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PROCÉD~ DE FABRICATION D'UNE DISPERSION AQUEUSE
DE VÉSICULES LIPIDI UES ET COMPOSITION Ä BASE
DF: LA DISPERSION AINSI OBTENUE
La présente invention porte sur un procédé de
fabrication de dispersions aqueuses de vésicules
lipidiques, ain:~i que sur les compositions à base des
dispersions ainsi obtenues.
Les vésicules lipidiques de ces dispersions ont
une structure lamellaire constituée d'au moins un feuillet
formé d'une bi-couche lipidique définissant un volume
fermé; ils enc:apsulent une phase aqueuse comprenant
avantageusement des substances actives hydrosolubles, par
exemple pharmaceutiques ou cosmétiques, lesquelles sont
ainsi protégées des conditions extérieures. Ces vésicules
peuvent être réalisées à partir de lipides ioniques ou de
lipides non-ioniques: le terme "vésicule" utilisé dans la
présente demande englobe les deux types de structure.
On connaît, par la demande de brevet français
FR-A-2 399 242, un procédé de préparation de liposomes en
suspension aque,.~se, suivant lequel . on disperse une
première phase aqueuse pouvant contenir des actifs dans un
solvant non miscible ou peu miscible à l'eau, en présence
d'un lipide de formule XY, où X est un groupe hydrophile et
Y est un groupe :Lipophile, ce qui permet d'obtenir dans une
phase solvant continue des "précurseurs de liposomes"
consistant en de:~ globules microscopiques de phase aqueuse,
dont l'enveloppe est une pellicule de la substance XY; on
émulsifie ces "précurseurs de vésicules" dans un milieu
aqueux en présence d'un excès du lipide XY ou d'un autre
lipide ZW, où Z est un groupe hydrophile et W est un groupe
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lipophile, le solvant précité étant éliminé avant ou après
ladite émulsification. Cependant, ce procédé requiert
d'utiliser des vibrations soniques ou ultrasoniques pour la
dispersion de la première étape, technique mal adaptée aux
productions à l'E~chelle industrielle.
Par le brevet français FR-B-2 418 023, on connaît
un procédé de fabrication de capsules synthétiques
oligolamellaires lipidiques propres à renfermer un (ou des)
matériaux) bio:Logiquement actifs) suivant lequel: on
prépare un mélange d'une phase organique contenant, dans un
solvant, un composé formateur de parois des capsules et
d'une phase aqueuse contenant le matériau biologiquement
actif destiné à être encapsulé, le rapport de la phase
organique à la phase aqueuse étant d'une valeur propre à
fournir une émul:~ion du type eau-dans-huile (E/H); on forme
une émulsion homogène de ce type; on évapore le solvant
organique de l'émulsion jusqu'à ce qu'on obtienne un
mélange ayant le caractère d'un gel; et on transforme ce
mélange en une suspension de capsules oligolamellaires
synthétiques reni=ermant le matériau biologiquement actif en
le dispersant dans un milieu aqueux. Dans ce procédé, la
concentration de:s lipides dans la phase organique doit
cependant rester relativement faible . on indique une gamme
allant de 0,05 à 5 ~ en poids, ce qui ne permet pas
d'obtenir facilement des compositions à forte concentration
de vésicules. Par ailleurs, 1'émulsification est obtenue de
préférence, par ,ultrasons, ce qui n'est guère applicable à
l'échelle industrielle.
Dans la demande de brevet japonais 87/273386
(publiée sous le n° 1117824), on a décrit un procédé de
préparation de vésicules dans lequel on dissout des lipides
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dans un solvant organique, on ajoute de l'eau, on élimine
le solvant pour former une phase hydratée et on disperse
cette phase hydratée dans une phase aqueuse pour former des
vésicules. Ce procédé nécessite un traitement de la
dispersion obtenue pour réduire la taille des vésicules et
la dispersion des tailles, ce traitement mettant en oeuvre
soit des ultrasons, soit un homogénéisateur. L'inconvénient
des ultrasons a déjà été explicité; celui d'une
homogénéisation, outre le fait qu'elle élêve la température
de dispersion, ce qui peut être gênant pour des actifs
encapsulés thermosensibles, est de libérer des particules
métalliques dans le milieu, ce qui peut être néfaste pour
des actifs encapsulés sensibles à des traces de métaux.
La demande de brevet français FR-A-2 561 101
décrit un procédé de préparation de liposomes consistant à
former une émulsion de type E/H par dispersion d'une
première phase aqueuse dans un solvant organique non
miscible à l'eau en présence de molécules comportant une
fraction lipophile et une fraction hydrophile, puis à
éliminer la majeure partie du solvant organique de cette
émulsion E/H par une méthode douce, pour obtenir une
émulsion E/H concentrée, et à ajouter progressivement à
cette émulsion, sous agitation, une seconde phase aqueuse
contenant des mc>lécules comportant une fraction lipophile
et une fraction hydrophile, en éliminant simultanément le
solvant organique résiduel par évaporation. Dans ce cas
également, la concentration en lipides dans la phase
organique est fa_~ble . on a indiqué, à cet égard, une gamme
allant de 0,5 à 5% en poids. De plus, l'élimination du
solvant organique de la deuxième étape est effectuée
principalement par décantation, ce qui demande beaucoup de
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temps et nuit, de ce fait, à l'application industrielle de
ce procédé.
On connaît enfin, par la demande de brevet
européen EP-A-349 429, un procédé de préparation de
systèmes colloïdaux dispersibles de lipides amphiphiles,
sous forme de liposomes oligolamellaires submicroniques,
dont la paroi est constituée par lesdits lipides et
éventuellement 'une substance A et dont le noyau est
constitué par de l'eau ou une solution aqueuse contenant
éventuellement 'une substance B. Selon ce procédé, on
prépare une phase liquide constituée essentiellement par
une solution des lipides (et éventuellement de la substance
A) dans un solvant pouvant contenir la substance B en
solution; on prépare une seconde phase liquide constituée
essentiellement :par de l' eau ou une solution aqueuse de la
substance B; on ajoute, sous agitation modérée, la première
phase à la seconde phase, de manière à obtenir pratiquement
instantanément, une suspension colloïdale de vésicules . si
on le désire, OI1 élimine tout ou partie du solvant et de
l'eau, de manière à obtenir une suspension colloïdale de
concentration voulue en vésicules. En pratique, les
solvants utilisés sont des solvants miscibles à l'eau. On a
indiqué que la concentration en lipides dans le solvant va
de 0.1 à 10 ~ en poids, ce qui est três limité.
La présente invention vise à proposer un procédé
de préparation de suspensions aqueuses de sphérules
lipidiques bien adapté aux applications industrielles. Cet
objectif est atteint, conformément à l'invention, par
l'utilisation d'un solvant non miscible à l'eau pour
dissoudre les lipides devant constituer les feuillets des
vésicules et par la dispersion dans une phase aqueuse de
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cette phase de solvant ayant dissout les lipides pour
obtenir une émulsion huile-dans-eau (H/E) avec mise en
oeuvre d'une agitation pour réaliser cette dispersion. Le
procédé selon L'invention offre l'avantage de permettre
d'opérer à basse température puisqu'il n'est pas-nécessaire
de fondre les lipides qui sont dissous dans la phase
solvant, ce qui, en particulier, autorise l'encapsulation
dans les vésicules de substances actives thermo-sensibles;
il permet aussi d'utiliser une phase organique concentrée.
Mais surtout, et de façon tout à fait inattendue et
inexpliquée, il aboutit toujours directement à une phase
vésiculaire de très bonne qualité, c'est-à-dire à des
vésicules de faible dispersité et de forts taux
d'encapsulation, ce qui dispense d'une étape ultérieure
d'homogénéisatio:n et évite donc tous les inconvénients
susmentionnés d'une telle étape.
Par ailleurs, le procédé selon l'invention est
plus rapide que le procédé classique consistant à mettre en
contact les lipides avec la phase aqueuse à encapsuler dans
les vésicules, à agiter doucement pour former une phase
lamellaire, à ajouter un liquide de dispersion, puis à
agiter énergiquement; en effet, on supprime l'étape
d'hydratation pour la formation de la phase lamellaire,
étape qui était toujours assez longue.
La présente invention a donc d'abord pour objet
un procédé de préparation d'une dispersion aqueuse de
vésicules lipidiques lamellaires, chacune de ces vésicules
étant constituée par au moins un feuillet lipidique
sphéroïde encapsulant un liquide aqueux, dans lequel:
(a) dans une première étape, on dissout au moins un
lipide dans au moins un solvant organique,
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(b) dans une deuxième étape, on ajoute la phase
organique obtenue à la première étape à une phase
aqueuse,
(c) dans une troisième étape, on disperse le mélange de
la deuxième étape sous agitation, et
(d) dans une quatriême étape, on évapore le (ou les)
solvants) en même temps qu'une partie de l'eau,
caractérisé par le fait que le(s) solvants)
organique:~(s) de l'étape a) est (sont) non
miscible(:) à l'eau; que les quantités respectives
des deux phases de l'étape b) sont telles que la
dispersion obtenue ultérieurement soit une
dispersion du type huile-dans-eau (H/E); et que les
étapes c) et d) sont menées sous forte agitation, la
phase continue de la dispersion restant en
permanencE: la phase aqueuse.
Dans ce procédé, le cas échéant, dans une
cinquième étape, on concentre la dispersion.
A l'étape (a), on peut utiliser avantageusement
tous les solvants non-miscibles à l'eau qui ont un point
d'ébullition infÉ~rieur â 50°C à une pression comprise entre
1,5 x 104 et 105 Pa et solubilisent les lipides utilisés
pour former les vésicules. Comme solvants utilisables
conformément à l'invention, on peut citer le
dichlorométhane, le chloroforme, l'acétate d'éthyle,
l'acétate de butyle, le formiate d'éthyle, l'hexane, le
cyclohexane, le toluêne, l'éther de pétrole, et les
mélanges d'au moins deux d'entre eux.
On peul. ainsi préparer à l'étape (a) une phase
organique dans laquelle le (ou les) lipides(s) est (ou
sont) présents) à raison d'environ 5 à 50% en poids, de
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préférence, d'environ 10 à 20°s en poids de ladite phase
organique. Cette haute concentration en lipides est une
caractéristique très intéressante du procédé selon
l'invention.
Par ailleurs, l'étape (a) du procédé selon
l'invention est avantageusement conduite à une température
d'environ 35°C à environ 55°C; de préférence, à une
température se situant aux environs de 35°C.
On peut choisir le (ou les) lipides(s) parmi les
lipides amphiphi.les non-ioniques, les lipides amphiphiles
ioniques, et les mélanges de lipides non-ioniques) et
ionique (s) .
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Les lipides amphiphiles non-ioniques sont notam-
ment choisis parmi:
(1) les éthers de polyglycérol, linéaires ou rami-
fiés, de formule:
RO--EC3H5 (OH) 0-~-~-H
n
dans laquelle:
~ -C3H5(OH)0 est représenté par les structures
suivantes prises en mélange ou séparément:
-CH2CHOHCH20-; -CH2-¿HO-; JiH-CH20-;
CH20H 1CH20H
~ n est une valeur statistique moyenne comprise
entre 1 et 6%
~ R représente:
(a) une chaîne aliphatique, linéaire ou
ramifiée, saturée ou insaturée, contenant
de 12 à 30 atomes de carbone; ou des
radicaux hydrocarbonés des alcools de
lanoline%
(b) un reste R'CO, où R' est un radical
aliphatique, linéaire ou ramifiée, en
C11-C17%
(c) un reste R2 -f-OC2H3(R3)-~-, où:
~ R2 peut prendre la signification (a) ou
(b) donnée pour R%
OC2H3(R3)- est représenté par les
structures suivantes, prises en mélange
ou séparément:
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-O¿H-CH2- et -O-CH2-IH-
R3 R3
où R3 prend la signification (a) donnée
pour R;
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(2) les éthers de polyglycérol, linéaires ou ramifiés,
comportant cLeux chaînes grasses;
(3) les alcools gras polyoxyéthylénés et les stérols et
phytostérol~~ polyoxyéthylénés;
(4) les éthers cLe polyols;
(5) les ésters de polyols, oxyéthylénés ou non;
(6) les glycolipides d'origine naturelle ou synthétique;
(7) les hydroxya.mides représentés par la formule:
1() R4-CHOH:-CH-COA
R5-CONH
dans laquelle:
- R4 désigne un radical alkyle ou alcényle en
C7-C21%
- R5 désigne un radical hydrocarboné, saturé ou
insaturé, en C~-C31;
- COA désigne un groupement choisi parmi les deux
groupements suivants:
2 () ~ un reste CON-B
R6
où:
B est un radical dérivé d'amines
primaires ou secondaires, mono- ou
polyhydroxylées; et
~ R6 désigne un atome d'hydrogène ou un
radical méthyle, éthyle ou
hydroxyéthyle; et
un reste -COOZ, où Z représente le reste
3() d'un polyol en C3-C~.
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Les lipides amphiphiles ioniques sont notamment
choisis parmi:
les phospholipides naturels, tels que la lécithine
d'oeuf ou de soja et la sphingomyéline;
- les phospholipides de synthèse, tels que la
dipalmitoy:L-phosphatidylcholine ou la lécithine
hydrogénée,; et
- les composés anioniques.
L'évaporation du solvant à l'étape (d) peut
avantageusement i~tre conduite à la pression atmosphérique.
L'évent:uelle concentration de la dispersion à la
fin du procédé s'effectue par entraînement, sous pression
réduite, du solvant résiduel éventuel et d'une partie de
l'eau.
On peut, associer aux lipides au moins un additif
choisi parmi:
- les alcool: et diols à longue chaîne;
- les stérols, par exemple le cholestérol;
- les amines à longue chaîne et leurs dérivés ammonium-
quaternaires;
- les dihydroxyalkyl-amines; les amines grasses
polyoxyéthylénées; les esters d'amino-alcools à
longue chaîne; et leurs sels et dérivés ammonium-
quaternaires;
- les esters phosphoriques d'alcools gras, par exemple,
le dicétylphosphate acide ou son sel de sodium;
- les alkylsulfates, par exemple le cétylsulfate de
sodium; et
- certains polymères, tels que les polypeptides et les
protéines.
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Conforrr~ément à une autre caractéristique
particulière de l'invention, à l'étape (b), on utilise un
rapport pondéral de la phase organique â la phase aqueuse
compris entre environ 0, 1 et environ 0, 6, conduisant à une
émulsion H/E.
Par ailleurs, il va de soi que l'on peut
incorporer au moins une substance active hydrosoluble à la
phase aqueuse et/ou au moins une substance active
liposoluble à la phase organique. On peut ainsi encapsuler
10 des actifs hydrosolubles dans la phase aqueuse encapsulée
dans les vésicules et des actifs liposolubles dans les
feuillets des vésicules.
En outre, dans le procédé selon l'invention, il
est important que le mélange de la phase organique
contenant les lipides et de la phase aqueuse soit effectué
sous une forte agitation. On peut notamment conduire les
agitations des étapes (c) et (d) avec des organes
d'agitation rotatifs dont la vitesse périphérique est
supérieure à 10 rn/s à l' extrémité libre desdits organes et
dont la vitesse angulaire est supérieure à 1000 tours/mn.
Les vitesses préférées sont respectivement de 40
m/s avec 5000 tours/mn.
Selon L'invention, on peut régler la taille des
vésicules en faisant varier la vitesse d'agitation au cours
du mélange des phases. Cette taille peut être réglée, en
particulier, entre 0,2 et 0,3 ~,m.:
La pré:~ente invention porte également sur les
compositions à b<~se des dispersions aqueuses de vésicules
lipidiques, telles qu'obtenues par le procédé qui vient
d'être décrit.
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Pour mieux faire comprendre l'objet de
l'invention, on va en décrire maintenant, à titre d'exemple
purement illustratif et non limitatif, un mode de mise en
oeuvre.
EXEMPLE 1 . Préparation d'une dispersion aqueuse de
vésicules à partir de lipides non ioniques.
On utilise une phase lipidique formulée comme
suit ( % en poids )
~ Lipide amphiphile non-ionique de formule:
RO--E- C3H5 (OH) O~H
n
dans laquelle:
~ R est un radical hexadécyle;
~ -C3H5(OH)O représenté:
~ -CH2-CHO- ; -iH-CH20- ;
CH20H CH20H
2p ~ n vaut 3
.......................................47,5
~ Cholestérol.............................47,5
~ Dicétyl phosphate........................5
On prépare des vésicules lipidiques encapsulant
une phase aqueuse à partir de la formulation suivante (% en
poids )
Phase lipidique ci-dessus définie............8,7
Dichlorométhane.............................34,8
Glucose.......................2
30 Glycérine.....................2,2
Phase aqueuse Eau..........................52,3
onservateur..Quantité suffisante
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On dissout la phase lipidique dans le
dichlorométhane à une température de 35°C; puis on
additionne la phase organique ainsi obtenue à la phase
aqueuse et on disperse pendant 10 mn, sous une agitation à
000 tours/mn, avec une turbine donnant une vitesse
périphérique en bout de pales de 40 m/s, dans un récipient
de 50 dm3 de volume utile et d'environ 40 cm de hauteur
contenant 20 kg de mêlange.
On distille, sous la même agitation, le
dichlorométhane, vers 40°C à la pression atmosphérique,
pendant 55 minutes.
Ensuite, on réalise un entraînement du
dichlorométhane résiduel et d'une partie de l'eau, vers
40°C, pendant 19:5 minutes en poursuivant la distillation
sous une pression réduite de 4 x 103 pascals.
On obtient une dispersion vésiculaire ayant une
concentration pondérale en phase lipidique de 23,1 %. On
observe que le taux d'encapsulation des vésicules à la fin
de l'opération e~~t de 2,4 ~,1/mg avec une fraction volumique
2c) de 79 % (la fraction volumique est le rapport du volume
occupé par les v~~sicules au volume total de la dispersion)
et un diamètre moyen de 200 nm. Ä tire de comparaison, il
faut noter que les procédés courants conduisent à des
vésicules de taille supérieure à 1000 nm. Pour les affiner
il faut utiliser des homogénéisateurs classiques, à
concentration lipidique équivalente, il faut alors
plusieurs passages pour atteindre des vésicules d'environ
220 nm et, dans ce cas, le taux d'encapsulation ne dépasse
pas 2 ~C1/mg pour des fractions volumiques inférieures à
30 70 %.
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L'évolution de la dispersion au cours de ce
procédé a été suivie; les résultats sont rapportés dans le
tableau 1; le temps t= 0 correspond au début de
distillation.
L'évolution de la conductance de la dispersion au
cours du procédé a été mesurée à l'aide d'un galvanomètre
associé à une électrode constituée de deux fils de platine
distants de 0, 5 cm et soumis à une différence de potentiel
de 4 volts.
Les résultats sont portés sur la figure 1 du
dessin annexé ,. le temps, en minutes, est porté en
abscisse, et la conductance, en Siemens, en ordonnée. On
peut constater que la conductance se maintient entre 10 et
40 .Siemens . un.e variation d'une si faible amplitude est
incompatible avec: une inversion de phase; le milieu continu
de la dispersion (phase aqueuse) ne change donc pas de
nature au cours de l'élimination du solvant.
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EXEMPLE 2 :Préparation d'une dispersion aqueuse de
vésicules à partir de lipides non-ioniques
On utilise une phase lipidique formulée comme
suit .
- Lipide non ionique de formule .
C12 2~0 C2H3 (R) ] -O- LC3H5 (OH) -O~-H
n
où -O C2H3(R)- est constitué par un mélange des
radicaux:
-O-¿H-CH2- et -O-CH2-¿H- ;
R R
où -C3H5 (OH)-O- est constitué par un mélange des
radicaux .
CH2 - ~ H-O- et --i H-CH2 -O- ;
CH20H CH20H
où n = 6 ;
et où R est un mélange des radicaux C14H29
et C16H33........................................... 380 g
- Cholestérol ..................................... 380 g
- Acide tout-trans rétinoïque .. .................. 10 g
- DL a-tocophérol .................................. 10 g
Dans un bac cylindrique de 50 dm3 de volume utile
et d'environ 40 cm de hauteur, on dissout la phase
lipidique dans 4C>00 g de dichlorométhane à une température
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de 35°C; puis on additionne la phase organique ainsi
obtenue à 13855 g d'eau et on disperse pendant 10 minutes
sous une agitation à 5000 tours/mn avec une turbine donnant
une vitesse périphérique en bout de pales de 40 m/s.
On distille, sous la même agitation, le
dichlorométhane, vers 40°C à la pression atmosphérique,
pendant 55 minutes.
Ensuite, on réalise un entraînement du
dichlorométhane résiduel et d'une partie de l'eau, vers
40°C, pendant 145 minutes en poursuivant la distillation
sous une pression réduite de 4.103 pascals.
On obtient une dispersion vésiculaire ayant une
concentration pondérale en phase lipidique de 8%, un
diamètre moyen de vésicules de 240 nm, avec un indice de
polydispersité de 0,27.
EXEMPLE 3: Préparation d'une dispersion aqueuse de
vésicules à partir de lipides ioniques
On prépare une phase lipidique formulée comme
suit:
- Lécithine hydrogénée à 30/35% de phospha-
tidylcholine hydrogéné, vendue par la
Société "NIKKO" sous la dénomination "LECINOL
S 10 ".............................................480 g
- Phytostérol polyoxyêthyléné (à 5 moles
d'oxyde d'éthylène) vendu par la Société
"NIKKO" sous la dénomination "GENEROL 122 E 5".....320 g
- mélange de chlorure de méthylène et de
chloroforme dans les proportions 81,5
18,5 en poids.....................................3200 g
On prépare une phase aqueuse formulée comme suit:
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- eau..............................................13800 g
- sel disodique de l'acide éthylènediamino-
tétracétique........................................10 g
On dissout la phase lipidique dans le mélange de
solvants à une température de 35°C. On obtient ainsi une
phase organique.
On additionne la phase organique à la phase
aqueuse dans un bac cylindrique de 50 dm3 de volume utile
ayant une hauteur de 40 cm et on disperse pendant 10
minutes sous une agitation à 5000 tours/mn avec une turbine
donnant une vitesse périphérique en bout de pales de 40
m/s.
On distille, sous la même agitation, le mélange
de solvants, vers 40°C à la pression atmosphérique, pendant
55 minutes.
Ensuite, on réalise un entraînement du mélange
résiduel de solvants et d'une partie de l'eau, vers 40°C,
pendant 145 minutes en poursuivant la distillation sous une
pression réduite de 4.103 pascals.
On obtient une dispersion vésiculaire ayant une
concentration pondérale en phase lipidique de 8,1%, un
diamètre moyen de vésicules de 204 nm, avec un indice de
polydispersité d~~ 0,3.
