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~7~3~
COMPOSITIONS A BASE DE PRINCIPES ACTIFS DE MEDICAMENTS ' -
HYDROPHOBES SOLUBILISABLES DANS UN SOLVANr AQUEUX
L'invention concerne des compositions comprenant
des principes actifs de médicaments hydrophobes,
néanmoins solubilisables dans un solvant aqueux.
L'invention concerne egalement un procedé
d'obtention de telles compositions, et leurs
utilisations notamment en tant que compositions
pharmaceutiques.
De nombreux produits utilises dans le domaine
pharmaceutique, ou susceptibles de l'être, ne peuvent
être solubilisés dans un solvant aqueux.
Cette insolubilité dans un solvant aqueux est
particulièrement desavantageuse pour des produits -
destines a être administres dans une solution
physiologique agueuse du type de celles habituellement
utilisees pour les préparations injectables. Elle
l'est aussi pour les produits destinés a être
administrés par voie orale et gui présentent une
efficacite et une biodisponibilité réduite.
Parmi ces produits pharmacologiquement actifs et
insolubles dans un solvant aqueux, on peut citer
notamment, les derives lipophiles de mura~yl-peptides,
tels que ceux decrits dans le brevet européen n- 0 165
123 du 10/05/1985, ou encore dans le brevet europeen
4512 du 20/03/1979.
De fait, ces produits sont des immunomodulateurs
capables d'augmenter la reponse immune specifique
(adjuvant de vaccin), ou de renforcer la resistance
non-specifique (agent anti-infectieux).
: ,. . ~ :~ , ,
WO92/01475 PCT/FR91/00595
De nature très hydrophobe, ils donnent des
suspensions aqueuses difficiles à disperser de façon
totalement satisfaisante (notamment en regard du
niveau de dispersion compatible avec la possibilite
de les injecter à un patient)l en utilisant les divers
moyens de mise en solution ou de dispersion aqueuse,
bases sur des techniques connues, notamment des
traitements mecaniques, ou encore l'utilisation de
solvants organiques ou de surfactants.
La presente invention a precisément pour but de
fournir des moyens permettant la solubilisation ou la
dispersion homogene dans un solvant aqueux de produits
hydrophobes, tels que les muramyl-peptides lipophiles,
ou d'autres principes actifs de medicaments
lipophiles, porteurs de chaînes hydrocarbonées.
Celles-ci contribuent parfois elles-mêmes à la faible
solubilite, de ces produits dans l'eau, voire à
l'instabilite de leurs dispersions aqueuses.
L'invention concerne d'une maniere generale une
composition susceptible d'être solubilisee ou
dispersée de facon homogene et stable dans une
solution aqueuse pharmaceutiquement acceptable,
caractérisée par l'association :
- d'une part, d'un principe actif lipophile de
médicament ou "substance pharmacologiquement active",
comprenant au moins un groupe hydrocarbone comportant
lui-même au moins 3 atomes de carbone, et
- d'autre part, d'un dérive osidique solubilisateur,
lui-même hydrosoluble, pharmaceutiquement acceptable,
portant lui-même un groupe hydrocarbone comportant au
moins 3 atomes de carbone et comprenant une ou
plusieurs fonctions hydroxyle, dont au ~oins l'une est
substituée par un groupe phosphate ou sulfate,
ce derive osidique etant en une proportion suffisante
par rapport au principe actif lipophile pour
,, . .-
' . ~.: ,' . ' '.: '~ '' ' '',.' ' -
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~087~3~
promouvoir la solubilisation ou la dispersion de
l'ensemble de la composition dans une solution
aqueuse.
La mise en solution ou en dispersion des deux
constituants sus-définis de la composition fait
apparemment intervenir la constitution de liaisons de
type Van der Walls entre leurs chaînes hydrocarbonées
respectives. Souvent les liaisons de Van der Walls
seront d'autant plus efficaces qu'elles seront
nombreuses et donc, que les chaînes hydrocarbonées
seront plus longues. Il va de soi que ces longueurs de
chaînes ne doivent pas, surtout en ce qui concerne le
derivé osidique hydrosoluble, exceder celles qui
auraient pour effet de trop accroître sa lipophilie.
Il est entendu que, dans ce qui précède et ce qui
suit, "lipophile" doit être entendu comme signifiant
que la substance concernee présente dans un système
bi-phasique (solution aqueuse - solution organique) un
coefficient de partage favorable à la phase
organique , en d'autres termes la substance lipophile
est plus soluble dans la solution organique que dans
la solution aqueuse. La substance lipophile peut même
être pratiquement insoluble dans l'eau.
A l'inverse, et dans la présente description,
l'adjectif "hydrosoluble" a la signification inverse.
Le coefficient de partage de la substance hydrosoluble
dans le susdit systeme bi-phasique est en faveur de la
phase aqueuse.
On peut faire l'hypothese que le pouvoir
solubilisateur du dérive osidique est attribuable aux
présences simultanees dans la structure de ce derive
osidique dudit (ou desdits) groupement(s)
hypocarbone(s) et du (ou des) groupe(s) sulfate ou
phosphate. Les groupements hydrocarbonés permettent
l'établissement de liaisons du type Van der Waals avec
' ' " :
WO~2/01475 pCT/FR91/00595
la (les~ chaine(s) hydrocarbonée(s) du principe actif
et le (ou les) groupe(s) sulfate ou phosphate
permet(tent) la solubilisation du complexe non
covalent ainsi forme.
Le cas echeant, les longueurs des chaînes
hydrocarbonées respectivement portées par la substance
active lipophile d'une part, le dérivé solubilisateur
hydrosoluble , d'autre part, sont choisies de façon a
favoriser l'établissement des susdites liaisons de
type Van der Waals.
La substance pharmacologiquement active peut être
constituée par toute substance répondant aux critères
indiqués plus haut. D'une façon génerale, on remarque
que la lipophilie de la substance pharmacologiquement
active peut résulter soit de la longueur des chaînes
hydrocarbonées qu'elle porte, soit - et en particulier
lorsque ces chaines hydrocarbonées sont courtes - du
nombre de ces chaines, soit encore, bien entendu, de
la conjugaison des longueurs et du nombre de ces
chaines hydrocarbonées.
On l'a déja vu, la substance active peut être
constituée par tout dérivé de muramyl-peptide
comportant une chaîne hydrocarbonee tendant a reduire
l'hydrosolubilite du muramyl-peptide correspondant,
dès lors qu'il serait dépourvu de ladite chaîne
hydrocarbonée. Une catégorie préféree de tels
muramyl-peptides dits "lipophiles" est encore
illustrée ci-apres.
Une autre catégorie de composés préferes est
constituée par des dérives ou analogues
saccharidiques, notamment mono- ou di-saccharidiques
du lipide A. Certains exemples préferes de ces
analogues sont évoques plus loin.
. . ., ., .. . : ~ . . : , .... . .: ~ . . .
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2087~3~
D'autres substances pharmaceutiques peuvent
également être solubilisees en mettant en oeuvre les
techni~ues de l'invention. ~ -
Parmi celles-ci, il faut citer en particulier les
peptides cycliques de la famille de la cyclosporine,
par exemple la cyclosporine A (J.F. Borel et al,
Agents Actions - 6 (1976) l + 68; is, Immumnology 32
(1977) 1017 ; P.J. Tudchka et al., Blood 61 (1983)
318) mais aussi les pseudopeptides cycliques, par
exemple la valinomycine ou des macrolides polyéniques,
par exemple la lucensomycine, et les vitamines
liposolubles, notamment vitamines A, D, E, K,
D'une façon genérale toute substance
pharmacologiquement active du type polyenique, mono ou
poly-saccharidique, polypeptidique, à caractere
cyclique ou non, ou encore glycopeptidique, qui porte --
au moins une chaine hydrocarbonee telle qu'elle a eté
definie plus haut, peut être former le constitutant
lipophile des compositions selon l'invention.
L'invention s'appligue en particulier a la
solubilisation de substances pharmacologiquement
actives, dont le caractere de solubilité s'avérerait
insuffisant pour une application médicale, quelle que
soit la voie d'administration envisagée, des lors
qu'elle comporte une chaîne hydrocarbonée qui peut
s'associer, par l'intermediaire de liaisons de type
Van de Waals, avec une chaîne hydrocarbonee
correspondante portée par un derivé osidique, tel
qu'il a eté defini plus haut.
Quant au derive osidique hydrosoluble, il
convient de noter que l'expression "osidique" telle
qu'utilisee ci-dessus, et dans ce qui suit, se
rapporte de faqon generale a tout produit comprenant
dans sa structure un (ou plusieurs) residu(s)
saccharidique(s).
., ! , ' 'j~ ;
' ' ' , :
.i, ' ' ' ' , "
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2~8r~ 3 ~ 6 ~.
D'une manière génerale, tout dérivé osidique tel ::
que défini ci-dessus est utilisable dans les
compositions de l'invention, dès lors que ce derivé
n'entraîne pas une modification des propriétes
pharmacologiques de la substance active sus-
mentionnée, telle que cette dernière deviendrait
inactive ou toxique.
Les chaînes hydrocarbonées portées, soit par la .
substance pharmacologiquement active, soit par le
derivé d'oside, sont avantageusement elles-mêmes des
groupements lipophiles. Elles sont notamment
constituées :
. soit par au moins une structure hydrocarbonée
linéaire de 3 a 20, notamment de 4 a 20 atomes de
carbone, comprenant le cas echeant, une ou plusieurs :
liaison(s) ether, ester, thioether, thioester, ou
amide, cette structure linéaire étant désignée ci-
apres par groupement lipophile "de type A",
. soit par au moins une structure hydrocarbonee
ramifiee de 5 à 50, notamment de lO à 50 atomes de
carbone, comprenant le cas écheant, une ou plusieurs
liaison(s) ether, ester, thioether, thioester, ou .
amide, cette structure ramifiée étant désignée ci- ~:
apres par groupement lipophile "de type B".
Une catégorie de dérives osidiques préférés pour
la production de compositions conformes à l'invention
sont ceux qui repondent a la formule (I) suivante : :
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7 ~87~3~ -
CH2R
~'
R3 R2
dans laquelle :
- R représente un groupement hydrocarbone comportant
au moins 3 atomes de carbones, notamment un groupement
lipophile "de type A" ou "de type B",
- R2 représente H, ou OH, ou un groupement acetamido,
sulfate, sulfamido, phosphate, phosphamido,
- R3 et R4, identiques ou differents, representent
soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un groupement
sulfate ou phosphate,
- R1 représente soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un
residu ose ou osamine dont le carbone anomérique en
position l (Cll est engagé dans une liaison
glycosidique, les positions C2, C3 et C4 étant
respectivement substituees par des groupes R ' 2, R ' 3,
et R'4 ayant respectivement les significations donnees
ci-dessus pour R2, R3, et R4, et la position C6 par un
groupe R ' ayant la signification donnée ci-dessus pour
R,
l'un au moins des groupes R2, R'2, R3~ R'3~ R4 ou R'4
représentant un residu sulfate ou phosphate.
A titre d'exemple de derives osidiques répondant
à la formule (I) sus-mentionnee, on peut citer les
composes suivants :
- a ou ~-methyl-glycoside N-acetyl-4-sulfate-6-OR-
2-désoxy-glucosamine,
, : ' :'' ','',,
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75~
- N-acetyl 4-sulfate-6-OR-2-desoxy-glucosamine,
- ~ ou ~-methyl-glycoside 4-sulfate-6-OR-glucopyrano-
se,
- 4-sulfate-6-OR-glucopyranose,
- 6,6'-di-OR-4,4'-di-sulfate-a,~'-D-tréhalose,
R ayant la signification indiquée ci-dessus.
Il va de soi que les groupements lipophiles ne
doivent pas être d'une longueur telle ou en un nombre
tel que l'ensemble du dérivé osidique tendrait a
devenir insoluble.
Des dérives osidiques préférés sont choisis parmi
les composés suivants :
- ~ ou ~-méthyl-glycoside N-acetyl-4-sulfate-6-
octanoyl-2-désoxy -glucosamine,
- ~ ou ~-methyl-glycoside-N-acetyl-4-sulfate-6-(2,3-
dipalmitoyl) glyceroyl-2-desoxy-glucosamine,
- N-acétyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy-glucosamine,
- N-acétyl-4-sulfate-6-(2,3-dipalmitoyl)-glyceroyl-2-
désoxy-D-glucosamine,
- a ou ~-methyl-glycoside 4-sulfate-6-octanoyl-glu-
copyranoside,
- ~ ou ~-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-(2,3-dipalmi-
toyl)-glyceroyl-D-glucopyranoside,
- 4-sulfate-6-octanoyl-D-glucopyranose,
- 4-sulfate-6(2,3-di-palmitoyl)-glycéroyl-
glucopyranose
- 4,4' di-sulfate-6,6' di-octanoyl~ '-D-trehalose,
- 4,4'di-sulfate-6,6'(2,3-dipalmitoyl~-glyceroyl-
~
D-trehalose.
Certaines categories de compositions conformes à
l'invention seront encore davantage - et de façon non
limitative - illustrées dans ce qui suit.
Les deux groupements hydrocarbones, le cas
echeant, lipophiles par eux-mêmes, assurant
respectivement une association non covalente entre la
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2n~7~3~
9 ,.
substance pharmacologiquement active et le dérivé
d'oside, sont des structures hydrocarbonées linéaires.
Cependant de manière avantageuse, ces groupements sont
tels que 1'un d'entre eux est compose d'une structure
hydrocarbonee linéaire, tandis que l'autre est
constitué d'une structure hydrocarbonée ramifiée.
La structure hydrocarbonée ramifiée est alors de
préference choisie parmi celles constituées d'-une
chaîne hydrocarbonee ramifiée, dont les ramifications
prennent naissance sur deux atomes de carbone
adjacents, ou au plus séparés par un atome de
carbone.
De preférence la structure hydrocarbonee linéaire
doit alors, pour s'associer à la chaine hydrocarbonée
ramifiée, avoir une longueur suffisante permettant
l'instauration de liaisons non covalentes, notamment
du type Van der Walls, avec l'une au moins des
ramifications de la structure hydrocarbonée ramifiée.
Ainsi, l'association de la substance
pharmacologiquement active et du dérive osidique
s'effectue-t-elle par l'intermédiaire de leurs
groupements hydrocarbonés, voire lipophiles
respectifs, des lors que s'établissent des liaisons
non covalentes suffisamment fortes pour permettre à la
structure hydrocarbonée linéaire, d'être maintenue
dans une position dite en "sandwich" entre les deux
ramifications de la structure hydrocarbonée ramifiée.
De preference, la structure hydrocarbonee
linéaire possède un nombre d'atomes de carbone au plus
egal au no~bre d'atomes de carbone des ramifications
de la structure hydrocarbonée ramifiée.
L'association du derivé osidique tel que decrit
ci-dessus, de nature amphiphile et hydrosoluble, ~ la
substance pharmacologiquement active hydrophobe et
- . . .
.~. .. . . . .
. , : ,., ::: : .. . : .
W092/01475
2 ~ 3 ~
insoluble dans l'eau, permet la dispersion homogene de
cette dernière dans un solvant aqueux.
- L'invention a plus particulièrement pour objet,
toute composition susceptible d'être solubilisee ou
dispersee de façon homogene dans un solvant aqueux,
caractérisée en ce qu'elle comprend :
(1) une substance pharmacologiquement active, insolu-
ble dans l'eau, cette substance étant substituée :
. soit par un groupement lipophile "de type A",
. soit par un groupement lipophile "de type B",
(2) un dérive osidique associe de façon non covalente
a la substance (1), ce derive osidique etant lui-même
substitué :
. soit par au moins un groupement lipophile "de
type A" lorsque ladite substance pharmacologiquement
active est substituée par un groupement lipophile "de
type B",
. soit par au moins un groupement lipophile "de
type B" lorsque ladite substance pharmacologiquement
active est substituée par un groupement lipophile "de
type A",
l'une au moins des fonctions hydroxyle du dérivé
osidique sus-mentionné étant substituée par un, ou
plusieurs, groupe(s) phosphate ou sulfate.
D'une manière génerale, toute substance
pharmacologiquement active, notamment de nature
insoluble dans un solvant agueux, et sur lequel est
- susceptible d'être greffé au moins un groupement
lipophile "de type A" ou "de type B" sus-mentionnés ou
plus généralement une chafne hydrocarbonée plus
courte, peut être utilisé en tant que substance
pharmocologiquement active entrant dans les
compositions de l'invention.
Les techniques decrites plus loin à titre
d'exemples
~, .. ,. , ,' ' . ' ''` .
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~8~53l~
pour le greffage de ces groupements lipophiles ou
chaines hydrocarbonees sur des derives d'oside sont
egalement applicables au greffage de chaines de même
nature sur les substances phamacologiquement actives
insolubles, des lors qu'elles en seraient elles-mêmes
depourvues.
Parmi les substances pharmacologiquement actives
(ou principes actifs lipophiles) entrant dans les
compositions de l'invention, on peut citer les dérivés
lipophiles de muramyl-peptide répondant a la formule
(II) suivante :
L-(31)nl~0 ~
~_, O H
HO\~/
HCOCH 3
/\
R5 Co-x-NH-clH-co-R6
CIH2
CH2-cO- ~ Al ) n2 Y
dans laquelle
~ Rs représente H ou CH3 ;
- R6 represente un groupe -NH2, -OH ou un groupe -OW1,
W1 etant un groupe hydrocarboné comportant de l à l0
atomes de carbone ;
- X représente un residu aminoacyle du groupe
comprenant alanyle, valyle, isoleucyle, norleucyle,
leucyle, threonyle, prolyle, glutaminyle,
asparaginyle, méthionyle, tryptophanyle,
phénylalanyle, tyrosyle, glycyle ;
: ' .- ': '" : '
: : '
WO92/01475 PCT~FR91/00595
- 2 Q ~ ~ ~ J ~ 12
- Y représente soit OH, soit NH2, ou un groupe -OW2, W2
etant un groupe hydrocarbone de l à 4 atomes de
carbone, ou encore un groupement lipophile du type A
ou du type B, -
- Z représente soit H, soit un groupement lipophile
"de type A" ou "de type B",
etant cependant entendu que l'un au moins des deux
groupes Y et Z est toujours constitué par un
groupement lipophile "de type A" ou "de type B" ;
- nl et n2, identiques ou différents, représentent . .
zéro ou l,
- A~ et B1 sont soit des groupes respectivement
identiques ou différents comprenant de l à 3 résidus
aminoacyles, eux-mêmes identiques ou différents entre
eux, ou encore un groupe -NH-(CH2)p-CO- avec des
valeurs de p comprises entre 2 et lO.
Une composition particulièrement preferée de
l'invention, comprend des composés de formule (II) - ~
sus-mentionnée, dans laquelle -
- n1 et n2 représentent zéro, -
- R5 représente CH3,
- R~ représente -OH, -NH2 ou -On (CH2) H avec x1 compris
entre l et 6, avec une preference pour x1=4, -
-X est L ou D-alanyle, L-threonyle, L-valyle, : :
- lorsque Y représente -O-CH2-CHO(R7)-CH2O(RB),
Z représente H, et lorsque Z représente
O
Il . ,.
-C-CHO(R7)-CH2O(R8), Y represente -OH, -NH2 ou un
groupe -OW2, W2 ayant la signification indiguee ci-
dessus, et R7 et R8 etant des groupes palmitoyle.
Une autre composition preferée de l'invention
comprend des composes de formule (II) sus-mentionnee,
dans laquelle :
, .,. , , , , ., ~ ,. : . , ~ . ,
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- 20~53',
- nl et n2 representent zero,
- ~ represente CH3
- ~ represente -OH, ou -NH2 ou On (CH2) 1H avec x~
compris entre l et 6, avec une preference pour x1=4,
-X est k ou D-alanyle, L-thréonyle, L-valyle,
- lorsque Y represente -O-(CH2)X2H avec x2 8, Z
représente H, et lorsque Z représente -CO(CH2)~2H, avec
x2 = 8, Y représente -OH, -NH2, ou un groupe -OW2, W2
ayant la signification indiquée ci-dessus.
La substance biologiquement active susceptible
d'être associee avec les dérives d'osides, definis
plus haut, pour former des compositions solubilisables
ou dispersables conformes a l'invention, peut encore
appartenir à d'autres catégories de produits.~ Il
s'agit, par exemple de substances immunomodulat_ices,
sélectionnées parmi :
- des constituants d'origine bactérienne, entre autres
des constituants de la paroi bacterienne : derives du
tréhalose, notamment du type du TDM (produits de la
classe des tréhalose dimycolates), et
lipolysaccharides (LPS) qui comportent d'une part des
chaines lipidiques et, d'autre part, au moins un
groupe phosphate ou sulfate :
- des fractions lipidiques obtenus à partir de ces
LPS, en particulier le "Lipide A" (cf par exemple
article de Ernst Th. Rietschel et al intitule
"Molecular structure of bacterial endotoxin in
relation to bioactivity" (Structure moléculaire des
endotoxines bactériennes en relation avec leur
bioactivite) dans l'ouvrage lui-même intitule
"Cellular and molecular aspects of endotoxin
reactions" (Aspects cellulaires et moléculaires des
réactions mettant en oeuvre des endotoxines), sous la
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7~3~
direction de A. Nowotny, J.J. Spitzer et E.J.
Ziegler ; 1990, Elsevier Science Publishers B.V.
(Division biomedicale), pages 15-32); on rappelle pour
memoire la formule du "Lipide A" (III) :
HO
COO--C ~ CH
(~H2)y (CH2~x CONH HO CH - OOC
CH~ CH~ CH2 CONH (CH2)X (CH2)y
COO ~ CH CH2 CH~ 3
~CH2)y (cH2)x COO CH
CH3 CH~ (CH2)y (cH2)x
CH~ CH~ x - ~o
- des analogues des précedents constituants d'origine
bacterienne ou des produits (naturels,
hémisynthetiques ou de synthèse) correspondant a des
fragments de ces constituants d'origine bactérienne,
notamment des derivés detoxifiés. On mentionnera tout
particulierement des dérivés ou analogues du lipide A,
mono- ou di-saccharidiques, mono- ou diphosphorylés,
porteurs de chaines ramifiees ou encore de chaines
hydrocarbonees lin~aires, pouvant être elles-mêmes
substituées ou non, par des chaînes hydrocarbonées
lineaires au moyen de liaisons ester, thioester, éther
ou thioether, produits qui, obtenus par synthèse ou
hémisynthese, ont une toxicit~ attenuée par rapport au
Lipide A naturel.
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~7~
Une première famille est celle des analogues ou
derives disaccharidiques du Lipide A, tel que les MPL
(monophophoryl Lipid A, produit par Ribi immunochem,
Research Inc.). Ce sont des structures très
hydrophobes dispersables dans l'eau de façon homogene,
en presence des susdits derivés d'osides.
Ces analogues du Lipide A repondent a la formule
genérale (IV),
HO -
R 40$
NHR2 OR t
NHR 2
dans laquelle:
R4 et R'1 representent H ou P04, avec au moins R4 ou R'
etant un groupe P04
R2, R3 et R'2, R'3 représentent CO-CH(OR)-(CH2)X-CH3,
x étant compris entre 5 et 15, avec une préférence
pour x = 10, et R étant CO-(CH2)y-CH3 y etant compris
entre 5 et 15 avec une préférence pour y = 10 ou 12.
Une deuxième famille est celle des analogues ou
dérivés monosaccharidiques du Lipide A, notamment le
MRL 953 (produit decrit dans P.L. Stuetz et al, in
Cellular and molecular aspects of endotoxin reactian
A. Nowotny, J.J. Spitzec, E.J. Zlegler editeurs.
(Elsevier Science Publishers) 1990, pages 129-144).
Ces analogues et dérives monosaccharidiques du
Lipide A repondent ~ la formule generale (V) :
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r~ ~) 3 b
16
HO--
~ORI
NHR2
dans laquelle : -
R~ représente H ou PO3
R2 et R3 représentent CO-CH(R)-(C~2)x-CH3, x etant
compris entre 5 et 15, avec une pré~érence pour
x = l0, et R etant H ou OH ou encore CO-(CH2)y~CH3, y
etant compris entre S et 15 avec une preférence pour
y = lO ou 12,
R4 représente PO3 si R1 n'est pas PO3, ou H ou encore
l'une des significations données à R2 et R3.
Pour les mêmes raisons d'hydrophobicite que dejà
évoquees a propos de certains Muramylpeptides, leur
formulation galenique est souvent diffici}e.
Néanmoins, comme les Muramylpeptides lipophiles ils
peuvent conduire à des solutions ou dispersions
aqueuses homogenes en presence du susdit derivé
d'oside.
La presente invention concerne donc l'utilisation
des compositions selon l'invention soit seules pour
stimuler les defenses génerales de l'organisme, soit
avec un antigene.
Le dérive d'oside et la substance
pharmacologiquement active sont, dans l'association,
avantageusement dans un rapport ponderal de 0,25 a 5,
notamment de 0,5 à l,5.
WO92/01475 PCT/FR91/OOS9S
2og7r~,3~j
L'invention a egalement pour objet les dérivés
osidiques de formule (I) eux-mêmes, des lors qu'ils
comportent au moins un groupe sulfate, ainsi que leur
procedé d'obtention selon des methodes qui sont
classiquement utilisees en chimie de synthèse des mono
et des oligosaccharides.
A titre illustratif, cette méthodologie procède
par etapes successives a partir de l'ose ou de
l'oligosaccharide a modifier chimiquement, pour
parvenir au dérive recherche, specifiquement substitue
sur la position voulue. Pour ce faire, les fonctions
en positions C1, C2, C3, C4 et C6 d'un ose et celles
correspondantes d'un oligosaccharide, sont protégées
temporairement par des groupements protecteurs (tels
que benzyle, benzylidene, acetyle...) introduits
specifiquement et sequentiellement sur les positions
qui ne seront pas finalement l'objet de la
modification chimique envisagée, en tirant partie des
différences de reactivité desdites fonctions.
Puis l'introduction des groupements lipophiles
"de type A" ou "de type ~" sus-mentionnés ou
d'ailleurs de chaînes hydrocarbonées plus courtes, est
avantageusement effectuée de la maniere suivante :
les (ou la) fonctions hydroxyles primaires non
protégées, peuvent reagir soit sous forme substituée
par un groupe tosyle avec un sel d'acide gras, en
presence d'ether couronne, soit sous forme libre avec
un chlorure d'acide gras, ou avec la fonction
carboxylique d'un acide gras en presence d'un réactif
de couplage.
Après introduction des (ou de la) modifications
chimiques envisagees sur les (ou la) positions restees -~
libres, le derive obtenu est libere (etape de
déprotection) de tous ses groupements protecteurs pour
aboutir au derive mono ou oligosaccharidique voulu.
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~2 ~ ~r`~ r~ 18
Le cas echéant, l'introduction des (ou du) groupes
phosphates est realisee préalablement à l'etape de
deprotection sus-mentionnee, par la méthode dite
phosphite triester decrite dans Perich, J.W. et al,
Tetrahedron Lett., (1988), 29, 2369.
L'introduction du (ou des), groupe(s) sulfate est
réalisee après l'etape de déprotection sus-mentionnee,
notamment par utilisation du complexe trimethylamine- -
anhydride sulfurique selon la méthode notamment
decrite dans Ichikawa Y. et al, Carbohydrate Research,
172, ('988), 37-64.
L'invention concerne également des compositions
pharmaceutiques comprenant une composition du type de
celles décrites ci-dessus, ou un mélange de ces
compositions, dispersee(s) dans un solvant a~ueux
physiologiquement acceptable.
De manière avantageuse, les compositions de
l'invention peuvent être lyophilisées a partir de leur
solution ou dispersion aqueuse, et se présentent alors
sous forme de poudre.
Ces compositions sous forme de poudre sèche, sont
aisément solubilisees ou dispersées à nouveau dans un
volume approprié de solvant aqueux.
L'invention concerne également un procede de
modification des propriétés de solubilité d'une
substance pharmacologiquement active du type (l)
décrite ci-dessus, ce procédé consistant en -- `-
l'association de la substance (l) avec un derive
osidique de type (2) tel que decrit ci-dessus, dans
des conditions telles que lorsque cette association de
(l) et (2) est mise dans l'eau, on obtient une
solution (ou une dispersion) utilisable notamment en
tant que préparation injectable, lorsque l'eau sus-
mentionnée est sterile.
. ; . ' ~ :
WQ92/01475 PCT/FR91/00595
~0~7~31`
La solubilisation de la substance phar-
macologiquement active (1) est telle que l'on obtient
un fluide caracterisé par une faible opalescence
(mesurable par nephelométrie), celle-ci étant même
souvent absente.
Ce fluide se comporte comme une solution et est
susceptible d'être administre dans l'organisme en tant
que solution injectable. La dispersion d'une substance
dans un milieu aqueux correspond a une répartition
stable et homogene des molécules de cette substance
dans la masse de ce milieu, résultant d'une
solvatation totale ou partielle par des molécules
d'eau, et non a une dispersion de cette substance
sedimentable avec le temps. En particulier on
n'observe aucun changement d'etat physique dans la
dispersion dans les 24 heures qui suivent sa
préparation.
L'invention a egalement pour objet un procede
d'obtention des compositions décrites ci-dessus
comprenant : -
- la solubilisation du (ou des) derivé osidique dans
une quantité déterminee d'un solvant aqueux,
- l'addition sous agitation à la solution précedemment
obtenue, d'une quantité déterminée d'une (ou
plusieurs) substance pharmacologiquement active, soit
en suspension dans un solvant aqueux, soit en solution
dans un solvant organique, `
- le cas echéant, l'elimination du solvant organique,
- le cas écheant encore, la lyophilisation de la
solution précédente.
En variante, le procede d'obtention des
compositions de l'invention est realise en
additionnant, dans les conditions prec~demment
decrites, le (ou les) derivé(s) osidique(s) à une
:
, . .
W092/Ot475 PCTtFR9t/00595
~ 0 ~
quantite determinee d'une (ou plusieurs) substance(s)
pharmacologiquement active(s).
L'invention est davantage illustree dans la
description detaillee qui suit, sans que cette
dernière ne revête un caractère limitatif.
Description de la ~ynthese du sel de sodium du 6,6'
di-octanoyl-~,4'-disulfonyl-~,~-D-tréhalose ~ou com-
posé P1)
.6,6'octanoyl-2,3-2~,3',tétra-0-benzyl-~,~'-D-tréhalo-
se
Dissolution dans le THF sec (50 ml), sous argon,
a l'abri de la lumiere de 3 mmoles de 2,3-2',3'-
tetra-0-benzyl~ -D-tréhalose (A.F. Hadfield,
L. Hough, and A.C. Richardson - Carbohyd. Res. 63,
(1978), 51) de 7,5 mmoles d'acide octanoïque, et de
7,87 mmoles de triphénylphosphine. A la solution
refroidie a O-C, addition en 15 minutes d'une solution
de diisopropylazodicarboxylate (8,02 mmoles) dans le
THF sec (25 ml). Purification sur silice 60 H sous -
pression dans le mélange de toluène/CH2Cl2/AcoET
30/10/5. Huile : m = 2,58 g (90 %).
. Sel de sodium ~u 6,6'-dioctanoyl-2,3-2~,3'-tetra-0-
benzyl-4.4~-di-~ulfonyl-,a~-D-trehalose.
A 1,5 mmole du produit précédent en solution dans
le DMF sec (15 ml), addition de 15 oles de complexe
trimethylamine/anhydride sulfurique (2,1 g~ et
incubation a 50 C en conditions anhydrides pendant 2
jours. Addition de C~30H (10 ml), puis, extension par
du chloroforme (10 ml) et percolation sur Sephadex
LH20 dans le melange CHCl3-CH30H : I/I. Apres
concentration, purification sur colonne de silice 60H
sous pression, dans le melange CHCl3-CH30~-H20
15/5/05 (1,7 g : huile). Dissolution dans le melange
DMF-H20 : I/I (80 ml) et percolation sur colonne de
~' ~ . ' . . ' ' . ' .' ' . ` . '' ' ' '
'~` "; ' ................ 1 1' ; '. ... ' `,
`', , ' ~ , ' . '
.
WO92/01475 pCT/FR9l/00595
~0875'~
resine Dowex 50 WX4 ~ (85 ml) par élution avec le
même mélange de solvants : neutralisation par NaOH
O,lN : lyophilisation m = 1, 51 g (87 %).
. Sel de sodium du 6,6~-dioctanoyl-4,4~-di-O-sulfonyl-
a~ts~-D-treh~lOse (C28H~8Na2019B2 798,79)
1,5 g du derive precedent, solubilisé dans 150 ml
d'un melange eau/alcool (6,5/10), est hydrogene en
présence de 750 mg de Pd/C a 10 ~. Après filtration,
concentration,lyophilisation en solution aqueuse.
Purification sur silice 60-G dans CHCl3-CH30H-CH3COOH-
H2O : 40/20/8/2. Concentration, coévaporation avec du
toluene, lyophilisation en solution aqueuse.
Percolation sur Sephadex LH20 dans le méthanol.
Concentration dessiccation, lyophilisation en solution
dans l'eau m = 525 mg (51 %). -
Teneur en sulfate : 2,7 Eq/g (conductimetrie).
teneur en acide octanoïque : 1,97 Eq/mole (CPV).
EXE~PLES DE MISE8 EN OEUVR~ DU DERIVE D'OSIDE P~ DAN8
DES CONPOSITION8 CONFORME8 a L~INVENTION
EXEMP~E - I :
1): Desicription de mises en oeuvre de la diseersion
aqueuise de MDP-GDP, ¢'est-~-dire le a~N-~cetyl-mura-
myl~ lanyl- D-iisoglutamine) -~B,~-dip~lmitoyl-sn-Gly-
cerol, avec le compoisié Pl
- Premier mode de mise en oeuvre
mg de P1 sont dissous dans 10 ml d'eau
distillee. A la solution sont ajoutés 10 mg de MDP-
GDP, sous forte agitation. La dispersion aqueuse
obtenue est d'aspect opalescent et ne sédimente pas ou
tres peu, (une nouvelle agitation permet d'obtenir a
nouveau la dispersion homogène). Après lyophilisation,
on peut par addition d'eau ou de solute physiologique,
reconstituer une dispersion d'aspect identique.
- Deuxième mode de mise en oeuvre
WO92/01475 PCTtFR91/00C~5
r~ ~ 3 ~j 22
Mode de mise en oeuvre 2.20,57 mg de MDP-GDP sont
dissous dans 2 ml de chloroforme (solution A). 20 mg
de P1 sont dissous dans l ml de chloroforme
(solution B).
Les solutions chloroformiques (A) et (B) sont
reunies. On ajoute de 5 à l0 ml d'eau distillée et on
fait barboter un courant d'azote a partir du fond du
tube contenant les deux phases, jusqu'à elimination
complète du chloroforme.
~ n obtient une dispersion aqueuse homogene et
stable, légerement opalescente.
La dispersion aqueuse est lyophilisee et la
poudre obtenue est reprise dans un solvant aqueux à la
concentration desiree. On obtient une dispersion de
même aspect et qualite que precedemment.
Le procéde permet une formulation galénique aisée
des principes actifs de medicaments lipophiles
correspondant à }a formule genérale (II). Il en
résulte des preparations qui conservent les activités
pharmacologiques de ces produits, notamment en tant
que regulateur de la réponse immune, telles qu'elles
ont été revendiquées dans le brevet européen n- 0 165
123 .
2~ : Influence de l~utilisation de Pl sur l' wtivité
adjuvante du MDP-GDP étudiée chez le cobaye.
a) PréParation de l~émulsion
l mg de P1 est dissous dans 0.5 ml de solute
physiologique, cette solution est ajoutee goutte à
goutte à l mg de MDP-GDP en poudre.
La dispersion obtenue est mélangée a 0,5 ml d'une
solution isotonique en ovalbumine a 20 mg/ml. Elle est
additionnee de l ml d'huile minerale (Adjuvant
Incomplet de Freund, AIF) et on procede à l'emulsion.
Cette preparation contient donc par ml, 0,5 mg
d'adjuvant, 0,5mg de Pl et 5 mg d'ovalbumine
.~
WO92/01475 PCT/FR91/00595
~87~t'~u
23
b) Methodoloqie
Les lots temoins reçoivent a) de l'emulsion
eau/huile minerale contenant l'antigène seul, b) la
même emulsion contenant les molecules adjuvantes
seules (MDP-GDP). Les lots expérimentaux reçoivent les
emulsions contenant le dérivé osidique P1. Les
injections se font par voie sous cutanee dans les
coussinets plantaires arrieres de cobayes mâles
Hartley pesant 350 g. Apres 3 semaines les animaux
reçoivent par voie intradermique 0,1 ml de soluté
physiologique seul ou contenant 0,1 ml d'ovalbumine.
Après 48 heures, on mesure le diametre d'induration
qui est le signe de l'etablissement d'un état
d'hypersensibilité retardée. Après 24 heures, les
animaux sont sacrifies par ponction cardiaque et les
serums recueillis. Le titrage des anticorps circulant
se fait par la methode Elisa suivant les modalites
classiques, notamment celles decrites dans :
F.AUDIBERT, L. CHEDID, P. LEFR~NCIER and J. CHOAY,
Immunol. tl976), (21), 143 ; et M. JOLIVET, F.
AUDIBERT, H. GRAS-MASSE, A. TARTAR, D. SC~hESSINGER,
R. WITZ and ~. CHEDID, Infect. Immunol. (1987), (55),
1498.
', ' , , '
WO92/01475 PCT/FR91/00~a5
i~a'~,'l 'à3 ~ -
24
c) Résultats
Les resultat3 obtenus sont con~ignes d~ns le
tableau suivant :
IMMUNISATION~ HYPERSENSIBILITE TITRE ANTI-
RETARDEE - CORPS ELISA
diamètre d'indu-
ration mm
AIF oØ0.0 22.000, 37.000,
65.000, 95.000
AIF+P1 o.O.o.0 7.000, 8.000,
100 ~g 21.000.
AIF+MDP-GDP 100~g 8,14,15,17 241.000,295.000
325.000,641.000.
AIF+MDP-GDP 5,16,20,25 157.000,275.000,
100~g+P1 275.000,318.0000
100 ~g
: Tous les animaux ont reçu 1 mg d'ovalbumine.
Les chiffres représentent la dilution maximum du sérum
permettant d'obtenir une densité optique égale à celle
obtenue en utilisant un sérum normal dilué 50 fois.
Ces resultats montrent que le MDP-GDP est un fort
adjuvant de la reponse a médiation cellulaire et de la
réponse humorale et que l'addition de P1 n'a pas
modifié leur activite.
3) : Influence du dérivé osidigue Pl 8US les
proprietés immunostimulante~ des muramyl-peptides.
a - Activite anti-infectieuse
Les souris Swiss ont reçu Pl, le MDP-GDP , ou le
MDP-GDP + P1 par voie veineuse 24 heures avant
~ - . , ' ` '
: . . . .
' . : ' ' '.
WO92/01475 PCT/FR91/00595
'~ a 87 ~ 3lj
1'infection par 1 x 104 Klebsiella pneumoniae. La
solution de P~ est ajoutee au MDP-GDP pour obtenir une
preparation contenant une quantité équivalente de 2
produits (poids/poids).
Les resultats du tableau I montrent que P1 seul -
n'a aucune action protectrice contre l'infection. La
comparaison de l'activité des différentes doses de
MDP-GDP, seul ou avec P1, ne montre pas de differences
significatives.
On peut conclure de ces expérimentations que le
compose P1 n'inhibe pas l'activité anti-infectieuse du
MDP-GDP.
b - Action du MDP-GDP sur la ~roduction de TNF
circulant
Le TNF (tumor necrosis factor), est une protéine
- synthétisée par les cellules c- la lignee
monocytes/macrophages lorsqu'elles son~ stimulees. Le
LPS (lipopolysaccharide bactérien) est un inducteur
tres puissant de la production TNF. Les muramyl-
peptides stimulent in vitro la production de TNF mais
ils sont nettement moins efficaces que le LPS. In
vivo, les taux de TNF serique produit après
l'administration de muramyl-peptides sont au-dessous
ou a la limite des possibilités de détection.
Le MDP-GDP, et ~es autres dérivés, qui ont une
action anti-infectieu~e, ont la propriéte d'augmenter
la reponse au LPS injecté apres, provoquant une
augmentation considérable du taux de TNF sérique. Le
tableau II represente les résultats d'une experience
de ce type. On voit que le prétraitement est plus
efficace 6 heures avant le LPS, en particulier dans le
cas de l'association MDP-GPD + P1, mais que 16 heures
avant, l'injection de MDP-GDP a encore un effet de
potentialisation de la reponse.
" ' . ' ': ~ ' ' ~ ' ' ' ~ ' ' ' ' ' " .
WO 92tO1475 PCr/FR91/00.
~8~ rj3~ 26
c - Action du MDP-GDP in vitro sur les monocYtes
du sana humain.
~es monocytes du sang sont isoles et incubés
pendant 24 heures avec différentes doses de produit. ~ -
Les surnageants sont préleves pour doser le TNF et
l'IL-6, cytokines qui sont produites par les monocytes
actives.
Le Tableau III montre que la production de TNF
n'est significative qu'avec 10 ~g/ml de MDP-GDP et que
le produit solubilisé avec le composé P1 est d'une
activite légerement plus élevee. Le dosage de l'IL-6
donne des résultats plus nets et montre également une
stimulation compara~le des monocytes entre le MDP-GDP
et le MDP-GDP solubilisé en association avec P1.
d - Action sur les Pol~nucléaires humains
Les muramyl-peptides ont une action directe sur
les polynucleaires qui est mise en evidence notamment
par la phagocytose et la destruction de Candida ~:
albicans.
L'estimation de cette action est faite par la
capacite d'incorporer du glucose traité par les
cellules du champignon restees viables.
Dans les deux expériences reportées sur le
Tableau IV, les cellules temoins non stimulées ont
deja une activite de base relativement elevée.
Toutefois, l'addition du muramyl-peptide, avec ou sans
Pl, produit une augmentation de l'activite inhibitrice
des cellules sur la croissance du champignon.
En conclusion, que ce soit dans les experiences
faites in vivo chez la souris ou in vitro avec les
cellules humaines, la solubilisation du MDP-GDP par le
compose P~ ne diminue jamais son activite. Le compose
P1seul est toujours inactif.
- ; . -- ~
,:, : , ' ' - ,.~ " ':
- ~. ..
WO92/01475 PCT/FR91/00595
~,a87~3,~
27
~ABI,EAU I
Action Protectrice du MDP-GDP solubilise Par le
com~osé P, chez la souris infectee Par Klebsiella
pneumoniae
:
Traitement i.v., Survie a J + 15 % Protection~
a J-1
.
Témoins 1/16
P~ 100 ~g 0/8
MDP-GDP 3 ~g 3/8 37,5 ns .-
3/8 37,5 ns
12/16 68,7 P < 0.01 - -
100 4/8 37,5 ns
MDP-GDP/ Pl
3/3~g 3/8 37,5 ns
10/10 3/8 37,5 ns
30/30 8/16 43,7 P < 0.02
100/100 7/8 75 P < 0.02
* : Les calculs statistiques sont faits en tenant
compte pour chaque lot de leurs témoins
respectifs.
:. . ~, . , . , ., ~ ,
WO92/0147s PCT/FR91/00~5
~ ~ ~ 7 j 3 j 28
TABLEA~ II
Influence du Prétraitement Par le MDP-GDP solubilise
par P, sur la re~onse TNF induite par le LPS
Traitement avec lOO~g LPS iv Activité TNF dans le
iv/souris avant le LPS 25 ~g serum
U/ml ~g/ml
: - ' '
h-6 P1 189 3,4
h--6 MDP-GDP/P, - < 10 < O ,18
h-6 MDP-GDP +11.475 206,55
h-6 MDP-GDP/Pl +19.038 342,68
h-16 MDP-GDP +1.899 34,18
h-16 MDP-GDP/Pt 4.296 77,33
: 2 heures après l'injection d'epreuve avec le LPS
Activité exprimee en U/ml et en équivalent TNF
recombinant murin, dans le test de cytotoxicité de la
lignée cellulaire L292.
, , .. . , .. , . ,~ ,
: ` '~ ; ~
' :, . : ' '.,., .~ ' "' . ., .: .
W092/01475 PCT/FR91/00595
~7~
~A~LEAU III
Action du MDP-GDP in vitro sur les monocvtes humains
.
Stimulant ~g/ml Activite dans le surnageant
TNF U/mlIL-6 U/ml
.. . .
Pl O < 10
MDP-GDP 0,1 0 < 10
0,1 0 < 10 :. ,
1 0,3 < 10 ~ .
6,9 94,9
MDP-GDP/Pl 0,01 0 ~ 10
0,1 0 < 10 -.-
1 5,9 83
10,5 594 ..
:''
Cellules a 2 x 106/ml, incubées pendant 24 heures avec
les produits.
WO92/01475 PCT/FR91/00C~
`2~ 3~ 30
$ABLEA~ IV
Action du MDP-GDP sur les PolYnucléaires humains
Stimulant ~g/ml Inhibition de croissance du
Candida (%)
lere exp. 2ème exp.
Témoins 35,3 41,5
Pl 10 34,6 38,7
MDP-GDP 0,1 44,1 47,2
1 7S,1 78,1
86,2 86,1
MDP-GDP/P1 0,1 32,2 77,2
1 41,4 93,6
65,9 95,1
.
Les polynucleaires (1 x 106/ml) sont incubes avec les
stimulants pendant 30 minutes et distribués dans les
puits des microplaques avec une suspension de C.
albicans à 1 x 104/ml. Après 18 heures, le milieu de
culture est éliminé et l'incorporation de 3~-D-glucose
par les cellules de Candida est mesurée apres une
incubation de 3 heures.
.. , , , l
. ~ - , . : - . , :-~
,: . . ., j . .
: . ~., " ' " .: ' '' . : '
.. . ..
. ::: ..
WO92/01475 PCT/FR91/00595
31 ~7~3i3
4) : Influence du derivé osidique Pl sur l'effet
pyrogène du MDP-GDP.
Les essais de pyrogénicite ont éte réalises sur
des lapins neozelandais de 3 a 4 kilogrammes maintenus
en boîte a contention. Les animaux ont rec,u une dose
de produit dans un volume de O.S ml/kg par voie
veineuse au temps zéro et leur température enregistrée
pendant 5 heures en continu.
(a). Evaluation de la ~vroqénicité de P1
Deux lots de trois lapins ont été constitués :
. groupe I : 10 ~g/kg de P1 ;
. groupe II : 100 ~g/kg de P1.
Les différences de température enregistrees étaient :
. pour le groupe I : 0.15, 0.25; 0.25 (C),
soit une moyenne de : 0.22 C + 0.06 ;
. pour le groupe II : 0.40, 0.15, 0.30 (-C),
soit une moyenne de : 0.28-C + 0.12.
Cette expérience indique que P1 est totalement
denue d'effet pyrogène chez le lapin et dans les
conditions drastiques d'un enregistrement effectué
durant 5 heures.
(b). Evaluation de la P~roqénicite de MDP-GDP en
~resence de P1
La dose minimale pyrogene de MDP-GDP préalablement
determinée, est égale a : 2 ~g/kg.
Il a été choisi une dose de 10 ~g/kg qui donne -
approximativement une augmentation de température de
l-C.
Deux lots de trois lapins ont eté constitués :
. groupe I : 10 ~g/kg de MDP-GDP ;
. groupe II : 10 ~g/kg de MDP-GDP ~ 10 ~g/kg de Pl. -
Les differences de temperature enregistrees sont :
. pour le groupe I : 0.70, 0.50, 0.85 (-C),
soit une moyenne de : 0.68-C + 0.18 ;
. pour le groupe II : 1.15, o.so, 0.65 (oC),
. : - : . . :~: .~ :
, .
W092/01~7~ PCT/FR91/OOC45
~ a ;~ i 32
soit une moyenne de : o.9o~C + 0.25.
Un test statistique de Student (unpaired two-
tailed t test, p = 0.2866) indique que cette
différence n'est pas significative et donc que P1
n'induit pas une synergie de l'effet pyrogène d'un
autre produit comme le MDP-GDP.
Les compositions dispersees obtenues presentent
des propriétés pharmacologiques qui sont de même
nature que celles rapportees ci-dessus pour les
dispersions de la composition MDP-GDP-P~. On fait
encore retour dans l'exemple V sur des résultats
pharmacologiques particulièrement intéressants qui
mettent aussi en oeuvre des compositions dispersables
à base de MDP(Thr)1-GDP et P1.
EXEMPLE II - Production d'une composition dispersable
dans une solution aqueuse à base de l~-acetyl-
muramyl-~-threonyl-D-isoglutamine)-~,~-dipalmitoyl-~n
-glycérol (M9P~hr)l-GDP)
Cette dispersion en présence du composé Pl, est
obtenue exactement dans les mêmes conditions que pour
le MDP-GDP
EXEMPLE III - Production d'une composition dispersable
dans une solution aqueuse d'un a~alogue
monophosphoryle du ~ipide A
2.1 mg du dérivé monophosphoryle du lipide A (MPL
produit par Ribi lmmunochem. Research, Inc.) est
dissous dans 0,5 ml de chloroforme (solution A).
3,8 mg de P1 sont dissous dans l ml de chloroforme
(solution B).
Les solutions chloroformiques (A) et (~) sont
reunies. On ajoute de 2 à 3 ml d'eau distillee et fait
barboter un courant d'azote à partir du fond du tube
contenant les deux phases, jusqu'à elimination
complète du chloroforme.
,~ ' ' . : !
. ' ' `
` : ` :: ' : . . :
WO92t01475 PCT1FR91/00595
2n87~3~
On obtient une dispersion aqueuse homogène et
stable, légèrement opalescente.
La dispersion aqueuse est lyophilisee et la poudre
obtenue est reprise dans un solvant aqueux a la
concentration desirèe. On obtient une dispersion de
même aspect et qualité que précedemment. `:
Propriétés biologigue~ de la di~per~ion agueu~e de MPL
~monophosphoryl Lipid A, Ribi immunochem. Research,
Inc.) ~vec le composé P1
Activité antibactérienne.
Le MPL est mis en solution selon la procédure
recommandee par Ribi immunochem. Research, Inc.. A
partir d'une solution dans le mélange chloroforme :
methanol (4:l) de 20 mg de MPL, une solution mere
contenant 4 mg/ml de MPL est ainsi preparée, puis par
addition de sérum physiologique depourvu de calcium,
solution à 2 mg/ml.
L'essai est réalisé comme decrit dans l'exemple l,
paragraphe 3a.
Le compose P1 n'altere pas l'effet protecteur du
MPL vis-à-vis d'une infection par ~.pneumoniae. `
' ` ~ ' , " ' ' ~, `'
WO92/01475 PCT/FR91/00545
7 ~
~ ABLEA~ V
Effet protecteur du MPL (Ribi immunochem. Research
Inc.) seul ou en presence du compose P1, vis-a-vis
d'une infection par une forte dose (4 x l0 5) de
K.pneumoniae, chez la souris Swiss.
TRAITBMBNT 8URVIVANT8/~OTAL
A~ JOUR + lS
-
TEMOINS 0/8
MPL 0,l mg 0/8
MPL l mg 4/8
MPL l0 mg 7/8
MPL/P10,l mg l/8
MPL/P1 l mg 4/8
MPL/P1 l0 mg 8/8
WO92tO1475 PCT/FR91/00595
;~Q~753 ~
EXEMPLE I~ - Dispersion agueuse d'un analogue
mono~accharidique du Lipide A, le MRL 953 (analogue
monosaccharidigue ~onophosphoryle), de formule VI,
avec le composé P1
0~
~HO~ OH
a) Production de la disPersion
10,65 mg de MRL 953 sont dissous dans O,5 ml de
chloroforme (solution A). 16,91 mg de P1 sont dissous
dans 0,5 ml de chloroforme (solution B).
Les solutions chloroformiques (A) et (B) sont
reunies. On ajoute 2 a 3 ml d'eau et fait barboter un
courant d'azote a partir du fond du tube contenant les
deux phases, jusqu'a élimination complete du
chloroforme. On obtient une dispersion aqueuse
homogène et stable, tres légèrement opalescente.
La dispersion aqueuse est lyophilisee et la poudre
obtenue est reprise dans un solvant aqueux à la
WO92/01475 PCT/FR9l/00~5
3 ~
36
concentration desiree. On obtient une dispersion de
même aspect et qualité que precédemment.
b) ProPrietes bioloqiaues de la disPersion aaueuse du
MRL 953 avec le comPose P1
Activite antibactérienne (figures l(a) et l(b)
L'effet protecteur contre une infection par K
pneumoniae a été évalué chez des souris Swiss femelles
(âgees ~e 5 à 6 semaines). -
Les souris ont reçu la veille de l'infection par
voie intraveineuse :
- 0,2 ml de sérum physiologique,
- LPS (lipopolysaccharide de Salmonella enteritidis)
en suspension dans 0,2 ml de sérum physiologique,
- 0,2 ml de ~1) la dispersion aqueuse de
P1 + MRL 953, contenant 30, lO, 3
et 1 ~g de MRL 953
~2) la dispersion dans un solution de
glucosée de ~RL 953, contenant 30,
10, 3, et 1 mg de MRL 953.
L'infection par ~.pneumoniae est réalisée par
injection intra-veineuse d'une suspension de 0,2 ml
d'une suspension de bactéries (contenant 4,5 x 103
bactéries). La mortalité est notée pendant les deux
semaines qui suivent l'inoculation des bactéries.
La comparaison des figures l(a) et l(b) montre que
l'effet protecteur du MRL 953 est comparable, quelle
que soit ~a méthode de dispersion employée. Les figures
l(a) et l~b) comprennent en effet des courbes
representatives des variations des pourcentages de
souris survivantes (% sur les axes des ordonnees) en
fonction du temps (T en jours sur les axes des
abscisses) lorsque les substances étudiées (LPS et
MPL953) ont eté administrees aux doses indiquees à la
droite des figures, sous forme dispersee dans :
- une solution glucosee (figure l(a) )
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~7~3~
- une solution du derivé d'oside P1 (figure l(b) )
Il résulte de l'examen des figures que l'effet
protecteur des substances etudiees, plus
particulierement du MRL9S3, vis-à-vis d'une infection
par K.Pneumoniae chez la souris est du même ordre de
grandeur dans les deux cas de figure. Il serait même
plus efficace, lorsque le MLR953 est administré sous
forme de dispersion, en association avec le dérive
d'oside P~.
EXENP~E V - I~fluence des dispersions selon l~invention
sur les propriétés biologigues d'un principe actif
tiers
L'association de certains muramylpeptides avec un
dérivé d'oside peut de façon très interessante
entraîner vis-à-vis d'un principe actif tiers ~
. soit un accroissement de l'activite biologique
du principe actif tiers,
. soit une diminution de la toxicité de ce
principe actif tiers,
. soit les deux à la fois.
Ainsi, par exemple, remarque-t-on :
. un accroissement important de l'activité
antivirale de l'interféron, lorsque ce dernier principe
actif est administre postérieurement a l'administration
de l'association du MDP(Thr)1-GDP et du compose P1 dans
les conditions permettant la formation de leur
dispersion aqueuse ;
. une diminution de la synergie toxique du- LPS
avec un muramylpeptide prés-ntant un certain effet
pyrogène, par exemple le MDP-GDP du compose P1, dans
des conditions correspondant à celles deja décrites
dans les exemples precedents. En particulier des doses
de LPS, léthales pour la souris lorsqu'ils lui sont
administrés seuls, ne le sont plus lorsque ces mêmes
- . .: , : .
.: ,, ' ' ' .. ,: - , . ~ ' ' '
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3 ~ 38
doses sont administrées en association avec le mélange
de MDP-GDP et le composé P1.
En d'autres termes, l'invention concerne encore
l'application des compositions selon l'invention à la
modulation de proprietes biologiques de composes tiers,
administrés de façon concomitante ou non.
Ces effets de modulation sont encore illustrés de
façon non-limitative par les exemples dont les
résultats sont rapportés ci-dessous.
~ l) - Influence de l~utilisatio~ du compo~é P1 sur les
propriétés immunostimulantes des muramylpeptides
lipophiles
a) - Auqmentation de 1'activite antivirale de
l'interféron par le MDP(Thr~1-GDP
Le modele expérimental est l'encéphalomyocardite
de la souris. Les animaux sont des souris mâles (Swiss,
17 g). Elles reçoivent par la voie intraperitoneale
soit une suspension aqueuse du seul MDP(Thr)1-GDP, soit
une dispersion aqueuse de MDP(Thr)1-GDP et de compose
Apres 24 heures, il leur est injecté le virus de
l'encéphalomyocardite par voie intrapéritonéale à
raison de lO0 fois la DL 50. Une heure apres cette
injection, certains animaux reçoivent par voie
intrapéritonéale 25.000 U.I. d'interféron ~,~ de
souris.
Le tableau VI présente les résultats obtenus. Il
en résulte que l'utilisation du composé P1 ne diminue
pas, mais au contraire augmente l'activite antivirale
propre du MDP(Thr)1-GDP, et l'effet de
potentialisation de l'activité antivirale de
l'interféron par ce muramylpeptide lipophile.
1, .. . , .. . ,, . . , , . I ' ~ ., ", , :'~ ', .. ' - " , . ", ' ........ . .
. ~
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w~75'~
39
T~BLEAU VI
.~ . .
Augmentation de l'activite antivirale de l'interféron
~,~ vis-a-vis d'une infection par le virus de .:-
l'encéphalomyocardite, chez la souris
.:
T~AITENENT i.p. INTERFERON ~,~ % DE S~RVIE
A J - l
.
Témoin - %
P1 ~600 ~g) _ 0 %
MDP(Thr)1-GDP (600 ~g) ` - 20 %
1P1 (600 ~g) +
¦MDP(Thr)1-GDP (600 ~g) - 35 %
_ + 30 %
P1 (600 ~g) + 30 %
MDP(Thr)1-GDP (600 ~g) + 46 %
¦P1 (600 ~g) +
¦MDP(Thr)1-GDP (600 ~g3 + 70 %
b) - Influence d'un Pré-traitement par les
muramvlpePtides liPophiles sur la Production de
TNF circulant consecutive a l'iniection de LPS
ou d'un analoque svnthetique de LiPide A
(Tableau VII~
Les souris Swiss reçoivent une injection
intraveineuse de :
- 0,2 ml de serum physiologique,
- - du MDP-GDP en suspension dans 0,2 ml de serum
physiologique,
- du MDP(Thr)1-GDP en suspension aqueuse, seul, ou
en dispersion aqueuse, en presence du compose Pl,
- du Murabutide en solution dans 0,2 ml de serum
physiologique.
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r~
L'injection intraveineuse qui précede est faite 6
heures avant l'injection de LPS (S. enteritidis) dans
du sérum physiologique ou bien de MRL 953 dispersé dans
du serum physiologique en presence de P1.
Les animaux sont saignés à l'aorte abdominale de
1,5 a 2 heures (temps optimum de réponse) après cette
derniere injection. L'activite TNF est évaluee par le -
test de cytotoxicite etant mesurée par le nombre de
cellules viables. Une unité de TNF représente la
concentration qui produit 50 % de cytotoxicité dans les
conditions données.
Les suspensions aqueuses de MDP lipophiles
stimulent la réponse TNF a la stimulation par le LPS ou
par la dispersion aqueuse de MRL 953 en presence de P1.
Cet effet est légèrement accentué avec les dispersions
aqueuses de ces MDP lipophiles en presence du
compoSe P1~
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41 ~7~3i3
TAB~EA~ VIS ;~:
Influence d'un pre-traitement par un MDP lipophile sur
la production de TNF sérique consécutive à l'injection
de LPS ou d'un analogue synthétique du Lipide A
(MRL 953).
TRAITEMENT i.v. CHALLENGE ACTSVS~B TN~
H - 6 LPS l~g ( en U.I./ml)
~RL953/P1 300 ~g 1,5h2h
aucun LPS 879
MDP-GDP 100 ~g LPS 2,947
MDP(Thr)t-GDP 100 ~g LPS 4,235
aucun LPS 900 - ~ -
MDP(Thr)1-GDP 100 ~g LPS 3,311
¦MDP(Thr)1-GDP 100 ~g ,~
I+ P1 LPS 7,347
aucun MRL953/P1 <10 ~10
MDP(Thr)l-GDP 100 mg MRL953tP11,089 488
¦MDP(Thr)1-GDP 100 mg
¦+ P1 MRL953/P1 ~ 1,838
Murabutide 100 mg MRL953/P1 ~ 1,150
aucun MRL953/P1 76
Murabutide MRL953/P1 820
WO 92/01475 PCr/FRgl/00595
r~
42
c) - Diminution de la syner~ie toxioue du LPS et du
MDP-GDP en Presence du compose P1 (TABLEAU ~III)
Le MDP-GDP, ~is en suspension dans 0, 2 ml de serum
physiologique, seul, ou dans une solution glucosee en
presence d'acide pluronique (F 68, SERVA), OU encore en
dispersion dans 0, 2 ml de serum physiologigue en
présence du composé P1, est administrée par voie
intraveineuse avec le LPS (S. enteritidis) à des souris
Swiss adrénalectomisees.
La mortalité est notée en 3 jours, mais elle se
produit le plus souvent en 24 à 48 heures.
Les suspensions de MDP-GDP dans le serum
physiologique ou dans une solution glucosée d'acide
pluronique augmente la toxicité du LPS in~ecte
simultanement. La dispersion de MDP-GDP en presence de
P1 diminue cet effet.
Cette diminution de l'effet toxique n'est ras due
à un effet direct du compose Pt sur le LPS iont la
toxicité demeure chez la souris normale en presence du -
composé P1 (résultats non presentes). ~-
On remarqiuera que l'interêt de ces résultats -
réside dans le fait que l'association avec le dérive -~ -
d'oside permet d'envisager l'utilisation in vivo d'un
plus grand nombre de produits lipophiles, par exemple
de muramylpeptides lipophiles qui, tels le MDP-GDP,
peuvent présenter une certaine pyroginicité résiduelle,
sans que l'on ait pour autant a craindre une synergie :
toxique importante, in vivo, de ces produits avec les
LPS des organismes infectieux eventuellement presents
chez l'hôte.
,; .. ' ' , ' :. ' , ,', 'i , .~ ~.
WO 92/01475 PCI/FR91/00595
43 `~ '7 ~ ~ ~
TABLEA~ VIII
Reduction de la synergie toxique du LPS et du MDP-GDP
en presence de P1
.
VE~IC~LE MDP--GDP LPSMORTS/TOTAL
~lg) ~25 lg)
sérum physiologique - + 0/18 ~ .
100 + 7/18 p<O, 02
300 + 17/18 p<O, 01
300 - 0/18
solution glucosée d '
acide pluronique (F68) - + 0/18
100 + 8/18 p<0, 01
300 + 17/18 p<0, 01 ~-
300 - 1/18
dispersion aqueuse,
en présence de P1 ~ + 0/18
100 + 0/18
300 + 6/18 p<O, 05 ~
300 - 0/18 : :
,: . . : . : ,
