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wo g~/03826 2 ~ ~ 7 7 ~ 2 PCT~94/00955
.
Préparations d'immuno~lobulines stabilisées et
procédé ~our leur Pré~aration
La présente invention a trait a des préparations
d'immunoglobulines (Ig) humaines ou ~n;mAles, en
particulier immunoglobulines polyclonales sanguines. La
présente invention a également trait a un procédé de
stabilisation des immunoglobulines.
- lO Les immunoglobulines sont largement utilisées
dans la prophylaxie et la thérapeutique. Leur mode
d'administration par voie intraveineuse nécessite de
réduire au mA~;mum leur activité anticomplémentaire qui
peut résulter d'une dénaturation des Ig conduisant
notamment à la formation d'agrégats et de polymères.
Ainsi, la norme européenne publiée dans
Pharmeuropa (3 (4), décembre 1991, 259-268) exige que les
solutions d'immunoglobulines pour administration
intraveineuse aient des taux d'agrégats et de polymères
inférieurs ou égaux à 3 % des protéines totales et une
activité anticomplémentaire inférieure ou égale à 1 unité
CH 50 par mg d'Ig. La formation d'agregats n'intervient
pas seulement au cours de la préparation des solutions
d'immunoglobulines, mais aussi au cours de leur
conservation sous forme liquide, notAmm~nt lors de leurs
manipulations. En effet, les immunoglobulines ont
tendance à se dénaturer aux interfaces liquide/gaz et
liquide/solide, ce qui se traduit par une augmentation de
l'activité anticomplémentaire par formation d'agrégats
solubles ou insolubles.
La demande de brevet francais FR-A-2 301 266
propose un procédé de préparation de gamma-globulines
injectables par voie intraveineuse. La mise sous forme
pharmaceutique comprend la dissolution des gamma-
~167712
_ ~ Q _
Patent abstracts of Japan, 5, n 41 (C-047) 18 mars 1981
divulgue une préparation d'immunoglobulines anti HB à laquelle
est ajouté un agent tensioactif dans le but d'assurer la
stabilisation lors de la lyophilisation de la préparation. La
concentration en tensioactif qui est preconisee est comprise
entre 0,1 g/l et 0,5 g/l.
La demande de brevet WO-A-8 911 297 concerne une composition
d'anticorps monoclonaux lyophilisés. Il n'y est pas question
de l'utilisation d'un quelconque sur~actant.
La demande de brevet DE-A-3 208 523 décrit l'utilisation du
PLURONIC TM à une concentration élevée (1 à 3 %) en tant
qu'agent précipitant des aggrégats, et non dans un but de
protection. Il n'y est pas fait mention des propriétés
surfactantes du produit, ni de celles protectrices contre la
dénaturation de l'immunoglobuline. Le taux résiduel en
PLURONIC TM y reste très élevée.>
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globulines dans une solution aqueuse tamponnee et
contenant du glycocolle et de l'albumine.
Fn outre, pour empecher ou reduire toute
dénaturation de surface (aux interfaces liquide/ai~ ou
liquide/solide), cette demande propose d'ajou-er a la
preparation pharmaceutioue obtenue un agent tensio-actif
non ioniaue. A titre d'agent tensio-actif, cette demande
propose les Tweens ou le Pluronic 68. Dans le seul mode
de realisation decrit, cette demande preconise
l'utillsation de T-~een 80 à une concentration de 0,1 %
c'est-a-dire de 1 g/l. En consequence, la mise sous forme
phar~aceutique des gamma-globulines passerait par
l'utilisation combinee de glycocolle, d'albumine e_ de
tensio-actif non-ionioue a une concentration de l'ordre
de 1 g/l.~ ~
p ~ ~ La demande de ~revet européen EP-A 448 075
_ a décrit un procede de preparation d'Ig int_aveineuse avec
filtra~ion sur memb-ane, dans leauel on cherc;~e a
empêcher la denaturation des Ig lors de la fil.ration a
l'aide d'un s~zbilisant tensio-actif, qui peut et-e un
tensio-ac~if non ionicue t~l cue le Pluronic. Le taux de
stabilisant recommande est compris entre 0,5 et 50 g/l.
Il en résulte oue le produit final contient le tensio-
actif à un taux tres eleve.
~.L. Levine et al. (J. of Pa-ente-al Science and
Technology, volume 45 (3) mai-juin 1991, pages 160 a 165)
rapportent une etude sur les effets protec.eurs des
tensio-actifs non ioniques contre la denaturation de
sur~ace de solutions d'anticorps monoclonaux fai~lement
concentrees dans un tes. d'agitation. Les auteurs
rapportent une concentration efficace de l'ordre de 0,1
~, c'est-a-dire correspondant a 1 g/l. Aucune protection
n'est par con~re obtenue avec une concent~ation de 0,1
g/l .
W095/03826 3 ~ ~ 7 ~ ~ ~ PCT/FR94/00955
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Or il est etabli qu'à ces concentrations élevées,
ces agents tensio-actifs présentent des inconvénients
sérieux en cas d'injection intraveineuse.
Ainsi, le brevet US-A-4 439 421 recommande de ne
pas utiliser les tensio-actifs non ioniques tels que
décrits notAmm~nt dans le brevet US-A-4 093 606
correspondant à la demande de brevet français ci-dessus,
pour un problème d'innocuité vis-à-vis des cellules
sanguines. Cela confirme les observations de J.C. KRANTZ
- 10 et al. (J. Pharmacol Exp. Ther. g3, pages 188 à 195,
1948) sur le pouvoir hémolytique du Tween 20 à la
concentration de 1 g/l. Le brevet US précité propose de
stabiliser les solutions d'Ig en vue de leur
lyophilisation en combinant plusieurs types de
stabilisants, macromolécules, protéines et polyols de bas
poids moléculaire. Le polyéthylène glycol est préféré en
liaison avec de l'albumine humaine et du glucose.
Il est en effet connu que l'albumine agit comme
un stabilisant efficace pour les immunoglobulines.
Mais dans le contexte médical actuel, on cherche
à éviter autant que faire se peut l'utilisation de
substances d'origine humaine ou An;mAle, qui présentent
un risque de contA~;nAtion virale.
La demanderesse a maintenant découvert de ~façon
surprenante qu'il était possible de préparer des
solutions d'immunoglobulines stabilisées sous forme
liquide à l'aide d'un tensio-actif non ionique en très
faible concentration, tout en se passant des stabilisants
habituels tels que l'albumine.
La présente invention a donc pour objet des
préparations d'immunoglobulines humaines ou animales, en
particulier polyclonales, et notamment IgG polyclonales,
qui comprennent, à titre de stabilisant de conservation
sous forme liquide, un tensio-actif non ionique en
concentration inférieure ou égale à 0,1 g/l et qui sont
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essentiellement dépourvues d'albumine. Par
essentiellement dépourvues d'albumine, il faut comprendre
qu'aucune trace d'albumine n'est détectée par la méthode
de référence Pharmeuropa en électrophorèse sur acétate de
cellulose , ce qui correspond à une quantité d'albumine
inférieure à 1% des IgG.
De préférence, la concentration en tensio-actif
non ionique est comprise entre 0,02 et 0,05 g/l environ
et est de préférence de l'ordre de 0,025 g/l.
- lO De préférence, les préparations selon l'invention
comprennent entre 30 et 120 g/l d'immunoglobulines.
Le tensio-actif non-ionique est choisi de
préférence dans le groupe consistant en monooléate de
sorbitanne polyoxyéthylène (20), éther octylphénylique du
décaéthylène-glycol, monolaurate de sorbitanne
polyoxyéthylène (20), copolymère mixte
polyoxyéthylène/polyoxypropylène et polyoxyéthylène et
Laurate de polyéthylène glycol 600.
Comme cela est d'usage, les préparations selon
l'invention peuvent aussi comprendre un stabilisant de
lyophilisation usuel tel que le saccharose, notamment en
concentration de l'ordre de 50 à 100 g/l.
Les préparations d'immunoglobulines selon
l'invention ont également de préférence les
caractéristiques préconisées par les normes en vigueur,
tel que pH compris entre 4,0 et 7,4, osmolalité
supérieure à 280 mosmol/kg par l'addition de solutés
osmotiquement actifs, tels que des sels minéraux (tel que
NaCl) ou des sucres (tel que glucose, saccharose,
maltose) ou des sucres-alcools (tels que mannitol,
sorbitol) ou des acides aminés (tel que glycocolle).
Les préparations obtenues répondent aux critères
de sécurité d'emploi particuliers aux solutions d'Ig pour
a~r;n;~tration intraveineuse, à savoir stérilité
bactérienne et fongique, apyrogénicité, taux réduit
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d'agrégats et de polymères et activité anticomplémentaire
réduite.
Les immunoglobulines présentes dans la
- préparation peuvent être obtenues à partir de plasma, de
sérum ou de placenta par les méthodes classiques de
- fractionnement des protéines, complétées le cas échéant
par des traitements spécifiques visant à réduire le taux
d'agrégats et de polymères et/ou à réduire l'activité
anticomplementaire de la préparation (par exemple
traitement modéré à la pepsine ou à la plasmine,
traitement dissociant à pH acide, modification chimique
par réduction et/ou alkylation ou précipitation des
agrégats et polymères par le PEG).
Les préparations selon l'invention peuvent être
des solutions prêtes à l'emploi, donc conservées sous
forme liquide, ou être des solutions obtenues
extemporanément par dissolution d'un concentré
lyophilisé.
La présente invention a également trait à un
procédé de stabilisation des préparations
d'immunoglobulines humaines ou animales, polyclonales,
dans lequel on ajoute à la préparation un stabilisant de
conservation sous forme liquide qui est un tensio-actif
non ionique de façon à obtenir une concentration
inférieure ou égale à 0,1 g/l dans la préparation finale.
De préférence, le tensio-actif non ionique est ajouté en
concentration comprise entre 0,02 et 0,05 g/l environ et
de préférence de l'ordre de 0,025 g/l. Le tensio-actif
non ionique est choisi parmi ceux indiqués plus haut.
L'agent tensio-actif est avantageusement ajouté juste
avant le conditionnement final en flacons, mais il peut
également être ajouté à un stade antérieur du procédé
d'extraction et de purification des Ig.
W095l03826 6 PCT/~ 4/00955
2167712
L'invention va être maintenant décrite plus en
détail à l'aide d'essais réalisés avec des préparations
d'immunoglobulines selon l'invention.
On a simulé des conditions sévères de
manipulation de flacons d'Ig intraveineuse à l'aide d'un
test d'agitation. Des flacons de verre borosilicate de
type I de 50 ml sont remplis aseptiquement avec 20 ml
d'une solution stérile d'Ig à 50 g/l. Les flacons sont
agités à température ambiante de 20-C pendant 1 ou 2 h
sur un agitateur de type oscillant/alternatif réglé pour
80 oscillations horizontales par minute.
L'activité anticomplémentaire (AcA) de la
solution est mesurée selon le test décrit dans
"Pharmeuropa" (supra).
Essai 1 : effet protecteur du Tween 80
Composition de la solution d'Ig intraveineuse :
Ig = 50 g/l
Saccharose = 100 g/l
NaCl z 1 g/l
pH = 4,3
Concentration variable de Tween 80 : de 0 à
100 mg/l
Tableau 1 :
Tween 80 (mg/l)
0 10 25 lO0
* AcA avant agitation O,34 0,35 O,35 O,36
* AcA après agitation 2h >1,19 1,19 O,75 0,38
* CH 50/mg Ig
Résultat : Une protection nette s'observe dès 25
mg/l. Elle est quasiment totale avec lOO mg/l de tensio-
actif.
W095/03826 7 ~ 7 ~ 1~ PCT/FR94/00955
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Bs~ai 2 : e~fet protecteur de ~riton X loo
Idem essai 1, mais avec du Triton X 100 au lieu du Tween
80 comme tensio-actif
Ta~leau 2 :
Triton X 100 (mg/l)
0 25 S0 100
* AcA avant agitation 0,37 0,36 0,36 0,31
* AcA après agitation 2h 0,50 0,34 0,36 0,19
- 10
* CH 50/mg Ig
Résultat : Une protection totale est obtenue avec
la plus faible concentration essayée, 25 mg/l.
Es~ai 3 : effet protecteur du Tween 80
Idem essai 1, mais avec une agitation de 1 h au lieu de
2h.
Tableau 3 :
Tween 80 (mg/l)
0 25
* AcA avant agitation 0,41 0,33
* AcA après agitation 1 h 0,70 0,27
* CH 50/mg Ig
Résultat : Dans cet essai moins sévère, la
concentration de 25 mg/l de Tween suffit à proteger
totalement l'Ig.
E~sai 4 : effet Protecteur de l~albumine
Idem essai 1, mais utilisation d'albumine humaine au lieu
de Tween 80 comme protecteur.
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Tableau 4 :
Albumine (mg/l)
0 100 1000 10 . 000
* AcA avant agitation 0,34 0,36 0,26 0,29
* AcA après agitation 2h 1,24 0,64 0,27 0,28
.
* CH 50/mg Ig
Résultat : L'albumine exerce un effet protecteur
- 10 sur l'Ig à partir d'une concentration comprise entre 100
et 1000 mg/l.
Tensio-actifs non ioniques Préférés :
- Tween 80 (ester oléique du sorbitanne polyoxyéthylene
fabriqué par Atlas).
- Triton X 100 (éther octyl-phénylique du polyoxyéthylène
fabriqué par Rohm et Haas).
- Tween 20 (ester laurique du sorbitanne polyoxyéthylène)
- Pluronic F 68 (copolymère de polyoxyéthylène et de
polyoxypropylène fabriqué par Ugine Kl~hlm~nn).
- Laurate de polyéthylène glycol 600 (fabrique par
Gattefossé).
Le Tween 80 est préféré du fait de son absence de
toxicité et de son emploi en formulation pharmaceutique
ou alimentaire bien documenté (Voir l'ouvrage "Non Ionic
Surfactants" M. Schick éd. Marcel Dekker NY, 1967, 28,
923-970).
