Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
2~~~~~3
1
La présente invention concerne le domaine des polysac-
charides de bas poids moléculaires. Plus particulièrement, elle
concerne le domaine des héparines de bas poids moléculaire.
Les héparines sont des substances biologiques d'extraction
de la famille des glycosaminoglycanes, utilisées pour leurs proprié
tés anticoagulante et antithrombotique. Notamment, elles sont
utilisées dans le traitement des thromboses veineuses postopéra
toires. Cependant, dans leur forme native, les héparines présentent
un certain nombre d'inconvénients qui limitent les conditions de
leur utilisation. En particulier, l'activité anticoagulante peut
occasioner des hémorragies, et la sensibilité à certains facteurs
sériques, tel pf4, impose l'utilisation de doses relativement
importantes. I1 est donc nécéssaire de privilégier l'activité
antithrombotique, attribuée notamment à l'activité antiprothrom-
binase, au dépens de l'activité anticoagulante, attribuée à l'effet
antithrombine.
Dans ce but, il a été proposé de fragmenter les héparines
en molécules de poids moléculaires moyens plus faibles. En
particulier, on connait dans l'art antérieur le brevet européen -
EP 40144. Ce brevet décrit des mélanges de polysaccharides sulfatés
ayant la structure générale des polysaccharides constitutifs de
l'héparine, possèdant une double liaison éthylénique à l'une des
extrêmités de leur chaîne, et dont le poids moléculaire moyen en
poids est compris entre 2000 et 10000 Daltons. Ces mélanges sont
obtenus par dépolymérisation et saponification d'un ester
d'héparine. I1 est indiqué qu'ils présentent une activité anti-
thrombotique élevée et une activité anticoagulante globale infé-
rieure à celle de l'héparine.
Toutefois, l'un des problèmes majeurs rencontrés avec les
héparines réside dans le fait qu'il s'agit de produits très hétéro
gènes. I1 est donc difficile d'apprécier la contribution de chacune
des espèces dans l'activité de l'héparine, de connaître le compor
tement de ces espèces lors de la dépolymérisation, et enfin de
contrôler la structure de ces espèces et leurs proportions respec
tives dans les produits finals. Pour ces raisons, les inconvénients
2
mentionnés ci-avant n'ont pu être résolus de manière totalement
satisfaisante. Notamment, les procédés décrits dans l'art antérieur,
et en particulier dans le brevet EP 40144 ne permettent pas
d'obtenir des mélanges possèdant les propriétés pharmacologiques
requises pour une meilleure application, à savoir une demie-vie
plasmatique suffisamment élevée, une vitesse d'absorption assez
grande, une forte biodisponibilité ou encore une faible "clearance".
D'autres procédés ont pourtant été décrits, permettant de
fragmenter l'héparine, en vue de diminuer ses effets indésirables
(Johnson et coll. Thrombos.Haemostas.Stuttg., 1976, 35, 586; Lane et
coll. Thrombosis Research 16, 65t, Lasker et coll. US 3,766,167).
Chacun de ces procédés semble indiquer que l'activité recherchée est
privilégiée lorsque le degré de fragmentation de l'héparine augmente
(voir aussi la demande de brevet européenne EP 301618 relative à des
pentasaccharides possédant une activité antithrombotiquel.
Dans le même sens, des études récentes sur le mécanisme
d'action des héparines dans la formation de la thrombine ont mis en
évidence une influence du poids moléculaire moyen des héparines sur
leur activité in vitro (Béguin et coll., Thromb. Haemost., 61, 30,
1989 ) . Les auteurs indiquent que les héparines de bas poids molé-
culaiâe possèdent plutôt une activité antiprothrombinase et les
héparines de poids moléculaire plus élevé, une activité antithrom-
bine.
Parallèlement, il a également été proposé de fractionner
les héparines, afin d'extraire des mélanges de poids moléculaire
moyen plus homogène. On tonnait en particulier la demande de brevet
européenne EP 337327, qui décrit un procédé de préparation de
fragments d'oligosaccharides dérivés de l'héparine, permettant
d'obtenir des mélanges ayant une dispersion moléculaire réduite.
Selon ce procédé, on élimine préalablement les fractions de poids
moléculaire inférieur à 3000 daltons, ce qui conduit à enlever du
produit final les fragments contenant moins de 10 à 16 saccharides,
et les espèces de poids moléculaire supérieur à 7000 daltons. Selon
les inventeurs, ce traitement, qui a pour objectif d'homogénéiser le
mélange final, permettrait de diminuer l'activité anticoagulante,
tout en conservant l'activité antithrombotique recherchée.
~~~~~~3
3
Cependant, en dépit de ces travaux, les mélanges obtenus
présentent toujours un effet hémorragique résiduel, ou une activité
antithrombotique trop faible. De plus, rien dans l'art antérieur ne
permet de déterminer quelles sont les propriétés qui doivent être
réunies pour obtenir une activité biologique optimale. D'aiïleurs,
la conclusion des auteurs de l'article précité est éloquente : "Nous
ne savons pas quelle est la combinaison optimale des propriétés de
l'héparine. La caractérisation précise de différentes préparations,
et la correlation de ces propriétés avec des observations cliniques
pourrait eventuellement apporter une réponse".
I1 a maintenant été trouvé qu'il est possible d'obtenir
des héparines présentant des propriétés avantageuses, notamment pour
leur utilisation dans la prophylaxie et le traitement des accidents
thrombotiques. De manière inattendue, la demanderesse a en effet
trouvé que la présence dans le produit final, à la fois d'espèces de
haut et de bas poids moléculaire, conférait une meilleure activité
au produit. Contrairement aux indications de l'art antérieur, il
semble donc préférable de conserver dans le mélange final des
espèces de poids moléculaire élevé, ainsi qu'une certaine hétérogé
néité.
L'étude pharmacocinétique des mélanges de l'invention
montre qu'ils rassemblent des propriétés particulièrement avanta-
geuses.
En particulier, les mélanges de l'invention présentent un
temps de demie-vie supérieur aux autres produits connus, et égale-
ment à l'héparine mature. Par ailleurs, par rapport à cette
dernière, il est important de souligner que la demie-vie des
mélanges de l'invention est indépendante de la dose injectée. Ceci
est intéréssant puisque l'effet produit est beaucoup plus prédictif
que dans le cas de l'héparine.
De plus, chez l'homme, les mélanges de l'invention présen-
tent une excellente biodisponibilité, mesurée par l'activité anti
Xa. Ainsi, de 30 % environ pour l'héparine, elle est de 90 % environ
pour les mélanges de l'invention. Ceci est très avantageux car
permet de réduire les doses injectées et d'améliorer la potentialité
thérapeutique.
2~~~~~~
4
Par ailleurs, une autre prapriété importante des mélanges
de l'invention réside dans leur grande vitesse d'absorption. Cette
caractéristique permet d'obtenir une activité biologique quasi
instantanée, et offre donc une plus grande sécurité dans le trai
s terrent, en couvrant rapidement le patient.
Une autre caractéristique des mélanges selon l'invention
est leur faible "clearance" comparativement aux autres produits et à
l'héparine mature. Grace à leur structure chimique, à leur poids
moléculaire ou à leur taux de sulfate, ces mélanges présentent en
effet une résistance particulière à la dégradation (désulfatation,
hydrolyse) et à l'élimination, qui augmente encore leurs capacités
thérapeutiques.
Également, les préparations de l'invention possèdent un
temps de résidence accru par rapport à l'héparine de départ. Cette
propriété se traduit par un prolongement du temps pendant lequel le
produit reste actif in vivo, et donc par une meilleure efficacité
thérapeutique.
De plus, ces préparations présentent également une sensi
bilité réduite aux facteurs sériques, qui augmente leur durée
d'action in vivo et permet de les utiliser à des doses faibles.
Ces propriétés particulièrement avantageuses sont obtenues
en contrôlant, au cours du procédé de préparation, certaines carac-
téristiques structurales des espèces en présence, ainsi que leur
répartition moléculaire. Les mélanges ainsi obtenus sont dans un
rapport favorable entre les fractions de hauts et de bas poids
moléculaires, qui leur confère les propriétés antithrombotiques
requises, avec un effet hémorragique faible.
Cette caractéristique de l'invention est exprimée à la
fois par le pourcentage de chaînes lourdes et de chaînes légères et
par le rapport entre le poids moléculaire moyen en poids des
mélanges et leur poids moléculaire moyen en nombre, qui reflète la
dispersion moléculaire.
Un objet de la présente invention réside donc dans des
mélanges de polysaccharides sulfatés présentant la structure
générale des polysaccharides constitutifs de l'héparine, carac
térisés en ce qu'ils ont un poids moléculaire moyen en poids
~ ~~~~ :=~ i~
inférieur à celui de l'héparine, contiennent entre 9 et 20% de
chaînes de poids moléculaire inférieur à 2000 Daltons et entre 5 et
20 % de chaînes de poids moléculaire supérieur à 8000 Daltons, et
dans lesquels le rapport poids moléculaire moyen en poids/poids
5 moléculaire moyen en nombre est compris entre 1,3 et 1,6.
Par ailleurs, la demanderesse a constaté qu'il est
possible d'améliorer encore les propriétés des mélanges en diminuant
leur taux d'impuretés. Notamment, la plupart des héparines contien-
nent des contaminants tels que les acides nucléiques, les polypep-
tides, ou divers polysaccharides. Parmi ceux-ci, on peut citer en
particulier les chondroïtines sulfates, et l'héparane ou le derma-
tane sulfate. Chacun de ces contaminants, de part son poids molécu-
laire très élevé, de part les substituants qu'il porte ou son degré
de sulfatation, est capable d'interférer lors de la préparation du
produit (dans la dépolymérisation par exemple) pour modifier la
répartition moléculaire finale, ou directement dans l'activité, en
modifiant les proportions de chaînes actives notamment. La demande-
resse a maintenant mis au point un procédé permettant d'éliminer ces
impuretés, et a constaté une amélioration des qualités des mélanges
ayant subi ce pré-traitement. L'effet de ce prétraitement peut être
mesuré en utilisant comme impureté témoin le dermatane sulfate.
Un objet plus particulier de la présente invention réside
dans des mélanges de polysaccharides sulfatés présentant les carac
téristiques énoncées ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils contien
nent moins de 2 % de dermatane sulfate.
Dans un mode préféré, les mélanges de polysaccharides
sulfatés selon l'invention possèdent un poids moléculaire moyen en
poids compris entre environ 3500 Daltons et environ 5500 Daltons.
Toujours préférentiellement, les chaînes de polysac
charides sulfatés constituant les mélanges selon l'invention ont un
acide 2-0-sulfo 4 enopyranosuronique à l'une de leurs extrêmités.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de
préparation de mélanges de polysaccharides sulfatés ayant un poids
moléculaire moyen en poids inférieur à celui de l'héparine, conte-
nant entre 9 et 20 % de chaînes de poids moléculaire inférieur à
2000 Daltons et entre 5 et 20 % de chaînes de poids moléculaire
2~~J~~~
6
supérieur à 8000 Daltons, et dans lesquels le rapport poids molé-
culaire moyen en poids/poids moléculaire moyen en nombre est compris
entre 1 , 3 et 1 , 6. Le procédé de l' invention est caractérisé en ce
que l'on effectue les étapes suivantes
- dans une première étape, on salifie en milieu aqueux une
héparine au moyen d'un sel d'ammonium quaternaire à longue chaîne,
- dans une deu:~ième étape, on estérifie le sel ainsi
obtenu pour former un ester ayant un degré d'estérification compris
entre 9,5 % et 14 %, et
- dans une troisième étape, on dépolymérise l'ester obtenu
ayant un degré d'esterification compris entre 9,5 et 14 %.
La demanderesse a en effet constaté que l'on peut contrô
ler le niveau de dépolymérisation, et donc les caractéristiques
moléculaires du produit final, en jouant sur le degré d'estérifi
cation du sel d'héparine de départ.
Selon l'invention, il est donc possible d'obtenir direc-
tement et de manière reproductible des mélanges de polysaccharides
sulfatés ayant les caractéristiques indiquées ci-dessus.
L'héparine de départ utilisée dans le procédé de l'inven
tion est de préférence une héparine de porc, et notamment de
muqueuse de porc. .Il a en effet été trouvé que selon l'origine de
l'héparine de départ, l'act_vité des mélanges obtenus pouvait varier
de manière substantielle. Notamment, lorsque l'héparine de départ
est d'origine bovine, on obtient des mélanges ayant une activité
anticoagulante supérieure à celle obtenue à partir d'héparine de
muqueuse intestinale de porc.
De plus, dans une variante particulièrement avantageuse,
le procédé de l'invention comprend en outre une étape préalable de
précipitation de l'héparine de départ au moyen d'un alcool. Ce
prétraitement permet de diminuer le taux en impuretés de type
chondroïtine sulfate ou héparane sulfate.
Un alcool donnant de bons résultats est par exemple le
méthanol.
~~~t ~~t~3
Le taux de pureté de l'héparine sodique peut ensuite être
déterminé par chromatographie liquide d'exclusion stérique.
Cette étape préliminaire permet notamment de préparer une
héparine ayant un taux de dermatane sulfate inférieur à 2 %.
Plus précisément, la salification de l'héparine est
réalisée de la manière suivante.
Le sel de l'héparine peut être obtenu par action d'un
excès du sel correspondant sur une héparine sodique, en milieu
aqueux, à une température voisine de 20°C. D'une manière avanta-
geuse, le sel d'ammonium quaternaire utilisé est de préférence un
sel de benzéthonium, tel que notamment le chlorure de benzéthonium,
que l'on peut faire réagir sur l'héparine sodique.
En ce qui concerne la deuxième étape, on préfère réaliser
l'estérification dans les conditions suivantes.
L'ester partiel de l'héparine sous forme de sel, dont le
taux d'estérification est compris entre 9,5 et 14 % peut être obtenu
par esterification du sel d'ammonium quaternaire à longue chaîne de
l'héparine dans un solvant organique chloré, en présence d'un dérivé
du chlore. De plus, l'efficacité de la réaction est augmentée en
contrôlant les proportions des différents réactifs et la température
et le temps de réaction.
D'une manière avantageuse, l'ester partiel de l'héparine
est un ester aromatique.
Encore préférentiellement, le dérivé du chlore est le
chlorure de benzyle, et le solvant chloré est choisi parmi le
chloroforme ou le chlorure de méthylène.
Pour obtenir un taux d'estérification compris entre 9,5 et
14 %, il peut être particulièrement avantageux d'utiliser, pour 1
partie en poids du sel de l'héparine, environ 1 partie en volume de
dérivé du chlore, au sein de 3 à 5 parties en volume de solvant
organique chloré, et d'effectuer la réaction pendant une période de
15 à 48 heures, à une température comprise entre 25 et 45°C, et de
préférence, entre 30 et 40°C.
Dans un mode préféré de réalisation, l'ester partiel de
l'héparine est sous forme d'un sel de sodium.
,f'~ 9 ;~ rD
~,;, L:ò .~j ~~: t/ °)
8
Les esters ainsi formés peuvent être récupérés par préci-
pitation au moyen d'un alcool, tel que notamment le méthanol, en
présence d'acétate de soude. De préférence, on utilise entre 1 et
1,2 volumes d'alcool par volume de milieu réactionnel. Le taux
d'esterification de l'ester peut ensuite être contrôlé par chromato-
graphie en phase liquide haute performance. En particulier, dans le
cas de l'ester benzylique, on peut mesurer la quantité d'alcool
benzylique obtenue par saponification de l'ester à 0°C.
La dernière étape du procédé de l'invention est conduite
avantageusement de la manière suivante.
Préférentiellement, la dépolymérisation est réalisée en
traitant l'ester avec une base forte en solution aqueuse. Plus
précisément, on peut utiliser la soude.
Avantageusement, le rapport en poids base/ester est
compris entre 0,05 et 0,2, et de préférence, entre 0,08 et 0,15.
La température du milieu est ajustée à une valeur comprise
entre 50 et 70°C, et de préférence, entre 55 et 65°C, et la
réaction
est effectuée durant une période allant de 30 minutes à 3 heures, et
de préférence, de 1 à 2 heures.
De plus, il est préférable d'opérer dans un milieu dans
lequel le rapport en poids eau/ester est compris entre 15 et 30.
Une manière particulièrement avantageuse de réaliser la
dépolymérisation consiste à mélanger
- une partie en poids d'un ester aromatique de l'héparine
tel qu'obtenu à la deuxième étape, sous forme de sel, dont le taux
d'esterification est compris entre 9,5 et 14 %,
- entre 0,08 et 0,15 partie en poids de soude, et
- entre 20 et 30 parties en poids d'eau,
puis à maintenir pendant 1 à 2 heures la température entre 55 et
65°C.
Le produit peut ensuite être récupéré par neutralisation
du milieu réactionnel au moyen d'un acide minéral dilué, et de
préférence d'acide chlorhydrique, et précipitation en présence d'un
alcool, tel que le méthanol.
~t~'.~f~~
9
De cette manière, il est possible d'obtenir directement,
et de façon reproductible un mélange de polysaccharides sulfatés
contenant
- entre 9 et 20 % de chaînes de poids moléculaire infé-
rieur à 2000 Daltons,
- entre 5 et 20 % de chaînes de poids moléculaire supé-
rieur à 8000 Daltons,
et ayant un poids moléculaire moyen compris entre 3500 et 5500
Daltons et un rapport poids moléculaire moyen en poids/poids molécu
laire moyen en nombre compris entre 1,3 et 1,6.
Les mélanges de la présente invention peuvent être
utilisés de manière avantageuse comme agents antithrombotiques.
En particulier, ils sont applicables pour la prévention
des thromboses veineuses dans les situations à risques. Ceci est
également valable dans les situations à risque prolongé. En parti
culier, ces mélanges permettent pour la première fais de diminuer, à
doses fixes, les risques d'accidents thrombotiques dans la chirurgie
orthopédique. Ce risque, qui est de 70 % en l'absence de tout
traitement et d'environ 25 % en présence d'héparine, se situe aux
alentours de 10 % avec les mélanges de l'invention, voire moins.
De même, injectés dans les tubulures d'un rein artificiel,
ces mélanges peuvent réduire les thromboses susceptibles de s'y
développer. Cette dernière application pouvant être étendue à la
prévention des thromboses dans le matériel chirurgical.
Une autre utilisation thérapeutique avantageuse des
mélanges de l'invention réside dans la prévention des accidents
thrombotiques artériels, et notamment dans le cas d'infarctus du
myocarde.
Par ailleurs, une application particulièrement intérés
sante des mélanges selon la présente invention réside dans la
possibilité d'utiliser, pour la prévention des thromboses veineuses
chez les malades chirurgicaux, un régime post-opératoire. Cette
application est tout à fait avantageuse puisqu'elle permet d'éviter
les risques d'hémorragie pendant l'opération, et les problèmes de
type et de doses d'anesthésiant, qui sont occasionnés par une
prévention en régime pré-opératoire.
10
L'ensemble de ces propriétës démontre les potentialités
thérapeutiques des préparations de l'invention.
Les exemples qui suivent, qui n'ont pas un caractère
limitatif, illustrent la présente invention.
TECHNIQUES DE DOSAGE
Les poids moléculaires et les répartitions de poids
moléculaire des produits sont déterminés par chromatographie liquide
haute pression avec deux colonnes en série, par exemple celles
commercialisées sous la désignation TSK G 3000SW (30x0,75 cm) et
Lichrosorb 100 Diol 10u (25x0,75 cm), ou TSK G 2000SW, couplées avec
un détecteur réfractométrique. Le solvant utilisé est un tampon
phosphate 0,3M pH 7, et le débit est de 0,7 ml/mn. Le système est
calibré avec des étalons préparés par fractionnement de l'énoxapa-
rine (PHARMUKA) par chromatographie d'exclusion sur agarose-poly-
acrylamide (IHF) selon la technique décrite par HarrowCliffe et
Coll., Thromb. res., 12, 27-36 (1977-78) ou D.A. Lane et Coll.,
Thromb.res., 12, 257-271 (1977-78). Les résultats sont calculés à
l'aide du logiciel GPC6 (Perkin Elmer).
Dans les exemples qui suivent, l'activité anticoagulante
globale des mélanges est mesurée par turbidimétrie en utilisant le
premier étalon international d'héparine de bas poids moléculaire.
L'activité anti facteur Xa (antithrombotique) est mesurée par la
méthode amidolytique sur un substrat chromogène décrite par Teien et
Coll., Thromb.res., 10, 399-410 (1977), en utilisant le premier
étalon international d'héparine de bas poids moléculaire.
EXEMPLE 1
Cet exemple illustre l'étape préalable de traitement de
l'héparine sodique, permettant de réduire le taux d'impuretés de
type chondroïtine sulfate et héparane sulfate.
~~1~~~'~ t:i2
11
A 10 g d'héparine commerciale (sel de sodium) en solution
dans 100 ml d'eau contenant 3 g de chlorure de sodium, on ajoute 80
ml de méthanol. Après précipitation, le produit obtenu est filtré,
rincé puis séché. Le taux de puretë de l'héparine sodique ainsi
obtenue est mesuré par chromatographie liquide d'exclusion stérique,
avec deux colonnes en série, celles commercialisées sous la désigna-
tion TSK 2000SW (60 x 0,75 cm) et TSK 3000SW (60 x 0,75 cm),
couplées avec un détecteur UV réglé à 206 nm. La phase mobile
utilisée est une solution aqueuse de sulfate de sodium 0,5M cir-
culant à un débit de lml.mn-1. L'essai est comparé à une héparine
témoin contenant 2 % de dermatane sulfate.
Dans les conditions indiquées ci-dessus, l'héparine
obtenue contient moins de 2 % de dermatane sulfate.
EXEMPLE 2
Cet exemple illustre la préparation du sel d'ammonium
quaternaire de l'héparine.
A une solution de 10 g d'héparinate de sodium selon
l'exemple 1 contenant moins de 2 % de dermatane sulfate, dans 100 ml
d'eau, on ajoute une solution de 25 g de chlorure de benzéthonium
dans 125 ml d'eau. Le produit obtenu à température ambiante est
ensuite filtré, lavé à l'eau puis séché.
De manière identique, on prépare le sel de benzéthonium
d'une héparine n'ayant pas été soumise au traitement de l'exemple 1.
EXEMPLE 3
Cet exemple illustre la préparation et les propriétés des
mélanges selon l'invention.
1. Estérification
A une solution de 15 g d'héparinate de benzéthonium
préalablement traitée selon le procédé de l'exemple 1 dans 75 ml de
chlorure de méthylène, on ajoute 15 ml de chlorure de benzyle. La
solution est chauffée à une température de 35°C, qui est maintenue
12
pendant 25 heures. On ajoute alors 90 ml d'une solution à 10 %
d'acétate de sodium dans le méthanol, filtre, lave au méthanol et
sèche. On obtient ainsi 6,5 g d'ester benzylique d'héparine sous
forme de sel de sodium, dont le taux d'esterification, déterminé
comme indiqué ci-dessus, est de 13,3 %.
2. Dépolymérisation
g de l'ester benzylique d'héparine obtenu ci-dessus
sous forme de sel de sodium sont dissous dans 250 ml d'eau. A cette
solution chauffée à 62°C, on ajoute 0,9 g de soude. La température
10 est maintenue 1 heure et 30 minutes à 62°C. Le mélange réactionnel
est ensuite refroidi vers 20°C et neutralisé par addition d'acide
chlorhydrique dilué. On ajuste alors la concentration du milieu
réactionnel à 10 % en chlorure de sodium. Le produit est enfin
précipité dans 750 ml de méthanol, filtré est séché. On obtient
ainsi une héparine présentant les caractéristiques structurales
suivantes
- poids moléculaire moyen en poids : 3900 daltons
- répartition moléculaire
. 20 % de chaînes de poids moléculaire inférieur à
2p 2000 Daltons
. 5,5 % de chaînes de poids moléculaire supérieur
à 8000 Daltons.
- dispersion : d = 1,39
- activité anti Xa : 106 UI
- activité anti coagulante : 22,6 UI
EXEMPLE 4
D'une manière similaire, partant d'esters ayant un taux
d'esterification compris entre 9,5 et 14 %, on prépare des solutions
d'héparine dépolymérisée ayant les caractéristiques structurales
suivantes
a) - poids moléculaire moyen en poids : 4425 Daltons
- répartition moléculaire
.y '',~
~~C~~ ~.'~s~
1' '! P!
13
. 12,4 % de chanes de poids molculaire infrieur
2000 Daltons
. 9,3 % de chanes de poids molculaire suprieur
8000 Daltons.
- dispersion : d = 1,37
- activit anti Xa : 102 UI
- activit anti coagulante : 33 UI
b) - poids molculaire moyen en poids : 4579 Daltons
- rpartition molculaire
. 11,2 % de chanes de poids molculaire infrieur
2000 Daltons
. 10,4 % de chanes de poids molculaire suprieur
8000 Daltons.
- dispersion : d = 1,37
- activit anti Xa : 104 UI
- activit anti coagulante : 37 UI
c) - poids molculaire moyen en poids : 4446 Daltons
- rpartition molculaire
. 12,6 % de chanes de poids molculaire infrieur
2000 Daltons
. 9,5 % de chanes de poids molculaire suprieur
8000 Daltons.
- dispersion : d = 1,38
- activit anti Xa : 100 UI
- activit anti coagulante : 32 Ui
EXEMPLE 5
Cet exemple illustre la préparation d'un mélange n'entrant
pas dans les caractéristiques de l'invention.
1. Esterification
A une solution de 15 g d'héparinate de benzéthonium
préalablement traitêe selon le procédé de l'exemple 1 dans 60 ml de
chlorure de méthylène, on ajoute 12 ml de chlorure de benzyle. La
14
solution est chauffée à une température de 28°C, qui est maintenue
pendant 30 heures. On ajoute alors 90 ml d'une solution à 10%
d'acétate de sodium dans le méthanol, filtre, lave au méthanol et
sèche. On obtient ainsi 6,3 g d'ester benzylique d'héparine sous
forme de sel de sodium. Le taux d'esterification de ce produit,
déterminé par mesure, en chromatographie liquide à haute perfor-
mance, de la quantité d'alcool benzylique libérée par saponification
de l'ester à 0°C, est de 9,2 %.
2. Dépolymérisation
10 g de l'ester benzylique d'héparine obtenu ci-dessus
sous forme de sel de sodium sont dissous dans 200 ml d'eau. A cette
solution chauffée à 5B°C, on ajoute 1,1 g de soude. La température
est maintenue 1 heure à 58°C. Le mélange réactionnel est ensuite
refroidi vers 20°C et neutralisé par addition d'acide chlorhydrique
dilué. On ajuste alors la concentration du milieu réactionnel à 10 %
en chlorure de sodi~m. Le produit est enfin précipité dans 600 ml de
méthanol, filtré est séché. On obtient ainsi une héparine présentant
les caractéristiques structurales suivantes
- poids moléculaire moyen : 5425 daltons
- répartition moléculaire
. 9,6 % de chaînes de poids moléculaire inférieur à
2000 Daltons
. 19,5 % de chaînes de poids moléculaire supérieur
à 8000 Daltons.
- dispersion : d = 1,44
- activité anti Xa : 122 UI
- activité anti coagulante : 68,6 UI
Ces résultats, qui font apparaître une activité anti
coagulante élevée, démontrent la supériorité des mélanges préparés
selon l'invention, et possédant les caractéristiques énoncées.
~~~~'â ~J
EXEMPLE 6
Cet exemple illustre le gain de stabilité in vivo des
mélanges de l'invention, exprimé par leur demi-vie plasmatique.
Une première étude pharmacocinétique a été réalisée sur
5 des volontaires ayant entre 21 et 30 ans. Des injections sous
cutannées sont pratiquées de doses variant entre 20 et 80 mg/ml. Au
cours du temps, des échantillons sont prélevés (4,5 ml), et stockés
à 4°C environ. Les échantillons sont alors centrifugés 15 minutes à
2300 g et le plasma pauvre en plaquettes est séparé, et congelé
10 avant analyse. La demi-vie des mélanges est ensuite déterminée par
mesure de l'activité anti Xa. Les résultats obtenus sont les
suivants:
- Avec les mélange obtenus dans les exemples 3 et 4
dose 40 mg : dans 75 % des cas la demi-vie est supé
15 rieure à 4 heures, et elle est même supérieure à 4 heures et demie
dans environ 45 % des cas.
. dose 60 mg : dans 75 % des cas, la demi-vie est supé-
rieure à 3,7 heures.
- dans des conditions de dosage identiques, l'héparine
intacte, injectée par voie intra-veineuse possède une demi-vie de
0,6 heures environ.
- Lorsque le produit est préparé selon le procédé décrit
dans le brevet européen EP 40194, la demi-vie est supérieure à
4 heures et demie dans 17 % des cas.
Une seconde étude réalisée dans des conditions similaires
sur 20 patients a donné les résultats suivants pour les mélanges
conformes à la présente invention
. dose 40 mg : dans 80 % des cas, la demi-vie est supé
rieure à 4 heure, et elle est supérieure à 4 heures et demie dans 40
% environ des cas.
. dose 20 mg : dans 60 % des cas, la demi-vie est supé-
rieure à 3,9 heures.
