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WO 2022/136536 1
PCT/EP2021/087268
Nouveau procédé de préparation d'un isolat de protéines cationiques de
lactosérum
et le produit ainsi obtenu
La présente invention se rapporte à un nouveau procédé de préparation d'un
isolat de protéines
cationiques de lactosérum de pureté élevée en lactoferrine.
La Demanderesse amis au point un procédé d'obtention d'un isolat de protéines
de lactosérum
dont la pureté protéique en lactoferrine est supérieure à 90% ; ce procédé
permet en outre le
contrôle de la teneur en vitamine B12 (cobalamine) dans l'isolat de
lactoferrine.
Ce procédé est caractérisé d'une part par une utilisation de matière laitière
préalablement
concentrée (telle que le lait écrémé concentré ou le lactosérum concentré) par
une technologie
membranaire (telle que l'osmose inverse, la nanofiltration, ou
l'ultrafiltration) et d'autre part
par une extraction sélective en utilisant les résines échangeuses de cations
fortes de type
sulfopropyl (SP) packées dans une colonne de chromatographie radiale. La
fraction pure en
lactoferrine éluée est concentrée et déminéralisée par ultrafiltration afin
d'obtenir un isolat de
protéines cationiques de lactosérum dont la pureté en lactoferrine est
supérieure à au moins
90% et de préférence à 95%. Cet isolat liquide obtenu est débactérisé ou
stérilisé par une
microfiltration et optionnellement séché par atomisation (spray-dry) ou
lyophilisation (freeze-
dry) pour obtenir l'isolat en poudre.
Le procédé de préparation d'un isolat de protéines cationiques de lactosérum
de pureté élevée
en lactoferrine comprend les étapes a) à f) suivantes :
a) La matière première de départ peut être un lait de mammifère préalablement
écrémé et
concentré par une technologie membranaire ; il peut aussi s'agir d'un mélange
de lait de
mammifère préalablement écrémé et concentré par une technologie membranaire et
de lait
écrémé (non concentré) ; le lait de mammifère est par exemple du lait de vache
ou du lait
de chèvre ; la matière première de départ peut aussi être du lactosérum issu
de lait de
mammifère et préalablement concentré ;
i. lorsque la matière première de départ est préparée avec un lait mammifère
tel que du lait de vache ou du lait de chèvre, il est écrémé et
optionnellement
pasteurisé, par exemple par un traitement thermique entre 60 et 78 C de courte
durée (un traitement thermique minimum de niveau équivalent de 72 C
pendant 15 secondes ; l'écrémage peut être exécuté soit avant ou après la
pasteurisation) ou débactérisé par une microfiltration avec une membrane de
porosité entre 0,8 et 1,4 win, puis concentré par osmose inverse ((Ill) ou
nanofiltration (NF) ou ultrafiltration (UF) ; pour la mise en oeuvre du
procédé,
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on peut aussi utiliser un mélange de lait écrémé (non concentré) et de lait
écrémé préalablement concentré par une technologie membranaire telle que
décrite ci-avant ; le produit à traiter à l'étape b) a de préférence une
concentration en matière protéique (MP) entre 40 et 72 g/L, de préférence
entre
43 et 57 g/L; quand une membrane d'OI est utilisée, la concentration de
matière sèche (MS) de lait écrémé pasteurisé est entre 110 et 200 g/L, de
préférence entre 120 et 160 g/L ;
ii. lorsque la matière première de départ est préparée avec du lactosérum, il
peut être concentré après séparation des caséines, par acidification ou action
de présure, soit par microfiltration (dont la membrane a une porosité
d'environ
0,1 gm), concentré par osmose inverse (01) ou nanofiltration (NF) ou
ultrafiltration (UF) ; pour la mise en oeuvre du procédé, on peut aussi
utiliser
un mélange dc lactosérum (non concentré) et de lactosérum préalablement
concentré par une technologie naembranaire telle que décrite ci-avant ; le
produit à traiter à l'étape b) a de préférence une concentration en protéines
entre 20 et 100 g/L, de préférence entre 30 et 80 g/L;
Il convient de noter que les traitements de pasteurisation et de
microfiltration ne sont pas
indispensables pour la conduite du procédé.
b) extraction sélective de protéines cationiques comprenant les étapes
suivantes :
i. passage de la matière première de départ (par exemple, un lait écrémé
pasteurisé, préconcentré) au travers d'une colonne de chromatographie en
flux radial ( radial flow chromatography ), contenant les résines
échangeuses de cations fortes de type sulfopropyl SP, de préférence supérieur
à 100 grn de diamètre (par exemple, SP Sepharose Big Beads de Cytiva
Sweden) :
- Le volume de matière première de départ (exprimé en volume
équivalent à celui de la matière première non concentrée ; c'est-à-dire
que le volume indiqué est celui qu'avait la matière première avant
d'être concentrée) est compris entre 40 et 500 fois, en particulier entre
80 et 500 fois de volume des résines (BV, Bed Volume), de préférence
entre 80 et 300 BV ;
- La vitesse linéaire de passage de matière première de départ est
comprise entre 1,0 et 4,0 m/h, de préférence entre 2,0 et 3,0 m/h ;
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ii. rinçage avec de l'eau déminéralisée, de préférence traitée par une
membrane d'OI (eau osmosée) :
- Le volume d'eau déminéralisée est compris entre 2 et 6 BV, de
préférence entre 3 et 5 BV;
- La vitesse de passage d'eau déminéralisée est comprise entre 3,0 et
5,0 m/h, de préférence entre 3,5 et 4,5 m/h ;
élution des protéines cationiques fixées avec une solution saline (NaCl
dans de l'eau déminéralisée, de préférence de l'eau osmosée) à conductivité
électrique entre 30 et 50 mS/cm
- Le volume de la solution saline est compris entre 4 et 8 BV, de
préférence entre 5 et 7 BV ;
- La vitesse de passage de la solution saline est comprise entre 0,3 et
2,0 m/h, de préférence entre 0,5 et 1,0 m/h ;
iv. élution des protéines cationiques fixées avec une solution saline (NaCl
dans de l'eau déminéralisée, de préférence de l'eau osmosée) à conductivité
électrique entre 80 et 140 mS/cm, de préférence entre 90 et 110 mS/cm :
- Le volume de la solution saline est compris entre 3 et 6 BV, de
préférence entre 4 et 5 BV ;
- La vitesse de passage de la solution saline est comprise entre 0,5 et
2,5 m/h, de préférence entre 1,0 et 2,0 m/h ;
L'étape de passage sur des résines échangeuses de cations sert à la fixation
de protéines
cationiques présentes dans la matière première de départ tout en laissant
passer des
constituants majeurs du lait écrémé tels que le lactose, les minéraux, les
protéines acides
comme les caséines, la P-lactoglobuline, l'a-lactoglobuline, l'albumine
sérique et la
plupart des immunoglobulines. La première étape d'élution sert à une
extraction sélective
de protéines cationiques spécifiques en gardant la majorité de la
lactoferrine, la protéine
majeure de protéines cationiques de lait, fixée sur les résines. La fraction
pure de
lactoferrine bovine est donc éluée dans le deuxième éluat.
c) concentration des protéines cationiques de pureté élevée en lactoferrine
éluées dans la
solution saline en utilisant une membrane d'ultrafiltration ayant un seuil de
coupure
(MWCO) compris entre 10 et 20 lcDa ;
d) déminéralisation des protéines cationiques de pureté élevée en lactoferrine
par une
diafiltration avec de l'eau déminéralisée, de préférence l'eau osmosée, en
utilisant une
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membrane d'ultrafiltration de MWCO compris entre 10 et 20 kDa pour atteindre
un ratio
cendres/protéines compris entre 0,001 et 0,03, de préférence entre 0,003 et
0,01 ;
e) microfiltration avec une membrane ayant un seuil de coupure compris entre
0,2 et 1,4
m, de préférence 0,8 et 1,4 pin en double couche, de la solution concentrée de
protéines
cationiques spécifiques afin d'en réduire la charge microbienne ;
f) optionnellement, séchage par atomisation ou par lyophilisation de la
solution concentrée
de protéines cationiques spécifiques préalablement microfiltrée afin d'obtenir
un isolat de
lactoferrine en poudre.
Avantageusement, l'utilisation d'une matière laitière de mammifères (par
exemple, le lait de
vache écrémé pasteurisé, le lactosérum de fromagerie issu de lait de chèvre
pasteurisé)
concentrée par membrane UF/NF/01 permet de réduire la vitesse de passage de
flux pour la
quantité équivalente de protéines présente pour un passage à travers d'une
colonne
d'extraction. Grâce à cette prolongation de temps de contact avec les résines
échangeuses de
cations fortes de type SP, l'efficacité d'extraction des protéines cationiques
est nettement
améliorée.
En outre, étonnamment, l'utilisation d'une colonne flux radial (ex. celle de
Albert Handtmann
Armaturenfabrick GmbH), en raison de la géométrie trapézoïdale de cette
colonne, permet de
supporter durablement la pression générée par passage d'une matière laitière
de mammifères
concentrée à travers de résines packées (packed resins).
Cette combinaison d'une matière laitière concentrée et une colonne de flux
radial est
essentielle pour exécuter une production industrielle de façon stable et
régulière.
Un autre avantage du procédé selon l'invention est qu'il peut être conduit
efficacement dans
une large gamme de température ; en particulier, alors que les fabricants de
résine
recommandent une mise en oeuvre à des températures comprises entre 30 et 50 C,
la
Demanderesse est parvenue à mettre au point un procédé efficace à froid, c'est-
à-dire à des
températures inférieures à 15 C, de préférence, inférieures à 10 C.
La présente invention se rapporte ainsi à un isolat de protéines cationiques
de lactosérum
enrichi en lactoferrine obtenu ou susceptible d'être obtenu par le procédé
selon l'invention,
tel que la proportion de protéines sur matière sèche est supérieure ou égale à
90% en poids et
dont la proportion de la lactoferrine sur les protéines totales est supérieure
à 90% en poids, de
préférence supérieure à 95% en poids, encore préférentiellement supérieur à
98% en poids.
La présente invention se rapporte également à un isolat de protéines
cationiques de lactosérum
enrichi en lactoferrine issu de lait ou de lactosérum issu de lait de vache ou
de lait de chèvre
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obtenu ou susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention dont la
proportion de
protéines sur matière sèche est supérieure ou égale à 90% en poids, la
proportion de la
lactoferrine sur les protéines totales est supérieure à 95% en poids (p/p), de
préférence
supérieure à 98% en poids, et contenant la cobalamine sous forme complexe avec
transcobalamine à une concentration inférieure ou égale 5 g/g de protéines,
en particulier, la
concentration de cobalamine sous forme complexe avec la transcobalamine est
comprise entre
1 à 5 g/g de protéines.
La présente invention se rapporte encore à un isolat de protéines cationiques
de lactosérum
enrichi en lactoferrine issu de lait ou de lactosérum issu de lait de vache ou
de lait de chèvre
obtenu ou susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention dont la
proportion de
protéines sur matière sèche est supérieure ou égale à 90% en poids, la
proportion de la
lactoferrine sur les protéines totales est supérieure à 90% (p/p), de
préférence supérieure à
95% en poids, contenant la cobalamine sous forme complexe avec transcobalamine
à une
concentration supérieure ou égale à 5 g/g, de préférence supérieure ou égale
à 8 g/g, encore
préférentiellement supérieure ou égale à 101.1g/g de protéines.
Les isolats selon l'invention peuvent se présenter sous forme liquide (étape f
non mise en
oeuvre) ou sous forme de poudre (mise en oeuvre de l'étape f). Dans le cas où
elle est sous
forme liquide, elle présente les mêmes caractéristiques que la poudre en
termes de
composition par rapport à la matière sèche et comprend généralement entre 5 et
25%, de
préférence entre 10 et 20%, en poids d'eau.
Selon un autre de ses objets, la présente invention se rapporte à un produit
alimentaire pour
l'alimentation humaine ou animale, à un médicament humain ou animal ou à un
complément
alimentaire contenant un isolat de protéines cationiques selon l'invention.
De préférence, les isolats selon l'invention ont une charge microbienne telle
que le
dénombrement de la flore mésophile aérobie est inférieur à 1000,
préférentiellement inférieur
à 100 ou 10 et encore préférentiellement inférieure à 1 ufc/g de poudre
d'isolat selon
l'invention ou inférieur à 100, préférentiellement inférieur à 10, encore
préférentiellement
inférieur à 1 ufc/ml d'isolat liquide. La combinaison d'utilisation d'une
matière laitière
concentrée et d'une colonne flux radial permet de produire de façon stable et
efficace, deux
sortes d'isolats de pureté élevée en lactoferrine par la chromatographie par
échange de cations
en choisissant les conditions appropriées :
- un isolat dont la pureté protéique de lactoferrine est > 95% ou à 98% et
dont la teneur en
vitamine B12 est < 5 g/g de protéines ou comprise entre 1 et 5 g/g de
protéines ;
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De tels isolats selon l'invention trouvent un intérêt particulier pour la
préparation de laits
infantiles (laits pour nourrisson ou laits de suite) à base de lait de vache
ou de chèvre.
et
- un isolat dont la pureté protéique de lactoferrine est > 90% ou 95% et dont
la teneur en
vitamine B12 est > 5 g/g de protéines, de préférence > 8 g/g de protéines,
encore de
préférence > 10 g/g de protéines ;
Cet isolat peut présenter un avantage nutritionnel pour un complément
alimentaire destiné aux
végétariens ou pour une préparation nutritionnelle destinée aux personnes
déficientes pour
l'absorption de vitamine B12 telles que les personnes ayant subi une
gastrectomie ou des
personnes traitées chroniquement avec des IPP (inhibiteurs de la pompe à
protons). En effet,
cet isolat peut apporter, en plus de bénéfices de la lactoferrine, une source
importante de
vitamine B12 de biodisponibilité élevée même en situation d'absence du facteur
intrinsèque
sécrété par l'estomac.
La présente invention se rapporte ainsi également à des compléments
alimentaires comprenant
l'isolat selon l'invention enrichi en vitamine B12, c'est-à-dire un isolat
dont la pureté
protéique de lactoferrine est> 90% ou 95% et dont la teneur en vitamine B12
est > à 5 g/g
de protéines, de préférence à? 8 g/g de protéines, encore préférentiellement
supérieure ou
égale à 10 g/g de protéines.
La teneur en isolat selon l'invention dans le complément alimentaire sera
choisie en fonction
du profil de la population à supplémenter, donc de la dose de vitamine B12 à
administrer, et
de la teneur en vitamine B12 de l'isolat. Par exemple, une dose journalière de
150 à 1000 mg
en protéines de l'isolat selon l'invention enrichi en vitamine B12 à 6 g/g de
protéines peut
apporter 0,9 à 6,0 g de vitamine B12 sous forme complexe avec
transcobalamine. Aussi, 100
à 600 mg en protéines de l'isolat selon l'invention enrichi en vitamine B12 à
10 g/g de
protéines peut apporter 1,0 à 6,0 g de vitamine B12 sous forme complexe avec
transcobalamine. Ainsi, un tel complément alimentaire peut couvrir les besoins
de chaque
groupe de population montrés dans le tableau ci-dessous même si l'absorption
intestinale de
vitamine B12 est perturbée.
Références nutritionnelles pour la vitamine B12 ( g/j) selon ANSES 2016
Groupes de prp t-on ..ioport
satisfaisant
(iug/jour)
Nourrissons de moi lfs is mois n
Nourrissons de 6 r n 11s
Enfi -1- 1
Lnfa--",' de 1" --
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Adolescents de 11 à 17 ans 25
' s de 18 ar
nmes enceintes r
r unes allaitantes
La présente invention se rapporte encore à un isolat dont la pureté protéique
de lactoferrine
est >90% ou 95% et dont la teneur en vitamine B 1 2 est > à 5 g/g de
protéines, de préférence
à > 8 ug/g de protéines, encore de préférence à > 10 pg/g de protéines pour
prévenir et/ou
traiter une absorption déficiente en vitamine B12, par exemple chez des
patients ayant subi
une gastrectomie ou traités chroniquement avec des IPP (inhibiteurs de la
pompe à protons).
La cobalamine (vitamine B12) est présente dans le lait sous forme de complexe
avec une
protéine fixatrice. Dans le lait de vache, elle est présente sous forme
complexe avec la
transcobalamine qui est une protéine cationique de 43 kDa (S.N. Fedosov, T.E.
Petersen, E.
Nex0, Transcobalamin from cow milk: isolation and physico-chemicalproperties,
Biochimica
et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1292 (1996)
113-119).
L'intérêt nutritionnel de ce complexe cobalamine¨transcobalamine est
important, puisqu'il
semblerait qu'il soit responsable de la biodisponibilité de vitamine B12 (S .N
Fedosov, Ebba
Nexo, Christian W. Heegaard, Vitamin B12 and its binding proteins in milk from
cow and
buffalo in relation to bioavailabilit y of B 12. Journal of Dairy Science.
American D airy Science
Association. 102 (2019) 4891-4905).
Bien que le comportement de ce complexe lors du traitement par chromatographie
par échange
de cations soit proche de celui de la lactoferrine, il est possible de faire
varier la teneur en
vitamine B12 dans l'éluat obtenu par le procédé selon l'invention en fonction
des conditions
utilisées.
En outre, malgré son intérêt nutritionnel, pour certaines applications (ex.
formules infantiles,
soit préparations/laits pour nourrissons ou/et préparations/laits de suite)
dans certains cas
spécifiques (dose d'incorporation élevée), il peut y avoir un intérêt de
limiter cette teneur en
vitamine B12 dans un ingrédient de fraction pure en lactoferrine. Dans ce
contexte, le procédé
selon l'invention, qui permet d'ajuster la teneur finale en vitamine B12,
présente un grand
intérêt.
L'invention se rapporte donc à des produits alimentaires pour l'alimentation
humaine ou
animale comprenant un isolat selon l'invention ; dans le cadre de formules
infantiles, soit
préparations/laits pour nourrissons ou/et préparations/laits de suite, on
utilisera de préférence
un isolat dont la pureté protéique de lactoferrine est >95% et dont la teneur
en vitamine B12
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est < 5 1.1g/g de protéines. Le taux d'incorporation de l'isolat selon
invention est de 50 à
1000 mg en protéines dans un litre d'une formule prêt à consommer.
La présente invention se rapporte également à des produits non alimentaires,
tels que des
produits d'hygiène et des produits cosmétiques comprenant un isolat selon
l'invention.
Sont également inclus dans la présente invention, les produits d'hygiène de la
cavité buccale,
tels que les dentifrices sous forme de gel ou de pâte, les bains de bouche,
les gommes à mâcher,
comprenant un isolat selon l'invention. Le taux d'incorporation de l'isolat
selon invention est
de 1 à 100 mg en protéines dans un gramme d'un produit.
FIGURES
Figure 1: Représentation schématique du procédé d'obtention de l'isolat de
protéines
cationiques de lactosérum de pureté élevée en lactoferrine.
Figure 2: Perte de charge générée par la colonne à flux radial et différents
paramètres du
passage dc lait écrémé pasteurisé (concentrations en MS et en MP, débits en MS
et en MP)
(exemple 4)
Figure 3 : Corrélation entre la perte de charge générée par la colonne à flux
radial et
différents paramètres du passage de lait écrémé pasteurisé (débits en MS et en
MP) (exemple
4)
Figure 4 : Profil CLHP PI (Chromatographie en phase liquide à haute
performance en phase
inverse ; colonne C18 300 A, 0.1% TFA dans H20/CH3CN en gradient, détection à
280 nm)
de l'Ingrédient 1 de l'exemple 5.
Figure 5 : Profil CLHP SEC (Chromatographie en phase liquide à haute
performance
d'exclusion stérique ; colonne TSK G3000PWxl, CH3CN/H20/TFA, détection à 210
nm) de
l'Ingrédient 1 de l'exemple 5. Les indications de poids moléculaires en haut
selon les temps
de rétention des protéines témoins.
Figure 6 : Profil CLHP PI de l'Ingrédient 2 de l'exemple 6.
Figure 7 : Profil CLHP PI de l'Ingrédient 3 de l'exemple 6.
Exemple 1 : essai en paillasse avec le lait de vache écrémé pasteurisé
(témoin)
1) Le lait de vache écrémé dont la MS est 92 g/L a été pasteurisé à 73 C
pendant 20 secondes,
puis refroidi à 6 C. La concentration de lactoferrine bovine dans ce lait
écrémé pasteurisé a
été mesurée par CLHP SCX (Chromatographie en phase liquide à haute performance
par
échange de cations fortes ; colonne Propac SCX, 20 mIVI tampon phosphate en
gradient de
NaCl, détection à 280 nm) ;
2) Le lait de vache écrémé pasteurisé a été passé sur une colonne de flux
axial (1,6 cm de
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diamètre) contenant 20 mL (BV) de SP Sepharose Big Beads à une vitesse
linéaire de 400
cm/h à volume variable de lait écrémé pasteurisé ;
3) Après un rinçage avec 5 BV de l'eau osmosée, les protéines fixées sont
éluées avec 6 BV
d'une solution de NaCl à 10% (p/v) à 20 C ;
4) La teneur en lactoferrine bovine de chaque éluat a été mesurée par CLHP PI
(Chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse ;
colonne C18 300
A, 0.1% TFA/CH3CN gradient, détection à 280 nm). Ainsi, la quantité de
lactoferrine bovine
dans chaque éluat a été obtenue.
Les conditions et les résultats des essais sont montrés dans le Tableau 1 :
Lait écrémé pasteurisé Eluat
MS Lactoferrine Volume Débit de passage
Lactoferrine
(mg/L de lait
(g/L) (mg/L) (L) (BV) (cm/h) (g MS/cm2/h) (mg)
écrémé)
92 89 4,00 200 400 36,8 g 255,5
63,9
92 78 6,00 300 400 36,8 g 317,3
52,9
92 86 9,00 450 400 36,8 g 511,7
56,9
Tableau I - Lactoferrine bovine obtenue avec le passage de lait écrémé à 92
g/L
Exemple 2: essai en paillasse avec le lait de vache écrémé pasteurisé
concentré
1) Le lait de vache a été écrémé, puis pasteurisé à 73 C pendant 20 secondes,
puis refroidi à
6 C. Ce lait de vache écrémé pasteurisé dont la MS est 92 g/L a été concentré
par une osmose
inverse jusqu'à 130 g/L de MS à 6 C. La concentration de lactoferrine bovine
dans ce lait
écrémé pasteurisé concentré a été mesurée par CLHP SCX (colonne Propac SCX, 20
mM
tampon phosphate en gradient de NaCl, détection à 280 nm) ;
2) Le lait de vache écrémé pasteurisé concentré (130 g/L de MS) est passé sur
une colonne de
flux axial (1,6 cm de diamètre) contenant 20 mL (BV) de SP Sepharose Big Beads
à une
vitesse linéaire variable à volume variable de lait écrémé pasteurisé ;
3) Après un rinçage avec 5 BV de l'eau osmosée, des protéines fixées sont
éluées avec 5 BV
d'une solution de NaC1 à 10% (p/v) à 20 C ;
4) La teneur en lactoferrine bovine de chaque éluat a été mesurée par CLHP PI
(colonne C18
300 Å, 0.1% TFA/CH3CN gradient, détection à 280 nm). Ainsi, la quantité de
lactoferrine
bovine dans chaque éluat a été obtenue.
Les conditions et les résultats des essais sont présentés dans le Tableau 2 :
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Lait écrémé pasteurisé
Eluat
MS Lactoferrine Volume Débit de passage
Lactoferrine
(mg/L de
(BV)
(g/L) (mg/L) (L)
(cm/h) (g MS/cm2/h) (mg) lait
[équivalence]*
écrémé)
127 4,20 210
116,2
130 200 26,0
487,9
[89] [5,93] [297]
[82,2]
127 4,20 210
109,0
130 300 39,0
457,8
[89] [5,93] [297]
[77,1]
127 6,00 300
118,8
130 200 26,0
671,0
[89] [8,48] [424]
[79,1]
127 6,00 300
102,9
130 300 39,0
617,6
[891 [8,481 [4241
[72,81
Tableau 2 - Lactoferrine bovine obtenue avec le passage de lait écrémé
concentré à 130 g/L
*Les valeurs équivalentes avec le lait écrémé pasteurisé non concentré (dont
la MS est de
92 g/L).
La comparaison des tableaux 1 et 2 montre que le rendement en lactoferrine
bovine obtenue
est bien supérieur (>20%) avec le lait écrémé pasteurisé préalablement
concentré en utilisant
les conditions de fixation comparables (ex. le passage de ¨300 BV équivalent
de lait écrémé
pasteurisé avec le débit de MS 37-39 g/cm2/h).
Exemple 3 : essai en paillasse avec le lait de vache écrémé pasteurisé
concentré
1) Le lait de vache a été écrémé, puis pasteurisé à 73 C pendant 20 secondes,
puis refroidi à
6 C. Ce lait de vache écrémé pasteurisé dont la MS est 92 g/L a été concentré
par une osmose
inverse jusqu'à 130 g/L de MS à 6 C. La concentration de lactoferrine bovine
dans ce lait
écrémé pasteurisé concentré a été mesurée par CLHP SCX (colonne Propac SCX, 20
mM
tampon phosphate en gradient de NaCl, détection à 280 nm) ;
2) Le lait de vache écrémé pasteurisé concentré (130 g/L de MS) est passé sur
une colonne de
flux axial (1,6 cm de diamètre) contenant 20 mL (BV) de SP Sepharose Big Beads
à une
vitesse linéaire variable à volume variable de lait écrémé pasteurisé ;
3) Après un rinçage avec 5 BV de l'eau osmosée, des protéines fixées sont
partiellement éluées
avec 6 BV d'une solution de NaCl à 2,6% (p/v) soit 38 mS/cm à 20 C. La
lactoperoxydase,
les ribonucléases et d'autres protéines basiques ont été récupérées dans cet
éluat ;
4) Des protéines encore fixées sont éluées avec 5 BV d'une solution de NaCl à
10% (p/v) à
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20 C. La lactoferrine bovine a été récupérée dans cet éluat ;
5) La proportion de lactoferrine dans les protéines totales dans ce 2 éluat a
été déterminée par
CLHP PI (colonne C18 300 A, 0.1% TFA dans H20/CH3CN en gradient, détection à
280 nm)
comme l'aire relatif du pic du lactoferrine bovine.
La teneur en cobalamine (vitamine B12) dans ce 2' éluat a été également
mesurée par la
méthode AOAC. Ainsi, sa teneur par protéines totales a été obtenue.
Les conditions et les résultats de 2 séries d'essais sont montrés dans le
Tableau 3 :
Lait écrémé pasteurisé 2' Eluat
Débit de
Lactoferrine Volume Lactoferrine
Cobalamine
passage
(Pgi g
(mg/L) (L) (BV) (cm/h) (%/protéines)
protéines)
130 1,60 80 150 94,0q
12.20
130 1,60 50 200 94,3%
12,15
130 1.60 80 300 94.7%
9.44
130 1.60 80 400 95 .6
9,13
127 4,20 210 200 95,2%
5,53
127 4,20 210 300 95,9%
2,69
127 6,00 300 200 95,0%
2,60
127 6,00 300 300 95,4%
1,85
Tableau 3 - Lactoferrine bovine obtenue dans le 2' éluat avec le passage de
lait écrémé
concentré à 130 g/L
Ces résultats montrent qu'en utilisant des conditions appropriées, deux sortes
de fraction de
la pureté élevée en lactoferrine (ex. >95% sur protéines totales) peuvent être
obtenues par la
chromatographie par échange de cations avec le passage de lait écrémé
pasteurisé concentré :
- une fraction dont la pureté protéique de lactofcrrine est >95% et dont la
teneur en
vitamine B12 est < 5 mg/g de protéines ;
- une fraction dont la pureté protéique de lactoferrine est >90% et dont la
teneur en
vitamine B12 est > 10 g/g de protéines.
Exemple 4 : essai à l'échelle industrielle avec le lait de vache écrémé
pasteurisé (témoin)
Bien que le lait écrémé pasteurisé concentré à ¨130 g/L puisse passer à
travers une colonne
axial à l'échelle paillasse, il est difficile d'envisager une production
stable dans la durée à
l'échelle industrielle avec un passage d'une matrice complexe comme une
matière laitière, en
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particulier concentrée, à la fois à cause d'une perte de charge élevée et un
colmatage de surface
filtrante.
Nous avons vérifié le comportement de perte de charge à travers d'une colonne
industrielle à
flux radial en faisant passer le lait écrémé de différent MS et à différents
débits.
1) Une colonne industrielle à flux radial de 260 L (Albert Handtmann
Armaturenfabrick
GnribH) a été préparée avec 280 L de résines SP Sepharose Big Beads Food
Grade. Elle a été
régénérée avec 10% de NaCl, puis satinée avec 1 N NaOH, enfin rincée avec de
l'eau
osmosée ;
2) Le lait de vache a été écrémé, puis pasteurisé à 73 C pendant 20 secondes,
puis refroidi à
6 C. Une partie de lait de vache écrémé pasteurisé a été concentré par une
osmose inverse à
6 C. Les compositions de ces laits écrémés pasteurisés non concentrés et
concentrés sont les
suivantes :
Lait écrémé pasteurisé Lait écrémé pasteurisé par ()I
MS (g/L) 87,6 231,5
MAT [Nx6,38] (g/L) 33,7 89,2
MP [(N-NPN) x6,38] (g/L) 31,9 85,4
MS : matière sèche ; MAT : matières azotés totales ; MP : matières protéiques
Tableau 4 - Composition des laits écrémés de départ
3) Après avoir préparé le niveau de concentration de lait écrémé pasteurisé en
mélangeant en
ligne, il est passé à différents débits à travers de la colonne à flux radial
préalablement préparée
à une température à 10 C.
Les compositions de lait écrémé, les débits et les pressions observés sont
dans le Tableau 5.
La perte de charge (soit la pression) générée par la colonne à flux radial a
augmenté en
fonction des débits et des concentrations en matières en phase mobile (Figure
2) et elle a une
bonne corrélation entre le débit en MS ou en MP (Figure 3). Ces résultats
montrent bien que
cette colonne à flux radial à l'échelle industrielle permet un passage de lait
écrémé pasteurisé
concentré (par osmose inverse) jusqu'à 200 g/L en MS ou 72 g MP (ou 75 g/L en
MAT) avec
une perte de charge acceptable en utilisant un débit de passage approprié dans
les conditions
industrielles de production en routine.
Composition MS
(g/L) 87,6 110,7 116,9 119,2 145,0 160,3 159,3 173,3 193,3 87,6
de lait MAT
(g/L) 33,7 42,6 45,0 45,7 55,9 61,8 61,4 66,8 74,5 33,7
écrémé
MP (g/L) 31,9 40,5 42,8 43,5 53,3 58,9 58,6 63,8 71,2 31,9
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Liquide (m3/h) 4.1 4,0 4,0 4,0 4,1 4,0 2,4
2,2 2,0 4,1
Débit MS (kg/h) 702 882 929 951 1170 1269 748 745 768 707
MP (kg/h) 256 323 340 347 430 467 275 274 283 258
Entrée (bar) 0,93 1,11 1,13 1,12 1,5 1,68 0,87 0,91 1,02 1,01
Pression de
Sortie (bar) 0,16 0,14 0,14 0,15 0,16 0,15 0,13 0,12 0,13 0,13
colonne
AP
(bar) 0,77 0,97 0,99 0,97 1,34 1,53 0,74 0,79 0,89 0,88
Tableau 5 - Les compositions de lait écrémé, les débits et les pressions
observés avec la
colonne industrielle à flux radiale
Exemple 5 : essai industriel pour la fabrication de l'isolat de lactosérum
pure en
lactoferrine bovine avec le lait écrémé pasteurisé concentré
1) Le lait de vache a été écrémé, puis pasteurisé à 73 C pendant 20 secondes,
puis refroidi à
6 C, puis concentré par une osmose inverse jusqu'à 128 g/L de MS à 6 C;
2) 80 m3 de ce lait écrémé pasteurisé concentré ont été passés sur une colonne
industrielle à
flux radial de 260 L (Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH) garnie avec 280
L de
résines SP Sepharose Big Beads Food Grade au débit de 2,6 m/h ;
3) Après un rinçage avec 5 BV de l'eau osmosée, des protéines fixées sont
partiellement éluées
par 6 BV d'une solution de NaCl à 38 mS/cm à 20 C. La lactoperoxydase, les
ribonucléases
et d'autres protéines basiques ont été récupérées dans cet éluat ;
4) Des protéines encore fixées sont éluées avec 4 BV d'une solution de NaCl à
10% (p/v) à
C. Cet éluat contenant la lactoferrine bovine a été refroidi et stocké à 6 C ;
15 5) Les étapes 2-4 ont été répétées 10 fois ;
6) 11,2 m3 de 2e éluat regroupé ont été concentrés sur une ultrafiltration
(membrane organique
spirale avec MWCO de 20 kDa), puis diafiltré sur UF (MWCO 20 kDa) avec l'eau
osmosée
jusqu'à 1 mS/cm, enfin microfiltré sur une membrane céramique à 1,4 um en
double couche
(Membraroxe, Pall Corporation) ;
20 7) L'isolat de protéines de lactosérum enrichie en lactoferrine bovine
obtenu sous forme du
microfiltrat a subi un séchage par atomisation et 40 kg de poudre ont été
obtenus (Ingrédient
1) ;
8) L'Ingrédient 1 a été analysé ; notamment la proportion de lactoferrine dans
les protéines
totales a été déterminée par CLHP PI (colonne C18 300 A, 0.1% TFA dans
H20/CH3CN en
gradient, détection à 280 nm) comme l'aire relatif du pic du lactoferrine
bovine (Figure 5). La
teneur en cobalamine (vitamine B12) dans ce 2e éluat a été également mesurée
par la méthode
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AOAC. Les résultats d'analyses sont présentés dans Tableau 6.
Exemple 6 : essai industriel pour la fabrication de l'isolat de lactosérum
pure en lactoferrine
bovine avec le lait écrémé pasteurisé concentré
1) Le lait de vache a été écrémé, puis pasteurisé à 73 C pendant 20 secondes,
puis refroidi à
6 C, puis concentré par une osmose inverse jusqu'à 120 g/L de MS à 6 C ;
2) 60 m3 de ce lait écrémé pasteurisé concentré ont été passés sur une colonne
industrielle à
flux radial de 260 L (Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH) guarnie avec 280
L de
résines SP Sepharose Big Beads Food Grade au débit de 2,6 m/h ;
3) Après un rinçage avec 5 BV de l'eau osmosée, des protéines fixées sont
partiellement éluées
par 6 BV d'une solution de NaCl à 36 mS/cm à 20 C. La lactoperoxydase, les
ribonucléases
et d'autres protéines basiques ont été récupérées dans cet éluat ;
4) Des protéines encore fixées sont éluées avec 4 BV d'une solution de NaCl à
10% (p/v) à
C. Cet éluat contenant la lactoferrine bovine a été refroidi et stocké à 6 C;
5) Les étapes 2-4 ont été répétées 15 fois ;
15 6) 116.8m3 de 2e éluat regroupé ont été concentrés sur une
ultrafiltration (membrane organique
spirale avec seuil de coupure (MWCO) de 20 kDa), puis diafiltré sur UF (MWCO
20 kDa)
avec l'eau osmosée jusqu'à 1 mS/cm, enfin microfiltré sur une membrane
céramique à 0,8 nm
en double couche (Membraroxe, Pall Corporation) ;
7) L'isolat de protéines de lactosérum enrichi en lactoferrine bovine obtenu
sous forme du
20 microfiltrat a subi les traitements supplémentaires afin de garantir la
stabilité de cette fraction
protéique suivants :
i. Une partie du microfiltrat a été microfiltré sur membrane PES à 0,2 i_tm
(Supor
Pall), puis mis dans les flacons stérilisés de 1 L (Ingrédient 3)
ii. Le reste du microfiltrat subi un séchage par atomisation et 60 kg de
poudre ont été
obtenus (Ingrédient 2).
8) Les Ingrédients 2 et 3 ont été analysés ; notamment la proportion de
lactoferrine dans les
protéines totales dans ce 2e éluat ont été déterminée par CLHP PI (colonne C18
300 Å, 0.1%
TFA dans H20/CH3CN en gradient, détection à 280 nm) comme l'aire relatif du
pic du
lactoferrine bovine (Figure 6 & Figure 7). La teneur en cobalamine (vitamine
B12) dans ce 2e
éluat a été également mesurée par la méthode AOAC. Les résultats d'analyses
sont présentés
dans le tableau 6.
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Ingrédient 1 Ingrédient 2 Ingrédient 3
Aspect Poudre fine Poudre fine
Liquide
Couleur Rose clair Rose clair Rose
2% solution pour
PH 6,1 5,8 5,9
poudre
Solubilité
% à 2% solution
(Transmittancc à 92 93 90
pour poudre
600nm)
Humidité 3,4 3,6 g/100 g
Protéines (Nx6,38) 95,9 97,2 14,1
g/100 g
Cendres 0,4 0,2 0,03 g/100 g
Lactoferrine 95,6 94,7 94,6 %
protéines
Vitamine B12 2,3 8,0 8,0 g/g
protéines
Flore aérobie
< 10 <10 <1
UFC/g
mésophile
Coli form es Absence Absence
Absence /g
Entérobactéries Absence Absence
Absence /100 g
Escherichia cou Absence Absence
Absence /100 g
Levures et
<10 <10 <1
UFC/g
moisissures
Salmonelles Absence Absence
Absence /750 g
Staphylocoques à
Absence Absence Absence /25 g
coagulase positive
Listeria Absence Absence Absence /250 g
Cronobacter spp Absence Absence
Absence /750 g
Tableau 6 - Les caractéristiques physico-chimiques et microbiologiques de
l'Ingrédient I,
l'Ingrédient 2 et l'Ingrédient 3
Exemple 7: essai en paillasse avec le lactosérum concentré issu de lait de
chèvre écrémé
pasteurisé
1) Le lait de chèvre a été écrémé, puis pasteurisé à 74 C pendant 30 secondes,
puis refroidi à
6 C;
2) 3000 L de lait de chèvre écrémé pasteurisé, après avoir maintenu à 50 C
pendant 30
minutes, ont été passés sur une microfiltration céramique à 0,1 _t.m
(Membrarox0, Pall
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Corporation) pour obtenir un lactosérum comme microfiltrat de lait de chèvre
dépourvu de
matière grasse et les micelles de caséines ;
3) 2000 L de lactosérum issu du lait de chèvre ont été concentrés sur une
ultrafiltration
(membrane organique spirale avec seuil de coupure (MWCO) de 10 kDa). Les
compositions
du rétentat obtenu (450 L) étaient dans le tableau 7 ci-dessous :
MS (g/L) 86
MAT [Nx6,38] (g/L) 33
dont 13-Lactoglobuline caprine (g/L) 21
a-Lactalbumine caprine (g/L) 10
Lactoferrine caprine (g/L) 0,10
Lactose (g/L) 38
Cendres (g/L) 6
Tableau 7 - Composition de lactosérum concentré issu du lait de chèvre
La concentration de 13-Lactoglobuline caprine et a-Lactalbumine caprine dans
ce lactosérum
concentré a été mesurée par CLHP SEC (colonne TSK G3000PWxl, CH3CN/H20/TFA,
détection à 210 nm). La concentration de lactoferrine caprine dans ce
lactosérum concentré a
été mesurée par CLHP SCX (colonne Propac SCX, 20 mM tampon phosphate en
gradient de
NaC1, détection à 280 nm).
4) 3 L de lactosérum concentré de chèvre est passé sur une colonne de flux
axial (1,6 cm de
diamètre) contenant 20 mL (BV) de SP Sepharose Big Beads à une vitesse
linéaire de 200 et
300 cm/h ;
5) Après un rinçage avec 5 BV de l'eau osmosée, des protéines fixées sont
partiellement éluées
avec 6 BV d'une solution de NaCl à 2,2% (p/v) à 20 C. Des protéines
cationiques autres que
la lactoferrine telles que la lactoperoxydase ont été récupérées dans cet
éluat ;
6) Des protéines encore fixées sont éluées avec 5 BV d'une solution de NaCl à
10% (p/v) à
C. La lactoferrine caprine a été récupérée dans cet éluat. La teneur en
lactoferrine caprine
20 dans l'éluat a été mesurée par CLHP PI (colonne C18 300 A, 0.1% TFA dans
H20/CH3CN
en gradient, détection à 280 nm).
Comme montré dans le tableau 8, une fraction de lactoferrine caprine dont la
pureté protéique
très élevée a été extraite très efficacement à partir du lactosérum concentré
issu du lait de
chèvre.
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Lactosérum concentré issu du lait de
2 Eluat
chèvre
Volume Débit de passage
Lactoferrine caprine
(L) (BV) (cm/h) (%/protéines)
(mg)
3,0 150 200 98,9%
277
3,0 150 300 99,0%
272
Tableau 8 - Lactoferrine caprine obtenue dans le 2e éluat avec le passage de
lactosérum
concentré issu du lait de chèvre
Exemple 8 : essai en paillasse avec le lactosérum de fromagerie concentré issu
de lait de
chèvre écrémé pasteurisé
1) 240 L du lactosérum de fromagerie issu du lait de chèvre pasteurisé (à 74 C
pendant 30
secondes) a été concentré sur une ultrafiltration (membrane organique spirale
avec MWCO
de 10 kDa). Les compositions du rétentat obtenu (60 L) étaient dans le tableau
ci-dessous :
MS (g/L) 70
MAT ll\Tx6,38] (g/L) 36
dont f3-Lactoglobuline caprine (g/L) 16
a-Lactalbumine caprine (g/L) 8
Lactoferrine caprine (g/L) 0,26
Lactose (g/L) 7
Cendres (g/L) 5
Tableau 9 - Composition des lactosérum fromagerie concentré issu du lait de
chèvre
La concentration de P-Lactoglobuline caprine et ci-Lactalbumine caprine dans
ce lactosérum
concentré a été mesurée par CLHP SEC (colonne TSK G3000PWxl, CH3CN/H20/TFA.
détection à 210 nm). La concentration de lactoferrine caprine dans ce
lactosérum concentré a
été mesurée par CLHP SCX (colonne Propac SCX, 20 mNI NaPB/NaC1 gradient,
détection à
280 nm).
2) 3 L de lactosérum concentré de chèvre sont passés sur une colonne de flux
axial (1,6 cm de
diamètre) contenant 20 mL (BV) de SP Sepharose Big Beads à une vitesse
linéaire de 200 et
300 cm/h ;
3) Après un rinçage avec 6 BV de l'eau osmosée, des protéines fixées sont
partiellement éluées
avec 6 BV d'une solution de NaCl à 2,2% (p/v) à 20 C. Des protéines
cationiques autres que
la lactoferrine telles que la lactoperoxydase ont été récupérées dans cet
éluat ;
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4) Des protéines encore fixées sont éluées avec 5 BV d'une solution de NaC1 à
10% (p/v) à
20 C. La lactoferrine caprine a été récupérée dans cet éluat. La teneur en
lactoferrine caprine
dans l'éluat a été mesurée par CLHP PI (colonne C18 300 A, 0.1% TFA dans
H20/CH3CN
en gradient, détection à 280 nm).
Comme montré dans le tableau 10, une fraction de lactoferrine caprine dont la
pureté protéique
élevée a été extraite très efficacement à partir du lactosérum de fromagerie
concentré issu du
lait de chèvre.
Lactosérum concentré issu du lait de
2 Eluat
chèvre
Volume Débit de passage
Lactoferrine caprine
(L) (BV) (cm/h) (%/protéines)
(mg)
1,2 60 200 93,3%
293
1,6 80 200 92,6%
393
1,9 95 200 92,3%
440
2,4 120 200 90,7%
506
Tableau 10 - Lactolerrine bovine obtenue dans le 2' éluat avec le passage de
lactosérum de
fromagerie concentré issu du lait de chèvre
Exemple 9: essai de préparation d'un lait infantile en poudre supplémenté en
lactoferrine bovine (teneur en Vitamine BU faible)
1) Un lait pour nourrissons en poudre à base de lait de vache a été préparé
par un procédé de
fabrication standard en formulant avec lait de vache écrémé, lactose,
maltodextrines, huile de
tournesol oléique, matière grasse de lait anhydre, lactosérum déminéralisé,
protéines solubles,
galacto-oligosaccharides, huile de tournesol, huile de colza, lécithine de
soja, lécithine de
tournesol, phosphate de calcium, huile de poisson, phosphate de potassium,
huile de
Mortierella alpina, bitartrate de choline, chlorure de calcium, citrate de
potassium, citrate de
magnésium, chlorure de sodium, fructo-oligosaccharides, vitamine C.
pyrophosphate ferrique,
carbonate de calcium, taurine, hydroxyde de potassium, chlorure de potassium,
inositol,
nucléotides, L-phénylalanine, extrait riche en tocophérols, palmitate de L-
ascorbyle, sulfate
de zinc, L-tryptophane, vitamine E, iodure de potassium, L-carnitine,
nicotinamide, sélénite
de sodium, pantothénate de calcium, sulfate de cuivre, thiamine, vitamine A,
vitamine B6,
sulfate de manganèse, acide folique, vitamine K, biotine, vitamine D,
riboflavine, vitamine
B12.
2) Le lait pour nourrissons en poudre a été mélangé avec l'Ingrédient 1 à un
taux
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d'incorporation de 82 mg/100 g.
Unités 100g 100 mL
VALEUR ÉNERGÉTIQUE kcal 502 67
kJ 2098 282
PROTÉINES g 9,6 1,3
Caséine g 3,4 0,5
Protéines solubles g 6,2 0,8
Lactoferrinc mg 74 10
MATIERES GRASSES g 26 3,4
Acides gras saturés g 6,7 0,9
Acide linoléique mg 4500 608
Acide ct-linolénique mg 430 58
Acide arachidonique (ARA) mg 139 19
Acide docosahexaénoïque
mg 126 17
(DHA)
GLUCIDES g 56,9 7,7
Sucres g 37,6 5,1
Lactose g 37,6 5,1
Maltodextrines g 19,3 2,6
FIBRES ALIMENTAIRES g 3 0,4
FOS & GOS g 3 0.4
SELS MINÉR A UX g
Sodium mg 150 20
Potassium mg 540 73
Chlorure mg 380 51
Calcium
mg 490 66
Phosphore mg 340 46
Magnésium mg 42 5,7
Fer mg 5 0,68
Zinc mg 3,8 0,51
Cuivre lig 400 54
Iode itg 100 14
Sélénium lig 21 2,8
Manganèse lig 100 14
Fluorure Itg 275 37
VITAMINES
Vitamine A (ER) lig 430 58
Vitamine D lig 11 1,5
Thiamine ug 500 68
Riboflavine lig 600 81
Niacinc mg 4 0,54
Acide pantothénique mg 3,2 0,43
Vitamine B6 lig 400 54
Biotine ug 16 2,2
Folates (EFA) lig 175 24
Vitamine B12 ug 1,1 0,14
Vitamine C mg 70 9,5
Vitamine K Ii-g 40 5,4
Vitamine E (ET) mg 13 1,8
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Nucléotides mg 21 2,8
Choline mg 160 22
Ino sitol mg 53 7,2
Taurine mg 41 5,5
Carnitine mg 11 1,5
Taux de reconstitution 13,5%
Tableau 11 - La composition d'un lait infantile en poudre incorporé en
l'Ingrédient 1
Exemple 10 : essai de formulation nutritionnelle en poudre supplémentée en
lactoferrine
bovine (teneur en Vitamine B12 élevée)
1) Un lait pour nourrissons (denrées alimentaires destinés à des fins
médicales spéciales, soit
DADFMS) en poudre à base de lait de vache a été préparé par un procédé de
fabrication
standard en formulant avec lait écrémé, huiles végétales (palme, colza,
coprah, tournesol),
protéines solubles déminéralisées, lactose, amidon, farine de graines de
caroube, lécithine,
citrate de calcium, huile de poisson, huile de Mortierella alpina, carbonate
de calcium,
vitamine C, phosphate de calcium, citrate de potassium, citrate de sodium,
hydroxyde de
calcium, chlorure de choline, taurine, vitamine E, inositol, sulfate ferreux,
L-tryptophane,
chlorure de potassium, chlorure de calcium, extrait riche en tocophérols,
palmitate de L -
ascorbyle, L-carnitine, sulfate de magnésium, nucléotides, sulfate de zinc,
vitamine A,
nicotinamide, vitamine K, vitamine D, pantothénate de calcium, sulfate de
cuivre, thiamine,
vitamine B6, riboflavine, sulfate de manganèse, acide folique, iodure de
potassium, sélénite
de sodium, biotine.
2) Le lait DADFMS pour nourrissons en poudre a été mélangé avec l'Ingrédient 2
à un taux
d'incorporation de 400 mg/100 g. Un apport de 3,1 g de vitamine B12 sous
forme complexe
avec transcobalamine par 100 g de la formulation en poudre a été obtenu par
cette
incorporation de l'Ingrédient 2.
Unités 100 g 100 mL
VALEUR ÉNERGÉTIQUE kcal 504 68
k.1 2108 284
PROTÉINES g 11 1,5
Caséine g 6,6 0,9
Protéines solubles g 4,4 0,6
Lactoferrine mg 370 50
MATIERES GRASSES g 26 3,5
Acides gras saturés g 11,2 1,5
Acide linoléique mg 4500 608
Acide ct-linolénique mg 430 58
Acide arachidonique (ARA) mg 139 19
Acide docosahexaénoïque
(DHA) mg 126 17
CA 03202799 2023- 6- 19
WO 2022/136536 21
PCT/EP2021/087268
GLUCIDES n
,-, 55 7,4
Sucres g 49,5 6,7
Lactose g 49,5 6,7
Amidon g 5.5 0,7
FIBRES ALIMENTAIRES g 3 0.4
SELS MINÉRAUX g
Sodium mg 150 20
Potassium mg 540 73
Chlorure mg 330 45
Calcium mg 540 73
Phosphore mg 300 41
Magnésium mg 42 5,7
Fer mg 5.0 0,68
Zinc mg 3,8 0,51
Cuivre lig 320 43
Iode lig 100 14
Sélénium lig 11 1,4
Manganèse lig 100 14
Chrome lig 20 2,7
Molybdène Itg 30 4,1
Fluorure lig <275 <37
VITAMINES
Vitamine A (ER) lig 450 58
Vitamine D lig 7,5 1,0
Thiamine !-Lg 500 68
Riboflavine lig 600 81
Niacinc mg 5,0 0,68
Acide pantothénique mg 3,2 0,43
Vitamine B6 lig 400 54
Biotine li-g 16 2,2
Acide folique li-g 70 9,5
Vitamine B12 itg 3,5 0,47
Vitamine C mg 70 9,5
Vitamine K lig 40 5,4
Vitamine E (ET) mg 10 1,4
Nucléotides mg 22 2,9
Choline mg 100 14
Inositol mg 45 6,0
Taurine mg 33 4,5
Carnitinc mg 17 2,3
Taux de reconstitution 13,5%
Tableau 12 - La composition de DADFMS en poudre incorporé en l'Ingrédient 2
Exemple 11 : essai de formulation nutritionnelle en poudre supplémentée en
lactoferrine
bovine (teneur en Vitamine B12 élevée)
1) Un lait pour nourrissons (aliments diététique destinés à des fins médicales
spéciales,
DADFMS) en liquide à base de lait de vache a été préparé par un procédé de
fabrication
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WO 2022/136536 22
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standard en formulant avec Lait écrémé, protéines solubles déminéralisées,
huiles végétales
(palme, palmiste, colza, tournesol), lactose, lécithine de soja, lécithine de
tournesol, citrate de
sodium, phosphate de calcium, citrate de potassium, chlorure de calcium,
carbonate de
calcium, vitamine C, huile de Mortierella alpina, huile de poisson, hydroxyde
de calcium,
chlorure de potassium, vitamine E, chlorure de choline, taurine, sulfate
ferreux, extrait riche
en tocophérols, palmitate de L-ascorbyle, inositol, sulfate de zinc,
nucléotides, L-carnitine,
nicotinamide, vitamine A, sulfate de magnésium, vitamine K, vitamine D,
pantothénate de
calcium, sulfate de cuivre, thiamine, vitamine B6, riboflavine. sulfate de
manganèse, acide
folique, iodure de potassium, sélénite de sodium, biotine.
2) Le lait DADFMS pour nourrissons en liquide a été stérilisé par un
traitement thermique
ultra-haute température (UHT), puis mélangé avec l'Ingrédient 3 avec un taux
d'incorporation
de 410 mg/100 g (sur la matière sèche). Un apport de 0,43 itg de vitamine B12
sous forme
complexe avec transcobalaminc par 100 mL de la formulation en liquide a été
obtenu par cette
incorporation de l'Ingrédient 3.
Unités 100 mL
VALEUR ÉNERGÉTIQUE kcal 69
kJ 288
PROTÉINES g 1,5
Caséine g 0,6
Protéines solubles g 0,9
Lactoferrine mg 50
MATIERES GRASSES g 3,5
Acides gras saturés g 1,6
Acide linoléique mg 418
Acide a-linolénique mg 46
Acide arachidonique (ARA) mg 7
Acide docosahexaénoïque
(DHA) mg 7
GLUCIDES g 7,8
Sucres g 7,8
Lactose g 7,8
FIBRES ALIMENTAIRES g 0
SELS MINÉRAUX g
Sodium mg 20,3
Potassium mg 72,9
Chlorure mg 44,6
Calcium mg 66,2
Phosphore mg 36,5
Magnésium mg 5,67
Fer mg 0,68
Zinc mg 0,54
Cuivre !tg 43
Iode jtg 14
CA 03202799 2023- 6- 19
WO 2022/136536 23
PCT/EP2021/087268
Sélénium 1,4
Manganèse tg 14
Chrome 1.1g 2.7
Molybdène tg 1.4
Fluorure tg <37
VITAMINES
Vitamine A (ER) ig 61
Vitamine D jig 1,0
Thiamine P-S 68
Riboflavine ig 81
Niacine mg 0,54
Acide pantothénique mg 0,43
Vitamine B6 tg 54
Biotine tg 2,2
Acide folique tg 9,5
Vitamine B12 ig 0,47
Vitamine C mg 9,5
Vitamine K 11g 5,4
Vitamine E (ET) mg 2,0
Nucléotides mg 2,9
Choline mg 14
Inositol mg 6,0
Taurine mg 4,5
Carnitine mg 2,3
MS totale g 13,2
Tableau 13 - La composition de DADI-MS en liquide incorporé en l'Ingrédient 3
Exemple 12: préparation d'un complément alimentaire en gélule en utilisant la
lactoferrine bovine (teneur en Vitamine B12 élevée)
Un complément alimentaire en gélule a été préparé à partir du mélange
d'Ingrédient 2 de
l'Exemple 5 (99,5% du mélange) et silice colloïdale (0,5% du mélange). Chaque
gélule
contient 200 mg de protéines.
La teneur en vitamine B12 sous forme complexe avec transcobalamine est de 1,6
g/gélule.
La dose journalière recommandée pour chaque groupe de population est comme
suite :
Vitamine B12
Laetoferrine
Groupe de population Dose journalière
sous forme complexe
bovine
.-.Enfant de 4 à 10 ans 1 gélule 1,6 g
189 mg
Adolescents de 11 à 17 ans 2 gélules 3,2 g
379 mg
Adultes 3 gélules 4,8 g
568 mg
LFemmes enceintes/allaitantes 4 gélules 5,6 g
757 mg
Tableau 14
CA 03202799 2023- 6- 19
