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I
CO~IPOSITION IM~IUNO~IODULATRICE UTILE EN PARTICULIER POUR LE
TKAITEMFNT DEIS INFECTIONS PROVOQII~ES PAR VIH.
La presente invention se rapporte à une nouvelle composition
S immunomodulatrice contenant des principes actifs d'un extrait végétal
pouvant etre obtenu par e.Ytraction à partir des feuilles d'une plante de la
famille des Buxacées, et m~ du genre Bu~us. L'invention concerne
egalement un médicament contenant cette composition, utile en
particulier comme immunomodulateur et pour le traitement des affections
I() pro~oquées par le virus de l'immunodéficience humaine (Vl~
Le s~ndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) se développe à la
suite de l'infection d'ull indi~idu par le VIH; le Vlll reconnait le récepteur
CD~ exprimé a la surface des Iymphocytes T~. Une période asymptomatique
pou~ ant durer plusieurs années peut suivre la contamination initiale. Le
1~ déclenchement du SIDA est entrainé par l'activation des cellules et la
multiplication du virus qui se propage a d'autres Iymphocytes. Ia phase
clinique de la maladie se traduit par la survenue d'affectlons opportunistes
~t la modification de ~dl.illl~ S sanguins, commc la chute du taux de CD~
ou l'augmentation de l'antigénémie p2cl.
~() L'eYtrême variabilité du Vl~} rend tres difficile la mise au point d'un
traitement efficace.
La demande de brevet FR ~ 6~8 835 a proposé l'utilisation d'un
e~trait préparé à partir du bois, de la raclne et de l'écorce de la racine de
~uYus sempervirens, essentiellement constitué d'alcaloïdes stéroïdiques,
~5 pour le tr~itement du SIDA.
De manière inattendue, la Demanderesse a maintenant trouvé qu'un
e~;tr~it végetal obtenu à panir de plantes de 1~ famille des Buxacées, dont
les alcaloïdes ont été pratiquement éliminés, possede une activité
immunomodulatrice. C~est pourquoi la présente illvention a pour objet une
O composition immunomodulatrice contenant des principes actifs d'un
eYtrait végétal, caractérisée en ce que l'extrait végétal peut être obtenu
par la mise en oeuvre des opérations successi~ es suivantes:
a) les feuilles d'une plante de la famille des Bu.~acées sont soumises à une
étape d'extraction par un mélange eau/solvanl organique, puis les
3~ solvants sont éliminés pour obtenir un extrait brut solide,
.. ..... .. . .... .... ... . . _ . _ . _ . _ _
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b~ l'e~ it brut est remis en suspension dans un mélange hydroalcoolique
puis introduit dans une colonne de résine non ionique ma--ul,o~.n~c,
qui est éluée par un mélange hydroalcoolique, de racon à récupérer un
extrait essentiellement dépour~u de sucres,
S c) les solvants de l'extrait obtenu à l'issu de l'étape ~) sont éliminés et le residu est remis en solution dans de l'eau,
d) la solution ~queuse obtenue à l'issue de l'érape c~ est introduite dans
une colonne de résine .S~h~n~e--ce de catiolls Faiblement acide, qui est
éluée par de l'eau,
10 e) les solvants sont éliminés de Itéluat obtenu a l'issue de l'étape d) et le résidu solide est remis en solution a~ueuse à pH acide,
f) la solution aqueuse est introduite dans une coionne de résine
érh~n~2~c~ de cations fortement acide, qui est éluée par de l'eau, de
facon à recupérer un extrait végétal essentiellement dépourvu
d'alcaloides.
Ia préparation s'effectue de préférence sur des feuilies sèches,
broSées, d~Lalds~e~.. de toute trace de bois ou de racine, les feuilles sont
é~elltuellement réduites en poudre avant d'être soumises à l'extraction.
L'extraction à l'étape a~ peut avantageusement etre effectuée par
20 un mélange hydroaicoolique, par exemp~e par un mélange éthanol~eau,
dans des rapports compris entre 99~1 et ~5~35, de manière préférée entre
90~10 et 75~5. Un mélange éthanol~eau dans un rapport de 80~2û est
particulièrement approprié.
Seion l'un des modes de mise en oeuvre de l'invention, I'extraction
de l'étape a) peut étre effectuée à température ambiallte, c'est-à-dire
comprise entre environ 18 C et 30 C, de l'ordre de 20 à 26 C. L'etape
d'extraction comprend de préférence plusieurs extractions repétées,
chaque période d'extraction pouvant durer plusieurs semaines. Après
chaque période d'extraction, le mélange est filtré pour séparer le solide de
O la solution. Le solide est ensuite réextrait dans ies conditions décrites
préc~ n-m~nt Les solutions pro~!enant des extractions successives sont
ensuite réunies, filtrées pour eliminer toute particule solide puis
évaporées soit sous pression réduite à une température ne dépassallt pas
~0 C, soit Iyophilisee.
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Par exemple, 4 I;g de feuilles sont mis en suspension avec 5 litres
d'un mélange d'éthanol absolu (4 litres) et d'eau ( 1 litre) dans un
récipient fermé et soumis à une agitation mécanique pendant trois
semaines. L'extract~on s'effectue à t~ dlUI~: ambiante. Le mélange est
5 filtré. La solution éthanolique est conser~ée. Le résidu solide est mélangé à
5 litres du meme mélange éthanol-eau 80/20 (volume/volume).
L'opération precédente est ainsi renou~elée deux fois.
Les solutions éthanoliques sont réunies et traitées pour obtenir
l'extrait brut solide.
Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, I'extraction
de l'étape a) est effectuée à chaud. Elle est effectuée de préférence
plusieurs fois, pendant p~usieurs heures, au moyen d'un solvant
organique et d'eau au reflu.x.
Par exemple, I'extraction est erfectuée en placant les feuilles
1~ broyées (100 g) en ~ .IsiL~l dans le melange éthanol (400 ml) et eau
~100 ml), dans un ballon surmonté d'un réfrigérant. La suspension est
chauffée jusqu'à l'ébullition qui est maintenue pendant 9 heures. La
suspension est ensuite refroidie, filtrée et le résidu solide est repris dans
les memes conditions que celles décrites ci-dessus. L'opération est
20 rcnouvelée en tout trois fois.
Les solutions provenant des extractions successives sont ensuite
réunies et traitées comme pour l'extraction effectuée à froid, afin
d~obtenir un extrait brut solide.
L'eYtrait brut solide est remis en suspension pour subir plusieurs
25 etapes de fractionnement par chromatographie d'adsorption et de
partition. Le rllélange hydroalcoolique scrvant à préparer cette
suspension est de préférence constitué par un mélange éthanol/eau, dans
Ics proportions indiquées pour le mélange utilisé à l'étape a).
Le passage sur la colonne de résine macroporeuse de l'étape b)
30 permet d'éliminer essentiellement les sels et les sucres présents dans
l'e.~trait brut solide de départ.
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~18~99
Par exemple, une coloIme de 3 cm de diarllètre et de 50 cm de
hauteur est remplie par une s~-~r~n~ n de DUOLITE S 861 (Rohm & Haas)
dans un mélange d'éthanol et d'eau 80/Z0 (volume~volume). 5g d'extra~t
en solution dans 10 cm3 d'eau distillee sont deposés au sommet de la
coionne. On fait passer à travers la colonne, pour l'élution, 1 litre du meme
mélange éthanol-eau. La solution recueillie est évaporée sous pression
réduite ou Iyophilisée.
L'extrait dépour~u de sucre ainsi obtenu, est de préférence trituré
dans de l'eau distillée, pour séparer une fraction insoluble. I.'extrait
obtenu à l'issue de l'étape b, débarassé de la fraction insoluble et remis en
solution aqueuse, est séparé par passage sur une colonne de résine
Prh~n~el-c~ d~ions, faiblement acide, ce qui COnSlitue l'étape d) ci-dessus.
Par exemple, dans une colonne, de mémes dimensions que celle
décrite à l'étape précédente, on place en suspension dans de l'eau distiLiée
1~ ulle résine échangeuse de cations faiblement acide, par exe~npie une
résine Amberlite IRC 50 (Rohm & Haas). L'extrait, débarrassé de la fraction
insoluble, est mis en solution dans de l'eau distillee ( 10 cm31 et dépose sur
la colonne. L'elution est effectuée au moyen d'un litre d'eau distillee. La
nouvelle solution obtenue est évaporée sous pression reduite à une
l-.~.,ué.dlull: ne dépassant pas ~0 C, ou Iyophilisée.
On obtient un résidu solide qul est remis en solution aqueuse à pH
acide puis fractionné par passage sur une colonne de résille échangeuse
cationique fortement acide, possédant de préférence des ~roupes
fonctionnels sulfonate ~étape n ).
Par exemple, une résine Amberlite IR 120 (Roh~l et Haas) sous
forme ionique Nai ~st placée en suspension dans l'eau distill~e dans une
colonne de mèmes dimensions qu'à l'étape précédente. I.'extrait est
solubilisé dans 10 cm3 d'eau distillée et le pll de cette solutioll est ajusté àpl-I = 2. Cette solution est déposée sur la colonne et l'élution s'effectue par
un litre d'eau distillée. La nouvelle solution obtenue est evaporée sous
presslon réduite à une ltlll~CldlUI~: ne dépassant pas 40~ C, ou Iyophilisée.
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On obtient un extrait qui, à l'issue des étapes e) et f) est
essentiellem~nt débarrassé des alcaloïdes présents dans le produit de
départ.
L'extrait végétal selon l'invention peut etre obtenu par la mise en
oeuvre des étapes du procéde défini ci-dessus, à partir de plantes de la
famille des Buxacées appartenant au genre Buxus, et en particulier à
partir de Buxus sempervirens.
En ~ dl~hie basse pressioll sur colonne Zorba.~ OL)S SB~
(250 x 4,6 mm) (colonne de silice, ~ ialisée par Dupont de Nemours)
10 éluée par un mé}ange eau + 19~o d'acide trifluoroacét~que, avec un débit de
I mlfmin, la composition présente, à 255 nm, le spectre .~I.a~l~Li: sur la
figure 1, ~c~ ;LIIt 6 pics majeurs.
Ces pics sortent aux temps suivants: - 0,07 min
- entre 3,72 et 4,87 min
1~ - 8,75 min
- 1 1 , 1 7 min
- 1~,29 min
- 28,70 min
La composition selon l'invention, en chromatographie sur appareil
Waters 990, sur colonne ~ypersil BDS C18~g (100 mm x 1,6 mm), éluée par de
l'acétate d'ammonium, pH 5,9 (10 min) puis par un gradient jusqu'à
acétonitrile-eau 70% (70 min), présente, à 75~ nm, le spectre representé
sur la figure 2. i--
La colonne ~persil BDS C18 est une colollne de silice greffée par
~5 des chaînes carbonées possédant 18 atomes de carbone, commercialisée par
Millipore.
Le spectre a éte enregistré sur un chromatographe liquide haut~
pression Waters 990, le spectre a été enregistré à 254 nm, la colonne
utilisée est une Hypersil BDS C18, support de 3 microns (dimensions de la
colonne 100mm x 4,6mm). I'échantillo~l a été prép~ré par mise en solution
de 30,5 mg de SPV 30 dans 750 micro litres d'eau distillée. Cette solution a
été ~lltrée sur un micro~iltre de type Millex GV13. 10 microlitres ont été
injectés dans l'appareil. L'élution a ét~ programmée en ~radient de la
manière sui~ante: pendant 10 mn avec une solution d'acétate
3~ d'ammonium 0,1 Molaire (pll 5,9), puis en 20 mn passage de cette première
solution à un mélange final acétonitrile-eau à 70% (par enrirhiccPmrnt en
acétonitrile).
,,, _ ,,, , . ,,, .. , . . . .... .. , , .... . . , , .. , ... .. . .. . , .. , _ _
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~18~99
La figure 3 le~,és~ le spectre à 254 nm de la phase aqueuse
obtenue après une extraction chloroforme.~eau de la composition selon
l'inventioll, et Filtration sur Millex GV13, par chromatographie sur une
colonne Hypersi~ BDS C18, dans des conditions Identiques à celles de la
S cf)mr~-sjti( tn tota~e.
La figure 4 représente Ic spectre chromatographique de la phasc
chloroformique obtenue après une extraction chloroforine~eau de la
composition selon l'invention et fi~tration sur Millex GV13, sur une
colonne Hypersil BDS C18 dans des conditions identiques à ce~les suivies
~0 pour la composition totale.
La figure S représente le spectre UV des trois principaux produits
trouvés dans la phase chloroformi4ue.
I.a composition selon l'invelltion présente une acti~ieé
immumJ.~Ioduldllice sur les cellules immuno~ lltes humaines.
La composition selon l'invention stimule la production basale d'lL-
1~, de T~'F~ et de (:I~I-CSF par les cellules mononuclées du sang
périphérique, de manière dose-dépendante.
Cependant, I'activation de la production induite par d'autles
activateurs est inhibée par ies compositions selon l'in~entio~ us4u'à 90~6
20 pour le Ghl-CSF ct à environ 30% pour le TN~
L'extrait selon l'invention est sans action sur la production d'lL-6.
La composition est également sans actio~l sur la production basale
d'lL-2. I.orsque la production d'lk7 est stimulée par des activateurs comms~
la ph~to-h~maglutinine, ou le PMA, I'addition d'ulle composition selon
7S l'ill~ention entraine une inhibition de cette production.
Les ~olllpu~ JIls selon l'invention renforcent l'eftet inhibiteur de
la ciclosporine sur la production d'}l.-2.
Les compositions selon l'invention ont une action antagoniste de
l'illhibition de ia prolifération cellulaire Induite par la ciclosporine.
3() C'est pourquoi la présente illvention a égalemel~t pour obiet un
médicament, caractérisé en ce qu'il contient une composition contenanf
les principes actifs de l'extrait végétai pou~ant etre obtenu par les étapes
a~ à f) décrites ci-dessus.
Plus particulièrement, I'in~-ention concerne l'utilisation d'une telle
35 composition poLr la preparation d'un médicament utile comme
immunom~-d~ tf~t~r
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De manière générale les compositions selon l'invention ont une
activité immunostimulante sur les cellules quiescentes tll~ , GM-
CSF), immunosu~",~ e sur les cellules activées (IL-2, G~I-CSF), agoniste
de la ciclosporine A dans l'inhibition de 1~ synthèse d'lL-2, antagoniste de
5 la ciclosp~rine A dans l'inhibition de la prolifér~tion.
Les médicaments selon l'invention pourront donc ètre
avantageusement utilisés lors de transplantation d'organes, dans le
traitement des maladies dul~ .,ulles ainsi que dans le traitement de
l'infection à Vlll.
L'invention a égalemellt pour objet l'utilisation d'une composition
selon l'invention po~ir la préparatioIl d'un médicament utile pour le
traitement des infections virales, en particulier provoquées par les
retrovirus comme le VIH.
L'administration de telles compositions selon l'invention à des
sujets infectés par le VIH est bien tolérée et entraine une remontée du taux
de CD~.
L'invention conceme également un procédé de stimulation in vitro
des Iymphocytes, caractérisé en ce qu'on introduit dans une culture
l)mphocytaire ulle composition selon l'invention.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sal~s
aucunement en limiter la portée.
Exemple l: Préparation d'un extrait végétal selon l'invention
(SPV 30)
2~
A partir de 4 kg de feuilles de Buxus semper~irens, traites durant 3
fois 3 semaines par 3 fois un mélange éthanol/eau (80:70), on récupère 350
g d'extrait brut. Le fractionnement est eFfectue sur 6g d'extrait brut à
l'aide d'une colonne de 3 cm de diamètre et de 50 cm de hauteur.
Première colonne:
EiiminatioIl des sels et des sucres par une résine D~lOLlrE S 861 qui
est introduite dans la colonne en s~ dans un mélange EtOH~H~O
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(80:20), jusqu'a une hauteur de 45 cm. 6 g d'e~trait brut, solubilisés dans 1-
S cm3 d'EtOll~112O (80:20), sont déposés. On élue par un litre de solution
EtOH/H2O (80:20) et on évapore les sol~!ants. La fraction afnsi obtenue est
solubilisée d~uls 4-5 cm3 cd'eau (une partie reste non soluble, elle est
5 éliminée du mifieu) et acidifiée par HCI IN jusqu'à pl~ ~ 4.
l)eu~i~-nP colonne:
La résine utilisée ici est l'Amberlite CG 50, échangeuse d ions,
faiblement acide. Elle est introduite dans la même colonne que
10 préc~rl~-mmrnt en su~ siol~ dans l'eau jusqu'à Ulle hauteur de 45 cm. La
fraction acidifiée résultant de la première colonne est déposée et OM élue
par un litre d'eau. On é~apore ensuite le so~ant. Cette dernière fraction
est alors déposee sur une troisième colonne.
Troisième colonne:
Echangeuse d'iQns fortement acide, cette Amberlite IR 120 (plus)
forme Na~ est introduite comme précédemment en suspension dans l'eau
jusqu'à une hauteur de 45 cm. La fraction résultant de ~a deuAième colonne
est déposée dans 4-5cc d'eau et on élue par 11 d'eau. Ia fraction SPV -30
recupérée est évaporée et on isole 3,5 g.
La régénération des différentes colonnes s'effectue de la faSon
sui~ante:
DUOLITE: Sl de NaOH à 49& Rinçage jusqu'à ph=7
AMB~RIIT~ CG ~0: 2,51 de HCI lN. Rincdge jusqu'a ph=7
AMBERI lTl~ IR 120: 2,51 de NaCl saturée. Rincage.
Exemple 2 ~ tude de la cytotoxicité du SPV30
L'effet toxfque de la fraction SPV30 sur les cellules CEi~r-SS n(~n
illfectées est apprécié par la réaction colorimetrique (~1~).
Cette réaction est basée sur la capacité des cellules ~ antes à
réduire le 3-(4,5 diméthylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl-tétrazolium bromide
eIl formazan après 5 jours d'incubation en présence de différentes
concentrations de la fraction SPV30.
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La c~totoxicité de SPV30 (SPV30. 1 ) a également été mesurée par
comptage en microscopie optique, en comparant l'exclusion du bleu
tr~pan par les cellules incubées en absence et en présence des
concentrations croissantes (de 50 llg~'ml à 10 mg/ml) de la fraction,
pendant 24, 48 et 120 heures.
L'absence de cytotoxicité de SPV30 a été demontrée d-dns plusieurs
e.~périences, en ~JIIIpdli~ Ia mortalité des cel~ules incubées en absence et
en présence des concentrations croissantes, 50 ~Ig~ml à 10 mg/ml, de la
fraction. I,'e.xclusion du b~eu tr~pan a été estimée à 24, à 48 et 120 heures
d'incubation, par comptage en microscopie optique. Jusqu'à 5 mg/ml la
~iabilité des cellules incubées en présence de SPV30 était la meme que
celle des cellules contrBles. Après 48 h d'incubation en presence de 10
mg~ml de SPV30, 70% de cellules sont restées vi~antes par rapport aux
cellules controles.
~ ~
Exemple 3: Evaluaeion de l'activité aDti-VII1-1 de la fraction
SPV30
1~. Activité anti-rétrovirale de SPV30
~() La multiplication du Vl~l-l (souche LAI) dans les cellules CEM-SS est
~aluée, ~pres 5 jours de culture, par dosage de 1~ réverse transc}iptase
(R1~).
L'acti~ité de la RT traduit la présence de virus, relargué dans le
surnageant de culture.
~5 La fraction SPV30 est ajoutée après l'adsorption du virus dans le
milieu de culture.
Activité aDti-VlH-1 dc la fraction S.P.V. 30 sur les autres
lignées cellulaires
~)
Activité anti-VIII mesurée:
1- par inhibition de ECY (Effet cytopathogène):
estimation de la viabilité cellulaire
(~Idll~r~lllld~iOn du MTT en formazellan)
wo s~/~36~ 218 ~ 6 9 9 r~ "
~o
2- par inhibition de la Reverse. Transcriptase à J5
infectés par le VIE-I (souche Lav-1-bru)
ou non inFectés pour déterminer la cytotoxicité du produit.
Emcacité testée sur dirr~ lignées: le SPV 30 est actif sur les
5 lignées:
à une ~u~ ion de 10-3 mg~ml
CEM-SS à une col1centration de 10-~ mg~ml
PBMC à une concentration de 10 3 mg/ml
Absence de cytoto~;icité jusqu'a des concentrdtions > lmg/ml, ce 4ui
perrnet de penser que l'irldex de sélectivité est important.
Z) Activité aatirétrovirale sur des cellules fibroblastiques de
15 souris (I~LluYilu~ murin de Friend F-MuLV~
Après 4 iours de culture de cellules fibroblastiques: recherche de
protéine d'enveloppe ~irale (gp70) à difFérentes concentrations de SPV 30
(mise en évidence des foyers de cellules infectées) et calcul du %
Z0 illhibition de la réplication ~irale~cellules non traitées mais infectées:
1,6 ~ug/l 39% inhibition 22 fo~ers
lOûO ,'lg~l 78% inhibition 8 foyers
5000 ug/l 100% inhibition 0 foyers
3) Evaluation de l'activité anti-VII~-I des composés sur les
cellules CEM-SS
Principe
3() La multiplication du Vl~-l (souche LAI) dans les cellules CElv~-SS
(infectées avec 20 TCiD50) est é~ aluee, après 5 jours de culture, par dosage
de la r~verse transcriptase (RT) dont l'activité traduit la présence de virus
relargué dans le surnageant de culture. Les composês testes sont ajoutés
après l'adsorption du virus dans le milieu de culture. On compare l'activité
35 de l'AZT et de l'eYtrait SP~'30 selon l'invention.
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L'eFfet toxique des composés sur les cellules CEM-SS non infectées
est apprécié par la reactiol colorimétrique (MTT basée sur la capacité des
cellules vi~antes a réduire le 3-(4,5 diméth~lthiazol-2-yl)-2,5 diphényl-
tétrazolium bromide en formazan après 5 jours d incubation en présence
S de différentes coll~c~ d~ions en composé.
Les résultats sont présentés sur la figure 6.
Les courbes font d~paldl~
- d'une part les resultats du test MTT exprimés en D0
- et d'autre par les valeurs (en cpm) de l'activité enzyma~ique
~n en présence du composé testé aux differentes concentrations indiquées.
4) Evaluation de l'activité anti VIH- I de différents composés
sur les cellules MT4
15 Principe
La multiplication du VIH-I (souche HTLV 111~) dans les cellules MT4
(cellules T4 transformées par le HTLV-1) est suivie par l'effet
c~topathogène induit parle virus. Les cellules sont infectées avec une dose
de Vl~l-1 produisant, après 5 jours de culture, une diminution de 90% de
20 nombre de cellules vivantes. Les cornposés testés sont ajoutés après
l'adsorptio!l du virus dans le milieu de culture à différentes
concentrations.
La viabilité des cellules est mesurée par 1~ réaction colorimétrique
(~TT) basée sur la capacité des cellules vi~ antes à réduire le 3-(4,5
25 diméthylthiazol-2-yl)-2,5 dip~len~l-tétrazolium bromide en formazan,
propriété due aux déshydrogénases mitochondriales. La quantité de
formazan produite (D0 à 5~0 nm) est proportionnelle au nombre de cellules
vis.antes.
Le pourcentage de protection (~) des cellules infectées par le
30 traitcment avec les composés est calculé en appliquant la formule
proposée par Pauwels et col.
1~0540 des ~ellules infectées traitées (T~ -1)05~o des cellules infectées To (S2)
D0s40 des ~ellules non infectées (S1) - D0s40 des ce~lules infcctécs Temoin (S2)
wossl23~/)6 21~16~g r~l,r ~ 47
12
L'ef~et toxique des composés sur les celiules hlT~ non infectées est
mesuré par la même réaction col~ t~ ue.
La ~o~f~ dtion c~totoxique 509~ (CC 50) est la concentration de
composé provociuant une diminution de moitié de la DOs40 par rapport à
5 celle des cellules témoins.
S~il y a lieu, ]a co~ tldtion du composé conferant une protection
de 50% (IC = 50 = ~ CtlllldtiOn inhibant la réplication virale de 50 96) est
calculée.
10 Résultats
La feullle de résultat represente, pour chaque produit,
- d'une part le plan de la plaque de culture (96 puits) avec les
résultats du test MTT (e,Yprimés en DO) des cellules infectées et non
infectees, en présence et en absence du composé,
- et d'autre part, exprimées sur le graphique, la protection
(~) et la toxicité (I) du compose en fonction de sa concentration.
Exemple 4: Effets i~l...~ . o~ f~rS in vitro du SPV 30
:O MATE~RIEL ET METHODES
Réactifs
La so}utlon stocl; de la fractioli SPV30 a cté préparée par dissolution
de la fraction désséchée dans un milieu aqueux ~milieu de culture, PBS ou
~5 NaCI 0,9%) à la ~ .tll~ldtion de 100 mg~ml, filtrée sur membrane 0,~5 !lm
puis sur membrane 0,~ llm et conservée à 4~ C darls un tube stérile. Dans
ces conditions, elle mairLtient ses propriétés biologiques pendallt au moins
deux mois. Le(s) principe(s) actif(s) de SPV30 est (sont) dialysable(s)
(membrane de dialyse avec cut off de poids moléculajre egal à 10 ICDa).
WO ~2360G 2 ~ 8 ~ 6 9 ~ r~ l lr l~ ' . 17
13
Un dewiième lot de la fraction preparé par le LCBO, désigné SPV30 l, a
également été testé; utilisés dans les mernes conditions, SPV30 et SPV30.1
ont manifesté les memes propriétés biologiques. Les autres réactifs ont été
préparés et stockés comme suit: P~A, solution dans EtOH absolu 1 mg/ml,
5 -20 C; ciclosporine A, solution dans EilOH absolu 1 mg~ml, -20 C; PHA,
solution dans PBS 1 mg~ml, -20~ C; anticorps monoclonal CD3, solution
dans PBS 1 mg/ml, -20 C; LPS, solution dans PBS 10 mg/ml, 4 C. Le milieu
de culture RPMI 16~0 a été supplémenté avec 10% (mesure de la
prolifération cellulaire) ou 5% (mesures de la s~nthèse des cytokines) du
10 sérum de veau foetal (SVF) inactivé par la chalcur (30 min à 56~ C), le
glutarnate de sodium 2 mM, la pénicilline 100 Ul/ml et la streptomycine 100
Ul/ml.
Ccllules et conditions de culture
l~ Les cellules mononucléées du sang periphérique de donneurs sains
ont été obtenues par cel1trifugation sur milieu de scparation des
l-mphocytes (soit le sang total mélangé à du NaCI 0,9% (2:1), soit les poches
de ~buff'~ coat" mélangées à du NaCI 0,9%, resuspelldues dans le milieu de
culture complet à la denslté de 106 cellules/ml, ensemencées dans des
20 plaques de culture de 2~ ou 48 puits (mesures de la synthèse des cytokines,
10f} cellules/puits) ou 96 puits (mesures de la prolifératioll cellulaire et de
~a cytotoxicité, 105 cellules~puits) et laissées a 37 C (humidité 5%~ en
absence de tout effecteur pendant 14 à 18 I~curcs. Lcs cellules ont ensuite
cté incubées avec le SPV30 (SPV30 l) à différentes concentrations testées en
absence, ou en présence, des concentrations optimales ou suboptimales
d'activateurs. Les cellules des lignées humaines T (Jurl;at) et monocytaire
(TIIP-I) ont été maintenues en culture continue dans le m-~me milieu (5%
SVF) et utilisées à la même densité et dans les memes conditions.
V/O!J5123hO6 2l8~ . r~llr~ c--47
Mesure de la synthèse des cytokines: 11.-lfs~ , IL-6, GM-CS~
IL-2 .
Les effets sur la production des cyto};ines ont éte testes pour des
concentrations de SPV30 de 2 ng~ml à 4 mg/ml. Au terme de l'in~l~h lti--n,
5 les plaques de culture contenant les dirférelltes conditions e.~périmentales
ont été rapidement congelées et décongelees. Les quantités de cytokines
produites par les cellules mononucléées ont été déterminees en utilisant
des imnll~n~o~es specifiques et 4uantitatifs (FLISA); les p~rOI,.,~
de ces tests ainsi que les détails techniques précis de mesure ont été
10 publies. Il a eté vérifié que la présence de SPV30 n'interferait pas avec la
qualltification des cytol;ines par ELiSA.
Determination de la prolifération cellulaire
Les effets sur la prolifération cellulaire ont été testés pou~ des
15 concentrations de SPV30 de ~ ng~ml à 4 mg~ml. La prolifération
Iymphocytairc, basale et induite par des mitogènes, a été quantifiée enmesurant l'incorporation de la thymidine tritiée par les cellules en
culture, selon les tecitniques déjà décrites.
7(1 RESULTATS
Production de 1'11.-1~
La fraction SPV30 en absence de tout autre efFecteur stimule de
manière dose-dépendante la production de l'IL-1~ par les cellules
25 mol1onuclées du sang périphérique. L'augment~tion de la production de
l'IL-1~ par rapport à la production basale est détectable à partir de 50-100
llg/ml de SP~30, après 24 heures d'incubation. L'IL-1,~ stimulée par le
SPV30 à 2 mg~ml atteint les concentrations 2 à 3 fois superieures (15-20
llg/ml) à celles induites, dans la même e?~périence, par les concelltratio~ls
3Q optin1ales ~1-10 ng/ml) de LPS; cependant, le plateau de production de
1'11.-1,~ n'est pas obser~é dans ces conditions. 1~ production de l'IL-1~3 par
les cellules stimulées par les LPS (1 ng/ml) ou pal- le Pl~,IA (10 ngfml) plus
le CD3 (1 ,~g~ml) l1'est pas modifiée de manière sigllificative par la
présence de SP~/30.
W0~5/23606 218~9~ r~l~rl~s~ 7
Production de l'IL-6
La présence de la fraction SPV30 dans le milieu de cul~ure des
cellules mononucléées du sang périphérique n'exerce aucun effet sur la
5 production de 1'IL-6, bas~le ou stimulée.
Production du TNFQ
En absence d'autres effecteurs, la fraction SPV30 stimule la
production de TNF par les cellules mononucléées du sang périphérique de
manière dose ~ f n~nte (détectable à partir de 50-100 ~g/ml de Sl'V30) et
modeste ~de l'ordre de 0,1 ng~ml pour la concentration de SPV30 de 2
mg/ml). La production de TNFtl induite par les concentrations optimales de
P~IA (10 ng/ml) plus CD3 (1 llg/ml), de l'ordre de 5-10 ng/ml à 24 h et de
50 ng/ml à 48 h, est légèrement inhibée par le SPV30 (inhibition maximale
1~ de 20 à 30% par la présence de SPV30 a 1 mg/ml, demi-effet à 750 llg/ml de
SPV30
Production du GM-CSF
La fraction SPV30 en absence de tout autre effecteur induit de
~0 m;mière dose-dépendante, détectable à partir de 50-100 ~Ig/ml de SPV30, la
production de Gh~-CSF par les cellules mononucléées du sang périphérique.
A 2~ h, en présence de 2 mg/ml de SPV30, le taux de Gl~f-CSF atteint 0,2
ng/ml (quatre fois la production basale), comp,lrable à celui induit par les
LPS. Le SPV30 inhibe de manière significative la rroduction de GM-CSF
7S induite par l'incubation avec Ph~A (10 ng/ml) plus C1~3 ~ g/ml) ainsi
qu'avec PMA (10 ng/ml) plus PHA lo ,Lg/ml). La production de GM-CSF
induite par ces activateurs est de l'ordre de 10 ng/ml à 48 heures.
Ltinhibition ma~dmale atteint 90% en présence d~ SPV30 à 4 mg/ml, le
demi-effet est à 1 mg/ml. L'effet inhibiteur de: SPV30 est aboli après la
~0 dialyse de la solution stocl~ contre du PBS.
w09s/u~(i6 ~1g,~i~9~- r~l~rh~s.: 17
16
Production d'lL-2
Mis en présence des ceLLules mononllrléé~ du sang périphéri4ue, le
SPV30 n'exerce aucun ef~et sur la production babale d'lk2. La s~nthèse
d'lk2 induite par différents activateurs, tels la P~A ~ g/ml~, le P~IA (10
S ng~ml) plus le CD3 ( 1 I,lg~ml~, ie PMA ( 10 ng~ml) plus la PHA ( 1 llg~ml), est
inhibee de manière spectaculaire, dose dépendante, par le SPV30. I.'effet
inhibiteur de la syntbèse d'lL-2 est détectable à 200-300 ~Lg/ml de SPV30, le
demi-effet est obser~!e à 750-1000 llg~ml, et ~ hibition ma~imaLe de 80-
~0% est atteinte à 4 mg~ml. Ia fract;oll diaLysai~le de SPV30 rend compte de
ces propriétes. Pour observer l'effet inhibiteur optim~l, le SPV30 doit etre
ajouté dans le milieu de culture ~h~ulldllL~Ilent avec l'activateur ou peu
apres, u~e à deu~ heures; l'inhibition de la production d'll-2 est
observable, mais suboptimale, quand les cellules ont été préincubées 2
heures avec le SPV30 seul ou 4 heures avec l'activateur seul. L'effet du
SPi~'30 est détectable dès le début de la production d'll.-2 elle-Même; puis
i'effet ~Uppl~.~b~.~ll augmente régulièrement pour atteindre 50Yo et 75%
d'inhibition ~SPV30 à I mg~ml et à 2 mg/ml, respectivement1 après 24 h
d~incuhation et ~5% et 85% d'inhibition après ~8 h.
2~ Action agonistc du SPV30 ct dc la ciclosporin~ A sur la
p}oduction d'lL-2
En accord avec les données publiées, I'effet inhibiteur de la
ciclosporine A sur la syntl1èse d'lk2 a été détectable à 10-20 nM, le demi-
effet a été observé à 50 nM et l'inhibition de 80% a été atteinte à 100 IlM. L~
présence de la fraction SPV30 a déplacé la courbe dose-réponse de
l'inhibition de production d'lL-2 par la CsA vers la bas et lègèrement à
gauche, indiquant leur action au moins additive . ainsi à 300 ~lg/ml de
SPV30, I'inhibition de la producti~n d'lL-2 a eté observable à 5-10 nM de
CsA; en présence de 1250 ~Lg/ml de SPV30, I'inhibition a été de 60% pour I
nM de CsA, de 80% pour 50 nM de CsA et de 92% pour 100 nM de CsA.
4~99
WO 95123G06 2 1 8 r~llr~ - ~7
17
Il existe un probable effet de potrnti~ ,3iion de l'action suppressive de la
ciclosporine A par la fractioil SP\/30; en présence de 50 n~l de CsA, la
courbe dose-réponse de l'inhibition de la production d'll-2 par le SPV30 est
plate, montrant 85% d'inhibition pour toutes les concentrations testées
~0,01 à 2,5 mg/ml) de SPV30 -
Prolifération cellulaire
La prolifération de cellules mononucléées du sang périphérique
induite par la PHA (I ~Lg~ml) est inhibée dc manière dose-dépendante par
le SPV30 pour des concentrations de 0,7 à 2 mg/ml; à l mg~ml de SPV30,
concentration demi-inhibitrice de la s~nthèse d'll.-2, la prolifération a été
inhibée de 30% et à 2 mg/ml l'inhibition de la prolif~ration a été de 75%.
Cepcndant, une amplification par le SPV30 de la proliferation cellulaire
induite par la PHA a été obser~ée pour des concentrations 4UI n'exercent
1~ pas d'effet detectable sur la productiol1 d'lL-2; 30% d'augmentation
d'incorporation de th~midine tritiée à 50 ,~g~ml de SPV30, 15%
d'augmentation a 200 ~lg/ml. rl faut souligller que l'influence de SPV30 sur
l~ proiifération cellulairc a été obser~!ée uniquement à 48 heurcs de
culture; la mesure de l'incorporation de thymidinc tritiée à des temps plus
2() tardifs (72 h ou 96 h) n'a montré aucun effet de SPV30 sur la prolifératioll,
bas~le ou induite par l t PHA.
Action antagoniste du SPV30 ct dc la ciclosporine A sur la
prolifération cellulaire
~S En accord avec les données publiées, I'effet suppresseur sur la
prolifération Iymphocytaire induite par les mitogènes a été observé pour
les memes concentrations de ciclosporine A, que son effet inhibiteur de la
production d'll.-2. La fraction SPV30 e~erce un effet antagoniste de
I'~ction de la CsA sur la prolifération. La présence de SPV30 à 0,3 mg/ml a
~0 illduit une amplification de la prolifération stimulée par la PilA en
présence des doses non inhibitrices de la CsA (60% d'augmentatioll a 1 ni~l
WO9~/23606 ~1 8~638 P~,l/rlh ~r 17
'I ' '
1~
de CsA, 30% à 10 nM de Csa~, à lO0 nm de CsA en présence de 0,3 mg~ml de
SYV30 à la proliférat;on reste à son niveau maYimal stimulé par la Pl-IA. Le
même effet est observe en présence de SPV30 à 1,2 mg~ml qui a proYoqué
une translation analogue de la courbe dose-répo~lse de l'inhibition de la
5 prolifération par la CsA vers le haut. L'eflet antagolliste de l'actior
suppressive de la prolifération par la CsA n'a pas été ohser~é en présence
de SFV30 à 2,5 mg~rnl.
F:xemple 5: Essai clinique: SPV vs PIACEBO
Essai pilote phase 1/11 rarldomisée en douhlc aveugle
- But: Efficacité et de la tolerance du S.P.V. patients V.l.!l asymptomatiques
- A~is favorable du C.C.P.P.R.B: avril 92
- Criteres inclusion: CD~ entre 2S0 et 500 / mm3.
patient V.l/ll asymptomatiquc (stade 11 CDC)
- Critères d'exclusion: prise d'antiviraux ~AZ1'-DDI~
- Critères prindpal de ~ugement: évolution du nom~re de CD~
- Critères secondaires:
~() Evaluation de la tolérance du S.P.V-l'~ si~,., dans la maladie
Autres marqueurs prédictifs de l'infection V.l.}~
(Agp~ 7microglobulinémie, néoptérine, IgA)
[,es résu~tats sont présentés sur la figure 7. Ctn observe une
augmentation significative du tau.x de CD~ dans le groupe traité par SPV30.
25 11 n'existe pas de différence significati~e des effets secondaires entre les
deux groupes.
