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~090701
La présente invention concerne une composition
pharmaceutique pour le traitement des infections aigu~s ou
chroniques dues au virus de l'hépatite B (également appelé virus
HB ou virus B).
Depuis 1 t identification, dans le sérum de la plupart
des sujets atteints d'hépatite virale B, d'un an-tigène apparemment
spécifique du virus B, appelé antigène Australie, on a proposé
l'utilisation de cet antigène purifié, et éventuellement atténué,
pour la préparation d'un vaccin contre l'hépatite à virus B
(voir le brevet français n 70.34574).
~'antigène Australie ne représente pas le virus de
l'hépatite B lui-même. En effet, on a constaté que la plupart
des donneurs de sang porteurs asymptomatiques de l'antigène
Australie n'ont que peu ou pas de virus circulant dans leur
sérum.
On sait que le sérum de nombreux sujets porteurs de
l'antigène Australie contient un autre antigène qui a éte appelé
antigène-e, en abrégé Ag-e, voir ~Ø Magnius et Ake ~spmark, Acta.
path. microbiol. scand., Section B, 80, 335-337 (1972).
On désigne par antigène-e un complexe antigénique
représentant un ensemble de protéines solubles (appelées e1, e2,.,.)
normalement absentes du sérum humain mais retrouvées dans le
sérum de certains porteurs d'antigène Australie, en particulier
ceux qui sont atteints d'hépatite chronique, ou encore chez des
sujets hémodialysés, immunodéprimés ou atteints de mongolisme.
Ces différents déterminants antigéniques sont immunologiquement
distincts de l'antigène Australie.
Dans la présente demande, on désigne par anticorps
anti-e des anticorps réagissant avec les protéines constituant
l'antigène-e. Ces anticorps peuvent être trouvés dans le sérum
de sujets ayant été contaminés par le virus B, en particulier dans
le sérum des porteurs chroni~ues d'antigène Australie ne souffrant
1090~01
p_s de maladies hépatiques.
On a découvert que l'administration d'antigène-e est
capable d'entraîner une réponse immunologique, avec formation
d'anticorps anti-e.
On a maintenant découvert que l'administration des
anticorps anti-e chez des sujets souffrant d'infections aigu~s
ou chroniques dues au virus B permet notamment de faire dispa-
raître les symptômes et les lésions histologiques d'hépatite.
On a égalernent décou~ert que l'addition d'anticorps
anti-e des liquides biologiques contenant des antigènes-e et/ou
des virus B permet de faire disparaître l'infectivité de ces
liquides ou de la réduire très considérablement.
Il n'existe actuellement aucun traitement actif des
hépatites aigu~s ni de thérapeutique susceptible en particulier
d'empêcher leur aggravation subite mortelle ou leur eYolution
chronique vers la cirrhose.
Il en va de même dans les infections chroniques à
virus HB latentes ou non (hépatite chronique, périartérite
noueuse, glomérulonéphrite à virus HB).
Utilisés dans ce second groupe de maladies, les
médicaments anti-inflammatoires (corticostéroides) et immunosupres-
seurs n'exercent une action bénéfique qu'en diminuant la réaction
inflammatoire mais n'ont aucun pouvoir sur l'infection virale
responsable de la maladie dont ils favorisent au contraire la
persistance.
~a découverte de l'efficacité des anticorps anti-e
dans le traitement de l'hépatite à virus B présente un caractère
surprenant car jusqu'à present les tentatives d'injecter chez
l'homme ou chez le chimpanzé du plasma contenant des anticorps
anti-HBs dirigés contre un antigène de surface du virus de
l'hépatite B (antigène appelé Ag HBs) dans l'espoir d'a~eliorer
une hépatite ou une viré~ie chronique ont toujours échoué. La
1090~01
lnsfusion de plasmas sélectionn-;s en fonction de leur haute
teneur en anticorps anti-HBs ne paraît donc pas avoir d'action
thérapeutique dans les conditions où on a pu les utiliser;
voir par exemple Reed et al., Lancet, 2, 1347 (1973), C.G. Trepo,
The American Journal of the Medical Sciences, 270, 248 (1975) et
i'Treatment of Pulminant Hepatitis with Hepatitis B Immune
Globulin: a Cooperative Study", Gastroenterology, 66, A 98-752
(1974).
La présente invention a pour objet une composition
pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle comprend, dans
un milieu physiologiquement acceptable, une fraction
gammaglobulinique conten`ant des anticorps anti-e, ladite fraction
étant obtenue au départ de sérum ou de plasma sanguin ou au départ
d'extraits placentaires contenant des anticorps anti-e.
On sait que les anticorps formés par un organisme en
réponse à l'administration d'un antigène constituent une famille
de protéines qui ont de nombreuses caractéristiques com~unes et
qui sont appelées gammaglobulines.
~ es fractions gammaglobuliniques contenant des
anticorps anti-e peuvent être obtenues selon les procédés
classiques de préparation des gammaglobulines au départ de sérums,
de plasmas ou d'extraits placentaires dans lesquels on a
préalablement détecté la présence d'anticorps anti-e. Ces procédés
classiques sont notamment ceux décrlts par E.J. COHN et al,
J.~.C.S., 66, 459 (1946); J.L. ONC~EY et al, J.A.C.S., 71, 541
(1949); H.L. TAYLOR et al, J.A.C.S., 78, 1356 (1956);
J. HORHJSI et R. SMETANA, Acta Medica Scandinavia, Vol. CLV,
65 (1956), et P. KISTLER et Hs. NITSC~IM~NN Vox Sang., 7, 414
(1962). I.es anticorps anti-e peuvent être trouves soit chez
des sujets ayant spontanément développé ces anticorps, soit
chez des sujets volontaires ayant été immunisés avec une preparation
d'antigène-e purifiée dénuée de tout risque infectieux, et qui
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t formé par réponse immunologiq~le des anticorps anti-e.
On peut détecter la présence des an-ticorps anti-e notamment à
l'aide d'un réactif contenant de l'antigène-e en utilisant la
technique d'immunodiffusion ou d'électroimmunodiffusion ou toute
autre technique sérologique classique (dosage radio-immunologique,
etc.)
Pour provoquer la formation d'anticorps anti-e par
réponse immunologique, ou pour détecter la présence desdits
anticorps, il convient de disposer de préparations partiellement
ou totalement purifiées d'antigène-e qui peuvent être obtenues
par exemple par chromatographie d'affinité sur un immuno-adsorbant
constitué par un support de matériau poreux dont la surface est
tapissée d'un revêtement de particules anticorps anti-e reliées
au support par l'intermédiaire d'un agent de couplage.
~ e support est constitué par exemple par d~ Sépharose,
et l'agent de couplage est par exemple un halogénure de cyanogène.
On peut utiliser notamment un support de Sépharose 4 B, l'agent
de couplage étant de préférence la bromure de cyanogène.
Bien entendu, on peut utiliser d'autres supports
poreux déjà connus comme étant utilisables dans des procédés
d'immunoadsorption, avec des agents de couplage également connus
constitués par des dérivés bi-fonctionnels tels que des
dialdéhydes.
~ es fractions purifiées contenant l'antigène-e
peuvent également être obtenues par un procédé comportant au
moins une des étapes suivantes, éventuellement en combinaison
avec l'étape d'immuno-adsorption:
- étape de filtration sur gel;
- étape d'ultra-filt~ation à l'aide d'une membrane dont
~0 la dimension des pores est telle qu'elle retient les molécules
ayant un poids moléculaire supérieur à 30.000;
- étape d'ultra-centrifugation zonale préparative,
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1090701
~lisée par exemple en gradient c'e sucrose.
On peut notamment utiliser un procédé suivant
lequel on equilibre une colonne contenant l'antigène-e dans le
à l'anticorps anti-c, avec un tampon borate à pH 8,4, on ajoute
dans la colonne une solution contenant l'antigène-e dans le
même tampon; on laisse en contact pendant un temps suffisant pour
favoriser une adsorption maximale, puis on élue l'antigène-e par
un tampon phosphate de pH 10,8 - 10,9 environ.
On recueille ensuite les fractions contenant
l'antigène-e, la présence des protéines antigène-e étant déter-
minée par exemple par mesure de la densité optique à 2~0 nm.
On ramène ensuite les fractions purifiées d'antigène-e
à un pH physiologique par addition d'acide chlorhydrique, puis
l'on concentre si désiré ces fractions par ultra-filtration, et
on confirme la présence d'Ag-e par immunodiffusion.
Comme indiqué ci-dessus, la fraction contenant de
l'antigène-e peut égalernent être préparée par ultra-centrifugation
zonale en gradient de sucrose. Pour cela, le sérum ou la plasma
défibriné de départ est concentré de 2 à 10 fois, de préférence
5 fois, par exemple par précipitation des protéines au polyéthylè-
neglycol, et redissolution dans une solution aqueuse tamponnée.
La solution ainsi obtenue est déposée à la surface de tubes
contenant un gradient linéaire de sucrose de 10 à 27% et soumis
à une centrifugation zonale préparative à 19.000-22.000
tours/minute entre 4 et 8C pendant 18 à 25 heures. 0~ collecte
ensuite des fractions à partir du fond du tube et l'on réunit
les fractions contenant l'antigène-e. Cette ultra-centrifugation
peut être rcpétee pour obtenir une plu5 grande purification et
complétée par filtrations sur gel. On peut ensuite dialyser
les fractions Ag-e réunies, vis-à-vis de tampon phosphate. On
peut ensuite, si désiré, concentrer par ultra-filtration avec
un filtre muni d'une membrane dont la dimension des pores est
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lle qu'elle retient les produit. de poids moleculaire supérieur
à 30.000.
1a solution obtenue peut être administrée à des
humains par voie sous-cutanée ou intramusculaire après avoir été
soumise par précaution à un traitement destiné à éliminer un résidu
d'infectiosité éventuel par les procédés conventionnels de
chauffage, ou de formolisation, ou d'irradiation par rayonne~ents
ultra-violets ou par toute autre irradiation~ On obtient ainsi
une fraction d'antigène-e physiologiquement acceptable.
Dans le but de provoquer une réponse anticorps chez
des volontai.res, la fraction d'antigène-e p~lysiologiquement
acceptable peut être administrée soit seule soit en combinaison
avec un adjuvant tel que l'hydroxyde d'aluminium, le phosphate
d'aluminium ou tout autre adjuvant naturel ou synthétique.
I.e produit de départ, pour la préparation de la
fraction purifiee contenant de l'antigène-e, est une solution
provenant soit de sérum, soit de plasma défibriné, donnant une
réaction de précipitation avec l'anticorps anti-e. ~a mise
en évidence et l'isolement de l'anticorps anti-e sont effectués
dans ce cas comme il sera indiqué ci-après.
~ 'antigène-e, mis en évidence par Magnius et Espmark,
article cité, se rencontre transitoirement dans le sang des
malades atteints d'hépatite B aigu~ et de façon persistante dans
le sal~g de nombreux sujets hémodialysés ou souffrant d'hépatite B
chronique et d'une proportion variable d'autres porteurs
d'Ag-Australie asymptomatiques en particulier dans certaines
ethnies ou dans certaines régions géographiques (Asie).
Pour préparer une fraction purifiée d'antigène-e, on
utilise donc le sérum ou le plasma de ces donneurs, éventuellement
prélevé par plasmaphérèse.
On rappelle que la présence d'antigène-e peut être
mise en évidence par immunodiffusion, comme décrit par Magnius
10'9~01
Espmark dans l'ar-ticle cité ci dessus, ou encore par
contre-electrophorèse.
Pour dctecter la présence d'antigène-e on peut
également prcparer un réactif selon une methode consistant à
administrer à un animal une préparation d'antigène-c purifiée,
telle que décrite ci-dessus, en combinaison avec de l'adjuvant
de Freund complet, ou tout autre adjuvant, en effectllant au
moins une administration et de préférence plusieurs, l'administra-
tion par injection étant alors répétée tous les mois environ, par
exemple pendant trois mois. On administre chaque fois la
combinaison antigène-e purifiée/adjuvant de Freund. On provoque
ainsi chez l'animal la formation d'anticorps anti-e.
On prélève alors le sang de l'animal, partiellement
ou en totalité et on recueille le sérum. On s'assure que ce
sérum ne contient pas d'anticorps anti-protéines humaines
normales.
En immunodiffusion, le réactif constitué par le
sc~um obtenu donnera une ligne de précipitation avec un sérum
d'origine humaine, si celui-ci contient de l'antigène-e.
Si le serum humain testé donne une ligne de précipi-
tation avec ce réactif, le sujet est infecté et probablement
atteint d'une hépatite persistante.
La mise en évidence répétée, selon cette méthode,
de la présence d'antigène-e pendant la phase aigu~ d'une
hépatite, et surtout la persistance de l'antigène-e, suggère un
risque accru d'évolution vers l'hépatite chronique.
On peut ainsi déceler les sujets infectés contagieux
et en outre deccler précocement ct de façon simp]c les risqucs
d'évolution vers l'hepatite chronique.
L'anticorps anti-e dcstiné à mettre en évidence la
présence d'antigène-e peut provenir soit d'un être humain, ~qoit
d'un animal. Pour la purification d'antigène-e destiné à la
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~ paration de vaccin pour l'homm~, on utilise de préference un
support couplé avec un anticorps anti-e d'origine humaine.
~ a mise en évidence de l'anticorps anti-e est
effectuée comme signalée par Magnius et Espmark, article cité,
ou par toute autre méthode serologique.
~ 'anticorps anti-e peut être obtenu par exemple par
centrifugation zonale d'un sérum dans lequel on a préalablement
détecté la présence de cet anticorps, ou~ de préférence, selon
les méthodes classiques de préparation des gammaglobulines; voir
les références rappelées ci-dessus. On peut utiliser les
techniques connues de fractionnement à l'éthanol, au sulfate
d'ammonium et/ou au Rivanol. On peut par exernple précipiter
l'anticorps par addition d'une solution de sulfate d'ammonium à
40% de saturation, redissoudre le précipité et le soumettre à une
dialyse pour eliminer le sulfate d'ammonium.
A titre d'illustration non limitative de ces méthodes
connues on donne dans la partie expérimentale ci-après un exemple
de fractionnement à l'éthanol.
~ a composition pharmaceutique selon l'invention est
généralement une fraction purifiée d'anticorps anti-e, ladite
fraction ayant été débarassée de tous autres constituants
protéiques sanguins normaux (autres que des gammaglobulines) et
de tous contaminants infectieux.
Mais la composition pharmaceutique selon l'invention
peut etre également constituée par la plasma entier ou le sérum
entier dans lequel on a reconnu 'a présence de cet anticorps.
~ es gammaglobulines contenant les anticorps anti-e
utilisables co~mc ingredient3 actifs dans la compo~i-tion
pharmaceutique de l'invention peuvent également avoir subi les
transformations classiques permettant d'administrer les gamma-
globulines par voie intraveineuse. On sait que ces traitements
consistent à suppri~er ou à réduire le pouvoir anti-complémentaire
1090701
s gammaglobulines, pouvoir anti!omplémentaire dû à la présence
d'agregats qui peuvent fixer le complérnent comme le fait le
coinple~e antigène-anticorps. On connait différents procédés
qui permettent d'obtenir des gammaglobulines injectables par
voie intraveineuse. Ces procédés consistent par exemple à sou-
mettre la garnmaglobuline soit à une incubation à pH 4, soit à
une digestion enzymatique par la pepsine, la papaine ou la
plasmine.
~a composition pharmaceutique selon l'invention
peut être administrée notamment au cours des hepaties ou infections
à virus B aigu~s afin de hâter leur guérison et de prévenir
tout risque d'évolution chronique.
La composition pharmaceutique est injectée par voie
intramusculaire, ou par voie intraveineuse.
I,e traitement par les gammaglobulines anti-e pourra
8tre utilisé seul ou en association avec des médications variées
anti-allergiques, anti-inflammatoires ou autres. Une ou plusieurs
injections successives seront effectuées en fonction des
résultats biologiques et sérologiques.
~a composition pharmaceutique de l'invention peut
aussi être administrée au cours des diverses hepatites et de
toutes infections chroniques à virus B. Ces maladies sont
diagnostiquées par les méthodes cliniques, biologiq`~es,histologiques
et sérologiques habituelles, en particulier par la détection de
l'Ag-HBs.
Ces affections seront caractérisées en outre
sérologiquement par l'absence de réponse anticorps anti-e
satisfaisante et mêlne Le plus souvent par une persistance de
l'Ag-e.
~es hépatites chroniques actives en représentent la
forme la plus grave, et doivent impérieusement être traitées par
des anticorps anti-e.
- lOgO701
~ 'administration d'an icorps anti-e sera nécessaire-
ment plus prolongée dans ces formes de maladies chroniques,
le recours à la voie intraveineuse sera parfois nécessaire et du
plasma contenant des anticorps anti-e pourra être utilisé à la
place des gammaglobulines adaptées à la voie intraveineuse. En
cas d'antigène-e circulant en quantité importante, on pourra
procéder à une élimination préalable de cet antigène-e circulant
par une exsanguino-transfusion préalable, ou une plasmaphérèse
continue au cours de laquelle le plasma contenant l'Ag-e sera
remplacé par du plasma iso-groupe dépourvue d'Ag-e et d'antigène
Australie, ou l'Ag-e sera retenu sur un filtre convenable par
exemple un support poreux couplé à des anticorps anti-e.
En fin d'opération, on remplacera une fraction du
plasma du malade par du plasma riche en anticorps anti-e ou
toute autre solution protéiniques humaine (albumine...) ou autre
contenant des gammaglobulines anti-e traitées pour l'administration
intraveineuse. ~'administration de médications anti-allergiques
et anti-inflammatoires (corticostéro'Jdes, antihistaminiques, etc)
évitera toute réaction fâcheuse durant cette opération qui pourra
être répétée en cas d'échec et surtout complétée par un
traitement avec des gammaglobulines anti-e ultérieur.
Cette thérapeutique pourra être associée à des
traitements adjuvants de toute autre nature, chimiothérapie ou
immunothérapie.
~ 'indication du traitement des hépatites chroniques
par les anticorps anti-e, sous ltune quelconque de ses formes:
intraveineux ou intramusculaire, avec ou sans exsanguino-
transfusion, isole ou associé à d'autres traitements sera décid~-e
sur le résultat d'un bilan clinique et immunobiologique complet
du malade.
~ a présence, dans le sérum et le foie du malade, du
virus IIB et de ses particules et antigènes associes (Ag-Australie,
-1 O-
109070~
~ 3C, ~g-e) sera précisée par d~s examens sérologiques, et par
des études des biopsies hépatiques en immunofluorescence ou en
microscopie électronique.
~ 'étude des réponses immunes humorales et cellulaires
dirigées contre ces trois antigènes pourra être appréciée par
la titration serologique des anticorps et par des tests
d'hypersensibilité retardés vis-à-vis de ces mêmes antigènes
(inhibition de la migration des leucocytes et éventuellement
intradermoréaction avec les trois antigènes ~ustralie, ~BC et
e purifiée non infectieux).
~ es résultats de tous ces tests ainsi que de ceux
explorant l'état des réponses immunitaires globales du malade
servent à décider du type de traitement adopté, la posologie
étant déterminée selon les méthodes habituelles de détermination
de la posologie pour les traitements à l'aide de gammaglobulines.
Les gammaglobulines anti-e pourront à doses conve-
nables être utilisées comme traitement préventif des infections
à virus HB spontanés, post-trans~usionnelles ou autres, en étant
soit injectées au sujets exposés soit ajoutées au sang et à
ses dérivés, avant ou après ~ractionnement éventuel pour injection
à l'hornme, afin de neutraliser le virus HB.
Comme cela a été indiqué ci-dessus l'antigène-e est
en réalité un complexe antigénique représentant un ensemble de
protéines. Deux de ces protéines ont été désignées par Ag-e1 et
Ag-e2 par Williams A~IAN et Georges ~E BOUVIER, Symposium
International sur les sous-types de l'antigène ~IBs tenu au
Centre National de transfusion Sanguine à Paris, 14-18 avril
1975, compte-rendu par dans Bibliotheca llematologica, ~, 65-70
(1976).
Il en existe d'autres qui peuvent être par exemple
désignées par e3...etc. On a constaté que chez les porteurs
d'antigène-e, les proportions respectives des divers antigènes-e
lO~Oi
rient. De la meme fa~on, les F oportions relative3 des divers
anticorps anti-e1, anti-e2,...etc sont variables. h~ immunisant
des sujets avec une préparation d'Ag-e riche en l'un des cons-
tituants du complexe antigeniqu~, ou en sélectionnant des plasmas
de sujets déjà porteurs d'anticorps anti-e riche en l'un des
anticorps correspondants, on peut obtenir des fractions
gammaglobuliniques riches en l'un de ces an-ticorps.
L'invention s'étend à de telles fractions gamma-
globuliniques riches par exemple en anticorps anti-e1 ou
10 anti-e2 .
Une autre application des fractions gammaglobuliniques
contenant des anticorps anti-e est l'élimination des virus HB
complets infectieux et des antigènes-e de tous liquides biologiques
les contenant ou susceptibles de les contenir, par agglutination
et/ou neutralisation réalisée par mise en contact avec des anti~
corps anti-e, par exemple en ajoutant les anticorps anti-e
auxdits liquides. Par exemple, on peut ajouter la fraction
gammaglobulinique contenant des anticorps anti-e dans des
flacons de sang ou de plasma ou de tout autre liquide biologique
à perfuser en urgence et dont on n'a pas le temps de vérifier
l'innocuité, c'est-à-dire, dans le cas présent, l'absence de
virus HB. On peut aussi faire passer lesdits liquides biologiques
sur un immunoadsorbant dont la surface est revetue par des
particules anticorps anti-e. Pour cela, on peut par exemple
effectuer une chromatographie d'affinité analogue à celle qui est
mentionnée ci-dessus à propos de l'obtention de préparations
partiellement ou totalement purifiées d'antigène-e, c'est-à-dire
une chromatographie sur un support poreux couple i de~ anticorps
anti-e. La régéneration du support, par élution de l'antigène
~0 adsorbé, permet en outre l'obtention de préparations d'Ag-e dont
l'utilité a été rappelée ci-dessus.
Dans ce cas, la composition pharmaceutique de
-12-
1090701
nvention est constituce par le sang, le plasma ou par tout
autre liquide biologique à perfuser, dans lequel on a ajouté la
fraction gammaglobulinique contenant des anticorps anti-e, ou que
l'on a fait passer sur un immuno-adsorbant tapissé de particules
anticorps anti-e.
Bien entendu, les fractions gaMmaglobuliniques
ajoutées aux liquides biologiques, ont subi un traitement
permettant l'administration par voie intraveineuse.
~ es exemples suivants illustrent l'invention sans
toutefois la limiter.
~MPLE 1 : Purification de l'antigène-e par ultra-centrifugation
~onale
On sélectionne, comme décrit ci-dessus, le plasma de
sujets porteurs de l'antigène-e, par exemple par réaction
d'identité en im~unodiffusion vis-àvis d'antigène-e de preférence.
On ajoute au plasma du chlorure de calciurn et laisse
reposer 24 heures afin d'éliminer la fibrine. On ajoute du
polyéthylène glycol de poids moléculaire compris entre 6.000 et
7.500 (CAR~O~AX 6000) jusqu'à 13% de concentration finale
(poids/volume) dans un tampon phosphate disodique 0,02% à pH 7.
~ près 24 heures à + 4C le précipite est séparé du
surnageant par décantation soigneuse. On se débarasse ensuite de
la plus grande partie du polyéthylèneglycol en ajustant le pH du
précipite à 5 dans un tampon acétate de sodium 0.25 M. On sépare
le précipité, après 24 heures à + 4C, par une centrifugation à
4.000 tours/minute. ~e surnageant qui contient l'Ag-e est
disposé sur une colonne de Sephadex G200 et les fractions sont
co]lectées.
~ es fractions trouvees positives pour l'Ag-c, par
immunodiffusion et/ou électroimmunodiffusion sont réunies et
concentrées par ultrafiltration sur Amicon équipé de filtre
PM ~0.000.
1 -3
105~0701
I.a solution ainsi con entrée est deposee à la sur~ace
de trois tu~es contenant un gradient linéaire de sucrose de lO à
30% (P/P en tampon phosphate de pH 7,4 et soumis à une centri-
fugation zonale préparative à 20.000 tours/minute à 4C pendant
18 heures. Des fractions de ~ ml sont collectées à partir du
fond du tube. Les fractions positives pour l'antigène-c (par
exemple par le test d'immunodiffusion) sont réunies. On peut
répéter la centrifugation de fa~con analogue sur ces fractions
positives pour l'Ag-e afin d'augmenter la purification. On
dialyse ensuite vis-à-vis de tampon phosphate de pH 7,~ pendant
24 heures puis concentrées par ultra-filtration avec un filtre
muni d'une membrane dont la dimension des pores est telle qu'elle
retient les molécules de poids moléculaire supérieur à 30.000.
~ a solution d'antigène-e obtenue peut être utilisée
pour susciter la ~ormation d'AC anti-e après avoir été soumise par
précaution à une atténuation par action de la chaleur, du formol,
de la bêta-propiolactone ou des rayonnements ultra-violets, dosés
et associés de façon à éliminer tout résidu d'infectiosité
éventuel, sans abolir l'antigénicité.
EXEMP~E 2 : Purification de l'antigène-e par chromatographie
d'affinité
a) Préparation d'un immuno-adsorbant Sépharose/anti-e
~ a fraction gammaglobulinique d'un sérum trouvé anti-e
positif est préparée par précipitation avec du sulfate d'ammonium
pH 7 à 40~ de concentration finale. ~e précipité est redissous
en tampon 0.1 M NaHC03 et dialysé vis-à-vis d'une solution 0,5 M
NaCl - 0,1 M Nal~CO~..
Les gammaglobulines anti-e sont couplées à du Sépharose
4 ~ activite; au brolnure de cyanogène (PHARMACIA-l~'INE UPSAL~,
Suède) selon le procédé décrit par CUA~RECAS et AFINSEN dans
ANN REV BIOCHEM 40 : 259, 1971.
7 g de Sépha-rose 4 B activé au CN~r sont mis à gonfler
~090701
. lavés sur un filtre en verre a ec 0,001 M ~iCl pen~ant
30 minutes. Immédiatement après lavage, le gel est loélange
avec 200 mg de gammaglobulines anti-e en solution bicarbonatée
et on agite pendant 2 heures à température ambiante.
~ e gel est ensuite lavé avec 600 ml de la solution
0.1 M Naf~C03 contenant 0,5 M NaCl et traitee avec 50 ml d'une
solution d'éthanolamine 1 M, pH 8, pendant 2 heures à 25~C. ~e
Sépharose ainsi couplé est ultérieurement lavé alternativement
avec un tampon 1 M NaCl - 0,1 M acétate pH 4,0 et un tampon 1 M
NaCl - 0,1 M borate, p~I 8,4.
Le dernier lavage est fait en tampon 0,1 M borate
pH 8,4 contenant 0,5 M de NaCl et 0,0005 M d'EDlA.
b) Isolement de l'antigène-e
Une colonne de 2 x 11 cm de Sépharose couplée à l'anti-e
est utilisée. ~a colonne est équilibrée avec le tampon à tempé-
rature ambiante. On ajoute 25 ml de la solution contenant
l'antigène-e obtenue à l'exemple 1 et diluée au 1/2 avec le tampon
et on laisse une heure à ~7C pour favoriser une adsorption
maximale. La colonne est ensuite placée à 4C et lavée avec le
tampon boraté jusqu'à ce que la densité optique des fractions
devienne nulle. I,'antigène-e est élué de la colonne par un tampon
phosphaté 0,1 M, pH 10,8, ~es fractions contenant l'antigène-e
déterminees par mesure de la densité optique à 280 nm sont
immédiatement ramenees à un pH physiologique par addition d'HCl
2 N.
On réunit toutes ces fractions et on concentre par
ultra-filtration sur filtre Amicon PM 30.
~es essais effectués montrent que le produit obtenu
ne contient pas d'antigène Australie.
Par précaution, la preparation d'Ag-e peut être
soumise à une atténuation par le formol, la bêta-propiolactone ou
les ultra-violets afin d'éliminer une éventuelle infectiosité
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,iduelle sans abolir l'antigcni(~ité.
~ 'absence de pouvoir infectieux et l'efficacité de
cette préparation sont évaluées par des essais sur le chimpanzé.
Ces essais comportent notamment la recherche d'une replication
virale par détermination de l'antigène Australie et de
l'anticorps anti-HBC, l'étude des transaminases et la surveillance
histologique par biopsie du foie.
L'administration de cette préparation per~et de faire
apparaître des anticorps anti-e chez des donneurs volontaires, et
le sang provenant de ces donneurs peut constituer le produit de
départ pour l'obtention de fractions purifiées contenant de
l'anticorps anti-e, comme décrit ci-après dans l'exemple 3.
EXEMP~E 3 : Préparation d'une fraction gamma~lobulinique
comprenant des anticorps anti-e
~ e produit de départ est un plasma défibrine obtenu
par plasmaphérèse provenant de donneurs sélectionnes dont le
sang contient des anticorps anti-e. On ajoute au plasma de
l'éthanol jusqu'à une concentration de 19% à pH 5,85 à une
température de -5C, les volumes étant choisis de façon à obtenir
une concentration finale de protéines égale à j~ environ. On
soumet à une centrifugation et isole un precipité qui contient
toutes les gammaglobulines et une partie des globulines alpha et
bêta.
~e précipité est mis en suspension dans de l'eau à
0C à raison de 10 litres d'eau pour chaque kilo~ramme de préci-
pité. On ajuste le pH à 4,5 par addition d'un mélange tampon de
pH 4 obtenu en mélangeant un volwne de Na2HP04 0,05 M et six
volumes d'acide acetique 0,05 M.
On ajoute ensuite un tampon de pH 4,~ composé d'un
volurne de Na2HP04 0,05 M et de 1,65 volume d'acide acétique
à 0,05 M, afin d'augmenter la force ionique. Il faut ajouter
environ 2,35 litres de tampon à pH 4.
-16-
10C~0701
On ajuste en~uite le lH à 5,1 en ajoutant environ 4,5
litres d'un tampon obtenu en mélangeant un volume de Na2~IP04
0,05 M et 0,83 volume d'acide aGétique 0,05 M, tout en maintenant
la température à - 5C.
On ajuste la ~orce ionique en ajoutant 0,4 litre d'un
tampon de pH 5,1 composé d'un volume de Na~HP04 0,05 ~l et de
1,25 volume d'acide acétique.
La suspension est ensuite diluée dans 9,7 litres
d'eau.
On a alors un volume total de solvant de l9,45 litres
pour cha~ue kilogramme de précipité.
On ajoute de l'éthanol jusqu'à obtention d'une concen-
tration en éthanol de 12~.
On centrifuge et recueille le surnageant. On ajoute
du chlorure de sodium jusqu'à obtention d'une force ionique
comprise entre 0,03 et 0,04. On ajuste ensuite le pH à 7,2 et
ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 25~, à la tempé-
rature de -7C. On ~btient un précipité de gammaglobulines que
l'on recueille par centrifugation. On prépare ensuite le
médicament final par les méthodes usuelles, c'est-à-dire mise
en solution, clarification et lyophilisation, puis préparation
d'une solution aqueuse à 16%. Afin d'obtenir une solution
isotonique procurant une meilleure solubilité et une
meilleure stabilité, on ajoute 0,3 mole par litre de glycine. On
ajoute également 0,1 g par litre de merthiolate comme agent de
conservation.
~ es traitements supplémentaires en vue de l'obtention
dc gamma~lobulines injectables par voie intraveincuse pcuvent
également être réalisés selon les procédés habituels.
F~EMPLE ~ - Préparation d'une fraction gammaglobulinique riche e_
anticorps anti-e1.
En opérant comme dans l'exemple 3, mais au départ de
01
~asmas sélectionnées pour leur rLchesse en anticorps anti-e1,
on obtient une fraction gammaglobulini~ue riche en anticorps
anti-e1 que l'on conserve sous forme lyophilisée.
EXEMPLE 5'- Préparation d'une fraction gamma~lobul nique riche en
anticorps anti-e .
En opérant comme dans l'exemple 3, mais au départ
de plasmas sélectionnées pour leur richesse en anticorps anti-e2,
on obtient une fraction gammaglobulinique riche en anticorps
anti-e2 que l'on conserve sous forme lyophilisée.
