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CA 02209267 1997-06-23
W O 97/lS815 PCTIFR96/01635
Ensemble de traitement d'un echantillon en milieu liquide,
notamment d'un materiel biologique
La présente invention concerne de manière générale
le traitement d'un échantillon en milieu liquide,
notamment aqueux, pour liberer et separer une fraction
predeterminee d'interêt dudit echantillon. De maniere
particulière, mais uniquement à titre d'exemple non
limitatif, l'invention concerne le traitement d'un
materiel biologique, par exemple cellulaire, pour liberer
et séparer un constituant ou une fraction predeterminee,
sub-cellulaire ou intra-cellulaire de l'echantillon
traité, par exemple une fraction nucléique ou protéique.
De maniere à introduire la presente invention et
expliciter cette dernière, celle-ci sera ci-après décrite
et définie par reference à l'analyse, détection,
concentration ou separation, d'une fraction nucleique dans
un echantillon biologique, par exemple d'un materiel
cellulaire comprenant ladite fraction nucleique
recherchee, pour son identification et/ou sa
quantification.
La presente invention a pour objet un ensemble de
traitement d'un echantillon, ledit ensemble etant
sterilisable et permettant d'eviter, d'une part toute
contamination du constituant ou de la fraction
prédéterminée, à analyser, du fait du traitement anterieur
d'un échantillon different, et d'autre part toute
contamination par differentes sources externes,
susceptibles en particulier de fausser ensuite l'analyse.
S'agissant du traitement de fractions ou
constituants nucleiques, un tel objet est particulièrement
important, quand on sait en pratique que beaucoup
d'analyses de materiel nucléique sont pertubees, voire
faussees, avec le même appareil d'analyse, d'une part par
des reliquats ou restes de l'echantillon precedemment
traite, et d'autre part par l'existence dans
l'environnement immediat de l'appareil d'analyse de
,
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"polluants" nucleiques. En consequence, l'analyse de
fractions ou constituants nucleiques impose des
contraintes, en particulier un travail dans des conditions
particulierement severes, pour éviter toute contamination
parasite du constituant ou de la fraction a analyser.
L'invention permet de remedier a ces
inconvenients. Un ensemble de traitement conforme à
l'invention comprend, d'une part un module actif,
permanent, essentiellement statique, clos par rapport à
l'exterieur, rassemblant dans un circuit de traitement en
serie, entre une entree principale pour l'echantillon a
traiter, et une sortie principale pour la fraction ou le
constituant predetermine de ce même echantillon :
- une première enceinte de dissociation de
l'echantillon traite, notamment de lyse du materiel
biologique, pour liberer la fraction ou le constituant
predetermine et recherche, ladite enceinte comprenant un
premier element de conduit
- une deuxième enceinte de separation de cette
fraction predeterminee, comprenant un second element de
conduit
- differents conduits de liaison entre les
differents elements ou composants du circuit de traitement
- differentes entrees secondaires et/ou sorties
secondaires pour differents agents liquides ou gazeux de
traitement, et/ou effluents liquides ou gazeux
respectivement
- et des vannes de contrôle des fluides, liquides
ou gaz circulant dans ce circuit
- tous les composants du circuit, y compris les
premiers et seconds elements de conduit, etant obtenus en
un materiau, notamment metallique, mecaniquement
resistant, susceptible de dissiper de la chaleur par effet
ohmique, pour constituer une source chaude directement
dans leur masse
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- et une source électrique connectée auxdits
composants, dont les premiers et seconds éléments de
conduit, pour faire passer en leur sein, de maniere
contrôlée, un courant électrique générant une source
chaude directement dans leur masse, le tout étant agencé
pour une incinération interne et complete du circuit, par
simple passage d'un courant electrique, dans les matériaux
constitutifs dudit circuit,
et d'autre part, un recipient externe jetable, pour
l'echantillon a analyser, connectable a l'entrée
principale du circuit de traitement, et un récipient
externe jetable d'analyse pour la fraction ou le
constituant predetermine et recherche, notamment une carte
connectable a la sortie principale du circuit de
traitement, cette carte comprenant differents reactifs et
moyens d'analyse de la fraction predéterminée
eventuellement le récipient externe jetable et la carte
externe jetable sont rassembles selon un même composant ou
dispositif, lui même jetable.
Préférentiellement, au moins plusieurs vannes de
contrôle du circuit de traitement sont chacune une vanne
dite "statique a congélation" du liquide de l'echantillon,
et/ou de tout autre agent liquide circulant dans le
circuit de traitement. Chaque vanne comprend à cette fin,
un element de conduit agencé pour recevoir le milieu
liquide dans sa section de passage, dont la paroi est
conductrice de la chaleur, et une source froide disposée
au contact thermique, notamment en échange de chaleur avec
ledit élément de conduit, dont la température et la
puissance frigorifiques sont adaptées a la congélation du
milieu liquide, dans ladite section de passage. L'element
de conduit est dimensionné en relation avec la source
froide, et la source chaude generee par passage du courant
electrique en son sein, pour passer rapidement, par
exemple dans un temps élementaire inférieur a 10 secondes,
d'un état froid, dans lequel le milieu liquide est
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susceptible par congélation de boucher de maniere etanche
le passage au travers de l'élément de conduit, y compris
vis-a-vis de pressions relativement importantes, par
exemple au moins égales a 50 bars, notamment 150 bars, a
S un état chaud dans lequel le milieu liquide est liquéfié
en libérant le passage précité.
Grâce a l'invention, on aboutit donc a un ensemble
ou système de traitement pouvant etre automatisé, et mis
en oeuvre dans des conditions et un environnement moins
séveres que ceux usuellement rencontrés avant l'analyse
d'échantillons ou matériaux "sensibles", c'est-a-dire
susceptibles d'être contaminés ou de contaminer leur
environnement immédiat, par exemple l'opérateur de
l'analyse.
La présente invention est maintenant décrite par
reference au traitement d'un échantillon biologique pour
l'analyse subsequente d'une fraction nucleique d'un
materiau cellulaire, par référence au dessin annexé, dans
lequel :
- la Figure 1 représente de maniere schematique un
ensemble d'analyse selon l'invention
- la Figure 2 représente de maniere schématique
une vanne statique à congélation, appartenant a l'ensemble
d'analyse représenté a la Figure 1.
Un ensemble de traitement selon l'invention
comporte trois parties, a savoir :
- un module actif A, permanent, essentiellement
statique, clos par une enceinte 26 par rapport a
l'extérieur, regroupant un circuit de traitement 6 décrit
ci-apres
- un récipient externe B, jetable, pour
l'echantillon fi traiter, par exemple un inoculum d'une
culture cellulaire ; ce récipient est connectable a
l'entrée principale 7 du circuit de traitement 6
- et un autre récipient externe C, jetable,
d'analyse de la fraction nucléique obtenue dans le circuit
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de traitement 6, connectable à la sortie principale du
circuit de traitement ; ce récépient comprend de manière
traditionnelle et non decrite ci-après, différents
réactifs et moyens d'analyse de la fraction nucléique, par
5 exemple pour l'amplification et/ou la détection d'un
fragment nucleique particulier.
Le circuit de traitement 6 rassemble entre
l'entrée principale 7 et la sortie principale 8 :
- un premier conduit 3, formant une première
enceinte 1 de dissociation ou lyse du matériel biologique
traité, en l'occurrence la culture cellulaire analysée
- un second conduit 4, formant une deuxième
enceinte 2 de séparation de la fraction nucléique à
analyser
- différents conduits de liaison, dont l'un 9
-
entre le premier conduit 3 et le second conduit 4, et
l'autre 10 entre le second conduit 2 et la sortie
principale 8
- différentes entrées secondaires 11 à 13, et/ou
sorties secondaires 14, 39, pour différents agents
liquides et/ou gazeux de traitement, et/ou effluents
liquides ou gazeux respectivement
- des vannes de contrôle 15 a 25 et 27 des flux
liquides ou gazeux circulant dans le circuit de
traitement; préférentiellement, les vannes de contrôle
15,16,17,18,21,22,23,24 et 25 sont des vannes dites
statiques a congélation, comme décrit ci-apres; la vanne
27 est soit une vanne mécanique ou traditionnelle, soit
une vanne statique a congélation ; dans ce dernier cas, il
est nécessaire de prévoir des moyens d'alimentation en
liquide, non représentés dans la Figure 1 annexée.
Tous les composants du circuit 6 de traitement, y
compris les premier 3 et second 4 éléments de conduits des
première 1 et deuxieme enceintes 2 respectivement, sont
obtenus en un materiau, notamment métallique,
mécaniquement résistant, susceptible de dissiper de la
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chaleur par effet ohmique, pour constituer une source
chaude directement dans leur masse. Pour ce faire, une
source electrique representee schematiquement sous la
reference numerique 5 est connectee à tous ces composants,
y compris aux premier et deuxième elements 3 et 4 de
conduits des première 1 et deuxième 2 enceintes
respectivement, pour faire passer en leur sein, et de
manière contrôlee, un courant electrique generant une
source chaude.
Comme particulièrement represente à la Figure 2,
chaque vanne statique à congelation, identifiee
precedemment, comprend, pour la congelation du milieu
liquide de l'echantillon traite, et/ou de tout autre agent
liquide circulant dans le circuit de traitement 6 :
- un element de conduit 29, agence pour recevoir
le milieu liquide dans sa section de passage 29a, dont la
paroi est conductrice de la chaleur,
- une source froide 28, representee de manière
globale et commune à la Figure 1, disposee au contact
thermique, notamment en echange de chaleur avec l'element
de conduit 29, dont la température et la puissance
frigorifique sont adaptées à la congelation du milieu
liquide, dans la section de passage 29a
- l'element de conduit 29 etant dimmensionne en
relation avec la source froide 28 et la source chaude
generee par passage en son sein du courant electrique, en
provenance de la source electrique 5, pour passer
rapidement, par exemple dans un temps elementaire
inferieur à 10 secondes, d'un etat froid dans lequel le
milieu liquide est susceptible par congelation de boucher
de manière etanche le passage au travers dudit element de
conduit, y compris vis-à-vis de pressions relativement
importantes, par exemple au moins egales à 50 bars,
notamment 150 bars, à un etat chaud dans lequel le milieu
liquide est liquefie en liberant ledit passage.
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Par consequent, il resulte de la description
precedente que pratiquement la totalité du circuit de
traitement 6, et par conséquent du module actif A, est
agencee pour une incineration interne complete, par simple
passage d'un courant electrique dans les materiaux
constitutifs dudit circuit.
La circulation des liquides dans la première
enceinte 1, ou premier élément de conduit 3, est contrôlée
par les vannes statiques à congelation 16 et 17,
respectivement a l'entree la et a la sortie lb de
l'element de conduit 3. La circulation des liquides dans
la deuxieme enceinte 2 est contrôlee par les vannes
statiques 22 et 23, respectivement a l'entrée 2a et à la
sortie 2b du deuxieme element de conduit 4.
Troi~ entLéês secondaires~l1 a 13, respectivement
pour trois liquides de lavage 30 a 32, a savoir
respectivement du thiocyanate de guanidium, de l'ethanol
et de l'acetone sont disposees sur le circuit de
traitement 6, entre la sortie lb de la premiere enceinte
et l'entree 2a de la deuxieme enceinte.
Une entree secondaire 33 pour un liquide d'elution
34 est disposee sur le circuit de traitement, entre la
sortie lb de la premiere enceinte et l'entree 2a de la
deuxieme enceinte 2, en aval des entrees secondaires 11 a
13.
Les entrees secondaires 11 à 13 et 33 sont
contrôlées respectivement par les vannes 18 à 21, et ces
dernieres sont des vannes statiques a congelation.
Dans le circuit de traitement 6, la sortie 2b de
la deuxième enceinte 2 communique avec un recipient de
collecte 35 des effluents liquides, par l'intermédiaire
d'une vanne statique a congelation 24.
Dans le circuit de traitement 6, l'entree la de la
premiere enceinte 1 communique avec un reservoir 36 d'un
milieu aqueux, par l'intermediaire d'une vanne statique a
congelation 15. Ce meme reservoir 36 communique avec le
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récipient de collecte 35, par l'intermédiaire d'un élément
de conduit 9' controlé par la vanne statique à congélation
25.
Une capacité 37 de stockage intermédiaire est
disposée dans le circuit de traitement 6, entre la sortie
2b de la deuxième enceinte 2 et la sortie principale 8.
Deux sorties secondaires 38 et 39, éventuellement en phase
liquide et/ou gazeuse, pour mise en dépression du circuit
de traitement 6, et/ou balayage du même circuit avec un
gaz, communiquent avec le circuit 6, en aval de la sortie
2a de la deuxième enceinte 2. La sortie secondaire 38 est
disposée sur le récipient de collecte 35 des effluents, et
la sortie secondaire 39 est disposée au-dessus de la
capacité 37 de stockage intermédiaire, en étant controlée
par une vanne statique 27 à congélation.
Le réservoir 36 du milieu aqueux, les recipients
de stockage des liquides de lavage 30 à 32, le récipient
de stockage du liquide d'élution 34, et le récipient 35 de
collecte des effluents liquides sont disposés à
l'extérieur de l'enceinte 26 renfermant le circuit de
traitement 6 proprement dit.
Aux fins de l'analyse d'une fraction ou d'un
constituant nucléique de cellules contenues dans un
échantillon de culture dans le récipient B, le protocole
opératoire suivant est mis en oeuvre, à partir de
l'ensemble d'analyse précédemment décrit.
Pour la description ci-après, fermer ou ouvrir une
vanne statique à congélation 16 ou 17, signifie
respectivement congeler le milieu liquide dans sa section
de passage, au moyen de la source froide 28, et faire
passer un courant électrique dans la masse de l'élément de
conduit, aux fins de chauffer et liquéfier ce même milieu
liquide, et ainsi libérer le passage dans ledit élément de
conduit.
Par tous moyens appropriés, par exemple par
aspiration de l'échantillon liquide dans le récipient B,
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l'échantillon à traiter est transfére dans la première
enceinte 1, la vanne 16 etant ouverte, et la vanne 17
initialement ouverte se fermant par congélation au contact
de l'echantillon liquide. L'intérieur de l'enceinte 1 se
trouve isolé et rempli avec l'échantillon à traiter, en
fermant la vanne la. En faisant passer un courant
électrique dans le premier element conduit 3, les vannes
16 et 17 etant toujours fermees, on vaporise le milieu
liquide d'une part, et on élève la pression du même milieu
à l'intérieur de l'element de conduit 3, à des valeurs
relativement importantes, d'autre part, de telle sorte que
le materiel cellulaire se trouve lyse, en liberant la ou
les fractions nucléiques a analyser, mais en melange avec
d'autres fractions residuelles, notamment proteiques,
provenant du même materiel cellulaire.
La deuxième enceinte est pourvue de moyens
permettant de fixer ou retenir la fraction nucleique
recherchee, disposes dans le deuxieme element de conduit
4, et consistant par exemple en un matériau adsorbant,
notamment de la silice.
En ouvrant les vannes 17 et 22, la vanne 23 etant
fermee, l'echantillon lysé, comprenant la fraction
nucleique d'interêt et les fractions residuelles, est
transfere, par exemple par aspiration, dans le deuxième
element de conduit 2. La fraction nucléique d'intérêt est
adsorbee sur ledit materiau adsorbant de la deuxième
enceinte 2.
Puis, en ouvrant successivement les vannes 18 a 20
et les vannes 22, 23 et 24, par exemple par aspiration,
les fractions residuelles de l'echantillon lyse se
trouvent transferees vers le recipient de collecte 35,
etant entendu que la vanne 25 est fermée.
Ainsi, la deuxième enceinte se trouve rincee par
les liquides de rinçage 30 à 32 respectivement, les
effluents etant evacués vers le recipient de collecte 35.
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De cette manière, les fractions autres que nucléiques sont
éliminées de la deuxième enceinte 2.
En fermant la vanne 24, et en ouvrant
successivement les vannes 21,22,23 et 25, par aspiration
dans la capacité 27, on fait circuler dans la deuxième
enceinte 2 le liquide d'élution 34, lequel emporte avec
lui, lors de son passage dans la deuxième enceinte 2,
spécifiquement et uniquement la fraction nucléique,
laquelle se retrouve en suspension dans la capacité 37 de
stockage intermédiaire. Puis, cette même fraction
d'élution peut être transférée, toujours par aspiration
par exemple, dans le récipient externe ou carte C
d'analyse, par la sortie principale 8. Et c'est dans cette
carte que s'effectue selon des moyens appropriés ne
faisant pas partie de la présente invention, l'analyse
proprement dite de la fraction nucléique, par exemple par
amplification et/ou détection, au moyen de réactifs déjà
disponibles ou ajoutés dans le récipient externe C
d'analyse.
La vanne 27 étant ouverte par tous moyens
appropriés, soit par aspiration, soit par refoulement, on
fait circuler dans la totalité du circuit de traitement de
l'air stérile, lequel est évacué par les sorties
secondaires 38 et 39.
Eventuellement, et si nécessaire, le liquide
d'élution peut être transféré, de la même manière et avec
les mêmes moyens, au travers de la deuxième enceinte 2 et
de la capacité 37, vers le récipient externe d'analyse C.
Par ouverture des vannes 15 et 24, la vanne 25
étant fermee et toujours par aspiration, la totalité du
circuit 6 de traitement se trouve lavée au moyen du milieu
aqueux 36. Par l'intermédiaire des sorties secondaires 38
et 39, toutes les vannes du circuit étant ouvertes, on
fait circuler dans ledit circuit de l'air de séchage. En
faisant passer un courant électrique dans la totalité du
circuit de traitement 6, on porte toutes les surfaces
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internes de ce dernier a une temperature permettant
l~incinération complète des matières organiques ou
biologiques, ce qui conduit à une décontamination complète
dudit circuit. La capacite 37 est decontaminee par tout
moyen thermi~ue approprié (non représenté). Après
décont~m;n~tion complète de l'ensemble de traitement, la
vanne 2~ est fermee par congelation, par alimentation du
milieu a~ueux 36 au travers de l'elément de conduit 10.
Et pour terminer, on peut faire circuler de l'air
de refroidissement dans ce même circuit 6, comme déjà
effectue avec l'air de sechage. Le module actif A est
alors prêt pour une nouvelle analyse, à partir d'un nouvel
echantillon dans le recipient B, et avec un nouveau
recipien~ externe C d'analyse.
-
