Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
-1
Séauences nucléotidiaues codant pour des régions variables de
chaînes B des récetpteurs des lymbhocytes Thumains , segments
peotidiaues corresuondants et les apolications diagnostiques
et thérapeutiques.
La présente invention concerne de nouvelles séquences
nucléotidiques codant pour des régions variables de chaines p
des récepteurs des cellules T, les segments peptidiques cor-
respondants et les applications diagnostiques et thérapeuti-
ques.
Il est connu que les récepteurs reconnaissant les antigè-
nes à la surface des lymphocytes T matures (désignés ci-après
récepteurs des cellules T) possèdent une structure ayant une
certaine analogie avec celles des immunoglobulines.,Ainsi, ils
comprennent des structures hétérodimériques comportant des
chaînes glycoprotéiques cz et p.ou des chaînes glycoprotéiques
y et 6 (voir Meuer et al. (1), Moingeon et al. (2), Brenner et
al. (3), Bank et al. (4)).
Le répertoire des récepteurs des cellules T doit pouvoir
faire face à l'immense diversité des déterminants antigéni-
ques. Ceci est obtenu par recombinaison génétique des diffé-
rents segments discontinus des gènes qui codent pour les
différentes régions structurales des récepteurs des cellules
T. Ainsi, les gènes comprennent des segments V (segments
variables), éventuellement des segments D (segments de diver-
sité), des segments J (segments de jonction) et des segments C
(segments constants). Pendant la différenciation des cellules
T, des gènes spécifiques sont créés par recombinaison des
segments V, D et J pour les locus p et 6 et des segments V et
J pour les locus a et p. Ces combinaisons spécifiques ainsi
que l'appariement des deux chaînes créent la diversité combi-
natoire. Cette diversité est fortement amplifiée par deux
mécanismes supplémentaires, à savoir la réunion imprécise des
segments V-D-J ou V-J et l'addition de nucléotides correspon-
dant à la région N (Davis et al. (5)).
On connaît déjà un certain nombre de segments géniques V.
Ces segments ont été groupés en sous-familles en fonction de
CA 02079881 2005-10-14
2
la similarité des séquences. Par définition, les segments qui
présentent plus de 75 % de similarité dans la séquence nucléo-
tidique ont été considérés comme des membres de la même sous
famille (Crews et al. 6)). Actuellement, on connaft environ 60
segments géniques Vp distincts (Wilson et al. (7), Robinson
(8), Leider et al. (9), Li et al. (11) qui ont
été classés en 20 sous-familles dont 7 avec un seul membre
(voir Wilson et al. déjà cité).
On a par ailleurs décrit récemment dans WO 90/06758 des
anticorps monoclonaux dirigés contre des segments spécifiques
des parties variables des récepteurs des cellules T, notamment
des chaines p et 6. Ces anticorps monoclonaux sont utiles non
seulement comme outils de diagnostic mais également comme
outils thérapeutiques, par exemple vis-à-vis de l'arthrite
rhumatoïde.
On a également décrit l'utilisation de peptides synthéti-
ques correspondant à des régions variables des chaînes a ou p
dans le traitement des maladies auto-immunes (27 et 28).
Il est par ailleurs connu qu'il existe des variations
d'un individu à un autre dans l'expression des différents
segments variables du récepteur T chez l'homme (27 et 28).
La présente invention vise à enrichir le répertoire des
segments géniques codant pour des régions variables des chai-
nes 0 des récepteurs des cellules T en fournissant de nouveaux
segments géniques VQ appartenant à des nouvelles sous familles
ou appartenant à des sous-familles dont on connaît déjà au
moins un membre.
La présente invention a ainsi pour objet des séquences
nucléotidiques codant poùr des régions variables de chaines p
des récepteurs des lymphocytes T humains, correspondant à des
ADNc comprenant des séquences nucléotidiques choisies parmi
l'un quelconque des segments Vp correspondant à l'une des
séquences SEQ ID N' 2 à 19, et les séquences qui en diffèrent
par un ou plusieurs nucléotides.
CA 02079881 2005-10-14
2a
Plus spécifiquement, la présente invention concerne
une séquence nucléotidique codant pour une région variable
de chaînes R de récepteur des lymphocytes T humains,
correspondant à un ADNc comprenant la séquence
nucléotidique SEQ ID No 15, et les séquences qui en
diffèrent par un ou deux nucléotides.
La présente invention a plus particulièrement pour objet
des séquences codant pour des régions variables des chaines Q
des récepteurs des lymphocytes T humains, correspondant à des
ADNc comprenant des séquences nucléotidiques choisies parmi
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
3 2a'8, 19 8 8 1
l'un quelconque des segments Vp correspondant à l'une des
séquences SEQ ID N 2 à 5, et les séquences qui en diffèrent
par un ou plusieurs nucléotides.
Par l'expression "et les séquences qui en diffèrent par
un ou plusieurs nucléotides", on englobe les allèles qui
présentent jusqu'à 8 nucléotides de différence, mais le plus
souvent 1 ou 2 nucléotides de différence, ou qui peuvent
différer par la délétion ou l'addition d'un ou deux codons.
La présente invention a également plus particulièrement
pour objet
- des séquences nucléotidiques codant pour des régions
variables de chaînes p des récepteurs des lymphocytes T hu-
mains correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie
des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque
des segments VQ correspondant à l'une des séquences
SEQ ID N' 2 à 5, et les séquences qui en diffèrent par un ou
deux nucléotides,
- des séquences nucléotidiques codant pour des régions
variables de chaînes p des récepteurs des lymphocytes T hu-
mains correspondant à des ADNc correspondant à l'une des
séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des
segments Vp correspondant à l'une des séquences SEQ ID N' 6 à
15, les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides
et les fragments de celles-ci, notamment les fragments des
séquences qui correspondent à tout ou partie des séquences
nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Vp
correspondant à l'une des séquences
1 à 155 de SEQ ID N' 8
1 à 125 de SEQ ID N' 9
1 à 111 de SEQ ID N' 10,
et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides,
- des séquences nucléotidiques codant pour des régions
variables de chaînes p des récepteurs des lymphocytes T
humains correspondant à des ADNc correspondant à tout ou
partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quel-
conque des segments Vp correspondant à l'une des séquences
1 à 195 de SEQ ID N 16
1 à 99 de SEQ ID N 17
WO 92/13950 ~.~ PCT/FR92/00130
~, fî èJ l' 4
1 à 113 de SEQ ID N 18
1 à 186 de SEQ ID N 19,
et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides.
Par l'expression "séquences nucléotidiques correspondant
à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences
nucléotidiques", on désigne aussi bien les séquences complètes
que des fragments de ces séquences, y compris des fragments
courts qui trouvent des applications en tant que sondes (géné-
ralement comportant au moins 10 nucléotides) ou en tant
qu'amorce (comportant généralement au moins 15 nucléotides).
La présente invention englobe d'une manière générale l'ensem-
ble des nouveaux oligonucléotides qui sont des fragments des
séquences Vp selon l'invention.
Quant aux séquences qui diffèrent par un ou deux nucléo-
tides, elles correspondent à des variations que l'on a observé
expérimentalement lors de la détermination de la séquence
nucléotidique de plusieurs ADNc.
La présente invention a également pour objet les peptides
codés par des séquences nucléotidiques selon l'invention ainsi
que les allèles et les dérivés de ceux-ci qui possèdent la
même fonction.
D'une manière générale, la présente invention englobe les
peptides constitués par ou comprenant une séquence peptidique
codée par les séquences nucléotidiques selon l'invention ainsi
que les fragments de ces peptides. Elle englobe également les
peptides qui diffèrent de ceux-ci d'un ou plusieurs
aminoacides et qui possèdent la même fonction. Ces peptides
peuvent correspondre à des modifications telles que celles
connues avec les mutéines ou à des variations allèliques. il a
en effet été montré en particulier que certains segments
géniques codant pour des régions variables de chaînes du
récepteur T chez l'homme.étaient soumis à un phénomène de
polymorphisme génétique appelé variation allèlique (29). La
présente invention englobe les peptides provenant de ce
phénomène.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention ont été
obtenues selon les étapes suivantes :
- isolement des ARN de lymphocytes périphériques d'un
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
individu
- obtention de l'ADN complémentaire à l'aide de reverse
transcriptase et d'une amorce A spécifique de la région CQ
(SEQ ID N' 20) ;
- amplification génique (par Anchored Polymerase Chain
Reaction ou A-PCR) à l'aide d'une ADN polymérase, d'une amorce
poly'C (SEQ ID N' 21) et d'une amorce B spécifique de la
région Co (SEQ ID N' 22) ;
- nouvelle amplification par A-PCR à l'aide de ADN poly-
mérase et d'une amorce C spécifique de la région Co (SEQ ID N'
23) ;
- insertion dans un vecteur plasmidique
- transformation d'un hote bactérien avec le vecteur
recombinant ;
- criblage des colonies bactériennes recombinantes avec
un oligonucléotide D spécifique de CQ (SEQ ID N' 24) marqué ;
- extraction des plasmides des colonies positives,
- et séquençage des fragments d'ADN contenant la région
C'a.
La présente invention peut être reproduite notamment par
amplification génique bispécifique (polymerase chain reaction
ou PCR) en partant de lymphocytes périphériques exprimant les
ARNm incluant les segments p variables ou jonctionnels
correspondant aux séquences ID N' 2 à 19 de l'invention ou
alternativement en appliquant cette technique de PCR à de
l'ADN génomique de toute cellule somatique d'un individu pris
au hasard. L'invention peut aussi bien être reproduite en
préparant les séquences géniques ci-dessus par synthèse
chimique d'oligonucléotides.
Les peptides selon l'invention peuvent être obtenus par
synthèse peptidique classique. Ils peuvent être également
obtenus par application des techniques connues de génie géné-
tique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour
un peptide selon l'invention dans un vecteur d'expression tel
qu'un plasmide et la transformation de cellules avec ce
vecteur d'expression.
La présente invention a donc également pour objet des
plasmides et des vecteurs d'expression comprenant une séquence
PCT/FR92/00130
WO 92/13950 2079881
6
d'ADN codant pour un peptide selon l'invention ainsi que hotes
transformés avec ce vecteur.
La présente invention a également pour objet des anti-
corps et notamment des anticorps monoclonaux, dirigés contre
un déterminant antigénique appartenant à ou comprenant un
peptide selon l'invention.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par toutes
les techniques qui permettent la production de molécules
d'anticorps à partir de culture de lignée cellulaire. Ces
techniques comprennent les différentes techniques utilisant
des hybridomes.
La production d'anticorps peut être obtenue chez l'animal
par immunisation des animaux par injection des peptides ou des
fragments selon l'invention, qu'ils soient naturels, recombi-
nants ou synthétiques, éventuellement après couplage à un
agent immunogène tel que l'anatoxine tétanique, ou encore par
injection de lymphocytes T humains exprimant les séquences
correspondantes à leur surface, y compris des cellules recom-
binantes transfectées avec les séquences codantes correspon-
dantes.
La présente invention a également pour objet des hybri-
domes produisant des anticorps monoclonaux dirigés contre les
polypeptides selon l'invention.
La présente invention englobe également les fragments et
les dérivés d'anticorps monoclonaux selon l'invention qui sont
réactifs avec des régions variables définies des récepteurs
des cellules T. Ces fragments sont notamment les fragments
F(ab')2 qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des
molécules d'anticorps avec la pepsine, les fragments Fab' qui
peuvent être obtenus par réduction des ponts disulfure des
fragments F(ab')2 et les fragments Fab qui peuvent être obte-
nus par clivage enzymatique des molécules d'anticorps avec la
papaïne en présence d'un agent réducteur. Les fragments peu-
vent être également obtenus par génie génétique.
Les dérivés d'anticorps monoclonaux sont par
exemple des anticorps ou des fragments de ces anticorps
auxquels sont liés des marqueurs tel qu'un radioisotope. Les
dérivés d'anticorps monoclonaux sont également des anticorps
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
~
2 ~ . ~0 ~ ~.
7 i~ ~~~~
ou des fragments de ces anticorps auxquels sont liées des
molécules thérapeutiquement actives, notamment des composés
cytotoxiques.
Les produits de l'invention trouvent plusieurs types
d'application dans le domaine du diagnostic et dans le domaine
de la thérapeutique.
1- Les applications dans le domaine du diagnostic
Les oligonucléotides contenus dans les séquences nucléo-
tidiques selon l'invention peuvent être utilisés pour consti-
tuer des sondes de détection (généralement au moins 10 nucléo-
tides) capables de s'hybrider à une région variable d'une
chaîne P ou des amorces pour l'amplification d'ADN (comportant
généralement au moins 15 nucléotides et de préférence au
moins 17 nucléotides) capables de se lier à une séquence à
amplifier.
Les oligonucléotides trouvent ainsi une application dans
le diagnostic des désordres immunitaires en détectant la
présence de séquences d'acides nucléiques homologues d'un gène
codant pour des régions variables de chaînes p des récepteurs
des cellules T dans l'ARNm d'un échantillon d'un patient.
Différentes méthodes peuvent être utilisées pour établir un
lien entre l'expression des gènes des cellules T et une
maladie. Ces méthodes comprennent
a-'la production et l'analyse de banques d'expressions
d'ADNc obtenu à partir de cellules T liées à la maladie pour
déterminer la fréquence de gènes dominants
b - l'analyse d'échantillons d'ADN génomique par Southern
blot pour déterminer s'il existe des polymorphismes génétiques
ou des réarrangements des gènes codant pour les récepteurs des
cellules T ;
c - l'analyse d'échantillons par obtention d'ADNc, âmpli-
fication par PCR et hybridation avec des sondes marquées
d - l'hybridation in situ de cellules T sans culture
préalable des cellules T.
Les amorces trouvent une application dans des réactions
de PCR dans une méthode telle que celle définie sous c.
Les anticorps monoclonaux, les fragments ou les dérivés
WO 92/13950 7 PCT/FR92/00130
J C~ 8
de ces anticorps selon l'invention peuvent être utilisés pour
étudier des réponses immunitaires de type T, par exemple dans
le domaine des maladies auto-immunes de la cancérologie, de
l'allergie, de la transplantation et des maladies infec-
tieuses. En particulier, le répertoire des différents segments
variables Q du récepteur T peut être étudié, qu'il s'agisse de
cellules T du sang ou des tissus. D'une manière générale, les
techniques utilisées peuvent être des méthodes in vitro ou in
vivo.
Dans les méthodes in vitro, les échantillons utilisés
peuvent être des échantillons de fluides corporels ou des
échantillons de tissus. Les techniques utilisées peuvent
inclure notamment la cytofluorimétrie de flux pour analyser
les lymphocytes T du sang, ou des marquages par immunopéroxy-
dase sur coupe anatomopatho-logique pour étudier les lympho-
cytes infiltrant les tissus.
Dans les méthodes in vivo, les anticorps, leurs fragments
ou leurs dérivés sont administrés par les voies habituelles,
par exemple par la voie intraveineuse, et l'on détecte les
liaisons immunospécifiques. Ceci peut être obtenu pa,F exemple
dans le cas où l'on utilise un anticorps marqué par un radio-
isotope.
2 Les applications dans le domaine thérapeutique
Les oligonucléotides contenus dans les séquences nucléo-
tidiques selon l'invention peuvent être utilisés en thérapeu-
tique comme oligonucléotides antisens. On sait en effet qu'il
est possible in vitro d'inhiber l'expression d'un gène trans-
crit dans des lymphocytes humains en incubant ces lymphocytes
avec un olignoculéotide antisens spécifique du gène en ques-
tion (30). Ces oligonucléotides antisens comprennent générale-
ment au moins 10 et de préférence au moins 16 nucléotides. Ces
oligonucléotides antisens peuvent être notamment les séquences
inversées et complémentées correspondant aux 20 nucléotides en
amont du site d'inititation de la traduction (ATG). L'intérêt
d'une utilisation in vitro d'oligonucléotides antisens spéci-
fique d'un segment génique Vp est d'abolir (ou de diminuer
,, .
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
9
fortement) l'expression d'un récepteur T compfeTlantcésegment
Vp et donc d'obtenir un phénomène de délétion clonale au
niveau de la réactivité spécifique des lymphocytes T. Les
oligonucléotides antisens peuvent non seulement être utilisés
in vitro sur des lymphocytes T humains qui sont ensuite réin-
jectés, mais également in vivo par injection locale ou systé-
mique de préférence après modification pour augmenter la
stabilité in vivo et la pénétration à l'intérieur des lympho-
cytes de ces oligonucléotides.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être
utilisés pour moduler le système immunitaire. C'est ainsi que
les anticorps peuvent être administrés pour bloquer l'inter-
action des cellules T effectrices avec leur antigène spécifi-
que. On peut également administrer des anticorps anti-récep-
teurs T liés par exemple à une molécule cytotoxique ou à un
radioisotope de façon à obtenir une délétion clonale, grâce à
la fixation spécifique sur une chaîne p d'un récepteur de
cellule T. Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent
être utilisés en thérapeutique à des concentrations faiblement
mitogéniques de façon à activer de façon spécifique certains
sous-ensembles de cellules T ou peuvent être utilisés à des
concentrations beaucoup plus élevées pour se fixer aux récep-
teurs concernés et ainsi marquer ces sous-ensembles en vue de
leur élimination par le système réticulo-endothélial. Un
critère important pour le traitement d'une maladie est l'apti-
tude à moduler des sous-ensembles de cellules T liées à une
maladie. La nature exacte de cette modulation thérapeutique, à
savoir bloquer ou supprimer un sous-ensemble particulier de
cellules T ou au contraire stimuler et activer un
sous-ensemble particulier, dépendra de la maladie en question
et du sous-ensemble spécifique de cellules T concerné.
Ce type de traitement présente un avantage par rapport
aux traitements actuels utilisant des anticorps tels que le
traitement par des anticorps anti CD3 chez des patients ayant
subi une transplantation rénale et ayant un problème de rejet,
étant donné que grâce à l'invention il n'y aura pas de modula-
tion de la totalité de la population des cellules T mais
seulement du sous-ensemble de cellules T exprimant la
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
sous-famille particulière de récepteurs de cellules T.
Par ailleurs, la réponse des cellules T étant souvent
oligoclonale, il convient généralement d'utiliser en thérapeu-
tique des "cocktails" de plusieurs anticorps.
5 On peut en outre utiliser les anticorps anti V/3 pour
sélectionner in vitro des lymphocytes T, par exemple par
passage sur une colonne contenant des billes portant l'anti-_
corps. Cette séparation de certains lymphocytes T peut être
utilisée en vue d'une mise en culture de ces lymphocytes avant
10 de les réinjecter au patient.
En outre, on peut utiliser en thérapeutique tout ou
partie des séquences peptidiques selon l'invention,
c'est-à-dire les séquences peptidiques codées par les
séquences nucléotidiques selon l'invention ou les fragments de
ces séquences (comprenant généralement au moins 8 à 10 amino-
acides). Ces séquences ou fragments administrés à l'homme ou à
l'animal, peuvent agir en tant que leurre, c'est-à-dire qu'ils
vont se fixer sur l'épitope porté par l'antigène néfaste et
empêcher la réaction des cellules T normales avec l'antigène,
en empêchant ainsi le développement d'une maladie agressive
contre les déterminants du soi. Ils peuvent aussi être uti-
lisés en tant qu'immunogènes dans la fabrication de vaccins
(éventuellement après couplage à des porteurs protéiques).
On décrira ci-après plus en détail la présente invention,
en se reportant aux Fig. annexées sur lesquelles :
- les Fig. 1 à 6 donnent en alignement à la fois des
séquences Vp connues et des séquences partielles des nouvelles
séquences selon l'invention (SEQ ID N' 6 à 19), notées IGRa 08
à IGRa 20 appartenent à des sous-familles Vp connues. Sur ces
Figures, la numérotation des nucléotides commence au codon ATG
d'initiation (qui est souligné). Les points indiquent les
nucléotides identiques. Les séquences qui sont supposées être
des séquences leader sont surlignées.
- La Fig. 7 donne les analyses par Southern blot de l'ADN
génomique traité par une enzyme de restriction en utilisant
des sondes spécifiques des sous-familles Vp. Les enzymes de
restriction utilisées sont EcoR I (colonne R), Hind III
(colonne H) et BamH I (colonne B). Sur cette Figure, les
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
il 2079881
triangles marquent les positions des fragments d'ADN
s'hybridant de façon spécifique avec Cg.
- La Fig. 8 représente la détection par autoradiographie
des transcrits amplifiés des chaînes Q du TCR exprimé par les
lymphocytes périphériques d'un individu sain, et du contrôle
0-actine co-amplifié.
- La Fig. 9 représente l'analyse par cytofluorimétrie de
la réactivité de l'anticorps monoclonal RO-73 respectivement
vis-à-vis du clone immunisant 3025 (9A), du clone 12410 (9B)
et des lymphocytes circulants (9C).
La réactivité-témoin des anticorps NKTa ou OKT3 est
donnée respectivement pour chaque type de cellule.
Le nombre de cellules comptées (échelle linéaire) est
donné en fonction de.l'intensité de la fluorescence (échelle
logarithmique).
- La Fig. 10 représente l'analyse par cytofluorimétrie de
la réactivité de l'anticorps monoclonal JtJ-74 (Fig. 10A, 10B,
10C : mêmes conditions que pour les Fig. 9A, 9B, 9C).
- La Fig. 11 représente l'analyse par cytofluorimétrie de
la comodulation avec la molécule CD3 de la structure TCR du
clone 3025 reconnue par l'anticorps monoclonal RO-73 respecti-
vement en absence (Fig. 11A) ou en présence d'anticorps anti-
CD3 (Fig. 11B).
La comodulation-témoin est donnée respectivement avec les
anticorps monoclonaux NKTa, OKT3 et anti-CD2.
- La Fig. 12 représente l'analyse par cytofluo-rimétrie
de la comodulation avec la molécule CD3 de la structure TCR du
clône 3025 reconnue par l'anticorps monoclonal JU-73, respec-
tivement en absence (Fig. 12A) ou en présence d'anticorps
anti-CD3 (Fig. 12B).
- La Fig. 13 représente la détection par autoradiographie
des transcrits amplifiés des chaînes a (Fig. 13A) et des
chaînes Q(Fig. 13B) du TCR exprimé par les cellules RO-73+.
I- Obtention de 18ADNc et amnlificatiar. par PCR
On a utilisé comme source d'ARN des lymphocytes périphé-
riques d'un individu. L'ARN total a été préparé selon la
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
:. 12
méthode à l'isothiocyanate de guanidinium et au chlorure de
césium (Chirgwin (12)) ou selon la méthode en une seule étape
par extraction avec de l'isothiocyanate de guanidinium, du
phénol et du chloroforme (Chomczynski (13)).
Le premier brin d'ADNc a été synthétisé dans un volume
final de 50 microlitres à une températur'e de 42= C pendant 1
heure en utilisant 5 microgrammes d'ARN total, la reverse
transcriptase et une amorce A spécifique de la région Cp
constituée par la séquence 5'-TATCTGGAGTCA TTGAGGGCGGGC (SEQ
ID N' 20). Ce matériau a été ensuite purifié par extraction au
phénol/chloroforme et précipitation à l'acétate d'ammonium.
Après sélection d'une fraction 0,45/1 kb sur gel d'agarose, on
a réalisé l'addition d'une extrémité dG sur l'hétéro duplex
ARN/ADNc dans un tampon d'addition COC12 avec 14 unités de
terminal désoxynucléotidyl transférase (Tdt) pendant 30 mn à
37' C. La réaction a été stoppée par maintien à 70 C pendant
10 mn. NaOH 1N (1/3 de volume) a été ajouté et l'échantillon a
été mis à incuber à 50' C pendant 1 heure pour hydrolyser
l'ARN puis a été neutralisé avec du Tris HCl 2M pH 8 et HC1
1N. Après extraction par un mélange phénol/ chloroforme le
premier brin d'ADNc à extrémité G a été précipité avec de
l'éthanol et soumis à une amplification en utilisant la tech-
nique PCR (Polymerase Chain Reaction décrite par Saiki et al.
(14)) dans un volume final de 100 microlitres contenant 50 mM
de KC1, 10 mM de Tris-Cl pH 8.3, 1,5 mM de MgC12, 0,1 %
(poids/ volume) de gélatine, 200 micromoles de dNTP, 2,5
unités de Taq polymérase et 100 picomoles de deux amorces. Les
deux amorces utilisées sont, d'une part, une amorce poly-C
(5'-GCATGCGCGCGGCC GCGGAGG-14C) (SEQ ID N' 21) décrite par Loh
et al. (15) ainsi qu'une amorce B spécifique de la région Cp
(5'-TGTGGCCAGGCATGCCAGTGTGGCC) (SEQ ID N' 22).
On effectue 25 cycles=d'amplification suivis par une
période de 15 mn d'élongation finale à 72' C. Chaque cycle
comprend une étape de dénaturation à 92' C pendant 1 minute,
une étape d'hybridation à 55' C pendânt 2 mn et une période
d'élongation à 72' C pendant 4 mn. Les produits amplifiés sont
ensuite précipités par de l'éthanol, remis en suspension dans
de l'acétate de sodium 30 mM pH5, NaCl 50 mM, ZnC12 1 mM,
CA 02079881 2002-10-01
13
glycérol 5 % en volume, et 1/10 de ce matériau est purifié en
fonction de la taille sur un gel d'agarose à bas point de
fusion 1 %.
Une seconde phase d'amplification est ensuite réalisée
directement sur approximativement 10 # de la bande contenant
l'agarose en suivant les mêmes conditions que précédemment,
sauf qu'on utilise comme amorce C spécifïque de la région Cp
l'amorce 5'-GGTGTGGGAGAA TTCTGCTTCTGA (SEQ ID N 23). Le
mélange de réaction est ensuite précipité par l'éthanol et
remis en suspension dans 60 l H20.
II - Clonage et sé ençaqe des ADNç
1/3 du produit de la seconde amplification est mis à
digérer avec Sac II, séparé sur gel d'agarose 1 % et purifié
par adsorption sur des billes de verre. Le matériau est inséré
dans le vecteur Bluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, U.S.A.)
et les recombinants obtenus sont utilisés pour transformer des
souches XL1-bleu de E. Coli (Stratagene). Après dépôt en
présence de X-gal et IPTG, on fait un test sur les colonies
blanches en utilisant une technique "dot blot" et comme sonde
un troisième oligonucléotide spécifï.que de la région CO
(5'-TCTGCTTCT GATGGCTCAA) (SEQ ID N' 24) marqué au 32 P. On
extrait l'ADN plasmidique des colonies positives et on
séquence sur les deux brins par le procédé par terminaison de
chaîne didésoxy (Sanger et al. (16)) avec de la Sequenase*2,0
(United States Biochemicals, Cleveland, Etats-Unis) en suivant
les recommandations du fournisseur.
Les séquences obtenues ont été comparées aux séquences
publiées Vp en utilisant la méthode développée par Lipman et
Pearson (17). Les codons de départ présumés ont été identifiés
en recherchant la présence de la séquence consensus Kozak pour
les sites d'initiation des traductions dans les cellules
eucaryotes (Kozak (18)). La présence de séquences leader
hydrophobes du côté N-terminal a été décelée par analyse de
l'hydrophobicité selon la méthode décrite par Kyte (19).
* (marque de commerce)
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
14
III - Analyse flar Southern blot
L'ADN a été extrait de la lignée cellulaire érythroleucé-
mique humaine K562 et mis à digérer avec l'une des enzymes de
restriction suivantes : Eco RI, BamH I ou Hind III. L'ADN (15
microgrammes) a été soumis à une électrophorèse sur agarose
0,7 % et a été transféré sur des membranes de Nylon comme
décrit par Triebel et al. (20). Les hybridations ont été
réalisées à 65' C avec 6 x SSC, 0,5 % de SDS, 5 x Denhardt's
et 100 microgrammes d'ADN de sperme de saumon dénaturé pendant
16 heures. Les membranes ontaété lavées à 65 C avec 2 x SSC,
0,2 % de SDS.
On a utilisé comme sondes Vp spécifiques des sondes
obtenues par amplification d'ADNc V-J-C en utilisant comme
amorce l'amorce poly-C et l'amorce C. Les sondes ont été
purifiées sur gel d'agarose 1 %. Des sondes d'ADN marquées au
32P ont été préparées à partir des fragments purifiés sur
agarose par la méthode de Feinberg (21).
IV - Résultats
En utilisant la méthode A-PCR, 350 ADNc qui hybrident
avec la sonde CJ3 ont été clonés, puis séquencés. Parmi
ceux-ci, 226 ADNc correspondent à des régions variables V-J-Cp
uniques.
Les séquences Vp de l'invention figurent dans la liste
des séquences sous les SEQ ID N' 2 à 19. Les séquences SEQ ID
N' 3 à 5 correspondent à 3 sous familles nouvelles tandis que
les séquences SEQ ID N' 2 et 6 à 19 correspondent à de
nouveaux membres de sous-familles Vp connues ou à des exten-
sions de segments Vp connus.
Sous-famille VQ w21 (SEQ ID N= 2)
Cette sous-famille a été identifiée par le clone IGR b02
(SEQ ID N' 2).
Cette séquence présente pour la partie codante une homo-
logie d'environ 85 ô avec la séquence HSTCRB23 (Wilson et al.
(41) ) .
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
18
correspondant à ces différentes sous-familles Vp, en vue par
exemple d'une étude de l'expression de certaines sous-familles
Vp chez un patient et finalement d'un diagnostic des désordres
inmmunitaires, comme indiqué plus haut.
L'expression prédominante de certaines sous-familles de
Vp a déjà été étudiée à l'aide d'une gamme incomplète d'oligo-
nucléotides.
Ainsi, Sottini et al. (33) ont mis en évidence à l'aide
d'une gamme d'oligonucléotides une expression prédominante de
certains Vo chez des patients atteints d'arthrite rhumatoïde.
De même, Choi Y. et al (32) ont mis en évidence à l'aide
d'une gamme d'oligonucléotides la stimulation de lymphocytes T
par des toxines deStaphylococcus aureus par l'intermédiaire
de Vo spécifiques.
La présente invention vise à fournir une gamme complète
d'oligonucléotides permettant l'étude à la fois des
sous-familles Vp connues et des nouvelles sous- familles VQ
de l'invention et qui soient tout-à-fait spécifiques de chaque
sous-famille. Les oligonucléotides ont donc été choisis et
synthétisés dans ce but et au besoin des modifications de un
ou deux nucléotides ont été introduites par rapport aux
séquences naturelles pour réduire les réactivités croisées
entre sous-familles.
La présente invention a ainsi également pour objet des
oligonucléotides, utilisables comme amorces pour l'amplifica-
tion d'ADN correspondant à des régions variables de chafnes
des récepteurs de cellules T, choisis parmi les séquences SEQ
ID N' 25 à 48.
La présente invention a également pour objet l'utilisa-
tion, comme amorces pour l'amplification d'ADN correspondant à
des régions variables de chaînes des récepteurs des cellules
T, d'oligônucléotides choisis parmi les séquences SEQ ID N' 25
à 48.
La présente invention a également pour objet un procédé
de détection de séquences nucléotidiques codant pour des
segments Vp des récepteurs T ou d'ADNc correspondant aux
produits de transcription de celles-ci, dans un échantillon
biologique, caractérisé en ce qu'il comprend
WO 92/13950 PC.T/FR92/00130
17 2~ 1 ~VC i
Sous-famille V/3 13 (Fig. 4)
SEQ ID N 13, 14 et 15 (IGR b14, IGR b15 et IGR b16)
Les séquences SEQ ID N 13 et 14 qui représentent de
nouveaux membres présentent une homologie respectivement de 78
à 91 % et de 77 à 79 % avec les autres séquences connues
HBVP34 (Kimura (23)) et CEM (Duby (26)).
La séquence SEQ ID N 15 présente une homologie de 94 %
avec HBVP34. Il est à noter que la séquence SEQ ID N 15
présente un intron (représenté en caractères minuscules) dans
la région leader. La séquence SEQ ID N' 15 est une séquence
consensus. On a observé en position 231 un C au lieu d'un T et
en position 259 un A au lieu d'un G.
Sous-famille Vp 7 (Fig. 5)
SEQ ID N 16 et 17 (IGR b17 et IGR b18)
Ces séquences présentent une forte homologie avec la
séquence PL4.19 tronquée (Concannon, déjà cité) et la prolon-
gent du côté 5' jusqu'au signal de début de la traduction.
SEQ ID N' 18 (IGR b19)
Cette sécjuence prolonge la séquence PL4.9 (Concannon,
déjà cité) du côté 5' jusqu'au signal de début de la
traduction.
Sous-famille Vp 9 (Fig. 6)
SEQ ID N' 19 (IGR b20)
Cette séquence prolonge la séquence PL2.6 (Concannon,
déjà cité) du côté 5'. on'observe une différence entre les
deux séquences aux positions 98 et 100 correspondant à des
aminoacides différents.
La présente invention vise également à fournir des oligo-
nucléotides spécifiques des différentes sous-familles VQ, qui
sont utilisables comme amorces pour l'amplification d'ADN
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
15 I
a
Sous-famille VQ w22 (SEQ ID N' 3)
Le segment SEQ ID N 3 a été défini comme séquence
consensus à partir de 23 clones distincts d'ADNc. On a observé
en position 322 un C au lieu d'un T et en position 350 un A au
lieu d'un G.
Sous-famille VQ w23 (SEQ ID N= 4)
Le segment ID N' 4 a été défini comme séquence consensus
à partir de 4 clones distincts. On a observé en position 154
un G au lieu d'un A et en position 160 un A au lieu d'un G. Il
présente une homologie de 75,7 % avec la séquence VB12A1
(Leiden déjà cité) mais présente une homologie inférieure à
75 % avec les autres membres de la sous-famille VQ 5 (repré-
sentés sur la Fig. 1). Il ne fait donc pas partie de la sous-
famille VQ 5.
Sous-famille Vp w24 (SEQ ID N' 5)
Le segment SEQ ID N' 5 a été défini à partir de 2 clones
distincts d'ADNc.
Les analyses par Southern blot d'ADN de lignée germinale
soumis à une digestion par les endonucléases, en utilisant des
sondes V-J-Cp comprenant des fragments Vp correspondant aux
sous-familles Vp w21 à Vp w24 ont été réalisées dans des
conditions d'hybridation de "faible stringence" pour identi-
fier le nombre de segments géniques Vp appartenant à chaque
famille et pour caractériser des fragments de restriction
d'ADN portant ces segments géniques Vp. Des résultats repré-
sentatifs sont reportés sur la Figure 7.
Ces analyses sont compatibles avec la présence dans les
cellules érythroleucémiques K 562 d'au moins trois segments
géniques pour la sous-famille V w21, deux pour la
sous-famille Vp w23 et un pour les sous-familles Vp w22 et Vp
w24.
Les tailles des fragments de restriction de l'ADN
germinal sont les suivantes :
Vp w21 : EcoR I 1,7-,3- et 6,5 kb, Hind III 2,5-, 7,2-, 11,7-,
14- et 18 kb, BamH 1 5,5-, 16,5- et 23 kb;
WO 92/13950 2 0'~ ~ ~ 8,L PCT/FR92/00130
16
V,B w22 ; EcoR I 2,8 kb, Hind III 8,8 kb, BamH I 5,3 kb;
V,6 w23 : EcoR I 3,2- et 4,4 kb, Hind III 7,4-,15,5- et 16,5
kb, BamH I 2,5- et 5,7 kb ;
Vo w24 : EcoR I 8 kb, Hind III 20 kb et 7,3 kb, BamH I 11,- et
22 kb.
Sous-famille VQ 5 (Fig. 1) :
SEQ ID N' 6 et 7 (IGR b06 et IGR b07)
Ces séquences présentent une homologie respectivement de
79 à 86 % et de 76 à 70 % avec les 4 segments précédemment
connus VB12A1 (Leiden déjà cité), HBP51 (Kimura (23)), PH24
(Tillinghast déjà cité) et PL25 (Concannon (24)) et représen-
tent de nouveaux membres.
SEQ ID N 8 et 9 (IGR b08 et IGR b09)
Ces séquences correspondent à des extensions du côté 5'
des clones VB12A1 et PL25 respectivement. Pour SEQ ID N' 8
deux substitutions de nucléotides sont observées par rapport à
VB12A1.
Sous-famille VQ 6 (Fig. 2)
SEQ ID N' 10 (IGR bll)
Cette séquence correspond à une extension du côté 5' du
clone HBP25 (Kimura, déjà cité).
SEQ ID N' 11 (IGR b12)
Cette séquence qui représente un nouveau membre présente
une homologie des nucléotides de 94 % avec PH 16 (Tillinghast,
déjà cité), GPPA (Li, déjà cité) et HT45 (Kimura (25)).
Sous-famille Vp 12 (Fig. 3) :
-35 SEQ ID N' 12 (IGR bl3),
Cette séquence qui représente un nouveau membre corres-
pond à plus de 85 % d'homologie avec les séquences PH27
(Tillinghast, déjà cité) et PL42 (Concannon, déjà cité).
WO 92/13950 PCI'/FR92/00130
19 20 7 9 I31 8; 1.
a) l'amplification de l'ADN avec au moins une paire d'amorces
formée par l'un des oligonucléotides définis ci-dessus et un
oligonucléotide appartenant au segment Cp, et
b) la détection des séquences amplifiées avec une sonde CQ.
L'oligonucléotide appartenant un segment Cp utilisé
pour l'amplification peut être notamment choisi parmi les
séquences SEQ ID N 49 et 50.
Pour contrôler l'efficacité de l'amplification, on opère
avantageusement en présence d'une paire d'amorces contrôle et
on détecte la séquence contrôle correspondante amplifiée à
l'aide d'une sonde contrôle correspondante.
Cette paire d'amorces contrôle peut correspondre à deux
segments Ca, par exemple les amorces CaE et CaJ correspondant
aux séquences SEQ ID N 55 et 56. On utilise alors une sonde
de détection Ca (correspondant par exemple à la séquence SEQ
ID N' 57). Mais cette paire d'amorces est avantageusement
constituée par deux amorces appartenant à la p-actine, notam-
ment celles correspondant aux séquences SEQ ID N' 52 et 53. On
utilise alors une sonde de détection correspondant à une
séquence de la /j-actine, telle la séquence SEQ ID N' 54.
La présente invention a également pour objet un kit de
diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé précédemment
défini, qui comprend
a) au moins un oligonucléotide choisi parmi les séquences SEQ
ID N' 25 à 48,
b) une amorce Cp,
c) une sonde Cp.
Un tel kit contient avantageusement en outre
d) une paire d'amorces contrôle,
e) une sonde contrôle.
Ce kit peut notamment comprendre
a) l'ensemble des 24 oligonucléotides correspondant aux
séquences SEQ ID N' 25 à 48,
b) une amorce Cp choisie parmi les séquences correspondant aux
séquences SEQ ID 49 et 50,
c) une paire d'amorces contrôle pour la p-actine ayant une
séquence correspondant respectivement aux séquences SEQ ID N'
52 et 53,
WO 92/13950 ~j ~ ry ~~~j ~ PCT/FR92/00130
(~ ( 20
d) une sonde C/3 correspondant à la séquence SEQ ID N 51,
e) une sonde contrôle pour la p-actine correspondant à la
séquence SEQ ID N 54.
Dans l'information donnée dans la liste des séquences
pour les séquences 25 à 54, les séquences SEQ ID N 25 à 45
correspondent à des séquences appartenant à des clones des
sous-familles connues Vp 1 à VQ 20 (accessibles dans la base
de données EMBL) ou à des séquences qui en diffèrent par un ou
deux nucléotides. Les séquences SEQ ID N' 45, 46, 47 et 48
correspondent à des séquences appartenant à des clones de
nouvelles sous-familles de l'invention, correspondent à des
sous-familles dénommées provisoirement Vp w2l, Vp w22, VQ w23
et VQ w24 (w indiquant que la désignation est dans l'attente
d'une désignation définitive).
Les séquences SEQ ID N 49 et 50 sont deux exemples
d'oligonucléotides Cp qui peuvent être utilisés comme amorces
pour l'amplification.
La séquence SEQ ID N 51 est la séquence d'une sonde CQ
qui peut être utilisée pour la détection des ADN amplifiés.
Enfin, les séquences SEQ ID N 52, 53 et 54 sont respec-
tivement les séquences d'une paire d'oligonucléotides appar-
tenant à la séquence de la p-actine qui peuvent être utilisés
pour le contrôle de l'amplification et la séquence d'une sonde
pour détecter les ADN amplifiés correspondants.
Dans la liste des séquences la position indiquée est la
position de l'extrémité 5' à compter du site d'initiation
prédictif de la traduction ATG. Dans le cas où les séquences
sont incomplètes (région 5' inconnue), la position (marquée
avec un astérisque) est donnée par rapport au premier nucléo-
tide de la séquence. Les nucléotides soulignés correspondent
aux mésappariements introduits par rapport à la séquence
naturelle.
Les oligonucléotides ont été synthétisés sur un synthéti-
seur d'ADN automatisé Applied Biosystems 381 A en utilisant la
méthode au p-cyanoéthylphosphoramidite (Sinha N. et al.
(34)) et en suivant le protocole recommandé par le fabricant.
Les oligonucléotides ont été détritylés dans l'appareil,
clivés du support et déprotégés par l'ammoniac (à 60 C
CA 02079881 2002-10-01
21
pendant 5 heures). Les produits bruts ont été purifiés par
chromatographie haute pression en phase inversée sur une
colonne de -bondapak C18*en utilisant un gradient d'acétoni-
trile (9 à 15 %) dans un tampon acétate de triéthylammonium
0,01 M à pH 5,5.
L'amplification effectuée en utilisant les amorces selon
l'invention peut être notamment la technique d'amplification
par PCR (Polymerase Chain Reaction) telle que décrite par
Saiki et al. (14) et brevets US-A-4 683 195, 4 683 202,
4 889 818.
Pour la PCR, on peut utiliser un ADN double brin que l'on
dénature ou un ADNc obtenu à partir d'ARN à l'aide de réverse
transcriptase comme mentionné plus haut.
L'agent de polymérisation est une ADN polymérase, notam-
ment la Taq polymérase.
Généralement, le cycle d'amplification est répété 25 à 40
fois.
Les sondes que l'on utilise pour la détection des
séquences amplifiées peuvent être obtenues par marquage
d'oligonucléotides avec un isotope radioactif, ce qui conduit
à une détection par autoradiographie, ou par couplage avec une
enzyme telle que la peroxydase (système ECL Amersham), la
phosphatase alcaline ou la p-galactosidase (système Tropix
Ozyme), ce qui conduit à une détection par chimioluminescence.
L'exemple suivant illustre la mise en oeuvre du procédé
de détection selon l'invention.
Les lymphocytes périphériques d'un individu sain ont été
préparés par centrifugation sur un gradient de densité. L'ARN
total a été extrait selon la méthode en une seule étape par
extraction avec de l'isothiocyanate de guanidium, du phénol et
du chloroforme (Chomczynski, 13). L'ADN complémentaire a été
synthétisé dans un volume final de 20 l à 42 C durant 1
heure en utilisant 1 à 5 g d'ARN total, la réverse transcrip-
tase et l'amorce CQ B (1,25 M).
Le matériel obtenu a ensuite été chauffé à 95' C durant 3
minutes avant d'être soumis à une amplification selon la
technique PCR en utilisant en parallèle chacune des amorces Vp
spécifiques correspondant aux séquences SEQ ID N 25 à 48 et
* (marque de commerce)
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
207Q881. 22
l'amorce Cp B spécifique de la région Cp (SEQ ID N 50).
Cette amplification a été réalisée dans un volume final de 10
l par tube contenant 50 mM de KC1, 10 mM de tris-HC1 pH 8,3,
1,5 mM de MgC12 0,1 % (poids/ volume) de gélatine, 200 M de
dNTP, 0,25 unités de Taq polymérase et 0,25 M de chaque
amorce. Dans chaque tube, une amplification contrôle a été
réalisée à partir de 25 mM d'un fragment d'ADN de p-actine de
877 paires de bases préparé par PCR et des amorces Act 1 et
Act 2 (SEQ ID N' 52 et 53) spécifiques de l'actine. 30 cycles
d'amplification ont été effectués suivis d'une étape d'élon-
gation finale de 5 minutes à 72 C. Chaque cycle comprenait
une étape de dénaturation à 94 C pendant 1 minute, une étape
d'hybridation à 65 C pendant 1 minute et une période d'élon-
gation à 72 C pendant 1 minute.
Les produits obtenus ont été séparés par électrophorèse
sur un gel d'agarose à 2 %, transférés sur des membranes de
nylon dans un tampon alcalin et hybridés simultanément.avec
les sondes oligonucléotides CPC (SEQ ID N' 51) et Act 3 (SEQ
ID N= 54) marquées au 32P par l'enzyme polynucléotidyl T4
kinase. L'hybridation a été réalisée à 42 C pendant 16 heures
dans un tampon contenant 6 x SSC, 0,5 % SDS, 5 x Denhart's,
0,05 % P04H2Na et 100 g/ml d'ADN de sperme de saumon
dénaturé. Les membranes ont ensuite été lavées avec du 6 x
SSC, 20mM P04H2Na, deux fois à température ambiante pendant 5
minutes et une fois à 50 C pendant 30 minutes puis autoradio-
graphiées.
Les résultats obtenus sont indiqués sur la figure 8.
Le contrôle d'actine (bande de 877 paires de bases)
permet de vérifier l'amplification dans tous les puits. Il
apparaît en-dessous de cette bande un signal spécifique dont
la taille correspond à la taille des fragments amplifiés
corespondants, chaque fragment ayant une longueur correspon-
dant à la distance entre l'emplacement de l'oligonucléotide
spécifique Vp et l'amorce Cp.
Chez l'individu testé, la Figure 8 met en
évidence l'expression préférentielle de certains segments
géniques définis par rapport à d'autres. Par exemple, les
sous-familles Vp 1 et 2 sont plus représentées que les autres
WO 92/13950 PCr/FR92/00130
23 207(01891.
sous-familles.
Exemple de orécaration d'anticorps monoclonaux anti VQ13 :
anticorps monoclonaux RO-73 et Jû-74
1) Cellules immunisantes
Le clone T'3025 (Moebius et al. (35)) a été cultivé en
milieu complet comprenant du DMEM (Seromed), 8 % de sérum
humain AB, de l'IL-2 et du TCGF comme décrit par Hercend et
al. (36). Des restimulations périodiques ont été effectuées
sur cellules allogéniques en présence d'IL-2. Les ARN messa-
gers codant pour le récepteur T exprimés par ces cellules ont
été séquencés par la technique d'A-PCR et représentent des
réarrangements des segments géniques ValO (séquence HAP58,
Yoshikai et al. (37)) et V/313 (séquence IGRb16=SEQ ID N 15
indiquée ci-dessus).
2) Immunisation des souris
Des souris Biozzi de 6 semaines (Institut Curie, Paris,
France) ont été immunisées avec les cellules T entières du
clone 3025. Après une première injection intrapéritonéale de 5
x 106 cellules en adjuvant complet de Freund, les souris ont
reçu trois injections intrapérito-néales de 5 x 106 cellules
en adjuvant incomplet de Freund à trois semaines d'intervalle.
Deux semaines après la dernière injection intrapéritonéale,
les souris ont reçu 2 x 106 cellules viables en injection
intraveineuse. Les souris ont été sacrifiées trois jours plus
tard et la rate a été prélevée.
3) Fusion
La fusion des cellules spléniques avec le myélome non
secrétant NS-1 a été menée selon la méthode de Kohler et
Milstein (38). Les cellules NS-1 (Kohler et Milstein (39)) ont
été cultivées en milieu comprenant du DMEM (Seromed), de la 8-
azaguanine (Sigma, Saint Louis, MI), 10 % de sérum de cheval
(Seromed, lot n 5Z04), de la pénicilline et de la strepto-
mycine (Eurobio), de la glutamine (Seromed, 200 mM) et du
pyruvate de sodium (Gibco, 100 mM).
WO 92/13950 2 ~ ,,~ ~ PCT/FR92/00130
Cl(' 24
Les spénocytes ont été fusionnés avec les cellules NS-1
par le polyéthylène-glycol (PEG 1000, Merck) avec un rapport
de 4 cellules spléniques pour une cellule de myélome. Après la
fusion, les cellules ont été cultivées à 3 x 106 cellules par
ml en plaques de 96 puits (Nunc) dans un milieu de sélection
HAT contenant du DMEM, 10 % de sérum de cheval, 10 % de sérum
de veau foetal (Seromed, lot n 219195), de l'aminoptérine
(Gibco), de l'hypoxanthine et de la thymidine (Gibco), de la
pénicilline et de la streptomycine, de la glutamine, du pyru-
vate de sodium et du NCTC 109 (Eurobio). Du milieu frais a été
ajouté dans les puits 2 jours (50 Ml par puits) et 9 jours
après la fusion (100 l par puits). La culture a été réalisée
à 37" C, dans un incubateur contenant 10 % de C02.
4) Criblage des hybridomes
Le surnageant des hybridomes obtenus a été récolté 15
jours après la fusion et testé pour sa réacti-vité avec la
cellule immunisante par immunofluorescence indirecte et ana-
lyse en cytométrie de flux. En bref, les cellules T3025 ont
été incubées à 4' C pendant 30 minutes avec le surnageant
d'hybridome (100 l pour 300 000 cellules), lavées et marquées
avec un anticorps de chèvre anti-immunoglobulines de souris
conjugué à la fluoresceine (Coulter Electronics, Hialeah, FL).
Les cellules ont ensuite été analysées par cytofluorométrie
(Coulter Profile). Comme le montrent les figures 9A et 10A,
les surnageants des hybridomes RO-73 et JU-74 permettent le
marquage de 100 % des cellules du clone immunisant 3025. Un
anticorps anti-CD3 (OKT3 Ortho-Co) et l'anticorps anti-clono-
type NKTa (IgG1, Hercend et al. (40)) servaient respectivement
de contrôles positif et négatif dans cette expérience.
5) Spécificité anti-récepteur T
La spécificité anti-récepteur T des anticorps monoclonaux
a été analysée selon les critères suivants :
1 - les anticorps doivent reconnaître le clone T 3025
immunisant mais pas un clone T portant un récepteur des
cellules T (TCR) différent, par exemple le clone 12410
(Moebius et al., (35), TCR exprimé : Va3/Va17).
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
25 2~~~9c"81
2 - Les anticorps doivent réagir avec un faible pourcen-
tage de lymphocytes circulants (PBL).
3 - La structure de surface reconnue par les anticorps
sur la cellule immunisante doit co-moduler avec la molécule
CD3 lors de l'incubation des cellules en présence d'anticorps
anti-CD3 (Meuer et al. (1)).
Comme le montrent les figures 9 et 10, les surnageants
des hybridomes RO-73 et JU-74 réagissent avec 100 % des
cellules du clone 3025 immunisant (Fig. 9A et 10A), moins de 2
% des cellules du clone 12410 (Fig. 9B et 10B) et 1 à 3 % des
PBL (Fig. 9C et 10C).
Pour les expériences de co-modulation, les cellules du
clone 3025 (106 cellules par ml) ont été incubées en milieu
seul ou en présence d'anticorps anti-CD3 (OKT3) dans des
plaques de culture de 24 puits. Après 24 heures d'incubation,
les cellules ont été récoltées et marquées avec le surnageant
d'hybridome RO-73 ou JU-74, l'anticorps monoclonal anti-CD3 ou
un anticorps monoclonal contrôle anti-CD2 (Coultronics Co.)
puis analysées par cytofluorimétrie. Comme le montrent les
Figures 11 et 12, l'analyse par cytofluorimétrie des cellules
incubées en présence d'anticorps monoclonal anti-CD3 (Fig. 11B
et 12B) montre une diminution de l'intensité de fluorescence
pour l'anticorps monoclonal anti-CD3 ainsi que pour RO-73 et
JU-74, alors que l'intensité du marquage avec l'anticorps
monoclonal anti-CD2 augmente par comparaison à l'intensité
obtenue respectivement en absence d'anticorps anti-CD3 (Fig.
11A et Fig. 11B). Ces résultats indiquent que la molécule
reconnue par les anticorps RO-73 et JU-74 co-module avec la
molécule CD3 à la surface des cellules du clone T 3025.
6) Isolement d'un sous-clone
Les cellules des hybridomes initiaux, respectivement RO-
73 et JU-74, ont été réparties en plaques de culture à raison
de 0,5 cellule par puits en milieu HAT complet, sur des
cellules spléniques syngéniques irradiées. 3 sous-clones ont
été sélectionnés pour chacun des hybridomes RO-73 et JU-74.
Ces cellules produisent des anticorps monoclonaux dont la
réactivité est identique à celle des hybridomes initiaux
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
26
(résultats non montrés).
Les sous-clones ont été cultivés en milieu non sélectif
contenant du DMEM, 10 % de sérum de veau foetal, 10 % de sérum
de cheval, de l'hypoxanthine, de la thymidine, de la pénicil-
line et de la streptomycine, de la glutamine, du pyruvate de
sodium et du NCTC 109.
Les cellules d'hybridomes ou de sous-clones ont été
congelées dans du sérum de veau foetal contenant 10 % de di-
méthyl-sulfoxyde (DMSO, Merck) et conservées dans l'azote
10.liquide.
7) Isotypage des anticorps monoclonaux
Les isotypes ont été déterminés par immunodiffusion sur
support solide en utilisant un kit "INNO-LIA mouse mAb
isotyping" (Innogenetics) pour la détermination des isotypes
d'immunoglobulines dans les surnageants de culture. RO-73 et
JU-74 sont des immunoglobulines de souris d'isotype IgGl,
kappa.
8) Purification des anticorps monoclonaux
Des ascites ont été produites dans des souris nudes. Le
liquide d'ascite obtenu a été filtré sur coton pour éliminer
la fibrine et précipité par le sulfate de sodium (18 %). Le
culot obtenu a été mis en suspension dans du tampon PBS, dilué
1/3 dans du tampon (NaCl 4,5 M, glycine 2,25 M, pH 8,8) et
chargé sur une colonne de Protéine A-Sepharose 4 Fast Flow
équilibrée dans le tampon de charge (NaCl 3M, glycine 1,5 M,
pH 8,8). Un pic majoritaire d'immunoglobulines a été élué à pH
6 en utilisant des tampons d'élution successifs de pH décrois-
sant. Ce pic majoritaire a été purifié sur colonne échangeuse
d'ions (Q Sepharose Fast Flow) en tampon Tris 50 mM, pH 8 et
élué par un gradient de NaCl.
La pureté de la préparation a été vérifiée par électro-
phorèse dans un système PHAST (Pharmacia LKB, Uppsala, Suède)
et les immunoglobulines purifiées ont été testées en immuno-
fluorescence indirecte sur la cellule 3025, comme indiqué
précédemment.
A titre d'exemple, pour 30 ml d'ascite de l'hybridome RO-
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
20 7~a~~ j.
27
73, on obtient après purification sur Proteine A et Q
Sepharose Fast Flow, 32 mg d'immunoglobulines purifiées.
9) Pourcentage de PBL reconnus par les anticorps
monoclonaux
Les pourcentages de lymphocytes circulants reconnus
respectivement par les anticorps monoclonaux RO-73 et JU-74
ont été déterminés pour 10 donneurs sains différents. Les
résultats sont montrés dans le Tableau 1. L'anticorps monoclo-
nal JU-74 reconnaît moins de 0,5 % à 2,1 % des PBL (moyenne
1,08 %) et l'anticorps monoclonal RO-73 reconnaît de 0,5 % à
2,2 % des PBL selon les individus (moyenne 1,09 %). Pour un
individu donné, les anticorps monoclonaux RO-73 et JU-74
reconnaissent respectivement environ les mêmes pourcentages de
lymphocytes circulants.
TABLEAU 1
Réactivité des anticorps monoclonaux RO-73 et JII-74
avec les cellules du sang périphériques
Donneur RO-73 JII-74
BQ 2,2 2,1
BY 0,9 1,1
BZ <0,5 <0,5
CA 0,5 <0,5
CB 0,5 0,6
CD l,8 1,7
CE 0,4 0,3
CH 1,6 1,3
CI 1,4 1,2
CJ 1,1 1,5
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
28
10) Purification des PBL reconnus par les anticorps
monoclonaux
Les PBL reconnus respectivement par les anticorps mono-
clonaux RO-73 et JU-74 ont été purifiés à partir d'un donneur
normal en utilisant un procédé de sélection positive par des
billes magnétiques (Dynabeads, Dynal). En bref, 1 à 4 x 109
PBL ont été marqués par l'un ou l'autre des anticorps monoclo-
naux purifiés ci-dessus et incubés avec les billes Dynabeads
M-450 prêtes à l'emploi recouvertes par un sérum de chèvre
anti-IgG de souris, dans la proportion de 3 billes pour une
cellule marquée. Les cellules positives ont ensuite été
séparées grâce à un aimant. Après plusieurs lavages, les
cellules ont été incubées avec un excès d'immunoglobulines de
chèvre anti-IgG de souris ("Detach-a-beads", Dynatech) pour
détacher les billes magnétiques puis directement analysées en
cytométrie de flux après marquage par l'anticorps monoclonal
RO-73 ou l'anticorps monoclonal JU-74, respectivement.
Les cellules positives sélectionnées ont été cultivées en
microplaque en présence d'IL-2 sur des cellules allogéniques
irradiées puis à nouveau purifiées par les billes magnétiques
après environ une semaine de culture afin d'obtenir une prépa-
ration d'une pureté supérieure à 95 %.
Pour l'anticorps monoclonal JU-74, 8 x 106 cellules
positives à 96 % de pureté ont été obtenues, après une culture
d'une semaine, à partir de 1 x 109 PBL d'un donneur sain
contenant initialement 1,7 % de cellules JU-74+.
Pour l'anticorps monoclonal RO-73, 9 x 106 cellules
positives à 98 % de pureté ont été obtenues, après 10 jours de
culture, à partir de 1,2 x 109 PBL d'un donneur sain contenant
initialement 2,4 % de cellules RO-73+.
A partir des cellules RO-73+ et JU-74+ purifiées ainsi
sélectionnées, des lignées cellulaires ont été respectivement
établies; chaque lignée est reconnue à 100 % par les deux
anticorps monoclonaux, ce qui montre que les deux anticorps
monoclonaux reconnaissent les mêmes cellules dans le sang
périphérique.
WO 92/13950 PCI'/FR92/00130
29 2R3 7988i
11) Analyse des transcrits du TCR exprimés dans les PBL
reconnus par RO-73 et JU-74 par les techniques de PCR
a) Méthode d'analyse des transcrits p
La gamme des oligonucléotides spécifiques des segments VQ
de type Vp1 à VQ24 décrite ci-dessus (SEQ ID N 25 à N' 48) a
été utilisée comme amorces spécifiques pour analyser les
transcrits Q du TCR exprimés dans les cellules RO-73+ et JU-
74+. La procédure employée est identique à celle décrite dans
l'exemple ci-dessus pour les lymphocytes périphériques d'un
individu sain. En bref, après préparation de l'ARN selon la
méthode de Chomczynski (13), l'ADN complémentaire a été syn-
thétisé en utilisant la réverse transcriptase et l'amorce Cp B
(SEQ ID N 50). Le matériel obtenu a été soumis à 30 cycles
d'amplification selon la technique PCR en utilisant en paral-
lèle chacune des amorces Vp spécifiques correspondant aux
séquences SEQ ID N 25 à 48 et l'amorce C,0 B spécifique de la
région CQ (SEQ ID N 50) comme décrit précédemment.
Les produits amplifiés obtenus ont été séparés par élec-
trophorèse sur un gel d'agarose à 2 %, transférés sur des
membranes de nylon et hybridés avec la sonde oligonucléoti-
dique CQ C (SEQ ID N 51) marquée au 32P. Les membranes ont
ensuite été lavées comme décrit ci-dessus puis autoradiogra-
phiées.
Le séquençage des transcrits de la chaîne p des TCR a été
réalisé en suivant la méthode de clonage et de séquençage
décrite précédemment~pour l'ADNc. Par exemple, le matériel
amplifié par l'oligonucléotide spécifique de la sous-famille
V013 (SEQ ID N 37) a été digéré par l'enzyme SacII et purifié
par électrophorèse sur gel d'agarose. Le matériel obtenu a été
introduit dans le vecteur pBS SK+ (comme décrit plus haut pour
la technique d'A-PCR] et utilisé pour transfecter les bacté-
ries E. Coli XL-1-blue. Les colonies transformées obtenues ont
été testées par hybridation en dot-blot en utilisant la sonde
oligonucléotidique Cp C (SEQ ID N' 51) marquée au 32P. L'ADN
plasmidique a été séquencé comme décrit précédemment.
b) Méthode d'analyse des transcrits a
Une méthodologie semblable à celle décrite pour les
,
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
20 6~à3f,C~ 30
transcrits Q a été appliquée à l'analyse des-transcrits de la
chaîne a du TCR en utilisant comme amorces spécifiques une
gamme d'oligonucléotides spécifiques des segments Va de type
Val à Va29 et des oligonucléotides spécifiques de la région
constante Ca (oligonucléotide Ca B pour la synthèse de l'ADN
complémentaire et l'amplification par PCR et oligonucléotide
Ca C pour la sonde de détection). Les séquences de ces oligo-
.nucléotides sont indiquées dans le Tableau 2.
TABLEAU 2
Sequence Zype
5'-GGCATTAACGGTTTTGAGGCTGGA-3' Val
5'-CAGTGTTCCAGAGGGAGCCATTGÇ-3' Va2
5'-CCGGGCAGCAGACACTGCTTCTTA-3' Va3
5'-TTGGTATCGACAGCTTCCCTCCCA-3' Va4
5'-CGGCCACCCTGACCTGCAACTATA-3' Va5
5'-TCCGCCAACCTTGTCATCTCCGCT-3' Vaô
5'-GCAACATGÇTGGCGGAGCACCCAC-3' Va7
5'-CATTCGTTCAAATGTGGGCAAAAG-3' Va8
5'-CCAGTACTCCAGACAACGCCTGCA-3' Va9
5'-CACTGCGGCCCAGCCTGGTGATAC-3' Va10
5'-CGCTGCTCATCCTCCAGGTGCGGG-3' Va11
5'-TCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCA-3' Va1Z
5'-TTCATCAAAACCCTTGGGGACAGC-3' Va13
5'-CCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTT-3' Va14
5'-TTGCAGACACCGAGACTGGGGACT-3' Va15
5'-TCAACGTTGCTGAAGGGAATCCTC-3' Va16
5'-TGGGAAAGGCCGTGCATTATTGAT-3' Va17
5'-CAGCACCAATTTCACCTGCAGCTT-3' Va18
~5'-ACACTGGCTGCAACAGCATCCAGG-3' Va19
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
40=i
31 2 ~i~ ~; ry t'
TABLEAU 2 (suite)
Sequence Zype
5'-TCCCTGTTTATCCCTGCCGACAGA-3' Va20
5'-AGCAAAATTCACCATCCCTGAGCG-3' Va2'
5'-CCTGAAAGCCACGAAGGCTGATGA-3' Va22
5'-TGCCTCGCTGGATAAATCATCAGG-3' Vccg 2 3
5'-CTGGATGCAGACACAAAGCAGAGC-3' Va:w24
5'-TGGCTAÇGGTACAAGCÇGGACCCT-3' Va,w25
5'-AGC,GCAGCCATGCAGGCAT.gTACC-3' Vaw26
5'-AAGCCCGTCTCAGCACCCTCCACA-3' Vaw27
5'-TGGTTGTGCACGAGÇGAGACACTG-3' Vay28
5'-GAAGGGTGGAGAACAGATGCGTCG-3' Va,p+29
5'-ATACACATCAGAATTCTTACTTTG-3' Ce
5'-GTTGCTCCAGGCCGCGGCACTGTT-3' CaB
5'-GTCACTGGATTTAGAGTCT-3' CaC
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
32
c) Résultats
La Figure 13 montre les résultats obtenus pour l'analyse
des transcrits des chaînes c(Fig. 13 A) et des chaînes p
(Fig. 13B) du TCR exprimés par les cellules RO-73+ reconnues
par l'anticorps monoclonal RO-73. On constate que de nombreux
segments Va différents sont exprimés dans ces cellules (Figure
13A). Par contre, seul l'oligonucléotide spécifique des
séquences de la-sous-famille VP13 permet une amplification de
l'ADNc (Figure 13B).
Des résultats identiques ont été obtenus pour les
transcrits Q du TCR exprimés dans les cellules JU-74+ recon-
nues par l'anticorps monoclonal JU-74 (résultats non montrés).
De plus, les transcrits p qui correspondent à la sous-
famille VP13 exprimés par les cellules JU-74+ ont été
séquencés à partir des cellules isolées précédemment afin de
déterminer, parmi les 5 membres connus ou nouveaux de la sous-
famille VP13 (Figure 4), ceux dont les produits sont reconnus
par l'anticorps monoclonal JU-74. Le tableau 3 montre les
résultats obtenus après analyse de ces séquences. Les huit
séquences différentes de VP13 obtenues correspondent toutes à
un réarrangement du segment génique nouveau V013 IGRb16 (SEQ
ID N' 15) avec des segments J et des régions N différents.
30
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
33
TABLEAU 3
Expression des transcrits de la chaîne dans les cellules JU-74+
ADNo Vp membre Jp Region
clones N
B001 13 IGRb16I J2.1 +
B002 13 IGRb16I J1.6 +
B006 13 IGRb16I Jl.l +
B007 13 IGRb16I J2.1 +
B009 13 IGRbl6I J1.6 +
BO10 13 IGRb16I J2.6 +
BO11 13 IGRbl6I J1.3 +
B012 13 IGRb16I J1.2 +
L'ensemble de ces résultats montre que les anticorps
monoclonaux RO-73 et JU-74 sont spécifiques des produits de
segments géniques appartenant à la sous-famille V013.
Plus précisément, les anticorps monoclonaux JU-74 et RO-
73 ont la méme spécificité et reconnaissent exclusivement le
produit du segment génique nouveau VQ13 IGRb16 de l'invention
(SEQ ID N 15 indiquée ci-dessus).
Les lignées cellulaires hybridomes suivantes ont été
déposées auprès de la Collection Nationale de Culture de
Microorganismes (CNCM - Institut Pasteur) : JU-74 et RO-73 le
12 février 1992 sous les numéros I-1173 et 1-1172
CA 02079881 2005-10-14
34
REFERENCES
1. Meuer, S.C., et al., J. Exp. Med. 1983. 157:705.
2. Moingeon, P., et al., Nature 1986a. 323:638.
3. Brenner, M.B., et al., Nature 1986. 322:145.
4. Bank, I., et al., Nature 1986. 322:179.
5. Davis, M.M., et al., Nature 1988.334:395.
6. Crews, S., et al., Cell 1981. 25:59.
7. Wilson, R.K., et al., Immunological Reviews 1988c.
101:149.
S. Robinson, M.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989.
86:9422.
9. Leiden, J.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1986. 83:4456.
11. Li, Y., et al., J. Exp. Med. 1990. 171:221.
12. Chirgwin, J.M., et al., Biochemistry 1979. 18:5294
13. Chomczynski et al., Anal. Biochem., 1987, 162, 156.
14. Saiki, R.K., et al., Science 1988. 239:487.
15. Loh, E.Y., et al., Science 1989. 243:217.
16. Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1977. 74:5463.
17. Lipman, D.J., et al., Science 1985. 227:1435.
18. Kozak, M., Nucl. Acids Res. 1984. 12:857.
19. Kyte, J., et al., R.F., J. Mol. Biol. 1982. 157:105.
20. Triebel, F., et al., J. Immun. 1988. 140:300.
21. Feinberg, A.P., et al., Anal. Biochem. 1983. 132:6.
22. Tillinghast, J.P., et al., Science 1986. 248:879.
23. Kimura, N., et al., J. Exp. Med. 1986. 164:739.
24. Concannon, P., et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 1986.
83:6598-6602.
25. Kimura, N., et al., Eur. J. Immunol. 1987. 17:375
26. Duby, A.D., et al., proc. natl. Acad. Sc. USA
1986. 83:4890.
27. Naudenbark A., et al., Nature, 341, 541.
28. Janeway C., Nature, 341, 482.
29. Lin Y., J. Exp. Med., 171, 221.
30. Acha-Orbea H., EMBO, 1990, 9,12, 3815.
31. Kappler J., Science, 244, 811.
32. Choi Y., PNAS, 86, 8941.
WO 92/13950 PCf/FR92/00130
35 ~~'~-~- I
jM iQ<~ J lJ -1,
33. Sottini A. et al., Eur. J. Immunol., 1991, 21,
461.
34. Sinha N. et al., Nucleic. Acids Res. 1984, 12,
4539.
35. Moebius, U. et al., Eur. J. immunol. 1990, 20, 889.
36. Hercend, T. et al., Cellular Immunol., 1984, 86, 381.
37. Yoshikai, Y. et al., J. Exp. med., 1986, 164, 90.
38. Kohler, G. et Milstein, C., Nature, 1975, 56, 495.
39. Kohler, G. et Milstein, C., Eur. J. immunol., 1976,
511.
40. Hercend, T. et al., J. Exp. Med., 158, 1983, 1547.
41. Wilson, R.K. et al., Immunogenetics, 1990, 32, 406.
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
2~ d 7~L~ j 36
LISTE DES SEQUENCES
I - INFORMATION GENERALE
(1) DEMANDEUR : Société dite ROUSSEL UCLAF
(2) TITRE DE L'INVENTION
Séquences nucléotidiques codant pour des
régions variables des chaînes ,Q des récepteurs
des lymphocytes T humains, segments peptidi-
ques correspondants et les applications diag-
nostiques et thérapeutiques.
(3) NOMBRE DE SEQUENCES : 56
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
37
III - INFORMATION POUR SEQ ID N 2
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
pondante
LONGUEUR : 387 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 02
SEQUENCE VQ w21
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AGTGACCCTG ATCTGGCAAA GCTTCCATCC TGCCCTGACC CTGCC ATG 48
MBT
1
GGT ACC AGG CTC CTC TGC CGG GTG GCC TTC TGT CTC CTG (;TG GAA GAA 96
Gly Thr Arg Leil Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Leu Leu Val Glu Glu
5 10 15
CTC ATA GAA GCT GGA GTG GTT CAG TCT CCC AGA TAT AAG ATT ATA GAG 144
Leu Ils Glu Ala Gly Val Val Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Ils Ile Glu
25 30
AAA AAG CAG CCT GTG GCT TTT TGG TGC AAT CCT ATT TCT GGC CAC AAT 192
Lys Lys Gln Pr0 Val Ala Phe Trp Cys Asn Pro Ils Ser Gly Hia Asn
35 40 45
ACC CTT TAC TGG TAC CGG CAG AAC TTG GGA CAG GGC CCG GAG CTT CTG 240
Thr Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Asn Lsu Gly Gln Gly Pro Glu Lsu Lau
50 55 60 65
ATT CGA TAT GaG AAT GAG GAA GCA GTA GAC GAT TCA CAG TTC CCT AAG 288
Ile Arg Tyr Glu Asn Glu Glu Ala Val Asp psp Ssr Gin Lsu Pro Lys
70 75 80
GAT CGA TTT TC~..' GCA GAG AGG CTC AAA GGA GTA GAC TCC ACT CTC AAG 336
Asp Arg Phs Ser Ala Glu Arg Lau Lys Gly Val Asp Ser Thr Lau Lys
85 90 95
ATC CAG CCT GCI. GAG CTT GGG GAC TCG GCC GTG TAT CTC TGT GCC AGC 384
Ile Gln Pro Ala Glu Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
AGC .387
sar
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
Us 38
IV - INFORMATION POUR SEQ ID N 3
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE nucléotide et sa protéine corres-
pondante
LONGUEUR : 395 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
SEQUENCE CONSENSUS
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 03
SEQUENCE VQ w22
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
ACAGGACCAG ATGCCTGAGC TAGGAAAGGC CTCATTCCTG CTCTCATC 48
CTGCC ATG GA4 A~C TGG CTC GTA TGC TGG GCA ATT TTT AGT CTC TTG 95
Met Asp Thr Trp Leu Val Cys Trp Ala Ile Phe Sar Lou Lou
1 5 10
AAA GCA GGA CTC ACA GAA CCT GAA GTC ACC CAG ACT CCC AGC CAT CAG 143
Lys Ala Gly Leu lhr Glu Pro Glu Val Thr Gln Thr Pro Ser His Gln
15 20 25 30
GTC ACA CAG ATG GGA CAG GAA GTG ATC TTG CGC TGT GTC CCC ATC TCT 191
Val Thr Gln Met Gly Gln Glu Val Ile Leu Arg Cys Val Pro Ile Ser
35 40 45
AAT CAC TTA TAC 1'TC TAT TGG TAC AGA CAA ATC TTG GGG CAG AAA GTC 239
Aan Hia Leu Tyr Phs Tyr Trp Tyr Arg Gin I1= Leu Gly Gln Lys Val
50 55 60
GAG TTT CTG GTT TCC TTT TAT AAT AAT GAA ATC TCA GAG AAG TQT GAA 287
Glu Phe Leu Val Ser Phe Tyr Aan Asn Glu Ile Ser Glu Lys Ser Glu
65 70 75
ATA TTC GAT GAT CAA TTC TCA GTT GAA AGG CCT GAT GGA TCA AAT TTC 335
Ile Phe Asp Aap Gln Phe ser Val Glu Arg Pro Asp Gly Ser Aan Phe
80 85 90
ACT CTG AAG ATC CGG TCC ACA AAG CTG GAG GAC TCA GCC ATG TAC TTC 383
Thr Leu Lys Ile Arg Ser Thr Lys Leu Glu Asp Ser Ala Met Tyr Phe
95 100 105 110
TGT GCC AGC AGT 395
Cys Ala Ser Ser
WO 92/13950 PCr/FR92/00130
39 14, ~8 8~.
V INFORMATION POUR SEQ ID N 4
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
pondante
LONGUEUR : 329 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
SEQUENCE CONSENSUS
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 04
SEQUENCE Vp w23
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AGCTCCTCTG CCATGTC ATG CTT TGT CTC CTG GGA GCA GGT TCA GTG 47
Met Leu Cys Leu Leu Gly Ala Gly Ser Val
1 5 10
GCT GCT GGA GTC hTC CAG TCC CCA AGA CAT CTG ATC AAA GAA AAG AGG 95
Ala Ala Gly Val ile Gln Ser Pro Arg llis Leu Ilo Lys G.Lu Lys Arg
L5 20 25
GAA ACA GCC ACT CTG AAA TGC TAT CCT ATC CCT AGA CAC GAC ACT GTC 143
Glu Thr Ala Thr f.3u Lys Cys Tyr Pro Ile Pro Arg Hie Asp Thr Val
30 35 40
TAC TGG TAC CAG CAG GGT CCA GGT CAG GAC CCC CAG TTC CTC ATT TCG 191
Tyr Trp Tyr Gin Gln Gly Pro Gly Gln Asp Pro Gln Phe Lou Ilo Sur
45 50 Si 9
TTT TAT GAA AAG ATG CAG AGC GAT AAA GGA AGC ATC CCT GAT CGA TTC 239
Phe Tyr Glu Lys f4et Gin Ser Asp Lys Gly Ser Ile Pro Asp Arq Phe
60 65 70
TCA GCT CAA CAG rTC AGT GAC TAT CAT TCT GAA CTG AAC ATG AGC TCC 287
Ser Ala Gln Gln Phe Ser Asp Tyr His Ser Glu Leu Asn Met Ser Ser
75 80 85 90
TTG GAG CTG GGG GAC TCA GCC CTG TAC TTC TGT GCC AGC AGC 329
Leu Glu Lau Glj+ Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser
95 100
WO 92/13950 (~ ~1 ) PCT/FR92/00130
JN ~,9 iJ lJ li i ... ,_
VI - INFORMATION POUR SEQ ID N 5
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
5 pondante
LONGUEUR : 366 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
10 ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 05
15 SEQUENCE VQ w24
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
ATTCCTGTAT GGGGTGGTAT TCCTCCC ATG GGT CCT CGG CTT CTC CAC 48
Met Gly Pro Gly Leu Lau Hia
1 5
TGG ATG GCC CTT TGT CTC CTT GGA ACA GGT CAT GGG GAT GCC ATG GTC 96
Trp Met Ala Leu. Cys Leu Leu Gly Thr Gly His Gly Asp Ala Met Val
10 15 20
ATC CAG AAC CCA AGA TAC CAG GTT ACC CAG TTT GGA AAG CCA GTG ACC 144
Ile Gin Asn Pro Arg Tyr Gin Val Thr Gln Phe Gly Lys Pro Val Thr
25 30 35
CTG AGT TGT TCT CAG ACT TTG AAC CAT AAC GTC ATG TAC TGG TAC CAG 192
Leu Ser Cys Ser Gln Thr Leu Asn His Asn Val Met Tyr Trp Tyr Gln
40 45 50 55
CAG AAG TCA AGT CAG CCC CCA AAG CTG CTG TTC CAC TAC TAT GAC AAA 240
Gln Lys Ser Ser Gln Ala Pro Lys Leu Leu Phe His Tyr Tyr A8p Lys
60 65 70
GAT TTT AAC AAT GAA CCA CAC ACC CCT GAT AAC TTC CAA TCC AGG AGG 288
Asp Phe Asn Asn Glu Ala Asp Thr Pro Aap Aon Phe Gin S.r Arg Arg
75 80 85
CCC AAC ACT TCT TTC TGC-TTT CTT GAC ATC CGC TCA CCA GCC CTC GCG 336
Pro Aan Thr Ser. Phe Cys Phe Leu Asp Ile Arg Ser Pro Gly Leu Gly
90 95 100
GAC GCA GCC ATG TAC CTG TGT GCC ACC AGC 366
Aap Ala Ala Met Tyr Leu Cys Ala Thr Ser
105 110
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
41
2079Sna.
VII - INFORMATION POUR SEQ ID N 6
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
pondante
LONGUEUR : 238 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphôcytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 06
SEQUENCE VQ 5
A GGA CAG CAA CCG ACT CTG AGA TGC TCT CCT ATC TCT GGG CAC ACC 46
Gly Gin Gin Ala Thr i,au Arq Cys Ser Pro Ile Ser Gly His Thr
1 5 10 15
AGT GTG TAC TGG TAC CAA CAG GCC CTG GGT CTG GGC CTC CAG CTC CTC 94
ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ala,isu Gly Lau Giy Leu Gln Leu Leu
25 30
CTT TGG TAT GAC GAG GGT GAA GAG AGA AAC AGA CCA AAC TTC CCT CCT 142
Leu Trp Tyr Aaap Glu Gly Glu Glu Arq Asn Arg Gly Asn Phe Pro Pro
35 40 45
AGA 'll'T TCA GGT CGC CAG TTC CC'r AA'l' 'l'A'l' ACC 'l'C'r CAG CTG AAT GTG
190
Arg Phe ser Gly Arg Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn Val
50 55 60
AAC GCC TTG GAG CTG GAG GAC TCG GCC CTG TAT CTC TGT CCC AGC AGC 238
Asn Ala Leu Glu Iau Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Als 8er 8er
65 65 70
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
220 742
VIII - INFORMATION POUR SEQ ID N 7
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
pondante
LONGUEUR : 192 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 07
SEQUENCE VQ 5
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
ACT GTG TCC TGG TAC CAA CAG GCC CTG GGT CAG GGG CCC CAO TTT ATC 48
Thr Val Ser Trp 'ryr Gln Gin Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe Ila
1 5 10 15
TTT CAG TAT TAT AGG GAG GAA GAG AAT GGC AGA GGA AAC TCC CCT CCT 96
Phe Gln Tyr Tyr Arq Glu Glu Glu Asn Gly Arg Gly Asn Ser Pro Pro
25 30
AGA TTC TCA GGT CTC CAG TTC CCT AAT TAT AGC TCT GAG CTG AAT GTG 144
Arg Phe Ser Gly Lou Gin Phe Pro Asn Tyr Ser Sor Glu Lou Asn Val
35 40 45
AJ1C GCC TTG GAG CTG GAC GAC TCG GCC CTG TAT CTC TGT GCC AGC AGC 192
11ain Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser
50. 55 60
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
43 2 0 7 9 S'a,
IX - INFORMATION POUR SEQ ID N 8
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
pondante
LONGUEUR : 371 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 08
SEQUENCE V/3 5
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
GAAC'1CAC1'G GG'ri'C7rCCC CACGACGACC AAUCCCTGAA 'l'CAGCI'CCAG 50
TGCTGCG'TGC CCCACTGTCC C ATG GGC CCT GGG CTC CTC TGC TGG 95
Met Gly Pro Gly Leu Leu Cys Trp
1 5
GTG CTG CTT TGT CTC CTG GGA GCA GGC CCA GTG GAC GCT CGA GTC ACC 143
Val Leu Leu Cys Iqu Leu Gly Ala Gly Pro Val Asp Ala Gly Val Thr
10 15 20
CAA AGT CCC ACA CAC CTG ATC AAA ACG AGA GGA CAG CAA GTG ACT CTG 191
Gin Ser Pro Thr His Leu Ile Lys Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu
30 35 40
AGA TGC TCT CCT ATC TCT GAG CAC AAG AGT GTG TCC TGG TAC CAA CAG 299
Arg Cys Ser Pro ile Ser Glu His Lys Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln
45 50 55
GTC CTG GGT CAG GGG CCC CAG TTT ATC TTr CAC 'l'AT TAT GAG AAA GAA 287
Val Leu Gly Gln Gly Pro Cln Pho Ilc Pho Cin 'Pyr 'l'yr Glu Ly,s Glu
60 65 70
GAG AGA GGA ACA GCA AAC 7"TC CCT CAT CCA 'i"rC 'l'CA GCT CGC CAG TTC 335
Glu Arg Gly Arg Gly Asn Phe Pro Asp Arg Phe Ser Ala Arg Gln Phe
75 80 85
CCT AAC TAT AGC 'rCT GAG CTG AAT GTG AAC GCC T'rG TTG CTG GGG GAC 383
Fro Asn Tyr Ser Sur Glu Le.u Asn Val Aan Ala Leu Leu Leu Gly Asp
90 95 100
TCG GCC CTG TA'l' CTC TGT GCC AGC AGC 410
Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser
105 110
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
71v)44
X INFORMATION POUR SEQ ID N 9
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
pondante
LONGUEUR : 380 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 09
SEQUENCE V/3 5
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AAGCCCTGAA TCAGATGCAG 'l'GCTL'CC'TGTC CCTCTGTGCC ATG GGC 47
Met Gly
1
CCC GGG CTC CTC TGC TGG GCA CTG CTT TGT CTC CTG GGA GCA GGC TTA 95
Pro Gly Leu Iw+iu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala Gly Lau
5 10 15
GTG GAC GCT GL.1 C'~C ACC C1lA AGT CCC ACA CAC C'PG ATC AAA ACC AGA 143
Val Asp Ala Gly Yal 'l'hr Gin Snr 1lro 'l'hr Ilis Lou llo Lys 'l'hr Arq
25 30
GGA CAG CAA GTG ACT CTG AGA TGC TCT CCT AAG TCT GGG CAT GAC ACT 191
Gly Gltn Gln Va.l Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly Hie Asp Thr
3'5 40 45
GTG TCC TGG TAC' CAA CAG GCC CTG GGT CAG GGC CCC CAG 'rTT ATC TTT 239
Val Ser Trp Tyu Gln Gin Ala Leu Gly Gln Cly Pro Gln Phe xle Phe
50 55 - 60 65
CAG TAT TAT GAG GAG GAA GAG AGA CAG AGA GCC AAC TTC CCT GAT CGA 287
Gin Tyr Tyr Gl~i Glu Glu Glu Arg Gln Arq Gly Asn l'tin Pro Aep Arg
70 75 80
TTC TCA GGT CAC CAG TTC CCT AAC TAT AGC TCT GAG CTG AAT GTG AAC 335
Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn Val Asn
85 90 95
GCC TTG TTG C+G GGG GAC TCG GCC CTC TAT CTC TGT GCC AGC AGC 380
Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser
100 105 110
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
Q1
2~79~t~;.:
~
XI - INFORMATION POUR SEQ ID N 10
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
5 pondante
LONGUEUR : 351 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
10 ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 11
15 SEQUENCE VQ 6
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
GACCCTGCC ATG GGC ACC AGT CTC CTA TGC TGG GTG GTC CTG GGT TTC 48
Met Gly Thr Sar Iwu Lau Cys Trp Val Val Leu Gly Pha
1 5 10
CTA GGG ACA GAT CAC ACA GGT GCT GGA GTC TCC CAG TCT CCC AGG TAC 96
Leu Gly Thr Asp His Thr Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr
15 20 25
AAA GTC ACA AAG AGG GGA CAG GAT GTA GCT CTC AGG TGT GAT CCA ATC 144
Gln Val Thr Lys Arg Gly Gln Asp Val Ala Lau Arg Cys Asp Pro Ile
30 35 40 45
TCG GGT CAT GTA TCC CTT TAT TGG TAC CGA CAG GCC CTG GGG CAG GGC 192
Ser Gly His Val Ser Lau Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Leu Gly Gin Gly
55 60
CCA GAG TTT CTG ACT TAC TTC AAT TAT GAA GCC CAA CAA GAC AAA TCA 240
Pro Glu Pha Leu Thr Tyr Phe Asn Tyr Glu Ala Gln Gln Arp Lys Ser
65 70 75
GGG CTG CCC AAT GAT CGG TTC TCT GCA GAG AGG CCT GAG GOA TCC ATC 288
Gly Lau Pro Asn Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Pro Glu Gly 8ar Iis
80 85 90
TCC ACT CTG ACG ATC CAG CGC ACA GAG CAG CGG GAC TCG GCC ATG TAT 336
Sar Thr Leu=Thr Ils Gln Arg Thr Glu Gln Arg Asp Ser Ala Met Tyr
95 100 105
CGC TGT GCC AGC AGC 351
Arg Cys Ala Ser Sar.
110
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
46
2079
XII - INFORMATION POUR SEQ ID N 11
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
pondante
LONGUEUR : 238 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 12
SEQUENCE VQ 6
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
A AAG GAT GTA GAG CTC AGG TCT GAT CCA A'1=T '1CA GGT CAT ACr GCC 46
Lys Asp VaL Glu Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Thr Ala
1 5 10 15
CTT TAC TGG TAC CGA CAG AGC CTG GGG CAG GGC CTG GAG TTT TTA ATT 94
Lou Tyr Trp Tyr Arg Gln Ser L u Gly Gln Gly Tau Glu Phe Leu Ile
25 11)
TAC TTC CAA GGC AAC AGT GCA CCA GAC AAA TCA GGG CTG CCC AAC GAT 142
Tyr Phe Gln Gly Asn Ser Ala Pro Asp Lys Ser Gly Leu Pro Asn Asp
35 40 45
CGG TTC TTT GC:: GTC AGG CCT GAG GGA TCC GTC TCT ACT CTG AGG ATC 190
Arq Phe Phe Ala Val Arg Pro Glu Gly Ser Val Ser Thr Leu Arq Ile
50 55 60
CAC CGC ACA GAc; CGG GGG GAC TCA GCC GTG TAT CPC 'l'GT GCC AGC AGC 238
Gin Arq Thr Glu Arg G1y Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser
65 70 75
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
r O
47 9 R
8 1
XIII - INFORMATION POUR SEQ ID N' 12
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
pondante
LONGUEUR : 294 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 13
SEQUENCE V/3 12
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
TCA GGA CAC AGG GAT GCT GAA ATC ACC CAG AGC CCA AGA CAC AAG ATC 48
Ser Gly His Arq Aop Ala Glu Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Lys Ils
1 5 10 15
ACA GAG ACA GCA AGG CAG GTG ACC TTG GCG TGT CAC CAG ACT TGG AAC 96
Thr Glu Thr Gly Arg Gin Val Thr Leu Ala Cye tlie Gin Thr Trp Aun
25 30
CAC AAC AAT A'YC TTC TGG TAT CGA CAA GAC CTG CCA CAT GGG CTC AGG 144
His Asn Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly His Gly Leu Arg.
35 40 . 45
CTG ATC CAT TAC TCA TAT GGT G'l'r CAA GAC AC'r nAC AAA GCA GAA GTC 192
Lau Ile Hia Tyr Ser Tyr Gly Val Gln Asp Thr Asn Lys Gly Glu Val
50 55 60
TCA GAT GGC TAC AGT GTC TCT AGA TCA AAC ACA GAG GAC CTC CCC CTC 240
Ser Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ser Asn Thr Glu Asp Leu Pro Leu
65 70 75 80
ACT CTG GAG TC: GCT GCC TCC TCC CAG ACA TCT GTA TAT TTC TGC GCC 288
Thr I.eu Glu Se; Ala Ala Ser Ser Gin Thr Scr Val Tyr Phe Cy~ Ala
85 90 95
AGC AGT 294
Sar Ser
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
48
XIV - INFORMATION POUR SEQ ID N 13
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
pondante
LONGUEUR : 369 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 14
SEQUENCE VQ 13
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AGAAGACCCC TCCATCCTGT AGCACCTGCC ATG AGC ATC GGG CTC CTG 48
Met Ser Ile Gly Lau Lau
1 5
TGC TGT GTG GCC TTT TCT CTC CTG TGG GCA AGT CCA GTG AAT GCT GGT 96
Cye Cys Val Al, Nho Soc Lou lnu 'Prp A1n a;nr vro Vnl Ann Aln Gly
10 15 20
GTC ACT CAG ACi CCA AAA TTC CAG GTC CTG AAG ACA GGA CAG AGC ATG 144
Val Thr Gln Th: Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr Gly G1n Ser Met
30 35
ACA CTG CAG TGT GCC CAG GAT ATG AAC CAT AAC TCC ATG TAC TGG TAT 192
Thr Leu Gln Cys Ala Gin Asp Met Asn ftis Asn Scr Mct Tyr Trp Tyr
40 45 50
CGA CAA GAC CCA GGC ATG GGA CTG AGG CTG ATT TAT TAC TCA GCT TCT 240
Arg Gin Asp Pro Gly Mot Gly tAU Arq Lou ilo 'Pyr Tyr Sor Ala 8or
55 60 G i 70
GAG GGT ACC ACT GAC AAA GGA GAA GTC CCC AAT GGC TAC AAT GTC TCC 288
Glu Gly Thr Thr i,yp Lys Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn Val Sar
75 80 84
AGA TTA AAC AAA CGG GAG TTC TCG CTC AGG CTG GAG TCG GCT GCT CCC 336
Arg Leu Asn Lys Arg Glu Phe Ser Leu Arg Leu Glu Ser Ala Ala Pro
90 95 100
TCC CAG ACA TC: GTG TAC TTC TGT GCC AGC ACC 369
Sor Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Thr
105 110
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
49
2079()~.'
:
XV - INFORMATION POUR SEQ ID N' 14
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
pondante
LONGUEUR : 356 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 15
SEQUENCE V(3 13
DESCRIPTION-DE LA SEQUENCE
TGCTTGTAGC ATCTGCC ATG AGA ATC AGG CTC CTG TGC TGT GTG GCC 47
Met Arq Ile Arq Lcu Lcu Cys Cys Val Ala
1 5 tn
TTT TCT CTC CTG TGG GCA GGT CCA GTG ATT GCT GGG ATC ACC CAG GCA 95
Pha Ser Leu Leu Trp Ala Giy Pro Val Ile Ala Gly Ila Thr Gln Ala
15 20 25
CCA ACA TCT CAG ATC CTG GCA GCA GGA CGG CGC ATG ACA CTG AGA TGT 143
Pro Thr Ser Gln Ila Leu Ala Ala Gly Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys
30 35 40
ACC CAG GAT ATG AGA CAT AAT GCC ATG TAC TGG TA'r AGA CAA GA'r CTA 191
Thr Gln Asp Mat Arg His Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Lau
45 50 55
GGA CTG GGG C'PA AGG Cl'C A'l'C CAT 'l'A'l' '1CA AA'l' AC'l' CCA CG'L' ACC
AC'l' 239
Gly Leu Gly Leu Arg Lau ile His Tyr Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr
60 65 70
GGC AAA GGA GAA GTC CCT GAT GGT TAT AGT G'l'C 'l'CC AGA GCA AAC ACA 287
Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr Ser Val Sor Arg Ala Asn Thr
75 80 85 90
GAT GAT TTC CCC CTC ACG TTG GCG TCT GCT GTA CCC TCT CAG ACA TCT 335
Asp Asp Pha Pro Lau Thr Leu Ala Ser Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser
95 100 105
GTG TAC TTC TGT GCC AGC AGT 356
Val Tyr Phs Cys Ala Ser Ser
110
WO 92/13950 PCI'lFR92/00130
20 9~U'
XVI - INFORMATION POUR SEQ ID N 15
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
5 pondante
LONGUEUR : 345 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
10 SEQUENCE CONSENSUS
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
15 NOM DE L'ADN : IGR b 16
SEQUENCE Vp
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AAGGCCt,.ACC CCCTTTCCAT TGGGGCTGCA GCATCAGCTC TTTCCPICTC 50
TGCAGGT CCA GTG AAT GCT GGT CTC ACT CAG.ACC CCA AAA TTC CGC 96
Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gin Thr Pro Lys Phe Arg
1 5 10
ATC CTG AAG ATA GGA CAG AGC ATG ACA CTG CAG 'PG'r GCC CAG GAT ATG 144
ile Leu Lys Ile Gly Gin Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met
15 20 25
AAC CAT AAC TAC A'l'G TAC 1'CG 'rAT CCA CAA CAC CCA CCC A'l'C CCC CTC 192
Asn Hia Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu
30 35 40 45
AAG CTG ATT TA'l' TAT TCA GTT GG'1' CCT GC'i' A'l'C AC'P GAT AAA GCA GAA 240
Lys Lau ile Tyr Tyr Sar Val Gly Ala G'ly Ilo Thr Asp Lys Gly Glu
50 55 60
GTC CCG AAT GGC TAC AAC GTC TCC AGA TCA ACC ACA GAG CAT TTC CCG 288
Val Pro Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Sar 'rhr Thr Glu Asp Phe Pro
65 70 75
CTC AGG CTG GAG TTG GCT GCT CCC TCC CAG ACA TCT CTG TAC TTC TGT 336
Lau Arg Leu Glu Leu Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys
80 85 90
GCC AGC AGT 345
Ala Sar Ser
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
51 ~~~9 8 ? i.
XVII - INFORMATION POUR SEQ ID N 16
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
pondante
LONGUEUR : 450 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 17
SEQUENCE VQ 7
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
TGGAGCAGTG ACATCACAGG AAAAACCACC AACCAAGGCC 40
AAGGAGACCA GAGCCCAGCA CCTCACCCAG AGGACCCCAG TCAGAGGCCC CATCTCAGAC 100
CCGAGG~-'AG C ATG GGC TGC AGG CTG CTC TGC TGT GCG GTT CTC 144
Met Gly Cys Arq Leu Leu cys cys Ala Va1 Leu
1 5 10
TGT CTC CTG GGA GCG GTC CCC ATG GAA ACG GGA GTT ACG CAG ACA CCA 192
Cys isu Leu Gly Ala Val Pro Met Glu Thr Gly Val Thr Gln Thr Pro
15 20 25
AGA CAC CTG GTC ATG GGA ATG ACA AAT AAG AAG TCT TTG AAA TGT GAA 240
Arg His Leu Val Met Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu
30 35 40
CAA CAT CTG GGu CAT AAC GCT ATG TAT TGC TAC AAG CAA AGT GC'r AAG 288
Gin Hia Leu Gly Hia Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gin 8ar Ala Lys
45 50 55
AAG CCA CTC GAG CTC ATG TTT GTC TAC AAC TTT AAA GAA CAG ACT GAA 336
Lys Pro Leu Glu Leu Met Phe Val Tyr Asn Phe Lys Glu Gln Thr Glu
60 65 70 75
AAC AAC AGT G'l'G CCA AGT CGC TTC TCA CC'P GAA 'l'GC CCC AAC AGC TC'T 384
Mn Asn Sar Val Pro Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser
80 85 90
CAC TTA TGC C1T CAC CTA CAC ACC CTG CAG CCA GAA GAC TCG GCC CTG 432
Hia Leu Cys Leu Hia Leu His Thr Leu Gln Pro Glu Asp SerAla LeC
95 100 105,
TAT CTC TGT GCC AGC ACC 450
Tyr Leu Cys Ala Ser Thr
110
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
7 9 t~.! 52
XVIII - INFORMATION POUR SEQ ID N 17
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
pondante
LONGUEUR : 354 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 18
SEQUENCE V{3 7
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AGACCCGAGG CTAGC ATG GGC TGC AGG CTG CTC TGC TCT GCG GTT CTC 48.
Met Cly Cys Arg Leu Leu Cys Ser Ala Val Lau
1 5 10
TGT CTC CTG GGA GCG GTC CCC ATG GAA ACG GGA GTT ACG CAG ACA CCA 96
Cys Leu Lsu Gly Ala Val Pro Met Glu Thr Gly Val Thr Gln Thr Pro
15 20 25
AGA CAC CTG GTC ATG GGA ATG ACA AAT AAG AAG TCT TTG AAA TGT CAA 144
Arg His Leu Val Met Gly Met Thr Asn Lys t,ys sor Leu Lys Cys Glu
] 0 35 ' 4 0
CAA CAT CTG GGT CAT AAC GCT ATG TAT TGG TAC AAG CAA AGT GCT AAG 192
Gin Hia Leu Gly His Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Ser Ala Lys
45 50 55
AAG CCA CTG GAG CTC ATG TTT GTC TAC AGT CTT CAA GAA CGG GTT GAA 240
Lys Pro Lau Glu Leu Met Phe Val Tyr Ser Leu Glu Glu Arg Val Glu
60 65 70 75
AAC AAC AGT GTG CCA AGT CGC TTC TCA CCT GAA TGC CCC AAC ACC TCT 288
Asn Asn Ser Vai. Pro Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser 8er
80 85 90
CAC TTA TCC CTT CAC CTA CAC ACC CTG CAG CCA GAA GAC TCG CCC CTC 336
His Leu Se; Leu His Leu His Thr Leu Gin Pro Glu Asp Ser Ala Leu
95 100 105
T1-T CTC TGC GCC AGC AGC 354
Tyr Lu Cys Ala Ser Ser
110
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
53
t 'J
XIX - INFORMATION POUR SEQ ID N 18
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
pondante
LONGUEUR : 368 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 19
SEQUENCE V(3 7
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AGAGGC::CCA TCTCAGACCC GAGGCTAGC ATG GGC TGC AGG CTG'CTC 47
Met Gly Cys Arq Leu Leu
1 5
TGC TGT GCG GTT CTC TGT CTC CTG GGA GCA GTT CCC ATA GAC ACT GAA 95
Cys Cys Ala Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala Val Pro Ile Asp Thr Glu
10 15 20
GTT ACC CAG ACA CCA AAA CAC CTG GTC ATG GGA ATG ACA AAT AAG AAG 143
Val Thr Gln 'Phr Pro Lys His Leu Val Met Gly Met Thr Asn Lys Lys=
30 35
TCT TTG AAA TGT GAA CAA CAT ATG GGG CAC AGG GCT ATG TAT TGG TAC 191
Ssr,Lau Lys Cys Glu Gln His Met Gly His Arg Ala Met Tyr Trp Tyr
40 45 50
AAG CAG AAA GCT AAG AAG CCA CCG GAG CTC ATG TTT GTC TAC AGC TAT 239
Lys Gln Lys Ala Lys Lys Pro Pro Glu Leu Met Phe Val Tyr Ser Tyr
55 60 65 70
GAG AAA CTC TCT ATA AAT GAA AGT GTG CCA AGT CCC TTC TCA CCT GAA 287
Glu Lys Leu Ser Ils Asn Glu Ser Val Pro Ser Arg Phe Ser Pro Glu
75 80 8S ..
TGC CCC AAC AGC TCT CTC TTA AAC CTT CAC CTA CAC GCC CTG CAG CCA 335
Cys Pro Asn Ser Ser Leu Leu Asn Leu Ris Leu His Ala Lau Gln Pro
' 90 95 100
GAA GAC TCA GCC CTG TAT CTC TGC GCC AGC AGC 368
G1u,Asp Ser Ala Lau Tyr Leu Cys Ala Sar Ser
105 110
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
2â~; 9 8 8 54
~.
XX - INFORMATION POUR SEQ ID N 19
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres-
pondante
LONGUEUR : 432 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 20
SEQUENCE VQ 9
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
ACCTCTCAAC GGCAGTGAAA CCACAGCCTA GTCCTCTCAC 40
CACTGCAGAC C4 %GAATCCTG CCCTGGGCCT TGCC'rCC'l'C'r CCCTCACTCT CCC ATG 96
MET
1
GGC TGC AGG CTu CTC TGC TGT GTG GTC TTC TGC CTC CTC CAA GCA GGT 144
Gly Cys Arg Lcu Leu Cys Cys Val Val Pho Cys [.ou Lou Gln Ala Gly
5 10 15
CCC TTG GAC ACA GCT GTT TCC CAG ACT CCA AAA TAC CTG GTC ACA CAG 192
Pro Leu Asp 'l'hr Ala Val Sor Cln 'lhr Llro I,yn 'I'yr iru Val 'Phr Gln
25 30
ATG GGA AAC GAC AAG TCC ATT AAA TGT GAA CAA AAT CTG GGC CAT GAT 240
Mat Gly Asn Ast-+ Lys Ser Ile Lys Cys Glu Gln Asn Leu Gly His Asp
35 40 45
ACT ATG TAT TGG TAT AAA CAG GAC TCT AAG AAA TTT CTG AAG ATA ATG 288
Thr Mat Tyr Trp Tyr Lys Gin Asp Sar Lys Lys Pha Leu Lys Ils Mat
50 55 60 65
TTT AGC TAC AAr AAT AAG GAG CTC ATT ATA AAT GAA ACA GTT CCA AAT 336
Pha Sar Tyr Asn Asn Lys Glu Leu Ila Ile Asn Glu Thr Val Pro Asn
70 75 80
CGC TTC TCA CCT AAA TCT CCA GAC AAA GCT CAC T'TA AAT CTT CAC ATC 384
Arq Pha Ssr Pro Lys Sar Pro Asp Lys Ala His Leu Asn Leu His Ile
85 90 95
AAT TCC CTG GAG CTT GGT GAC TCT GCT GTG TAT TTC TGT GCC AGC AGC 432
Asn Ser Leu Glt. Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser
100 105 110
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
~!}r)t'i ?CJ~
XXI - INFORMATION POUR SEQ ID N 20 à 24
OLIGONUCLEOTIDES
5
SEQ ID N' 20 5'-TATCTGGAGTCATTGAGGGCGGGC
10 SEQ ID N' 21 5'-GCATGCGCGCGGCCGCGGAGG-14C
SEQ ID N 22 5'-TGTGGCCAGGCATGCCAGTGTGGCC
SEQ ID N 23 5'-GGTGTGGGAGAATTCTGCTTCTGA
SEQ ID N' 24 5'-TCTGCTTCTGATGGCTCAA.
WO 92/13950 PCT/FR92/00130
56
J.
SEQ ID Sequence Type Clone Position
N.
-------
77
25 5'-CCGCACAACAGTTCCCTGACTTGC-3' V81 HBVT73 251
26 5'-GGCCACATACGAGCAAGGCGTCGA-3' V82 MOLT4 210
27 5'-CGCTTCTCCCGGATTCTGGAGTCC-3' V83 DT259 232*
28 5'-TTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAA-3' V84 DT110 257
29 5'-AGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCC-3' V85 VB12A1 199*
30 5'-TCTCAGGTGTGATCCAAATTCGGG-3' V06 ATL12.2 117
31 5'-CCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTC-3' V87 PL4.9 169
32 5'-CCATGATGCGGGGACTGGAGTTGC-3' V08 PH11 170
33 5'=TTCCCTGGAGCTTGGTGACTCTGC-3' V89 PL2.6 .201*
34 5'-CCACGGAGTCAGGGGACACAGCAC-3' V810 ATL12-1 299
35 5'-TGCCAGGCCCTCACATACCTCTCA-3' V81t PL3.12 297
36 5'-TGTCACCAGACTGgGAACCACCAC-3' V812 VBPH27 109*
37 5'-CACTGCgGTGT,&CCCAGGATATGA-3' V813 CEM-VB1 116
38 5'-GGGCTçGGCTTAAGGCAGAçCTAC-3' V814 VBPH21 175
39 5'-CAGGCACAGGCTAAATTCTCCCTG-3' V815 ATL2-1 262
40 5'-GCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGG-3' V816 HBP42 192*
41 5'-CTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCC-3' V817 VBPH29 254
42 5'-TGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCA-3' V818 HUT102 173*
43 5'-TCCTCTCACTGTGACATCGGCCCA-3' vBy9 HBVT02 279
44 5'-TCTCAATGCCCCAAGAACGCACCC-3' V820 HBVT72 274
45 5'-TCCAACCTGCAAGGCTTGAçGACT-3' VB.w21 IGRbOlI 318
46 5'-AAGTGATCTTGCGCTGTGTCCCCA-3' Vaw22. IGRbO3 110
4.7 5'-GCAGGGTCCAGGTCAGGACCCCCA-3' VBw23 IGRaO4 155
48 5'-CCCAGTTTGGAAAGCCAGTGACCC-3' V13w24 IGRaO5 95
49 5'-GGTGTGGGAGAATTCTGCTTCTGA-3' CaA 71
50 5'-ACCAGCTCAGCTCCGCGGGGTCGG-3' (;8s 135
51 5'-TCTGCTTCTGATGGCTCAA-3' CBC 58
52 5'-ATTTGCGGTGGACGATGGAGGGdC-3' AOt1 4-actine 1161
53 5'-GGCATCGTCACCAACTGGGACGAC-3' Act 2 6-actine 261
5=4 51-ACCACCACGGCGGAGCGGG-3' ACt3 D-actine 642
ST~ 5'-GTTGCTCCAGGCCCCGGCACTGTT-3' Co(E 201
56 5'-CCCTGACCCTGCCCTGTACCAGCT-3' Co4 J 12
57 5'-GTCACTGGATTTAGAGTCT-3' Ca C 57
