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l~lL01332
On a décrit plusieurs procédés d:Lfférents pour la produc-
tion du facteur antih~mophilique (AHF ou Facteur VIII), en vue
d'une utilisatlon th~rapeutique, par exemple : précipltation
selective, absorption et élution fractionnées, extraction en
milieu faiblement ionique et chromatographie. Les produits
chimiques ~es plus fr~uemment utilis~s pour la précipitation
comprennent l'alcool, l'acide tannique, le sul~ate d'ammonium,
I la glycine et le polyéthylène glycol. Bien que la purification
! du Facteur VIII entraine l'élimination diun certain nombre
d'autres protéines plasmatiques, le fibrinogène esf, parmi ce6
protéines, de loin la plus importante et la plus gênante, en par-
ticulier lorsqu'il est dénaturé par des procéd~s tels que la
précipitation par l'alcool, la congélation et la d~congélation.
Ce fibrinogène dénaturé nuit ~ la filtration de l'AHF, provoque
des pertes appréciables d'AHF pendant les étapes de puri~ication
et diminue la solubilité du produit lyophilisé dans le fluide
de reconstitution. Ainsi tout proc~d~ de purification de l'AHF
necessite l'élimination de quantités appréciables de fibrinog~-
ne Les techniques de précipitation s~lective d~crites ci~dessus
sont destinées a cela mais toutes ont l'inconvénient de dénaturer
encore plus le-fibrinog~ne et llAHF ou d'occasionner des pertes
- non souhaitables d'AHF.
- Les procedés utilisant la simple précipitation par le froid
sans produits chimiques (cryopr~cipitation) sont limit~s aux
productions de faibles quantités de Facteur VIII, habituellement
dans les banques de sang, et aboutissent ~ des niveaux eleves
de fibrinogène dans le sang lors de l'utilisation en thérapeuti-
gue, ce qui est consideré comme indésirable par certains experts
- en la matiere.
Les procédés qui comportent l'extraction du Facteur VIII
a partir de la cryoprécipitation dans des tampons de faible force
ionique, tout en diminuant, dans une certaine mesure, la teneur
en fibrinogène du produit final donnent encore une teneur en pro-
téine indesixablement ~levée, nécessitent un é~uipement spécial
et des procédés de oe~ntrifugation et sont limités en ce qui
concerne la quantite totale d'AHF qui peut 8tre extraite du cryo-
précipité sans nuire ~ la purification. O
D'autres problemes communément associ~s ~ la fabrication
à grande échelle de l'AHF sont notamment la contamination du pro-
4~ duit final par des substances pyrogènes, des isohemagglutinineset des virus qui provoguent 1 'hépatite (antig~ne associ~, de
MK/ S. 2
.
1~3)133Z
, ,--'.
l'hepatite (HAA). Certains précipitants chimi~ues favorisent la
présence de ces contaminants ind~sirables. Le polyéthylène gly-
ccl est maintenant communément utilisé dans la production de
concentr~is de Facteur VIII de grande pureté, mais ces techniques
utilisent des concentrations de polymère si élevees que des
~tapes ultérieures de lavage et de reprécipitation sont nécessai-
res pour eliminer du produit final les quantités en exc~s de po-
lyéthylène glycol. Ces proc~idés conduisent ~lors ~ de nouvelles
pertes indésirables d'AEIF. On cite ~ ce sujet, Wickerhauser M. :
Large-scale fractionation of Factor VIII- Concentrate from cryo-
ethanol pre~ipitate (référence 1) ; Shanbrom, E. ~ Fekete, L. :
Production of stable high-potency human A~F using polyethylene
~lycol and glycine to fractionate a cryoprecipitate of AHF
concentrate , U.S. Patent No.3,631,018 -(reférence 2); Sgouris,
15 J . T. et Wickerhauser, M. : Vse of frozen cryoprecipitate for the
preparation of clinical Factor VIII concen~rate, Trans~usion,13:~9
1973(référ.3);~ewman, Johnson, A.J., Karpatkin, M.H. et Puszkin,
S. : Methods for the production of clinically effective interme-
diate and high-purity Factor VIII concentrates , Brit.J.Haemat,
1971 211,(refer.4); ~ekete, L.F. and Holst, S.L. : Stabilization
of AHF using Heparin, V.S. Patent N~ 3,803,115,(référence 5).
Le procédé d~icrit ici élimine virtuellement les probl~mes
susmentionn~s, ne comporte pas les inco~v~nients associ~s aux
techniques de précipitation chimique décrites précédemment ~it
re~ose sur le simple pr~céd~ de la pr~cipitation s~ilective à froid
du fibrinogène, de ses produits de dénaturation et de degradation,
et de la concentrati~n selective de Facteur VIII par de petites
qua~tités de polyol, par exemple de polyethylèneglycol ou de po-
lyol Pluronic . L'elimination du fibrinog~ne, comme expli~u~
ci-après entra~ne également l'élimination de ses produits de
d~inaturation et de dégradation.
L'~limination s~ilective du fibrinog~ne sans perte associ~e
de ~acteur VIII n'a en gen~ral pas été effectuée précédemment
en tant que m~ithode pratique pour la fabrication ~ grande ~chelle
d'un c~ncentré purifie de AHF. En effet, Wickerhauser souligne
l'importance de la limitation de dur~e et de la temp~irature d'~x-
traction de l'AHP:"Des rendements un peu plus ~lev~is en AH~ sont
obtenus par extraction prolong~e au tampon-Tris ~ 30~C pendant
plus de 60 minutes, mais l'extrait est de plus en plus contaminé
par des agrégats de fibrinogène, ce qui rend le concentr~ final
MK/ S.2
*Marque de Commerce
,3~
,
difficilement filtrable".
Une 'echnique utilisant la pr~cipitation sélective de fibrinogène
a basse temp~rature pour la fabricati~r~ ~ grande échelle avec un ren-
dement ~levé de concentr~ de Fac~eur VIII de yrande pureté fait 1'ob-
~et de 1~ demande de brevet nC258~324 dépos~e aux Canada le 3
Aout 1976~, de E. Shanbrom, intitul~e : "A simple method ~or the
production of high-yield, high-purity Fact~ur VIII, (R~f.7). 11 est
indiq~e que la préparation pourrait atre en~ore raffinee et concen-
trée en utilisant une précipitation au poly~thylène glycol (P~G)
froid.
Jusque récemment tous les procédés utilisant du PEG dans la fa-
brication de concentrés d'AHF n~cessitent une ~tape additionnelle de
lavage et/ou de repr~cipitation avec de la glycine ou de l'alcool
parcP que le polym~re est utilisé ~ concentrations élev~es (10-12%),
(voir les r~férences précitees). On a récemment utilisé l'id~e
de précipitation ~ froid avec du PEG. Vermeer, C., Soute, B.A.~S.,
et Brummelhuis, H.G.J. : Improvement of the preparation of Factor VIII
Concentrates. Proc. of Int. Soc. ~aemos~asis and Thrombosis, Paris,
July, 1975. (Réf.8). Cependant, la concentration de PEG u~ilis~e pour
pr~cipiter le fibrinogène est de 2 ~ ~ seulement, ce ~ui c~nduit ~
obtenir un produit moins pur. De plus, ces auteurs n'ont pas consid~-
ré comme importante ia concentration de protéines, ils ont utilis~
du mandelate pour éviter une préc~pitation irr~versible du fibrin~ge-
ne et, ~ar cons~quent, ont obtenu un produit consid~rable~ent moins
2~ pur et un rendement moindre. De façon similaire, le procédé de Shan-
~rom et Fekete tarticle cit~ ci-dessus) utili~e une concentration de
proteines relativement faible pendant les ét~pes de précipitation au
PEG, c'est-~-dire 1 volume de précipité dans 10 volumes de ~ampon dis-
solvant, e~ cela oDnduit ~ un rendement tra~ faible et à une puret~
limit~e. Ces auteurs de m~me que Johnson et al (r~f.4~ et Johnson
et al "Antihemophilic factor prepared from blood plasma using p~ly-
ethylene glycol. U.S. Patent N~3,652,530, (r~f.6) ont utilis~ 10-12%
de PEG pour la concentxatlon finale de AHF, ce qui a n~cessité
une etape ~uppl~mentaire de dissoluticn et de repr~c~pitatlon par
la glycine ou par l'~thanol a froid pour r~duire la teneur en PEG
du produit final. ~-~
~ ne autre preuve que la concentration de proteines et la précipitation au PEG
à frold sont importantes et conduisent à un produit original réside dans le
fait que les isohemagglutinines "incomplètes" (anticorps) ~ont virtuellement
éliminees, ce qui
LK/ S.2
. .
. . .; ,, , ~ ~, ; :, . ., ,., , : :
l33~:
4 . -
~vite le risque de reactions hémolytiques ~ui pourraient surve- i
nir lorsque des injections massives de concentrés
actuellement disponibles dans le co~erce sont nécessaires.
(Voir:Seeler,R.A.Telischi, M., Langehennig, P.L. et Ashenhurst,
J.B. : Anti-A and Anti-B titers in coagulation concentrates.
Abst.Of Int. Soc~ of Blood Transf., Helsinki,1975,(ref.9).
Une autre caractéristique originale du produit de l'inven-
tion est le haut degré de pureté (c'est-~-dire la faible teneur
en proteine) en particulier en ce qui concerne la quantité de
fibrinogène mesurable. Ce haut degré de purete donne un produit
tres sol~ble, si soluble en fait qu'aucun matériau non dissous
ne subsiste dans le flacon apres reconstitution. Ceci élimine
- le besoin d'utiliser un filtre spécial ou une aiguille filtran-
te pour eliminer la protéine non dissoute avant l'injection au
; 15 patient. On évite ainsi la contamination du concentré de Facteur
VIII par des particules metalliques (Couper~ I.A., McAdam, J.H.
MacRenZie, M.S. et Davidson, J.~ Contamination of Factor VIII
Concentrates with metal particles. Lancet, Dec.~1,1974, p.l515
~ (réf.10).
i-2o Le procédé décrit, ou partie de celui-ci, est egalement uti-
le pour le "re-traitement" de lots pyrogéniques de concentres
de Facteur VIII fabriquespar tout autre procédé, ce qui trans~or-
¦ me le 'acteur ~III pyrogénique couteux non utilisable en un agent
therapeutique utilisable précieux. Le produit re-traite est dé- -
2S barrasse du materiau pyrogénique soit par une seule étape de
precipitation à froid au PEG ~ 5%, soit en deux etapes par
le procede decrit en detail dans la presente demande.
~ Les resultats inattendus et grandement améliores obtenus
et decrits ici s~nt contraires-aux enseignements et suggestions
de l'art antérieur, et ont eté découverts à l'origine plus par
hasard qu'au cours d'une recherche syst~matique.
La presente invention est un procede spécifique pour la
fabrication ~ une grande echelle d'un concentre de Facteur VIII
de tres grande purete. Parmi les traits les plus caracteristi-
ques de l'invention, on cite la précipitation sele~tive de
, quantites en excès de fibrinogène et de produits de dénaturation
¦ et de degradation, l'~limination d'autres proteines ind~sirables
telles ~ue les isoh~magglutinines, et la concentration en une
etape du Facteur VIII par précipitation ~ froid avec un polyol,
1 40 sans perte indésira~le a ~ activit~ AHF. Une autre caractéristique
! remarquable est le rendement étonnamment ~lev~ en Facteur VIII~ ¦
! MK/.S. 2
.. .
332
environ 20-40% de la quantit~ plasmatique théorique utilisee.
! De plus, et en dépit du rendement ~leve en AHF, la teneur en
protéine s'est trouvée réduite de fa~on frappante, en partlcu-
lier la teneur en fibrinogene, par comparaison avec d'autres
! 5 prodults. Ceci est illustr~ par le tableau I ci-dessous. Le
beso~n d'un rendement ~levé de concentré d'AHF lyophilise, de
grande puret~, est universellement reconnu et a retenu l'atten-
tion sur un pla~ internatior.al. On cite : Recent Advances in Hemo-
philia. Ann. N.Y.Acad.Sci. 240,1975, (réference 11); Pool, J.G.: !
Recent chapters in the Factor VIII saga : perils of a protein.
West J. of Med., 122:406, 1975,(reference 12) et l'on admet
généralement que les concentres du commerce donnent habituelle-
ment moins de 20% de l'AHF théoriquement présent dans le plasma,
tandis que les rendements pour les produits hautement purifiés
15 sont encore plus faibles (reférence 11, pp.l56,208; réferences -
5 et 8).
Dans le tableau I ci-apres les donnees, sauf en ce qui concer-
ne les resultats obtenus selon le procéd~ de la présente demande
sont extraites de l'article de Robert Breckenridge :"Recent
20 a~vances in hemophilia" Ann. N.Y. Acad.of Science,240.1975.
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La presente invention a pour objet un 2rocédé de préparation
d'un concentre de Facteur VIII, caractérise par le fait ~u'il comprend
1'étape cons~stant ~ maintenir une solution tam~on conten~t le
Facteur VIII et environ 6% en volume de polyol a une température
s d'environ O ~ 5~C jusqu'~ ce que la précipitation se produlse.
L'invention a notamment pour obj~et un procéd~ caract~risé par
le falt qu'il comprend les étapes consistant à précipiter le ~ribri-
nogene sélectivement a partir d'une solution de plasma ou de cryopré-
cipité de plasma dans un tampon par addition d'environ 4% en volume
de polyol à ladite solution, à concentrer le Facteux VIII dans la
solution en accroissant la concentration de polyol jusqu'~ environ
6% et ~ maintenir la solution contenant le polyol a 6% à une temp~-
rature d'environ O à 5~C ~usqu' a ce que la précipitation se produise
et ensuite ~ redissoudre le Facteur VIII pr~cipit~ dans une 301ution
tampon pour obtenir une solution contenant un Facteur VIII de très
grande pureté qui est sensiblement exempt de proteines ~trangères
contaminan~es.
Dans ses modes d'exécution préférés, le procéde de l'invention
présente les caract8ristiques suiva~tes, prises isolement ou en
combinaison :
- la source de Facteur VIII est un cryop~écipité dissous dans
environ 2 à 4 fois son volume de tampon;
- le rapport volumique du cryoprécipité au tampon est d'en~iron
1 à 3;
- le proced~ comprend les etapes subséquentes consistant ~ re-
dissoudre le Facteur VIII pr~ciplté dans un tampon et ~ maintenir la
solution résultante ~ une température d'env~ron 0,5 ~ 5~C pendant
une période d'environ 12 a 24 heures et ensuite ~ séparer la matiere
particulaire formée ~ partir de ladite solution pour obtenir ainsi
un Facteur VIII pratiquement exempt de fibrinog~ne,de fragments
de fibrinogene et de leurs complexes;
- les tampons sont des tampons citrate;
- les polyols utilisables comprennent les poly~thyl~neglycols en
particulier le polyéthyl~neglycol 4000, et les copolym~res séquenc~s
du type alpha-hydroxy omega-hydroxy, poly (oxyéthylène) poly~oxy-
pro~ylène) poly (oxy~thyl~ne). Parmi ces copolym~res s~quenc~s on
citera not~mnent ceux d~signés par la marque PLURONIC (WYANDOTTE
C~EMICALS ET UGI~E-KU~LMANN), et en particulier le PLuronic F68
qui est un copol~nère présentant les caractéristiques suivantes:
Poids moiéculair~ du groupement poly ~oxypropylane) de base: 1750
B/S.2
*Marque de Ca~nerce
33;~
8 ~ .
en~iron; pourcentage en poids de poly (oxy~thyl~ne): 80% environ;
- la precipitation du Facteur VIII en pr~sence ae 6% de polyol
est effectuee de pr~ference ~ pH 6,8-7,2;
- la pr~ci~itation prealable du fibrinogane en pr~sence de 4~
de polyol est ef~ectuée de pr~f~rence à p~ 6,0~6,5 et ~ ~emperature
d'environ 20-30~C.
Le procéde de 1'invention permet notamment d'~liminer les pyro-
g~nçs d'une solution tampon de Facteur VIII; ce procedé est caracté-
rise par le fait que l'on ajoute en~iron 6~ de polyol 3 ladite solu-
tion et on malntient la solution résultante ~ une température d'en-
viron 0~C ~ 5~C, pour pr~cipiter le Facteur VIII en laisqant en solu-
tion le matériau pyroganique. Ce proc~dé peut 8tre mis en oeu~re
selon les modes d'executlon pref~rés suivants :
- pour ef~ectuer l'addition de polyol aux solutions tamion de
Facteur YIII on ajoute environ 4% de polyol, on s~pare le précipit~
de la solution, on ajoute 2~ de polyoi et maintient la qolution ~
une temparature de 0 ~ 5~C~Çusqu'~ ce que se produise la precipita-
tion.du Facteur VIII;
- de pr~ erence, la solution ~ puri~ier contient environ 1 ~ 3%
2~ de proteine, et notamment 2 ~ 3%; -
- le proc~dé comprend les ~tapes subsequentes consistant ~ re-
dissoudre le Facteur VIII precipite dans un tampon citrate, ~ main-
tenir la solution resultante ~ une temp~rature d'environ 0,5 ~ 5~C
pendant un laps de temps d'environ 12 ~ 2~ heures et ensuite ~ s~pa-
rer la mati~re particulaire formée de ladite solution pour obtenir1Q Facteux VIII pratiquement exempt de ~ibrinog~ne, des fragmentsde fibrinog~ne, et des complexes de ceux-ci;
- l'in~ention a notamment pour objet un procédé de concentration
du Facteur VIII caracteris~ par le fait qu'il comprend le maintien
d'une solution d'environ 1 partie d'une ~raction sanguine contenant
du Facteur VIII obtenue par cryoprécipitation de plasma dans environ
3 parties de tampon citrate contenant environ 6~ de polyol ~ une
temp~rature d'environ 0 ~ 5~C pour provoquer la pr~cipitation du
Facteur VIII de ladite solut~on, et la redissolution dudit Facteur
VIII dans le tampon pour donner une solution de Facteur VIII de tras
grande puret~.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la
limiter.
EXEM~LE
On d~cong~lo du plasma congel~ par exemple 100 ~ 3000 litres
~B/S.2
'
g ~ 2
~, .,
~ temperature d'environ - 5~C ~ environ +2~C et on la recueille
dans un recipient approprie. On peut traiter de plus grands volumes
mais les operatlons devien~ent difficilcs. La fraction insoluble
~ ~roid (cryopr~clpit~) e~t recueillie, de préf~rence en ce~trifu-
geuse ~ circulation continue (Sharpless ou appareil similaire) ~temp~rature inf~rieure ~ 3~C. D'autre.~ procedes de collecte peuvent~tre utilis8s mai - le proced~ comprend les etapes subséquentes consistant ~ re-
on et ~ maintenir la
te ~ séparer la matiere
brinog~ne,de fragments
s comprennent les poly~thyl~neglycols en
omega-hydroxy, poly (oxyéthylène) poly~oxy-
d~signés par la marque PLURONIC (WYANDOTTE
sentant les caractéristiques suivantes:
erce
yl~ne): 80% environ;
- la pr~ci~itation prealable du fibrinogane en pr~sence de 4~
d'environ 20-30~C.
procedé est caracté-
te ~ une température d'en-
oc~dé peut 8tre mis en oeu~re
tions tamion de
et maintient la qolution ~
r~ erence, la solution ~ puri~ier contient environ 1 ~ 3%
prend les ~tapes subsequentes consistant ~ re-
resultante ~ une temp~rature d'environ 0,5 ~ 5~C
re particulaire formée de ladite solution pour obtenir1Q Facteux VIII pratiquement exempt de ~ibrinog~ne, des fragments
ne, et des complexes de ceux-ci;
fait qu'il comprend le maintien
oprécipitation de plasma dans environ
pour provoquer la pr~cipitation du
er une solution de Facteur VIII de tras
er.
g ~ 2
On peut traiter de plus grands volumes
recueillie, de préf~rence en ce~trifu-
s sont moins ef~icaces. Le cryopr~clpite est pes8,
decoupe en petits morceaux ou m~lang~ dans un m~langeur de type
Waring pendant quelques secondes pour produlre une pâte ou ~mulsion.
Ces morceaux de cryoprecipit~ ou cette pâte sont alors dissous dans
2 ~ 4 volumes de tampon constitu~ par du citrate de trisodium 0,02 M
de la glycine 0,1 M et on ajuste le pH ~ 6,9 par l'acide citrigue
temp~rature de 20-30~C. Apr~s dissolution compl~te on pr~cipite
selectivement le ~ibrinog~ne par addition de 4% de poly~thyl~ne
glycol~
, . . . _ . . _ _ _ . . _ . . . _ . .
1l332
4000 ou de Pluronic F-68 ~ pH de 6,0 ~ 6,5 et ~ une température
d'environ 25~C. Le pr8cipite est ~liminé par centrifugation co~tinue
dans un appareil de type Sharpless et le fluide surnageant est
ajusté ~ pH 6,8-7,2. Une quantité supplémentaire de 2% de PEG ou de
Pluronic F-68 est ajoutee et l'on refroidit la suspenslon a 0-5~C
jusgu'à ce produise une pr~cipitation vistble.
On utilise une cuve de r~action ~ double paroi pour toutes les
~tapes de dissolution et de pr~cipitation avec agitation continue,
en prenant soin d'~viter la mousse.
La seconde etape de précipitation est suivie d'une centrifuga-
tion à circulation continue e~ 1-2~C et on éllmine le surnageant.
ensuite
On dissouy le precipite dans un tampon glycine-~itrate ou un
tampon citrate, le volume dependant de la qualit~ du cryoprécipite
et du nombre d'unites d'AHF pr~sentes dans la solution initiale.
Les deux proc~d~s pour calculer ce volume sont les suivants :
1. Dissoudre le précipité ~inal dans un volume de tampon égal
1/100 du volume de plasma d'ori~ine.
2. Dissoudre le pr~cipite final dans un volume de tampon ~gal
e~ 15-25 fois le poids du précipité.
~a solution est alors ajust~e ~ un pH de 6,7-6,9 à llaide d'a-
cide citrigue, clarifiee et ensuite stérilisée par passage du li-
quide e~ travers des filtres e~ membrane micropores (hauteur de fil-
tres 293 mm ou équivalents en cartouche) ayant par exemple des
pores d'un diam~tre de 1,2 - 0,65-0,45 et 0,3 microns. La solu~ion
stérile obtenue, contene~nt 20-40'~ environ du Facteur VIII dans
le plasma de d~part est lvophilisée de mani~re usuelle pour le
stockage.
On peut utiliser des varlantes de technique de fabrication,
en employant en particulier du cryoprécipit~ recongelé ou des va-
riantes de la Fraction I de Cohn, bien que dans de telles eondition
le rendement en Facteur VIII soit moindre et d~pende de sa concen-
tration dans le mat~riau de départ. La dissolution ou l'extraction
initiale d'A~F peut être effectuee dans de l'eau distillée ou dans
des tampons de faible force ionique comme le tampon Tris. Le temps
d~ refroidissement peut également varier~soit augmenté, soit
réalis~ de façon s~uentlelle sans sortir du cadre de l'invention.
De m~me, le t~ps d'extraction peut ~tre ac~ru jus~ul~ 24 heures
dans le processus d~crit. De plus, le processus peut ~tre inter-om-
pu a toute ~tape et repris un autre jour. Toutes ces variantes
peuvent provoquer une certaine dimlnution du rendement ~ot~l d'A~F
'~ MB/ S.2
*Marque de Commerce
332
du plasma de depart.
ExEM~LE N~II
Des lots pyrogèniques de concPn~ré de Facteur VIII de puret~
moyenne realisés par tout autre procédé, tel qu'extraction au tam-
pon de faible force ioni~ue, pr~cipitation à la glycine, pr~cipita-
tion au PEG, etc, peuvent etre repris selon le schéma indiqué dans
1'exemple I. Les flacons lyophilis~s sont reconstitu~s dans un volu-
me d'eau exempt de pyrogène suffisant pour produire une teneur en
protéines1-3 g~,les ~ontenus des flacons sont ensuite réunis dans
une cuve et à nouveau soumis au traitement selon les étapes indi~uées
dans l'Exemple I.
En variante, si les niveaux pyrogéniques sont seulement mod~ré
ment elevés et si le produit est dejà d'une purete elev~e, une seu-
le etape de précipitatlon peut ~tre suffisante. Les flacons sont
reconstitués comme d~crit ci-dessus et l'on ajoute 6~ de PEG ~ un
pH de 6,8-7,2 ~ une température de 0-5~C. La precipitation formée
est ensuite traitée comme avant et le surnageant contenant le maté-
riau pyrogenique solubilis~ est élimin8.
EXEMPLE N~ III
On effectue le proc~d~ decrit dans l'exemple I.
- Cependant, avant d'effectuer les etapes finales de filtration
on place le produit dans une chambre froide ~0~5~ ~ 5~c)et ~n le
laisse reposer pendant 12-24 heure~. Le matériau floculant blanc
qui se forme apres cette période de repos est élimin~ par décanta-
tion, centrifugation ou prefiltration. Le produit final est stéri-
lisé par filtration comme précédemment d~crit et soumis aux m~mes
processus de lyophilisation. Ce produit est m~me plus purifi~ que
les produits pr~cedents et donc plus facilement filtré. Il ne se
produit pas de perte de Eacteur VIII du fait de cette étape s~p-
plémentaire.
Les produits résultants peuvent être stock~s ~ ~5~C pendant une
p~riode prolongée d~n ~ deux ans, et reconsti~u~s dans de l'eau
distillée ou un sé_um physiologique. Du fait de sa tr~s grande
pureté et de son extremement faible teneur en fibrinogene, le
produit lyophilis~ se laisse dissoudre tr~s rapidement (1-2 minutes).
Le temps total de _raitement étant très court compare aux au~xes
procedes de fabxication depuis le moment o~ les sacs de plasma
sont ouverts, le développement de bacteries se ~rouve limite. Le
fait que la dissolution initiale est effectu~e dlns de petites
quantit~s seulement de tc~mpon diminue la quantit~ de gamma-~lobu-
~ MB~ S.2
32
lines pouvant er_rer dans la solutio~ et la pr~cipitation optimale
du fibrinog~ne en excès se produit e~ utilisant une concentration
en polyol de 4~. De plus, le lourd pr~cipit~ floculant de fibrino-
~ene emprisonne probablement le mat~riau pyrogènique pr~sent et
réduit les quantit~s d'a~tigène associ~ de l'hépatite (HAA ou virus
de l'h~patite). En n'utilisant que 6% cle polyol dans l'~tape de pr~- -
cipitation ~ froid, les prot~ines ind~sirables, en particulier les
isohemagglutinines qui peuvent avoir ~-té dissoutes même dans des
volumes moindr~ de tampon, ne pr~cipitent pas avec l'AH~ et sont
éliminées avec le surnageant. On ~btient ~nsi un produit purif ié
200 à 400 fois, par rapport au plasma, et contenant tres peu de
fibrinogene et d'isohémagglutinines, Les concentr~s de Facteur
VIII fabxiqués avec de plus grands volumes de tampon d'extraction,
par exemple 10 volumes (ref~rence 2) ne présentent pas le mame
degré de pureté ou le meme rendement d'AHF(ref~rences 1,2,3,4,8),
probablement à cause du fait que le rapport opt~mal de la prot~ine
au polymère pour la coprecipitation n'a pas et~ obtenu. Si on le
désire ce produit peut ~etre encore purifie et concentr~ par des
procéd~s connus ou de nouveaux procédés. ~n grand avantage de la
presente invention réside dans le fait qu'on peut effectuer la
production ~ grande ~chelle d'AXF tres pure en la moiti~e ou les
deux tiers du temps requis dans d'autres proc~dés.
Les exemples donnes precédemment sont l~s proced~s opt~mum
connus actuellement pour la mise en oeuvre de l'invention. Il est
c~air, cependant, que l'invention peut être mlse en oeuvre par
l'application de techniques de traitement et de mat~riaux c~n~en-
tionnels selon le principe de la présente invention . Par exemple~
bier. qu'il ne soit pas en g~n~ral ~conomique de debuter avec moins
de l~0 litres environ de plasma, ou de cryopr~cipit~ de cette quan-
tite de pl~sma, il n'y a ~videmment pas d'in-onv~nient ~ utiliser
les valeurs sup~rieures ou inf~rieures de volume donn~es dan~ l'e~
xemple et des variantes de cinquante pour cent ou analogu s dans
ces ~aleurs ne serait pas pr~judiciables ~ l'invention. Les pro-
cessus dans l'exemple optimal sont mis en oeuvre en utilisant un
~quipement connu et ~acilement disponible, tel que l'appareil
centr;fugeur Sharpless, le m~langeux Waring, etc~mais chacun peut
- voir que ces ~tapes en elles-m~mes, isol~es du principe inventif,
et les ~quipements englobés, ne sont pas essentiels et un grand
nombre de variantes sont ~ la dlsp~sition de 1ihomme de 1'art sans
sortir du cadre de 1'in~ention selon le personnel et l'~quipement
MB~ S.2 *Marque de Commerce _ -
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13 ~ 32
disponibles, etc... Une fois ~ue l'on a obtenu le li~uide surnageant,contenant le facteur VTII avec un bon rendement, on le traitede
mani~re conventionnelle pour stockage et reconstitution; par exemple,
il est clarifi~ et sterilise, à travers un filtre micropores stan-
dard,lyophilise pour concentrer le Facteur VIII en un petit volumefacilement stockable et reconstitu~ en utilisant des liquides conven-
tionnels, par exemple de l'eau distillee apyrogène ou un sérum
physiologique.
L'invention n'est pas limitee par les details ae procede
donnes ~ titre d'exemples. Le produit obtenu poss~de des caract~ris-
tiques originales, bénefiques pour l.e patient et distinctes de celles
de tous les autres concentres de Facteur VIII actuellement fabriques:
1) Pureté la plus élevee et donc la plus grande "activite
specifique";
2) Solubillté la plus grande, en ce qui concerne sa rapidité
et la solubilite finale, ce qui le rend id~al pour le traitement
d'urgence;
3) La plus faible teneur en proteine, ce qui diminue les reac-
tions secQndaires indesirables.
4) La plus faible teneur en immunoglobulines ce qui diminue
les reactions allergiques;
S)/isohemagglutinines négligeable/ qui ~limine les r~actions
hemolytiques.
6) la plus faible teneur en fibrinogene, ce qui diminue les
complications d'hyperfibrinogenemie.
7) Aucune aiguille filtrante n'est n~cessaire~donc le risque
de presence de particules etrang~res est elimin~;
8) L'elimination des pvrogènes durant le processus conserve
le facteur VIII utilisable.
Ces avantages et d'autres ressortent du proced~ decrit ici,
illustr~ par des exemples non limitatifs et d~fini dans les reven-
dications. En r~sume le proc~de de l'invention pour preparer un
concentre de Facteur VIII est la decouverte qu'en maintenant une
solution tampon contenant du Facteur VIII et environ 6% de polyol
~ une temperature d'environ 0~C ~ environ 5~C la precipitation du
Facteur VIII se produit, procurant ainsi une tr~s grande puret~ au
Facteur VIII qui ~est sensiblement exempt de proteines ~t~ang~res
contaminantes. ~
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