Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
~1~8610
La présente invention concerne un nouvel antibiotique
cyclopeptidique, désigné par le numéro 35665 RP, sa.préparation
et les compositions qui le contiennent.
Ce nouvel antibiotique, dont la toxicité est faible,
est particulièrement intéressant comme facteur de croissance
utilisable dans l'alimentation des animaux.
L'antibiotique 35665 RP, dont la formule brute est
C48H40011H12S6, répond à la formule développée:
N
O~H
" ~\S
N
\S _ q (I)
H0 ~ / S ~
-
dans laquelle R représente un radical -CONH2 et il présente
, les propriétés physico-chimiques suivantes:
- aspect : poudre amorphe jaunâtre
- solubilité : l'antibiotique 35665 RP est soluble dans le .
diméthylformamide, la pyridine et l'acide acétique, peu ou pas .
soluble dans l'eau, l'éthano~ l'acétone, le chloroforme et
l'hexane normal.
- point de fusion (tube capillaire) : noircit à 270C sans
- 1 ,
~ 386~0
' fusion à 3Q0C
- analyse élémentaire (sur tel quel) :
- % trouvé. C 48,3 H 3,6 0 16,6 N 13,5 S 15,35
. calculé 49,99 3,50 .' 15,26 14,57 16,68
' Cendres sulfuriques: 0,6; perte sous pression réduite
100C : 5,9
- Le 35665'RP donne un test négatif à la ninhydrine.
Après hydrolyse dans l'acide chlorhydrique 6N pendant 20 heures
à'reflux sous,azote, 'le produit donne un test pasitif à la
10, ninh~drine.conformément à sa nature polypeptidique.
-- spectre ultra-violet : (détermination à partir d'une solution
- à 10,5 mg/litre dans le méthanol)
3~ max = 320 nm El /m = 313
- épaulement vers 295 nm
- spectre visible : (détermination à partir d'une soluti'on à
.21 mg/litre dans le méthanol) ..
max = 405 nm El c/m = 107
épaulement vers 372 nm
- spectre infra-rouge : (détermination à partir de comprimés
en mélange avec KBr?. Ce spectre est représenté par la figure
1 sur laquelle on a porté en abscisses, d'une part les longueurs
. d'ondes exprimées en microns (échelle supérieure) et d'autre
' part les nombres d'ondes en cm 1 (échelle inférieure) et en
ordonnées les.densités optiques. '
Dans .le tableau I sont indiquées les principales '
'bandes d'absorption caractéristiques exprimées en nombre :.
d'ondes (cm ~
TABLEAU I
' 3450 ,(H20) '1538 tF 1168 m 880 tf
. 3400 F 1510 ép. 1150 m 845 m
3250 ép .1485 F 1110 ép . 825 m
3130 m 1422 m 1100 m 790 m
-- 2 --
~3t86~0
2970 m 1382 m 1080 ép. 755 F
2940 m 1370 ép. 1060 m 725 tf
2860 f 1342 m 1040 ép. 700 tf
2340 (CO2) 1310 m 1012 m 665 tf
1740 F 1300 ép. 985 t~ 630 m
1665 tF 1245 m 965 ép. 600 f
1610 ép. 1210 m 942 m 570 f
1578 tf 1200 ép. 918 m 525 tf
650 à 400 (H2O)
10tF : très forte m : moyenne tf : très faible
F : forte f : faible ép : épaulement
- pouvoir rotatoire :
/~D = 61 + 1,3 (c = 0,88 ; pyridine)
- spectre de résonance magnétique nucléaire du proton dans le
diméthylsulfoxyde hexadeutérié : ce spectre, qui est représenté
par la figure 2, a été enregistré à la fréquence de 250 Mhz sur
un appareil Cameca TSN 250. (marque de commerce dé~osee).
Les déplacements chimiques ~ sont comptés en ppm
positivement vers les champs faibles à partir du TMS pris en
référence interne.
Les constantes de couplage J sont exprimées en Hz.
Déplacements chimiques Forme du signal , constante de ~ -
en ppm par rapport au TMS couplage J
_
0,86 triplet
0,8 à 1,2 massif
1,72 doublet , (J = 7)
2,3 à 2,8 massif
2,52 multiplet
303,42 singulet
3,84 double doublet , (J = 14 et 4)
4,09 multiplet
. . ~ .
~ ;,s,
,
11q38610
:.
Déplacements chimiques Forme du signal , constante de
en ppm par rapport au TMS couplage J
4,36 triplet , (J = 4,5)
4,58 multiplet
5,3 à 5,7 masslf
. 5,74 doublet , (J = 6,5)
. 5,88 multiplet
. 6,46 quadruplet , (J = 6,5)
io 7,13 doublet , (J = 7)
. 7,28 triplet , (J = 7,5)
7,56 massif
: 7,70 épaulement
7,62 à 7,89 massif
7,9 singulet
8,20 singulet . -
8,32 singulet - :
8,48 singulet -
. 8,52 ` - épaulement
20 : 8,62 singulet large
8,67 singulet
: 9,44 singulet large
10,80 massif
11,40 - massif
_ _ , . !
- spectre de résonance magnétique nucléaire du 13C dans le
diméthylsulfoxyde hexadeutérié : ce spectre, qui est représenté
par la figure 3, a été enregistré à la fréquence de 62,86 MH~ sur
un appareil Cameca TSN 250.
Les déplacements chimiques sont mesurés en ppm en
prenant le diméthylsulfoxyde hexadeutérié comme référence
interne à 39,5 ppm par rapport au TMS.
4 --
~86~0
: Déplacements chimi~ques Forme du signal sur le spectre
en ppm par rapport au TMS pris en "off-resonance"
181,8 singulet
172,8 singulet
170,1 singulet
169,2 singulet
- 167,8 et 167,8 - singulet
166,5 singulet
163,9 singulet
` 161,6 singulet
159,9 singulet
159,7 singulet
159,5 - singulet
153,2 I singulet
lS0,8 I singulet
150,4 singulet
149,9 singulet
148,8 singulet
147,7 singulet
. 142,8 singulet
137,7 singulet
134,5 ` singulet
130,5 singulet
130,1 singulet
129,3 et 129,3. singulet
129,2 doublet
127,5 doublet
126,5 doublet
126,2 doublet
125,6 doublet
125,0 singulet
. ..
~ )86~0
Déplacements chimiques Forme du signal sur le spectre
en ppm par rapport au TMS pris en "off-resona~ce"
:
124,9 et 124,9 doublet
123,4 doublet
120,2 doublet
.118,6 singulet
114,6 doublet
66,5 et 66,5 doublet
; 10 66,1 triplet
56,7 doublet
49,2 doublet
45,3 doublet
37,7 triplet ,:,
29,6 triplet - :
18,4 quadruplet
13,7 quadruplet
12,4 quadruplet
_ _ !
Ces spectres montrent que le 35665 RP contient 48
atomes de carbone répartis en 11 atomes de carbone sp3 et 37
atomes de carbone sp2
- chromatographie en couche mince : en chromatographie ascendante -
sur couche mince de gel de silice en utilisant comme solvant :~
de développement le mélange benzène-méthanol-acide acétique-
pyridine (75-10-2-15 en volume) et en,observant la fluorescence
jaune sous lumière ultra-violette à 366 nm, le 35665 RP a un
Rf de 0,I6.
- activité bactériostatique : l'activité bactériostatique du
30 35665 RP envers un certain nombre de germes a été déterminée
par une des méthodes de dilution couramment employées à cet
effet. Pour chaque germe, on a déterminé la plus petite
~, - 6 - .
86~0
concentration de substance qui, dans des conditions définies,
empêche tout développement visible dans un milieu nitritif.
approprié. Les ré=ultats des diverses déterminàtions sont
rassemblé S dans le tableau II où les concentrations bactérios-
tatiques~minimales sont exprlmées en micro.grammes de substance
par cm3 de milieu d'essai.
TABLEAU II
MicroorganismeConcentration minimale
inhibitrice (,ug/cm3) ~ .:
. ._. ............................ ~ .. ~
Staphylococcus aureus - Souche 209 P - 0,00051 .
ATCC 6538 P .
. Staphylococcus aureus - Souche 133 - 0,0013 .. :
. Institut Pasteur
Staphylococcus aureus - Souche Smith 0,0010 ..
l Micrococcus lysodeikticus - ATCC 4698 0,00027 . ~.
.. Sarcina lutea - ATCC 9341 0,00046
Streptococcus faecalis ATCC 9790 0,0016 . :
Streptococcus faecalis ATCC 8043 0,00078
Streptococcus pyogenes - Souche Dig 7, 0,00014
Institut Pasteur
. Diplococcus pneumoniae - Souche Til 0,00017
Neisseria catarrhalis - Souche A 152 ~ 0,0072
. Institut Pasteur :
Bacillus subtilis - ATCC 6633 0,0023. - ~
Bacillus cereus - ATCC 6630 0,021 . .-
Mycobacterium species - ATCC 607 50
Escherichia-.coli - ATCC 9637 sup. à 200
-Proteus vulgaris - Souche A 272 - sup. à 200
Institut Pasteur
Klebsiella pneumoniae - ATCC 10031 sup. à 200
Pseudomonas aeruginosa - Souche Bass sup. à 200
Institut Pasteur .
- 30 . . ......... __ ~ .
- La toxicité du 35 665 RP a été etudiée chez la souris.
Par voie orale, le 35665 RP est atoxiqùe à la dose de 2,5 g/kg.
.
8610
L'antibiotique 35665 RP peut être obtenu par hydrolyse
ménagée de l'antibiotique 9671 RP, connu sous le nom de
nosiheptide.
Le nosiheptide et sa préparation par culture de
Streptomyces actuosus (~RRL 2954) sont décrits dans le brevet
francais 1 392 453. La structure proposée pour cet antibioti-
que a été publiée dans Tetrahedron Letters, N 16, p. 1395 à
1406 (1977) et elle correspond à la formule (I) *ans laquelle
~ représente le radical -CO~H - C - CONH2.
CH2
Le procédé selon l'invention a pour résultat de rempla-
cer le radical -Cl-CONH2 par un atome d'hydrogène sans toucher
au reste de la 2 molécule et, en particulier, sans rompre
les liaisons peptidiques ou lactoniques.
Généralement, la réaction s'effectue par chauffage du
nosiheptide dans une solution d'un acide minéral et d'un solvant
organique neutre ou dans une solution aqueuse d'un acide
organique contenant moins de 3 atomes de carbone, à une --
température comprise entre 40 et 120C. Selon la température
et l'acidité du milieu réactionnel, la durée de réaction est
comprise entre 10 minutes et 4 heures. Comme milieu réactionnel
approprié, on peut citer, par exemple, l'acide chlorhydrique
anhydre en solution 1 ~ 5 ~ dans des mélanges chlorure de
méthylène et méthanol, et l'acide acétique aqueux à 95 % en
volume.
Le 35665 RP obtenu est séparé du milieu réactionnel
par filtration après précipitation par addition d'un mauvais
solvant.
Le 35665 RP peut être purifié par des méthodes physico-
chimiques telles que la chromatographie.
Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif,
montrent co~nent l'invention peut être mise en pratique.
~ 8610
EXEMPLE 1
Une suspension de 100 mg de nosiheptide dans 10 cm3
d'un mélange acide acétique-eau (90-10 en volume) est chauffée
à reflux pendant 1 heure. Après refroidissement, la solution
obtenue est versée dans 100 cm3 d'éther éthylique. Le précipité -
qui se forme est séparé par filtration, lavé par 50 cm3 d'éther
éthylique et séché sous pression réduite (5 mm de mercure) à
35C. - ~
Le produit ainsi obtenu (100 mg) est purifié, en deux ~ ~`
fois, par chromatographie liquide à haute performance (C.L.H.P.)
sur une colonne en acier inoxydable de 60 cm de longueur et
0,75 cm de diamètre contenant environ 15 g de gel de silice
(granulométrie 10 à 40 ~m, tassé sous une pression de 300 bars).
Lors de chaque operation, on injecte dans la colonne
50 mg de produit en solution dans 1 cm3 du mélange chloroforme-
éthanol-eau (80-20-0,25 en volume).
Le solvant d'élution est constitué d'un mélange
chloroforme-éthanol-eau (95-5-0,25 en volume).
L'élution, qui est effectuée sous une pression de 50
bars (2,5 cm3 par minute), est suivie par la mesure en continu
de la densité optique à la longueur d'onde de 360 nm.
La fraction contenant le 35665 RP est concentrée à
sec sous pression réduite à l'abri de la lumière. On obtient
ainsi 13 mg de 35665 RP.
EXEMPLE 2
Une suspension de 100 mg de nosiheptide dans 10 cm3
d'un mélange chlorure de méthylène-méthanol chlorhydrique 8N
(70-30 en volume) est chauffée à reflux pendant 1 heure, et
on refroidit à 20-25C.
La solution obtenue est versée dans 100 cm3 d'éther
éthylique. Le précipité obtenu est séparé par filtration, lavé
par 50 cm3 d'éther éthylique et séché sous pression réduite
_ g _
~ ~86~L~
(5 mm de mercure) à 35C.
On isole ainsi 100 mg de produit qui es~ purifié
dans les conditions décrites à l'exemple 1.
On obtient ainsi 27 mg de 35665 RP.
Ajouté à la nourriture des animaux l'antibiotique
35665 RP permet d'obtenir un accroissement de poids de l'animal
plus rapide qu'avec des aliments qui en sont exempts. D'autre
part cet antibiotique présente l'avantage d'être très stable au
stockage et de pouvoir être mélangé à tous les produits habituel-
lement donnés en nourriture aux animaux sans crainte d'altéra-
tion au cours du stockage.
Un autre objet de la présente invention est constitué -
par les aliments mixtes pour animaux ou les mélanges concentrés
pour alimentation animale renfermant l'antibiotique 35665 RP.
La dose nécessaire pour produire un effet convenable ;
peut naturellement varier dans d'assez lar~es limites suivant les
espèces animales et suivant la valeur nutritive des aliments
eux-mêmes. D'une façon générale, il suffit que les rations
a7imentaires mises à la disposition des animaux contiennent 1
à 50 g d'antibiotique 35665 RP par tonne d'aliment.
L'antibiotique 35665 RP peut être contenu en disper-
sion uniformie dans des aliments composés complets, aux doses
ci-dessus. Il peut être réparti dans des aliments complémentai-
res qui en contiennent de 0,1 à 0,001 %, le plus souvent avec
d'autres additifs tels que vitamines et sels minéraux. Ces
aliments complémentaires peuvent être soit mélangés à la ration
soit consommés tel~ quels et représentent habituellement 5 à
20 % de la ration.
Les "prémixes", utilisés pour la préparation des
rations complètes ou des aliments complémentaires, contiennent
habituellement de 0,05 % à 20 % d'antibiotique 35 665 RP, dilué
dans une charge alimentaire. Ils constituent un intermédiaire
-- 10 --
86~L0
commode facilitant la répartition uniforme de l'antibiotique
35665 RP dans les aliments. Les "prémixes" eux-mêmes sont
généralement obtenus à partir de concentrés qui contiennent
99,9 à 20 % d'antibiotique 35665 RP, additionné de dénaturants
comestibles tels que colorants alimentaires, aromatisants,
agents dispersants ou évitant l'agglomération et charges
alimentaires. Un concentré peut contenir en poids par exemple
99 % d'antibiotique 35665 RP avec 0,1 % de colorant et 0,9 %
d'anti-agglomérant.
Les concentrés et "prémixes" sont généralement pulvéru-
lents. Les aliments complémentaires et les aliments composés
complets peuvent être soit pulvérulents, soit sous forme de
granulés, préparés selon les techniques habituelles. Dans ces
différentes compositions l'antibiotique 35665 RP peut être sous
forme de fines particules libres ou recouvertes d'un enrobage.
L'administration de 1'antibiotique 35665 RP convient
pour tous les animaux et notamment pour la volaille.
L'exemple suivant, donné à titre non limitatif,
illustre une composition selon l'invention.
Exemple
On prépare un aliment pour poussins ayant la composi-
tion suivante (% en poids) :
- farine de blé .................. 15 %
- farine de mais ................. 45 %
- - matière grasses ................ .0,8 %
- farine de soja ................. 25 %
- farine de poisson .............. .7 %
- lait sec ....................... .1,2 %
- solubles de distillerie ........ .2 %
- complexe minéral vitaminisé .... .4 %
On répartit uniformément dans cet aliment l'antibioti-
que 35665 RP a raison de 5 g ou 10 g par tonne d' al iment.
11~8610
Des poussins (STUD 160 Blancs) sont répartis en
batteries à raison de 14 par case et l'on utilise 6 cases par
~ssai (soit 84 poussins se répartissant en 42 coquelets et
42 poulettes).
Les poussins sont placés en batteries chaudes de
l'âge de 1 jour à 4 semaines, en batteries froides de 4 à
.. . . . .
8 semaines.
Les aliments sont distribués à partir du jour 1.
Les coquelets et poulettes sont pesés à 4 et 8
- 10 semaines.
On détermine alors :
l) le ~ain de poids de poulets nourris avec l'aliment additionné
de l'antibiotique 35665 RP aux doses indiquées précédemment
par rapport à celui des poulets nourris avec L'aliment témoin
(exprimé en %)
2) l'indice de- conversion (poids d'aliment consommé) des
- gain de poids
- poulets nourris avec l'aliment additionné de l'antibiotique
35665 RP aux doses indiquées précédemment par rapport à celui
des poulets nourris avec l'aliment témoin (exprimé en %).
Les résultats sont rassemblés dans le tableau
suivant :
- 12 -
11~861~
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