Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
21~675~
wo 95/26738 ~ P~l/r~SS t l~ ~
ut11~sat~on des polymeres protégeant des facteurs de cro1ssdnce pour le
traltement de l'lnflammatlon
La présente invention a pour ob~et
5 1 'utilisation de polymères ou de biopolymères pour la
préparation d ' un médicament pour le traitement de
f lammation .
Elle est en outre relative a une composition
contenant ces polymères et destinée à un tel
10 traitement.
L' infl tion est une manifestation
particulièrement complexe qui s ' installe à la suite
d'u~le lésion tissulaire spontanée ou traumatique.
Caractérisée par une modification de la perméabilité
15 capillaire, elle s'accompagne d'une infiltration de
composants sanguins, moléculaires et cellulaires, qui
se manifeste généralement par des érythèmes et des
oedèmes. De n~ ' ~eun médiateurs rhimiq~c sont libérés
ou activés pendant ce processus au cours duquel des
20 éléments du sang, en particulier des globules blancs
s'accumulent et relarguent différentes activités
lytiques. De nombreuses substances sont employées
comme agents anti-inf lammatoires . Elles peuvent
grossièrement être classées en agents stéroïdiens et
25 non stéroïdiens.
Les facteurs de croissance appartenant à la
famille des Heparin Binding Growth Factors (HBGF) sont
naturellement relargués dans le cas d'une lésion ou
d'u~ traumatisme tissulaire soit directement par ces
30 tissus au niveau de leurs cellules constitutives, à
partir des éléments de la matrice extracellulaire qui
représente un site de stockage naturel de ces
molécules, soit par les cellules circulantes et en
particulier les cellules de l'~nflr -tion. La
~ i
Wo 95/26738 ~ 1 ~3 6 7 5 8 2 1 ~ v~
réaction inflammatolre s'accompagne d'une augmentation
locale des concentrations en facteurs de croissance
dont certalns appartiennent à la famille des HBGF.
Le sucrose sulfate ester et son sel d'aluminium
5 le sucralfate sont des produits décrits et utilisés
comme ~gents anti-inflammatoires (Brevet US
N-3,432,489) et dans différentes associations et
compositions pharmaceutiques décrites dans une série
de brevets (US 4.975.281, 4.885.281, US 5.013.557, US
105.164.379, US 5.196.405, US 5.240.710 et DK 102.488 et
DK 505.588).
D ' autres composés ont été décrits comme des
agents anti-inf lammatoires: la suramine, c os~nt
organique sulphonaté par LAROCCA R et coll. (US
7479817), des compositions contenant des mélanges de
bas poids moléculaires de 1 ' héparine par COHEN IR et
coll. (WO9219249), des fri~, t.s d'héparine présentant
des effets inhibiteurs du système du complément par
EKRE H P et coll. (W09202232), des produits dérivant
par modifications chimiques de protéines glycosylées
par MIYAZAKI K et coll. (EP454898), des protéoglycanes
heparane sulfate comme le syndecan par ~ D M et
coll. (WO9305167), des oligosaccharides dérivés de
dermatanes sulfates par BTANrT~TNT P et coll.
(W09305075).
Une composition contenant en association de
l'héparine et du sulodexide, qui est un mélange de
polymères comprenant des glycosaminoglycanes (GAG), a
d'autre part été étudiée pour son action dans le
traitement de traumatismes légers (Dragani et al.,
1989, Minerva Medica, 80, n 4, 397-403). Néanmoins ces
deux composés n'ont pas été testés séparément.
Il n'est donc pas possible de détPrminPr si
1~ 2186758
wo 95/26738 3 ~ ~ I P~llr~
1 ' un de ces deux composés est responsable de
1 ' activité thérapeutique .
L ' activité d ' un autre mélange de
glycosaminoglycanes, le mésoglycan, sur les
5 hémorroïdes a été testée par S2ggioro et al., t 1985,
Min. Dlet. e. Gastr, 31, 311-315). Il ressort de cette
publication que le mésoglycan est très efficace à
l'encontre des hémorroïdes et permet d'Plim1nPr les
symptomes tout en améliorant 1 ' aspect endoscopique .
Néanmoins cette publication est limitée à des
polymères d'un type bien particulier, qui de plus
présentent une composition d'origine animale mal
définie et su~ette à des variations.
La synthèse d'une autre famille de polymères,
15 appelés CMDBS ~Carboxy Méthyl Dextrane Benzylamine
Sulfonate) a été décrite dans le brevet PR 2 461 724
ainsi que dans le brevet US 4 740 594. Certains de ces
polymères miment 1 ' héparine et peuvent être utilisés
en tant que produits de remplacement de 1 ' héparine du
20 plasma, grâce a leurs propriétés anticoagulante et
anticomplément .
Parmi 1 ' ensemble des polymbres CMDBS, certains
miment une autre propriété de 1 ' héparine qui consiste
en une sf Ahi 1 i !'2ation, protection et potentialisation
25 in vitro de l'activité biologique des facteurs de
croissance de la famille FGF . (Tardieu et coll,
Journal of Cellular Physiology,1992,150 pages 194 à
2 03 ) .
Le brevet FR 2 644 . 066 décrit 1 ' utilisation de
30 certains CMD3S associés aux FGF pour la cicatrisation
de la peau et de la cornée. Des expériences ont été
réalisées en provoquant une blessure cutanée à l'aide
d ' un emporte pièce de 6 mm de diametre chez le rat .
21~7~8~ --
Woss/2673s 4 ~I/rl~ r
Dans cet exemple, le CMDBS associé au FGF 2 permet
d'obtenir un effet net sur la vitesse et la qualité de
la réparation de la peau.
Il ressort donc de l'analyse de l'état de la
5 technique que des polymeres de type CMDBS ont de~ a ete
utilisés en association avec des facteurs de
croissance sur certaines lésions d ' un type bien précis
de tissu, le tissu cutane.
Du fait de l'imprévisibilité des effets
10 thérapeutiques d'une molecule donnée, il n'etait pas
evident que ces polymeres, seuls , et non associés a
des facteurs de croissance, puissent avoir un effet
sur d'autres tissus que ceux de la peau.
En effet, il est bien connu que les differents
15 tissus du corps humain ou animal presentent des
specificites tant structurelles que fonctionnelles qui
rendent impossible toute prediction quant à l'effet de
la molecule, connue pour son ef~et sur 1~
cicatrisation du tissu cutane, sur des tissus de
20 diverses origines soumis a une inflammation.
De même , il est bien connu qu'il est
impossible de predire l'activite in vivo d'une
molecule sur un tissu particulier à partir de
resultats obtenus in vitro sur un modèle experimental
25 specifique.
De manière surprenante, il a ete trouve; selon
1 ' invention, que certains polymeres definis comme
appartenant a la classe des EIBGFPP et en particulier
des CMDBS avaient un effet sur l'intensite de la
30 réaction inflammatoire qu'ils diminuent de façon tres
marquee tout en accelérant les processus de
réparation, de régénération et de restauration de
tissus lésés. A une augmentation de la vitesse et de
21~67~8
W0 gs/26738 5 P~ l/rl ~ I ~ ~
la qualité de la cicatrisation des lésions des tissus
du tractus digestif, des tissus cutanés, des tissus
- osseux, les HBGFPP associent des effets anti-
inf lammatoires .
Il a en outre été montre que des doses très
faibles de ces polymères permettent d'obtenir des
e f f ets therapeutiques .
La presente invention a pour objet une
utilisation d'au moins un polymère ou d'un
10 biopolymère, appeles HBGFPP, a l'exclusion du
mésoglycan, protégeant specifiquement les facteurs de
croi ssance des familles des FGF et TGF bêta de la
degrad2tion trypsique et n' inhibant pas de manière
significative la coagulation, pour la fabrication d'un
med$cament pour le traitement des infli ~tions de
divers tissus.
Un tel polymère presente particulierement une
activité anti-coagulante inférieure à S0 unites
internationales par mg de polymère mesurée selon
Maillet et al (Mol. Immunol, 1988, 25, 915-923).
Ava~ltageusement, il potentialise les FGF in vitro.
Préferentiellement, il n'actlve substantiellement pas
le système du complement, c'est-à-dire qu'il possede
une activite anti-complément superieure à 0,5 yg pour
le ~H50 (selon ~auzac et al., Biomaterials, 6, 61-63,
1985 ) .
Selon la présente invention on entend par
polymères toutes substances naturelles, naturelles
modif iées chimiquement ou totalement synthetiques
répondant à la definition donnée ci-dessus.
Ainsi il peut s ' agir de :
- polymères obtenus à partir de dextranes mais
modifiés par d'autres types de substitutions avec
` !-
WO 95/26738 r n5- c
d'autres types de radlcaux,
- polymères naturels autres que ceux dérivant
de dextranes mais comportant des résidus osidiques
(cellulose, chitine, fucanes, etc. . . ),
- polymères obtenus par polymérisation de
es de natures non osidiques (poly acide
malique, poly acide oxalique, poly acide lactique,
polystyrène, polyéthylène glycol) modifiés ou non.
Avantageusement, ledit polymère ou biopolymère
lO est un polysaccharide qui peut etre composé
principalement de résidus glucose.
Il peut aussi ~ dL~: des résidus
gll-cos~m~ne et/ou d'acide uronique, particulièrement
sous la forme de dimère glucosi~minf~-acide uronique.
Des polysaccharides particulièrement préférés
sont des dextranes substitués, des glycos~mi nr~lycanes
eventuellement associés à un lipide, un peptide ou un
protide ou des sulfates de ces polymères.
Un tel polymère présente avantageusement un
poids moléculaire d'au moins 10 kDa et
preférentiellement d' environ 40 kDa .
La présente invention est en outre relative à
une composition pharmaceutique contenant ces
polymères .
Les polymères et/ou biopolymères peuvent etre
selectionnés à partir de substances naturelles qui
peuvent ensuite etre éventuellement modifiées par
additions de yl~Ju~ ts chimiques appropriés, ou
encore etre obtenus entièrement par synthèse . Ces
polymères naturels, semi synthétiques ou entièrement
synthétiques sont ensuite sélectionnés sur la base de
leurs capacités à lnteragir spécifiquement avec
plusieurs facteurs de croissance notamment ceux de la
2~ 86758
W0 95/~6738 7 ~ r~SS,.
- famille des FGF et des TGF bêta. Ils peuvent être
également sélectionnés pour leurs capacité à protéger
- ce ou ces facteurs contre des dégradations
protéolytiques, et à agir comme des inhibiteurs
5 d ' activités protéinasiques impliquées dans le
processus inflammatoire comme l'élastase leucocytaire,
et la plAcmine par exemple, et pour leur activité
anti-coagulante. Ces polymères sont désignés sous le
sigle générique de HBGFPP (heparin bLnding growth
10 factor protectors and promotors). Deux prototypes de
ces polymeres ou bio polymères sont donnés comme
exemples ainsi que les procédés et critères de
sélectlon de ces polymères.
Le premier exemple de HBGFPP appartient à la
15 famille de~ CMDBS qui sont des produits connus, à
savoir des dextranes biospécifiques fonctionnalisés,
substitués par des résidus carboxyméthyle, benzylamide
et benzylamine sulfonate. Ces polymères illustrent
1 ' obtention de HBGFPP à partir de produits naturels
20 (de~trans ) subséquemment chimiquement substitués . Le
deu~ième exemple décrit la sélection de produits
complètement naturels comme les glycosaminoglycanes
sulfates purifiés à partir d'extraits tissulaires.
Ces deux exemples illustrent les capacités de
25 ces HBGFPP à d'interagir, a stabiliser, a protéger et
a potentialiser les facteurs de croissances des
familles FGF et TGF bêta et leur utilisation dans une
composition pharmaceutique permettant le traitement
d'lnfl~ -tions de toutes origines.
Les dif férents exemples décrits dans cette
invention montrent qu'en plus des effets cicatrisants
propres des CMDBS sur différents types de régéneration
ou de cicatrisation tissulaire, l'intensité de la
t ~
W0 95/26738 2 1 8 6 7 5 8 8 r~llrl ~ t t I ~ --
réaction inflammatoire locale est très fortement
diminuée .
On entend, dans la présente demande, par
traitement toute operation curative ou preventive
5 effectuee pour la prophylaxie ou la resorption
d'inflammations faisant intervenir en particulier des
activites protéinasiques comme 1 ' élastase
leucocytaire, la plasmine, les métalloprotéinases en
supplement d'effets stimulateurs de la regénération et
10 de la cicatrisation tissulaire.
Les exemples ci-après illustrent une diminution
de 1 ' intensité de la réaction inflammatoire observee
dans des tissus léses traites par une fraction
efficace de HBGFPP par exemple de CMDBS associé a un
15 ou plusieurs vehicules compatibles et
pharmaceutiquement acceptables avec le type de lesion.
La composition ph~ ceutique peut être également
associee a des agents comme par exemple des
antibacteriens, des antifongiques, des vitamines ou
20 analogues, des antiseptiques, des analgesiques, des
agents protecteurs des rayonnements solaires et
d'autres agents anti-inflammatoires ou tous autres
types de composes associes pour leur effets
specifiques et administrée sous toute formes
25 galléniques pharmaceutiques acceptables et compatibles
avec le type de traitement envisage.
Avantageusement, une telle composition est
conçue pour être directement a~sorbée par voie orale,
déposée sur la lésion ou injectée si celle ci est
30 directement accessible notamment dans les lesions sous
cutanees, buccales ou rectales ou encore lors des
interventions chirurgicales en déposant ou in~ectant
les tissus. La dose unitaire est de 10 à 2500 ~g CMDBS
~ 21867~8
Wo 95l26738 9 P~l/r~ S '~ ~ :c [
ou de HBGFPP par ml ou cm2 de tissu à traiter sous un
volume adapté à la spécificité de la pathologie. La
dose de produit CMDBS ou HaGFP utilisée correspond
selon la surface de la plaie a une fraction d'une
solution de départ de 10 a 2500 ~lg par millilLtre (ce
qui pour une application locale sur des plaies
courantes implique une dépose rarement supérieure a
que]Lques centaines de microlitres de la solution)
cett:e dose étant appliquée une ou deux fois par 24
heures. Les compositions utilisées de sucralfate sont
de 0.01 a 5~ (selon le brevet US N- 5 196 405 )
soient des concentrations au moins 10 fois supérieures
à celles décrites dans la présente invention et les
effets decrits dans tous les exemples de ce brevet US
N-5 196405 sont obtenus à partir de compositions 50
milligrammes par mlllilitre.
Le véhicule peut être du sérum physiologique ou
des tampons tels que le PBS contenant NaCl 0.15
molaire ou toute autre sorte de solution comp~tible et
non irritante pour le tissu lésé. Des formulations
permettant d ' obtenir des solutions pâteuses ou en gel
ou en aérosol selon les techniques courantes connues
de 1 ' homme de 1 ' art peuvent être proposées selon le
typ,e et 1 ' accessibilité de la lésion.
Les 1, ineS d'applications de ces composés
correspondent sur un plan thérapeutique ou
prophylactique aux pathologies associees aux activités
de 1 ' élastase et/ou de la plasmine.
Les principales pathologies associées à une
activité de type élastase recouvrent les principaux
domaines suivants:
- les lésions cutanées incluant les lèvres, la
cavité buccale, la gencive ( les maladies
21~17~8, ~
Wo 95/26738 1 0
parodontales ), les muqueuses par exemple vagLnale et
les surfaces anales pour des eruptions superficielles
inflammatoires, pruritiques, érythémateuse, l'acne ou
les rosacées comme l'infli ~tion de type séborrhée ou
5 pustulaire, les furoncles, les abcès;
- les infections bactériennes, fungiques,
virales du revètement cutané comme candida ou herpès,
- les dermatites à 1 ' état aigu ou chronique en
réponse à différents agents comme les coups de solell
10 ou brûlures superf icielles,
- les réactions inflammatoires en réaction à
des corps étrangers comme des pansements, des
cathéters et les hémorroïdes;
- les vulvites ou prurits périanaux;
- les pathologies et désordres habituels de la
sphère oto-rhino-laryngologigue et pulmonaires comme
les sinusites ou les rhinites allergiques, aiguës ou
chroniques, les otites, les réactions inflammatoires
p..1 ~ res, les oedèmes, les emphysèmes, les
20 fibroses, des réactions secondaires à des bronchites,
1 ' asthme;
- les pathologies oculaires en rapport avec des
désordres de l~nfli -tion des produits de beauté
allergisants, les con~onctivltes, kératites ponctuées,
25 les ulcères;
- les maladies liées à des désordres
immunologiques ou viraux comme les arthrites et la
polyarthrite rhumatoïde, les synovites, la goutte et
différentes formes d'inflammation arthritiques, le
30 lupus érythémateux, l'anaphylaxie, les septicémies
bactériennes, le SIDA;
- les maladies parasitaires comme la
toxoplasmose, le cytomegalovirus, la malaria, la
~ ;~18~758
Wo 95/2Z738 1 1 A ~,l/r~ r
polyomélyte, etc.;
- le traitement des ré2ctions infli -toires
- des organes comme les glomérulonéphrities par exemple
pour le rein, ou celles associées à des procédures
5 chirurgicales supposant ou non 1 ' implantation de
matériaux étrangers a 1 ' organisme;
- les pathologies vasculaires avec notamment
les anévrismes athéromateux ou celles liées au
vieillissement comme celle de type artériocleromateux.
Les principales pathologies associées aux
activites de type plA~ n~ Le:COUVL~ t en outre les
,i, - i n~i de la progression tumorale et des
complications induites.
L'invention sera illustrée, sans être
15 aucuinement limitée par les exemples qui suivent, dans
lesquels:
La iigure 1 L~L~sente la formule du CMiD~3S.
La f igure 2 illustre la potentialisation de
l'activite biologique des FGFl (2a) et FGF2 (2b) par
20 l'héparine, le mesoglycan et le sulodexide. La mesure
de l'activité ibiologique est effectuée sur des
cellules CCL39 par la mesure de 1 ' augmentation de
1 ' incorporation de thymidine tritiée en f onction de la
dose de FGFl et de FGF2 ajoutée seule ou en présence
25 de 20 yg d'héparine, de 10 yg de mésoglycan, ou de
lOyg de sulodexide.
Les figures 3 et 4 illustrent l'effet
protecteur de 1 ' héparine, du mésoglycan et du
sulodexide contre une dégradation thermique du FGFl ~ 3 )
30 et FGF2 ( 4 ) . Les échantillons de FGF sont incubés
seuls ou en présence de 20 1~g d'héparine, de 10 11g de
mésoglycan ou de 10 llg de sulodexide à 20-C (a) et
37 ~ (b) pendant 1, 7, 15, 30 jours. La mesure de
21867 ~8
WO95/~6738 12 P~ l/rhS~
1 ' activité biologique presentée en abscisse correspond
aux valeurs des unites de stimulation (ED50) de
1 ' in~orporation de thymidlne tritiee dans des cellules
CCL3 9 .
La figure 5a illustre l'effet protecteur de
1 ' héparine, du mesoglycan et du sulodexide contre une
dégradation protéolytique du 125I-FGFl. La digestion
protéolytique a été effectuée a~ 37-C et les
echantillons ont été séparés par électrophorese sur
gel de polyacrylamide à 18~ . Les gels sont séchés et
autoradiographiés. La premiere piste contient le 125I-
FGFl seul, dans la deuxième (piste 2) le 125I-FGFl est
incubé en présence de trypsine et d'héparine (piste
3), de mesoglycan (piste 4) ou de sulodexide (piste
5)
La figure 5b illustre l'efet protecteur de
l'héparine, du mésoglycan et du sulodexide contre une
dégradation protéolytique du 125I-FGF2. La disposition
des pistes est identique à celle présentée pour le
125I_FGFl en 5a-
Les figures 6A et 6B sont des profils d'élution
sur colonne de DEAE-~risacryl respectivement des
fractions HSM (Fig.6A) et HSS (Fig.6B), en présence de
fractions chondroïtines sulfates (CSA) pour le
calibrage de la colonne.
Les figures 7A et 7B représentent
respectivement des tissus osseux présentant une
inflammation traitée par un pansement de collagène
imbibé de sérum physiologique (7A), et le meme
pansement imbibé de CMDBS (78).
Les f igures 8A a 8C d ' une part et 8D à 8F
d'autre part représentent respectivement des coupes de
plaies cutanées traitées avec du collagène imbibé de
21867~8 ~
W095/26738 13 P~l/r~5~
CMD3S et du collagène imbibé d ' une solution
phyl3iologique .
- La figure 9 illustre l'expression de met2110-
pro~éinases à J = 5 (pistes 1 à 11) et J = 6 (pistes
12 à 17) dans des tissus sains (pistes 1 et 12), des
tis.sus cicatriciels traités par le CMDBS ( pistes 2 a
4 et 13 à 15 ), et des tissus cicatriciels traités par
de la solution physiologique (pistes 5 à 11, 16 et
17) .
EXEMPLE 1: PréParation et sélection des CMDBS
a ) Préparation des CMDBS
Les CMDBS sont des dextranes substitués par des
U,lUI~p. Ls caLl,o,.y ~hyl, benzylamide et benzylamide
sulfonate. La méthode de synthèse des CMDBS peut etre
15 celle décrite par M.MAUZAC et J.J~ UV1CZ dans
Biomaterials 1984, 5, 301-304 .
Selon ce procédé, le carboxyl méthyle dextrane
( CMD ) est préparé à partir de dextrane par
sub~titution de quelques unités glycosylées avec des
gro~pes carboxyliques sur le carbone en position 5 ou
6.
Dans une deuxième étape, la benzylamide est
couplée aux groupes carboxyliques pour former le
carboxymétllyl-benzylamide dextrane ( ou CMBD ) . Enf in
25 quelques noyaux aromatiques du benzylamide sont
sulfonés pour aboutir au calLo~y thyle dextrane
benzylamide sulfonate ou CMDBS.
Les sels de sodium de ces dérivés sont
ultrafiltrés, lyophilisés et dissous dans le tampon
30 approprié avant utilisation.
La formule génerale des CMDBS est representee
sur la figure 1.
Les CMDBS possèdent une distribution
21867~i8:
Wo 95/26738 ; ~ r~
statisti~ue des differents substituants. Les
poul~e~Lages pour chaque type de CMDBS sont detPrn in~5
par les méthodes classiques.
b) Sélection des CMDBS
i:Tests de Protection et de stabilisation des FGFs
Lors de la synthèse des CMDBS il est possible
de contrôler le taux de substitution de chacun des
~lUUl_ -ts par modification des conditions de la
réaction de substitution. Le contrôle des paramètres
comme la température, le temps de réaction, les
concentrations relatives des constituants et le nombre
de réaction de substitution etc . . permettent d ' obtenir
un très grand nombre de polymères substitués. La
substitution des hydroxyles par le carboxymethyl sur
les carbones en position 5 et 6 permet d'obtenir des
taux de carboxyméthylation allant de 0 à 200$ ( 10096
pour chacun des r~rhonr~c en position 5 et 6 ) . Le
groupement cal~ohy Lhyl peut être a son tour
partiellement ou totalement utilisé pour la fixation
de la benzylamide. Les groupes benzylamides peuvent
être partiellement ou totalement utilisés pour la
sulfonation. Les dextranes substitués fonctionnalisés
utilisés selon 1 ' invention sont parmi ceux
speci~1~ t décrits dans le brevet français
n-2.461.724. Outre la capacité à stabiliser et
protéger les facteurs de croissance de la famille FGF
comme décrit dans la publication de Tardieu et coll
J.Cell.Physio.1992 150 p 194 à 203; et dans le brevet
Français N-2.461.724; le CMDBS selectionné doit
pouvoir interagir avec au moins un membre de la
famille des facteurs de croissance de la famille TGF
bêta selon une méthode d ' évaluation décrite ci-dessous
et protéger les TGF bêta contre une protéolyse.
218~7~8
~ .
WO 9512673~ 15 P~I/rn75'~
Evaluation des caDacités d ' inter~ctions entre
CND3S et les f acteurs de croissance de la ~amille TGF
bêta.
Afin de mesurer la capacité de certains CMDBS à
5 interagir avec les membres de la ~amille TGF bêta et
de par cette interaction ~ proteger les TGF bêta, un
test de criblage a ete établi. Ce test consiste à
mesurer la capacité du CMDBS sélectionné à permettre
au TGP bêta de garder son activité biologique malgré
10 un traitement protéasique.
Dans 1 ' exemple ci dessous le CNDBS utilisé est
le lot 26.2 défini par un taux de substitution de 11096
de motifs carboxyméthyles, 3,6~ de motifs benzylamides
et 36,5% de motifs sulfonates et possède une activité
15 anti coagulante de 4 UI/mg (Unités Internationales).
L ' activité anti-complément de ce lot est de 1,1 yg de
Cl;50, mesurée selon Mauzac et al tprécédemment cités).
L'héparine utilisée comme témoin provient des
établissements Sanofi. ( Institut Choay) et présente une
20 activité anticoagulante de 175 UI~mg
Le TFG bêta 1 est préparé à partir de
plaquettes sanguines I - i nPc selon le protocole
décrit dans de nl ' t:uses publications et CUUL L
utilisés p2r l'homme de l'art, par exemple dans la
25 publication Growth Factors and their Receptors 1992,
vol. 1 PP 419-472 par A. Roberts et N.Sporn édité par
A. Roberts et N. Sporn et publiée par Springer Yerlag
Berlin. Le test d'activité biologique du TGF bêta
utilisé dans cet exemple est celui de 1 ' inhibition de
30 croissance des cellules CCL64 (provenant de l'Amerlcan
Tissue Culture Collection). Cette inhibition est
mesurée par la capacité du TGF b à inhiber
1 ' incorporation de Thymidine tritiée d ' une manière
218675~
W0 95126738 1 6 , ~
dose dépendante dans ces cellules CCL64 stimulées par
le facteur de croissance FGF ou par du sérum de veau
foetal selon le protocole décrit par Van Zolen dans
Progress in Growth Factor Resarch, l990 ,2 p. 131 à
5 152 . Le TGF beta est utilisé a deux doses, l ' une
correspondant à la capacité d'inhibition de 5096 de
1 ' incorporation de Thymidine tritiée (définie comme
1 ' unité d ' activité inhibitrice ) 1 ' autre, correspondant
~ la capacité d'inhibition de 100%. Dans cet exemple
lO les valeurs obtenues sont de 250 pg de TGF b8ta pour
obtenir l ' unité d ' activité d ' inhibition sur les
cellules CCL64 cultivées dans l ml de milieu de
culture. Le lO0~ d'inhibition est obtenu avec lng de
TGF beta dans l ml de milieu de culture.
Un échantillon de 50ng de TGF bata dans du
tampon phosphate salin contenant 0.1% de serum
~lhllmin~ bovine (provenant de la société SIGMA à Saint
Louis USA) est incubé seul, ou associé soit a 5000 ug
de C~DBS, soit à 5000 yg d'héparine, avec ou sans 500
20 yg de trypsine. Le volume final de la solution incubée
est a~usté à 1 ml et l'incubation est effectuée à 37-C
durant un temps variable ( 10 minutes dans l ' exemple
décrit tableau 1 ) .
Des échantillons d'un volume de 20 yl de
25 chacune des réactions d ' incubation sont prélevés et
a~outés aux cellules CCL64 cultivées dans des plateaux
de 24 puits contenant chacuns un millilitre de milieu
de culture selon le protocole décrit par E . Zohlen
mentionné ci dessus. Dans ces conditions la
30 concentration finale de TGF bata par puits est de
lng/ml. La tableau 1 résume les résultats obtenus dans
diverses conditions et montre l'effet protecteur du
CMDBS. Ainsi apres lO mn d'incubation a 37-C, 7S% de
~ 21867~8
W095/26738 17 ~ r~S,'~:~[[
1 ' activité biologique du TGF bêta est encore présente,
alors que 1 ' héparine qui pourtant peut se f ixer au TGF
- bêta (Mac Caffrey et al., J. of Cell Physiology, 1992,
vol.52, 430-440) ne protege pas le TGF bêta contre
5 cette degradation protéolytique ( il reste moins de 20%
d~activité biologique). Il est à rappeler que dans le
cas des FGFs 1 ' héparine assure une protection contre
la protéolyse induite par la trypsine. (Tardieu et al.,
Journal of C~ Ar Physiology, 1992, 150: 194-203 ) .
Il a été vérifié que le CMDBS n'avait pas de
pouvoir inhibiteur sur 1 ' activité de la trypsine
~ta~leAU 2). Ainsi,10 yg de trypsine ont été incubés
soit avec un substrat ( S . 87 fourni par la societé
Serbio, Paris et utilisé selon les Lec -n~Ations de
ce fournisseur) ou soit avec ce substrat et un
Lnhibiteur de la trypsine tel celui provenant du so~a
( comme le Soyabean trypsin inhibitor ou STI de chez
Sigma) ces incubations étant faites en l'absence ou en
présence de quantités variables de C~DBS ( lot AM26 ) .
L ' activité enzymatique de la trypsine a été mesurée
par absorption spectrophotométrique du produit de
transformation du S 87 en fonction du temps
d ' incubation .
ExemPle 2: Sélection d ' autres HBGFPP
Une préparation commerciale de protéoglycosa-
minoglycane et glycosaminoglycanes, le sulodexide a
été sélectionnee selon sa capacité a interagir avec
les facteurs de croissance de la famille des FGF ainsi
qu ' avec ceux de la famille des TGF bêta .
Des préparations d'héparane sulfate obtenues
par fractionnement du mésoglycan et du sulodexide ont
d ' autre part été testees .
Le mésoglycan et le sulodexide ont été fournis
rj 7 `
Wo 95/26738 ~ 1 ~ 6 7 ~; 8 18 1 ~, l /r r~
par la Société Sigma Chemical Co, Saint Louis MO USA.
Leurs propriétés sont résumées dans le tableau 3.
Les cellules utilisées dans cet exemple sont
les cellules CCL39 qui proviennent de 1 ' American
Tissue Culture Collection. Les conditions de culture
et de tests de mesure d ' activité biologique des FGFs
sont les mêmes que celles décrltes dans la publication
Tardieu et coll J.Cell.Physiol. 1992. Les facteurs de
croissance FGF utilisés sont les formes recombinantes
FGFl et FGF 2.
a) Effet du sulodexide sur l'activité biolQgique des
FGFs in vitro. _
Dans ces expériences le FGF1 ou 2 est utilisé a
une dose ~oLla_,~ondant à la dose F~ffir~rf~ (notée ED50)
pour induire une stimulation de 1 ' activité biologique
de 50% de la dose n~7~ Ant la stimulatlon maximale .
L ' activité biologique est mesurée par la capacité
d ' induire une augmentation de 1 ' incorporation de
thymidlne tritiée dans les cellules selon les
protocoles largement décrits dans de nombreuses
publications dont celle de Tardieu et coll mentionnée
précedemment et également dans le brevet français N' 2
644 066.
Dans cet exemple 1 ' ED50 est de 5 ng/ml pour le
FGF1 et de 3 ng/ml pour le FGF 2, valeurs mesurées
experimentalement (Figs.2a et 2b). La même expérience
de stimulation en fonction de la dose de FGF est
effectuée en présence de 10 llg/ml de Sulodexide ou 20
ug/ml d "léparine . La f igure 2 montre que dans ces
conditions l'ED50 devient 0.4 ng/ml et 0.2 ng/ml
respectivement pour les FGFl et FGF2 en présence de
ces doses de Sulodexide ou d ' Héparine . Outre cette
capacité à potentialiser 1 ' activité biologique des
~86758
, .
WO95/26738 19 ` I_I/r~5~. I r
FGFs les HBGFPP protègent les FGFs contre les
dégradations thermiques alnsi que contre
- 1 ' inactivation induite par 1 ' action protéolytique de
la trypsine. (Figs.4 et 5) . De la meme manière ces
HBGFPP protègent FGF1 et 2 contre une inactivation
induite par 1 ' actLvité proteolytique de la trypsine
(Figs.5a et 5b).
b) Effets ~rotecteurs du sulodexine, du
dextrane. du dextrane sulfate et de la sucrase vis-à-
vis des TGFbeta.
Plusieurs autres composés ont ete evalues: le
dextrane sulfate (Sigma Chemical, de poids moléculaire
40.000, le dextrane ayant servi à la synthèse du CMDBS
( egalement de chez Signa ) de la sucrase ou sucrose
octasulfate ( fournie par D. Bar Shalom, societé BUKH
MED]:C, au Danemark). Certains de ces conposes ont éte
cho~isis car ils protègent et stabilisent les FGF tels
que la sucrase se confère au brevet US N 5202311 ou
le dextrane sulfate se confère au brevet japonais n-
138 907/88 ) . Le dextrane est celui qui a servi a la
synt;hèse du CMDBS AM26.
L ' experience de protection de 1 ' activite
biologique des TGFbêta a eté realisée de la meme
manière qu ' avec les CMDBS ainsi que decrit dans
l'e~cemple 1 ii. Le melange d'incubation contient 50 ng
de TGF beta (dans 0.1 ~ d'Alh~lminp serique de bovin)
et de la trypsine (500 yg). Le Mesoglycan ou le
Sulodexide ou le dextran sulfate ou le dextran ou la
sucrase sont utilisés à la dose de 5000 ~g.
L ' activité biologique du TGFbeta est mesurée
comme décrit ci-dessus après une dilution de 50 fois
et en utilisant des cellules CCL64.
Les résultats sont présentés dans le tableau 4.
2186~8 ~
W095l26738 20 r~l,rl~5s~
Ces résultats illustrent que, comme certains
CMDBS capables de répondre aux deux criteres de
selection vis-a-vis des FGF et TGFbeta, le sulodexide
presente une activité protectrice significative pour
5 les TGFbeta.
c) Isolement de la f~action HeParane Sulfate du
Sulodexide et du Méso~lycan
Le Sulodexide et le Mésoglycan correspondent à
des mélanges de plusieurs substances dont 1 ' essentiel
10 est constitue de différents glycosAm~noglycanes (GAG).
Par une premiere ét~pe de purification, il a
été etabli qu ' un gramme de produit sec de chacun de
ces deux produits contenait respectivement 874 mg pour
le mesoglycan et 795 mg pour le sulodexide de GAG
15 totaux.
Cette puri~ication a éte obtenue en soumettant
ces produits solubilisés a une chromatographie
echangeuse d'ions (DEAE - Trisacryl) pour enlever tous
les contaminants proteiques. Les GAG totaux ont alors
20 été purifiés en eluant le gel de DEAE avec une
solution d'acetate de sodium, pH 4, contenant 1,5 M
NaCl .
Après une phase de dialyse extensive contre de
l'eau, 60 mg de chaque produit de GAG ont ete digeres
25 par la chondroïtinase ABC pendant une nuit à 37-C ( 1
unite par mg de GAG). Cette enzyme degrade tous les
GAG à l'exclusion des héparanes sulfates (HS). Les
produits de digestion ont éte soumis à une
chromatographie sur tamis moleculaire (G50 Sephadex,
30 colonne de 1,8 x 95 cm). L'élution est ensuite
réalisee en tampon bicarbonate d'ammonium sous un
débit de 18 ml/h. Le matériel non digéré qui
correspond à des GAG de nature HS est collecté dans le
~ -~18~S8
W095/26738 21 I_l/r~
volu--e mort d ' elution de la colonne .
Les concentrations en GAG sont calculées à
- partir de leur contenu en acide uronique par la
methode au carbazole (Bitter T. et Muir H.M., 1962,
Anal. Biochem 4, 330-334).
Ces dosages ont permis de préciser la
composition suivante de chacun des produits:
Sulodexide Mésoglycan
GAG totaux 79 ~ 87 %
Fraction Héparane Sulfate (HS) 48 % 52 %
Autres GAG 31 % 35 %
Les fractLons HS de chacun de ces deux produits
ont été chromatographiées à nouveau sur un gel de DEAE
Trisacryl. 1 mg de chaque fraction HS, purifiée à
partir du mésoglycan ~Fig. 6A) ou du sulodexide ( Fig.
6B), dans 3 ml a ete deposé sur une colonne équilibrée
avec du tampon 0,05 M NaCI, 0,05 M TMS-Hel pH 7,5.
Après un lavage de la colonne par 10 volumes du meme
tampon suivi d'un lavage par 10 volumes d'un tampon
0,05 M NaCl, 0,05 M d'acétate de sodium pH 4, le
matériel fixé à la colonne est désorbé par un gradient
salin allant de 0,05 M NaCl à 1,5 M NaCl dans le meme
tampon acétate. 1 ml de chaque fraction collectée a
éte dose par la methode au carbazole.
Le matériel correspondant aux constituants HS
de chacun des produits d ' origine présente
approximativement le meme profil d'élution et donc à
peu près la meme charge apparente. Ce maximum du pic
d ' élution est obtenu pour une concentration saline de
0, 94 M NaCl . Une fraction définie de chondroïtine
sulfate (CSA) a eté soumise au meme protocole en vue
de calibrer la chromatographie. Cette fraction CSA qui
ne contient qu'un groupe sulfate par disaccharide est
W0 95/26738 218 6 7; 9 r~
- 22
élué à la force ionique de 0, 72 M NaCl .
Ces résultats montrent que la fraction HS
contient plus de yluu~ --ts sulfates que les CSA de
référence. La fraction HS présente environ deux
5 groupes sulfates par unité ~ sArhAridique.
Ces fractions ont été testées pour connaître
leur pouvoir protecteur vis-à-vis du TGF ~ et du FGF
en comparaison des pouvoirs établis avec les produits
bruts respectifs.
Evaluation semi-auantitative de~ eifets
ProteCteurS du FGF par dii'férents pol~mères.
Comme décrit ci-dessus, une quantité constante
de FGF radioactif est incubée dans des conditions
différentes. Après autoradiographie des produits de la
réaction, la quantité de FGF radioactif non dégradé
est quantifiée par densitométrie. Les valeurs
C UL~ c:a~ondent au pourcentage de FGF radiomarque
retrouve par rapport à la quantite deposee en début de
réaction. (~ableau 5).
Les résultats des tableaux 4 et 5 montrent que
les fractions HSM et HSS issues respectivement du
mésoglycan et du sulodexide presentent des effets
protecteurs supérieurs à ces deux compositions et
proches de 10096.
EXEMPLE 3: Effets inhibiteu~s in vitro des CMD9S et
des alYcosaminoal~canes sur 1 ' activité de l ' élastase
leucoc~rtaire et sur la plasmine.
Les pouvoirs d' inhibition de différents CMDBS
et de leurs composes intPrmPrl;Aires de leur synthèse,
ont été etablis pour l ' elastase leucocytaire et la
plasmine .
L'élastase leucocytaire purifiée a éte obtenue
par Elastin Products Co (Owenville, MO, USA) et la
218~758
W09S/26738 23 P~l~rl~9s~
plasmine chez SIGMA.
L'inhibition des activités enzymatiques par ces
- différents composés est effectuée à 37-C dans un bain
th~ Laté. Les enzymes considerées sont mises en
solution dans un tampon Tris-HCL 100 mM, pH8 pour
l'élastase et pH 7,4 pour la rl~cminP, en présence de
0,02% d'azide de sodium et de 0,01~ Triton Xl00 pour
la plasmine. Les concentrations des substrats et
celles des enzymes.sont: 0,10 mM MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-
Val-pNA (paranitroanilide) pour l'élastase à 8,3 nM et
0,20 mM dVal-Leu-dLys-pNA pour la plasmine à 77 nM.
Pour chacune des conditions est établi l ' IC50 .
Le tableau 6 donne les resultats obtenus dans
lesquels, le lot AM6 ~o.- ~a~ond à un dextrane T40 de
40 000 kD. Le lot EN5 correspond à un dextrane T10 de
10 000 kD . Les produits int~ i res de synthèse
sont repertoriés d'apras les sigles designés ci-dessus
indexés d ' un numéro qui précise le nombre de chacune
des réactions de substitution.
Les valeurs des IC50 démontrent que les CMDBS
ont des effets inhibiteurs de type hyperbolique non
competitif sur l'activité de l'élastase leucocytaire
comparables à ceux de l'heparine, l'un des meilleurs
inhibiteurs de cette activite (Ki de l'ordre de 1 nM).
Les CMDBS exercent de plus et à l ' inverse de
l'héparine des effets inhibiteurs sur la plasmine.
Il ressort en outre du tableau 6 que les effets
inhibiteurs des fractions HSM et HSS sont supérieurs à
ceux du mésoglycan et du sulodexide, respectivement.
EXEMPLE 4: Effet anti-inflammatoire des CMDBS dans le
tissu osseux.
Afin d'étudier l'effet anti-inflammatoire des
CMD13S dans le tissu osseux on a utilisé un modele de
218'~7~'''` --
W095/26738 24 ~I/r~5, " 1
régeneration de l ' os calvaria chez le lapin . Après
avoir effectué une découpe de cet os dans sa demi
epAicsellr on a comparé la réaction inflammatoire dans
le tissu de granulation en présence ou en absence de
5 CMDBS.
Des lapins adultes blancs de la race New
Zealand ayant f ini leur crn i CsAn~-e osseuse et pesant 3
à 4 kg sont repartis en 2 groupes de 8 lapins des
deux sexes . Ces lapins ont eté anesthesies par
10 in~ection intrapéritonéale d'hydrochloride kétamine
(100 mg/kg) et d'a- ~pL, -7in-~ (100 mg/kg) . Une
incision paL -S-iAn~ fronto-parietale a été réalisée
pour accéder à la calvaria. Quatre defauts osseux de 5
mm de diamètres et 3 mm de profondeur ont éte réalises
15 à l'aide d'une fraise . Durant l'intervention, le coté
opéré a été constamment irrigue pour éviter des
accidents thermiques. Les deux régions céphaliques
n ' ont pas été comblees et de ce f ait, servent de
controle alors que les cotes posterieurs gauche et
20 droit sont combles avec du collagène (collagène
hémostatique microfllaire (Pangen) provenant des
laboratoires Fournier Di~on, France) ou du collagene
imprégné la nuit dans une solution de CMDBS à 100
~Ig~ml. Une hemostase appropriée a été réalisée avant
25 de proceder à la suture de la plaie. Les plaies sont
refermées avec du fil en nylon de suture et le coté
operé est recouvert d'un pansement sterile. Les
animaux ont éte laissés en convalescence et aucune
complication post-operatoire n'a eté constatee. Les
30 animaux ont été euthanasiés aux jours 3, 4, 8 et
durant les 12 semaines qui ont suivi l ' intervention.
Tous les animaux ont reçu un traitement identique et
ont servi pour leur propre contrôle. Après examen
~1 8~.~5~8..
.. ,.; .
WQ 95l26738 25 ~I/r~
macroscopique du site de l ' operation, les crânes sont
décalcifiés et inclus dans de la paraffine. Le coté
opéré a été étudié au microscope pour etre mLs en
culture. Après que les modeles soient décalclfiés et
5 posés dans de la paraffine, des sections sagittales (5
mm d'épaisseur) des zones correspondants aux défauts
ainsi créés ont été découpées a l'aide d'un microtome
et colorées a l'hématoxylin et à l'éosine. Ces coupes
sont étudiées au microscope et les défauts ont été
100 fois grossis, en utilisant une grille de 2,5 x 2.5
mm normalisée par 10 divisions de 0,25 mm de chaque
coté. Ces mesures ont été ensuite rapportées sur un
graphique pour comparer les résultats suivant les
différents groupes traités.
Dans ce travail, on a utilisé le CMDBS , lot
AM26, dont le contenu en acide méthylcarboxylique est
de 110 %, celui en benzylamide de 2, 5 % et en
benzylamide sulfoné de 36,5% . L'activité anti-
coagulante spécifique de ce CMDBS est 4 IU/mg
20 comparé a l'heparine standard (echantLllon n 108,
Sanofi-Choay Recherches, GentLlly, France) qui a une
activité anticoagulante de 173 IU/mg.
Les figures 7A et 7B montrent la différence de
la réaction inf lammatoire observée apres 3 semaines
25 dans le tissu de granulation correspondant au
comblement du défaut osseux réalisé expérimentalement.
Dans la figure 7A qui correspond au pansement
de collagene imbibé uniquement de sérum physiologique,
la réaction inflammatoire est très forte; le tissu de
30 granulation contient un grand nombre de cellules
inf lammatoires et peu de cellules ostéoblastiques
Par contre, le meme traitement avec un
collagene imbibé de la solution de CMDBS a fait
2~6758
Wo 95/26738 : 2 6 r _ 1 /r ~ S.'t ~: ~ ~
régresser très nettement cette réaction lnflammatoire,
favorisant la réparation du défaut osseux et
démontrant ainsi l'effet anti infli -toire du CNDBS.
FXFMPLE 5: Effet anti-inflammatoire du CMDBS sur la
5 muqueuse ~astriaue.
princiDe
L'administration par voie orale d'l ml
d ' éthanol absolu chez le rat provoque dans 1 ' heure qui
suit 1 ' apparition de lésions hémorragiques de la
10 muqueuse gastrique.
Méthodes
Des groupes de 6 rats mâles Sprague Dawley,
d'environ 200g, sont mis en ~eûne hydrique 24H avant
1 ' essai . Le jour du test, 1 ml est administré par voie
15 orale et les animaux sont sacrifiés 1 h 30 après.
L'estomac est préleve, ouvert selon la grande courbure
et rincé.
L ' atteinte de la muqueuse est côtee selon le
barème suivant.
20 0: muqueuse normale
1: petites stries roses hémorragiques superficielles
2: stries hémorragiques superficielles rouges, courtes
et larges
4: stries hémorragiques superficielles rouges-noires,
25 longues et larges
5: perforation
Trai tement: _ _
Le CMDBS a été dissous dans l'eau distillée, la
PGE2 dans l'éthanol à 10~ puis dilué dans le soluté
30 physiologique. Les traitements sont effectués par voie
orale, 1 heure avant 1 ' éthanol et 45 mn après sous un
volume de 5ml/kg.
Expression des résultats _ _
~18~75g ~
W095~26738 27 P~llrh~S,~[~
Pour chaque lot d'animaux, les valeurs moyennes
+/- e . s . m . des scores d ' altération ont été calculées .
-. Elles sont présentées dans le tableau 7. La
comparaison statistique est effectuée a l'aide du test
5 non parametrique de White, par rapport au groupe
témoin avec une dLfférence significative notée p <
0,01 .
Résultats
Comme 1 ' illustrent ces résultats,
10 l'administration d'éthanol absolu induit chez la
ma jorité des animaux 1 ' apparition de larges stries
hémorragiques conf luentes . Chez les animaux témoins le
score d'alteration est de 3,75 +/ - 0,17.
Le CMDBS administré per os à la dose de 100
yg~kg (2 fois par jour ~ réduit en 24 heures de 56~
(p~al,01) la gravité des lésions. Aux doses supérieures
l'activité cytoprotectrice n'est pas L~LLuuvee. Le
CMDBS exerce des ef f ets comparables a la
prostaglandine E2 considérée comme un agent
20 protecteur de la muqueuse gastrique contre des agents
topiques irritants qui induisent une reaction
inflammatoire intense locale (réduction de 63t des
lés ions ) .
EXEMPLE 6: Effet anti-inflammatoire sur des colites
25 ind~.ites Par le TNB chez le rat.
Princil~e:
L ' administration intrarectale d ' acide
trinlitrobenzène sulfonique (TNB) entralne chez le rat
l'apparition d'un colite chronique, associée à de
30 graves lésions de la muqueuse produites par une
reaction inflammatoire aigUe avec libération de
mediateurs (PAF, interleukines, eicosanoïdes), et
accompagnée d'un oedème important quantifiable au Bleu
~ ~. A ~J; 1 ~
WO 95/26738 2 8 I
d ' Evans .
ethodes .
. , . . . _ . . . _ _ . . .
Des groupes de 6 rats mâles Sprague Dawley,
d'environ 200g, sont mis en ~eune hydrique 24 heures
avant l'essai. Le ~our du test, les animaux sont
anesthesiés au pentobarbital ( 30 mg/kg3 par voie
intraperitoneale. 20 mg de TNB dissous dans 0,25 ml
d'éthanol a 50~ sont instilles dans le colon à 6 cm de
1 ' anus . Les animaux sont remis dans leur cage apres le
réveil avec nourriture et boisson a volonté.
4 ~ours plus tard, les animaux sont sacrifiés
et le colon est prélevé. 30 mn avant le sacrifice, 1
ml de Bleu Evans est administré par voie veineuse pour
evaluer 1 ' oedeme a ~Ant la colite selon le
protocole suivant: Le colon est mis dans un tube
contenant 9 ml de forr-mide. Apres centrifugation, le
surnageant est prelevé et un dosage spectrometrique
est effectue a 620nm de longueur d'ondes.
Traitement:
Le CMDBS a ete dissous dans la
carboxymethylcellulose a 0, 596 . Les traitements ont éte
effectués par voie intrarectale sous un volume de 1
ml~kg, 4 heures avant le TNB 1 fois par ~our jusqu'au
s~crifice de l'animal.
Resultats
Pour chaque lot d ' animaux, les valeurs moyennes
+/- e.s.m. des scores d'altération ont eté calculées.
Elles sont presentees dans le tableau 8. La
comparaison statistique est effectuee a l'aide du test
"t" de variance par rapport au groupe témoin avec une
différence significative notée p ~ 0,05.
Dans cet exemple, le CMDBS a un effet anti-
inflammatoire comme le montre le ~ n~ nt des
218~75g` ' -
Woss/26738 29 1'~l/r~5,.~
cellules inflammatolres révélées par coloration au
bleu d ' Evans . 300 llg de CMDBS par kg réduisent de
- moitié cette coloration ( p S 0,05).
EXEMPLE 7: Effet sur l'inflammation cutanée chez le
rat.
A. Animaux
Les expérimentations ont été effectuées sur des
rats males Hairless OFA-hr/hr Ico, EOPS, exempts
d ' or~A n i ! - - pathogènes spéci f ~ ques, ages . ia . EOPS
(Exempts d'or~ni - pathogènes spéci~iques); de 9 à
10 semaines (250-300 gr) (IFFA CREDO, France). Ces
rats se caracterisent par un système pileux très peu
développe du à un gène recessif hr, defini par le
terme "Hairless". Dès reception, les rats sont
stabulés et hébergés selon les directives de la
r ~-]té Economique Européenne, décret d'Avril 1986,
n 86/609/CEE.
B. Mode ol~ératolre
Les rats sont anesthésies par injection intra-
peritonéale de pentobarbital sodique ( 0 .1 ml/100 g
pour les rats sains et 0 . 05 ml/100 g pour les rats
diabétiques ) . Trois défauts cutanés dermo-épidermiques
sont pratiqués de part et d ' autre de la colonne
vertébrale à 1 ' aide d ' un emporte pièce de 6 mm de
diamètre. Des compresses de collagène bovin inactivé
(PA~GEN, Fournier) sont découpées à l'emporte pièce,
imbibées de la solution à tester ou d'une solution de
PBS . ia . PBS; pendant 2 heures à température ambiante
avant d ' etre déposées dans chaque plaie . L ' ensemble
est alors recouvert d'un pansement occlusif (OPSI~E)
gardant le collagène hydraté, puis d ' un élastoplaste
empêchant le rat de se débarrasser de son pansement.
Les rats sont placés dans des cages individuelles avec
21gB~ ~8
W0~5126738 30 1~I~r~
eau et nourriture à volonte. Chaque condition
experimentale regroupe des lcts de 6 à 10 animaux. Le
processus cicatriciel est considere à des temps
variables exprimes en ~ours (Jx) apres la date de
5 1 ' operation ( J0 ) .
C. Traitement des l~laies
Les plaies des rats sains sont traitees avec
des pansements de collagène imbibes d ' une solution
physiologiques contenant ou non du CMDBS-AM6 a 50
10 ~g/ml.
D. Prelevements des Plaies
Les lots d'animaux temoins (sans CMDBS) ou
traites (avec CMDBS) sont sacrifies par in~ection d'un
exces de pentobarbital sodique. Les contours de la
15 plaie sont reportes sur un calque, puis la plaie est
prelevee a 1 ' aide du même emporte-pièce de la meme
dimension que celui utilise a J0 et conservee a -80 C.
Pour 1 ' etude histologique, les pieces sont prelevees
en prévoyant un exces de 5 mm de peau non lesee autour
20 des contours d'origine puis placees dans un fixateur
dont la composition varie en fonction de l'etude
envisagee .
E. Etude histolo~icue
Les prélavements de tissus sont places pendant
25 24 à 48 heures dans un exces de fixateur
(paraformaldehyde 4%, glutaraldehyde 0.1~, saccharose
5~, PBS lOOmM, pH7) puis déshydratés progressivement
avant d'etre inclus dans du Paraplast Plus (Prolabo).
Des coupes de 5 mm sont realisées avec un microtome a
30 paraffine (Reichert-Yung) et colorees au trichrome de
Masson (GABE, 1988).
Les resultats des observations histologiques
sont presentés sur les figures 8A a 8F qui rapportent
21867~8 ~
Wo 95~26738 3 1 ~ r~lrr~
cette étude histologique de la cicatrisation cutanée à
J6 post-operatoire, (coloration des coupes au
- Trichrome de Masson).
Les f igures 8A a 8C présentent les plaies
traitées avec du CMDBS ( 5 0 yg/ml ) et les f igures 8D à
8F représentent les plaies traitées avec le véhicule
seul. Ces figures montrent une inégalité dans la
qualité du tissu de granulation. Il existe un aspe~t
plus mature de la cicatrice (Fig.8A, x4) par rapport
au témoin (Fig.8D, x4). Un agrandissemnt (x25) de la
région épidermique montre une reconstitution de ceLle-
ci dans les deux cas (Fig.8B et 8E x25).
La différence réside dans la maturation du
tissu de granulation: la plaie traitée (Fig.8C x25)
avec du CMDBS montre la présence de fibroblastes
(fléche) qui _ ~~e a s'orienter et qui produisent
une matrice en quantité plus lmportante que dans la
plaie témoin. Les cellules inflammatoires dans les
plaies traitées avec du CMDBS sont en nombre restreint
par rapport au témoin (Fig.8F x25) qui montre la
persistance de rh~n, ` O imfli -toires importants.
EXEMPLE 8: Mise en évidence des activités métallo-
protéinases matricielles extraits des tissus cutanes
en cours de cicatrisation.
Des prélevements de tissu cutane sont effectues
selon le meme protocole et les memes conditions
expérimentales que ceux présentés dans l'exemple
précédent .
Traitement des Plaies
Les plaies des rats sains sont traitées avec
des pansements de collagène imbibés d'une solution
physiologique contenant ou non du CMDBS-AM6 a 50
yg/ml .
Wo 95/26738 ~ ~ 8 3 2 r~ "r ~ t
Les métalloprotéinases matricielles tMMPs ) et,
plus particulierement les collagénases 92 kD
(collagenase de type V) et 72 kD ( collagénase de type
IV), sont mises en évidence grâce a la technlque du
zymogramme.
La peau préleYée à J0 est nommée contrôle (C).
Le prélevement effectué au jour x ~Jx) au même
emplacement selon les contours d ' origine est nommé
plaie (P). C et P sont toujours traités en même temps
et selon le même protocole.
Chaque prélèvement est pulvérise une minute
dans un broyeur à azote liquide (Bioblock). La poudre
est pesée et mélangée dans un tampon 100 mM phosphate
pH7.4, lM NaCl (lml pour 100 mg de poudre). L'ensemble
est homogénéisé a l'Ultra-turax pendant 30 secondes,
laissé 1 heure a 4-C puis centrifugé a 43700g (Beckman
J2-21) à 4-C pendant 30 minutes. Le volume du
surnageant est mesure puis aliquoté avant d ' être
conservé a -80 C.Le culot, pesé, est conservé a -80 C.
Les extraits obtenus à partir de broyats de
peau cicatricielle ou non ( 25 mg de protéines en
tampon non réducteur, non chauffés), sont déposés sur
des gels de polyacrylamide 10% contenant 1 mg/ml de
gelatine (Sigma, ref G2500). Après migration en tampon
de Laemmli, les protélnes déposées sur gels sont
renaturées avec une solution de Tris-HCl 100 mM, pH
7.4 contenant 2.596 de triton xlO0 (2 fois 30 minutes).
Le Triton est éliminé par deux lavages en tampon Tris-
HCl 100 mM. Les gels d ' électrophorèse sont incubes à
37 C durant 48 heures dans un tampon Tris-HCl 100 mM
contenant 10 mM de CaC12, 0.001~ NaN3, 0.001596 Bri;
35, 1 mM ZnC12. Apres avoir éliminé soigneusement le
tampon d'incubation, les gels sont colorés durant 20
~ 186~8
w095/26738 33 ~l/r~
- minutes sous agitation avec une solution de Bleue de
Coomasie R250 (5mg/ml) contenant de l'acide acetique
- (10%~, du propanol-2 (30%), puis decolores ~acide
acét~Lque 10%, méthanol 40%), jusqu'à visualisation des
5 bandes. Les gels sont photographies. Afin de s'assurer
que les differentes bandes de digestion obtenues sont
bien dues a des MMPs, les echantillons sont incubes en
présence d'inhibiteurs spécifiques; Phenyl méthyl
sulfonyl fluoride ou PMSF (2 mM final) inhibiteur des
10 serines endopeptidases, l'acide ethylene dlamine
tetracetique ou EDTA ( 2 0 mM f inal ) inhibiteur des
métallo-endopeptidases, le N-ethyl maleimide ou ~EM (2
mM f inal ) .
La f igure 9 montre 1 ' expression des Métallo-
15 Prot~inases Matricielles detectees dans les extraitsde plaies en fonction du traitement ou non par le
CMDBS et en fonction du temps de la cicatrisation.
25 mg de protéines obtenues a partir des
extralts de broyats de peau saine ou de peau
20 cicatricielle à J5 et J6 post-operatoires sont deposes
sur un gel de polyacrylamide 10% contenant comme
substrat 1 mg/ml de gelatine. Les pistes 1,12
representent la peau saine qui sert de temion interne
de migration. Les pistes 2, 3, 4 et 13, 14, 15
25 representent les extraits obtenus a partir de
cicatrices traitees avec du CMD~S a raison de 50 mq~ml
(6 rats differents). Les pistes 5 à 11 et 16, 17
representent les témoins correspondants. Chaque piste
represente un rat different.
Deux types de collagenases sont retrouvés dans
la peau saine: La forme de 72 kDa et sa forme activee
la 68 kDa. Par contre, a J5 et J6, dans les plaies
traitees ou non avec le CMDBS, la 92 kDa est presente
W0 95l26738 ~ i 8 ~ 7 ~i 8 ; r~llr~
O ~ ~ 34
de manière identique. La différence reside dans les
niveaux d'expression de la 72 kDa et de sa forme
z~ctivee, la 68 kDa. A J5, dans les plaies temoins la
72 kDa et la 68 kDA sont exprimees de manière tras
5 importante par rapport aux plaies traitees avec du
CMDBS . De plus, il y a apparition d ' espèces de bas
poids moleculaires qui n ' existent pas dans les plaies
traitées avec le CMDBS. A ~6, cette difference se
confirme puisque pour le même depôt protéique qu'à J5,
10 1 ' activité des col 1 A~PnAReS est telle que les pistes
16 et 17 apparaissent sous forme de deux traces
blanches . Cette activité qui n ' existe pas chez les
rats traités au CMDBS.
Les CMDBS modulent donc les niveaux
15 d'expression des MMPs soit directement soit
indirectement à travers leur rôle inhibiteur sur la
plasmine qui est un de leurs activateurs.
~186i58
W095/~67~ rl ~ :
,cJ _
C
--I, - cJ
a ~ ~ ~
<,~C ~ ,o O
,, ~ ~ .~ ~ V~ O O O
'5 ~ ~ ~ ~ O C O _ O Ir, o
.IJ ~ 04
-' m - . ~ o o
~ ~ j G ~ O _~
a r ~ . _ o c
a _ ~ 8 ~
~1867~ 36
WO95/26738 ~ rl~ 5
~ IRT~T~lT 2
E~fet non i~h~l-iteur du CNDR~i vis-à-vi5
de la tr~rPsine
'rrvpsinc tlOu~ml)+ SX7 1.00
'rrypsinc+S87+5uolml 100
~ iDl~S
Tr~rsinc+~R7+.~nll~lml 100
'rr~llsinc+SX7+:5nn~ ml Inn
0~1nn~
'I'r~ sinc+S~7+!i'i'1~1 t)
218~758
.. (, .~, ..
WO95/26738 r~llr~ r 1-
TA13LEAU 3
Oriqine . activité anticoaqulante et
comvosition D~rtlelle du Meso~lvc~n
et du Sulodexide (informations du fournisseur)
5~1or~Y1~ Nesoglycan
Origine duodenum aorte
de porc
Activite 50-70 IU/mg < 50 ~U /mg
Antlcoagulante
Composition
chlmiSIue
Dermatane
8uli'ate 20 - 35 96 25 - 60 96
Chondroitine 2-7% 3-15
Sulfate
Héparane sulf~te + +
{, ,~ t ~
W095/26738 ~18~7~8 38 r~l/r~5.~ D~
TABLEAU 4
Protect~ on du TGFbêta par divers Pol~rmères
5TGF beta 100
TGF bêta + tsypsine 0 %
TG~ ~eta + ~ gly~l 100 %
T&F beta + ~ Gly~l + trypsinc 50 %
TGF~+~S~ IW%
TGF ~ + HSM + trypsine 75 %
TGF beta + sul~dcxide 100 %
TGF beta + sulodcxide + trypsine 20 %
TGF ~ + HSS 10() %
TGF ~ + HSS + Irypsine 4~ %
TCFbêta + Dextrane 100 %
TGF bêta + Dext~ane + ~ypsine 0 %
TGF b~ta + Dexlranc Sulfate 100 %
TGF beta + Dextrane Sul&te + ~rypsine 0 %
T&F b~ta + Sucrase 100 %
TGF b~ta + SucTase + tlypsine 0 Y0
HSM = Héparanes Sulfatcs pur;fiés à panir du Mcsoglycan
HSS = llApan nes Suln~les pun nii; A p~r~ir ~ Sulod~i~c
2186758
wog5n6738 39 ~ r~llr~5
TABLEAU 5
Protection du FGF Par divers Polvmeres
PROTECTION EN %
FGF seul 100
5FGF + Trypsine o
FGF + Trypsine + Héparine 100
FGF + Trypsine + Mésoglycan 75
FGF + Trypsine + Sulodexide 70
FGF + Trypsine + Mésoglycan traité 0
10Héparinase
FGF + Tryps ine + Sulodexide traité 0
Heparinase
FGF + Trypsine + Héparine Traité 0
Héparinase
15FGF + HSM + Trypsine 95
FGF + HSS + Trypsine 90
WO951~6738 ~1g 67~8 40 lt~ llr~9' ~
:. '
TABI,EAU 6
Tnh;hition des activités de 1'elastase et de
la P1asmine
Compos~s tcst~s ~;lasta~ R~ rl~LSm;ne
~C50 en ~ ml 1C50 en ~Ig~ml
C~)BS lotAM6 2.2 1,5
10T40 ~ lO0 ~ ~00
CMDBS lot EM5 lO 7
TlO CMD2B 50 53
T105CMDIB > 100 ~100
T103CMD > 100 ~ I01)
15TlO > I00 ~ 100
r ~ 72 65
RS M~u~ 20 22
Sulodexidc 79 75
HS Sulndexide 25 20
20H~parine l,8
Lip~héparine 0~5
HSM = Hcpar~nes Sulfate~ purifi~s ~ partir du M~ ;l
HSS = Héparanes Sulfi~tes purifiés à p~rtir de Sulodcxide
~1867~-8
WO9S/26738 41 ._llrnS',~
TABLEAU 7
Traitcment Doses en llg/kg Scores Variations
PO
Témoins - 3,75 ./ 0.17
PGE2 200 1,4 ., 0,35 -63%
100 1,6 ./ 0,25 -56%
CMDBS 300 3,2~, 0,33 -16%
1000 3,1 ., 0.35 -17%
TA8LEAU 8
Traitements Doses Nombres de Concentration de Bleu
rats ~vans en llg/g de côlon
T~moins 5 0,17 ., 0,03
TN!3 5 0,87 ., 0,14
100 ug/kg 6 0,54 ., 0,16
CMDBS 300 llg/};g 6 0,45 ~ 0,12
l~'e/ke 6 0, .~0.11
