Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
2 ~ 8
~WO 95/1678~ PCT/FR94/014S8
VECTEURS EXPRIMANT UN INTERFERON HUMAIN
POUR LE TRAITEMENT DU SIDA
0
La présente invention a pour objet une cassette comportant une séquence d'ADN
codant pour un IFN humain dont l'e,c~, ~ssion est placée sous le contrôle
15 d'éléments régulables par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). La
présente invention trouve une application intéressante dans le traitement ou la
prévention des infections dues au VIH, notamment par thérapie génique.
Le VIH, agent étiologique du SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise),
20 infecte préférentiellement une sous-population de Iymphocytes T, (T helper)
responsables de l'amplification de la réponse immunitaire. En conséquence, la
maladie évolue vers un déficit de l'immunite cellulaire, ce qui rend les individus
malades particulièrement sensibles aux infections opportunistes. Jusqu'à présent,
aucun tr~it~ment ne s'est révélé totalement s~ticf~ic~nt malgré les multiples efforts
25 investis dans le développement de nouvelles molécules antivirales. Ces difficultés
relèvent sans doute de la complexité particulière du virus VIH et de sa capacitéà réprimer les systèmes de défenses immunitaires dans les cellules infectées.
Le VIH est un rétrovirus appartenant à la famille des lentivirus. Son matériel
30 génétique, constitué d'une molécule d'ARN, est encapsidé dans une capside de
nature protéique, elle-même entourée d'une enveloppe virale. Outre les gènes
structuraux (gog, pol et e~v) codant respectivement pour les protéines de la
capside, la réverse-transcriptase et la protéine d'enveloppe, le génome du VIH
comprend des genes régulateurs qui commandent la réplication virale. Parmi ces
wo 95/16784 PCT/FRg4/01458 ~
21~5~
-- 2 --
derniers, on peut citer les gènes tat et rev codant respectivement pour les protéines
TAT et REV.
La protéine TAT a un rôle trans-activateur de l'expression de l'ensemble des gènes
du VIH (Arya et al., 1985, Science, ~29, 69-73). Il semble que TAT intervient
aussi bien à un niveau transcriptionnel que post-transcriptionnel. Elle interagit
spécifiquement avec une courte séquence nucléotidique, désignée séquence TAR
(pour Trans-activation Responsive Region), et localisée à l'extrémité S' du génome
et des transcrits viraux (position +l à +80; +I reprçsent~nt le site d'initiation de
la transcription) (Rosen et al., 1985, Cell, 41, 813-823).
La protéine REV favorise le transport vers le cytoplasme des A~N messagers
(ARNm) codant pour les protéines de structure, pour y être traduits. De son côté,
REV reconnaît spécifiquement une séquence RRE (pour REV Responsive
1~ Element) sur les AE~Nm. Celle-ci est localisée dans le gène enV à proximité d'une
autre séquence dite CRS (cis-acting Repression Sequence), impliquée dans la
rétention nucléaire des AR~m la portant. On suppose que la fixation de la
protéine REV au niveau de sa séquence cible RRE a pour effet de contreb~l~ncer
l'effet inhibiteur de CRS sur le passage des grands ARNm viraux vers le
20 cytoplasme.
Les séquences essentielles à la transcription des gènes viraux sont localisées aux
deux extrémités du génome au niveau des LTRs (Long Terminal Repeat). Alors
que le LTR 5' contient les séquences promotrices ainsi que les séquences TAR,
2~ le LTR 3' comprend les séquences impliquées dans la terminaison de la
transcription.
D'une manière générale, lorsqu'une cellule est infectée par un virus, elle secrète
des interférons (IFNs) en réponse à l'infection virale. Il s'agit d'un groupe de30 protéines exerçant des ef~ets antiviraux et classifié en trois types a, ~ et y. S'il
existe plus d'une vingtaine de sous-types d'IFN a, les IF~Ns ,B et y semblent
uniques.
Paradoxalement, la synthèse des IF~Ns cellulaires (endogènes) est réprimée dans
~Wo 95/16784 21~ 5 6 ~ PCT/FRg~/01458
Ics cellules infecte~s p31' le vm Cene répression empeche les cellules infectéespar le VI~ et les cellules avoisinantes de se défendre efficacemenl contre
l'in~ection viral~ (Mark, 199?, .'~IDS Res. Hun~. Retrovirus~ ~, 199-207).
On a ~ nt trouve que l'introduction dans une ~ellule d'un gène cod,mt pour
un l~N humain (IFN exo~ène) dont l'expression est inductible par les protéines
virales T~'l` etlou RE~, permet ~ la cellule génetiquelnent ll70difiée de se
défendre dans un contexte infectieux. La presente invention a pour but de
proposer différents vecteurs d'eA~r~a~,on d'JFN humain rc~ulables par les
protéines TAT etlou REV du ~IH. Cette approche met à profit les caractéristiquesde réplic.~tion du ~irus Vl~ insi, en cas d'infectic)n, la synthèse des ~Ns
cellulaires est inhib~e mais la synthèse des rFNs exo~enes est i~duite par le v~rus
VIH lui même, reconstituant ainsi un système de défense efficace à son encontre,L'usage d'un système d'expression inductible évite les prol~lèmes de toxicité
cellulairc dans les cellules non ir fect~es.
C'est pourquoi la présente in~ention a pour objet une cassette d'expression
eon~l)rellant au moins une séquence d'ADN codant pour un ~ humain, placée
sous le comrôle des clcments capables d'~ssurer son e~;pression da}ls une cellule
de rn~n~mif~re, caracteriscc ~n ce que lesdits cléments sont régulables par le virus
de l'immunodéficience humaine (~I).
Une séquence d'P,DN en usage dans la présentc invention, peut coder pour un IFN
humain de type a, p ou y. Il peut s'aOir des scquences divulguées dans l'alt
2S anterieur et nolamlllellt dans Sha w et al. (19~3, Nucleic Acid Res., Il, 555-~73)
pour ~ , Hi~as}li Ct ~1. (1983, J. Biol. Chem., ~5~, 95~2-~529) pour IqFN~
et Gray et al. (19S2, Nature, ?95, ~03-50~) pour 1'IFNy. Ces séquences peuvent
etre isolees du gène ou de l'ADl~c. Par séquence codant pour un IFN humain, on
entend é~lem~nt dési~n~r une sequence codant pour un analo~uc d'un IFN. P~
"analo~u~", on en~end unc molecule qui aura;t une séquence en acides aminés
lé~:rement différellte d'un I~N natif mais clui conserverait l'~ss~nti~l de la
fonction antivirale. En prat;que, un tel analo~ue peut etre obtenu par délétion,substitution et/ou addition d'un ou plusieurs acidc~ amines de la protéine native
ou d'un fr2~ment de celle-ci. I.,'homme du métier connalt les techniq~les qui
wo 95/16784 - PCT/FRg~/014~8 ~
8 4
permettent d'ef~ectuer ces modifications sans abolir la fonction biologique de la
protéine.
Les éléments assurant l'expression d'une séquence d'ADN en usage dans le cadre
de la présente invention, sont les éléments conventionnels permettant la
transcription de la séquence d'ADN en ARNm et la traduction de ce dernier en
protéine, comme par exemple un promoteur et les codons d'initiation et de
terminaison de la traduction. En outre, une c~csette selon l'invention comprend des
sequences régulables par le virus VIH.
0
D'une manière générale, on choisit un promoteur fonctionnel dans une cellule de
ma,.,.l~irè,e et, de yl~:rélence~ dans une cellule humaine. Il peut être issu d'un gène
eucaryote quelconque ou d'un génome viral et être de nature ubiquitaire ou
régulable, notamment en réponse à certains signaux cellulaires tissu-spécifiquesou événement-spécifiques. Le choix du promoteur est très large et à la portée del'homme de l'art. Cependant, on aura avantageusement recours au promoteur des
gènes murins PGK (PhosphoGlycérate kinase) et ,B-actine ou au promoteur SV40
(Simian Virus 40).
20 Selon un mode particulièrement préféré, les séquences régulables par le VIH sont
constituées d'une séquence de type TAR et/ou RRE/CRS. Une séquence de type
TAR interagit avec la protéine TAT pour activer l'expression des gènes sous son
contrôle. De son côté, une séquence de type RRE/CRS interagit avec la protéine
REV pour favoriser le transport des ARNm dans le cytoplasme. On indique qu'elle
2~ contient naturellement un site accepteur d'épissage. Conformement aux buts
poursuivis par la présente invention, ces séquences peuvent être légèrement
différentes des séquences TAR et RRE/CRS natives (telle que publiées par Wain-
Hobson et al., 1985, Cell, ~0, 9-17), à condition toutefois d'être capables
d'interagir avec les protéines TAT et REV virales.
S'agissant d'une séquence de type TAR, celle-ci est insérée en 3' du promoteur et,
de manière tout à fait préférée, en position +l (+I étant le site d'initiation de la
transcription). Dans ce contexte, il peut être avantageux d'avoir recours au LTR5' du VlH qui comprend naturellement un promoteur fonctionnel dans les cellules
~ WO 95/16784 2 i 5 ~ PCT/FR94/01458
-
de mammifere suivi de la séquence TAR (en position +1 à +80). On peut
egalement mettre en oeuvre une portion de celui-ci, qui comprend les séquences
promotrices minimales (séquences Sp l, CAAT box et TATA box) et la séquence
TAR. On désigne sous le nom de mini LTR un fragment de 200 pb correspondant
., ~ à l'extrémité 3' du LTR et s'étendant des positions -120 à +80 du génome viral.
Selon une autre approche, une cassette selon l'invention comprend un promoteur
conventionnel et une séquence de type RRE/CRS capable d'interagir avec la
protéine virale REV du VIH. Ainsi, dans une cellule non infectée, les ARNm
lo seront bloqués dans le noyau sous l'action de CRS. Par contre, dès l'infection
virale et la synthèse de REV, ils seront transportés dans le cytoplasme où ils
seront traduits en IFN. De manière préférée, la séquence RRE/CRS est introduite
en 3' de la séquence d'ADN codant pour un IFN.
1~ Selon une autre variante, on peut soumettre l'expression d'une séquence d'ADNen usage dans la présente invention, à une double régulation par TAT et REV, ce
qui permet de contourner les problèmes d'échappement de l'expression observés
couramment avec certains promoteurs. Dans ce cas, une cassette d'expression
selon l'invention, peut comprendre une séquence de type TAR et une séquence de
20 type RRE/CRS; de sorte qu'en cas d'échappement de l'expression, les quelques
ARNm produits resteront bloqués dans le noyau. Seule la pénétration du VIH et
la synthèse des protéines virales TAT et REV pourront déclencher la synthèse
d'IFN.
2~ Par ailleurs une cassette d'expression selon l'invention peut, en outre, contenir
d'autres éléments contribuant à l'expression de la séquence d'ADN codant pour
IFN, notamment, un intron, des signaux d'épissage adéquates et des éléments de
terminaison de la transcription (signal de polyadénylation). Le choix et la
localisation de ces éléments est à la portée de l'homme du métier.
A titre d'exemples préférés, on peut citer une cassette comprenant de 5' vers 3':
( I ) Le LTR 5' du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de
polyadénylation de SV40;
WO 95116784 PCT/FR9-1/01458 ~
21~ 6~
.
(2) Le mini LTR du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal
de polyadénylation de SV40;
(3) Le promoteur PGK, la séquence TAR, une séquence d'ADN codant pour un
IFN et le signal de polyadenylation de SV40;
(4) Le promoteur ,~-actine, la séquence TAR, une séquence d'ADN codant pour
un IFN et le signal de polyadénylation de SV40;
(5) Le promoteur SV40, une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence
RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV40;
(6) Le LTR ~' du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence
RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV40;
(7) Le mini LTR du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence
RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV40; et.
20 (8) Le mini LTR du VIH, un site donneur d'épissage (du gène gag du VIH), une
séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence RRE/CRS et le signal de
polyadénylation de SV 40.
L'invention s'étend également aux vecteurs comprenant une cassette d'e~pl-es~ion25 selon l'invention. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme de l'art, ainsi que
les methodes pour les construire et les propager. On aura avantageusement recours
à des vecteurs viraux derivés des rétrovirus, virus de l'herpès, adénovirus ou virus
associés à l'adénovirus. Bien entendu on peut également employer des vecteurs
synthetiques. Dans le cadre de l'invention, les vecteurs défectifs pour la
30 réplication, et notamment les vecteurs rétroviraux, sont particulièrement préférés.
Selon un mode de réalisation avantageux, une cassette selon l'invention est
positionnée en orientation réverse par rapport aux LTRs du vecteur rétroviral, afin
de positionner les promoteurs en sens inverse pour éviter les interférences. Bien
entendu, un vecteur selon l'invention peut, en outre, comprendre un gène codant
WO 95/16784 ~ i 6 ~ PCT/FR94/01458
pour un marqueur de sélection, comme par exemple, les gènes néomycine et
puromycine acétyl transfërase conférant une résistance aux antibiotiques G418 etpuromycine. L'invention couvre également les virus et particules de vecteur viral
obtenus par transfection du vecteur selon l'invention, dans une lignée cellulaire
s d'encapsidation, notamment amphotrope, produisant les protéines structurales du
virus en cause.
L'invention a également trait à une cellule eucaryote comprenant, une cassette
d'expression ou un vecteur selon l'invention. Ces derniers peuvent être introduits
lO soit i~ vitro dans une cellule prélevée du patient soit directement in vivo. La
cellule est avantageusement une cellule humaine et, de manière préférée, une
cellule de la lignée hématopoïétique (cellules souches ou lymphocytes primaires).
L'invention concerne également l'usage thérapeutique d'une cassette d'expression,
s d'un vecteur ou d'une cellule selon l'invention, pour la fabrication d'un
medicament destiné à la prévention ou au traitement des infections virales et, en
particulier, des infections dues au VIH.
L'invention s'adresse é~alement à une composition pharmaceutique comprenant
20 à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique une cassette d'expression, unvecteur ou une cellule selon l'invention, en association avec un véhicule
acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière
2s conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement
efficace d'un tel agent thérapeutique ou prophylactique à un support, un diluantou un adjuvant acceptable. Elle peut être a~lministrée par n'importe quelle voieconventionnelle en us.age dans le domaine de l'art. L'~dminictration peut avoir lieu
en dose unique ou répétée après un certain délai d'intervalle. La quantité à
30 administrer sera choisie en fonction de différents critères, en particulier la voie
d'administration, le patient, I'état d'évolution de la maladie et la durée du
traitement. A titre indicatif, une composition pharmaceutique selon l'invention
contient de 103 à 10~ ufp (unité formant des plages), avantageusement de 105 à
1013ufp, de p~érél~nce de 106 à 10l2 ufp et, de manière tout à fait préférée, de 107
wo 95/16784 21 ~ 5 ~ ~ ~ PCT/FR9 ltO1458 ~
à 101 ufp de particules de vecteur viral.
Par ailleurs, I'invention concerne une méthode de traitement des infections virales
et, notamment à V~H, selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquements e~lcace, d'une cassette d'expression, d'un vecteur ou d'une cellule selon l'invention
à un patient ayant besoin d'un tel traitement. Selon un premier protocole
thérapeutique, on peut les administrer directement i~7 ~ivo, par exemple par voie
intraveineuse. On préférera adopter un protocole de thérapie génique somatique
qui consiste à prélever des cellules souches de moelle osseuse ou des Iymphocytes
10 du sang périphérique d'un patient, de les transfecter avec un vecteur selon
l'invention, de les cultiver m vitro selon les techniques de l'art et de les ~minictrer
au patient. A titre indicatif, il peut être avantageux d'employer 106 à 10I cellules
par kg, de préférence 107 à 109 et, de manière préférée 5 x I07 à 5 x 1o8.
s Naturellement, ce protocole peut être sujet à de nombreuses variantes. En
particulier, il peut être avantageux de combiner au moins deux cassettes, vecteurs
ou cellules selon l'invention permettant l'expression d'un IFN de types différents,
par exemple un IFNa et un IFN~.
20 L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes.
La figure I schematise le vecteur pTG43 13 permettant l'expression d'une
séquence d'ADN codant pour l'IFNa sous le contrôle du LTR du VIH.
La figure 2 représente le vecteur pTG4344 co-exprimant le gène IFNa et le gène
de sélection puromycine.
La figure 3 schématise le vecteur rétroviral pTG4379 pour le transfert d'un gèneIFN et son expression inductible par TAT.
La figure 4 montre l'évolution de l'infection dans des cellules U937 infectées par
le VIH III B et transfectées par les vecteurs d'expression de l'IFNa (o), ~ (-) et
y (O), comparée au témoin cellules non transfectées (~
~Wo 95/1678~ 2 ~ ~ ~ 5 ~ 8 PCT/FR94/01458
La fi~ure 5 illustre le vecteur rétroviral pTG6324 comprenant les cassettes
d'expression de l'lFNa (sous le contrôle du mini LTR du VIH) et du gène de
selection ~l~;o (sous le contrôle du LTR 5' rétroviral).
La figure 6 illustre l'evolution de l'infection dans des PBL humains CD8-
transduits par le vecteur pTG6327 (~) puis infectés par le virus VIH III B,
comparée aux cellules non transduites (-).
EXEMPLES
0
Toutes les opérations de clonage détaillées ci-après, sont effectuées selon les
techniques classiques de biologie moléculaire (Maniatis et al., 1989, LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Ces
etapes sont réalisées dans la souche l~;scherichia coli (E. coli) 5K, XLl-Blue ou
1 106.
Les genes humains codant pour les rFNs a et ,~ ont été clonés par PCR
(Polymerase Chain Reaction) à partir de l'ADN génomique de cellules
Iymphoïdes, par exemple de cellules CEM-A3 (dérivées d'une lignée CEM
20 disponible à l'ATCC sous le numéro CCLI 19). De telles banques sont disponibles
dans le commerce. L'amplification de fragments d'ADN par PCR peut être
efl~ectuee à l'aide de kits commerciaux selon les spécifications du fabricant ouselon la technologie décrite dans PCR Protocols-A (edited by Innis, Gelfand,
Sninsky and White, Academic Press Inc) à l'aide d'amorces complémentaires aux
2~ séquences publiées. Le gène humain codant pour l'IFNy est obtenu du pTGI I
décrit dans la demande de brevet français publiée sous le numéro 2.583.429. Des
sites de restriction appropriés ont été introduits en amont et en aval de l'ATG
initiateur et du codon stop des différents gènes IFN afin de pouvoir faciliter les
étapes de clona~ge ultérieures. D'autre part, les sites de restriction protubérants en
30 5' peuvent être convertis en sites francs par traitement par le grand fragment
Klenow de l'ADN polymerase d'L;: coli alors que les sites protubérants en 3' sont
traites par la T4 polymérase.
EXEMPLE 1: Construction de vecteurs d'expression de l'interféron inductibles
WO 95/16784 ~ I ~ 5 ~ 6 8 PCT/FRg~/01458 ~
- 10 -
par la protéine TAT du VIH et dans lesquels le ~ène de sélection çst çonstitué par
le gène puromvcine.
A. Vec~e1n .s ~70~7 ~i/mlx d ~expJ essio~7 cle / IFN SOIIS le contrôle dll promotezlr dz~
VIH.
On décrit la construction de vecteurs dans lesquels l'expression des gènes IFNa,~, et y est placée sous le contrôle du LTR 5' du VIH. Ces vecteurs ont été
construits à partir du vecteur pTG1322 décrit dans Mehtali (1992, AIDS and
Human Retroviruses, S, 1959-1965) comprenant un gène hétérologue placé sous
le controle du LTR 5' du VIH (fragment X7toI-~ 7dlII de 725 pb correspondant
aux positions -645 à +80 du génome VIH). Ce vecteur porte également l'intron et
le signal de polyadénylation du virus SV40. Il est digéré par Hi~ldlII traité à la
Klenow puis digéré par SmaI.
On introduit dans pTG1322 ainsi traité, le gène IFNa sous forme d'un fragment
délimité par les sites Sn7al et EcoRI traité à la Klenow et on génère pTG4313
(Figure 1). pTG4314 est obtenu par insertion du fragment SntaI-EcoRV portant
le gène IFN,B dans pTG 1322 obtenu comme précédemment. On génère pTG4315
20 par insertion du gène ~FNy sous forme d'un fragment HpaI-PvtlII entre les mêmes
sites de pTG1322.
On introduit dans le site EcoRI de ces différents vecteurs d'expression d'un IFN,
un gène de sélection confërant la résistance à la puromycine (puromycine R) sous2~ forme d'un fragment de 1,2 kb Ban7HI-Bgl~I traité à la Klenow. Ce fragment
comporte le promoteur precoce du virus SV40, le gène puromycine R et le signal
de polyadénylation de SV40. On obtient les vecteurs pTG4344 (représenté à la
Figure 2), pTG4345 et pTG4346, qui permettent la co-expression du gène de
sélection puromycine R et respectivement du gène IFNc~, ~ ou y.
B. Vec~eto rétroviralpo1tr le tra~7sfert et l'expressio~l des gè~?es IFN.
Le vecteur à la base des constructions est le pLXSP qui dérive de pLXSN (Miller
et Rossman, 1989, Biotechniques, 7, 980-988) après remplacement du gène de
WO 95/16784 ~ PCT/FR94/01458
sélection néomycine par le gène puromycine R et du LTR 3' de MSV (Myelo
Sarcoma Virus) par le LTR 3' du MPSV (Myelo Proliferative Sarcoma Virus).
On isole du génome du VIH un fragment ScaI-~Ii )clIII de 200 pb correspondant
au mini LTR (position - 120 à +80), qui est ensuite introduit en amont de chacundes gènes IFNs. Puis on introduit en 3' des gènes, le signal de polyadénylation du
SV40. Le vecteur ainsi obtenu est digéré par Bgf~I, traité à la Klenow. Le
fragment comportant la cassette d'expression "mini LTR - IFN - signal de
polyadénylation" est introduit entre les sites HpaI-BgllI du vecteur rétroviral
lo pTG4056. On selectionne les clones dans lesquels ce fragment est positionné en
orientation réverse par rapport aux LTRs 5' et 3'. pTG4056 provient du pLXSP à
la suite de la délétion du bloc d'expression promoteur SV40-puromycine R et la
réinsertion du gène puromycine R dans l'orientation correcte pour être placé sous
le contrôle du LTR 5'.
1~
On obtient les vecteurs rétroviraux pTG4392, pTG4391 et pTG4~79 (Figure 3)
permettant le transfert et l'expression des séquences codant respectivement pourles IFNs a, ,~ et y. Ils peuvent être transfectés dans une lignée cellulaire
d'encapsidation amphotrope, par exemple la lignée PA317 (Miller et al., 1986,
Mol. Cell., Biol. 6, 2895-2902), Gp Env. Am (Markowitz et al., 1988, Virology,
167, 400-406) ou PG13 (Miller et al., 1991, J. Virol, 6~, 2220-2224). Le jour
suivant, les cellules transfectées sont placees en milieu sélectif (puromycine 6~lg/ml). On isole les cellules résistantes qui constitueront des lignées productrices
de particules amphotropes capables d'infecter les cellules humaines, à partir
2~ desquelles on peut constituer un stock viral susceptible d'être utilisé en thérapie
génique anti SIDA.
C. Vectem s r églllable.s pa~ TA T da~ls lesq1/els l'expre.ssio~l de l 'IrN es~ dirigée
pa~ ?1~7 p~ on70tel/r ellca~yote.
I . Promoteur PGK murin.
La sequence TAR (correspondant aux nucléotides + I à +80 du génome du VIH)
est générée par synthèse chimique. Puis, I'oligonucléotide double brin ainsi obtenu
wo 95/16784 PCT/FRg4/014~8 ~
~ ~5~68 12-
est introduit par mutagénèse insertionnelle en position +1 du promoteur PGK
murin, dont la séquence est publiee dans Adra et al. (1987, Gene, 60, 65-74). Oninsère en aval de la séquence TAR, le fragment comportant la séquence codant
pour l'IFN humain a, ~ ou y suivie du signal de polyadénylation de SV40.
Enfin, la cassette d'expression "promoteur PGK-TAR-IFN-polyA" est introduite
dans le vecteur rétroviral pLXSP. Bien entendu à chaque séquence IFNa, ~ ou y
correspond un vecteur rétroviral. Comme précédemment, on établit une lignée
d'encapsidation amphotrope productrice de chaque type de particules virales.
0
2. Promoteur ~-actine murin.
L'exemple précédent est reproduit avec la variante suivante:
l s La sequence synthétique TAR est introduite en position +l du promoteur ~-actine
de rat dont la séquence est décrite dans Nudel et al., (1983, Nucleic Acids Res.,
ll, 1759-1771)
EXEMPLE 2: Construction de vecteurs d'expression d'un IFN humain
20 inductibles par la protéine TAT du VIH et dans lesquels le ~ène de sélection est
constitué par le ~ène néomycine et établissement de li~nées amphotropes
correspondantes.
A. C0~7.5~tllCtiO~I ~,JI( pTG632~ polm l'exp~essio~7 de l'IFNa.
2~
En premier lieu, le mini LTR du VIH est isolé du génome viral après digestion
ScaI - Hil~dIII, inséré dans un plasmide quelconque pour être resorti sous formed'un fragment Smc7I-Hi~7dIII puis cloné entre les mêmes sites du vecteur pTG2359.
Ce dernier correspond au clonage du site de polyadénylation du virus SV40 dans
30 le plasmide p Biuescript KS (Stratagène). On obtient pTG4347 dans lequel on
introduit, après digestion par BnlI, un fragment SmoI-HpaI portant les séquencescodant pour l'IFNa.
Enfin, la cassette d'expression "mini LTR-IFNa-polyA SV40" est purifiée du
WO 95116784 ~ 1 5 S ~ ~ 8 PCT/~R94/014~8
vecteur pTG4355 obtenu a l'étape précédente sous forme d'un fragment BamHI-
Bg/II, qui est cloné dans le site BamH~ de pTG6320 pour donner pTG6324 (Figure
S). Ce dernier comprend donc le LTR du MSV dirigeant l'expression du gène de
selection ~7~;0 suivi de la cassette "mini LTR - IFNa - polyA SV40" positionnée
en orientation réverse afin d'éviter les phénomènes d'interférence entre les
promoteurs et enfin le LTR 3' rétroviral du MPSV. A titre indicatif, pTG6320
provient du pLXSP à la suite de la dététion de la cassette d'expression du gène
puromycine et remplacement par le gène néomycine (Colbère - Garapin et al.,
1981, J. Mol. Biol., l~n, 1-14).
0
B. C0~7slr7rclio~7 ~1~ pTG63~S pOIII I expressio~ ~ I IFNy.
La stratégie de clonage est tout a fait similaire à ce qui est décrit ci-dessus. Le
vecteur pTG6311 provient de l'insertion d'un fragment SmaI-HpnI portant la
séquence codant pour l'IFNy dans le site Ba/I du pTG4347. Puis, on obtient le
vecteur rétroviral pTG6328 en clonant le fragment Ban~HI-Bg/II purifié du
pTG6311 dans le vecteur pTG6320 préalablement digéré par BamHI. Celui-ci est
l'équivalent de pTG6324 à la différence qu'il porte le gène IFNy à la place du
gène IFNa.
C. Co~lstrllctio~l dl~ vect~ c;trovilalpTG6327poln l'explessio~7 de lIFNp.
Le fragment .SntaI-Hi~fllI portant le mini LTR VIH est inséré entre les mêmes
sites de pTG43S6, pour générer pTG6312. Le vecteur pTG4356 correspond au
2~ vecteur pTG2359 dans lequel on a cloné (site Ba/I) le gène IFN ,~ (fragment
SnlaI-EcoRV). Comme précédemment, la cassette d'expression de l'IFN~ est
purifiée de pTG6312 après digestion par Ban1HI et Bg/II puis sous-clonée dans lesite Bnn1HI de pTG6320 pour donner pTG6327.
30 D. ~;~abliss~n7e~ le /ig~-~;es an7phot7 opes po~lr la prodllction de parlic~lles virales
infectiellse.s~
On peut preparer des stocks de particules virales infectieuses à partir de chacun
des vecteurs précédents pTG6324, pTG6327 et pTG6328. Pour ce faire, ces
WO 95/16784 PCT/ElR9 1/014;~8
21 ~5s~6~ 14 -
derniers sont transfectés de manière classique dans une lignée d'encapsidation
ecotrope, par exemple la li ~née GP + E 86 (Markowitz et al., 1988, J. Virol., 62,
1120- 1124). 48 h apres la transfection, les cellules sont cultivées en milieu sélectif
(G418 I mg/ml).
-
Le mélange de clones résistants au G418 est maintenu pendant 3 jourssupplémentaires en milieu sélectif. Le surnageant de culture est récolté pour
infecter de façon conventionnelle, une lignée d'encapsidation amphotrope comme
la lignée PA317. Après sélection, les lignées ainsi obtenues constitueront les
10 cellules productrices de particules virales infectieuses permettant le transfert et
l'expression des différents IFNs dans le cadre d'une thérapie génique humaine.
Leur capacité à produire un IFN actif peut être évaluée dans les surnageants de
culture par la méthode décrite dans The Interferon System (W.E. Stewart, 1979,
1~ Ed: Springer-Verlag Wien, New York). Ce test de fonctionnalité, lorsqu'il esteffectué sur les cellules générées à l'étape précédente, donne un niveau faible
d'lFN dans les trois cas. Par contre, lorsque les cellules sont transfectées de
manière transitoire par le plasmide pHMG-TAT, le niveau mesuré est élévé et
atteint quelques centaines d'unité par ml. pHMG-TAT est un vecteur d'expression
20 de la protéine TAT native et résulte du clonage de la séquence codant pour celle-
ci dans le vecteur pHMG (Mehtali et al., 1990, Gene, 91, 179-184).
Par ailleurs, il peut être intéressant d'isoler des clones producteurs. Ceci est réalisé
classiquement par la technique de dilution clonale (0,3 cellule par puit). On
2~ sélectionne un clone bon producteur de virions titrant 5x lo6 à 107 ufp/ml après
infection des cellules murines NIH-3T3 (ATCC CRL 1658) par une aliquote de
surnageant de culture du clone. On vérifie sa capacité à produire de l'IFN commeindiqué précédemment. On effectue à nouveau une dilution clonale à partir des
clones précédents afin de générer des sous-clones. On sélectionne pour chacun
30 d'entre eux un sous clone bon producteur de virions et d'IFN après titration et
dosage de l'IFN.
Les sous-clones sont congelés avant utilisation dans un but de thérapie génique.
~ WO 9~/16784 21 ~i ~ 5 613 PCT~R94/01458
EXEMPLE 3: Constmction de vecteurs d'expression d'un IFN humain
inductibles par la protéine REV du VIH.
On decrit un vecteur rétroviral par insertion dans le vecteur pLXSP et dans
s l'orientation réverse par rapport aux LTRs, d'une cassette d'expression comprenant
de 5' vers 3' :
- le promoteur du virus SV40;
- la séquence d'ADN codant pour l'IFN humain a, ~ ou y;
- la séquence RRE/CRS. Cette dernière est isolée du génome du VIH-I
isolat Lai sous forme d'un fragment BglII-BamHI (s'étendant des
nucléotides 7178 à 8032 de la séquence telle que publiée par Wain-
Hobson et al., s~.~/p~n) Ce fragment peut être traité par la Klenow
avant d'être introduit dans un site de restriction adéquat; et
- le signal de polyadénylation de SV40.
Comme précédemment, on peut constituer des stocks viraux après transfection
dans une lignée d'encapsidation amphotrope.
20 EXEMPLE 4: Construction de vecteurs d'expression d'un rFN humain inductibles
par les protéines TAT et REV du VIH.
On insère dans les vecteurs pTG4392, pTG439 1 et pTG4379 le fragment BQmH1
BglII traité à la Klenow et porteur de la séquence RRE/CRS du VIH entre la
2s séquence codant pour un des IFNs et le signal de polyadénylation de SV40.
De plus, les vecteurs ainsi obtenus peuvent être modifiés par l'insertion d'un site
donneur d'épissage entre le LTR du VIH et le gène IFN.
30 Comme precédemment, on peut générer une lignée amphotrope productrice de
particules infectieuses correspondant à chacun des vecteurs ainsi obtenus.
EXEMPLE 5: Résistance à l'infection virale des li~nées cellulaires transfectées
par les vecteurs d'expression de l'IFN inductibles par TAT.
WO 95/16784 PCT/FR94/01458 ~
2~ 8 - 16-
Les expérimentations ci-après decrites sont effectuées dans des lignées cellulaires
naturellement infectables par le VIH, comme:
- la lignée U937 (ATCC CRL1593) dérivée de monocytes hllm~in~; et
- la lignée CEM-A3 dérivée de cellules Iymphocytaires humaines CD4+
(ATCC CCLI 19).
10 En pratique, les cellules sont cultivées selon les recommandations du fournisseur
et transfectées par électroporation d'au moins 20 ,ug d'ADN à l'aide d'un
appareillage approprié (Gene Pulser Biorad, voltage 21 0V, capacitance 960,uF).
Dans une première expérience, on co-électropore dans les cellules U937 (2x107
I s cellules) le pTG43 14 avec le vecteur pLXSP dans un rapport de concentration en
ADN 20:1. Les cellules sont remises en culture à 37C en présence de 5 % de CO,
et le jour suivant, placées en milieu sélectif (puromycine 0,5 llg/ml). On
sélectionne les cellules résistantes à l'antibiotique.
20 On teste leur résistance à l'infection en les infectant par une préparation de VIH
à une TCID50 élevée (au moins 1000). La TCID50 est déterminée selon la méthode
décrite dans Reed et al., (193g, Am. J. Hyg., 27, 493-497), sur lignées cellulaires
infectables par le VIH, comme les cellules CEM. Elle correspond à la dose à
laquelle S0 % des cellules sont infectées et 50 % ne le sont pas. Elle est vérifiée
2s pour chaque lot de VIH employé.
Pour ce faire, on prélève une fraction de la culture cellulaire U937 électroporée,
correspondant à environ 106 cellules, que l'on centrifuge à basse vitesse. Aprèslavage, le culot cellulaire est repris dans 200 ~ll de milieu de culture en absence
30 de serum. Puis les cellules sont traitées par différentes dilutions de la préparation
virale. On laisse l'infection se poursuivre I heure à 37C.
Les cellules sont ensuite lavées 2 fois dans du milieu de culture et mises en culture
dans 5 ml du même milieu, complémenté avec 10 % de SVF (sérum de veau
3~ foetal). Le milieu est renouvelé 2 ou 3 fois par semaine. La propagation du virus
est évaluée par mesure de l'activité réverse-transcriptase à intervalles réguliers
21 5~
~ WO 95/16784 PCT/FR94/01458
- dans le surnageant de culture selon la méthode décrite dans Spire et al. (1985,
Lancet, i, 188-189).
On observe une diminution significative Gusqu'à 85 %) de l'activité réverse-
5 transcriptase sur 14 jours post-infection par rapport aux cellules U937 témoin non
électroporée avec un vecteur d'expression de l'interféron.
L'expérience est répétée cette fois avec des cellules U93 7 initialement
électroporées avec le pTG4344, pTG43~5 ou pTG4346. Dans les trois cas, on
10 observe une diminution encore supérieure de l'activité réverse-transcriptase sur
21 jours post-infection par rapport au témoin cellules non électroporées. (Figure
4).
EXElvlPLE 6: Mécanisme moléculaire de la résistance à l'infection VIH.
L'analyse est effectuee sur les cellules U937 électroporée et infectée i~7 vitro par le
VIH (exemple 5).
On recherche tout d'abord la présence du génome du VIH dans une pl~pal~ion
20 d'ADN génomique cellulaire. Ceci est réalisé par PCR à l'aide d'amorces adéquates
permettant l'amplif!cation d'un fragment du gène gag viral. La présence d'une bande
d'amplification de taille attendue indique que l'expression de l'IFN n'interfère pas
avec l'intégration du génome du VIH sous forme provirale dans les ch~omosomes
cellulaires.
2s
Il a également été possible de détecter la présence des ARNm codant pour les
produits du gène gag par la technique de reverse-transcription PCR (mêmes amorces
que précédemment). Ceci laisse supposer que l'expression de l'IFN n'a pas d'effet
notable sur la transcription des séquences provirales.
Enfin, on évalue la présence et la localisation de la protéine virale gpl20 par
immunofluorescence à l'aide d'un anticorps anti-gpl20 (obtenu de sérum de patients
séropositifs). On constate que dans les cellules exprimant l'IF~, la protéine gpl20 est
sous forme intracellulaire, alors qu'elle devrait être sous-membranaire, afin de3s permettre le bourgeonnement des particules virales.
wo 95/16784 PCT~g~/01458
2~ 8 18-
Dans leur ensemble, ces résultats indiquent que l'IF~ agit au niveau des étapes
tardives du cycle viral et probablement au niveau de l'assemblage des virions.
EXEMPLE 7 Méthode de traitement du SIDA par thérapie ~énique.
-
Dans le cadre d'une thérapie génique appliquee à l'homme, deux types de cellulescibles peuvent être envisagés:
- les Iymphocytes CD4+ du sang périphérique qui peuvent être collectés
o notamment par leucophérèse, et
- les cellules souches hématopoïétiques CD34+ qui peuvent être obtenues d'un
prélèvement de moëlle osseuse ou du sang périphérique (mobilisation par
chimiotherapie ou par action de facteurs de croissance hématopoïétiques).
1~
A. Pro~ocole appliqllable allx cellules CW+
Le patient est soumis à un prélèvement de sang ou à une leucophérèse. Après avoir
éliminé les globules rouges, les cellules mononuclées sont isolées par centrifugation
sur Ficoll et cultivees selon les techniques de l'art. Dans un premier temps, on se
debarasse des cellules adhérentes au plastique des flasques de culture. La suspension
cellulaire est recupéree et cultivée dans des flasques revêties d'anticorps anti-CD8
(Immunotech) afin d'éliminer les cellules CD8+. La suspension cellulaire ainsi
obtenue est composee majoritairement de Iymphocytes CD4+. Bien entendll, les
2~ autres techniques d'enrichissement peuvent également être employées.
Ceux-ci sont stimulés dans le but d'induire la division cellulaire avant d'effectuer la
transduction retrovirale. Les facteurs de croissance pouvant être mis en oeuvre à cet
ef~et sont varies. A titre indicatif, on peut citer un mélange d'anticorps anti CD3
humain (Immunotech, environ 10 ng/ml) et d'IL-2 (Cetus; 100 Ulml) ou encore de
PHA (phytohemagglutidine, Sigma, à une concentration d'environ 5 ~lg/ml) et d'IL-2.
Après 72 heures de culture dans ces conditions, les cellules sont tr~ncduites par le
vecteur rétroviral. Différentes méthodologies sont applicables:
3~ ..
- co-culture des cellules CD4+ et des cellules productrices amphotropes des
_ wo 95/16784 PCTIFR94/014~8
~ 2 1 ~
- 19-
- exemples I à 4.
- co-culture des 2 types cellulaires, les cellules CD4+ étant déposées dans les puits
de culture et les cellules productrices dans un Transwell (Costar)
s
- infection des cellules CD4+ avec une aliquote de surnageant de culture des
cellules productrices selon une m.o.i. (multiplicité d'infection) de préférence
comprise entre I et 5.
o Généralement la transduction est réalisée en présence de sulfate de protamine (à une
concentration d'environ S ~,lg/ml) pour favoriser l'attachement du virus à la surface
cellulaire.
Le jour suivant, la culture cellulaire est passée en milieu sélectif (puromycine dans
I S le cadre des vecteurs de l'exemple I ou G4 18 dans le cadre des vecteurs de l'exemple
2) et poursuivie pendant 7 à 8 jours jusqu'à obtenir le nombre de cellules appropriées.
On indique qu'il peut être avantageux d'employer le milieu AIM V (Gibco BRL)
complémenté par de la L-glutamine (2 mM) et de llL-2 (100 U/ml) et dépourvu de
sérum.
La capacite de ces cellules à inhiber la réplication du VIH est testée i~ vitro. Elles
sont infectées par le VIH-I IIIB à une m.o.i. de lo-2 selon la méthodologie classique
dans le domaine de l'art. Après lavage et remise en culture, la propagation du virus
est évaluée par mesure de l'activité réverse-transcriptase dans le surnageant de2~ culture (Figure 6). Celle-ci se situe à un niveau très bas pendant au moins 20 jours
de culture A titre comparatif, dans le cas des cellules non transduites, l'activité
réverse-transcriptase augmente très fortement jusqu'à atteindre un maximum dès le
troisième jour de culture et est rapidement suivie de la mort cellulaire.
30 B. Protocole app/icable a71x cell~lles CD3~+.
Les étapes de la purification des cellules CD34 sont les suivantes:
- isolement des cellules mononuclées du prélèvement de sang périphérique ou de
3~ moëlle osseuse par centrifugation Ficoll,
WO 95/16784 PCT/FR91/01458
~155~S8
- 20 -
- déplétion des cellules adherentes, et
- capture des cellules CD34+ par culture dans des flasques recouvertes d'anticorps
anti-CD34 (lmmunotech) ou en présence de billes revêtues de cet anticorps. On
élimine les cellules en suspension et on récupère les cellules adhérentes après
action, par exemple, de papaïne.
Comme précédemment, les cellules CD34+ ainsi obtenues sont stimulées par divers
facteurs de croissance pour les placer en cycle de division et ainsi favoriser l'infection
rétrovirale. On peut utiliser à cet effet un mélange d'IL-3 (environ 10 ng/ml), d'IL-6
(à environ S0 U/ml) et de SCF (Stem cell factor, environ 50 U/ml) incorporé dans le
milieu de culture pendant 48 heures avant d'effectuer la transduction selon le
protocole indiqué précédemment. Ces facteurs sont disponibles commercialement.
Les cellules sont ensuite réadministrées au patient.
