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Ceci est une division de la demande de brevet
canadien no. 456.495 déposée le 13 juin 1984.
La présente invention a pour objet, à titre de
produits industriels nouveaux, des antigènes constitués par
la conjugaison d'un produit de formule générale (III) sous
forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme
d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti:
1~
H3C-I ~ ~OR
3 ~ "'~C- C CH
N ~ (III)
CH2
HO-CO
dans laquelle la ligne ondulée sur l'azote oximinique
signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou
anti et dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un
~5 groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un
groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12
atomes de carbone, avec de l'albumine sérique bovine (BSA)
ou avec de l'albumine sérique humaine (HSA), et répondant
aux formules (V) et (VI):
-- 1 --
H3C-N ~ R
~ C - C-CH3
~ tv)
S O
cH2
O __ _ _ _.
I n
BSA
dans laquelle R a les significations précédentes, n = 20 à
30 et la partie oxime de stéroide est sous forme d'isomère
syn, d'isomère anti ou sous forme de mélange d'isomères syn
et anti,et:
CH~ C--CH3
~ (VI)
~ H2
: CO~
HSA
~ :
2 -
~: ~
.,.. ~ -
,
23~6~
dans laquelle R a les significations précédentes, n = 20 à
30 et la partie oxime de stérolde est sous forme d'isomere
syn, sous forme d'isomère anti ou sous forme de mélange
d'isomères syn et anti.
Parmi les valeurs de R, on peut citer:
a) les radicaux méthyle, éthyle, propyle,
isopropyle, butyle, sec-butyle, tert-butyle, pentyle, iso-
pentyle, sec-pentyle, tert-pentyle, néo-pentyle, hexyle,
iso-hexyle, sec-hexyle, tert-hexyle;
b) les radicaux formyle, acétyle, propionyle,
butyryle, isobutyryle, valéryle, hexanoyle, benzoyle,
caprylyle, méthoxy-carbonyle, éthoxy carbonyle.
De préférence R est l'hydrogène.
Ces antigènes sont nécessaire pour permettre la
réalisation de dosages radioimmunologique de la 17~-hydroxy
~ (4-diméthylaminophényl) 17G~-(prop-1-ynyl) estra-4,9-
dièn-3-one (Produit B) et de ses métabolites dans les
fluides biologique, chez l'homme ou l'animal. Ces dosages
sont effectués à l'aide des dérivés estradiéniques marqués à
l'iode, faisant l'objet de la demande principale, sous forme
de melange d'isomères syn et anti ou sous forme d'isomères
syn ou sous forme d'isomères anti, de formule générale (I):
H3C-N ~ /~R
~ ~ C - c-cH3 (I)
O
~2
=O
NH R
:
~ 3 ~
::
5~6~
dans laquelle la ligne ondulée sur l'a~ote oximinique
signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou
anti, formule dans laquelle R représen-te un atome
d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de
carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant
de 1 à 12 atomes de carbone et Rl représente le reste d'un
acide aminé Rl NH2 ou le reste d'un dérivé de ce dernier, ce
xeste étant accepteur d'iode et étant marqué à l'iode 125 ou
131.
Un produit de formule (III) sous forme de mélange
d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous
forme d'isomère anti:
CH3 ~ R
C--C-CH3
(III)
o
CH2
H-O-CO
dans laquelle R a les significations précédentes et la ligne
ondulée sur l'azote indique que ce produit est sous forme de
mélange d'isomères syn et anti, peut être obtenu en faisant réagir
un produit de formule générale (II):
H3C-N_~
a~ ( II)
.
: , ' .
,~ ~
,: ~
1~3S06~
dans laquelle R a les significations précitéeS avec un
halogénure de carboxyméthoxylamine en présence d'une base.
Le produit obtenu est isolé sous forme de mélange
d'isomères syn et anti, ou le produit obtenu est séparé, si
désiré, en ses isomères, puis, le cas échéant, la fonction
hydroxyle en 17 est éthérifié ou estérifié.
Dans une mise en oeuvre préférentielle du procédé
l'halogénure de carboxyméthoxylamine est l'hémihydrochlorure
de carboxyméthoxylamine et on opère sous atmosphère inerte
et en présence de soude.
Dans une mise en oeuvre très préférentielle du
procédé, l'halogénoformiate d'alcoyle est le chloroformiate
d'isobutyle et on opère en présence de tri-n-butylamine.
L'éthérification ou l'estérification de la
fonction hydroxyle en 17 du produit de formule générale (III),
dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, peut etre
effectuée selon des méthodes habituelles.
L'éthérification peut être effectuée par exemple
au moyen d'un agent d'éthérification tel qu'un halogénure
d'alcoyle ou d'aryle, ou un sulfate de dialcoyle.
L'estérification peut être effectuée par exemple
au moyen d'un agent d'estérification tel qu'un dérivé
fonctionnel d'acide, comme un chlorure d'acide ou un
anhydride.
Pour obtenir les isomères syn et anti des produits
de formule générale (III) séparés, on peut procéder par
exemple de la manière décrite ci-après:
- on soumet un produit de formule générale (III),
sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, où R
a les significations précitées, à l'action d'un agent
d'estérification pour estérifier la fonction carboxyle,
sépare l'isomère~syn de l'isomère anti de l'ester résultant
puis saponifie séparément ladite fonction ester de chacun
des isomères syn et antij obtient l'isomère syn et l'isomère
-- 5
... ,. - ~ - ::
'
..
' -'
~506~
anti des produits de formule générale (III), dans laquelle R
garde les significations précitées.
Dans des conditions préférentielles de mise en
oeuvre, l'application des produits de formule générale
(III), est caractérisée par les points suivants:
- on fait réagir un produit de formule générale
~III) sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous
forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti:
CH3 ~ R
C - C-CH3
~ (III)
0
CH2
H-0-~0
dans laquelle la ligne ondulée et R ont les significations
précitées, en vue de l'activation de la fonction carbonyle,
avec un halogénoformiate d'alcoyle, en présence d'une base
tertiaire, en milieu anhydre et sous atmosphère interte,
obtient l'anhydride mixte correspondant, de formule (IV):
~5
H3C- = - C-CH3
(IV)
o
CH~
CO
' /~
R2
.
. - ' ' .
~3Sa)69L
dans laquelle R garde la signification précitée et R2
représente un radical de formule -CO-O-alc, alc étant un
radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de carbone, que l'on
conjugue avec l'albumine sérique hovine (BSA) ou humaine
(HSA) et obtient l'antigène cherché.
Dans un mode d'exécution préférée, l'application
des produits de formule générale (III) est encore
caractérisée par les poiPts suivants:
- l'halogénoformiate d'alcoyle est le
chloroformiate d'isobutyle et on opère en présence de tri-n-
butylamine et sous atmosphère inerte,
- on fait réagir l'anhydride mixte de formule
générale (IV) avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou
humaine (HSA) en ayant préalablement dissout cette dernière
dans un mélange eau-dioxane sous atmosphère inerte.
L'application selon l'invention permet d'obtenir
au départ du 3-carboxyméthyloxime de 17~-OR-11~ -(4-
dimethylaminophényl) 17~-(prop-1-ynyl) estra-4,9-dièn-3-one,
sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, sous
~0 forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti, les
antigènes de formules générales (V) et (VI) dans lesquelles
R a les significations précitées:
J~ ( v,
,
cH2
o
~
sSA
:
;.,,
:
,
:,,
,
'
.
~\
~506~
dans laquelle n = 20 à 30 et la partie oxime de stéroide est
sous ~orme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme
d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti, et:
I
CH3 ~ -- C-CH3
(VI)
~H2
n
1 5 HSA
dans laquelle n = 20 à 30 et la partie oxime de stéro;de est
sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme
d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti.
L'invention a également pour objet l'application
des antigènes ci-dessus à la préparation des anticorps.
Pour étudier et doser par des méthodes
radioimmunologiques la 17~-hydroxy-11~-(4-diméthyl-
aminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9 -dièn-3-one non
radioactive (produit B), on prépare comme déjà dit à partir
de ce dernier,~ des antigènes avec l'albumine sérique bovine
(BSA) ou avec l'albumine sérique humaine (HSA).
Les antigènes résultant de formules (V) et (VI),
objets de l'invention peuvent servir au développement
d'anticorps lorsqu'ils sont injectés chez l'animal en
présence d'un adjuvant. Ils permettent ainsi d'obtenir des
serums contenant des anticorpsF
~ Ces anticorps servent ensuite de récepteurs de
produits radioactifs et/ou de produits non-radioactifs, à
`
- 8 -
: :; :
:~
::
: ,
:
: ~ :
-~Z;~5(~6~
savoir de récepteurs de produits de Eormule générale (I) et
notamment du 3-carboxymé-thyloxirne de 17~-hydroxy- 1 ~ -(4-
diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dien-3-one
sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, sous
forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti, couplé a
1'(~5I) histamine (produi-t A), ainsi que de la 17~-hydroxy 1
-(4-diméthylaminophényl) 17O~-(prop-l-ynyl) estra 4,9-dièn-3-
one non radioactive (produit B) et de ses métabolites.
La présence de ces anticorps est mise en évidence
au moyen d'un produit de formule générale (I) et no-tamment
au moyen du 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11~-(4-
diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one
sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, sous
forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti, couplé à
1'( 5I) histamine radioactif ~produit A).
Le dosage du produit B ou de ses métabolites selon
des methodes radioimmunologiques conventionnelles, telles
que celle décrites par:
- S.A. BERGSON et R.S. YALOW, HORMONE 4, p. 557
(1964) et
- G.E. ABRAHAM J. of CHEM. ENDOCRINAL METAB., 29,
p. 866 (1969~
Les exemples suivants illustrent l'invention sans
toutefois la limiter.
EXEMPLE_l:
Antigène à partir de 3-carboxyméthyloxime de 17~-
hydroxy-ll-~(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-
4,9-diène-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti
et d'albumine sérique bovine (BSA).
STADE A:
Anhydride mixte de 3-carboxyméthyloxime de 17~ -
hydroxy~ -(4-diméthylamlnophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-
_ g
~s~
4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti
avec le formiate d'isobutyle.
On dissout sous agitation et sous atmosphère
inerte 63 mg de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11/~-(4-
diméthylaminophényl)-l7~-(prop-l-ynyl)-estra-4~9-diène-3-one
dans 1,2 ml de dioxane, ajoute 57,5 ,ul de tri-n-butylamine,
puis abaisse la température vers 13 C, ajoute 16 ~l de
chloroformiate d'isobutyle, maintient ce mélange réactionnel
sous agitation à la température de 13 C environ pendant une
demi-heure. On obtient une solution du produit cherché, que
l'on utilise telle quelle pour le stade suivant de la
synthèse.
STADE B:
Dissolution de l~albumine sérique bovine.
On introduit à 4 C sous agitation e~ sous
atmosphère inerte 175 mg d'albumine sérique bovine dans 0,5
ml d'eau, maintient sous agitation pendant 20 mn environ,
rajoute successivement après la dissolution 3 ml de dioxane
et 170 ,ul de NaOH N.
STADE C:
Conjugaison.
On verse lentement dans la solution d'albumine
serique bovine obtenue au stade B, la solution d'anhydride
mixte obtenue au stade A, amène le pH à 8,9 à l'aide d'acide
chlorhydrique N et agite le mélange réactionnel pendant 5
heures à 10 C environ. On sépare ensuite la phase
organique du précipité formé, la dilue par 30 ml d'eau
distillée, amène le pH à 4,1 par l'addition d'acide
chlorhydrique N, sépare le précipité formé, le reprend par
25 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 1~.
La solution résultante est laissée au repos, puis soumise à
l'ultrafiltration. On épuise ensu~te la solution des
- 10 -
.
.
3S~
molécules de poids moléculaire <10-15000 par 510 ml d'eau
distillée puis ajuste le volume final à 17 ml. On
lyophilise cette solution pendant 30 heures environ et
obtient 169 mg d'antigène cherché.
Analyse
Spectre UV
- dans eau: max 265 nm E'1= 53
max 290 nm E'1= 62
- dans HCl N/10: max 290 nm E'l= 61
Dichroisme circulaire
- dans eau: max 222 nm ~E'1= -0,305
max 260 nm ~ E'1= -0,070
max 289 nm ~ E'1= -0,050
- dans HC1 /10: max 222 nm ~E'1= -0,250
max 290 nm ~ E'1:~0,027
Ce produit contient 20 à 22 groupes de stéroide
liés par mole de protéine.
Préparation de 3-carboxyméthyloxime de 17~-
hydroxy-11~-(4-diméthylaminophényl)-17~(prop-1-ynyl)-estra
-4,9-diène-3-one.
A une solution de 1 g de 17~-hydroxy-11~-(4-
diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn -3 -
one dans 35 ml d'éthanol, on ajoute 665 mg d'hemihydrochlo-
rure de carboxyméthoxylamine, soumet le mélange réactionnel
à l'agitation pendant une heure environ à température
ambiante, additionne de 1,6 ml de soude N, puis concentre
sous vide, reprend le résidu par le chloroforme, essore,
évapore le filtrat à sec, le chromatographie sur silice
(eluants chloroforme/methanol 7:3), isole le produit cherché
que l'on empâte par l'ether isopropylique, essore et sèche
sous vide~ pour obtenir 1,13 g dudit produit cherché sous
forme de ;mélange~d'isomères syn et anti. La chromatographie
sur couche mince de si~lice, en éluant au mélange
chloroforme/méthanol ( a ~2) donne Rf=0,45.
~3SV~i9L
EXEMPLE 2:
Antigène à partir de 3-carboxyméthyloxime de 1 ~-
hydroxy-ll ~(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-l~ynyl)-estra-
4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti
et d'albumine sérique humaine (HSA).
En procédant comme décrit dans le stade C de
l`exemple 1, mais en partant de la solution d'anhydride
mixte du stade A et d'une solution d'albumine sérique
humaine preparée selon la méthode décrite au stade B, on
obtient 180 mg d'antigène cherché.
Ce produit contient 34 à 36 groupes de stéroîde
lies par mole de protéine.
Analyse
Spectre UV
15- dans eau: max 2~5 nm E'1= 79
max 291 nm E'1= 94
- dans HCl jlO: max 290 nm E'l= 93
Dichro~sme circulaire
- dans eau: infl. 218 nm aE'l= -0,308
max 259 nm ~E'l= -0,115
max 288 nm ~E'l= +0,085
- dans HCl /10: max 223 nm aE' = -0,300
max 283 nm ~E'1= +0,037
~,. .
,~
