Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
~ 8C~
La présente invention a pour objet un nouveau matériau .
à caractère cationique capable de fixer de facon réversible des
macromolécules biologiques, des proteines diverses, des acides
nucléiques, etc
Jusqu'à présent, il n'a pas été possible de mettre au .
point des supports, pour la chromatographie par échanges d'ions
de tels types de molécules, présentant d'une part d'excellentes
propriétés chimiques et d'autre part d'excellentes propriétés
mécaniques.
En effet, il a déjà été proposé de nombreux types de ~:
supports, parmi ceux-ci certains présentent de très bonnes propri- ~
étés chimiques et permettent ainsi des séparations sélectives mais :
possèdent par contre des propriétés mécaniques tout-à-fait .
médiocres.
Inversement, il a été également proposé des supports
ayant de très bonnes qualités mécaniques notamment pour une utilisa-
tion préparative ou industrielle en colonne~ mais il s'est avéré
que ces supports possédaient des propriétés chimiques tout~à-fait
insuffisantes vis-à-vis notamment des macromolécules biologiques, ` .
20 ces supports présentant des sites d'absorption irréversible.
Etant donné que les techniques modernes de séparation
des macromolécules biologiques nécessitent à la Eois l'utilisation
de supports présenkant d'une part une excellente activité chimiques
et d'autre part une grande résistance mécanique, la Société deman- .
deresse après d'imporkantes recherches, vient de constater qu'il .
était possible d'obtenir de tels résultats en utilisant un matériau
d'un type particulier~
La présente invention a donc pour objet à titre de
produits industriel nouveau un matériau capable de fixer de facon
réversible des macromolécules biologiques, ce matériau étant ca- ~
ractérisé par le fait qu'i.l comprend un support constitué d'un . .
h~
oxyde minéral poreux ayan~ une surface interne inferieure ou
égale à 100 m2/y et un diamètre poreux supérieur ou égal à 25 nm,
ledit support étant revêtu directement sur sa surface par un
polymère polysaccharidique aminé porteur de charges positives,
ledit polymère ayant un poids moléculaire supérieur ou égal à
104 daltOns.
Les différents essais ef~ectués par la Société demande-
resse ont permis de montrer que ce type de matériau béné~icie de
qualités mécaniques, physiques, chimiques et biologiques du
support minéral poreux tout en ayant une nouvelle surface chimique
particulièrement appropriée pour la séparation chromatographique
- des ~acromolécules biologiques.
Selon l'invention, le support minéral poreux peut être
de la silice, de l'alumine, de la magnésie, un oxyde de titane,
ou leurs dérivés s~nthétiques ou naturels tels que verres, sili-
cates, kaolin, etc
Le polymère polysaccharidique aminé est fixé sur le
support minéral poreux par encollage, ce mécanisme dladhésion
ne semble pas uniquement de type électrostatique car des supports
poreux tels que l'alumine de surface non négative peuvent être
également revêtus de polymère polysaccharidique aminé et conduire
à des matériaux selon l'invention d'excellentes qualités.
Il s'ensuit c~ue le revêtement de polymère polysaccha-
ridique aminé est Eixé de Eaçon pratiquement irréversible sur le
support. Toutefois, dans certaines conditions qui seront décrites
ai-apres il est possible après un certain temps d'utilisation de
réyénérer le support minéral poreux qui peut alors à nouveau être
réutilisé pour une nouvelle imprégnation à l'aide d'un polymère
polysaccharidique aminé.
Le support minéral poreux doit avoir une porosité con-
trôlée bien définie. La surface interne de support doit être in-
férieure ou égale à 100 m2/g; elle est de préférence comprise
--2--
,' , . ' .~ ~
38/~
entre 5 et 80 m /g. Le diamètre poreux moyen est supérieur ou
égal à 25 nm et, de préférence, compris entre 50 et 1000 nm, `
des intervalles plus précis pouvant être conseillés suivant le
type d'application envisagé. Pour des surfaces plus grandes ou
des diamètres poreux faibles la surface interne du support devient
inaccessible au polymère polysaccharidique aminé et ultérieurement
aux macromolécules à séparer. Selon un mode préfére de l'invention,
le support poreux minéral est de la silice ou de l'alumine et de
préférence un support de silice poreuse à caractère anionique
obtenue par exemple selon les procédés décrits dans les brevets
franQais No 1.473.239, No 1.473.240, No 1.475.929 et No 1.482.~67.
On utilise par exemple des silices poreuses vendues par RHONE-
POULENC CHIMIE FINE sous les marques de commerce SPHEROSILS XOB
030, XOB 015 et XOC 005, ces silices ayant des surfaces respectives
de 50, 25 et 10 m /g.
Le polymère polysaccharidique aminé qui sert à imprégner
et à recouvrir la surface interne du support poreux minéral doit
avoir un caractère cationique prononcé et avoir de bonnes pro-
priétés d'hydrophilie. Il a un poids moléculaire au moins égal
à lQ4 daltons et, de préférence, compris entre 105 et 106. Sa ;
formule peut être quelconque et il peut en particulier être un
dérivé aminé du dextrane, de ].'amidon, de la cellulose, de l'agarose
ou d'un polymère naturel ou synthé~ique de tous les oses connus
à condition,bien entendu qu'il ne comporte pas de groupements
anionigues tels que carboxyliques ou sulfoniques en quantité ap-
préciable de telle sorte que le polymère possède des charges élec-
triques négatives importantes qui gêneraient lors de l'utilisation
du support comme échangeur d'anions.
Les fonctions amines du polymère polysaccharidique
peuvent être primaires, secondaires ou tertiaires ou éventuellement
quaternaires. Les fonctions secondaires tertiaires, et quaternaires
sont cependant préférables.
--3--
~y .
Se1on un mode préférentiel, le polymère polysaccharidique
aminé correspond à la formule suivante:
R ~ CH2)n N ~ R2 ~~~~~~~~-----~
~o~
dans laquelle: :
R représente un reste de dextrane, d'amidon, de cellulose ou
d'ag~rose, ;
n est un nombre entier de 1 à 10 et de préférence de 2 à 5,
Rl et R2 identiques ou diérents représentent les radicaux
suivants: CH3, CH2 CH3l CH2OH, CH2 C 2 u C 2
CHOH - CH3, ce composé pouvant être quaternisé à l'aide d'un
agent quaternisant classi~ue tel que les halogénures et en
particulier les iodures et bromures d'alkyle ou d'hydroxyalkyle,
le sulfate de diméthyle etc...
Parmi ces composés de ce t~pe on peut.en particulier citer
les composés connus sous les dénominations de DEAE DEXTRAN
(diéthylamino eth~l dextran) de poids moléculaire 500.000 et de .
QAE DEXTRAN (diethylamino ethyl dextran quaternisé) vendus par
la firme PHARM~CIA et le composé connu sous la dénomination de
DEAE amidon (diéthylamino éth~l amidon) ainsi que les amidons
cationiques tels que ceux vendus sous la marque de commerce
CATO par la Societé RO~UETTE NATIONAL.
Selon un autre mode preférentiel de l'invention le poly-
mère polysaccharidi~ue aminé peut être réticulé à l'aide d'un . ::.
agent réticulant tel que le 1-4 butanedioldiglycidyléther ou
l'épichlorhydrine~ l'épibromhydrine, un diépoxyde de Eormule:
CH2 - CH - R~ - N - R3 - C \- /H2
O O
dans laquelle: .
Rl est un alkyle de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence un
alkyle inérieur de 1 à 4 atomes de carbone, R2 et R3 représen-
tent une chaine hydrocarbon~e de l à 10 atomes de carbone et de
préférence un radical alkylène inférieur par exemple le diépoxyde
de formule:
. - 4 -
., .:
.
`
Q7
CH
(fH2)3
H2 !CH - CH2 - N - CH2 ~ C~ -/CH2
O O
La pr~sente invention a également pour objet le procédé
de preparation du matériau ~ caract~re cationique selon l'inven-
tion capable de fixer de façon réverRible des macromolecules biolo-
giquesO
Ce procéd~ peut 8tre réali~é selon deux methodes diffé-
rentes ~ ~a~oir l'imprégnation en colonne et l'impr~gnation aufour.
Selon la premi~re m~thode, on introduit l'ox~de minéral
poreux dans une colonne de chromatographie en versant directement
la poudre sèche et homog~ne. On lave et homogé~éise ensuite pour
chasser les bulles d'air en faisant passer une solution d'acide par
exemple l'acide chlorhydrique 0,1 N. On fait alors passer un
; tampon de pH 3 ~ 12 (par exemple tampon TRIS 0,05 M pH 7) jusqu~ ;
équilibre.
On introduit ensuite le polym~re polysaccharidique amin~
en solution ~ ~roid ou ~ chaud dans le tampon précédent ou dans
de l'eau ajustée au m8me pH~ L'excès de polymère poly~accharidi-
que amin~ est alors élimin~ par ~lution à l'aide du tampon préce-
dent puis ~ l'aide d'une solution d'un sel par e~emple ~ l'aide
de citrate trisodlque; 1'ab~ence da~s l'éluat ~inal de polymère
; polysaccharidique aminé peut 8tre détermine par électrophor~se
en ac~tate de cellulose et coloration de la plaque au rouge
Ponceau ou encore par précipitation en présence d'acide polyacry- ;
liqu~.
Le matériau ainsi obtenu permet de fixer de faço~
réversible environ 20 ~ 50 mg de protéines par gramme de support. -
~
Ce matériau présente une grande stabilité dans unelarge gamme de pH (~ ~ 12 environ)O
: .
5 - ;
Selon la deuxiame méthode dite d9imprégnation au four,
1'oxyde minéral poreux après avoir été pesé est imprégné ~ froid
ou à chaud ~ l'aide d'une solution aqueuse de polymère polysaccha-
ridique aminé, ~ un pH compris indif~éremment entre 3 et 12. On
s~che ensuite à l'~tuve entre 50 et 120 et de preférence ~ 80G
jusqu'~ ce que l'on obtienne un poids constantr
La poudre ainsi obte~ue es~ alors homog~néis~e et tamisée
si cela s'av~re nécessaire pour éliminer d7éventuels agglomérats.
Le matériau obtenu par imprégnation au four peut alors 8tre utilisé
en colonne apr~s lavage prealable ~ l'aide de solution tampon ou
de citrate 0,05 M pH 4 ou 0,05 M pH 6, 8; le matériau o~te~u par
cette méthode permet de ~ixer de façon réversible environ 40 à
200 mg de protéines par gra~me de support.
Comme on peut le constater, cette méthode d'i~prégnation
au four augmente de façon appréciable les capacités de fixation
des protéines.
La méthode d'imprégnation au four permet également
d'obtenir un matériau dont le rev8temen-t de polymère polysaccha-
ridique ami~é est ~ixé de ~açon prati~uement irréversible.
En e~et, ce matériau peut etre lavé par de l'acide chlor-
hydrique 0,1 N, par de la æoude ou par de l'ammoniaque 0,1 N sans
af~ecter ces propriétés d'échangeur d'anions alors que selon la
méthode d'imprégnation en colonne, de tels lavages régénèrent
l'oxyde minéral poreux initial. Si l'on souhaite rénégerer l'oxyde
minéral poreux des matériaux obtenus selon la méthode d'impré-
gnation au four, il importe de traiter le materiau dans des
condltions beaucoup plus énergiques par exemple à l'aide d'acide
nitrique fumant.
Il résulte donc que selon la méthode par imprégnation
au four, il est possible d'utiliser le matériau selon l'invention
pour de nombreuses opérations sans pour cela affecter ses excellen-
tes propriétés d'échangeur d'anions.
- 6 -
'.
Selon un autre mode de réalisation du procédé s~lon
l'invention, il est possible apr~s imprégnation selon l'une des
méthodes décrites ci-dessus, et après avoir séché à l'étuvc entre
environ 50 et 80C pour obtenir une poudre homogène, de traiter
le produit obtenu à l'aide d'une solution d'un agent réticulant
dans un solvant volatil tel que l'éther éthylique par exemple
comme agent réticulant on peut`utiliser l'un quelconque de ceux
précédemment mentionnés.
Dans ce cas le produit à traiter est agité jusqu'~
évaporation complète du solvant ceci de ~açon ~ obtenir une
imprégnation réguliare.
On porte ensuite à une température compri~e entre 40
et 120C de pré~érence voisine de 80C pendant environ 15 heures.
Apr~s tamisage éventuel le support est alors monté ~ sec en
colonne, lavé par de la soude puis par une solution de chlorure de
sodium et en~in équilibré avec le tampon de chromatographie
souhaité.
Par cette réticulation on obtient ainsi un matériau
présentant d'excellentes qualités et qui peut être lavé de façon
réguli~re par de la soude ou de l'ammoniqaue 0,1 N ou de l'acide
chlorhydrique 0,1 N sans pour cela altérer soit ses qualités
geparatriceS 50it sa capacité de fixation réversible des protéines.
La capacité du mat~riau ainsi obtenu est aomprise entre
40 et 200 mg de protéines par gramme de support~ Pour des sur-
faces du support poreux initial allant de 10 à 80 m2/g cette
capacité est ~ peu pr~s constante.
Co~me pour les matériaux obtenu~ selon le procédé d'im- ~
prégnation en colonne ou au ~our il est également possible dans ;
le cas présente de laver le matériau ~ l'acide nitrique concentr~
de façon ~ régénérer 1'oxyde minéral poreux servant de support.
La présente invention a en outre pour objet l'applica-
tion des nouveaux matériaux décrits ci-dessus ~ la purification
~ 7-~
ou ~ la séparation des macromolécules biologiques, notamment des
protéines.
D'une façon g~nérale cette application consiste à utili-
ser les propriétés cationiques du matériau selon l "nvention soit
pour fixer s~lectivement les macromolécules biologiques que l'on
désire isoler ou purifier soit pour retenir sélectivement les impu-
retés ou autres protéines non désirés.
La fixation sélective des protéines est facilement
obtenue en réglant le pH et la molarité selon les m~thodes bien
connues d~utilisation des échangeurs d'ions.
D'une ~açon générale cette application est caract~risée
par le fait ~ue l'on fait passer sur le matériau objet de l'in~en-
tion, une solution contenant les macromolécules biologiques que
l'on désire isoler ou purifier en réglant le pH et la molarit~ ;
pour que ledit matériau ~ixe sélec~ivement soit les macromolécules
biologiques que l'on désire purifier ou isoler soit les impuretés
non désirées.
Dans le cas o~ le matériau ~ixe les macromolécules que
l'on désire purifier ou isoler, celles-ci sont ensuite éluées
avec une solution de pH et de molarité convenables.
Dans le cas où le matériau fi~e les impuretés on recueil- ;
le directement les macromolécules biologiques en ~olution. On
élue ensuite avec une solution de pH et de molarit~ convenables
pour ~limlner les impuretés et rég~n~rer al~si le matériau pour
une nouvelle opération.
Quelques applications selon l'invention sont mentionnées
ci-après à titre d'illustration seulement :
a) Puri~ication de~ gammaglobulines à partir de sérums ou
de plasmas humains ou animaux.
~0 b) Elimination de l'hémoglobine dans le procédé de
purification de l'albumine ~ partir du sang placentaire et concen-
tration des autres protéines.
,
,, ~ . . .
c) Concentration d'une solution de protéines diluées
en milieu alcoolique et ~limination de l'alcool.
d) Concentration et purification de l'albumine dans une
solution de caprylate de sodium.
e) Concentration et purification de gangliosides
partir d'extraits aqueux de cerveaux dianimaux.
Ce~ dif~érentes applications du matériau selon l'inven-
tion seront décrites en dé~tails dans les exemples de réalisation
don~és ci-apr~s.
Le mat~riau selon l'in~ention trouve également une
application pour la purification d'anticorps ou d'an~ig~nes. Dans :~:
ce cas on im~obilise sur le matériau selon l'in~ention des anti-
g~nes ou anticorps et on utilise le matériau ainsi modifié pour
la purification et la concentration des anticorps et antiganes
ou anticorps et on utilise le matériau ainsi modifié pour la puri-
fication et la concentration des anticorps e-t antig~nes corres-
: pondants.
Ainsi il est possible d'immobiliser : ..
- L'albumine, les alpha b8ta et gammaglobulirles humaines
ou animales.
! - Tout antigene bactérien et viral pourvu ~u'ils pOs~
dent des charges électriques négatives ~ pH 6,8. C'est le cas de
la plupart des protéines, polysaccharides et acides nucléiques
connus.
A titre non limitat~ on peut par exemple également
citer~ les toxlnes bactériennes9 l'anatoxine t~tanique, l'antigène
HBS a~socié ~ l'hépatite B, le virus grippal, le virus de la rage,
le virus de l'herpès, le ~irus de la rougeole, le virus de la :~:
rubéole? les ad~novirus, les papora~irus, les arboYirus, les `:
rhinovirus, les picorna~irusj les ent~rov{rus, les poxivirus, les
myxo~iru~, les paranyxovirus, les réovirus, les coronavirus~ ou
leurs produits de dégradation tels que leurs antigènes divers.
_ 9 _
'
De m8me que les materiaux selon l'invention peuvent
immobiliser des antiganes ou anticorp~, ceux-ci peu~ent é~alement
immobiliser divers enzymes conduisant à des materiaux d~activité
enzymatique suiva~te :
pepsine, trypsine, chrymotrypsine, plasmine, lacticode- ~-
shydrogénase, L aminoacylase~ invertase~ glucose isomerase,
amyloglucosidase, glucose oxydase, catalase, lipase, uréase.
Selon un mode de réalisation particulier ces substances
macromoléculaires immobilis~es peuvent 1'8tre de façon irréversi~
bles si on ré~lise ultérieurement une réticulation ~ l'aide d'un
agent réticulan~ tels que ceux énumérés ci-dessus.
Cette réticulation est en g~néral e~fectuée ~ température
ambi~nte~
En~in, les matériaux selon l'invention peuvent également
8tre utilisés pour immobiliser des molecules de ~aibles poids molé-
culaires telles que certains amino-acides ou certains ligands
possedant des fonctions amines, alcools ou thiols en présence d'un
agent couplant tel que le glutaraldéhyde ou des composés dipéoxy
tels que ceux énumérés ci-dessus.
C'est ainsi qu'il est possible d'immobiliser par exemple
de la lysine et le matériau obtenu peut être utilisé pour purifier
ou éliminer le plasminogènss ou la plasmine, protéine du sang ayant
une a~finité ~orte pour la lysine.
De m~me il est possible d'immobiliser diver~ stéro1des
et utiliser de tels matériaux ainsi modi~iés pour purifier leurs
protéines de tra~sport. Enfin,il est possible d'immobiliser
divers récepteurs cell~laires par exemple des gangliosides pré-
alablement désacétylés pour faire appara~tre les fonctions aminées
les plus réactives et utiliser ces matériaux pour l'élimin~ion,
la neutralisation ou la purification de leurs ligands.
~n va maintemant donner ~ titre d'illustration et sans
aucun caractère limitatif plusieurs exemples de préparation du ~ ~
~' ''
- 10 -
'' ' ~
matériau selon l'inventîon ainsi que plusieurs exemples d'applica-
tion de ce matériau.
E:XE:MPLE 1 .
10 g de Sphérosil X0 C005 sont mis en colonne de chroma-
tographie en versant directement la poudre sèche et ~omog~ne, ce
qui facilite le montage de la colonne. 100 ml d'une solution
d'acide chlorhydrique HCl n,l N sont alors introduits dan~ la
colonne grâce ~ u~e pompe péristaltique à un débit de 500 ml/h~
pour laver, imprégner la colonne et chasser toutes les bulles
d'air (le sens d~élution ascendante es~ préférable)~ Un tampon
de pH 3 ~ 12 est alors introduit dans la colonne (tampon TRIS 0,05
M pH 7 par exemple3 jusqu'~ equilibre, contrôlé par mesure du pH
et de la résistivité du tampon en sortie de colcnne . Environ
150 ml d'une solution de DEAE dextran ~ 1 % (ou 30 ml ~ 5 %) dans
le tampon précédent ou dans de l'eau aJustée à ce pH, sont alors
introduits à un débit de 100 ml/h. Ensuite l'excès de DEAE dextran
non fixé sur la colonne est élué par le tampon précédent puis par
du citrate 0,05 M pH 4 et du citrate 0,05 M pH 8 à un débit de
1000 ml/h. Enfin la colonne est é~uilibrée dans le tampon de ~;
chromatographie souhaité. L'absence de DEAE ~extr~n dan~ l'éluat
final peut être déterminée par électrophor~se en acétate de
cellulo~e et coloration de la plaque au rouge PDnceau, ou par
précipitation en présence d'acide polyacryliq~e. Le support
ainsi impr~gné est stable dans une large gamme de pH (3 à 12
environ) et se comporte en ~changeur d'anions, il est particulière-
ment adapté à la purification ou la concentration des protéines.
Dans un système tampon adéquat, il est capable de fixer de mani~re
réversible de 20 ~ 50 mg de protéines par gramme de support
~mprégné.
Dans cet exemple le DEAE Destran peut ~tre avantageuse-
ment remplace par le OAE Dextran.
",
.. . . .. - . . ~ : .
EXEMPLE 2
10 g de Sphérosil XO B 015 sont peses et imprégnés de
20 ml d'une solution aqueuse de polysaccharide aminé ~DEAE Dextran
par exemple~ à une concentration comprise entre 1 et 10 % de
préférence comprise entre 5 et 8 ~, et à un pH compris indifférem-
ment e~tre 3 et 12. L~ensemble est séché ~ l~étuve entre 50 et
120C, mais de pre~érence ~ 80C pendant le temps ~éce~saire
(15 h. par exemple~ pour avoir un poids constant (élimination de
l'eau). La poudre obtenue est homogénéisée et tami~ée si néces-
saire pour él~miner d'eventuels agglomérats , puis montée encolonne.
Apras remplissag~ d~une colonne et lavages préalables
par les tampons HCl 0,1 N, ou citrate 0,05 M pH 49 OU citrate
0,05 M pH 6,8 ou NaOH 0,1 N, la colonne est équilibrée dans le
tampon adéqua-t pour le type de chromatographie recherchée. La
capacité de fixation des protéines est cette fois plus élevée, ;. `
elle est de l'ordre de 40 à 200 mg/g en ~onction des conditions
de chromatographie. :
Dans cet exemple le DEAE9 Dextran peut être avantageuse-
ment remplacé par un autre polymère polysaccharidique aminé telque le DEAE amidon.
EXEMPLE ~
A 10 g de Sphérosil XOB 030 ~mprégnés selon l'une des
deux méthodes préc~dentes, par une solution de cpolysaccharide
amlné de pH compris entre 8 et 13, mais de préférence égal à
11,5 puis sécbé ~ l'étuve pour obtenir une poudre homogène,sont
additionés ~0 ml d'une solution de 1-4 butanedioldiglycidyl~ther
de 0,02 % ~ 2 % dans l'éther ~thylique, mais de pré~érence égale
~ 0,15 %. L'ensemble est agité en continu ~ une température de
40C, jusqu'à évaporation complète de l'éther éthylique et pour
obtenir une imprégnation régulière par ce composé diépoxy servant
d'agent réticulant.
. .
,' .:.~; ` ;
L'ensemble est ensuite porté ~ une température comprise
entre 40 et 120C, de préférence voisine de 80~C 9 pendant 15
heures environ. Après tamisage éventuel en final, le support
est alors monté ~ sec en colonne, lavé par 1 litre de soude 0,1 N
puis 1 litre de NaCl M et enfin équilibré a~ec le tampon de
chromatographie. -
La capacite de fixation des protéines est comprise
entre 40 et 200 mg par gramme de support en ~onction des conditions
de chromatographie. Pour des sur~aces du support poreux initial
allant de 10 ~ 80 m2/g, cette capacité est ~ peu près constante.
EXEMPLE 4
... . _ ,
.
serums ou ~lasma humains ou animaux.
1, 2 ou 3 précédents :
- Equilibrage de la colonne ~ pH 6,8 par exemple (entre
6,3 et 8) (tampon P04 0,01 à 0,02 ~ ou tampon TRIS-HCl 0,05 ou
NaCl 1 à 3 g/1)9 ~ un débit de 200 ml/cm2/h.
- Introduction de 50 ml plasma ou ~érun préalablement
dialysé contre le tampon de chromatographie et filtré pour éliminer
toute possibilité de colmatage. (Débit moyen 50 ~ 100 ml/cm2/h).
Pour un support préparé suivant l'exemp~e 1 la quantit~ de sérum
ou plasma par cycle doit ~tre ramenée à 2~ ml,
- ~avage de la colonne par le tampon d* chromatographie.
- Collection du pi~ de sortie constitué de gammaglobu-
lines pures en immunoélectrophorèse, avec un rendement compris
entre 50 et 100 % sui~ant les tampons utilisés. Le rendement est
meilleur pour les pH plus bas que pH 6~8 ou les forces ioniques
les plus ~ortes, mais la puret~ risque alors d'~tre moi~s bo~ne.
Une telle préparation de gammaglobulines est débarrassée des
substances pyrog~nes et de l'~ntig~ne associé à l'hépatite B
(Ag HBS) éventuellement présents dans la matiare brute de départ.
... , . , ,",, ,. .~ , , "" . ~ , ", - ,
- Elution des autres protéines retenues sur la colo~ne
par un tampon quelconque de pH 4 ou par le tampon de chromato-
graphie additionné de 10 ~ 60 g/l de ~aCl, ou enfin par un tampon
citrate 0,05 M de pH L~ ~ ~. La durée de ce cycle est d'environ
2 heures, un nouveau cycle peut alors ~tre immédiatement entrepris,
si bien qu'a~ec un automatisme assez simple9 une dizaine de
cycles peu~ent ~tre réalisés dans la m8me jou~née7 soit un débit
de traitement voisi~ de 10 litr~s de sérum ou plasma par kilo-
gramme d'oxyde minéral poreux et par jour.
~ . ,,
. ~
Le ~ractionnement du sang placentaire par llalcool seion
la methode de Cohn passe par une étape de précipitation du bloc
globulines à pH 6,8 et 20 ~ 25 % d'éthanol. Dans ces conditions,
1'albumine, certaines alpha 1, alpha 2 globulines et 1'hémoglobine
pour 1'essentiel restent en qolution dan~ le surnageant. Celui-ci
est recueilli par c~ntrifugation au froid, dilué dans un volume
égal d'eau distillée (pour diminuer la concentration en alcool)9
a~usté ~ un pH compris entre 6 et 7 et clarifié par filtration sur
membrane~ d'esters de cel}ulose.
Schéma d'un cycle de puri~ication sur ~0 ~ de support
(100 g de support sont n~cessaires s'il s~agit de celui
obtenu selon l'exemple 1.)
- Equilibrage de la colonne en tampon P0~0,01 M ou
TRIS-HCl 0,05 M pH 6 à 7 (6,5 de pr~érence) ~ un débit de 200
ml/cm2/h~
- Introduction ~ un débit moyen de 100 ml/cm2/h de 1000 ml
de la solution ~ purifier précedente.
- Lavage de la colonne par le tampon de chromatographie
au même débit. L'hémoglobine puri~iée sort de la colonne avec
- 14 _
un ~acteur de dilution négligeable alors que les ~utres protéines,
dont l'albumine, restent fixées sur la colonne.
- Elution des protéines ~ixées sur la colonne dans
des conditlons identiques ~ l'exemple 4, le pic contient les
protéines concentrées et pratiquement débarrassées d'hémoglobine.
- La durée de ce cyle est d'environ 4 heures, un nouveau
cycle peut alors etre immédiatement entrepris.
EXEMPLE 6 ~
~L ". ," ,.. : "
10 ~
Le ~ractio~nement des pr~téines, selon la m~thode de
Cohn, entra~ne inévitablement lors de diverses étapes des redis-
solutions de précipités alcooliques. Pour cela il est préférable
de dlluer fortement le précipité pour diminuer la concentration
en alcool résiduel qui gênerait. Ensuite, il y a donc nécessité,
d'une part d'éliminer la présence d'alcool, d'autre part de concen-
trer les protéines présentes. Ceci est généralement ef~ectué par
concentration SOU5 vide, lyophilisation ou dialyse, ces deux derni-
ères étapes étant ou très onéreuses ou sourced~ pyrogènes, on pro-
pose le procédé suivant extr8mement commode, rapide et économiqueO
Exemple d'~ne solution d'albumine à 2 % contenant 10 %d'alcool.
Schéma d'un c~cle de puri~ication etQ onçentration sur 1 K~J de
~Y~E~ (pr~paré selo~ les exemple~ 2 ou 3, dans le cas de l'exem-
ple 1, il y a lieu de doubler la quant~t~ de support nécessaire)
sa durée est de l'ordre de 4 heures~
1) Equillbrage du support en tampo~ phosphate 0,01 M
pH 7 - Débit 200 ml/cm2~h.
~ ) Introduction de la solution alcoolique d'albumine
~0 ajustée à pH 7 par addition de HCl ou NaOH selon le pH initial~
Débit moyen 100 ml/cm2/h.
Il est ainsi possible de fixer 200 g ~'albumine sur
,
- 15 -
.~
cette colonne (soit 10 litres de la solution/cycle3 si l'albumine
se fixe mal sur la colonne, il suffit de diluer davantage la
solution initiale dans l'eau distillée de maniere ~ baisser la
force ionique du milieu.
3) Lavage par de l'eau dlstillée. Débit 200 ml/cm2th. et
vérification que l'albumine ne sort pas mais que par contre l'al-
cool termine dc sor-tir.
4) Elution de l'albumine da~s un des tampons sulvants:
NaCl 0,1 M ou citrate de 0,05 M pH 6,8 on obtient généralement ~ -
de~ concentrations finales en albumine de 10 ~ 20 % environ,
l'élimination de l'alcool est totale, le rendement de l'opération
est voisin de 100 %. Ce procédé est applicable pour toute `
protéine dont le point isoélectrique est inférieur ~ 6,5. Pour
des protéines dont le point isoélectrique serait supérieur~ la
méthode serait applicable à condition d'augmenter le pH du tampon
de chromatographie. Enfin, il est évident que toute impureté
présente dans ces solutions prot~igues peut ainsi 8tre éliminée
à condition qu'elle soit électriquement neutre ~glucides et
polysaccharides) ou chargée positivement de la même manière ~ue
le support (cations). Dans le cas d'impuretés chargées négative-
ment, il peut y avoir compétition sur le support avec les protéinesnégatives que l'on cherche ~ fixer. Dans ce cas, si l'affinité
de l'impureté pour le support est plus ~aible que celle de la
protéine et si la solution peut ~tre diluee suffisamment dans
lleau pour obtenir une force ioni~ue compatible avec la fixation
de la protéine sur le support~ il est alors possible d'éliminer
m8me les anions. L'application suivante illustre une telle
séparation.
EX_
Concentration et puri~ication de l'albumine dans une
solution de caPrylate de sodium.
Des m~thodes de fractionnement extr~menent intéressantes
- 16 -
utilisent le caprylate de sodium pour coaguler toutes les prot~ines
l'exception de l'albumine uniqueme~t, qui reste donc en solution
en présence de caprylate.
Exemple dlune solution contenant 15 g/l d~albumine et 3 g/l de
caprylate. ,
Schéma d~un cycle sur 1 k~ de sup~ort (préparé selon les exemples
2 ou 3, dans le cas de l'~xemple 1 il faut doubler la quantité
de support nécessaire).
1) Equilibrage du support e~ tampon Phosphate 0901 M
pH 6 - Débit 200 ml/cm2/h.
2) Introduction de la solution d'albwmine et caprylate
ajustée elle m~me ~ pH 6 (diluée dans l'eau dans le cas de ~orces
ioni~ues trop élevées)~ Le débit moyen est de 100 ml/cm2/h.
Environ 8 1 de la solution peuvent être introduits sur
la colonne. Il est aisé de constater la fixation et d'observar
la sortie du caprylate de sodium en continu (odeur très marquée
; de ch~vre).
3) Lavage de la colonne par le tampon de chromatographie
jusqu'~ ce que rien ne sorte plus de la colonne~
4) Elution de l'albumine selon la m8me méthode que dans
les applications précédentes. On obtient une solution de 10 à
20 % d'albumine qui ramenée à 20 % contlent en final moins de
2,5 g/l de caprylate de sodium. La durée totale du cycle est de
4 heures environ.
Il est évident que cette méthode peut ~tre généralisée
~ la purification et concentration de diverses molécules biologi-
ques chargées négativement à certains pH (acides nucléiques,
protéines, polysaccharides anioniques, glycolipides anioniques).
Pour montr~r que cette générali~ation est possible et qu'une
telle colonne supporte sans conséquence le passage de liquides de
polarité tr~s diverses nous a~ons réalisé 1'application suivante.
EXEMPLE 8
.
- 17 -
- - ~o~0~
Concentration_et ~urification de ~an~liosides ~ partir
d'extraits aqueux de cerveaux d'animaux.
Les gangliosides sont des glycolipides dont les bio-
chimistes étudient actuellement le rôle physiologique ou patho-
logique extr8mement important, qu'ils jouent au niveau des membra-
nes cellulaires, comme récepteur et effecteur.. Ils contiennent
plus ou moins d'acide sialique et à ce titre sont chargés négati-
vement au-dessus de pH ~ environ.
A partir de 1 kg de cervelles de veau, il est possible
d'obt~nir un extrait aqueux d'environ 7 1. (selon un procédé
décrit dans une publication de L. SVEMNERHOLM : Gangliosides,
isolation. In: Methods in carbohydrate chemistry vol. 6 Edition
R.L. Whister and J.N. BEMILLER Acad. Press New York 1972).
Cet extrait aqueux est passé directement sur une colonne
de 50 g d'un support réalisé suivant l'exemple 3, préalablement
équilibrée en tampon TRIS-HCl 0,05 M pH 6,8. Le débit est de
200 ml/cm2/h. Tous les gangliosides s'accrochent sur la colonne
dans ces conditions. Un lavage préalable par les solutions
suivantes et dans 1'ordre indiqué:
TRIS-HCl 0,05 M pH 6,8
NaOH 0,1 N
H20
Chloroforme - Methanol - eau en proportions volumétri-
ques respectives ~uivantes ~30-60-25~ permet d'éliminer des
impureté~ nombreuses.
L'élution des gangliosides sous forme concentrée et
pur~fiée est alors réalis~e au m~me débit avec le mélange :
Chloro~orme - Méthanol - HCl 0,1 N en proportions volumétriques
respectives (30-60-25).
Aussit8t l'élution, le pic recueilli est neutralisé
par addition de NaOH 0,1 N, évaporé et repris dans un syst~me
chromatographique quelconque pour analyseO Le rendement est de
- 18 -
100 %. Il est remarquable de constater que la colonne peut,
sans aucune conséquence nuisible, passer d'un solvant orga~ique
une solution aqueuse et inversement. Ceci peut être le cas éché-
ant exploité pour des nettoyages particuliers, ou pour maintsnir
des conditions stériles dans la colonne.
. ,.
.~ .
~9~. ..
La capacité élevée de fixation de protéin~s révélée dans
les applications précédentes peut ~tre mise ~ profi-t pour immobili-
ser l'~natoxine tétanique sur une colonne de support minéral
poreux. Par exemple 10 g de Sphérosil XOC 005 (surface spécifique
10 m2/g) sont imprégnés de DEAE Dextran suivant l'exemple l; et
équilibrés en tampon phosphate 0,01 M pH 6,8. 25 ml d'anatoxine
tétanique (de titre biologique voisin de 1500 Lf ou Unités
floculantes) sont dilués ~ 250 ml dans ce même tampon et intro-
duits sur la colonne en continu. Au début du passage la fixation
de l'anatoxine tétanique est quantitative, aucune trace n'est
décelable en sortie de colonne par les méthodes immunologiques
appropriées jusqu'~ environ 200 ml d'éluat. Les 50 derniers ml
sont introduits malgré tout pour 8tre certain d'avoir un rev~tement
uniforme et complet d'anatoxine tétanique~ Puis la colonne est
rinc~e par le tampon de chromatographie. Il e~t alors possible
d'immobiliser d~finitivement l'anatoxine tétanique en la réticu-
lant, de mani~re ~ ce qu'elle ne puisse être éluée dans une gamme
de pH a~sez large (pH 2 ~ 12).
La réticulation se fa~t par circulation continue de
100 ml d'u~e solution de glutaraldéhyde ~ 095 % en tampon phosphate
0,01 M pH 6,8 pendant 2 heures ~ un débit de 40 ml/cm2/h environ
et à la température du laboratoire.
Puis la colonne est rincée par plusieurs tampons,
.
-- 19 --
.. ...
~0~ 7
successiYement : ~ -
Phosphate 0~01 M pH 6~8 ,
Glycocolle 092 M pH 8,2
Glycocclle 0,2 M pH 7~2 (aveC et sans NaCl 60 g/l)
Citrate 0,05 M pH 2,8
Retour ~i~al et conservation en glycocolle 0~2 M pH 7j2.
La colonne est alors pr~te ~ l'emploi et peut permettre
de faire de nombreux cycles identiques de puri~ication. Plusieurs
~izaines de cycles successifs ont ainsi été réalis~s sur la m8me
colonne et conservant toutes les propriétés de celle-ci.
.~
1,5 litre d'une solution de gamma-globulines ou de
séru~s ou de plasma~ ajustés aux concentrations suivantes:
Glycocolle 15 g/l
NaCl
pH 7,2
et titrant environ 5 U.I/ml en anticorps antit~taniques sontintro-
duits dans la colonne ~ un débit de 40 ml/cm2/h,à la temperature du
laboratoire. Moins de 5~ des anticorps antitétaniques sont décela-
bles en sortie de colonne, par les méthodes immumologiques appropri-
~es,alors que toutes les autres protéines traversent la colonne.
La colonne est ensuite rincée par le tampon gl~cocolle
0,2 M pH 7,2 contenant 60 g/l de NaCl, puis par le m8me tampon
San8 NaCl ~usqu'~ ce quo l'~luat de colonnc n'absorbe plus la
lumière ultraviolette ~ 280 nm de manière signi~icative~ Chaque
tampon est a~pliqué environ 15 nm ~ un débit de 200 ml/cm2/h.
L'~lution des a~ticorps antit~tanique~ fixés sur la
colonne d'anatoxine est alors réalisée par application du tampon
citrate trisodique-acide citri~ue 0905 M pH 2,8 à 20C et ~ un
débit de 40 ml/cm2/h.
L'éluat de colonne est récolté dans un récipient réfrigéré
et neutralisé immédiatement ~ pH 7 par addition continue de soude
- 20 -
q
normale commandée par un pH mètre enregistreur. Dès que le pic
d'élution (lecture par absorption ~ 280 nm) est éluré, la colonne
est rééquilibrée dans le tampon glycocolle de départ~ et un nouveau
cycle peut immédiatement recommencer~ La solution d'anticorps
antitétaniques pur$fiés peut 8tre concentrée par les moyens classi-
ques (ultra~iltration, précipitation par le polyéthylaneglycol ,
l'alcool ou le sulfate d'ammo~ium). L'aotivité moyenne des solu-
tions d'anticorps antitétaniques ainsi puri~iés est de 30 à 100
U.I./mg de protéine. Le rendement en anticorps antitétanique
varie de 20 ~ 100 %.
En suivant rigoureusement le m8me procédé que celui
décrit ~ l'exemple 9 il est possible d'immobiliser différents
antig~nes ou anticorps tels que ceux qui ont été énumérés dans la
description de la présente demande.
Pour certains antigènes dont le point iso~lectrique
est supérieur à pH 6 il est préférable de réaliser l'étape de
fixation sur la colonne en tampon phosphate 0901 M pH 8 au lieu
de pH 6,8. Il peut meme 8tre pré~erable de remplacer les ions
phosphates par des ions chlore en utilisant du chlorure de sodium
~ 0,01 à 0,05 M au m8me pH 8. Egalement une solution consisterait à
employer des échangeurs quaternaires selon l'invention ~ortement
ionis~s à pH 8. C'est le cas notamment des protéines à activité `
anticorps de type b~ta 2, gamma 1 ou gamma 2 provenant des espèces
animales courante~ (chèvre, mouton, lapin, cheval, cobaye, etc...)
ou humaines. `
EXEMPLE 10
A 10 g de Spherosil XOB 015 imprégnés de DEAE Dextran
suivant l'un quelcon~ue des exemples 1-2 ou 3, on a~oute 30 ml
d'une solution de butane-diol-diglycidyl éther ~ 0,1 %, on é~apore
ensuite le solvant pendant 30 minutes ~ 80C, et additionne en~in
une solution de lysine dans l'eau à pH 11,5 (30 ml ~ 1 %). Le
tout est alors porté 15 h à 80C. Le matériau obtenu est monté
- 21 -
. . , ; ; ~ :~
en colonne, puis lavé par du tampon citrate OjO5 M pH 6,8. Ilest ~acile de vérifier par rapport ~ des supports témoins (n'ay-
ant pas eu d'agent couplant) qu'un fort pouroentage de lysine a été
couplé définitivement sur le support imprégné de DEhE Dextran,
; (les réactions colorées avec la ninhydrine sont utiles pour un
tel bilan).
A l'aide de la colonne ainsi formée par le matériau
recouvert de lysine il est possible de réaliser dans d'excellentes
conditions la purification ou l'éIimination du plasminog~ne ou
de la plasmine, protéine du sang ayant une grande affinité pour
ia lysine~
- 22 -
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