'invention contenant
1,5% d'humâtes (MCPH15).
[0082] La Figure 7 présente l'effet de l'invention sur
l'évolution du pH du milieu
ruminal de 2.0 à 6.5 heures d'incubation en condition de fermentation in
vitro.
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
13
[0083] La Figure 8 présente l'effet de l'invention sur les
concentrations en AGV du
milieu ruminai de 2.0 à 6.5 heures d'incubation en condition de fermentation
in vitro.
[0084] La Figure 9 présente l'effet de différentes doses de
l'invention sur le taux
d'adsorption de diverses nnycotoxines dans l'estomac de monogastriques en
conditions in
vitro.
[0085] La Figure 10 présente l'effet de différentes doses de
l'invention sur le taux
d'adsorption de diverses mycotoxines dans l'intestin de monogastriques en
conditions in
vitro.
[0086] La Figure 11 présente l'indice de consommation (IC) moyen
en fin de finition
(ICO-35 entre JO et 335) de lots de poulets dont l'aliment a été enrichi avec
différents MCP
contenant ou non différentes doses d'humâtes.
[0087] La Figure 12 présente la teneur en cendres et la quantité
de calcium et de
phosphore des tibias de poulets prélevés à J35 en fonction des traitements.
[0088] La Figure 13 présente la force de fracture des tibias de
poulets prélevés à 335
en fonction des traitements.
[0089] La Figure 14 présente pour chaque traitement, l'écart (
/0) de pH de viande
de poulet entre la valeur mesurée et la valeur à atteindre après 15 minutes de
maturation
(pH = 6.4) ou 7 jours de conservation (pH = 5,6).
[0090] La Figure 15 présente l'indice de consommation (IC) moyen
en fin de finition
(ICO-35 entre JO et 335) de lots de poulets dont l'aliment a été enrichi avec
un phosphate
de calcium standard ou le produit d'invention MCPH15.
[0091] La Figure 16 présente la quantité de P205 de la litière à
342 de poulets ayant
reçu dans leur aliment un phosphate de calcium standard ou le produit
d'invention MCPH15.
[0092] Exemple 1: Préparation d'un complexe d'humâtes et de
phosphate
de calcium puis caractérisation
[0093] Préparation du complexe
Plusieurs solutions aqueuses d'humâtes de sodium de concentration variable en
humâtes
allant de 100 g/L à 250 g/L sont préparées en solubilisant les humâtes de
sodium dans de
l'eau, de préférence de l'eau chauffée à 50 C.
L'humâte de sodium (numéro CAS 68131-04-4) est disponible dans le commerce
sous la
référence Nut Mordane fabriqué par la société Humatex. Le pH de ce produit
dilué à 10%
dans l'eau est compris entre 10.0 et 12.0 et sa teneur en acides humiques en
poids sec est
supérieure à 60%. La teneur en acides humiques en poids sec est égale au
complément à
100% de la teneur en cendres mesurée après calcination de l'échantillon dans
un four
électrique à 500 C pendant 60 minutes et à 805 C-825 C pendant 60 minutes
(selon le
fabricant).
Une solution d'acide phosphorique vert israélien (P205 total=54.2 /0) diluée à
50% P205 avec
de l'eau chauffée à 50 C est préparée.
Chaque solution aqueuse d'humâtes est ensuite versée sous agitation dans la
solution
d'acide phosphorique, l'agitation étant maintenue pour disperser le solide
formé et la
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
14
température maintenue à 50 C. Du carbonate de calcium (ayant une teneur totale
en CaO
supérieure ou égale à 53%) est ensuite versé dans la dispersion, puis le
mélange est agité
fortement, émotté, granulé puis séché.
Alternativement, l'acide phosphorique n'est pas dilué dans l'eau et il est
versé
simultanément à la solution d'humâtes de sodium sur le carbonate de calcium.
Le rapport massique entre l'acide phosphorique non dilué à 54% P205 dans l'eau
et le
carbonate de calcium était de 2.5 pour fabriquer du MCP.
En faisant varier la concentration de la solution d'humâtes, des phosphates
monocalciques
contenant 1.0% (noté MCPH10), 1.5% (noté MCPH15), 2.0% (noté MCPH20), 2.5%
(noté
MCPH25), 5.0% (noté MCP50) et 10.0% (noté MCP100) d'humâtes ont pu être
préparés.
Des phosphates bicalciques contenant 0% (noté DCP), 1.0% (noté DCP10), 5.0%
(noté
DCP50) et 10.0% (noté DCP100) d'humâtes en appliquant un ratio massique [acide
phosphorique à 54%P205 / carbonate de calcium] = 1.3. ont également pu être
préparés.
Dans la plupart des essais, et afin de limiter le nombre d'échantillons
d'invention mis à
l'étude, le choix s'est porté sur les doses comprises entre 1.0% et 2.5%,
préférentiellement
à 1.5%.
[0094] Caractérisation par DRX et RMN
[0095] Conditions expérimentales de l'analyse de DRX :
Les diffractogrammes ont été enregistrés sur un diffractomètre (X'Pert Pro de
marque
PANalytical) en mode réflexion et équipé d'un tube cuivre (Ka = 0.1542 nm,
45kV et 40mA)
et d'un détecteur linéaire PIXcel (longueur active = 3.347 020). Sur le trajet
du faisceau de
rayons X ont été montés comme optiques primaires des fentes de Soller de 0.04
rad, une
fente de divergence de 1/16 , un masque de 10 mm, une fente anti-diffusion de
1/8 , et
comme optiques secondaires, un filtre de Nickel et des fentes de Soller de
0.04 rad. Après
un broyage fin, les échantillons ont été compactés dans un porte-échantillon,
à chargement
par l'arrière.
[0096] Résultats de l'analyse de DRX:
Les pics du diffractogramme ont relevé que le MCP sans humâte (MCPHO) est
constitué de
deux phases cristallines : majoritairement du phosphate monocalcique
monohydraté
(Ca(H2PO4)2.H20) et minoritairement de la calcite (carbonate de calcium ;
CaCO3).
Cependant, trois pics de très faibles intensité après 65 n'ont pu être
identifiés, les
réflexions de la carte de référence n'ayant été enregistrées que jusqu'à 64
(Figure 1). Ceci
indique qu'une phase cristalline supplémentaire est présente dans le MCPHO
sans pouvoir
être identifiée par la DRX.
Les pics du diffractogramme du MCPH15 révèlent que cet échantillon contient
principalement du phosphate monocalcique monohydraté (Ca(H2PO4)2.H20),
probablement
du phosphate bicalcique anhydre (monétite Ca(HPO4)) et possiblement de la
calcite
(carbonate de calcium ; CaCO3) et du phosphate monocalcique anhydre
(Ca(H2PO4)2(Figure
2). Cependant, le diffractogramme du MCPH15 montre des pics de diffractions
moins
intenses que celui du MCPHO, ce qui indique que cet échantillon est moins bien
cristallisé.
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
Pour confirmer ceci, lorsque les deux diffractogrammes des deux échantillons
sont
superposés, il est possible de constater que la ligne de base de l'échantillon
MCPH15 entre
15 et 400 est plus haute que celle de l'échantillon MCPHO (Figure 3). Cela
indique donc la
présence d'amorphe dans l'échantillon MCPH15. En outre, les matrices
organiques ne
5 peuvent pas être identifiées par la diffraction de rayons X et
apparaissaient ainsi sous forme
de phase amorphe. Cette baisse d'intensité des pics et cette ligne de base
plus haute du
MCPH15 s'expliquent par la présence d'humâtes qui correspondent à un produit
organique
non cristallin et à phase amorphe non identifiée par la DRX. De manière
générale, les
complexes organo-minéraux caractérisés par la DRX montrent un élargissement
des courbes
10 qui signifie la présence d'un produit amorphe dans l'échantillon.
[0097] Conditions expérimentales de l'analyse RMN :
Après un broyage fin, les échantillons (poudres) ont été introduits (tassés)
dans un porte
échantillon (rotor) cylindrique en oxyde de zirconium de 4mm de diamètre fermé
par un
bouchon en Kelefle. Les analyses ont été effectuées à température ambiante
avec un
15 spectromètre Bruker Avance II 400MHz (fréquence de Larmor (31P) = 103.85
MHz), équipé
d'une tête de mesure double canaux 4mm Bruker. Les spectres 31P MAS (Magic
Angle
Spinning) ont été enregistrés à une vitesse de rotation de 12kHz avec un angle
d'impulsion
égal à d'une durée de 3micros et un temps de recyclage de 200s. Les
déplacements
chimiques sont exprimés par rapport à une solution aqueuse à 85% d'H3PO4.
Après analyse,
les échantillons ont été intégralement récupérés.
[0098] Résultats de l'analyse RMN :
La Figure 4 montre la superposition des spectres de RMN-31P des deux
échantillons analysés.
Plus précisément, la Figure 5 montre qu'après déconvolution, le spectre de
MCPHO présente
quatre signaux à 0.75, -0.15, -1.45 et -4.65 ppm. Les signaux à -0.15 et -4.65
correspondent à la présence de phosphate monocalcique monohydraté
(Ca(H2PO4)2.H20)
composé majoritaire (80%), comme le démontrait l'analyse de DRX. En outre, ces
deux
signaux correspondent à deux groupes H2PO4- qui se différencient, celui à -
4.65 étant
accepteur de liaisons hydrogène avec les protons de la molécule d'eau alors
que celui à -
0.15 serait donneur d'une liaison hydrogène. Les deux signaux plus larges à -
1.45 et 0.75
ppm caractérisent les sites cristallographiques du phosphate bicalcique
(CaHPO4) non révélé
par la DRX et en quantité minoritaire dans cet échantillon (20%).
La Figure 6 montre qu'après déconvolution, le spectre de MCPH15 présente cinq
signaux à -
0.1, -0.2, -1.75, -4.75 et -10.0 ppm. Comme dans l'échantillon MCPHO, il
s'observe les
signaux caractéristiques du phosphate monocalcique monohydraté
(Ca(H2PO4)2.H20) à -0.2
et -4.75 ppm mais en proportion plus faible (40% de l'échantillon), leurs pics
correspondant
étant plus faibles que pour MCPHO. Le pic à -1.75 ppm correspond au pic à -
1.45 ppm du
MCPHO, il s'agit donc de la présence de phosphate bicalcique (CaHPO4), à
hauteur de 10%.
Toutefois pour le MCPH15, il est impossible de distinguer l'équivalent du pic
à 0.75 ppm du
MCPHO également révélateur de la présence de ce phosphate bicalcique. Ainsi,
le signal à -
0.1 ppm particulièrement large correspondrait à la superposition de plusieurs
éléments
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
16
chimiques, à savoir : la partie manquante du phosphate monocalcique
monohydraté
(Ca(H2PO4)2.H20 ; soit 20%), la résonnance invisible de ce phosphate
bicalcique (CaHPO4;
soit 10%) et une partie cachée de phosphate monocalcique anhydre (Ca(H2PO4); à
hauteur
de 5% à 10%) seul composant phosphaté dont les déplacements chimiques peuvent
se
trouver dans la zone autour de -0.1 ppm. Bien qu'en très faible quantité, ce
dernier composé
ne peut se présenter que sous forme amorphe expliquant la forme
caractéristique du signal
très élargie. Enfin, le signal très large entre -6.0 et -12.0 ppm correspond à
des
PYrophosphates de type p-Ca2P207 amorphes, présents à environ 15% dans
l'échantillon.
Cette caractéristique amorphe est mise en évidence par la largeur du signal
qui indique que
l'environnement du P est très peu ordonné et donc modifié. Ce pic reflète le
nouvel
environnement du phosphate lié par des sites de liaison Ca-acide humique,
mettant en avant
la complexation des acides humiques avec les minéraux (Ca ou P).
L'élargissement de ces
deux pics, révélateurs de phases amorphes, met en évidence une réaction
chimique entre
les sources de phosphore et les humâtes indiquant la présence de complexes.
Ainsi, les résultats des analyses par DRX et RMN31P des deux échantillons sont
cohérents et
complémentaires. Concernant l'échantillon MCPHO, les deux méthodes confirment
la
présence de phosphate monocalcique monohydraté (Ca(H2PO4)2.H20) cristallisé.
Contrairement à la DRX, la RMN31P permet de mettre en évidence la présence de
phosphate
bicalcique autrement appelé monétite (CaHPO4) dans le MCPHO et
vraisemblablement sous
forme amorphe (signaux larges à -1.45 et 0.75 ppm de la RMN) car non détectée
en DRX.
Cela signifie que les 3 pics non identifiés au-delà de 64 ne correspondent
pas à cette
monétite. En revanche, la DRX révèle qu'il reste de la calcite (CaCO3)
cristallisée dans le
MCPHO. Enfin, la RMN31P permet d'estimer que les proportions relatives du
phosphore sont
réparties de la manière suivante : comme phase majoritaire 80% de Ca(H2PO4)2=1-
120 et
d'approximativement 20% de CaHPO4.
Concernant l'échantillon MCPH15, la RMN31P permet de confirmer la présence de
phases
cristallisées observées en DRX, à savoir : le phosphate monocalcique
monohydraté
(Ca(H2PO4)2.1-120) qui est majoritaire suivit de la monétite (CaHPO4). Du
phosphate
monocalcique anhydre (Ca(H2PO4)2) amorphe ou très peu cristallisé (car
possiblement visible
en DRX) est également présent. La RMN31P met également en évidence la présence
d'une
nouvelle espèce, les pyrophosphates de calcium ([3-Ca2P207) qui sont sous
forme amorphe
puisque non identifiés par la DRX. D'après la DRX, des traces résiduelles de
calcite semblent
également présentes. Aussi d'autres types de phases amorphes ont été
identifiés. Certaines
des phases amorphes non identifiées parfaitement par RMN sont liées à la
présence des
complexes dans l'échantillon, ce qui met en évidence qu'une réaction chimique
a eu lieu
entre les sources de phosphore et les humâtes. Des liaisons physico ¨
chimiques entre la
matrice organique de types humâtes avec les minéraux sont présentes dans le
système
(calcium et phosphore). Enfin, la RMN31P permet d'évaluer de manière très
relative la
répartition du phosphore de la manière suivante : phase majoritaire , plus que
50 % de
Ca(H2PO4)2.1120, plusieurs phases minoritaires (moins de 50 0/0) ont été
identifiées de
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
17
CaHPO4, de pyrophosphates amorphes et de Ca(H2PO4)2 partiellement
cristallisées, aussi une
phase amorphe représentée par l'élargissements des spectres (courbes)
correspondant à
notre complexe organo- minéral.
Ainsi, les deux analyses DRX et RMN révèlent la présence des phases amorphes
équivalentes
à un complexe organo-minéral issu des réactions chimiques dans le milieu entre
les acides
humiques et les composés inorganiques (phosphates de calcium).
[0099] Exemple 2: Essai in vitro sur fermenteur artificiel :
impact du
produit d'invention sur les paramètres de fermentation
Un essai en fermenteur artificiel a été conduit avec les quatre produits
d'invention MCPHO,
MCPH10, MCPH5 et MCPH100 préparés selon l'Exemple 1.
[0100] Protocole expérimental
Le principe de la fermentation artificielle repose sur l'incubation de jus de
rumen en
condition d'anaérobiose à 39 C (Menke and Steingass, 1988). La flore
bactérienne en
présence du substrat adapté reproduit les fermentations ruminales ce qui
permet de suivre
la production de gaz ainsi que les produits terminaux tels que les acides gras
volatiles
(AGV), le N-N H3 etc. en fonction des objectifs de l'étude.
[0101] Le dispositif se compose de 21 flacons de 250m1 contenant
150m1 d'un
inoculum à base de jus de rumen et de salive artificielle tamponnée (1:2). Cet
inoculum est
incubé en condition d'anaérobiose à 39 C sans substrat (Blanc) ou avec 1,25g
de substrat
(ensilage de maïs, foin, concentré : 50/30/20, apporte 2,2g de P/kg) seul
(Témoin CT) ou
avec le substrat additionné de la dose adéquate de chaque produit testé pour
avoir un
apport en phosphore identique (MCPHO à MCPH100). Le système de prélèvement des
flacons permettra de réaliser une cinétique à 2h, 4h et 6h30. La Tableau 1
rappelle le design
expérimental de l'essai.
[0102] [Tableau 1] Design expérimental de l'essai de fermentation in vitro
en
présence des produits d'invention
Concentration Dose produit Nb
Produit Substrat
P(%) (g/J/VL) flacons
CT 4
MCPHO 22,4 100 4
EM/F/C
MCPH10 50/30/20 22,5 99,6 4
MCPH5 21,9 102,3 4
MCPH 100 21,7 103,2 4
Blanc 1
Total 21
[0103] Résultats
La Figure 7 donne l'évolution du pH en début et fin de fermentation. Les
traitements et le
temps ont un effet significatif (p.val < 0,001). La dose haute (10%) d'acide
humique dans le
MCP augmente le pH par rapport au témoin et aux autres traitements. De plus,
l'interaction
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
18
traitement*temps est significative (p.val = 0,06). Il semble donc que
l'impact des
traitements est variable en fonction des points de cinétique.
[0104] La Figure 8 montre que les concentrations en AGV
augmentent au cours du
temps (p.val < 0,001). Certains traitements en particulier tendent à augmenter
la production
d'AGV totaux par rapport au Témoin CT (p.val < 0,10). L'étude statistique de
ce paramètre
met en évidence une interaction significative entre les traitements et le
temps (p.val =
0,02). Les résultats de l'étude statistique à chaque temps montrent qu'après
2h de
fermentation les doses fortes en acides humiques tendent à réduire la
production en AGV
(p.val = 0,07). Après 4h, les traitements n'ont pas d'effet (p.val > 0,10).
Enfin, après 6h, la
supplémentation en MCP augmente la production d'AGV et les formules avec 1% et
10%
d'acides humiques favorisent cet effet (p.val < 0,01).
[0105] Conclusion
Cette étude in vitro a permis d'évaluer l'effet du complexe MCP-Humâtes sur
les
fermentations du rumen. La supplémentation en complexe MCP-Humâtes limite la
baisse du
pH au cours de la fermentation dans ces conditions de batch fermé. De plus,
elle améliore
la production d'AGV et donc l'apport en énergie pour le ruminant.
Exemple 3: Essai de digestion in vitro monogastrigue : impact du produit
d'invention sur la digestibilité des minéraux Ca, P et Mg
Le présent essai de digestion in vitro a pour objectif d'évaluer la
digestibilité des minéraux
Ca, P et Mg des produits d'invention de l'Exemple 1. Afin de confirmer les
résultats, l'essai a
été répété une fois. Les résultats des deux essais in vitro menés sont
présentés ainsi : essai
1 et essai 2 ci-après.
[0106] Protocole expérimental
Le dispositif utilisé est un Bain-Marie composé de 15 places pouvant
accueillir chacune un
tube Eppendorf de 50 ml contenant chacun un échantillon d'aliment de 1,0 g.
Les
échantillons sont mis à incuber à 40 C. Un essai se déroule en 3 étapes afin
de mimer la
digestion des poulets en croissance, dans le jabot (amylase, pH : 5.8, durée :
35 min), puis
le ventricule succenturié (pepsine, pH : 2.7, durée : 42 min) et enfin dans
l'intestin jusqu'à
la phase iléale (pancréatine, pH : 6.5, durée : 170 min).
[0107] Le Bain-Marie pouvant accueillir 15 échantillons, un essai est
réalisé sur 1
jour afin d'avoir un nombre suffisant de répétitions par aliment (n = 3). Sur
les 15 tubes, un
tube sert à vérifier l'absence de contamination par les minéraux (blanc, pas
d'échantillon) et
un tube sert à recevoir du son de blé (standard du laboratoire) pour vérifier
le bon
déroulement de l'essai. Neuf tubes servent à recevoir des échantillons
d'aliment complets
pour poulets en croissance qui contiennent les produits d'invention aux doses
d'humâtes
suivantes : 0% et 1.5%.
[0108] La composition chimique des aliments mis à digérer est
donnée dans le
Tableau 2.
[Tableau 2]. Composition nutritionnelles des deux aliments expérimentaux pour
poulets en
croissance.
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
19
% Aliment MCPHO Aliment MCPH15
Humidité 17.5 11.0
MS 82.5 89.0
MM 6.0 5.7
MO 94.0 94.3
Protéines 18.8 18.8
Ca 0.84 0.78
0.49 0.48
Mg 0.17 0.16
Na 0.17 0.16
Ca/P 1.71 1.63
La digestibilité in vitro s'exprime par le calcul de la solubilité des
minéraux. C'est-à-dire que
plus la quantité de minéraux dans le liquide du bol alimentaire (jus iléal)
sera importante
meilleure sera l'absorption potentielle de ces minéraux. La solubilité se
calcule ainsi :
Solubilité (0/0) = quantité de minéral dans le jus iléal / quantité de minéral
dans les 1 g
d'aliment mis à digérer.
[0109] Résultats
Un essai de digestion in vitro a été mené où MCPHO et MCPH15 ont été comparés.
Les
résultats étaient les suivants.
lo [0110] La solubilité des aliments poulets pourvus en MCPHO ou MCPH15
fabriqués
selon l'exemple 1 est donnée dans la Tableau 3.
[Tableau 3] Solubilité des minéraux de l'essai de digestion in vitro
monogastrique en
fonction des traitements à base ou non du produit d'invention (Moy ET).
Solubilité Solubilité P Solubilité
Mg
Aliment
Ca (0/0) (0/0) (0/0)
MCPHO 2 59.6 ( 0.74) 68.2 ( 3.15) 57.8 (
2.99)
MCPH15 3 62.9 ( 0.91) 72.2 ( 0.92) 62.2 (
0.69)
p.val 0.02 0.11 0.08
[0111] La solubilité du calcium est impactée significativement
par la présence
d'humâtes (p.val = 0.02). En outre, la solubilité du calcium est
significativement plus élevée
de 3 points en présence de 1,5% d'humâtes qu'en son absence. De la même façon,
la
solubilité du phosphore est plus élevée non significativement (p.val = 0.11)
de 4 points en
présence d'humâtes qu'en son absence. Enfin, la solubilité du magnésium est
également
plus élevée non significativement (p.val = 0.08) de 4 points en présence
d'humâtes qu'en
son absence.
[0112] Conclusion
Les résultats ont montré que les solubilités du Ca et du P sont impactées dans
l'aliment de
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
l'essai par la présence de MCP pourvu en humâtes. Ces résultats montrent que
les solubilités
du Ca et du P sont significativement meilleures en présence d'humâtes (+ 3 et
4 points
respectivement). La solubilité du Mg est systématiquement significativement
meilleure (de 1
à 4 points) en présence d'humâtes, quel que soit l'essai de digestion.
5 [0113] Exemple 4: Etude in vitro de la capacité d'adsorption des
mycotoxines par le produit d'invention dans le tractus digestif de
monogastriques
[0114] La présente étude in vitro a pour but d'évaluer la
capacité d'adsorption de
mycotoxines du produit d'invention dans les conditions de digestion des
monogastriques. Le
10 principe consiste à mettre le produit en contact avec une dose donnée
de mycotoxines à
une température et un pH donnés.
[0115] Protocole expérimental
Quatre mycotoxines ont été choisies en fonction de la récurrence de leur
présence dans les
aliments ou matières premières végétales à destination des monogastriques mais
également
15 en fonction de la sensibilité des volailles et porcins (jeunes et
adultes) envers elles. La dose
de chacune de ces quatre mycotoxines a été déterminée en fonction de la
réglementation
européenne (aflatoxine Bi) et de la sensibilité des deux espèces (zearalenone,
ochratoxine
A et deoxynivalénol). Ainsi, trois doses (0.5%, 0.8% et 1.0%) du produit
d'invention
MCPH15 ont été mises en contact avec 100 à 900 ng/ml de mycotoxines mélangées
20 (Tableau 4).
[Tableau 4] Doses de mycotoxines et de produit d'invention introduites dans le
système de
digestion in vitro monogastrique
Dose de mycotoxine Dose de produit
d'invention
Mycotoxine
(ng/ml) (g/100g)
aflatoxine B1 20
zearalenone 250 0.5
0.8
ochratoxine A 100
1.0
deoxynivalénol 900
[0116] La concentration en mycotoxines a été mesurée après
chaque temps
d'incubation pour déterminer la quantité adsorbée par le produit.
[0117] Les concentrations de mycotoxines ont été mesurées par
UHPLC-MS / MS.
Plus précisément, une solution de phosphate tamponnée a été préparée à 0,1 M à
pH 2,50
0,05 (pl-lestomac moyen entre le porc et la volaille) et enrichie de
mycotoxines aux
concentrations énumérées ci-dessus. L'échantillon a été ajouté aux solutions
enrichies en
mycotoxines et la suspension a ensuite été incubée à 40 C pendant 1 heure. La
suspension
a ensuite été centrifugée et le surnageant a été échantillonné. Le surnageant
restant a été
rejeté, et le matériel d'essai a ensuite été remis en suspension dans une
solution de
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
21
phosphate tamponnée 0,1 M à pH 6,80 0,05 (pHintestin moyen entre le porc et
la volaille)
avant d'être incubé à 40 C pendant 3 heures supplémentaires. La suspension a
été à
nouveau centrifugée et le surnageant a été échantillonné. Les solutions
d'échantillons ont
été enrichies d'étalons internes marqués isotopiquement avant d'être analysées
par UHPLC-
s MS / MS. La quantification a été réalisée à l'aide de solutions
d'étalonnage externes
enrichies d'étalons internes marqués isotopiquement. Tous les échantillons ont
été préparés
en quintu pl icata.
[0118] Le calcul du taux d'adsorption est le suivant :
Taux d'adsorption estomac (0/0) = ([mycotoxine]initiale
[MYCCOXine]surnageant estomac)/
[mycotoxine]
Taux d'adsorption final (0/0) = 1-((rmycotoxinelsurnageant estomac -I-
[MYCCOXine]surnageant intestin)/
[mycotoxine]initiale)=
[0119] Résultats
Les résultats montrent que plus la dose de produit est élevée dans le système,
plus le taux
d'adsorption est élevé. Les taux d'adsorption à pH bas (niveau estomac) sont
également
plus élevés qu'à pH haut (niveau intestin). Au passage dans l'intestin, la
remontée de pH a
pour conséquence une certaine désorption des mycotoxines. Plus précisément, la
capacité
d'adsorption est par ordre décroissant : aflatoxine > zéaralénone >
ochratoxine >
déoxynivalénol. Une fois dans l'intestin, le taux de désorption (quantité de
mycotoxines
relarguées dans le système car non retenues par le binder) est respectivement
de 20, 37, 50
et 100% pour déoxynivalénol, aflatoxine, zéaralénone et ochratoxine. Le
produit ne présente
donc aucune capacité d'adsorption dans l'intestin pour cette dernière (Figures
9 et 10).
Exemple 5 - Essai 1 in vivo sur volaille de chair : effet du produit
d'invention sur
les performances, le métabolisme et la qualité de viande
[0120] Conditions d'étude :
Essai zootechnique sur 48 cages de 40 poulets mâles au sein d'un bâtiment
d'élevage
conventionnel présentant un indice de consommation standard (IC 135 = 1.50).
[0121] Aliment :
Distribution de six aliments (soit 8 répétitions par aliment) à des poulets de
chair de souche
Ross 308 pendant 35 jours d'élevage.
L'aliment a été fabriqué à façon avec une incorporation des produits testés
lors du mélange
des matières premières.
L'aliment ne contient pas de phytase microbienne et les matières premières
choisies sont
pauvres en phytases endogènes.
Produits testés : phosphates monocalciques pourvus ou non en humâtes. Les
doses
d'humâtes dans le produit d'invention varient de 1.0 à 2.5%.
[0122] Mesures :
Les mesures suivantes ont été réalisées en cours d'élevage :
- Pesée collective à JO, 17, J13, 121 et 128 (poids total des animaux/nb
d'individu) et
Pesée individuelle à 135;
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
22
- GMQ (gain moyen quotidien) à 37, 313, 321, J28 et 335 (poids moyen/nb de
jours de
la période) ;
- Consommation d'aliment à 37, 313, 321, 328 et J35 (pesée des reliquats
d'aliment à
chaque âge, en amont chaque sac d'aliment a été pesé et identifié) ;
- IC (indice de consommation) à 37, 313, 321, 328 et 335 (GMQ/poids
d'aliment
consommé pour chaque période) ;
- Dosage des minéraux sanguins à 335
- Dosage des minéraux dans les tibias à 335
- Qualité des tibias :
o Test latency-to-lie à 327
o Force et résistance osseuse post-mortem
- Qualité de la viande post-mortem
Les conditions de l'étude sont résumées dans la Tableau 5 ci-dessous.
[Tableau 5] Conditions de l'essai sur in vivo poulets de chair
Caractéristiques élevage Indice de consommation (IC) standard
3 phases : Démarrage (30-313), Croissance (J13-328) et Finition (328-
Phases alimentaires
335)
Recommandations Ross : 95% d'énergie métabolisable, protéines et
lipides
Apport de P sous forme de phosphate monocalcique (MCP)
Démarrage :100% de P digestible dans les six aliments
Croissance et finition :
Caractéristiques Aliment - 100% de P digestible avec MCP dans aliment
témoin positif
- 80% de P digestible avec MCP dans aliment
témoin négatif
Remplacement du MCP par le produit de l'invention à hauteur de
80% de P digestible dans les quatre derniers aliments.
Produits testés : produits d'invention contenant de 1.0 à 2.5%
d'humâtes.
Poids, Gain Moyen Quotidien, Consommation aliment, IC
Mesures zootechniques
Qualité de litière
Mesures individuelles Poids à 335
Mesures métabolisme Dosages sanguin à 335
Dosages de minéraux dans les tibias à 335
Mesures Os Test latency-to-lie à 327
Mesures de la résistance osseuse post-mortem
Poids de carcasse et des pièces de viande
Qualité de viande Evaluation du wooden breast et white stripping
pH de la viande
Nombre d'animaux 8 répétitions de 40 mâles
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
23
[0123] Résultats de l'étude in vivo
Les résultats ont montré des effets sur l'indice de consommation [Fig. 11], la
qualité [Fig.
12] et la résistance osseuse [Fig. 13] et le pH de la viande [Fig. 14].
[0124] A plus faible dose de P digestible dans l'aliment, l'IC est meilleur
de -2 points
(-1%) avec MCPH10 et MCPH15 comparativement au témoin positif (p.val = 0.05)
[Fig. 11].
De même, le pH de la viande est au plus proche de l'objectif au bout de 15
minutes de
maturation (pH = 6.4) avec l'apport de MCPH20 (p.val = 0.02) alors qu'à 7
jours de
conservation (pH = 5.6) c'est le cas avec l'apport de MCPH10 (p.val = 0.13)
[Fig 14].
A dose de P digestible égale dans l'aliment, la force de fracture des tibias
est 10% plus
élevée et 12% plus élevée respectivement avec MCPH10 et MCPH20 comparativement
au
témoin négatif (p.val = 0.004) [Fig 13]. En outre, le taux de cendres et les
quantités de Ca
et P dans ces mêmes tibias sont plus élevés de 0.4 (p.val = 0.001), 0.8 (p.val
= 0.004) et
1.7% (p.val = 0.04) respectivement avec l'apport de MCPH10 comparativement au
témoin
négatif [Fig 14]. Ainsi, à quantité de nutriments égale, 80% de P digestible
dans la ration
apporté à l'aide du produit d'invention permet d'obtenir un meilleur IC
qu'avec 100% de P
digestible apporté avec un phosphate monocalcique standard. De la même façon,
à quantité
de nutriments égale dont en P digestible, le produit d'invention permet
d'obtenir de
meilleurs résultats de qualité osseuse et de conservation de la viande.
[0125] Exemple 6 - Essai in vivo sur volaille de chair : effet du produit
d'invention sur les performances, la qualité des pattes et la litière
[0126] Conditions d'étude
Essai zootechnique sur 16 cages de 30 poulets mâles au sein d'un bâtiment
d'élevage
conventionnel présentant une prévalence de 70% minimum en pododermatite et un
indice
de consommation standard (IC = 1.50 à 335 et 1.65 à 342).
[0127] Aliment :
Distribution de deux aliments (soit 8 répétitions par aliment) à des poulets
de chair de
souche Ross 308 pendant 42 jours d'élevage. L'aliment a été fabriqué à façon
avec une
incorporation des produits testés lors du mélange des matières premières. En
fin de
fabrication, une phytase est ajoutée on-top dans les aliments à une dose
équivalente de 500
FTU/kg. Produits testés : phosphates monocalciques pourvus ou non en humâtes
(Aliment
témoin : MCPHO ; Aliment test : MCPH15).
[0128] Mesures :
Les mesures suivantes ont été réalisées en cours d'élevage :
- Pesée collective à 30, 37, 313, 321, 328 et 335 (poids total des animaux/nb
d'individu)
et Pesée individuelle à 342 ;
- GMQ (gain moyen quotidien) à 37, 313, 321, 328, 335 et 342 (poids
moyen/nb de
jours de la période) ;
- Consommation d'aliment à 37, 313, 321, 328, 335 et 342 (pesée des
reliquats
d'aliment à chaque âge; en amont chaque sac d'aliment a été pesé et identifié)
;
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
24
- IC (indice de consommation) à 37, J13, J21, J28, J35 et 142 (GMQ/poids
d'aliment
consommé pour chaque période) ;
- Qualité de la litière à J7, J13, J21, J28, J35 et 342 (score litière en
fonction de la
grille ITAVI, institut technique avicole français) ;
- Pododermatites à J21 et J42 (score selon la grille de notation ITAVI) ;
- Résidu de P dans la litière à J21 et J42 (2 prélèvements par cage, un
échantillon à
mi-distance entre le bord de cage côté couchage et la ligne de pipette et à un
tiers
entre la mangeoire et le bord de cage ; un échantillon à mi-distance entre le
bord de
cage côté couchage et la ligne de pipette et à deux tiers entre la mangeoire
et le
bord de cage) par dosage au spectromètre d'émission atomique à plasma à
couplage
inductif (ICP-OES) du P après minéralisation à l'eau régale à chaud.
[0129] Les conditions de l'étude sont résumées dans la Tableau 6
ci-dessous.
[Tableau 6] Conditions de l'essai sur in vivo poulets de chair
70% de prévalence de pododermatite
Caractéristiques élevage
Indice de consommation (IC) standard
3 phases : Démarrage (30-313), Croissance (313-328) et Finition (328-
Phases alimentaires
342)
Recommandations Ross : 6% d'énergie métabolisable, 10% de protéines
brutes, 10% de lysine digestible, 6% de Calcium, 10% de Phosphore,
11% ratio Ca/P par rapport aux besoins.
Apport de P sous forme de phosphate monocalcique (MCP)
Dose standard (500 FTU/kg) de Phytase on-top.
Caractéristiques Aliment
Démarrage : 100% de P digestible dans les deux aliments
Croissance et finition : Remplacement du MCP par le produit de
l'invention à hauteur de 80% de P digestible (22.7% P, 17.0% Ca et
0.0% Na) dans l'un des deux aliments.
Produits testés : MCPHO et MCPH15
Poids, Gain Moyen Quotidien, Consommation aliment, IC
Mesures zootechniques
Qualité de litière
Mesures individuelles Poids à 342 et mesures de pododermatites
Humidité
Mesures sur litière
Phosphore
Nombre d'animaux 8 répétitions de 30 mâles
[0130] Résultats de l'étude in vivo
Parmi les résultats obtenus, des effets significatifs ont été observés sur
l'indice de
consommation (IC) sur la période 0-35 jours comme l'illustre la Figure 15.
CA 03196681 2023- 4- 25
WO 2022/096831
PCT/FR2021/051946
Cela montre que l'IC est plus faible significativement de 2 points (-1%; p.val
= 0.056) sur la
période 0-35 jours avec le produit d'invention (MCPH15) en comparaison du
témoin MCPHO.
Ce résultat confirme ce qui avait déjà été observé dans l'essai présenté
précédemment. De
plus, à dose de P digestible égale dans l'aliment, le produit d'invention
permet de diminuer
5 significativement (p.val = 0.001) de 14% la quantité de P205 dans la
litière à 342 par rapport
à l'apport d'un phosphate monocalcique standard (Figure 16).
CA 03196681 2023- 4- 25
