Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
1 ~ ~ 3 ~ L 5; S
La présente invention, réalisée au Centre d'Immunologie
et de Biologie Pierre Fabre, concerne des vaccins acellulaires
perfectionnées.
Il est déj3 connu, par les brevets francais 73 43957, 75 10252 et
76 24124, de préparer des vaccins accellulaires composés de ribosomes ou d'acides
ribonucléiques (ARN) ribosomaux associés à des polysaccharides membranaires
et adjuvés par des glycoprotéines membranaires.
Mais, il est maintenant apparu que, pour certaines
bactéries porteuses de capsules, l'action antigénique et donc
vaccinale de leurs ribosomes ou ARN était fortement potentialisée
par les polysaccharides capsulaires correspondant auxdites ~
bactéries. ; ~;
C'est pourquoi la présente invention concerne un pro- ~ -
cédé pour potentialiser l'action des vaccins acellulaires
contenant à titre de principe vaccinal des ARN or des r?bosomes-
d'au mcoins une souche bactériene à capsules polysaccharidiques,
dans lequel on ajoute à ce vaccin les polysaccharides capsulaires
extraits d'au moins une desdites souches bactériennes à capsules -i
` polysaccharidiques.
Ce procédé est, en particulier, utilisable pour
potentialiser les vaccins a base d'ARN-ou de ribosomes de
pneumocoques tels les Diplococcus, en particulier D. pneumoniae ~ `
:. :
ainsi que de Klebsiella pneumQniae et d'Hemophil~us inFluenzae.
Bien entendu, les compositions des vaccins acellulaires ~ -
sont connues et décrites dans les brevets fran~cais cités ;
précédemment.
En particulier, ces vaccins peuvent contenir, outre
les ARN ou les ribosomes qui constituent la fraction vaccinale
: ;- .
proprement dite, des glycoprotéines membra?aires à titre d'adjvant
et/ou des polysaccharides membranaires. ;
ba quantité de polysaccharides capsulaires ajoutée
peut varier dans de larges limites mais sera, de préf~rence,
- 1 ~
~ 3~
comprise dans un rapport en poids de 2/1 à 1/2 par rapport aux
ARN ou ribosomes des bactéries capsulaires du vaccin.
Il n'est pas indispensable, pour obtenir un vaccin
potentialisé selon l'invention, d'introduire des polysaccharides
capsulaires correspondant à toutes les souches de bactéries cap-
sulaires utilisées dans le vaccin, il suffit qu'il comprenne au
moins les polysaccharides capsulairles extraits d'une des souches
capsulées dont les ARN ou les ribosomes sont utilisés dans le
vaccin. : :
On donne ci-après des exemples de vaccins perfectionnés
selon la présente invention:
I) Vaccin anti-pneumococcique
Ribosomes de Diplococcus pneumoniae 1 2 ;ug
Ribosomes de Diplococcus pneumoniae ll 2 ~g
Ribosomes de Diplococcus pneumoniae lll 2 ~9
Polysaccharides capsulaires de3 ~9
Diplococcus pneumoniae 1l
Polysaccharides capsulaires de3 ~9
Diplococcus pneumoniae lll
Glycoprotéines membranaires de18 ~9
Klebsie-la pneumoniae ~:.
Il) Vaccin anti-pneumococcique ARN `
ARN de Diplococcus pneumoniae 11,5 ~9
ARN de Diplococcus pneumoniae ll1,5 ~9
ARN de Diplococcus pneumoniae lll 1,5 ~g
Polysaccharides capsulaires de3 ~9
Diplococcus pneumoniae ll `
Polysaccharides capsulaires de3 ~9
Diplococcus pneumoniae lll
Glycoprotéines membranaires de20 ~9
Klebsiella pneumoniae
III)Vaccin anti-bronchique
-- i
Ribosomes de Diplococcus pneumoniae I 1 ~g
Ribosomes de Diplococcus pneumoniae ll 2 ~9
Ribosomes de Diplococcus pneumoniae lll 1 ~9
- 2 -
5i5
Ribosomes de Klebsiella pneumoniae 2 ~9
Ribosomes d'Hemophilus influenzae 1 ~9
Ribosomes de Streptococcus pyogenes A12 1 -,ug ;
Polysaccharides capsulaires de2,5~9
Diplococcus pneumoniae 11
Polysaccharides capsulaires de2,5~9
Diplococcus pneumoniae 111
Polysaccharides capsulaires de3 119
Klebsiella pneumoniae
Glycoprotéines de Klebsiella pneumoniae 24 ~g
IV) Vaccin anti-bronc-hique
. ribosomes de Diplococcus pneumoniae 11 2 ~9
. ribosomes de Klebsiella pneumoniae 2 ~ug
. ribosomes d'Hemophilus influenzae 1 ~Ig
. Polysaccharides capsulaires de
Diplococcus pneumoniae 11 2,5,ug
. Polysaccharides capsulaires de
Klebsiella pneumoniae 2,5ug
. Polysaccharides capsulaires -:
d'Hemophilus influenzae 1,5~9
. Glycoprotéines membranaires de
Klebsiella pneumoniae 17 ~9
V) Vaccin anti-bronchique
. ARN de Diplococcus pneumoniae 11 1,5 ;ug
. ARN de Klebsiella pneumoniae1,5 ~9
. ARN d'Hemophilus influenzae1 ,ug
. Polysaccharides capsulaires de ~ ~ :
Diplococcus pneumoniae 11 2 ~9 ;~
. Polysaccharides capsulaires de ... :
Klebsiella pneumoniae 2 ,ug
. Polysaccharides capsulaires
d'Hemophilus influenzae 1,5 ;ug : .
. Glycoprotéines membranaires de :-:
Klebsiella pneumoniae 15 ~9 : ,.
Les différents éléments de ces compositions peuvent être
~0 dosés notamment par des procédés décrits dan les brevets franc,ais
cités précédemment.
Les polysaccharides capsulaires peuvent etre préparés,
~;~ ~ 3 ~
, ~ . . . ... . . . .
~ 3~
notamment, à partir d'une so1ution aqueuse de capsules par pré-
cipitation 3 l'aide de chlorure de cétyl-pyridinium. Le complexe
polysaccharide-chlorure de cétyl-pyridinium est dissocié par un sel
inorganique tel que le chlorure de sodium 2M, dans ces conditions
le polysaccharide passe en solution et le chlorure de cétylpyridin- ;
ium précipite. ~-
On peut alors récupérer les polysaccharides, par exemple
en ajoutant de l'éthanol à la solution de polysacc'narides qui ~ '
precipite. ~ '
Les polysaccharides peuvent ensuite ètre à nouveau lavés
et purifiés. On peut laver les polysaccharides par un mélange
eau/éthanol en présence d'acétate de sodium. ' '
Si on désire purifier les polysaccharides pour éliminer
les protéines qui sont encore présentes, on peut extraire ces -
protéines 3 partier d'une solution aqueuse de polysaccharides par
du phénol, par exemple du phénol à 90~ à chaud.
Les polysaccharides contenus dans la phase aqueuse sont
récupérés par précipitation 3 'l'éthanol.
L'invention concerne également les vaccins obtenus par ~
le procéde décrit précédemment. - '
On donne, ci-aprés, des exemples de préparation des
différents composants des vaccins selon l'invention que ne la ~
limitent aucunement. ~ '
Procédé général de-fermentati'on ~ -
Les souches bactériennes sont entretenues sur tubes de
gélose inclinée et la production des biomasses est réalisée en
trois étapes successives, tout d'abord en flacon de 500 ml statique
à l'étuve puis dans un fermenteur de 20 1 qui est ensemencé au
moyen des 500 ml du flacon et enfin dans un fermenteur industriel
de 600 1 inoculé avec les 20 1 du fermenteur précedent.
Pour chaque germe3 une étude pilote sur fermenteur de
20 1 est réalisée préalablement afin de d~terminer les conditions ;
~''`' .
- 4 - ^
~, ~
optimales de developpement en ce qui concerne la ternpérature, le
pH, l'oxyg~ne, la vitesse d'agitation et les temps de croissance.
Chacun de ces paramètres étant définis, son contrôle et sa régula- , "'
tion automatique sont aussurés au niveau des fermenteurs de 20
et de 600 1.
Les cellules bactériennes sont recueillies en fin de
phase de croissance par centrifugation continue à froid et lavées
par dispersion dans du tampon tris-HCl, MgC12, pH7 et concentrées
par un nouveau passage en centrifugation continue. Dans le cas
de germes fragiles ayant tendance à s'autolyser, la culture est
refroidie rapidement vers 8 à 10C avant le centrifugation.
La biomasse ainsi obtenue est conservée congelée en
attendant d'être utilisée. Sur un prélèvement un contrôle
bactériologique est réalisé afin de vérifier l'identité du germe '`'
et l'absence de contaminants. La teneur en extrait sec est
également déterminée. ~ r
Procédé de préparat~on des polysaccharides capsulaires ''~; ~
Pour obtenir les polysaccharides capsulaires, les ~ '
cellules lavées sont dispersées dans un tampon tris-HCl 0,01 M, ''
pH7, contenant NaCl 0,10 M et MgC12 0,01 M. La température de la
suspension est portée à 40C et les capsules sont séparées par '~
homogénéisation quelques minutes dans un warring blendor à cette ~ '
température. '
Après refroidissement, les cellules décapsulées sont ; ~
séparées par une centrifugation de 30 minutes à 30.000 9 et 4C. '~'
Le culot est conservé pour la préparation des ribosomes
et de l'ARN ribosomal. Le surnageant contenant les capsules est ~'
i~
recueilli.
Les polysaccharides capsulaires sont tout d'abord
précipités à partir du surnageant parune additionl'ente d'une
solution aqueuse d~e chlorure de cétylpyridinium 3 2%, jusqu'en
fin de floculation. Après une heure de repos à 4C, le précipité
'~
de polysaccharide est recueilli par centrifugation et le surnageant
écarté. ;~
Le complexe polysaccharide-chlorure de cétylpyridinium
précipité est dissocié dans du chlorure de sodium 2M, dans ces
conditions le polysaccharide passe en solution alors que le ~ ;
chlorure de cétylpyridinium est éliminé par centrifugation et le
surnageant conservé.
Trois volumes d'alcool éthylique froid sont ajoutés au
surnageant pour précipiter le polysaccharide qui est recueilli
par centriFugation après une heure de repos à 4C. ~ :~
- Le polysaccharide précipité est lavé par dispersion dans
un mélange eau-éthanol (30:70 v/v) contenant CH3C00 Na 0,1 M,
pendant 30 minutes à température ambiante. La solution de
lavage est éliminée par centrifugation et le culot est repris ;~
dans une solution aqueuse 0,1 M de CH3C00 Na.
Afin d'éliminer les protéines pouvant encore contaminer
" :
la préparation à ce stade, il est procédé à une extraction 10
minutes à 65C par un volume de phénol à 90% dans l'acétate
de sodium 1 M. Aprè~s agitation vive, 10 minutes à 65C, le
mélange est refroidi rapidement dans un bain de glace et les deux
phases sont séparées par centrifugation 5 minutes à 10.000 9 et
0C. La phase aqueuse supérieure est prélevée délicatement.
Trois volumes d'alcool éthylique froid sont ajoutés 3 la phase
aqueuse et le polysaccharide est laissé en précipitation 1 heure
à 4C.
Le précipité est recueilli par centrifugation puis
dispersé dans un mélange eau-éthanol (30:70 v/v) contenant
CH3C00 Na 0,1 M pendant 30 minutes 3 température ambiante. ;
Le précipité lavé est recueilli par centrifugation et repris dans
l'eau distillée puis stérilisé par filtration sur membrane 0j22
et lyophilisé.
Procédé de préparation de la fraction ribosomale
- 6 -
~3 ~
La fraction ribosomale est préparée, soit à partir des
cellules décapsulées obtenues précédemment lorsqu'il s'agit des
ribosomes de bactéries capsulées, soit à partir des cellules
obtenues dans le procédé général de fermentation après un éventuel
lavage. Les cellules sont mises en suspension dans un tampon
tris-HCl, MgC12, pH 7 et soumises à un broyage en continu dans
un homogénéiseur équipé d'un réfrigérant à plaques sous une
pression de ~00 kg/cm .
Le suspension de broyat bactérien est alors débarrassée
des débris cellulaires par une centrifugation de 45 minutes à
30.000 9 et 4C; le surnageant clair, contenant les ribosomes, ` ~`-
est conservé.
Les ribosomes bruts sont précipités une première fois du ~--
surnageant précédent par addition de 0,8 volume d'alcool éthyligue -~
à -20C. Après un repos de 30 minutes à 4C, le précipité est ;
recueilli par centrifugation et repris dans une solution 3 0,5%
de sodium dodécyl sulfate dans le tampon tris HCl, MgC12, pH 7,2,
à température ambiante avec une agitation rapide pendant une heure.
La suspension obtenue, contenant les ribosomes, est
précipitée par 0,7 volume d'alcool éthylique 3 -20C. Après
un repos de 30 minutes à température ambiante, les ribosomes sont `
recueillis par centrifugation à 15C et le culot est repris dans -
le tampon tris-HCl, MgC12, pH 7 à 4C par agitation lente, une nuit .
à 4C.
La suspension obtenue est clarifiée par une centrifugation ;
à 30.000 9 à 0C pendant 45 minutes et le surnageant contenant
les ribosomes puriFiés est conservé. ;
A ce stade, la solution peut être conservée congelée ~
en vue de la préparation de l'ARN ribosomal ou bien stérilisée ~`par filtration, puis lyophilisée. ~
Procédé d'extraction de l'ARN ribosomal ~ ~;
On extrait l'ARN ribosomal à partir de la fraction
~ 7 ~
ribosomale précédente non lyophilisée.
On mélange un volume de suspension de ribosomes et un
volume de phénol 3 80% préalablement équilibré avec du tampon
tris-HCl 0,01 M, pH 7, contenant EDTA O,OOl M (sel disodique)
; et O,5% de dodécylsulfate de sodium, puis la température du m~lange
; est port~e rapidement à 65C, et maintenue pendant 10 minutes
sous agitation. Le mélange est ensuite refroidi rapidement dans
un bain de glace.
Les deux phases sont séparées par centrifugation sous
10 10.000 9 pendant 5 minutes à 4C et la phase aqueuse supérieure
, est recueillie avec précaution.
La phase aqueuse obtenue est ensuite réextraite deux
fois dans les mêmes conditions par 1/2 volume de phénol à 80%. ~ ;
La phase aqueuse finale est recueillie et débarrassée
du phénol résiduel par trois extractions successives avec chaque
fois un volume d'éther, dans une ampoule à décanter. Un barbotage
d'azote permet ensuite d'éliminer l'éther restant dans la phase
aqueuse.
Onajoute alors à la phase aqueuse du chlorure de sodium ~ ;
20 pour obtenir une molarité de 0,1 M, l'ARN est précipité de cette h
phase aqueuse par addition de deux volumes d'alcool à -20C. ;
Le précipité est recueilli par centrifugation sous,l o.obo g pendant
10 minutes à 0C. Le culot d'ARN est remis en suspension dans -
du tampon tris-~Cl 0,025 M, pH 8,1, contenant NaCl 0,025 M pour
avoir environ 2 mg d'ARN par ml de solution.
Procédé de purification de l'ARN ribosomal
A la solution d'ARN obtenue précédemment on ajoute un ;
volume d'une solution 2,5 M de phosphate dipotassique et un volume
de 2-méthoxyéthanol. Après une agitation énergique de 2 3 3 ;
30 minutes, le précipité est éliminé par centrifugation à 10.000 9
pendant 5 minutes à 4C. Le surnageant clair contenant l'ARN
est recueilli et mélangé avec un volume d'acétate de sodium 0,2 M.
- 8 -
3~
L'ARN est alors précipité par addition lente de 0,5 volume d'une
solution aqueuse à 1~ de bromure de cétyl-triméthylammonium.
Après un repos de 5 minutes 3 4C le précipité d'AR N
est recueilli par centrifugation sous 10.000 9 pendant 5 minutes
3 4C. Le tube de centrifugation est parfaitement essuyé et le
précipité lavé deux fois par un exc~s d'alcool à 70~ contenant
CH3C00 Na 0,1 M.
. Le précipité d'ARN est alors remis en solution dans
du tampon tris-HCl, pH 7, et dialysé une nuit à 2C contre 20
volumes de ce tampon puis lyophilisé après stérilisation par
filtration.
Procédé de préparation des glycoprotéines membranaires
Les glycoprotéines membranaires sont préparées à partir
des broyats bactériens obtenus, par exemple, par mise en suspen-
sion des cellules bactériennes obtenues après fermentation dans `:
un tampon tris-HCl, MgC12, pH 7, et broyage en continu dans un ;: ;
homo~énéiseur équipé d'un réfrigérant à plaques sous une pression ~ ~:
de 600 kg/cm2. Le broyat est centrifugé dans le tampon précédent
:;,,,:
. à 7.500 g pendant 15 minutes pour éliminer un culot de sédimenta-
tion qui contient. les débris cellulaires, puis le surnageant est
centrifugé à 30.000 9 pendant 15 minutes pour sédimenter les ` :-:
membranes. La fraction membranaire obtenue, après éventuelle-
ment trois cycles de lavage par centrifugation dans des tampons de `~
force ionique décroissante, est suspendue dans l'eau distillée et
lyophilisee. .
Le lyophilisat est ensuite soumis à deux extractions . :
successives de deux heures à température ambiante: la première
par un melange chloroforme-méthanol (2:1), le deuxième par un . -~
mélange éthanol-éther (3:1~.
Le résidu dégraissé est séché et utilisé pour préparer
les glycoprotéines membranaires.
Après remise en suspension du résidu dans une solution
~ ~ ,
e3~
aqueuse à 2~ de sodium dodécyl sulfate et clarification par
centrifugation 15 minutes 3 10.000 tr/min., les glycoprotéines
sont précipitées du surnageant par addition de 3 volumes d'éthanol ,
et quelques ml d'une solution concentrée d'acétate de sodium.
Après un repos d'une heure 3 température ambiante, le r
précipité est recueilli par centrifugation et repris dans l'eau
distillée.
La reprise est clarifiée par centrifugation 15 minutes
à 10.000 tr/min. et le surnageant contenant les glycoprotéines
est lyophilisé.
Ces procédés sont utilisés pour préparer les composants
utilisés dans les expériences ci-dessous.
Expérience 1
Dans cette expérience on teste l'activité de l'association
ribosomes + Polysaccharides capsulaires de Diplococcus pneumoniae.
On utilise 4 groupes de 10 souris.
Chaque souris du groupe A est traitée par 7 ~9 de
ribosomes de D. pneumoniae.
Chaque souris du groupe B est traitée par 10 ~9 de
polysaccharides capsulaires de D. pneumoniae. `:
Chaque souris de groupe C est traitée par une association
, ~ .
de 7 ~g de ribosomes et 10 ~g de polysaccharides capsulaires de
D. pneumoniae.
,:
Le groupe D est non traité.
- Chaque dose indiquée est injectée en 5 fois par voie
sous-cutane~e au rythme d'une injection tous les trois jours
pendant 15 jours. ~- -
10 jours après la dernière injection, les animaux sont
ponctionnés par les sinus rétro-orbitaires et le sérum est
étudié:
1) en immunodiffusion (technique d'Ouchterlony)
2) en immunoélectrodiffusion (technique de Laurell)
- 1 0 - , ,:
~3~5
'~
en gel d'agarose à 1~ en tampon de véronal, pH 8,6 contre de
l'antigène de D. pneurnoniae total.
En immunodiffusion
Contre un antigène total 3iplococcus pneumoniae le s~rum :
des souris traitées du groupe C fait appara~tre des arcs de
précipitation identiques en nombre à un sérum de souris vaccinée
avec d.e l'antigène Diplococcus pneumoniae total.
En immunoélectrodiffusion .
Contre un antig~ne total Diplococcus pneumoniae, le
sérum des souris du groupe C forme un immunoprécipité spécifique
en forme de "rocket" dont la hauteur est très supérieure à celle ~:~
de "rocket" obtenue avec du sérum des souris du groupe A ou du
groupe B.
La hauteur des "rocket'' peut varier dans des proportions .~
qui vont du double au quintuple en taux d'anticorps spécifiques, ~ .:
suivant les souris, par rapport aux résultats obtenus dans le ~ :~
groupe A. ;
Expérience 2 :.
.~ :
On effectue les memes expériences que précédemment en
~O remplaçant les 7 ~9 de ribosomes de D. pneumoniae par 5 ~9
d'ARN de _. pneumoniae.
En immunodiffusion
Contre un antigène total Diplococcus pneumoniae, le .
sérum des souris traitées avec l'association (groupe C) fait
appara~tre desarcs de précipitation identiques en nombre à un
sérum de souris vaccinée avec de l'antigène Diplococcus
,:
pneumoniae total. ~ :.
~'
En immunoélectrodiffusion
Contre un antigène total Diplococcus pneumoniae, le : .
sérum des souris du groupe C forme un immuno précipité spécifique
en forme de "rocket" dont la hauteur est très supérieure à la
hauteur de "rocket'l formée par du sérum anti-ARN de Diplococcus ~.:
3~
pneumoniae (groupe A) ou par du s~rum anti-polysaccharides
capsulaires de Diplococcus pneumoniae (groupe B) contre un
antigène Diplococcus pneumoniae également.
Cette hauteur de "rocket" pour le groupe C peut varier
dans des porportions qui vont du double au quintuple en taux
d'anticorps spécifiques suivant les souris par rapport aux
résultats obtenus pour le groupe A.
Expérience 3
Cette expérience a pour but l'étudier un vaccin plus
complete que dans l'expérience 1.
On utilise pour ce faire 10 souris formant le groupe E
et on injecte à ces animaux une association de: -
3,5 ~9 de ribosomes de D. pneumoniae,
5,- ~9 de polysaccharides capsulaires de D. pneumoniae,
12,- ~19 de glycoprotéines membranaires de Klebsiella
pneumoniae, :
au même rythme que dans l'expérience 1. . :
. Le sérum des animaux ponctionnés comme précédemment `:.
donne en immunoélectrodiffusion:
- un immuno précipité spécifique en forme de "rocket"dont
la hauteur est deux fois supérieure aux résultats obtenus sur le
groupe C de l'expérience 1. ~ ~:
Expérience 4
On opère comme dans l'expérience 2 pour étudier un `
vaccin plus complet que celui de l'expérience 2. .
On utilise pour ce faire 10 souris formant le groupe F
et on injecte 3 ces animaux une association de:
2,5 ~9 d'ARN de D. pneumoniae
5,- ~9 de polysaccharides capsulaires de D. pneumoniae
10,- ~g de glycoprotéines membranaires de Klebsiella
pneumoniae,
au même rythme que dans l'expérience 2.
- 12 -
~3~5~i
.
Le sérum de ces animaux ponctionnés comme précédemment
donne en immunoélectrodiffusion:
- un immuno précipité spécifique en forme de "rocket"
dont la hauteur est deux fois supérieure aux résultats obtenus
pour le groupe C de l'expérience 2. ;
On constate donc que les vaccins selon la présente `~
invention présente une activité vaccinante très supérieure aux
vaccins de la technique antérieure.
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