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s
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METHODE DE TRAITEMENT DES CANCERS PAR REGULATION DE LA
PROTEINE P53
La présente invention concerne une nouvelle méthode pour le traitement des
cancers. Plus particulièrement, elle concerne une méthode de traitement des
cancers
par régulation des niveaux cellulaires de la protéine p53. Elle concerne
également des
vecteurs de thérapie génique permettant de réguler la protéine p53, ainsi que
les
compositions pharmaceutiques les contenant.
Depuis une quinzaine d'années, la caractérisation moléculaire des oncogènes
et des gènes suppresseurs de tumeur a pemis de jeter un regard nouveau sur le
processus de la cancérogenèse. Ainsi, la connaissance de plus en plus
approfondie de
la régulation de ces gènes et de la fonction des protéines correspondantes
permet de
concevoir de nouvelles approches thérapeutiques.
Plus particulièrement, l'élucidation du catabolisme des protéines oncogéniques
et anti-oncogéniques représente un enjeu majeur en terme de lutte anti-
cancéreuse
dans la mesure où elle laisse entrevoir, dans le cas des protéines
oncogéniques, la
possibilité d'accélérer leur dégradation et donc d'anihiler leur action, dans
le cas des
suppresseurs de tumeur, d'inhiber leur dégradation et donc d'augmenter leur
effet anti-
prolifératif ou anti-tumoral, dans le cas de protéines mutées, de
potentialiser leur
présentation antigénique par les molécules du Complexe Majeur
d'Histocompatibilité
et ainsi de stimuler une réponse immune spécifique des tumeurs, et, dans le
cas où la
forte expression de l'oncogène ou de l'anti-oncogène est capable d'induire la
mort
cellulaire programmée, la possibilité de stabiliser ces protéines pour
déclencher le
processus apoptotique.
Originellement, la protéine p53 a été classée comme un oncogène nucléaire
puisqu'elle pouvait, dans des expériences de transfection, allonger la vie de
cellules de
rongeurs en culture ainsi que coopérer avec des oncogènes activés comme ras
pour
transformer des cellules en culture primaire. En fait, les gènes utilisés dans
ces
premières expériences étaient mutés et menaient à l'expression de protéines
p53
variantes caractérisées par un gain de fonction. Sans exclure des fonctions
qui
resteraient à découvrir, on sait maintenant que la protéine p53, au moins sous
sa
forme sauvage, est un facteur de transcription qui régule négativement la
croissance et
la division cellulaire et qui, dans certaines situations, est capable
d'induire l'apoptose
(Yonish-Rouach et al., Nature, 352, 345-347, 1991). Ces propriétés se
manifestant en
a
situation de stress où l'intégrité de FADN cellulaire est menacée, p53 a été
suggérée
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être un "gardien du génome". La présence de p53 mutées dans environ 40 % des
tumeurs humaines, tous types confondus, renforce cette hypothèse et souligne
le rôle
probablement crucial que jouent les mutations de ce gène dans le développement
tumoral (pour revues, voir Montenarh, Oncogène, 7, 1673-1680, 1992 ; Oren,
FASEB J., 6, 3169-3176, 1992 ; Zambetti and Levine, FASEB J., 7, 855-865,
1993).
Là protéine -p53 sàuvàge est àsujett e à ui e régulation complexe qui fait
intervenir le contrôle de sa synthèse et de son catabolisme ainsi que celui de
sa
localisation intracellulaire et de ses modifications post-traductionnelles
(voir les
revues citées plus haut). La protéine p53 sauvage est extrêmement instable
avec une
demi-vie de quelques minutes. Par contre, certaines protéines mutées qui
s'accumulent
à haut niveau dans les tumeurs ont une demi-vie significativement allongée.
Peu de
choses ont clairement été établies concernant la dégradation de p53. En effet,
ni les
sites intracellulaires de dégradation, ni le nombre et la nature des voies
cataboliques
empruntées, ni les motifs peptidiques marquant p53 pour sa dégradation ne sont
connus. A notre connaissance, la seule information disponible concerne
l'implication
de l'enzyme El du cycle de l'ubiquitine dans certaines conditions
expérimentales
(Ciechanover et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 139-143, 1991 ; Chowdary
et al.,
Molec. Cell. Biol. 14, 1997-2003, 1994). Par ailleurs, il a été montré que
certains
produits protéolytiques dérivés de p53 peuvent être présentés de manière
antigénique.
La présente invention concerne un procédé pour l'identification d'un
inhibiteur de la dégradation d'une protéine p53 comprenant :
a) la mise à disposition d'un extrait cellulaire comprenant au moins une
protéine p53 et au moins une calpaïne;
b) l'administration d'au moins une protéine et/ou d'au moins un polypeptide
inhibiteur de l'activité calpaïne de l'extrait cellulaire; et
c) la mise en évidence de la dégradation en mesurant la protéine p53 et les
fragments de la protéine p53.
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2a
La présente invention concerne l'utilisation de la calpastatine ou d'une
séquence d'acide nucléique codant la calpastatine pour la préparation d'une
composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers.
La présente invention concerne aussi un vecteur viral comprenant une
séquence d'acide nucléique codant une calpastatine, caractérisé en ce qui est
choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus et les virus adéno-associés, et
qu'il
comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2.
La présente invention concerne également une composition telle que définie
précédemment formulée en vue d'une administration intratumorale.
La présente invention résulte en partie de la mise en évidence que les
protéines p53 sont des substrats pour des protéases dépendantes du calcium :
les
calpaïnes. Elle résulte plus particulièrement de la démonstration que les
protéines p53
sont dégradées spécifiquement par la m-calpaïne ou la p.-calpaïne. La présente
invention constitue la première mise en évidence d'un mécanisme de régulation
des
niveaux cellulaires des protéines p53 et offre ainsi une nouvelle approche
particulièrement efficace et spécifique pour moduler les niveaux de cette
protéine dans
des situations pathologiques telles que notamment certains cancers.
En particulier, la présente invention décrit une nouvelle approche pour le
traitement des cancers, basée sur l'utilisation de composés modulateurs de
l'activité
des calpaïnes sur les protéines p53, qui permettent soit d'activer la
dégration de
protéines p53 mutées, pour bloquer leur effet=tumorigène .et/ou pour augmenter
la
présentation de peptides immunogènes, soit de stabiliser la protéine p53
sauvage,
WO95133060 , 2 14,d! g73 PCTIFR95100670
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pour contrebalancer l'effet tumorigène des protéines mutées exprimées dans les
tumeurs et/ou pour induire l'apoptose des cellules tumorales.
Un premier objet de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un composé
capable de moduler l'activité de la calpaïne pour la préparation d'une
composition
pharmaceutique destinée au traitement des cancers.
Les calpaïnes sont des enzymes ubiquitaires trouvées dans la plupart des
cellules mammifères (pour revue, voir Croall et deMartino, Physiol. Rev., 71,
813-847,
1991). Elles sont essentiellement cytoplasmiques mais elles peuvent pénétrer
dans le
noyau à la faveur de la destruction de l'enveloppe nucléaire lors de la mitose
ou à la
suite de certains stimuli. Comme indiqué ci-avant, l'activité protéolytique
des calpaïnes
est dépendante de la présence de calcium.
Les composés capables de moduler l'activité de la calpaïne au sens de la
présente invention peuvent être de plusieurs types.
Il peut s'agir de composés capables d'inhiber l'activité de la calpaïne sur
les
protéines p53. Ces composés sont particulièrement avantageux puisqu' ls sont
utilisables pour inhiber, au moins en partie, la dégradation de la protéine
p53 sauvage.
Ces composés permettent donc de stabiliser intracellulairement la protéine p53
sauvage et de contrebalancer l'effet des formes mutées. Parmi les composés
inhibiteurs
utilisables dans le cadre de l'invention on peut citer les inhibiteurs de
protéases
(leupeptine, aprotinine, PMSF, etc), les chélateurs du calcium (EGTA, EDTA,
etc), ou
des inhibiteurs plus spécifiques tels la calpastatine ou tout fragment ou
dérivé de celle-
ci. La calpastatine est un inhibiteur connu des calpaïnes. Sa séquence a été
décrite dans
l'art antérieur (SEQ ID n 1). Un mode de réalisation particulièrement
avantageux de
la présente invention consiste à transférer dans les tumeurs un vecteur
portant tout ou
partie de la séquence codant pour la calpastatine. Cette approche est
particulièrement
adaptée au traitement des cancers présentant toujours un allèle p53 sauvage,
tels que
les carcinomes coliques ou bronchiques par exemple. Différents fragments ou
dérivés
de la calpastatine peuvent être utilisés dans le cadre de la présente
invention. De tels
fragments ou dérivés peuvent être toute molécule obtenue à partir de la
séquence SEQ
ID n 1 par modification(s) de nature génétique et/ou chimique, conservant la
capacité
d'inhiber au moins en partie l'activité d'une calpaïne. Par modification de
nature
génétique et/ou chimique, on entend toute mutation, délétion, substitution,
addition,
et/ou modification d'un ou plusieurs nucléotides. De telles modifications
peuvent être
effectuées dans différents buts, et notamment celui de préparer des séquences
adaptées
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à l'expression dans un type particulier de vecteur ou d'hôte, celui de réduire
la taille de
la séquence pour faciliter leur pénétration cellulaire, celui d'augmenter
l'activité
d'inhibition, ou, de manière particulièrement avantageuse, d'augmenter la
sélectivité de
l'inhibiteur vis-àvis de l'activité des calpaïnes sur la dégradation de la
protéine p53
sauvage.
Dans un mode de la réalisation particulière de la présente invention, le
procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que
l'inhibiteur
administré est une calpastatine.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, le procédé
selon l'invention est caractérisé en ce que la séquence d'acides nucléiques
codant
pour la calpastatine est la séquence SEQ NO: 1 ou la séquence SEQ NO: 2.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, le procédé
selon l'invention est caractérisé en ce que l'extrait cellulaire provient
d'une cellule
cancéreuse.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, le procédé
selon l'invention est caractérisé en ce que l'inhibiteur administré est un
fragment de
la calpastatine.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, le procédé
selon l'invention est caractérisé en ce que la mesure de la protéine p53 et
des
fragments de la protéine p53 est effectuée par électrophorèse.
De telles modifications peuvent être effectuées par exemple par mutagénèse
in vitro, par introduction d'éléments additionnels ou de séquences
synthétiques, ou par
des délétions ou des substitutions des éléments originels. Lorsqu'un dérivé
tel que
défini ci-dessus est réalisé, son activité d'inhibiteur de l'activité des
calpaïnes sur les
protéines p53 peut être mise en évidence de plusieurs façons, et en
particulier en
mettant en présence ledit inhibiteur et les différentes formes de protéines
p53, puis en
détectant les produits de dégradation obtenus (voir exemples 1 à 3). Toute
autre
technique connue de l'homme de l'art peut bien évidemment être utilisée à cet
effet.
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4a
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, on utilise
comme inhibiteur tout ou partie de la calpastatine, ou un acide nucléique
codant pour
tout ou partie de la calpastatine. Encore plus particulièrement, on utilise un
peptide
comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n I ou d'un dérivé de celle-
ci.
Concernant plus spécifiquement les dérivés, on peut citer à titre d'exemple le
composé de séquence SEQ ID n 2, qui correspond à un fragment de la
calpastatine.
On utilise avantageusement tout dérivé composés de séquence SEQ ID n 1 ou 2
capable d'inhiber spécifiquement ou préférentiellement la dégradation de la
protéine
p53 sauvage par la calpaïne,
Les composés capables de moduler l'activité de la calpaïne sur les protéines
p53 au sens de la présente invention peuvent également être des dérivé de la
calpaïne
capable de dégrader spécifiquement ou préférentiellement les protéines p53
mutées.
De tels dérivés sont également très avantageux puisqu'ils permettent d'activer
la
dégration des protéines p53 mutées, pour bloquer leur effet tumorigène et/ou
pour
augmenter la présentation de peptides immunogènes, sans affecter de manière
significative les niveaux cellulaires de protéine p53 sauvage. De tels dérivés
peuvent
être obtenus à partir de la calpaïne, par modification(s) structurales de
nature
génétique et/ou chimique. La capacité des dérivés ainsi obtenus de dégrader
spécifiquement ou préférentiellement les protéines p453 mutées peut ensuite
être mise
en évidence comme décrit dans les exemples 1 à 3.,
WO95/33060 9 0-',L g3 PCTIFR95100670
Préférentiellement, les modulateurs utilisés dans le cadre de l'invention sont
des protéines ou polypeptides, ou des séquences d'acides nucléiques codant
pour ces
polypeptides ou protéines. Encore plus préférentiellement, les composés
modulateurs
sont des protéines ou polypeptides inhibiteurs spécifiques de l'activité de la
calpaïne
5 sur la protéine p53 sauvage ou des formes de calpaïnes, modifiées ou non,
pour
dégrader spécifiquement les protéines p53 mutées.
D'une manière particulièrement avantageuse, l'invention réside dans la
possibilité de faire exprimer dans des cellules cancéreuses présentant à la
fois un allèle
p53 sauvage et un allèle p53 muté des séquences nucléiques codant pour des
inhibiteurs de la calpaïne, comme la calpastatine ou partie de la
calpastatine, ou des
formes de calpaïnes, modifiées ou non, pour dégrader spécifiquement les
protéines p53
mutées.
La séquence d'acides nucléiques utilisée dans le cadre de la présente
invention
peut être administrée telle quelle, sous forme d'ADN nu selon la technique
décrite dans
la demande WO 90/11092. Elle peut également être administrés sous forme
complexée, par exemple avec du DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967)
891),
avec des protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), avec
des lipides
(Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), sous forme de liposomes (Fraley et al.,
J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Préférentiellement, la séquence utilisée
dans le
cadre de l'invention fait partie d'un vecteur. L'emploi d'un tel vecteur
permet en effet
d'améliorer l'administration de l'acide nucléique dans les cellules à traiter,
et également
d'augmenter sa stabilité dans lesdites cellules, ce qui permet d'obtenir un
effet
thérapeutique durable. De plus, il est possible d'introduire plusieurs
séquences d'acide
nucléique dans un même vecteur, ce qui augmente également l'efficacité du
traitement.
Le vecteur utilisé peut être d'origine diverses, dès lors qu'il est capable de
transformer les cellules animales, de préférence les cellules cancéreuses
humaines.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise un vecteur
viral, qui
peut être choisi parmi les adénovirus, les rétrovirus, les virus adéno-
associés (AAV)
ou le virus de l'herpès.
A cet égard, la présente invention a également pour objet tout virus
recombinant comprenant, inséré dans son génome, un acide nucléique codant pour
un
composé capable de moduler l'activité de la calpaïne. Préférentiellement, les
virus
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utilisés dans le cadre de l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont
incapables de
se répliquer de façon autonome dans la cellule infectée. Généralement, le
génome des
virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc
dépourvu au
moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule
infectée.
Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues
non-
fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la
séquence
codant pour le modulateur des calpaïnes. Préférentiellement, le virus défectif
conserve
néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation
des
particules virales.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la
structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi
ces
sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les
adénovirus
humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale
(voir
demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans
le
cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine,
bovine,
murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine,
aviaire
ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine
animale est
un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche
manhattan
ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre
de
l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les
ITR,
une séquence permettant l'encapsidation et la séquence codant pour le
modulateur des
calpaïnes. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de
l'invention, le gène El et au moins l'un des gènes E2, E4, Ll-L5 sont non
fonctionnels.
Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique
connue de
l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion
partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes
considérés. De telles
modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ,
par
exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement
au
moyen d'agents mutagènes.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés
par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101
(1991)
195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent
être
préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide
portant
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902
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entre autre la séquence d'ADN codant pour le modulateur des calpaïnes. La
recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et
plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée
doit de
préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les
séquences
capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de
préférence
sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre
d'exemple de
lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham
et al.,
J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome,
la
partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). Des stratégies de
construction
de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les
demandes n
FR 93 05954 et FR 93 08596.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés
selon
les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les
exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille
relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils
infectent, de
manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large
spectre de
cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la
différenciation
cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies
chez
l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend
environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée
(ITR)
de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste
du
génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions
d'encapsidation : la
partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication
virale et
l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le
gène cap
codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro
et
in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO
93/09239;
US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes
constrictions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont
délétés et
remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro
(sur cellules
en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt.
Les AAV
recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-
transfection, dans
un lignée cellulaire infectée par un virus. auxiliaire humain (par exemple un
adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence codant pour le modulateur des
W O 95133060 PCT/FR95100670
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calpaïnes bordé de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un
plasmide
portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV
recombinants
produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de
vecteurs
recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment
Breakfield et
al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genet.
Eng.
7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement
avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus recombinant défectif. Ces
vecteurs possèdent en effet des propriétés particulièrement intéressantes pour
le
transfert de gènes dans les cellules tumorales.
Avantageusement, dans les vecteurs de l'invention, la séquence codant pour le
modulateur des calpaïnes est placée sous le contrôle de signaux permettant son
expression dans les cellules tumorales. Préférentiellement, il s'agit de
signaux
d'expression hétérologues, c'est-à-dire de signaux différents de ceux
naturellement
responsables de l'expression du modulateur. Il peut s'agir en particulier de
séquences
responsables de l'expression d'autres protéines, ou de séquences synthétiques.
Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou
viraux.
Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la
cellule
que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices
issues du
génome d'un virus, y compris du virus utilisé. A cet égard, on peut citer par
exemple
les promoteurs EIA, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences
d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de
régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. Il peut en effet
être
particulièrement intéressant d'utiliser des signaux d'expression actifs
spécifiquement ou
majoritairement dans les cellules tumorales, de manière à ce que la séquence
d'ADN ne
soit exprimée et ne produise son effet que lorsque le virus a effectivement
infecté une
_ cellule tumorale.
Dans un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un virus
recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour un modulateur
des calpaïnes sous le contrôle d'un promoteur viral, choisi de préférence
parmi le LTR-
RSV et le promoteur CMV.
2 t g PCTIFR95/00670
WO 95/33060
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Toujours dans un mode préféré, l'invention concerne un virus recombinant
défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour un modulateur des calpaïnes
sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans les
cellules
tumorales.
L'expression est considérée comme majoritaire au sens de l'invention lorsque,
même si une expression résiduelle est observée dans d'autres types
cellulaires, les
niveaux d'expression sont supérieurs dans les cellules tumorales.
La présente invention concerne également toute composition pharmaceutique
comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits
précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue
d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale,
intraveineuse,
intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De
préférence, les
compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceu-
tiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une
injection
directe dans la tumeur du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions
stériles,
isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par
addition
selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la
constitution de
solutés injectables. L'injection directe dans la tumeur du patient est
avantageuse car
elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés.
Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent
être
adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du
vecteur
viral, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore
de la
durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus
recombinants
selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises
entre 104
et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque
forming
unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est
déterminé par
infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après
48 heures,
du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du
titre plu
d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Concernant
les
rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement
les
cellules productrices, en vue de leur implantation.
La présente invention est particulièrement adaptée au traitement des cancers
dans lesquels des formes mutées de p53 sont observées. Plus spécifiquement, la
WO 95/33060 9! a~ PCT/FR95/00670
présente invention est particulièrement avantageuse pour le traitement des
cancers
dans lesquels les allèles sauvage et mutés de p53 sont présents. De tels
canccers sont
notamment les cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers du poumon,
les
cancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les lymphômes B, les cancers
ovariens,
5 les cancers de la vessie, etc.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples
qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
légende des figures
Figure 1 : Etude de la régulation de la protéine p53 par la calpaïne. La
réaction est
10 effectuée dans un volume final de 30 pl, dont 1 provenant du mélange de
traduction.
ligne 1 : TO; ligne 2 : 30 min en présence de 1 mM Calcium + 20 Mg/ml
Calpaïne; ligne
4 : 30 min en présence de lmM Calcium + 20 gg/ml Calpaïne + 0,5 mg/ml
calpastatine; ligne 5 : 30 min en présence de 1mM Calcium + 20 g/ml Calpaïne
+
lOmM EGTA; ligne 6 : PBS; ligne 7 : PBS + calcium; ligne 8 : PBS +
calpastatine.
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les
extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN
plasmidique en
gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou
d'acrylamide, la
purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de
protéines au
phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de
l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc
... sont bien
connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature
[Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds),
"Current
Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont
d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille
par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou
par un
mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de
l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
WO 95/33060 2 ILS 0t b-3 J PCT1FR95100670
11
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le
fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les
spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes
est
effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon
les
recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes
est
effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut
être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids
Res. 12
(1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de
PCR [Rolymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science Q (1985)
1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym.. (1987) 335-350] peut
être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon
les
spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la
méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977)
5463-
5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Exemples
Exemple 1, Cet exemple montre que l'addition de m-calpaïne au lysat de
réticulocyte de
lapin induit la dégradation de la protéine p53 sauvage ainsi que celle de
certaines
formes mutées. Cet exemple montre également que des inhibiteurs des calpaïnes
sont
capables d'inhiber la dégradation de p53 et donc de moduler l'activité de
cette
protéine.
1.1. Mise en évidence de la dégradation: Les protéines p53 sauvages de souris
et d'homme ainsi que diverses protéines p53 mutées (protéines humaines C273,
H273,
H175, 1247) ont été traduites dans le lysat de réticulocyte de lapin. Les
protéines ainsi
30- obtenues sont résistantes à toute dégradation, même en présence de haute
concentration de calcium (co-facteur indispensable des calpaïnes). L'addition
de m-
calpaïne de boeuf (Sigma) au lysat de réticulocyte en présence de calcium a
entrain la
disparition rapide des protéines néo-synthétisées et l'apparition de fragments
protéolytiques résolvables par électrophorèse. La résistance à la dégradation
d'autres
protéines comme la dihydrofolate réductase ou la glycéraldéhyde-3-phosphate
CA 02190293 2009-09-24
12
deshydrogénase dans les mêmes conditions expérimentales indique la spécificité
de
substrat de la réaction.
1.2. Utilisation d'inhibiteurs de calpaïne pour moduler les niveaux de
protéines
p53 : Dans l'exemple 1.1. ci-dessus, il a été montré que l'addition de m-
calpaïne
induisait une dégradation des protéines p53. Dans cet exemple, en plus de m-
calpaïne,
différents composés ont été introduits au milieu pour tester leur capacité
d'inhiber
l'activité de la calpaïne. Les résultats obtenus montrent que l'addition d'un
chélateur du
calcium (I'EGTA) ainsi que d'un peptide inhibiteur spécifique des calpaïnes
(dérivé
d'un inhibiteur physiologique, la calpastatine ; Maki et al., J. Biol. Chem.,
254, 18866-
18869, 1989) sont capables d"inhiber de la dégradation des protéines p53
induite par
la calpaïne exogène,
mpl 2
Dans l'exemple précédent, il a été montré que l'addition de calpaïne exogène à
une solution de protéines p53 entrainait leur dégradation. Cet exemple montre
que la
dégradation de la protéine p53 sauvage ainsi que celle de certaines formes
mutées
peut être induite par les calpaïnes endogènes dans des extraits
cytoplasmiques. Cet
exemple montre également que des inhibiteurs des calpaïnes sont capables, en
présence de calpaine endogène, d'inhiber la dégradation de p53 et donc de
moduler
l'activité de cette protéine.
2.1. Dégradation par les calpaïnes endogènes : Les protéines p53 sauvages de
souris et d'homme, ainsi que certaines formes mutées (Cf exemple 1) ont été
traduites
dans le lysat de réticulocyte puis ont été incubées en présence d'extraits
cytoplasmiques de cellules Iymphoblastoïdes humaines Daudi ou Jurkat. Les
extraits
cytoplasmiques ont été préparés de la manière suivante : Les cellules
(accessibles à
l'ATCC) ont été cultivées dans du milieu DMEM supplémenté de 10% de sérum de
veau fétal. Les cellules ont ensuite été récoltées, lavées dans un tampon PBS,
puis
incubées 5 min dans un tampon de lyse hypotonique sans détergent (1-IFPES 20
mM
pH 7,5; KOAc 10 mM; MgOAc 1,5 mM; 2ml pour 5.108 cellules). La lyse a été
complété en utilisant un homogénéiseur Dounce*, puis vérifiée sous microscope.
Les
noyaux ont ensuite été éliminés par centrifugation à 2000 g pendant 5 min, et
les
surnageants ont été centrifugés à 10 000g pendant 1 heure (Beckman SW60). Les
extraits cytoplasmiques ont ensuite été aliquotés à raison de 5 à 12 mg/ml.
* (marques de commerce)
WO 95/33060 219'D' PCTIMSI00670
âââ
13
Lorsque le lysat de réticulocutes a été incubé en présence d'extraits
cytoplasmiques,
en l'absence de calcium, aucune dégradation n'a été observée. Par contre, en
présence
de calcium, une dégradation très rapide des protéines p53 a été observée, avec
apparition d'un profil de produits protéolytiques caractéristique proche de
celui
obtenu dans l'exemple 1. Cet expérience montre bien que les protéines p53 sont
dégradées par les calpaïnes endogènes.
2.2. Utilisation d'inhibiteurs de calpaïne pour moduler les niveaux de
protéines
p53 : La chélation du calcium par lEGTA, ainsi que l'utilisation de toute une
gamme
d'inhibiteurs de protéases (leupeptin, aprotinin, soybean trypsin inhibitor et
PMSF) et
surtout le peptide calpastatine montrent que la dégradation de ces protéines
est sous
la dépendance des calpaïnes de l'extrait cytoplasmique, et que différents
composés
capables de moduler l'activité des calpaïnes peuvent être utilisés pour
réguler les
niveaux de protéine p53.
Exemple 3
Cet exemple démontre que les protéines p53 sauvages de souris et d'homme
sont des substrats directs pour les calpaïnes dans les extraits
cytoplasmiques.
Les exemples 1 et 2 montrent que les calpaïnes peuvent induire la dégradation
de- p53 dans des mélanges réactionnels complexes. Ces expériences n'excluent
cependant pas que dans les conditions utilisées les calpaïnes activent des
protéases
secondaires qui sont celles qui agissent véritablement sur p53. Dans cet
exemple,
l'expérience suivante a été conduite : (1) les protéines p53 sauvages de
souris et
d'homme néo-synthétisées dans le lysat de réticulocyte de lapin ont été
incubées
pendant 30 minutes en présence d'extrait cytoplasmique de cellules Daudi ainsi
qu'en
présence de calcium pour activer les calpaïnes comme dans l'exemple 2, (2) de
la
protéine p53 a alors été rajoutée au mélange réactionnel et la réaction a été
poursuivie
minutes dans des conditions permissives (mêmes conditions réactionnelles) ou
non
(addition soit d'EGTA pour chélater le calcium, soit de peptide calpastatine)
pour les
30 calpaïnes. En présence de calcium, la protéine p53 nouvellement ajoutée est
complètement dégradée indiquant que l'activité protéase est fonctionnelle tout
le
temps de l'expérience. Quand les calpaïnes sont inhibées par la présence
d'EGTA ou,
plus significativement, du peptide calpastatin, la protéine p53 nouvellement
ajoutée
n'est par contre plus dégradée. Cette dernière observation exclut donc la
possibilité
WO 95133060 il) 7 PCT/F1195/00670
14
que dans la première partie de l'expérience les calpaïnes aient induit une
seconde
protéase responsable de la dégradation de p53 (figure 1).
Exemple 4
Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant comportant
une séquence d'acides nucléiques codant pour la calpastatine. Cet adénovirus
est
construit par recombinaison homologue entre l'adénovirus défectif Ad-d11324 et
un
plasmide portant la séquence SEQ ID n 1 sous controle du promoteur RSV.
4.1. Construction du plasmide SEQ ID n 1
Le plasmide SEQ ID n 1 comporte la séquence codant pour la calpastatine
sous le contrôle du promoteur LTR-RSV, ainsi que des régions de l'adénovirus
permettant la recombinaison homologue. Il est construit par insertion de la
séquence
SEQ ID n 1 dans le plasmide pAd.RSV(3gal. Le plasmide pAd.RSV(3Gal contient,
dans l'orientation 5'->3',
- le fragment PvuII correspondant à l'extrémité gauche de l'adénovirus Ad5
comprenant : la séquence ITR, l'origine de réplication, les signaux
d'encapsidation et
l'amplificateur ElA;
- le gène codant pour la f3-galactosidase sous le contrôle du promoteur RSV
(du virus du sarcome de Rous),
- un second fragment du génome de l'adénovirus AdS, qui permet la
recombinaison homologue entre le plasmide pAd.RSV(3Ga1 et l'adénovirus d1324.
Le
plasmide pAd.RSV(3Ga1 a été décrit par Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin.
Invest.
90 (1992) 626).
4.2. Construction de l'adénovirus recombinant
Le vecteur décrit en 4.1. est linéarisé et cotransfecté avec un vecteur
adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans
les
fonctions codées par les régions El (ElA et El1B) d'adénovirus.
Plus précisément, l'adénovirus recombinant est obtenu par recombinaison
homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-d11324 (Thimmappaya et al.,
Cell
31 (1982) 543) et le vecteur décrit dans l'exemple 4.1., selon le protocole
suivant : le
plasmide SEQ ID n 1 et l'adénovirus Ad-d11324, linéarisé par l'enzyme Clal,
sont
co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour
permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi
générés
W O 95/33060 /gg95/00670
sont ensuite sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN
de
l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui
conduit à
un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non
purifié
ayant un titre d'environ 1010 pfu/ml.
5 Les particules virales sont purifiées par centrifugation sur gradient de
chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al.,
Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus obtenu peut être conservé à -80 C dans
20 %
de glycérol.
WO 95133060 PCT/FR95/00670
16
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Methode de traitement des cancers par
regulation de la protéine p53.
(iii) NOMBRE DE'SEQUENCES: 2
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release 111.0, Version 1{1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2085 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..2085
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= "Calpastatine humaine"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
ATG GAA GGA CCA CAT CTT CCT AAC AAG AAA AAA CAC AAA AAA CAG GCT 48
Met Glu Gly Pro His Leu Pro Asn Lys Lys Lys His Lys Lys Gln Ala
1 5 10 15
GTA AAA ACA GAA CCT GAG AAG AAG TCA CAG TCA ACC AAG CTG TCT GTG 96
Val Lys Thr Glu Pro Glu Lys Lys Ser Gln Ser Thr Lys Leu Ser Val
20 25 30
GTT CAT GAG AAA AAA TCC CAA GAA GGA AAG CCA AAA GAA CAC ACA GAG 144
Val His Glu Lys Lys Ser Gln Glu Gly Lys Pro Lys Glu His Thr Glu
35 ,40 - 45
CCA AAA AGC CTA CCC AAG CAG GCA TCA GAT ACA GGA AGT AAC GAT GCT 192
Pro Lys Ser Leu Pro Lys Gln Ala Ser Asp Thr Gly Ser Asn Asp Ala
~Q 3PCTIFR95100670
WO 95/33060
17
50 _ 55 60
CAC AAT AAA AAA GCA GTT TCC AGA TCA GCT GAA CAG CAG CCA TCA GAG 240
His Asn Lys Lys Ala Val Ser Arg Ser Ala Glu Gln Gln Pro Ser Glu
65 70 75 80
AAA TCA ACA GAA CCA AAG ACT AAA CCA CAA GAC ATG ATT TCT GCT GGT 288
Lys Ser Thr Glu Pro Lys Thr Lys Pro Gln Asp Met Ile Ser Ala Gly
85 90 95
GGA. GAG AGT GTT GCT GGT ATC ACT GCA ATA TCT GGC AAG CCG GGT GAC 336
Gly Glu Ser Val Ala Gly Ile Thr Ala Ile Ber Gly Lys Pro Gly Asp
100 105 110
AAG AAA AAA GAA AAG AAA TCA TTA ACC CCA GCT GTG.CCA GTT GAA TCT 384
Lys Lys Lys Glu Lys Lys Ser Leu Thr Pro Ala Val Pro Val Glu Ser
115 120 125
AAA CCG GAT AAA CCA TCG GGA AAG TCA GGC ATG GAT GCT GCT TTG GAT 432
Lys Pro Asp Lys Pro Ser Gly Lys Ser Gly Met Asp Ala Ala Leu Asp
130 135 140
GAC TTA ATA GAT ACT TTA GGA GGA CCT GAA GAA ACT GAA GAA GAA AAT 480
Asp Leu Ile Asp Thr Leu Gly Gly Pro Glu Glu Thr Glu Glu Glu Asn
145 150 155 160
ACA ACG TAT ACT GGA CCA GAA GTT TCA GAT CCA ATG AGT TCC ACC TAC 528
Thr Thr Tyr Thr Gly Pro Glu Val Ser Asp Pro Met Ser Ser Thr Tyr
165 170 175
ATA GAG GAA TTG GGT AAA AGA GAA GTC ACA ATT CCT CCA AAA TAT AGG 576
Ile Glu Glu Leu Gly Lys Arg Glu Val Thr Ile Pro Pro Lys Tyr Arg
180 185 190
GAA CTA TTG GCT AAA AAG GAA GGG ATC ACA GGG CCT CCT GCA GAC TCT 624
Glu Leu Leu Ala Lys Lys Glu Gly Ile Thr Gly Pro Pro Ala Asp Ser
195 200 205
TCA AAA CCC ATA GGG CCA GAT GAT GCT ATA GAC GCC TTG TCA TCT GAC 672
Ser Lys Pro Ile Gly Pro Asp Asp Ala Ile Asp Ala Leu Ser--Ser Asp
210 215 220
TTC ACC TGT GGG TCG CCT ACA GCT GCT_GGA AAG AAA ACT GAA AAA GAG 720
Phe Thr Cys Gly Ser Pro Thr Ala Ala Gly Lys Lys Thr Glu Lys Glu
225 230 235 240
GAA TCT ACA GAA GTT TTA AAA GCT CAG TCA GCA GGG ACA GTC AGA AGT 768
Glu Ser Thr Glu Val Leu Lys Ala Gin Ser Ala Gly Thr Val Arg Ser
245 250- 255
GCT GCT CCA CCC CAA GAG AAG AAA AGA AAG GTG GAG AAG GAT ACA ATG 816
Ala Ala Pro Pro Gln Glu Lys Lys Arg Lys Val Glu Lys Asp Thr Met
260 265 270
AGT GAT CAA GCA CTC GAG GCT CTG TCG GCT TCA CTG GGC ACC CGG CAA 864
Ser Asp Gln Ala Leu Glu Ala Leu-Ser Ala Ser Leu Gly Thr Arg Gln
275 280 - 285
GCA GAA CCT GAG CTC GAC CTC CGC TCA ATT AAG GAA GTC GAT GAG GCA 912
Ala Glu Pro Glu Leu Asp Leu Arg Ser Ile Lys Glu Val Asp Glu Ala
290 295 300
AAA GCT AAA GAA GAA AXA CTA GAG AAG TGT GGT GAG GAT GAT GAA ACA 960
W O 95133060 !~ ~ J PCT/FR95/00670
18
Lys Ala Lys Glu Glu Lys Leu Glu Lys Cys Gly.Glu Asp Asp Glu Thr
305 --- -- - 310 315 320
ATC CCA TCT GAG TAC AGA TTA AAA CCA GCCACG GAT AAA GAT GGA AAA 1008
Ile Pro Ser Glu Tyr Arg Leu Lys Pro Ala Thr Asp Lys Asp Gly Lys
325 330 335
CCA CTA TTG CCA GAG CCTGAA GAA AAA CCC AAG CCT CGG AGT GAA TCA 1056
Pro Leu Leu Pro Glu Pro Glu Glu Lys Pro Lys ProArg Ser Glu Ser
340 345 350
GAA CTC ATT GAT GAA CTT-TCA GAA GAT TTTGAC CGG TCT GAA TGT AAA 1104
Glu Leu Ile Asp Glu Leu Ser Glu Asp Phe Asp Arg Ser Glu Cys Lys
355 360 365
GAG AAA CCA TCT AAG CCA ACT GAA AAG ACA GAA GAA TCT AAG GCC GCT- 1152
Glu Lys Pro Ser Lys Pro Thr Glu Lys Thr Glu Glu Ser Lys Ala Ala
370 375 380
GCT CCA GCT CCT GTG TCG GAG GCTGTG TCT CGG ACC TCC ATG TGT AGT 1200
Ala ProAla Pro Val Ser Glu Ala Val Ser Arg Thr Ser Met Cys Ser
385 390 395 400
ATA CAG TCA GCA CCC CCT GAG CCG GCT ACC TTG AAG GGC ACA GTG CCA 1248
Ile Gln Ser Ala Pro ProGlu Pro Ala Thr Leu Lys Gly Thr Val Pro
405 410 415
GAT GAT GCT GTA GAA GCC TTG GCT GAT AGC CTG GGG AAA AAG GAA GCA 1296
Asp Asp Ala Val Glu Ala Leu Ala Asp Ser Leu Gly Lys Lys Glu Ala
- 420 425 430
GAT CCA GAA GAT GGA AAA CCT GTG ATG GAT AAA GTC AAG GAG AAG GCC 1344
Asp Pro Glu Asp Gly Lys Pro Val Met Asp Lys Val Lys Glu Lys Ala
435 440 445
AAA GAA GAA GAC CGT GAA AAG CTT GGT GAA AAA GAA GAA ACA ATT CCT 1392
Lys Glu Glu Asp Arg Glu Lys Leu Gly Glu Lys Glu Glu Thr Ile Pro
450 455 460
CCT GAT TAT AGA TTA GAA GAG GTC AAG GAT AAA GAT GGA AAG CCA CTC 1440
Pro Asp Tyr Arg Leu Glu Glu Val Lys Asp Lys Asp Gly Lys Pro Leu
465 470 475 480
CTG CCA AAA GAG TCT AAG GAA CAG CTT CCA CCC ATG AGT GAA GAC TTC 1488
Leu Pro Lys Glu Ser Lys Glu Gln Leu Pro Pro Met Ser Glu Asp Phe
485 490 495
CTT CTG GAT GCT TTG TCT GAG GAC TTC TCT GGT CCA CAA AAT GCT TCA 1536
Leu Leu Asp Ala Leu Ser Glu Asp Phe Ser Gly Pro Gln Asn Ala Ser
500 505 510
TCT CTT AXA TTT GAA GAT GCT AAA CTT GCT GCT GCC ATC TCT GAA GTG 1584
Ser Leu Lys Phe Glu Asp Ala Lys Leu Ala Ala Ala Ile Ser Glu Val
515 520 525
GTT TCC CAA ACC CCA GCT TCA ACG ACC CAA GCT GGA GCC CCA CCC CGT 1632
Val Ser Gln Thr Pro Ala Ser Thr Thr Gln Ala Gly Ala Pro Pro Arg
530 535 540 - -
GAT ACC TCG CAG AGT GAC AAA GAC CTC GAT GAT GCC TTG GAT AAA CTC 1680
Asp Thr Ser Gln Ser Asp Lys Asp Leu Asp Asp Ala Leu Asp Lys Leu
545 550 555 560
fi g _l& u 0 - 2 ' -
WO 95133060 1 PCT/FR95/00670
19
TCT GAC AGT CTA GGA CAA AGG CAG CCT GAC CCA GAT GAG AAC AAA CCA 1728
Ser Asp Ser Leu Gly Gln Arg Gin Pro Asp Pro Asp Glu Asn Lys Pro - -
565 570 - 575
= 5 ATG GGA GAT AAA GTA AAG GAA AAA GCT AAA GCT GAA CAT AGA GAC AAG 1776
Met Gly Asp Lys Val Lys Glu Lys Ala Lys Ala Glu His Are Asp Lys
580 585 590
CTT GGA GAAAGA GAT GAC ACT ATC CCA CCT GAA TAC AGA CAT CTC CTG 1824
Leu Gly Glu Are Asp Asp Thr Ile Pro Pro Glu Tyr Are His Leu Leu
595 600 605
GAT GAT AAT GGA CAG GAC AAA CCA GTG AAG CCA CCT ACA AAG AAA TCA 1872
Asp Asp Asn Gly Gln Asp Lys Pro Val Lys Pro Pro Thr Lys Lys Ser
610 615 620
GAG GAT TCA AAG AAA CCTGCA GAT GAC CAA GAC CCC ATT GAT GCT CTC 1920
Glu Asp Ser Lys Lys Pro Ala Asp Asp Gln Asp Pro Ile Asp Ala Leu
625 - - 630 635 640
TCA GGA GAT CTG GAC AGC TGT CCC TCC ACT ACA GAA ACC TCA CAG AAC 1968
Ser Gly Asp Leu Asp Ser Cys Pro Ser Thr Thr Glu Thr Ser Gln Asn
645 650 655
ACA GCA AAG GAT AAG TGC AAG AAG GCT GCT TCC AGC TCC AAA GCA CCT 2016
Thr Ala Lys Asp Lys Cys Lys Lys Ala Ala Ser Ser Ser Lys Ala Pro
660 665-- -- -- 670
AAG AAT GGA GGT AAA GCG AAG GAT TCA GCA AAG ACA ACA GAG GAA ACT 2064
Lys Asn Gly Gly Lys Ala Lys Asp Ser Ala Lys Thr Thr Glu Glu Thr
675 680 - 685
TCC AAG CCA AAA GAT GAC TAA 2085
Ser Lys Pro Lys Asp Asp *
690 695 - -
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 399 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..399 -
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
TCA GGC ATG GAT GCT GCT TTG GAT GAC TTA ATA GAT ACT TTA GGA GGA 48
Ser Gly Met Asp Ala Ala Leu Asp Asp Leu Ile Asp Thr Leu Gly Gly
2 / u L 3 PCTJFR95/00670
W O 95133060
2190293
700 705 710
CCT GAA GAA ACT GAA GAA GAA AAT ACA ACG TAT ACT GGA CCA GAA GTT 96
Pro Glu Glu Thr Glu Glu Glu Asn Thr Thr Tyr Thr Gly Pro Glu Val
5 715 720 725
TCA GAT CCA ATG AGT TCC ACC TAC ATA GAG GAA TTG GGT AAA AGA GAA 144
Ser Asp Pro Met Ser Ser Thr Tyr Ile Glu Glu Leu Gly Lys Arg Glu
730 735 740
GTC ACA ATT CCT CCA AAA TAT AGG GAA CTA TTG GCT AAA AAG GAA GGG 192
Val Thr Ile Pro Pro Lys Tyr Arg Glu Leu Leu Ala Lys Lys Glu Gly
745 750 755
ATC ACA GGG CCT CCT GCA GAC TCT TCA AAA CCC ATA GGG CCA GAT GAT 240
Ile Thr Gly Pro Pro Ala Asp Ser Ser Lys Pro Ile Gly Pro Asp Asp
760 765 770 - 775
GCT ATA GAC GCC TTG TCA TCT GAC TTC ACC TGT_GGG TCG CCT ACA GCT 288
Ala Ile Asp Ala Leu Ser Ser Asp Phe Thr Cys Gly Ser Pro Thr Ala
780 785 790
GCT GGA AAG AAA ACT GAA AAA GAG GAA TCT ACA GAA GTT TTA AAA GCT 336
Ala Gly Lys Lys Thr Glu Lys Glu Glu Ser Thr Glu Val Leu Lys Ala
795 800 805
CAG TCA GCA GGG ACA GTC AGA AGT GCT GCT CCA CCC CAA GAG AAG AAA 384
Gln Ser Ala Gly Thr Val Arg Ser Ala Ala Pro Pro Gln Glu Lys Lys
810 815 820
AGA AAG GTG GAG AAG 399
Arg Lys Val Glu Lys
825
