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WO 96/18740 PCI~/FR95/01650
Transfert de gènes dans les motoneurones mé~ ires
au moyen de vecteurs adénoviraux
La présente invention concerne le domaine de la thérapie génique. Elle concerne
plus particulièrement une nouvelle méthode de tr~iteme-nt des pathologies du système
5 nerveux par transfert de gènes dans les motoneurones m~ ires au moyen de vecteurs
adénoviraux.
La thérapie génique et 1'1-tili.e~ti-)n de virus mc~lifi~s comme vecteurs pour les
m~l~rlies neurodégénératives c--n~it~lent des nouvelles approches thérapeutiquesparticulièrement promotteuses. Parmi les vi~s utilisés à cet effet dans l'art antérieur, on
lo peut citer en particulier les adénovirus (Le Gal La Salle et al., Science 259, 988-990), les
virus de l'herpès, les virus adéno-associés et les ~ vir~ls. Les études ~léçrit~s dans l'art
antérieur montrent que ces vecteurs, et en particulier les adénovirus, sont c~r~hles
d'infecter avec une très grande efficacité les cellules du système nerveux central. Ces
résultats permettent ainsi de mettre au point des méthodes de traitement des pathologies
15 du système nerveux central par injection directe au niveau du système ne~ ux central
(en particulier par stéréotaxie) d'adénovirus recomhin~nt.e comprenant un gène
thérapeutique.
Concernant la moelle épinière, dans le cadre de certaines m~ s
neurodégénératives ou de tr~llm~tiemes~ la thérapie génique pourrait également
20 permettre de lutter contre la dégénérescence des neurones moteurs (motoneurones) en
apportant certains gènes codant par exemple pour des facteurs de croiee~n~e.
Né~nmoine, ces applications sont encore limitées par l'~hs~nce de méthode simplepermettant de transférer spécifiquement un gène au niveau de la moelle. La présente
invention permet de remédier à ce problème.
La présente invention décrit en effet une métnode particulièrement efficace pourle transfert sélectif de gènes dans la moelle. La présente invention découle en particulier
de la ~7~monetration qu'il est possible de transférer spécifiquement un gène au niveau des
motoneurones par ~].~,.n;~ l-on, au niveau du muscle, d'un vecteur adénoviral
incorporant ledit gène. En effet, la cl~m~n;e~esse a m~int~n~nt montré que, de manière
particulièrement avantageuse, les adénovirus sont absorbés au niveau des jon-~tione
ne~u~ sculaires (plaques motrices), et ~-~h~min~s jusqu'aux corps c~ 71~ires desmotoneurones (corne ventrale de la moelle épinière) par transport rétrograde le long des
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axones motoneuronaux. L'~tlmini~tration ~lL An~,~ea~l~ire de vecteurs adénovi.dux selon
l'invention c-netit~-r- ainsi une nouvelle mPthor.e très spérifique d'infection des
motoneurones par transport rétrograde, permett~nt de cibler de façon précise l'étage
m~.3~ ire sur lequel on désire i,lL~.v~ r en fonction de la lor~lie~tion du Irfl~ e
5 et/ou de la dégénérescence.
Le procédé selon la présente invention est tout particulièl~m~l av~nt~elnc
puisqu'il permet, en suivant une carto~rz3rhie précise des jon~ti- ne neu~-..iisct-l~ires,
d'infecter de façon spérifique et unilatérale les motonPl~rones des dirréL~,ls étages
fonctionnels mé~ ires. Il s'avère de plus beaucoup moins tr~l3m~tique qu'une injection
lO stéréotaxique dans le parenchyme mPd11ll~ire, laquelle serait de toutes façons plue diffuse
et non restrictive aux motoneurones.
Un premier objet de l'invention réside donc ~lans l'utilisation d'un adénovirus
recomhin~nt comprenant dans son ~PnomP un acide nucléique d'intérêt pour la
préparation d'une composition ph~rm~cel1tique destinée au tr~nsfert dudit acide
5 nucléique dans les motoneurones m~3l~ ires par ~3~ ion i~lkcLlllusculaire.
Comme indiqué ci-avant, le procédé selon la présente invention est très
avantageux puisqu'il permet de cibler préri~r-mPnt les motoneurones de chaque étage
fonr,ti0nn~l me~ ire. Ainsi, selon le site de l'altération à traiter, l'~rmini~tration est
pratiquée dans un muscle portant une liaison nerveuse avec ledit site. Selon la présente
20 invPnti-n,il est m~int~n~nt possible, par un choix judicieux de diverses injections,
d'infecter, de façon spécifique et unilatérale, un grand nombre de motoneurones
mer3.l1ll~ires répartis sur les dirrér~ niv~aux. A titre de mode de ré~ ti~-n pl~fer~s,
;n;~ lion dans des ml1~rles des membres supérieurs (biceps, triceps) permet de
transférer un gène dans les motoneurones au niveau cervical; l'~-lmini~tration dans des
25 ml1~ du thorax (pectoraux) permet de transférer un gène dans les motoneurones au
niveau thoracique; ou encore l'~ l.cl~ion dans des ml1~rles des membres inférieurs
(gastrocnémien) permet de transférer un gène dans les motoneurones au niveaux
lombaire et sacré. D'autres ml1~r1~ peuv~-ll bien Pnten~ être utilisés pour
l'~-lmini~tration au niveau de ces motoneurones, et d'autres motoneurones peuvent
30 é~lemPnt être ciblés. A cet effet, il est possible d'utiliser des cartographies précises des
jonrtion.~ neuromusculaires afin de ~ ".;n~r, en fonction de l'étage mi~lllllslire ciblé, le
ou les mnsrlPs les plus a~prupLiés pour l'a~ 1ic)n De telles cartographies sont
~ccPs~ihlP~ à l'homme de l'art (voir not~mm~nt Nicholopoulos et al., J. Comp. Neurol.
217, 78-85; Peyronnard et Charon, Exp. Brain Res. 50, 125-132). Selon l'étage
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m~ ire qu'il s'avèrera opportun d'il~r~L~ un ou plusieurs m~ lec connus pour être
innervés par l'étage en question peuve.lL ainsi être choisis.
L'~ Lion ;nl.n.~ c..l~ire d'adénovirus peut être réalisée de dirréfel-L~s
manières. Selon un premier mode de ré~ ti~n, elle est pratiquée par injection en5 plll~iellr.~ points d'un même muscle de façon à concernp-r un très grand nombre de plaques
motriceS. Ce mode de r~ tinn est particulii:,~,..en~ ~fflc~ce lorsque le point d'insertion
du nerf dans le muscle cnn~itleré n'est pas i(lentifi~hle Lorsque le point d'insertion du
nerf est repérable, r~ "n;~ ;on est av~nt~ l~m~nt réalisée par une ou pl1l~ie-
~
injections au niveau ou proche(s) dudit point. Selon ce mode de ré~ ti- n, l'effi~ .it~ du
0 L-~lsrel~ est plus grande car une proportion élevée de v~cLe~ .ee est absorbée
au niveau de la jonction neuromusculaire.
Dans un premier mode préféré de mise en oeuvre de la présente invention,
.aLion intr~ml-~all~ire est réalisée par injections en plusieurs points d'un même
muscle.
Dans un autre mode préféré de mise en oeuvre de la présente invention,
l'~(~l.";ni~l.a~ion lllL~ all~ire est réalisée par injection(s) au niveau ou proche(s) du
point d'insertion du nerf.
Selon un objet particulier, rinvention cnn~rne l'utili.~tinn d'un adénovirus
recnmhin~nt comprenant dans son ~.nome un acide nucléique d'intérêt pour la
~r~aL~Lion d'une composition ph~rm~celltique ~ tinée au transfert dudit acide
nucléique dans les motoneurones m~l~ ires cervicaux par aflmini.~tration dans les
m~ l~ des membres supérieurs (exemrle biceps, triceps).
Selon un autre objet particulier, l'invention con~erne l'llt~ tion d'un adénovirus
rec-~mbin~nt comprenant dans son genome un acide nucléique d'intérêt pour la
préparation d'une composition rh~rm~cel~tique (lestinee au transfert dudit acidenucléique dans les motoneurones m~ ires thoraciques par ~mini~tration dans les
mn~les du thorax (ex. pectorallx).
Toujours selon un objet particulier, l'invention con~rne l'l~tili~ti-)n d'un
adénovirus recomhin~nt COlllpl~l ant dans son ~ nome un acide nucléique d'intérêt pour
la préparation d'une composition ph~rm~celltique cle~~nee au transfert dudit acide
nucléique dans les motoneurones m~llll~ires lombaire et/ou sacré par ~mini~tration
dans les muscles des membres inférieurs (gastrornemien par exemrle).
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La méthode selon l'invention peut être mise en oeuvre en ~lti1i~nt des
adénovirus d'origine diverses. Dirr~ L~ sé~Lypes d'adénovirus, dont la structure et
les propriétés varient quelque peu, ont en effet été car~t~ri~ç~s. Parmi ces séroLypes,
on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus l~ de
5 ty-pe 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine ~nim~le (voir (l~m~n~P F~? ~3
05954). Parmi les adénovirus d'origine animale uh1i~hles dans le cadre de la présente
invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, m11rine, (exemple:
Mavl, Beard et al., Virology- 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore
~imi~nne (~Yemr1e: SAV). De pl~ri~ ce, radénovirus d'origine animale est un
lO adénovirus canin, plus pl~rere"l;e11em~nt un adénovirus CAV2 [souche m~nh~tt~n ou
A26/61 (ATCC VR-800) par exemple].
Selon un mode particulier de ré~ ati(m préféré de l'invention, l'adénovirus utilisé
est un adénovirus d'origine h1~m~ine Selon un autre mode avantageux, l'adénovirus est
un adénovirus d'origine ~nim~le
Le génome des adénovirus comprend not~mment une séquence inversée
répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'~n~psitlation (Psi), des gènes
précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes précoces sont cont~nl1~ dans les
régions El, E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région El (Ela et
Elb not~mm~nt) sont néc~s~ires à la rép1ic~ti~ n virale. Les régions E4 et L5 par
exemple sont elles impliquées dans la propagation virale. Les principaux gènes tardifs
sont c~ntçn11~ dans les régions Ll à L5. Les génome de l'adénovirus Ad5 a été
entièrement séquencé et est accessible sur base de rlonnéçs (voir not~mment
Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité du génome d'adénovirus
de sér~Lypes dirr~ Ls (Ad2, Ad7, Adl2, etc) ont éga1em~nt été séqu~-neées. Les
vecteurs adénoviraux utilisés pour la mise en oeuvre de la présente invention
comprenent les ITR, une séquence permettant l'~ne~r.~i-lation et l'acide nucléique
d'intérêt.
Dans un mode de ré~ tion préféré de l'invention, le génome de l'adénovirus
utilisé est dépourvu de tout ou partie de la région El. La région El est en effet
~-~sçntielle à la rép1ieation virale et son inactivation conduit à la formation de virus
défectifs pour la rép1icatic)n, c'est-à-dire incapables de se répliquer de façon autonome
dans les cellules infectées. La région El, ou tout autre région virale considérée, peut être
rendue non fonctionnelle par toute technique connue de l'homme du métier, et
not~mment par sul)pre~ion totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou
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p~ iel1r~ bases dans le ou les gènes con~ rés. De telles moflifis~tic~n~ peuvent etre
obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques
du génie génétique, ou encore par tr~item~nt au moyen d'agents mllt~g~n~s
Avantagell~em~nt le ~nome de l'adénovirus utilisé est dépourvu d'une partie de la
région El correspondant aux résidus 454 à 3328 (fragment PvuII-BglII) ou 382 à 3446
(fragment HinfII-Sau3A).
Selon un mode de ré~ tiQn particulièrement avantageux, le génome de
l'adénovirus utilisé est ég~l-?ment dépourvu de tout ou partie de la région E3 et/ou E4. La
.lt?m~n~1~resse a .~ nt montré qu'il est possible de construire des vecteurs portant
0 ces dirrer~llLs types de cl~leti~n~. Ces délétions suprlem~nt~ires permettent d'accroitre la
sécllrité du vecteur et dl~l1gmenter sa c~p~cité
L'acide nucléique d'intérêt peut être inséré en di~rér~,~L~ sites du génome de
l'adénovirus. Avantag~LIselllent, il est inséré au niveau de la région El, E3 ou E4.
Cependant, il est clair que d'autres sites peuv~lll être utilisés. En particulier, l'accès à la
séquence nucléotidique du ~ nome permet à l'homme du métier d'i~l~-ntifier ou de créer
des sites de restriction utilisables à cet effet.
Les adénovirus rec-~mhin~ntc défectifs selon l'invention pe~lv~"L etre préparés
par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195,
EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent etre pl~pal~s
par recombinaison homologue entre un adénovirus et un pl~mi~le portant entre autre la
séquence d'ADN d'intéret. La recombinaison homologue se produit après co-transfection
desdits adénovirus et ~ mille dans une lignée cell~ ire appr~liée. La lignée c~ ire
utilisée doit de pl~r~lence (i) etre transformable par lesdits élém~nt.~, et (ii), comporter
les séquences c~p~hles de c~mrle."~-"l~ la partie du ~nom~ de l'adénovirus défectif, de
pr~r~lence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titred'exemple de lignée, on peut m~ntionner la lignée de rein embryonnaire hllm~in 293
(Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient not~mm~nt intégrée dans son
génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 ~o).
,~ Une première méthode con~i~te à transfecter l'ADN du virus recomhin~nt
30 (défectif) pr~are in vitro ~lans une lignée cellulaire compétente, c'est-à-dire portant en
trans toutes les fonctions n~ce~ ires à la complt~-",~?"l;.lion du virus défectif. ~es
fone~ti~n.~ sont ~r~Çe~ ;ellem~-nt intégrées dans le génome de la cellule, ce qui réduit les
risques de recomhin~ )n, et confère une st~hilité accrue à la lignée cellulaire. Dans le cas
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d'adénovirus dans lesquels seule la région El est ~l~fi~ nte, la lignée préférée est la
lignée 293.
Une seconde approche consi~Le à co-transfecter dans une lignée c~ ire
apppr~priée l'ADN du virus rec~ mhin~nt défectif préparé in vitro et l'ADN d'un ou de
5 plusieurs virus ou pl~cmi~ helper. ~elon cette méthode, il n'est pas n~cçss~ire de
disposer d'une lignée c~lh-l~ire comp~ell~e capable de comrl~m~nter toutes les fonctions
défectives de l'adénovirus recomhin~nt. Une partie de ces fonctions est en effetcomplfim~ntee par le ou les virus helper. Ce ou ces virus helper sont eux-mêmes
défectifs.
Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont
également été décrites dans les ~lçm~n~s n~ FR93/05954 et FR93/08596.
Ensuite, les adénovirus qui se sont mllltipliç,s sont récupérés et purifiés selon
les techniques classiques de biologie mol~c~ ire, comme illustré dans les e~mplçs.
Pour leur utilisation selon la présente invention, les adénovirus sont
~l~fé.~ iellement associés à un ou des véhicules ph~rm~ceutiquement acceptables pour
une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate
monosodique, disodique, chlorure de sodium, pot~s.sil1m, calcium ou m~gn~sillm, etc, ou
des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, not~mm~nt
lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau st~rili~ee ou de sérum physiologique,
permettent la constitution de solutés injectables. Les doses de virus lltilisé~s pour
mini.stration peuvent être ~ptées en fonction de (liCîérell~ paramètres, et not~mm~nt
en fonction du site (muscle) d'~fl. ~ lion considéré, du nombre d'injections, du gène à
exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les
adénovirus recomhin~nt.s selon l'invention sont formlll~s et ~ s sous forme de
doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de pl~rellce 106 à 101~ pfu. Le terme pfu
("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est
déterminé par infection d'une culture cellulaire appl~Liée, et mesure, génér~lement après
15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de ~l~termin~tion du
titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Le procédé selon la présente invention est particulièrement avantageux pour le
traitement des tr~-lm~tismes m~ ires ou des maladies de dégénérescence
motoneuronale. Les tr~llm~tism~s m~lllll~ires correspondent plus particulièrement à des
sections au niveau des motoneurones qui les privent de leurs afférences provenant des
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centres supérieurs et entrainent leur ~légPnPrPsGen~-p~ Le transfert de gènes codant des
facteurs de cn~ nre dans les moluneur~nes sous lPci~nnPlc par transport rétrograde
selon l'invention offre ~ n~l~l la po.scihilité de réduire voire empêcher cette
dégénérescence. S'~ice~nt de nellrop~l~lies du motoneurone, on peut citer par exemple
la sclérose latérale alllyoko~hique~ les alllyoll~phies spin~lPs de type I (m~ lie de
Werdnig Hoffman) de ty-pe II ou III (m~ ie de Kugelberg-Welander), les al~ly~ko~hies
spin~lPe bulbaires (telles que la m~ lie de Kennedy). Le transfert de gènes codant pour
des facteurs de cru;~s~i-re ou autres moléc~ ,e c-)nnlles pour exercer un effet
neu~olr(~phique sur le motoneurone en dégénérescen~e selon la présente invention offre
é~l~m~nt une nouvelle voie pour le k~ilel-,ent de ce ty-pe de pathologies. L'Pffi~rité du
procédé de l'invention peut en particulier être mise en évidence sur modèle ~nim~l1x:
modèle de section partielle ou complète de la moelle épinière, souris Wobbler (modèle
animal d'étude de la sclérose latérale anly~,lrupl~ique (T eP,stm~ J. E., Am. J. Pathol., 100,
821-824)); souris mnd ("motoneurone degeneration": modèle animal d'étude de la
sclérose latérale a,llyollu~l~ique (Messer et al., 1992, GPnomies, 18, 797-802)) ou souris
pmn ("progressive motoneurone ne~uop~ y'': modèle animal d'étude de la
dégénérescence motoneuronale lors du développement), comme illustré dans les
PxemrlPe L'incorporation, la tolérance et l'inocuité pour rhomme peuvent être testés sur
des modèles in vitro de culture de neurones m~ ires embryonnaires hllm~ine.
A cet égard, l'acide nucléique d'intérêt incorporé dans les vecteurs adénovirauxselon l'invention code ~ rélt?llliellPment pour une substance neuroactive, c'est-à-dire
capable d'exercer un effet bénéfique sur les cellules nerveuses. Il peut s'agir d'une
sllhst~n~e capable de compenser un déficit en ou de réduire un excès d'une sllh.st~n~e
endogène, ou ég~lçm~nt d'une ~lhst~nce conférant aux cellules des propriétés nouvelles.
Il peut s'agir plus particuliè~ ~lll d'un facteur de croie.e~nr,e, d'un facteur
neun~kophique~ d'une c-ytokine, d'un neurukansllletteur ou encore d'une enzyme, ou d'un
récepteur de neur~.ailsmetteur ou d'hormone.
Pl~rélel-l;PllPmçnt parmi les facteurs de croies~nre, on peut citer les facteurs de
stimulation des colonies (G-CSF, GM-CSF, M-CSF, CSF, etc), ou les facteurs de
croies~nre des fibroblastes (FGFa, FGFb) ou des cellules vasculaires (VEGF). Parmi les
facteurs neurotrophiques, les facteurs préférés sont notamment le facteur neulul.ophique
ciliaire (CNTF), les facteurs de maturation des cellules gliales (GMFa,b) le GDNF, le
BDNF, le NT3, le NT5, etc. Les cytokines préférées sont les interleukines et les~ elrér~ns et, parmi les enzymes, on utilise pr~ri~ iellement les enzymes de
3~ biosyntnèse de neuruk~lsmetteurs (tyrosine hy~u~ylase, acétyl choline transférase,
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glutamic acide décarboxylase), les enzymes ly~os~ e (héxos~mini-3~eee, arylsulfatase,
glucocérébrosidase, HGPRT), les enzymes impliqués dans la détoxification des radicaux
libres (superoxyde tliemut~ee I, II ou III, c~t~l~ee, gluthation peroxydase). Parmi les
récepteurs, on utilisera entre autres les réc~euls aux androgènes (impliqués dans la
5 m~ ie de Kennedy).
Ces dirré ~ll~ f~ctel-r.e peuvent être utilisés sous forme native, ou sous forme de
variant ou fragment ayant une activité de même type.
Il est également possible de transférer des séquences ~ntieene
L'acide nucléique peut être d'origine naturelle ou artificielle. Il peut s'agir
0 notamment d'ADN génomique (ADNg), d'ADN complémentaire (ADNc), de séquences
hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Il peut être d'origine
hum~in~, ~nim~le, végétale, bac-teri~nne, virale, etc. Il peut être obtenu par toute
technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, parsynthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes in~ nt la modification chimique
15 ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Il s'agit
préférentiellement d'ADNc ou d'ADNg.
Généralement, l'acide nucléique comprend ég~l~m~nt une région promotrice de
la transcription foncti~nnelle dans les motoneurones, ainsi qu'une région située en 3' du
gène d'intérêt, et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de
20 polyadénylation. L'ensemble de ces ~l~m~nte con~tit~le la cassette d'expression.
Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement
responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de
fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de régions d'origine
dirfé~ L~ (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques).
25 Not~mment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par
exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du ~nome de la cellule que l'on
désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un
virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les
promoteurs des gènes ElA, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces régions promotrices
30 peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou
permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire (promoteurs GFAP, enolase,
etc). Par ailleurs, lorsque l'acide nucléique hétérologue ne comporte pas de séquences
promotrices, il peut être inséré dans le génome du virus en aval d'une telle séquence.
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La présente invention a e~,ql~mPnt pour objet une méthode pour le transfert
d'acides nucléiques d,qns les motoneurones co~ nant l'~-lr";n;~l~dLion musculaire d'un
vecteur adénoviral incoporant ledit acide ntlclPiqlue dans son génome. ~rc~ .mçnt
la méthode selon l'invention est réalisée par injechon(s) en plusieurs points d'un même
5 muscle ou, lorsque le point ~l'insellion du nerf est repérable, par une ou plusieurs
injections au niveau ou proche(s) dudit point.
La pf~sen~e invention sera décrite plus en détail à l'aide des e~.~.mples qui suivent,
qui doivent être c~onxitlPrés comme illi-.~;l- ,rl;rx et non l;~ rl;l'
L~ende des fi~ures
10 F~GURE 1 (PHOTO A):
Marquage ~-Galacto.~ l,qxe de coupes lon~ittl-iin,qles (50 !lm) de moelle épinière
de rat au niveau lombaire, après injection il~ ire d'adénovirus 13-G,ql,qct~ lq~e
dans le muscle gastro~némien.
- marquage diffus de nombreux corps cellulaires motoneuronaux (/\).
5 - marquage plus intense de quelques motoneurones au niveau du corps cellulaire et des
neurites, mettant en évidence la morphologie typique des motoneurones (--).
F~GURE 2 (PHOTO B): idem A, grQxxi.~ix~ supérieur.
Marquage ~ G,ql l;tosi(1,qxe de coupes lon~ihl-lin,qk~-~ (50 ~lm) de moelle épinière
de rat au niveau lombaire, après injection "~ cul,qire d'adénovirus ~3-Galactosidase
20 dans le muscle gastrocnémien.
F~GURE 3 (PHOTO C):
Co-marquage ~3-G,ql,qcto.~ fq~e-Tmmlmocytochimie "C,qkit-)nin Gene Related
Peptide" (CGRP) de coupes lonEih~ in,qles (50 ~m) de moelle épinière de rat au niveau
lombaire, après injection i,~ "~ ire d'adénovirus B-Gal,qr,to~ ,q.ce dans le muscle
25 gastro~némi~n.
Exemples
1. Injection de l'adénovirus b-Galactosidase dans le muscle gastrocnémien chez le rat
intact ou chez le rat ayant subi une hémisection thoracique de la moelle épinière.
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Cet exemple décrit le transfert du gène b-gal au niveau des motoneurones
lombaires par ~minietration dans le muscle gastr~n~-mi~-n d'un adénovirus incorporant
ledit gène.
Plus particulièrement, l'étude a été réalisée sur un modèle de section partielle ou
5 complète de la moelle épinière de rat pratiquée au niveau thoracique bas ayant pour effet
de paralyser l'animal pour l'un ou ses deux membres inférieurs. Une telle section prive les
motoneurones de leurs afférences provenant des centres supérieurs et en entr~in~ la
dégénér~ecen~e. L'~tlmini~tration a été réalisée de manière à infecter les motoneurones
sous lçeionnel~ par transport rétrograde.
Le vecteur adénoviral utilisé dans cet ex~mrle est le vecteur Ad.RSV.~gal. Ce
vecteur est dépourvu des séquences nécessaires à sa réplication, mais comporte
néanmoins les séquences néce~s~ires pour pénétrer dans les cellules infectables par celui-
ci ainsi que l'~-n~emhle des séquences essentiell~s n~cee~ires à l'~ne~r~ ti-)n de cet
adénovirus. Il porte é~lçment, sous le controle du promoteur RSV, le gène de la ~
15 g~l~cto,si~l~ee de E.coli. La construction de l'adénovirus recomhin~nt défectif
Ad.RSV~3gal a été décrite dans la liliéL~Lu~ (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest.
90 (1992) 626). Brièvement, l'adénovirus Ad.RSVbGal est un adénovirus recombinant
défectif (délété des régions E1 et E3 ) obtenu par recomhin~i.eon homologue in vivo
entre l'adénovirus mutant Ad-dl324 (Thimm~rpaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le
20 pl~mi~le pAd.RSVbGal (Akli et al. 1993).
Le pl~micie pAd.RSVbGal contient, dans l'orient~ti~n 5'->3~,
- le fragment PvuII correspondant à l'e~e~ gauche de l'adénovirus Ad5
co.5l5~ nant: la séquence ITR, l'origine de réplication, les signaux d'~n~ps~ tion et
l'~mplifi~t~ur ElA;
- le gène codant pour la b-g~l~cto~ e sous le contrôle du promoteur RSV
(du virus du sarcome de Rous),
- un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la
recombinaison homologue entre le pl~cmi~ pAd.RSVbGal et l'adénovirus dl324.
Après liné~ri~tion par l'enzyrne ClaI, le pl~mi~l~ pAd.RSVbGal et l'adénovirus
dl324 sont co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosrh~te de calcium pour
permettre la recombinaison homologue. I,es adénovirus rec- mhin~nt.~ ainsi générés sont
sélectionnés par pl~rifi~tion sur plaque. Après isolem~nt l'ADN de l'adénovirus
rec-~mhin~nt est ~mplifié dans la lignée celll-l~ire 293, ce qui conduit à un surnageant de
culture conten~nt l'adénovirus défectif rec-mhin~nt non purifié ayant un titre d'environ
101~ pfu/ml. Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient
CA 02208224 1997-06-05
Wo 96/18740 Pcr/FR9S/01650
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de chlorure de césium selon les techniques c~nmles (voir not~mm~nt Graham et al.,
Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus a ensuite été utilisé sous forme purifiée dans une
solution saline phosphate (PBS).
Trois injections d'adénovirus Ad-RSV-b-Gal (107 pfu par injection) ont été
5 pratiquées dans le muscle gastro~n~-mi~-n, juste après que ranimal ait subi (ou pas) une
h~mi.eectic)n de la moelle épinière (niveau thoracique bas, ayant pour effet de paralyser
l'animal pour l'un de ses membres i lré,ie~). 9 ,ul d'adén~viLus sont injectés par point
d'injection à la seringue ~milton
Les ~nim~llx ont été s~crifi~.s (perfusion 4~o pa,~ çhyde) quatre jours après
lo injection, temps l..;ll;,-....-~ pour que le transport rétrograde s'effectue du muscle à la
moelle épinière. Trois blocs de moelle épinière ont été coupés longit~lAin~lement aux
niveaux cervical, thoracique et lombaire, en coupes de 50 mM d'épaisseur. Les coupes
ont été traitées pour la révélation de la 13-G~l~ctQ.ei~l~ee p~rm~tt~nt de mettre en évidence
les cellules ayant été infectées par le virus. Certaines coupes ont de plus subi une
5 immlmQcytochimie anti-"C~lcitonin Gene Related Peptide" (CGRP), p~rmett~nt de
marquer spe~ifiquement les motoneurones.
La ~-Galactosidase a été révélée à partir de son substrat, le X-Gal, et le produit
de la réaction donne une coloration bleue.
Le "C~lcit )nin Gene Related Peptide", CGRP, est un neurotransmetteur,
20 marqueur spé~ifique des motoneurones. Il est révélé par imm1ln~cytQf~himi~ avec un
anticorps secondaire couplé à la péroxidase et comme substrat de l'enzyme la
diaminob~n7i~in~; le produit de la réaction donne une coloration marron.
La révélation de la b-G~l~ctosi~ e a permis de mettre en évidence la présence demotoneurones infectés, exclusivement au niveau lombaire, sous le~ionntq.l dans le cas des
2s rats hémi~ectionnés, et du coté correspondant à l'injection.
Deux types de marquage ont été obtenus, un marquage diffus du corps c~ ire
d'un grand nombre de motoneurones, et un marquage plus intense du corps c~ ire et
des neurites d'un nombre plus limité de motoneurones (photos A et B). Cette différence
d'int~n~ité de marquage est prob~hlçm~nt due au fait que se~ m~-nt quelques
30 motoneurones, très proches du site d'injection, ont pu absorber le virus de fac~on int~n~e
L'immnn-~cytQchimie anti-CGRP couplée à la révélation b-G~l~ctosi~ e a permis
de mettre en évidence par une double coloration que la quasi totalité des corps c~ ires
CGRP positifs (i.e. motoneurones) étaient infectés par le virus (photo C).
